BRPI0916366B1 - Anticorpo que se liga às variantes de peptídeos abeta, sua composição, seu uso, seu kit de diagnóstico, e linhagem celular de hibridoma - Google Patents

Abstract

anticorpo que se liga às variantes de peptídeos abeta, sua composição, seu uso e seu kit de dlagnóstico, bem como linhagem celular de hibridoma e método de diagnóstico in vitro. a presente invenção refere-se aos novos exames de diagnóstico para a diagnose de amiloidose, em particular doença de alzheimer, e aspectos relacionados. em particular, são fornecidos anticorpos monoclonais e exames de anticorpo.

Description

[001] A presente invenção refere-se aos novos exames de diagnóstico para a diagnose de amiloidose, um grupo de distúrbios e anormalidades associadas à proteína amiloide tal como doença de Alzheimer e aspectos relacionados. Em particular, um exame de anticorpo é fornecido.

[002] Amiloidose não é uma entidade de doença única, mas um grupo diverso de processos de doenças progressivas caracterizados pelos depósitos de uma cera, proteína do tipo amido chamada amiloide, a qual acumula em um ou mais órgãos ou sistemas corporais. Como os depósitos de amiloide acumulam, eles começam a interferir com a função normal do órgão ou sistema corporal. Existem pelo menos 15 tipos diferentes de amiloidose. As formas principais são amiloidose primária sem antecedente conhecido, amiloidose secundária que segue alguma outra condição, e amiloidose hereditária.

[003] Amiloidose secundária ocorre durante infecção crônica ou doença inflamatória, tal como tuberculose, uma infecção bacteriana chamada febre Mediterrânea familiar, infecções no osso (osteomielite), artrite reumatoide, inflamação do intestino delgado (ileíte granulomatosa), doença de Hodgkin e leprose.

[004] O depósito de amiloide inclui o componente (AP) da amiloide P (pentagonal), uma glicoproteína relacionada a soro normal de amiloide P (SAP), e glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), carboidratos complexos do tecido conjuntivo. Fibrilas da proteína amiloide, que totalizam cerca de 90% do material amiloide, compreendem um de diversos tipos de proteínas. Estas proteínas são capazes de dobrar nas assim chamadas fibrilas de folha "beta pregueadas", uma configuração única de proteína que exibe sítios de ligação para vermelho Congo resultando na propriedade de coloração única da proteína amiloide.

[005] Muitas doenças do envelhecimento estão baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide e são caracterizadas, em parte, pelo acúmulo de depósitos extracelulares de material amiloide ou tipo amiloide que contribui para a patogênese, assim como a progressão da doença. As doenças incluem, mas não estão limitadas a distúrbios neurológicos tais como deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tais como Demência Britânica Familiar (FBD) ou Demência Dinamarquêsa Familiar (FDD), neurodegeneração na Síndrome de Down, demência de corpo de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Demência-Parkinson de Guam. Outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início Adulto, amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[006] Embora a patogênese destas doenças possa ser diversa, seus depósitos característicos geralmente contêm muitos constituintes moleculares compartilhados. Em um grau significativo, isto pode ser atribuível à ativação local de vias pró-inflamatórias resultando em uma deposição concorrente de componentes complementos ativados, reagentes da fase aguda, moduladores imunes, e outros mediadores inflamatórios (McGeer et al., Tohoku J Exp Med. 174 (3): 269 - 277 (1994)).

[007] Recentemente, evidência acumulada demonstra o envolvimento de variantes do peptídeo Aβ na doença de Alzheimer. Biópsias-alvo apresentam a presença de Aβ 1-40 e Aβ 1-42 não somente no cérebro de pacientes com Alzheimer, mas também em placas senis de indivíduos não afetados. Entretanto, Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42 modificado com piroGlu e cortado no N-terminal é quase exclusivamente afogado dentro de placas de pacientes com doença de Alzheimer, tornando esta variável Aβ um marcador diagnóstico elegível e um alvo potencial para o desenvolvimento de fármacos.

