FI104735B - Pseudomonas aeruginosa ja sen käyttö menetelmässä L-ramnoosin valmistamiseksi bioteknisesti - Google Patents

Description

104735

Pseudomonas aeruginosa ja sen käyttö menetelmässä L-ram-noosin valmistamiseksi bioteknisesti

Deoksisokeri L-ramnoosi (6-deoksi-L-mannoosi) so-5 veltuu kiraalisena rakenneosana erittäin hyvin erilaisten orgaanisten yhdisteiden valmistukseen. L-ramnoosilla tai sen johdannaisilla on yhä laajempaa käyttöä farmaseuttisten valmisteiden ja kasvinsuojeluaineiden synteesissä kuten myös kasvi- ja eläinsoluopin, mikrobiologian, immuno-10 biologian ja aromiainevalmistuksen alalla. Täten esim. L-ramnoosia lähtöyhdisteenä käyttäen voidaan valmistaa 2,5-dimetyyli-4-hydroksi-2,3-dihydrofuran-3-onia (Fura-neolR), jota puolestaan voidaan käyttää erilaisten aromiaineiden ainesosana elintarvike- ja hajusteteollisuudessa.

15 L-ramnoosisokeria voidaan saada kemiallista tietä vain hyvin vaikeasti. Sitä voidaan kuitenkin saada uuttamalla erilaisista luonnollisista lähteistä happaman tai entsymaattisen hydrolyysin jälkeen, näin esimerkiksi fla-vonoidiglykosideista hesperidiini, rutiini, naringiini, 20 kversitriini tai esim. arabikumista tai merilevistä [Bio-techn.Bioeng. 33 (1989) 365, R.J. Linhardt et ai.; EP-A-0 317 033; JPA 62293; US-patenttijulkaisu nro 5 077 206, ~

Cheetham et ai.]. Happaman hydrolyysin menetelmän huonoja puolia ovat L-ramnoosin työläät eristysvaiheet, joissa 25 osittain käytetään orgaanisia liuottimia, ja edelleen .'.j työstössä syntyvät aromaattiset, mahdollisesti myrkylliset • · ··.·. jätteet sekä luonnollisten lähteiden koostumuksessa vaih- televat, vuodenajan tahdista riippuvaiset ainesosat.

• · · ’ US-patenttijulkaisussa nro 5 077 206 vaaditaan pa- 30 tentoitavaksi menetelmä L-ramnoosin valmistamiseksi kasvi- • · · * · „ '·’ materiaalista käyttäen useampia entsyymejä ja sittemmin useampia puhdistusvaiheita. Tämän menetelmän huono puoli , ·;·· on L-ramnoosin vaikea erotus kasvimateriaalista peräisin .···. olevista sokereista, erityisesti glukoosista, sokerien f I i

» · f I I • I I

f 1 I . · • · 2 104735 voimakkaiden kemiallisen rakenteen samankaltaisuuksien johdosta (mukaan lukien molekyylipaino).

L-ramnoosia voidaan valmistaa myös fermentatiivi-sesti ramnoosia sisältävien heteropolysakkaridien muodossa 5 käyttämällä eri sukujen bakteereja, kuten esim. Alcallge-nes, Acinetobacter, Klebsiella, Streptococcus tai Lactobacillus [Enzyme Microb.Technol. 10 (1988) 198, M. Graber et ai.; J.Amer.Chem.Soc. 71 (1945) 4124, F.G. Jarvis ja M.J. Johnson; J.Bacteriol. 68 (1954) 645, G. Hauser ja M.L.

10 Karnovsky].

Näiden menetelmien huonoja puolia ovat tavallisesti viskositeetista johtuvat alhaiset saannot sekä heteropoly-sakkaridin hydrolyyttisen pilkkomisen jälkeen suoritettava L-ramnoosin välttämätön vaikea erotus (perusteet: ks. ed. ) 15 erilaisten sokerien seoksesta. Toisessa kirjallisuuslähteessä kuvataan ramnoosia sisältävää heteropolysakkaridia, joka valmistetaan fermentatiivisesti käyttämällä suvun Klebsiella bakteeria. Ramnoosisaannot ovat viljelyliuok-sesta laskettuna noin 17 g/litra ["Commission of the Euro-20 pean Communities", ECLAlR-ohjelma, sopimusnro AGRE-0011-C, raportti nro 2 (lopullinen raportti), 1991].

Toista 6-deoksisokerien biogeenistä lähdettä edustavat glykolipidit, joita voidaan valmistaa fermentatii- visesti [Microbiol.Sei. 3:5 (1986) 145, D.G. Cooper; I t ' 25 Surfactant Sei.Series 25 (1987) 89, Christoph Syldatk ja ·. ; Fritz Wagner; Biotecn.Bioeng. 33 (1989) 365, R.J. Linhardt ·. ·: .#<.t et ai.; US-patenttijulkaisu 4 933 281, Daniels et ai.; '.,1 US-patenttijulkaisu 4 814 272, Wagner et ai.].

p · J

Jo pitkään on tiedetty, että bakteeri Pseudomonas 30 aeruginosa muodostaa ramnolipide-jä [J.Amer.Chem.Soc. 71 ««f - - ·...' (1949) 4124, F.G. Jarvis et ai♦; J.Bacteriol. 68 (1954) • * · ——— 645, George Hauser ja Manfred L. Karnovsky], Lukuisat ha- » kemus- ja patenttijulkaisut käsittelevät ramnolipidien , fermentatiivista muodostamista Pseudomonas aeruginosalla 35 [Appi.Environ.Microbiol. 51:5 (1986) 985, H.E. Reiling et I i i “

