ES2969987T3 - Dispositivo de criopreservación - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de criopreservación (60) incluye un adaptador (65) montado en un puerto de un contenedor (62) para recibir y almacenar una muestra líquida. El adaptador incluye una primera rama tubular (67) cerrada por un tabique de aguja (72) y una segunda rama tubular (69) que incluye un tubo flexible (74) que termina en un tabique de aguja (75). El recipiente se encuentra inicialmente a una presión inferior a la atmosférica. En uso, la muestra se inyecta a través del tabique en la segunda rama. A continuación, el tubo flexible se sella térmicamente y se corta. El recipiente sellado podrá entonces someterse a un protocolo de criopreservación. Después de la descongelación, la muestra líquida se puede extraer mediante una aguja que perfora el tabique en la primera rama. Se puede introducir en el recipiente un dispositivo de autonucleación que incluye un tubo hueco que contiene una matriz de colesterol cristalina, en el que los extremos del tubo están cerrados por una membrana impermeable al colesterol pero permeable a los líquidos, y proporciona un sitio para la nucleación del hielo durante congelación de la muestra líquida dentro del recipiente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
d e s c r ip c ió n
Dispositivo de criopreservación
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo para la criopreservación de células, como células de mamíferos, y muestras/especímenes de tejido.
Las células y los tejidos se suelen criopreservar con frecuencia para prolongar temporalmente<su>viabilidad y utilidad en aplicaciones biomédicas. El proceso de criopreservación implica, en parte, colocar células en soluciones acuosas que contienen electrolitos y compuestos químicos que protegen las células durante el proceso de congelación (crioprotectores). Tales crioprotecTores suelen ser moléculas de bajo peso molecular como glicerol, propilenglicol, etilenglicol<o>dimetilsulfóxido (DMSO).
A medida que estas soluciones se enfrían a temperaturas ligeramente por debajo de<su>punto de congelación, la solución permanece en estado líquido. Esta condición en la que la solución permanece líquida por debajo de<su>temperatura de transición de fase se denomina sobreenfriamiento. A medida que las soluciones acuosas se enfrían aún más por debajo de<su>punto de congelación, aumenta la cantidad de sobreenfriamiento. En ausencia de intervención, las moléculas de agua en la solución, a una temperatura generalmente no más de 15 °C por debajo del punto de congelación, se cristalizarán espontáneamente y el agua pura precipitará como hielo.
Durante esta transición del estado líquido al estado sólido, la solución se mueve de un estado de energía libre más alto a uno más bajo, lo que resulta en una reacción exotérmica. El calor producido durante esta transición de fase causa un calentamiento transitorio de la muestra durante el cual la temperatura de la muestra aumenta. Mientras tanto, el entorno circundante (por ejemplo, el dispositivo en el que se está criopreservando la muestra) ya sea se mantiene a una temperatura constante<o>continúa enfriándose (dependiendo del enfoque de enfriamiento utilizado). Posteriormente, a medida que el calor en la muestra se disipa, el desequilibrio térmico entre la muestra y el dispositivo de enfriamiento creado durante este evento hace que la muestra experimente una rápida tasa de enfriamiento para restablecer el equilibrio térmico. En muchos casos, esta rápida velocidad de enfriamiento provoca la formación de hielo intracelular, lo cual generalmente resulta en la muerte celular. La formación de hielo intracelular típicamente depende de la masa de la muestra, las propiedades de transferencia de calor del contenedor de la muestra, el protocolo de enfriamiento utilizado y las propiedades criobiológicas fundamentales de las células.
La relación entre el estado congelado y los sistemas vivos ha fascinado a la humanidad durante años. Ya en 1683, Robert Boyle observó que algunos peces y ranas podían sobrevivir a temperaturas bajo cero durante períodos cortos de tiempo si una fracción de<su>agua corporal permanecía sin congelar. La criopreservación inducida artificialmente fue observada por primera vez en 1948 por Polge, Smith y Parkes mediante el descubrimiento fortuito de las propiedades crioprotectoras del glicerol para el semen de aves y toros, y posteriormente, para los glóbulos rojos. En tiempos más recientes, los científicos interesados en los fenómenos naturales y las aplicaciones biomédicas asociadas con la congelación de sistemas biológicos han comenzado a investigar los procesos fundamentales que rigen esta relación. Para empezar, es bien sabido que la disminución de la temperatura resulta en la supresión de la actividad metabólica y, por lo tanto, en una reducción de la velocidad a la que ocurriría el deterioro de un sistema biológico desnutrido. El proceso de congelación, sin embargo, no es tan benigno como se podría suponer; generalmente induce variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas que podrían alterar los orgánulos intracelulares, las membranas celulares y los delicados sistemas de interacción célula-célula asociados con los tejidos y órganos. De hecho, dada la extrema complejidad incluso de las células biológicas más simples, es sorprendente que sea posible un estado reversible de animación suspendida mediante congelación.