[008] Atualmente, diversos fabricantes comerciais oferecem kits de ELISA que permitem uma detecção de Aβ 1-40/1-42 e Aβ N3pE- 40/Aβ N3pE-42 na faixa baixa de picograma (pg).

[009] Os cérebros dos pacientes com doença de Alzheimer (AD) são mofologicamente caracterizados pela presença de emaranhados neurofibrilares e pelos depósitos de peptídeos Aβ em estruturas cerebrais neocorticais (Selkoe, D.J. & Schenk, D. Doença de Alzheimer: entendimento molecular prevê terapêutica baseada em amiloide. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Peptídeos Aβ são liberados a partir da proteína amiloide precursora (APP) após clivagem sequencial por β- e Y-secretase. A clivagem por Y—secretase resulta na geração dos peptídeos Aβ 1-40 e Aβ 1-42, os quais diferem em seu C- terminal e exibem diferentes potenciais de agregação, formação de fibrila e neurotoxicidade (Shin, R.W. et al. Beta-proteína amiloide (Abeta) 1-40, mas não Abeta 1-42 contribui para a formação experimental de fibrilas amiloides da doença de Alzheimer no cérebro de ratos. J. Neurosci. 17, 8187 - 8193 (1997); Iwatsubo, T et al. Visualização de Abeta 42 (43) e Abeta 40 em placas senis com Abeta monoclonais específicos de extremidade: evidência que uma espécie inicialmente depositada é Abeta 42 (43). Neuron 13, 45 - 53 (1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. Depósito de Proteína beta amiloide (Abeta): Abeta 42 (43) precede Abeta 40 em síndrome de Down. Ann. Neurol. 37, 294 - 299 (1995); Hardy, J.A. & Higgins, G.A. Doença de Alzheimer: a hipótese de cascata amiloide. Science 256, 184 - 185 (1992); Roβner, S., Ueberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R. & Bigl, V. A regulação do metabolismo do precursor da proteína amiloide por mechanismos colinérgicos e sinalização do receptor de neurotrofina. Prog. Neurobiol. 56, 541 - 569 (1998)). Em adição à variabilidade C- terminal, peptídeos Aβ N-terminalmente modificados são abundantes (Saido, T.C. et al. Depósito dominante e diferencial de espécies distintas do peptídeo beta-amiloide, A beta N3(pE), em placas senis. Neuron 14, 457 - 466 (1995); Russo, C. et al. Mutações pré-senis-1 na doença de Alzheimer. Nature 405, 531 - 532 (2000); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Heterogeneidade amino- e carboxil- terminal dos peptídeos beta-amiloide depositados no cérebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173 - 176 (1996)). Parece que uma proporção principal dos peptídeos Aβ é submetida à truncagem N-terminal por dois aminoácidos, expondo um resíduo de glutamato, o qual é subsequentemente ciclizado em poliglutamato (pE), resultando em peptídeo Aβ3 (pE)-42 (Saido, T. C. et al. Depósito dominante e diferencial de espécies de peptídeos beta-amiloide distintas, A beta N3(pE), em placas senis. Neuron 14, 457 - 466 (1995); Saido, T. C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Heterogeneidade amino- e carboxil-terminal de peptídeos beta-amiloides depositado em cérebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173 - 176 (1996)). Alternativamente, pE pode ser formado seguindo β’-clivagem por BACE1, resultando em Aβ N11 (pE)-42 (Naslund, J. et al. Abundância relativa de variantes de peptídeo beta amiloide A de Alzheimer na doença de Alzheimer e envelhecimento normal. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8378 - 8382 (1994); Liu, K. et al. Caracterização do depósito de peptídeo Abeta11- 40/42 em cérebros com doença de Alzheimer e síndrome de Down jovem: implicação de espécies Abeta N-terminalmente truncadas na patogênese da doença de Alzheimer. Acta Neuropathol. 112, 163 - 174 (2006)). Em particular Aβ N3 (pE)-42 tem sido mostrado como sendo um constituinte principal dos depósitos Aβ na doença de Alzheimer esporádica e familiar (FAD) (Saido, T. C. et. al. Depósito dominante e diferencial de espécies de peptídeos beta-amiloide distintas, A beta N3(pE), em placas senis. Neuron 14, 457 - 466 (1995); Miravalle, L. et al. Espécies de peptídeo Abeta amino-terminalmente truncadas são o componente principal de placas de algodão. Biochemistry 44, 10810 - 10821 (2005)).