« < I

• « » I < a ,1 3 104735 ai.; J♦Chem.Techn.Blotechnol. 45 (1989) 249, K. Venkata Raraana et ai.; US-patenttljulkaisu 4 933 281, Daniels et ai.; DE-hakemusjulkaisu 2 150 375; US-patenttijulkaisu 4 814 272, Wagner et ai♦]♦ 5 Pseudomonas aeruginosan viljelyliuoksessa esiintyy pääasiassa 4 ramnolipidiä (RL1 - RL4, katso kuva 1), jotka koostuvat yhdestä tai kahdesta L( + )-ramnoosiyksiköstä ja yhdestä tai kahdesta β-hydroksidekaanihaposta [Z.Natur-forsch. 40c (1985) 61, C. Syldatk et ai.].

10 Kuva 1: Ramnolipidit Pseudomonas aeruginosasta 0

II

11Λ 0-CH-CH--C-0-CH-CH2-C02H-H20 " <τ>ιμ μ>.

/ ch5 cHj

20 0 H 0 H

Ramnolipidi 1 0-CH-CH,-C0,H'H20 H°/f—°v f; ” Y„s N <'».>.

ro YY c»,

• · · I

0H 0H

ϊ...: Ramnolipidi 2 • · · t » w · • · » • li' - I I *

t I 1 I I I III

«111'

I I

4 104735

O

II

11A 0-CH-CH,-C-0-CH-CH,-C0,H Ή,Ο HO -0 | 2 | 2 2 2 * y {cHj)· [cHi,s / CHj CHj

) H

O

H0 y,-O

OH OH

15 Ramnolipidi 3 „„ O-CH-CH.-CO.H *H?0 H0 -o I 2 2 2 {cHj)‘ 20 I—[ C"5

OH

O

«O,-o „ ^

OH OH

Ramnolipidi 4 • · · • » » 30 Uusi julkaisu osoittaa, että Pseudomonas aeruginosa kykenee muodostamaan muita ramnolipidejä [Biochim.Biophys.

C.s Acta 1045 (1990) 189, N.B. Rendell et ai.]. Nämä eivät « kuitenkaan kykene määrällisesti kilpailemaan ramnolipidien ,···. 1-4 kanssa. Ne koostuvat L-ramnoosin ja ö-hydroksidekaa- ...

• · · • · 5 104735 nihapon ohella lisäksi 3-hydroksioktaanihaposta, 3-hydrok-sidodekaanihaposta tai 3-hydroksidodekan-5-eenihaposta.

Glukoosin, glyseriinin, n-alkaanien, rasva-alkoholien ja rasvahappojen ohella myös kasviöljyt, kuten soija-5 öljy tai oliiviöljy soveltuvat C-lähteiksi ramnolipidituo-tantoon [Z.Naturforsch. 40c (1985) 61, C. Syldatk et ai.; Surfactant Sei.Series 25 (1987) 89, C. Syldatk et ai.;

Appi.Environ.Microbiol. 51:5 (1986) 985, H.E. Reiling et ai.; Biotechn.Bioeng. 33 (1989) 365, R.J. Linhardt et ai.; 10 Agr.Blol.Chem. 35:5 (1971) 686, H. Hisatsuka et ai.; US-patenttijulkaisu 4 814 272, Wagner et ai.]. Ramnolipi-dien keskinäinen suhde ja niiden saannot ovat suuresti viljelyolosuhteista riippuvaiset [Z.Naturforsch. 40c (1985) 61, C. Syldatk et ai.; Tenslde Surf.Det. 27:5 15 (1990) 302, J.L. Parra et ai.].

Täten Parra et ai. osoittavat, että käytettäessä oliiviöljyä C-lähteenä muodostuu pääasiassa RLl:tä ja RL3:eä.

Ramnolipidien tähänastisesti fermentatiivisesti 20 maksimissaan saatuja saantoja kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 933 281 (Daniels et ai.). Patenttivaatimuksista ilmenee, että käytettäessä maissiöljyä ("cornoil") C-lähteenä Pseudomonas aeruginosa -kannan fermentoinnin jälkeen ramnolipidejä eristetään kasvualustasta pitoisuus 30 -25 50 g/litra. Puhdistettujen ramnolipidien saamiseksi suori- « .·. : tetaan eristys. Eristettyjen ramnolipidien sittemmin suo- j • · ··,·, ritettavassa hydrolyysissä syntyy reaktiotuotteina L-ram- • · ’..It noosia ja hydroksidekaanihappoa.

• i · * Patenttijulkaisun sisältämistä esimerkeistä, eri- 30 tyisesti esimerkistä 3, ilmenee selvästi, että patent- - 1···' tivaatimuksissa ilmoitettu ramnolipidipitoisuus 30 - : • · · f · r- ·...1 50 g/litra viittaa kasvuliuoksessa esiintyvään pitoisuu teen .

Nyt on yllättäen löydetty menetelmä L-ramnoosin 35 valmistamiseksi Pseudomonas aeruglnosaa fermentoimalla, I I · • Il

I

6 104735 jota käyttämällä fermentointiliuoksessa päästään ramnoli-pidipitoisuuksiin 70 - 120 g/litra. L-ramnoosin valmistus tapahtuu ilman solumassan työlästä erottamista kasvuliuok-sesta ja ramnolipidiä ennen hydrolyysiä eristämättä.