Desde el primer descubrimiento de los efectos crioprotectores del glicerol y el posterior descubrimiento del dimetilsulfóxido (DMSO), un crioprotector permeable ampliamente aplicable, muchos investigadores han intentado la preservación de células<o>tejidos, principalmente a través de métodos empíricos. La mayoría de los protocolos de criopreservación de suspensiones celulares se han establecido utilizando concentraciones molares de aditivos crioprotectores permeantes para permitir la supervivencia durante la congelación. Al utilizar estos crioprotectores artificiales, se ha añadido mucha flexibilidad al proceso de criopreservación. Por ejemplo, los glóbulos rojos humanos necesitan ser enfriados a una velocidad de alrededor de 1000 °C/min. para una supervivencia óptima sin la adición de un agente crioprotector (ACP). En presencia de 3,3 M (30 %) de glicerol, sin embargo, la supervivencia de este tipo de célula se mantiene alrededor del 90 % en un rango de enfriamiento de 2-3 logaritmos. Como era de esperar, a mayor concentración de ACP, mayor es la probabilidad de daño osmótico durante la adición/remoción de la sustancia, y, en consecuencia, mayor es el cuidado que se requiere en estos procesos.
Durante cualquier proceso de criopreservación, las soluciones involucradas se enfriarán por debajo de<su>punto de congelación hasta encontrar un sitio de nucleación aleatorio para la formación de cristales. Al criopreservar mediante un método de congelación-descongelación, la formación de hielo en el medio extracelular debe ser iniciada deliberadamente mediante la siembra a bajos grados de sobreenfriamiento. Si la formación de hielo no es inducida por la siembra, el hielo se formará espontáneamente cuando la solución se enfríe lo suficiente por debajo de<su>punto de congelación de equilibrio. Debido a que este proceso es aleatorio por naturaleza, la formación de hielo ocurrirá a temperaturas aleatorias e impredecibles; en consecuencia, las tasas de supervivencia de las muestras serán altamente variables entre los ensayos repetidos con el mismo protocolo de congelación. Además, la cristalización extremadamente rápida que ocurre cuando se forma hielo en una solución altamente superenfriada causa daño a las células y tejidos. Además, se ha demostrado que, si se inicia la formación de hielo extracelular a altos grados de sobreenfriamiento, la probabilidad de dañar la formación de hielo intracelular aumenta drásticamente. Este fenómeno resulta del retraso en el inicio de la deshidratación celular inducida por la congelación, lo cual resulta en una mayor retención de agua intracelular y, por lo tanto, una mayor probabilidad de formación de hielo en la célula.
Como se mencionó anteriormente, durante la transición del estado líquido al estado sólido, la solución se mueve de un estado de energía libre más alto a uno más bajo, lo que resulta en un desequilibrio térmico entre la muestra que continúa calentándose y el dispositivo de enfriamiento que continúa enfriándose. Este desequilibrio resulta en última instancia en una desviación severa de la velocidad de enfriamiento prescrita para el tipo de célula en particular, y en el potencial de daño celular durante el proceso.
Para evitar que ocurran estas situaciones potencialmente dañinas, los pasos en el proceso de criopreservación a menudo incluyen intervenciones para introducir cristales de hielo en la solución extracelular cerca del punto de congelación de la solución. Este proceso llamado "siembra" se realiza típicamente enfriando las muestras hasta cerca del punto de congelación de la solución, luego tocando el exterior del contenedor de muestra con un dispositivo metálico (por ejemplo, pinzas<o>una varilla metálica) preenfriado en un fluido criogénico (por ejemplo, nitrógeno líquido). Este paso de siembra produce cristales de hielo en la solución extracelular y proporciona una "plantilla" sobre la cual las moléculas de agua superenfriada en la solución se organizan y producen más hielo. Sin embargo, sembrar muestras de esta manera es un proceso que consume tiempo y pone en riesgo las muestras en casos en los que son retiradas temporalmente del dispositivo de enfriamiento para este procedimiento y porque este método de siembra puede causar inadvertidamente la formación de hielo intracelular.
Existe la necesidad de un sistema de criopreservación que evite los problemas asociados con las condiciones de desequilibrio descritas anteriormente. Existe una necesidad adicional de un sistema que no requiera el paso adicional de siembra auxiliar que actualmente se realiza para inducir la producción controlada de cristales de hielo. Existe una necesidad adicional de un dispositivo de criopreservación que facilite la solución a los problemas mencionados anteriormente. El dispositivo de criopreservación necesario también debe proporcionar medios para simplificar<su uso>en la adquisición y almacenamiento de células y tejidos a ser criopreservados.
El documento US-B-6592613 describe un aparato de recolección de sangre que comprende una bolsa de recolección de sangre, una aguja, un primer tubo, una porción de ramificación, un segundo tubo, una bolsa de resina flexible y un tercer tubo.
El documento US-A-2005084838 describe una bolsa para recolectar fluidos corporales en donde las regiones para almacenar los fluidos corporales recolectados son sellables y separables entre<s í>, pero aún están conectadas entre<sí>a través de líneas de conexión.
Resumen de la invención
Estas y otras necesidades en el campo de la criopreservación son satisfechas por la presente invención. La invención está definida en las reivindicaciones adjuntas.
En la presente invención, se proporciona un dispositivo de criopreservación que comprende: un contenedor para recibir y almacenar una muestra líquida, dicho contenedor tiene una abertura de ajuste de entrada en dicho contenedor; un adaptador, en el cual dicho ajuste de entrada recibe dicho adaptador dentro de dicho ajuste de entrada, dicho adaptador tiene una primera bifurcación tubular y una segunda bifurcación tubular, dicha segunda bifurcación tubular termina en un ajuste de enganche de tubo; un septo que cierra dicha primera bifurcación tubular, dicho septo adaptado para ser perforado por una aguja; un tubo enganchado en un extremo a dicho ajuste de enganche de tubo en dicha segunda bifurcación tubular; y un cierre en el extremo opuesto de dicho tubo, en el cual dicho cierre es un septo adaptado para ser perforado por una aguja, y en el cual dicho dispositivo de criopreservación está configurado para almacenamiento en condiciones de criopreservación a una temperatura tan baja como -196 °C.