[010] Os peptídeos Aβ N3pE-42 coexistem com peptídeos Aβ 1 40/1-42 (Saido, T. C. et. al. Depósito dominante e diferencial de espécies de peptídeos beta-amiloide distintas, A beta N3(pE), em placas senis. Neuron 14, 457 - 466 (1995); Saido, T. C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Heterogeneidade amino- e carboxil-terminal de peptídeos beta-amiloides depositado em cérebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173 - 176 (1996)), e, baseado em um número de observações, poderia desempenhar um papel proeminente na patogênese de AD. Por exemplo, uma neurotoxicidade particular de peptídeos Aβ N3pE-42 tem sido descrita (Russo, C. et. al. Peptídeos beta amiloide modificados com piroglutamato --Abeta N3 (pE)-- afetam fortemente a sobrevivência dos astrócitos e neurônios cultivados. J. Neurochem. 82, 1480 - 1489 (2002) e a modificação com pE de peptídeos Aβ N-truncados confere resistência à degradação pela maioria das aminopeptidases assim como endopeptidases Aβ degradantes (Russo, C. et. al. Peptídeos beta amiloide modificados com piroglutamato --Abeta N3 (pE)-- afetam fortemente a sobrevivência dos astrócitos e neurônios cultivados. J. Neurochem. 82, 1480 - 1489 (2002); Saido, T. C. Doença de Alzheimer como doenças proteolíticas: anabolismo e catabolismo de beta-amiloide. Neurobiol. Aging 19, S69- S75 (1998)). A ciclização do ácido glutâmico em pE leva a uma perda de carga N-terminal resultando em agregação acelerada de Aβ N3pE coparado aos peptídeos Aβ não modificados (He, W. & Barrow, C. J. Os peptídeos Abeta 3-piroglutamil e 11-piroglutamil encontrados em placas senis têm melhor propensão à formação e agregação de folha beta in vitro do que A beta de comprimento completo. Biochemistry 38, 10871 - 10877 (1999); Schilling, S. et al. Na semeadura e oligomerização de peptídeos pGlu-amiloides (in vitro). Biochemistry 45, 12393 - 12399 (2006)). Assim, a redução da formação de Aβ N3pE-42 deveria desestabilizar os peptídeos tornando-os mais acessíveis para degradação e deveriam, por sua vez, prevenir a formação de agregados Aβ de peso molecular mais elevado e evidenciar a sobrevivência dos neurônios.

[011] Entretanto, por um longo tempo não foi sabido como a modificação pE dos peptídeos Aβ ocorria. Recentemente, foi descoberto que glutaminil ciclase (QC) é capaz de catalisar a formação de Aβ N3pE- 42 sob condições brandamente ácidas e que inibidores específicos de QC previne a geração de Aβ N3pE-42 in vitro (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H. -U. Glutaminil ciclases desvelam a atividade de glutaminil ciclase sob condições ácidas brandas. FEBS Lett. 563, 191 - 196 (2004); Cynis, H. et al. Inibição de glutaminil ciclase altera a formação de piroglutamato em células de mamíferos. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618 - 1625 (2006)).