5 Keksintö koskee täten: 1. Pseudomonas aeruginosaa, jolle on tunnusomaista, että se syntetisoi ramnolipidejä pitoisuutena 70 -120 g/litra kasvuliuosta.

2. Menetelmää L-ramnoosin valmistamiseksi, jolle on 10 tunnusomaista, että fermentoimalla Pseudomonas aeruginosaa syntetisoidaan ramnolipidejä pitoisuutena 70 - 120 g/litra kasvuliuosta ja ramnolipidit hydrolysoidaan L-ramnoosiksi.

Seuraavassa kuvataan keksintöä yksityiskohtaisesti. Lisäksi patenttivaatimusten sisältö määrittelee sen.

15 Fermentointi voidaan suorittaa laboratoriomitta kaavassa (fermentointimäärät litraluokkaa) sekä teollisessa mittakaavassa (esim. 20 - 50 m3:n mittakaavassa).

Prosenttiluvut viittaavat painoon ellei toisin ole mainittu.

20 Mikro-organismeina voidaan fermentoida kaikkia bakteerikantoja, jotka erittävät ramnolipidejä viljelysu-pernatanttiin.

Mikro-organismit eristetään rikastusviljelmiä käyttämällä luonnollisesta ympäristöstään. Tämä menette- • * * 25 lytapa on alan ammattilaiselle tuttu, ja seuraava on tästä .·. : lyhyt yhteenveto:

• M

.1^·, Rikastusolosuhteet ovat sellaiset, joissa organismi • · pääsee kilpailussa voitolle. Öljyä ja rasvaa suosiville • · • · * mikro-organismeille, kuten esim. Pseudomonas aeruginosa, 1 2 3 4 5 6 « käytetään minimivaatimuskasvualustoja, joissa on öljyjä, • · 2 rasvoja ja/tai hiilivetyjä hiililähteinä. Valmistetaan 3 »»· ·...· nämä ympäristöolosuhteet ja ympätään sekapopulaatiolla, 4 9 5 joka esiintyy luonnollisessa ympäristössä. Tällaisessa ,··. rikastusravintoliuoksessa toivotut bakteerikannat pääsevät 6 voitolle ja kasvavat ohi kaikkien kanssaorganismien. Mo- t · ·

I I I

7 104735 neerx kertaan samanlaiseen ravintoliuokseen siirrostamalla ja levittämällä kiinteälle kasvualustalle rikastunut kanta voidaan eristää helposti. Toistuva, lyhyin väliajoin tapahtuva "neste-nestesiirrostus" ehkäisee kanssaorganis-5 mien kasvun, jotka hyödyntäisivät ensisijaisesti suosittujen solujen eritys- tai suorastaan autolyysituotteita ["Allgemeine Mikrobiologie", H.G. Schlegel, 6. painos, G. Thieme Verlag, Stuttgart, New York, s. 182].

Edullisesti käytetään bakteereja, jotka on eris-10 tetty vesinäytteen rikastusviljelmästä. Erityisesti käytetään öljyjä ja rasvoja työstävän laitoksen vesinäytteitä.

Käytetty vesinäyte on peräisin laitokselle ominaisesta vedestä. Tästä vesinäytteestä eristetyn kannan mää-15 ritti Pseudomonas aeruqinosaksi talletuslaitos die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, W-3300 Braunschweig, Saksa. :

Pseudomonas aeruginosa -solut ovat sauvanmuotoisia, niiden halkaisija on noin 0,6 - 0,8 pm, ne ovat noin 1,5 -20 30 pm:n pituisia ja ovat liikkuvia.

Eristyksen jälkeen tapahtuu Pseudomonas aeruginosan mutatointi. Pseudomonas aeruginosan mutatointi suoritetaan • * : sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen kemiallista mutageenia N-metyyli-N'-nitronitrosoguanidiini (MNNG).

Ill 25 Pseudomonas aeruginosan mutatoinnin jälkeen suori- * : tetaan läpivirtaussytometrian avulla soluerottelu tuotta- • # ··.·, jakantojen eristämiseksi. Tällöin mitattiin lietettyjen, ^ • f MNNG:llä käsiteltyjen solujen optiset ominaisuudet läpi- Γ virtauksessa. Tyypillisen tai vaihtelevan kokoiset ja

30 muotoiset solut eroteltiin täten automaattisesti erilai- I

· _ ’···’ sille kasvualustoille.

• · · Käytetään kaupallisesti saatavana olevaa sytofluo-* _ . metriä, jossa on seuraava varustus: argon-laser (aallon- Γ pituus: 488 m, reho: 20 mW); mittalaite optisille signaa-35 leille eteenpäin suuntautuneesta sirontavalosta ja 90e-si- I.

I « i li· tiili — « ( 104735 δ rontavalosta solukoon ja -muodon määrittämiseksi; automaattinen lajitteluyksikkö.

Yksittäisten solujen lajittelu suoritettiin kahdella erilaisella kasvualustalla, alan ammattilaiselle 5 tutulla glyseriiniminimivaatimuskasvualustalla sekä soi-jaöljyminlmivaatimuskasvualustalla.

Kun kasvualustoja oli inkuboitu 37 °C:ssa, tutkittiin klooneiksi kasvaneiden yksittäissolujen ramnolipidien tuotto ravistelukolveissa ja pienfermentoreissa.