La presente invención además proporciona un método de almacenamiento de una muestra líquida tal como se define en la reivindicación 11.
Se describe y no se reclama per se un dispositivo de autonucleación para introducir en un recipiente de criopreservación antes de congelar un líquido contenido en él. El dispositivo comprende un tubo hueco alargado de tamaño adecuado para introducirlo en el recipiente de criopreservación y una composición de nucleación de hielo dispuesta dentro del tubo hueco. Ambos extremos del tubo están sellados, mientras que al menos un extremo está sellado con una membrana que es impermeable a la composición de nucleación de hielo, pero permeable al líquido contenido dentro del recipiente de criopreservación. Ambos extremos pueden incluir la membrana para permitir el flujo del líquido de muestra dentro y a través del dispositivo.
Descrito y no reivindicado per se es que la composición de nucleación de hielo puede ser un esteral, y preferiblemente puede ser colesterol. El colesterol puede ser un revestimiento en el interior del tubo hueco<o>puede ser proporcionado como una matriz sólida dentro del tubo.
Se describe y no se reclama per se, que se proporcionen recipientes de criopreservación que se pueden utilizar con el dispositivo de autonucleación. El recipiente de criopreservación comprende un cuerpo tubular flexible que tiene un extremo inicialmente abierto para la introducción de una muestra líquida en el cuerpo y un puerto cerrado definido en un extremo opuesto del cuerpo. El puerto está adaptado para ser perforado por una aguja para la extracción de la muestra líquida. El extremo abierto se sella térmicamente después de que se haya introducido la muestra líquida en el recipiente. El dispositivo de autonucleación se fija al interior del cuerpo tubular desplazado desde la entrada de manera que no puede ser contactado por una aguja que atraviese el puerto cerrado.
En la presente invención, el dispositivo de criopreservación comprende un contenedor para recibir y almacenar una muestra líquida, el contenedor tiene una abertura de ajuste de entrada en el contenedor y un adaptador montado en el ajuste, en donde el adaptador tiene una primera bifurcación tubular y una segunda bifurcación tubular, siendo que la segunda bifurcación tubular termina en un ajuste de enganche de tubo, y en donde un septo cierra la primera bifurcación tubular, en el cual el septo está adaptado para ser perforado por una aguja, y en donde el dispositivo de criopreservación está adicionalmente provisto de un tubo enganchado en un extremo al ajuste de enganche de tubo en la segunda bifurcación tubular y un cierre en el extremo opuesto del tubo, en donde dicho cierre es un septo adaptado para ser perforado por una aguja, y en donde dicho dispositivo de criopreservación está configurado para almacenamiento en condiciones de criopreservación a una temperatura tan baja como -196 °C.
El cierre para la segunda bifurcación es inicialmente un septo que puede ser perforado por una aguja para la introducción del líquido de muestra en el recipiente. El contenedor puede estar inicialmente a una presión por debajo de la atmosférica para mejorar la transferencia del líquido de muestra desde una jeringa hacia el recipiente. Una vez que se ha transferido el líquido de muestra, el tubo en la segunda bifurcación se sella térmicamente y se corta justo encima del accesorio de ajuste del tubo para formar un cierre final para la segunda bifurcación. El dispositivo cerrado puede ser sometido a un protocolo de congelación y descongelación. Después de descongelar, se puede utilizar una jeringa para extraer el líquido de muestra a través del septo en la primera bifurcación del adaptador.
Se contempla que la presente invención proporcionará un sistema simple y reproducible para la inducción de hielo y la reducción de la sobreenfriamiento en muchas aplicaciones diferentes de congelación de células. La descripción contempla dispositivos para la inducción extracelular controlada de cristales de hielo durante la criopreservación de células y tejidos mediante la construcción de dispositivos de matriz de estado sólido donde la nucleación del hielo ocurrirá de forma espontánea.
La presente descripción presenta varias ventajas sobre los sistemas y métodos anteriores.
Actualmente, la mayoría de los métodos para inducir la nucleación controlada del hielo son engorrosos, difíciles de reproducir y muchas veces pasados por alto, a pesar del amplio cuerpo de literatura que señala la mayor supervivencia de células y tejidos durante el proceso de congelación-descongelación cuando se emplea esta técnica. Hasta la fecha, los métodos más comúnmente utilizados han variado desde simplemente tocar el costado de un frasco<o>pajita con un objeto metálico enfriado (generalmente a -196 °C)<o>un hisopo de algodón, hasta dispositivos elaborados diseñados para rociar nitrógeno líquido en una pequeña área de la muestra. Sin embargo, incluso cuando se realiza en condiciones óptimas, la siembra mecánica de cristales de hielo de esta manera puede resultar en la incapacidad de inducir un cristal de hielo lo suficientemente grande como para permitir una propagación completa en toda la solución extracelular,<o>en daño y pérdida localizados de células debido a las enormes velocidades de enfriamiento observadas en la parte de la muestra más cercana a donde se dirige el objeto metálico<o>la pulverización de nitrógeno líquido en el contenedor.
Un objetivo de la invención es proporcionar dispositivos de criopreservación de células que faciliten significativamente la congelación de un líquido de muestra. Un beneficio de la invención es que reduce en gran medida la cantidad de células que se dañan durante la criopreservación. Otro beneficio es que permite la criopreservación de muestras de esperma de baja movilidad y/o baja concentración que no podrían ser preservadas utilizando técnicas anteriores.