10 Tällä tavalla voitiin eristää Pseudomonas aeru- ginosan kaksi korkeatehomutanttia. Näitä mutantteja käytetään erityisen edullisesti L-ramnoosin fermentoimiseksi ja siten valmistamiseksi.

Ne ovat, kuten ei-mutatoitu Pseudomonas aeruginosa, 15 sauvanmuotoisia, niiden halkaisija on noin 0,6 - 0,8 pm, ne ovat noin 1,5 - 3,0 pm:n pituisia ja ovat liikkuvia.

Pseudomonas aeruginosan korkeatehomutantit on talletettu nimikkeillä DSM 7107 ja DSM 7108 talletuslaitokseen die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell-20 kulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, W-3300 Braunschweig, Saksa, 16. kesäkuuta 1992 Budapestin sopimuksen sääntöjen mukaisesti.

: Tällaisia mutantteja voidaan synnyttää myös muilla tutuilla tavoilla fysikaalisin keinoin, esimerkiksi sätei- « ♦ « 25 lyttämällä ultravioletti- tai röntgensäteillä tai käyttä- i .·. ; mällä muita kemiallisia mutageeneja, kuten esimerkiksi .•t·, etyylimetaanisulfonaattia (EMS) tai 2-hydroksi-4-metoksi- • · '..I bentsofenonia (MOB).

• ♦ « i * i * Seuraavassa kuvattu menettelytapa koskee kaikkia 30 Pseudomonas aeruginosa -isolaatteja.

• ·

Pseudomonas aeruginosaa fermentoidaan kasvualus- ··· tässä, jossa on kasviöljyjä hiililähteenä. Esimerkkejä ..... kasviöljyistä ovat rapsi-, oliivi-, maissi- ja auringon- kukkaöljy. Kasvualustan on kasviöljyn ohella sisällettävä ; 35 myös yhtä tai useampaa typpi lähdettä, sulfaatti- ja mag- I · ' 9 104735 nesiumioneja sekä kalium- ja kloori-ioneja, yhtä tai useampaa fosforilähdettä ja hivenaineita. Kasviöljynä käytetään erityisesti soijaöljyä pitoisuutena noin 100 -250 g/litra, jolloin pitoisuudet 125 g/litra - 165 g/litra 5 ovat edullisia.

Typpilähteinä voidaan käyttää alan ammattilaiselle tuttuja N-lähteitä, kuten esim. (NH4)2S04:ää pitoisuutena 5-50 g/litra ravintoliuoksessa, jolloin edullisesti käytetään NaN03:ea pitoisuutena 15 g/litra.

10 Sulfaatti- ja magnesiumionien käyttöön saamiseksi käytetään 0,01 - 2 g/litra MgS04*7H20:ta, edullisesti 0,5 g/litra. Tuotantoon tarvittavat kalium- ja kloridi-ionit voidaan saada käyttöön lisäämällä 0,1-5 g/litra KClrää, jolloin edullinen pitoisuus on 1 g/litra.

15 Fosforilähteenä ja kasvualustan puskuroimiseksi käytetään 0,001 - 0,1 M natriumfosfaattipuskuria. Edullisesti tähän käytetään noin 6,5 g/litra 75-%:ista fosfori-happoa ja noin 8,9 g/litra 33-%:ista natriumhydroksidi-liuosta.

20 FeCl3:ea sisältävä hivenaineliuos, jossa on eri laisia metallisuoloja, ja joka on liuotettu natriumsit-raatin vesiliuokseen, lisätään kasvualustan steriloinnin » r : jälkeen joko 4 - 5-kertaisena pitoisuutena tai edullisesti - 4-5 kertaa lähtöpitoisuutena eri ajankohtina fermentoin-

| I

25 tiliuokseen.

• « .·. : Ravintoliuoksen pH-arvon tulisi fermentointia aloi- tettaessa olla pH 5,5 - 7,5, edullisesti pH 6,3, ja sitä • · *..! ei tarvitse fermentoinnin aikana säätää.

f « · * · · • Ilmastus suoritetaan käyttäen steriiliä ilmaa, jota 30 puhalletaan sekoitettuun fermentointiliuokseen. Ilmastus- • · , ’···' nopeudet ovat 0,02 - 0,5 VVM (tilavuutta ilmaa/fermentoin-

Ml tiliuoksen tilavuus/minuutti) ja ne ovat riippuvaisia fer- ψ mentorin ja sekoittajan geometriasta, energiankulutukses- ta, jolloin ennen muuta ne ovat kuitenkin riippuvaisia 35 fermentointiliuoksen kulloisestakin tilasta. Tyypillisesti « i < f « — I * 10 104735 kasvufaasissa käytetään noin 0,3 +/- 0,05 WM ja tuotan-tofaasissa 0,1 +/- 0,03 VVM.

Fermentointiliuoksen vaahtoamiskäyttäytymisestä riippuen lisätään fermentoinnin aikana noin 5-15 ml/lit-5 ra kasvuliuosta kaupallisesti saatavaa silikonivaahdones-toainetta, esimerkiksi vaahdonestoainetta VP 1133 valmistajalta Fa. Wacker Chemie GmbH (Muenchen, Saksa), jota englanninkielisellä alueella kutsutaan myös nimellä "Silicon Antifoam Agent VP 1133".

10 Fermentointilämpötila on 20 - 40 °C, edullisesti 30 - 35 °C. Fermentoinnin kesto on noin 4-11 päivää, edullisesti 6-8 päivää. Pseudomonas aeruginosa -kantoja voidaan fermentoida yksittäis- tai sekaviljelmänä. Kannat DSM 7107 ja 7108 soveltuvat varsin hyvin fermentointiin 15 sekä laboratoriomittakaavassa, että teollisessa mittakaavassa.

Edellä mainituissa fermentointiolosuhteissa mikro-organismit muodostavat pääasiassa ramnolipidejä 1 ja 3 (kuva 1), jolloin ramnolipidien volumetrinen kokonais-20 tuotto on noin 70 - 120 g/litra. Tällöin päästään L-ram-noosipitoisuuksiin 30 - 50 g/litra.

L-ramnoosi saadaan suoraan hydrolysoimalla ramno-! lipidit, eli solumassaa erottamatta ja ramnolipidejä ennen niiden hydrolyysiä L-ramnoosiksi eristämättä. i 25 Ramnolipidien ohella kasvuliuoksessa on vielä i .'.j pilkkomatta jäänyttä kasviöljyä, pääasiassa soijaöljyä, • · kuolleita soluja, kaikkia mikro-organismien käyttämättä • * jättämiä kasvualusta-ainesosia, rasvahappoja, vaahdonesto- • · · ' ainetta, liuenneita suoloja sekä muita bakteeriaineenvaih- 30 dunnan tuotteita, joita ei ole tarkemmin määritetty.

• · *···’ Fermentointiliuoksen edelleentyöstämiseksi sen si- sältämät bakteerit tapetaan ensin kuumentamalla fermento- * rin sisältö kokonaisuudessaan 80 - 120 °C:seen, edulli-. sesti 100 °C:seen, joka lämpötila pidetään 15-90 minuu- « I l 35 tin, edullisesti 60 minuutin, ajan.

t < I a i · a a a · 3 a 11 104735 Jäähtyneen kasvuliemen, joka edustaa oleellisesti vesiemulsiota, työstön jatkomenettelyvaiheita kuvataan hakemusjulkaisussa PCT-EP 91-01 756 ("Menetelmiä puhdistettujen glykolipidien valmistamiseksi membraanierotusme-5 netelmällä") ja hakemusjulkaisussa PCT-EP 91-01 426 ("Menetelmiä L-ramnoosin valmistamiseksi ramnolipideistä").

Työstövaiheet ramnoosin eristämiseksi ovat loogisessa järjestyksessä seuraavat: 1. Lämmöllä inaktivoidun kasvuliuoksen happamaksi - 10 tekeminen.

2. Konsentrointi ultrasuodattamalla membraaneilla, joiden erotusraja on 30 000 - 300 000 daltonia.

3. Suolojen poistaminen diasuodattamalla samalla membraanilla.

15 4. Konsentraatin, josta on suolat poistettu, hyd- rolyysi pH-arvossa 0 - 3 ja lämpötilassa 120 - 150 eC.

5. Ramnoosipitoisen vesifaasin erottaminen lipidi-faasista.

7. Vesifaasin puhdistaminen pH:ssa 3-8 käsitte- 20 lemällä värinpoistoaineilla kuten aktiivihiilellä tai bentoniitilla tai ioninvaihtokromatografisesti.

8. L-ramnoosin kiteyttäminen haihdutetusta vesi-faasista.

Lämmöllä inaktivoidun kasvuliuoksen happamaksi te-

I I I

25 keminen tapahtuu hapoilla, erityisesti joko H2S04:llä sil- • · » . loin kun suoritetaan ramnolipidien jatkuva hydrolyysi • · · .* .* L-ramnoosiksi, tai kun kyseessä on "erähydrolyysi", eri- • · · •>§;* tyisesti HCl:llä tai H2S04:llä.

I I I

'·’ ‘ Näissä happamissa olosuhteissa glykolipidit, jotka 1 2 3 4 5 6 normaalisti voivat läpäistä ultrasuodatusmembraanin, tule- 2 » · t - vat pidätetyiksi.

3 • · · _ _ 4 '•"S Ultrasuodatukseen liittyen diasuodattamalla samalla 5 membraanilla suolat pestään osittain pois lisäämällä jatkuvasti vettä ja poistamalla suodosta. Suolapitoisuus mää- 6 ritetään suodatuksen aikana johtokykymittauksilla. Johto-

I I I ( 1 I

« 411« f · 12 104735 kykymittaus suoritetaan käyttäen kaupallisesti saatavana olevia elektrodeja.

Tuloksena tästä menettelytavasta (konsentrointi ja pesu) syntyy 2 - 3-kertaisesti konsentroitu vesiliuos, 5 joka oleellisesti sisältää seuraavat ainesosat: ei-metabo-loituja rasvahappoja ja soijaöljyjäämiä, suoloja (johto-kyky alentunut noin 20 %:iin), kuolleita soluja, vaahdon-estoainetta, ramnolipidejä ja muita bakteeriaineenvaih-dunnan tuotteita, joiden molekyylipaino on korkea. Ramno-10 lipidit säilytetään täysin tällä menettelytavalla.

Ramnolipidien kemiallinen hydrolyysi suoritetaan ilman niiden edeltävää eristystä suoraan kasvuliuoksessa, jota on käsitelty edellä kuvatun mukaisesti.