Se describen y no se reivindican per se recipientes de criopreservación que son sistemas cerrados pero que son fácilmente accesibles para el almacenamiento de múltiples muestras sometidas a diferentes regímenes de congelación/descongelación.
Otros beneficios y objetos de la invención se harán evidentes al considerar la siguiente descripción escrita y las figuras adjuntas.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es una vista de un dispositivo de autonucleación que se describe, pero no se reivindica en<sí>mismo. La Figura 2 es una vista de recipientes de criopreservación conocidos que incorporan el dispositivo de autonucleación mostrado en la Figura 1.
La Figura 3a es una vista de un vial de sistema cerrado flexible para la criopreservación de muestras líquidas, que se describe, pero no se reivindica en<sí>mismo, con el vial mostrado en una condición inicial para la entrega de una muestra.
La Figura 3b es una vista del frasco mostrado en la Figura 3a, mostrado con el extremo del frasco sellado.
La Figura 4 es una vista en perspectiva de un dispositivo de criopreservación de células según la presente invención.
La Figura 5 es una vista en perspectiva de un adaptador utilizado en el dispositivo mostrado en la Figura 4.
La Figura 6 es una vista desglosada del dispositivo mostrado en la Figura 4.
Descripción de las modalidades ilustradas
En esta especificación se utilizan las siguientes unidades no SI, las cuales pueden convertirse a la unidad respectiva del SI<o>métrica según la siguiente tabla de conversión:
Con el fin de promover la comprensión de los principios de la invención, se hará referencia ahora a las modalidades ilustradas en los dibujos y descritas en la siguiente especificación escrita. Se entiende que no se pretende limitar el alcance de la invención. La invención está definida en las reivindicaciones adjuntas.
Se describe y no se reclama en<sí>mismo que se proporciona un dispositivo de autonucleación 10, como se muestra en la Figura 1, que implica el<uso>de composiciones capaces de nucleación de hielo. Una composición de nucleación de hielo 20 está unida a la superficie interna 14 de un tubo abierto hueco 12. El tubo puede estar hecho de plástico. Se introduce una cantidad suficiente de la composición de nucleación en el tubo para formar una matriz sólida dentro del tubo, permitiendo al mismo tiempo el flujo de líquido a través del tubo.
Se describe y no se reclama per se, que la composición de nucleación puede ser colesterol cristalino. El<uso>de composiciones de esteróles, y especialmente de colesterol, es conocido en otros campos, como se muestra en la Patente de Estados Unidos Núm. 4,928,493. En estos otros<usos>, las composiciones en polvo se disponen dentro de un contenedor para exponerse al agua y ayudar en la formación de hielo. Como se explica a continuación, se determinó después de experimentación que el colesterol cristalino no era tóxico para las células de la muestra y los líquidos que se preparaban para la criopreservación, como la sangre, las soluciones de células madre y el semen.
L<os>extremos 16 del tubo están sellados con una membrana permeable a la solución 18. En particular, la membrana es permeable al líquido de criopreservación e impermeable a las células<o>tejidos que se van a preservar. E<s>importante mantener la separación y evitar el contacto directo entre las células/tejido y la composición de nucleación de hielo. Las membranas en cada extremó también contendrán cualquier cristal de colesterol que pueda desprenderse del tubo y evitar que los cristales contaminen el líquido circundante. También es importante que la membrana permita el flujo libre del líquido de criopreservación hacia el tubo 12. El tubo y los intersticios en la composición de matriz sólida de nucleación también pueden llenarse inicialmente con un tampón isotónico.
Este dispositivo de autonucleación 10 se dimensiona adecuado para ser colocado en un recipiente de criopreservación como un vial 30<o>una bolsa de sangre 40, como se muestra en la Figura 2. El dispositivo puede estar libre dentro de los recipientes<o>puede estar fijado a una superficie interior. Dado que el dispositivo está diseñado como un sitió de nucleación para la formación de hielo, no necesita ser muy grande. El tubo 12 puede tener una longitud de 0,25 pulgadas y un diámetro de 0,0625 pulgadas. El recipiente de criopreservación puede llenarse con la muestra<o>espécimen particular, y una solución de criopreservación, si corresponde, como se conoce en el arte, mientras el dispositivo 10 permanece dentro del contenedor. El contenedor 30<o>40 es entonces sometido a un protocolo de criopreservación. Dado que el líquido de criopreservación está en contacto con la composición de nucleación de hielo 20 dentro del dispositivo, el hielo se formará espontáneamente dentro del tubo 12 del dispositivo 10 con poco<o>ningún sobreenfriamiento. El hielo luego continúa formándose en el tubo hacia la solución circundante, lo que resulta en la congelación de la suspensión celular con poco<o>ningún sobreenfriamiento y una formación mínima de hielo intracelular.
Se diseñó un primer experimentó para determinar que el colesterol unido físicamente al interior de los recipientes de almacenamiento criogénico inducirá la nucleación del hielo. La solución esterol de trabajó se preparó añadiendo 0,025 g de colesterol seco a 3 ml de metanol. La suspensión resultante se colocó luego en un bañó seco a 70 °C y se agitó intermitentemente hasta que todo el esterol sólido se disolviera. L<os>viales disponibles comercialmente fueron recubiertos con 100 |jl de la solución de esterol y colocados en el bañó seco a 75 °C para permitir que el metanol se evapóre y lograr la recristalización y adhesión del colesterol. L<os>viales fueron luego enjuagados con 1 ml de PBS, de 2-3 veces, para eliminar cualquier cristal suelto.
A continuación, se prepararon soluciones de glicerol al 6 % (para replicar un medio típico de criopreservación de bancos de esperma) y DMSO al 10 % (para replicar un sistema generalizado de criopreservación de líneas celulares) en PBS y se evaluaron enfriándolas a -5 °C/minuto en un vial recubierto de esterol y en un vial sin recubrimiento (control). Para lograr poder estadístico, se evaluaron 20 viales que contenían DMSO y l2 viales que contenían glicerol. La temperatura dentro de cada vial se monitorizó utilizando un termopar a intervalos de un segundo para permitir la resolución del punto de congelación de la solución y la liberación del calor latente de fusión.
L<os>resultados de este experimento indicaron que tanto en DMSO como en glicerol, el punto de congelación fue más alto y el cambio de temperatura durante el calor de fusión (AT) se redujo para los viales recubiertos con esterol. Estos resultados se resumen en la siguiente tabla.
En este experimento, también se observó cierto desprendimiento<o>astillamiento de los cristales (y cierto grado de disolución en las muestras de DMSO), lo que resultó en contaminación de la solución (posiblemente debido en parte a la manipulación física inevitable de los contenedores y las soluciones). Para abordar este problema, se proporcionó un dispositivo de autonucleación 10 en el que se recubrió el interior de un tubo hueco de 0,25 pulgadas con 100 |jl de solución de esterol y se permitió que se secara durante 48 horas. Un extremo del tubo fue sellado con un tapón de algodón permeable, mientras que el otro extremo del tubo fue adherido al interior de una tapa de frasco utilizando una resina epoxi y se permitió secar durante 14-24 horas. El stent fue diseñado para mantener el colesterol unido en un entorno aislado mientras permite que la solución (pero no las células) entren en contacto.
En un segundo experimento, se criopreservó semen humano utilizando este dispositivo de autonucleación 10 y se analizó específicamente para determinar si las muestras criopreservadas de acuerdo con la presente invención tenían una viabilidad post-descongelación más alta que el semen congelado utilizando viales de configuración estándar. En este experimento, se obtuvieron muestras de semen humano descartadas (20 muestras de 4 donantes) y se colocaron en una incubadora a 37 °C y con humedad (5 % de CO2, 95 % de aire) durante 30-60 minutos hasta que se licuaron. Una vez licuadas, las muestras se ajustaron a 5 ml utilizando PBS isotónico (equilibrado a 37 °C) y se evaluaron utilizando un dispositivo de análisis de semen asistido por computadora para medir y registrar el recuento inicial y la movilidad general. Las muestras fueron luego equilibradas al 6 % de glicerol en un tampón de yema de huevo de PRUEBA mediante un procedimiento de adición escalonada. Después de equilibrada, cada muestra se dividió en tres alícuotas de 1,5 ml y se depositó en (1) un frasco que contenía el dispositivo 10; (2) un frasco estándar para ser sembrado manualmente (control positivo); y (3) un frasco estándar que no recibiría ningún sembrado (control negativo).
Todas las muestras fueron colocadas en un congelador de velocidad controlada y enfriadas desde 22 °C hasta -8 °C a una velocidad de -5 °C/min. Después de 3 minutos a -8 °C, se utilizó un hisopo de algodón empapado en nitrógeno líquido para iniciar la siembra en el frasco sembrado manualmente. Después de 7 minutos adicionales a -8 °C, las muestras se enfriaron nuevamente a una velocidad de -10 °C por minuto hasta llegar a -40 °C. A -40 °C, la velocidad se aumentó a -20 °C por minuto, y a -80 °C las muestras se sumergieron en nitrógeno líquido (LN2).
Después de la congelación, las muestras se descongelaron colocándolas en la superficie de la mesa (correspondiente a una velocidad de descongelación de aproximadamente 300 °C/min). Una vez que el último de los hielos se había derretido, el glicerol fue diluido gota a gota durante un período de 10 minutos mediante la adición de PBS; luego, las muestras fueron lavadas y suspendidas nuevamente en PBS libre de glicerol. Finalmente, las muestras se incubaron (37 °C, atmósfera humidificada, 5 % CO2, 95 % aire) durante al menos una hora antes de evaluar el recuento y la movilidad después de la descongelación.
L<os>resultados de este segundo experimento indicaron que las muestras congeladas utilizando el dispositivo de autonucleación de la presente descripción retuvieron significativamente (<p><0,05) una motilidad más alta (66,1 ± 4,7 % media ± SEM) que aquellas congeladas utilizando la siembra manual (56,0 ± 3,8 %). Ambos enfoques de siembra fueron significativamente mayores (<p><0,05) que las muestras de control negativas no sembradas (43,4 ± 3,7 %), según se determinó utilizando técnicas de análisis de varianza.
En un tercer experimento se determinó que el colesterol unido no produciría efectos citotóxicos en el semen cultivado durante un período de tiempo prolongado. En este experimento, las muestras de semen licuado fueron expuestas a placas de cultivo que habían sido recubiertas con 100 j l de la solución de esterol. Las evaluaciones de movilidad realizadas a las 1,2, 4 y 8 horas de incubación no mostraron ningún efecto citotóxico significativo del contacto directo con el colesterol unido en los espermatozoides humanos durante 8 horas de cultivo.