Kemiallinen hydrolyysi tapahtuu homogenisoidussa 15 tilassa, eli samalla sekoittaen. Hydrolyysin päätteeksi vesi- ja lipidipitoiset faasit erotetaan alan ammattilaiselle tutuilla menetelmillä. L-ramnoosin eristys tapahtuu vesifaasista.

Jos ensimmäisessä vaiheessa (happamaksi tekemisen 20 vaihe) käytettiin H2S04:ää, vesifaasiin lisätään Ca(0H)2:ta tai CaC03:ea K2S04:n poistamiseksi. Sitten tapahtuu vesifaasin puhdistus pH:ssa 3-8 käsittelemällä värinpoistoai-neilla tai ioninvaihtokromatografisesti. Hydrolyysin aika-na vähäisissä määrissä syntynyttä hydroksidekaanihappoa ei 25 eristetä.

: 3. Esimerkkejä

• M

,! .’ 3.1. Esimerkki 1 • · · • «

Pseudomonas aeruginosa -isolaattien hankkiminen: • « · 1' ” '·* a) Rikastuskasvatus 30 Mikro-organismit saadaan laitokselle ominaisista • · · ’...· vesinäytteistä. Tässä tarkoituksessa noin 10 ml:n jäteve- • « · sinäytettä inkuboidaan 500 ml: n erlenmeyerkolvissa 200 ml:ssa rikastuskasvualustaa (mineraalisuolakasvualusta, f·.·, ks. alla) 37 °C:ssa 3 päivän ajan ravistelulaitteessa.

i i · • « · » # » * * · * 1 • · | 13 104735

Mineraalisuolakasvualusta: 15 g/litra oliiviöljyä 10 g/litra NaN03:ea 0,1 g/litra CaCl2·2H20:ta 5 0,4 g/litra MgS04‘7H20: ta 6,8 g/litra KH2P04:ää 8,7 g/litra K2HP04·3H20:ta 5 ml/litra hivensuoloja deionisoitua vettä 10 Hivensuolat: 1 g/litra rauta(3)sitraattia 0,2 g/litra MnS04:ää 0,1 g/litra ZnCl2:ta 0,025 g/litra CuS04 · 5H20: ta 15 0,02 g/litra natriumtetraboraattia 0,01 g/litra natriummolybdaattia 0,004 g/litra CoCl2:ta deionisoitua vettä 2 ml 1. rikastusviljelmää inkuboidaan 2. kolvissa 20 samassa kasvualustassa uudestaan kuten edellä kuvattiin.

Tämä menettely toistetaan vielä 4 kertaan, b) Eristys

Kasvuliuos viimeisestä rikastusviljelmästä levitetään agar-maljaan, jossa täyskasvualusta koostuu 10 25 g:sta/litra glukoosia, 4 g:sta/litra kaseiinipeptonia, . 4 g:sta/litra lihauutetta, 0,5 g:sta/litra hiivauutetta, • · · 0,5 g:sta/l.itra maksauutetta ja 2,5 g:sta/litra NaClrää.

• · ·

Inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen Pseudomonas aeruginosa eris- *·1 ‘ tetään kloonina.

30 c) MNNG-mutatointi · ·

Kloonia esimerkistä 1, kohta b, viljellään 24 tun-

IM

nin ajan täyskasvualustassa 37 4C:ssa. Sitten kasvualustaa laimennetaan 1:10 lisäämällä tuoretta täyskasvualustaa.

I I

... Soluja regeneroidaan 2 tunnin ajan 37 °C:ssa ravistelu- 35 laitteessa.

· • · · • · · · - 14 104735

Sentrifugoimalla erotettuja ja Tris-maleiinihappo-puskurilla (pH 6) pestyjä ja uudelleenlietettyjä soluja käsitellään MNNG:llä (0,4 - 0,8 mg/ml) 37 °C:ssa 15 - 20 minuutin ajan.

5 Solut pestään jälleen 3 kertaan Tris-maleiinihap- popuskurilla, minkä jälkeen mutatoitua solulietettä viljellään täyskasvualustassa 37 °C:ssa 24 tunnin ajan.

Sitten suoritetaan läpivirtaussytometrian avulla solujen erottaminen.

10 Yksittäisten solujen lajittelu suoritetaan seuraa- valla kasvualustalla:

Minimivaatimuskasvualusta: 20 g/litra glyseriiniä (tai soijaöljyä**) 10 g/litra NaN03:ea 15 1 g/litra KCl:ää 1 g/litra NaClrää 0,02 g/litra CaCl2· 2H20: ta 6,8 g/litra KH2P04:ää 8,7 g/litra K2HP04:ää 20 0,5 g/litra MgS04♦ 7H20:ta 2 ml/litra hivenaineliuosta* 20 g/litra agaria ' deionisoitua vettä pH säädetään 6,5:ksi ennen sterilointia.

25 * lisätään steriloinnin jälkeen

( I

,·, : ** kuumennettu kasvualusta homogenoidaan vähän en- • · · .! .* nen kaatamista • t f • ·

Hivenaineliuos: • t · ’·' ' 1 g/litra natriumsitraatti · 2H20: ta 30 0,14 g/litra FeCl3· 6H20:ta

• M

·...· 0,7 g/litra ZnS04 · 7H20: ta ί>§>ί 0,6 g/litra CoCl2· 6H20: ta ,0,6 g/litra CuS04· 5H20: ta i i .... 0,4 g/litra MnS04 · 5H20: ta i 35 deionisoitua vettä • · · i #

• I I

« ^ * * 3 15 104735 Tällä tavalla saatuja kantoja käytetään seuraavassa kuvattuun fermentointiin.