A<s í>, se demuestra que el dispositivo de autonucleación 10 de la presente descripción produce una mejor movilidad post-descongelación que el<uso>de siembra manual<o>ninguna siembra en los procedimientos de criopreservación de esperma. Estos experimentos demostraron que la nucleación de hielo inducida por esteróles es un método consistente y confiable que puede reducir la sobreenfriamiento y, por lo tanto, disminuir el rápido aumentó de temperatura asociado a la formación "repentina" de cristales de hielo típica del evento de congelación de soluciones superenfriadas, con mejores resultados. El dispositivo y método de la presente descripción permite que las muestras permanezcan en la cámara de enfriamiento sin ser perturbadas durante toda la duración del congelamiento, ya que no es necesario utilizar las técnicas de siembra manual de la técnica anterior.
Se cree que el dispositivo y los métodos de la presente descripción son especialmente adecuados para los métodos estándar y comerciales de bancos de esperma. En un entorno estándar de un banco de esperma comercial, se procesan muchas muestras y las limitaciones de tiempo/personal no siempre permiten un enfriamiento a una velocidad controlada<o>un manejó cuidadoso que se puede lograr en el laboratorio. Se cree que la presente invención permite la criopreservación repetible de muestras con resultados que superan las técnicas actuales. Además, la presente invención puede permitir la congelación y recuperación exitosa de muestras con baja movilidad que normalmente serían excluidas de los grupos de donantes.
De manera similar, el dispositivo 10 y los métodos de la presente descripción pueden tener un impacto significativo en la capacidad de almacenar células madre hematopoyéticas y/o progenitoras criopreservadas (PCB HPC) de manera que permita la banca y el tiempo suficiente para realizar un adecuado cribado de enfermedades infecciosas, así como la tipificación HLA. La criopreservación ofrece la oportunidad de preservar las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de PCB de pacientes neonatales que podrían beneficiarse de la terapia génica,<o>que corren el riesgo de perder la función hematopoyética normal debido a enfermedades<o>iatrogénicamente a través de la radioterapia y/o quimioterapia. Recientemente, se han dirigido esfuerzos crecientes hacia la mejora de los métodos de selección de células progenitoras. La capacidad de preservar estas poblaciones de células progenitoras relativamente "puras" (por ejemplo, células que expresan la glicoproteína de superficie CD34) potencialmente minimiza el volumen total de la suspensión celular trasplantada. Sin embargó, debido a que el volumen de PCB típicamente adquirido es mucho menor que las muestras de médula ósea, se pueden obtener cantidades limitadas de C<p>H por kilogramo de peso del receptor. Esto hace que los métodos de criopreservación eficientes y óptimos para las C<p>H derivadas de PCB sean mucho más críticos que en el caso de otras fuentes de CPH (por ejemplo, médula ósea, sangre periférica).
El dispositivo de autonucleación produce medios más eficientes y óptimos para la criopreservación y recuperación de muestras delicadas que hasta ahora no estaban disponibles. Se cree que la integración del dispositivo 10 en la investigación y desarrollo en curso de métodos mejorados de criopreservación de células madre de sangre de cordón umbilical resultará en un enfoque único para preservar este tipo de células con una mayor recuperación y menos trabajó. Se han desarrollado protocolos experimentales para verificar la viabilidad en la criopreservación de PCB y sangre de cordón umbilical, así como semen de toro utilizado en instalaciones comerciales de inseminación artificial. Estos protocolos se describen en la solicitud provisional Núm. 60/814,982.
Un aspecto adicional de la presente descripción reconoce que la criopreservación de diversas células madre/progenitoras derivadas de la sangre del cordón umbilical puede requerir procedimientos completamente diferentes y, por lo tanto, contenedores de almacenamiento diferentes a los existentes en los procedimientos conocidos actualmente. Para la banca y almacenamiento de múltiples tipos de células derivadas de la sangre del cordón umbilical, puede ser óptimo utilizar protocolos de congelación muy diferentes, incluyendo diferentes tasas de enfriamiento/calentamiento. La tecnología actual se basa en bolsas criogénicas, algunas con múltiples compartimentos,<o>viales. Sin embargó, ambos sistemas tienen inconvenientes sustanciales. Las bolsas de múltiples cámaras no permiten utilizar diferentes tasas de enfriamiento<o>ACP en las diferentes cámaras. L<os>viales por<sí>solos no pueden considerarse sistemas "cerrados" a temperaturas criogénicas a menos que se utilice un envoltorio sellado térmicamente, cuya aplicación puede comprometer muestras sensibles.
Para superar esta limitación, se describe y no se reclama per se un recipiente de criopreservación en forma de un vial de sistema cerrado flexible 50, ilustrado en las Figuras 3a, b, que permite que la muestra se divida entre unidades separadas y se congele utilizando diferentes protocolos en un sistema cerrado. El frasco 50 incluye un cuerpo tubular flexible 52 que tiene un puerto 54 en un extremó. El puerto está sellado, preferiblemente con el mismo material que el cuerpo flexible, pero está adaptado para ser perforado por una aguja para extraer asépticamente la muestra después de descongelar.
Como se muestra en la Figura 3a, el extremó opuesto 56 del frasco está inicialmente abierto para permitir la introducción de una muestra líquida. Una vez que el frasco 50 ha sido llenado, el extremó 56 se cierra, por ejemplo, mediante una tira de sellado térmico 58, como se muestra en la Figura 3b. El frasco cerrado del sistema 5<o>está entonces disponible para congelar y almacenar una unidad única. Opcionalmente, pero preferiblemente, cada frasco incluye el dispositivo de autonucleación 10 descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 3a, el dispositivo 10 se adhiere preferiblemente a la pared interna del cuerpo 52 de manera que no sea accesible por una aguja que atraviese el puerto 52.