3.2. Esimerkki 2

Eräfermentointi teollisessa mittakaavassa L-ram-5 noosin saamiseksi a) Esiviljelmä

Kannan Pseudomonas aeruginosa DSM 7107 ensimmäinen esiviljelmä 4 litraan esikasvatusravintoliuosta (taulukko 1) valmistetaan ravistelukolveihin (2 litran erlenmeyer-10 kolveja, joissa kussakin on 500 ml ravintoliuosta, 30 eC, 200 kierr./min, 20 tuntia). 1. esiviljelmä kokonaisuudessaan käytetään 2. esiviljelmän (350 litraa) siirrostuk-seen.

Tässä tarkoituksessa 450 litran fermentorissa, 15 jossa on 350 litraa kompleksista esikasvatusravintoliuosta (taulukko 1), fermentoidaan kantaa DSM 7107 aerobisesti ilmastusnopeudella 180 litraa ilmaa/min käyttäen se-koitusnopeutta 300 kierr./min 28 °C:n lämpötilassa 16 tunnin ajan.

20 Taulukko 1: Esikasvatusravintoliuos: 10 g/litra glukoosia 5 g/litra kaseiinipeptonia 1 g/litra hiivauutetta 0,5 g/litra NaClrää 25 2. esiviljelmä kokonaisuudessaan käytetään päävil- .·. : jelmän siirrostukseen.

• · 9 b) Pääviljelmä • · *..I Fermentoriin, jonka nimellistilavuus on 30 m3, • « · valmistetaan 17 m3 taulukossa 2 esitettyä ravintoliuosta: 30 Taulukko 2: Pääviljelmän ravintoliuos: 6,47 g/litra 75-%:ista H3P04:ää • · · - ·...· noin 8,94 g/litra 33-%:ista NaOH-liuosta ....: 0,5 g/litra MgS04 · 7H20: ta 1 g/litra KC1: ää * * * < · · • * · • · · • · 16 104735 15 g/litra NaN03:ea 125 g/litra soijaöljyä vettä

5 Lisäksi tarvittavan vesimäärän lisäyksen jälkeen pH

säädetään H3P04:llä ja NaOH:lla arvoon 6,8. Kun on lisätty loput ravintoliuosainesosat, pH-arvo korjataan H2S04:llä 6,2:ksi.

45 minuutin steriloinnin jälkeen pH-arvo on aset-10 tunut 6,3:een. Erillisessä astiassa steriloidaan hivenaineet (taulukko 3) sisältävä liuos. Tässä tarkoituksessa 150 litraan deionisoitua vettä liuotetaan seuraavat aineet ja steriloidaan:

Taulukko 3: Hivenaineliuos: 15 2 mg/litra natriumsitraatti·2H20: ta 0,28 mg/litra FeCl3 · 6H20:ta 1,4 mg/litra ZnS04 · 7H20: ta 1.2 mg/litra CoCl2 · 6H20: ta 1.2 mg/litra CuS04 · 5H20: ta 20 0,8 mg/litra MnS04 · 1H20: ta deionisoitua vettä

Pitoisuustiedot koskevat 1 litraa pääviljelmää.

Tätä hivenaineliuosta lisätään ennen siirrostusta 25 ja 3 lisäkertaa fermentoinnin kestettyä noin 20, 40 ja 70 : tuntia pääfermentoriin steriileissä olosuhteissa.

• · · .* Ymppinä käytetään esifermentorin (350 litraa) ko- • · · ·,.· konaissisältöä. Fermentointilämpötila on 30 °C. 10 ensim- • · · *·' ' mäisen fermentointitunnin aikana ilmastetaan 250 m3:11a il- 30 maa/tunti, 10. - 30. tunti 400 m3:lla/tunti ja 30. tunnista • · ·...· eteenpäin 100 - 75 m3:lla/tunti.

• · ·

Vaahdonestoon käytetään erikseen steriloitua sili-konivaahdonestoainetta VP 1133 (Fa. Wacker), jota annos-teilaan fermentoriin pieninä erinä riippuen fermentointi-

« « I

« « · • · « « · · • « 17 104735 liuoksen vaahtoamiskäyttäytymisestä, jonka määrittämiseksi apuna käytetään vaahtoelektrodia.

Sekoituselimenä käytetään säteissekoittajaa, joka käsittää 4 turpiinia, joiden halkaisijat ovat 1 040 mm 5 (sekoittajan halkaisija:fermentorin halkaisija = 0,4:1). Kierrosluku on ensimmäisten 10 fermentointitunnin aikana 50 kierr./min ja 10. tunnista eteenpäin 75 kierr./min.

Edellä mainituissa fermentointiolosuhteissa voidaan 167 tuntia kestävässä fermentoinnissa saada litraa kasvu-10 liuosta kohden noin 78 g ramnolipidejä ja L-ramnoosipitoi-suus noin 32 g. Fermentoinnin päätyttyä fermentointiliuos kokonaisuudessaan kuumennetaan fermentorissa tuotantokan-nan tappamiseksi 100 °C:seen, jossa lämpötilassa sekoitetaan 1 tunnin ajan. Seuraavat työstövaiheet aina kiteiseen 15 L-ramnoosiin suoritetaan analogisesti patenttijulkaisuihin PCT/EP 91-01 756 ja PCT/EP 91-01 426 nähden.