Se contempla que el frasco 50 se pueda utilizar para múltiples protocolos de congelación/descongelación en contenedores criogénicos discretos. A<s í>, un conjunto de viales 50 puede ser soportado en un dispositivo con el extremó abierto 56 disponible para la introducción de múltiples alícuotas de la muestra líquida. Cuando cada frasco está lleno, se sella el extremo correspondiente para proporcionar un frasco de sistema cerrado para criopreservación.
Según la presente invención, se proporciona un dispositivo de criopreservación 60, como se muestra en las Figuras 4-6, que además simplifica el proceso de obtención de una muestra y<su>preparación para la congelación. El dispositivo incluye un contenedor 62 de tamaño adecuado para recibir la muestra líquida. El contenedor 62 incluye un accesorio de entrada 64 en un extremo. Como se muestra en la Figura 6, se puede introducir un dispositivo de autonucleación 10 en el contenedor a través del accesorio de entrada 64.
El accesorio de entrada recibe un adaptador 65, mostrado en detalle en la Figura 5. El adaptador incluye una porción tubular inferior 66 que se dimensiona para ajustarse perfectamente dentro del accesorio de entrada 64. La porción inferior 66 puede sellarse al accesorio de entrada utilizando un epoxi<o>sellado térmico,<u>otros medios adecuados para proporcionar un sellado hermético al aire y líquido entre el contenedor 62 y el adaptador 65.
El adaptador incluye dos bifurcaciones tubulares 67 y 69. La bifurcación 67 termina en una porción final 68 que está configurada para enganchar un septo de aguja 72 (Figura 6). La segunda bifurcación 69 termina en un accesorio con púas 70. Este accesorio con púas 70 está en contacto sellado con el extremo 74a del tubo 74. El extremo libre 74b del tubo 74 recibe<su>propio septo de aguja 75. Tanto los septos de aguja 72 como 75 están configurados para proporcionar un sellado hermético al aire y líquido en el extremo de las dos bifurcaciones 67, 69. Además, los septos 72, 75 están configurados para ser perforados por una aguja de manera conocida y se sellan automáticamente una vez que se retira la aguja.
En una modalidad específica, se proporciona un sujetador de tubería 80 para estabilizar el tubo 74 cuando está enganchado al adaptador 65. El sujetador 80 incluye una porción 80 configurada para deslizarse sobre la bifurcación 67 del adaptador y una porción adjunta 84 que está configurada para deslizarse sobre el tubo 74, como se muestra en la Figura 4.
El contenedor 62 del dispositivo de criopreservación 60 se dimensiona adecuado para ser colocado en el separador estándar de "cartón de huevos" utilizado para transferir y almacenar muestras de células para<su>congelación y posterior descongelación. Se contempla que varios dispositivos de criopreservación 60 que llevan muestras de células de una fuente común puedan ser alojados en un separador de cartón para huevos común. En<uso>, el dispositivo 60 se almacena inicialmente en la configuración mostrada en la Figura 4, es decir, con el tubo 74 sobresaliendo hacia arriba desde el propio contenedor de la celda. El adaptador 65 se dimensiona de manera que no se extiende más allá del sobre vertical del contenedor y, por lo tanto, no interferirá con el almacenamiento de otros dispositivos similares 60. El tubo 74 se muestra con una curva que se extiende fuera del sobre vertical. Si los dispositivos en el contenedor de cartón de huevos están correctamente alineados, el tubo 74 no interferirá con otros contenedores de células. Sin embargo, de acuerdo con la modalidad preferida, se contempla que el tubo 74 sea flexible para que pueda ser dispuesto según sea necesario para evitar interferir con otros contenedores 62 en el mismo separador de cartón de huevos.
El tubo 74 es preferiblemente flexible por una razón adicional. En particular, la bifurcación 69 y el tubo adjunto 74 se utilizan para llenar el contenedor 62 del dispositivo 60. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, el tubo flexible 74 puede ser manipulado para permitir la introducción de una muestra de células recién extraída en el contenedor. Esta introducción ocurre en un aspecto al perforar el septum 75 con una aguja de una jeringa que contiene la muestra líquida extraída. Alternativamente, el septo 75 puede ser removible del extremo 74b del tubo flexible para que la muestra pueda ser inyectada directamente en el tubo sin tener que perforar una membrana. En ambos casos, el tubo flexible 74 facilita este paso de llenar el contenedor 62 ya que el tubo puede ser manipulado según sea necesario mientras el contenedor permanece en el contenedor de cartón para huevos.
Una vez que la muestra ha sido introducida en el contenedor 62, se contempla que la bifurcación 69 del adaptador quede sellada permanentemente. En la modalidad preferida, este sellado ocurre al sellar el tubo flexible justo encima del accesorio dentado 70. Una vez sellado, el resto del tubo se puede retirar ya que ya no es necesario. En una modalidad específica, se puede utilizar una barra de sellado por pellizco conocida para aplanar simultáneamente el tubo, sellar térmicamente la porción aplanada y cortar la porción sobrante. Este sellado y corte ocurre preferiblemente lo más cerca posible del accesorio con púas 70 para que ningún resto del tubo flexible 74 quede fuera del envoltorio vertical del contenedor 62.
E<s>deseable que los pasos de sellado y corte no comprometan la integridad estéril<o>el aspecto cerrado y sellado del dispositivo de criopreservación 60. Cuando la muestra se inyecta a través del septo 75, la bifurcación 69 permanece sellada durante todo el proceso, incluso después de retirar la aguja. Una vez que la bifurcación 69 está sellada, el dispositivo 60 que contiene la muestra líquida está listo para ser congelado y almacenado en la misma caja de huevos que albergó el dispositivo durante el paso de llenado. Cuando se desea recuperar la muestra, el dispositivo 60 puede ser retirado de la caja de huevos para descongelarse de forma individual, aparte de los otros dispositivos que se encuentran en la caja. El septo de aguja 72 de la bifurcación 67 proporciona la vía para la extracción estéril de la muestra. A<s í>, una aguja y una jeringa pueden ser utilizadas para perforar el septo y extraer la muestra líquida hacia la jeringa. El dispositivo vacío 60 puede ser desechado.
En otro aspecto de la invención, se contempla que el contenedor 62 del dispositivo de criopreservación 60 pueda estar provisto de un vacío inicial. Este vacío ayuda a la extracción de la muestra líquida durante el paso de llenado del contenedor del dispositivo 62. Dado que las aberturas de cada bifurcación 67, 69 están selladas por los septos correspondientes 72, 75, el vacío puede mantenerse durante un largo período de tiempo. Se puede proporcionar una tapa sobre cada septo para garantizar un sellado hermético al aire. En una modalidad específica, el vacío inicial en el contenedor 62 puede ser a una presión subatmosférica de entre 100 mmHg (absolutos) y aproximadamente 160 mmHg (absolutos).
El dispositivo de criopreservación 60 puede estar formado por materiales estándar utilizados en el campo de la banca de sangre y almacenamiento a largo plazo en condiciones criogénicas estándar (es decir, temperaturas tan bajas como -196 °C). Para poder encajar en los contenedores estándar de cartón para huevos, el dispositivo 60 (después de sellar el tubo flexible) debe ajustarse dentro de un diámetro de 10 mm y una altura de 90 mm. El tubo flexible 74 también debe ser capaz de soportar temperaturas criogénicas sin comprometer la capacidad de sellar térmicamente y cortar el tubo al sellar la bifurcación 69 del adaptador 65. En una modalidad específica, el tubo flexible está hecho de TYGON®<o>un material similar.
Si bien la invención ha sido ilustrada y descrita en detalle en los dibujos y en la descripción anterior, lo mismo debe considerarse como ilustrativo y no restrictivo en carácter.
Claims (11)
1. Un dispositivo de criopreservación (60) que comprende:
un contenedor (62) para recibir y almacenar una muestra líquida, dicho contenedor (62) tiene un accesorio de entrada (64) que se abre en dicho contenedor (62);
un adaptador (65), en donde dicho accesorio de entrada (64) recibe dicho adaptador (65) dentro de dicho accesorio de entrada (64), dicho adaptador (65) tiene una primera bifurcación tubular (67) y una segunda bifurcación tubular (69), dicha segunda bifurcación tubular (69) termina en un tubo (74) que se acopla al accesorio de enganche (70):
un septo (72) que cierra dicha primera bifurcación tubular (67), dicho septo (72) adaptado para ser perforado por una aguja;
un tubo (74) enganchado en un extremo a dicho accesorio de enganche de tubo (70) en dicha segunda bifurcación tubular (69); y
un cierre (75) en el extremo opuesto de dicho tubo (74), en donde dicho cierre (75) es un septo adaptado para ser perforado por una aguja, y
en donde dicho dispositivo de criopreservación está configurado para almacenamiento en condiciones de criopreservación a una temperatura tan baja como -196 °C.
2. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 1, en donde dicho accesorio de enganche de tubo (70) es un acoplamiento con púas.
3. El dispositivo de criopreservación de la reivindicación 1, en donde dicho tubo es un tubo flexible que tiene una longitud de manera que dicho extremo opuesto del tubo está por encima de dicho septo cerrando dicha primera bifurcación cuando el contenedor está en posición vertical.
4. El dispositivo de criopreservación de la reivindicación 1, en donde dicho tubo (74) es flexible y está adaptado para sellarse térmicamente justo encima del accesorio de enganche del tubo (70).
5. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 1, en donde dicho contenedor (62) está adaptado para mantenerse a una presión por debajo de la presión atmosférica.
6. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 1, en donde dicho tubo (74) comprende una longitud de tubería flexible y termosellable.
7. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 1, en donde dicho adaptador comprende una porción tubular inferior, en donde dicha porción tubular inferior se dimensiona para ajustarse perfectamente dentro de dicho accesorio de entrada.
8. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 6, en donde dicho tubo flexible y termosellable es operable para mantener un sellado térmico en condiciones de criopreservación a una temperatura tan baja<como -1>96<°C.>
9. El dispositivo de criopreservación (60) de la reivindicación 1, que además comprende un sujetador de tubería, dicho sujetador de tubería configurado para estabilizar dicha primera bifurcación tubular y dicho tubo (74).
10. El dispositivo de criopreservación de la reivindicación 1, en donde dicho septo (72) que cierra dicha primera bifurcación tubular (67) está adaptado para la extracción estéril de una muestra del contenedor.
11. Un método de almacenar una muestra líquida, el método que comprende los siguientes pasos:
introducir la muestra en un dispositivo de criopreservación (60) según cualquiera de las reivindicaciones 1 10;
sellar dicha segunda bifurcación tubular (69); y
congelar y almacenar el dispositivo de criopreservación (60).
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