3.3. Esimerkki 3

Eräsyöttöfermentointi teollisessa mittakaavassa L-ramnoosin saamiseksi 20 18,5 m3:een pääkasvualustaa, jonka koostumus on kuten esimerkissä 1, siirrostetaan 350 litraa esiviljelmää (kuvattiin samoin esimerkissä 1). Tuotantokantana käyte- ' tään Pseudomonas aeruginosa -kantaa DSM 7108. Ennen siir- .rostusta ja kulloinkin fermentoinnin kestettyä 20, 40, 70 25 ja 120 tuntia lisätään steriileissä olosuhteissa hivenai- .·. : neliuosta (katso esimerkki 1).

« · · .! / Ilmastusnopeuksia vaihdellaan seuraavasti: fermen- • · , tointi aloitettaessa 250 m /tunti, 10 fermentointitunnin • · · ' jälkeen 350 m3/tunti ja 30 fermentointitunnin jälkeen 30 vaahdonmuodostuksen voimakkuudesta riippuen 100 - 130 • · « *...* m3/tunti ilmaa. „ • · " ·... Ensimmäisten 10 fermentointitunnin aikana sekoi- ~ t tetaan nopeudella 50 kierr./min, sitten nopeudella 75 kierr./min. Fermentointitunteina 72. - 109. annostellaan f \ 35 jatkuvasti vielä 564 litraa soijaöljyä.

( I I

« » « I « · I · « I · _ 18 104735

Vaahdonmuodostuksen esto tapahtuu samalla tavalla kuin kuvattiin esimerkissä 1. Mainituissa fermentointi-olosuhteissa saadaan 9 päivässä kasvuliuokseen 95 g/litra ramnolipidejä ja L-ramnoosipitoisuus 39 - 40 g/litra.

5 Kasvuliuoksen jatkotyöstö tapahtuu kuten kuvattiin esimerkissä 1.

3.4. Es imerkki 4

Eräfermentointi L-ramnoosin saamiseksi 300 litran mittakaavassa 10 Fermentorissa, jonka nimellistilavuus on 450 lit raa, steriloidaan 300 litraa pääkasvualustaa (koostumus kuten esimerkissä 1). Ymppäys suoritetaan 4 litralla Pseudomonas aeruginosa -kannan DSM 7108 ravistelukolviesivil-jelmää (kasvualusta esimerkistä 1). Käytetään seuraavia 15 fermentointiolosuhteita: fermentointilämpötila on 30 °C.

Ensimmäisinä fermentointitunteina sekoitetaan nopeudella 300 kierr./min ja 30. tunnista eteenpäin nopeudella 400 kierr./min. Aina 10. fermentointituntiin ilmastetaan 80 litralla ilmaa/min, 10. fermentointitunnista eteenpäin 120 20 litralla ilmaa/min ja 30. fermentointitunnista eteenpäin 30 litralla ilmaa/min. Ennen siirrostusta ja kulloinkin 20, 40 ja 70 fermentointitunnin jälkeen lisätään hivenai-neita esimerkistä 1 kulloinkin steriloituna 4 litrassa

I I

E-vettä. Fermentoinnin kestettyä 112 tuntia lisätään tois- t i « 25 tamiseen steriilisti 11,3 kg soijaöljyä. Vaahtoamiskäyt- « « * ^ · täytymistä vastaten silikonivaahdonestoainetta VP 1133 • · · (Fa. Wacker) annostellaan tarpeen mukaan. Mainituissa i « i fermentointiolosuhteissa 11 päivässä muodostuu noin 112 g • · · ’·* * ramnolipidejä kohden litraa kasvuliuosta ja noin 46 g/lit- 30 ra L-ramnoosia.

t · · ·...· Kasvuliuoksen jatkotyöstö tapahtuu kuten esimerkis- • · · ί,,.ί sä 1 kuvattiin.

* < * «·· « « « «Il 4 « f

I I

Claims (8)

104735

1. Menetelmä L-ramnoosin valmistamiseksi, jolloin Pseudomonas aeruoinosaa fermentoimalla syntetisoidaan ram- 5 nolipidejä ja ramnolipidit hydrolysoidaan L-ramnoosiksi, tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruainosan tuottamat ja kasvulluokseen sisältyvät ramnolipidit hydro- ! lysoidaan L-ramnoosiksi ilman niiden edeltävää eristystä. !

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että fermentoidaan Pseudomonas aeruginosaa DSM 7107 ja/tai DSM 7108.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ramnolipidit hydrolysoidaan L-ramnoosiksi pitoisuudeksi 30 - 50 g/litra kasvuliuosta.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että kasvualustaan lisätään hiililähteeksi yhtä tai useampaa kasviöljyä, erityisesti soijaöljyä.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen 20 menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi kes tää 4-11 päivää.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen «i _ :/; menetelmä, tunnettu siitä, että ilmastusnopeus on 0,02 - 0,5 WM. « i i 2 5 7. Pseudomonas aeruginosa DSM 7107, joka kykenee syntetisoimaan ramnolipidejä pitoisuutena 70 - 120 g/litra kasvuliuosta. I V

8. Pseudomonas aeruginosa DSM 7108, joka kykenee • · · * syntetisoimaan ramnolipidejä pitoisuutena 70 - 120 g/litra 30 kasvuliuosta. · · • · • · « · · · • · « • · · • · · t I I I H - r « r · (tl f « i « * · I I I f • lim 104735