[012] Demência de corpo de Lewy (LBD) é um distúrbio neurodegenerativo que pode ocorrer em uma pessoa mais velha do que 65 anos de idade, e tipicamente causa sintomas de deficiência cognitiva (pensamento) e mudanças de comportamento anormais. Os sintomas podem incluir deficiência cognitiva, sinais neurológicos, distúrbio do sono, e falência autonômica. Deficiência cognitiva é a característica apresentada de LBD na maioria dos casos. Pacientes têm episódios recorrentes de confusão que progressivamente pioram. A flutuação na habilidade cognitiva é geralmente associada com desvios nos graus de atenção e vigilância. Deficiência cognitiva e flutuações de pensamento podem variar durante minutos, horas, ou dias. Corpos de Lewy são formados a partir de proteínas de neurofilamento fosforiladas e não fosforiladas; eles contêm a proteína sináptica alfa-sinucleína assim como ubiquitina, a qual está envolvida na eliminação de proteínas danificadas ou anormais. Em adição aos corpos de Lewy, neuritos de Lewy, os quais são corpos de inclusão nos processos celulares das células nervosas, também podem estar presentes. Placas amiloides podem se formar no cérebro de pacientes afligidos com DLB, contudo eles tendem a ser menores em número do que o visto em pacientes com doença de Alzheimer. Emaranhados neurofibrilares, a outra marca micropatológica de AD, não são uma característica principal de LBD, mas estão frequentemente presentes em adição às placas amiloides.

[013] Esclerose lateral amiotrófica (ALS) é caracterizada pela degeneração dos neurônios motores superiores e inferiores. Em alguns pacientes com ALS, demência ou afasia podem estar presentes (ALS- D). A demência é mais comumente uma demência frontotemporal (FTD), e muitos desses casos têm inclusões ubiquitina-positivas, tau- negativas nos neurônios do giro denteado e camadas superficiais dos lobos frontais e temporais.

[014] Miosite de inclusão de corpo (IBM) é uma doença paralisante geralmente encontrado em pessoas acima de 50 anos, nas quais as fibras musculares desenvolvem inflamação e começam a atrofiar - mas nas quais o cérebro é poupado e os pacientes conservam seu intelecto completo. Duas enzimas envolvidas na produção da proteína β amiloide foram descobertas como sendo aumentadas dentro das células musculares dos pacientes com esta doença muscular progressiva, mais comum, em pessoas mais velhas, nas quais β amiloide é também aumentada.

[015] Outra doença que é baseada em ou associada com o acúmulo e depósito de proteína do tipo amiloide é a degeneração macular. A degeneração macular é uma doença comum de olho que causa a deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido da finura de papel no fundo do olho onde as células sensíveis à luz enviam sinais visuais para o cérebro). Uma visão nítida, clara, segura é processada pela mácula. Dano à mácula resulta no desenvolvimento de pontos cegos e visão embaçada ou distorcida. Degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a causa principal de deficiência visual nos Estados Unidos e para pessoas acima de 65 anos é a causa que leva à cegueira legal entre os Caucasianos. Aproximadamente 1,8 milhões de Americanos de 40 anos de idade ou mais velhos possuem AMD avançada, e outros 7,3 milhões de pessoas com AMD intermediária estão em risco substancial para perda de visão. O governo estima que em 2020 existirão 2,9 milhões de pessoas com AMD avançada. Vítimas de AMD estão geralmente surpresas e frustradas ao descobrirem que pouco é conhecido sobre as causas e tratamento desta condição de cegueira. Existem duas formas de degeneração macular: degeneração macular seca e degeneração macular úmida. A forma seca, na qual as células da mácula vagarosamente começam a se quebrar, é diagnosticada em 85 porcento dos casos de degeneração macular. Ambos os olhos são geralmente afetados por AMD seca, embora um olho possa perder a visão enquanto o outro olho permanece inafetado. Drusas, que são depósitos amarelos sob a retina, são sinais precoces comuns de AMD seca. O risco de desenvolver AMD seca ou AMD úmida avançada aumenta conforme o número de drusas aumenta. É possível para AMD seca avançar e causar a perda de visão sem se transformar na forma úmida da doença; entretanto, também é possível para AMD seca de estágio precoce se transformar na forma úmida.

[016] A forma úmida, embora ela só conte para 15 porcento dos casos, resulta em 90 porcento da cegueira, e é considerada AMD avançada (não existe nenhum estágio precoce ou intermediário de AMD úmida). AMD úmida é sempre precedida pela forma seca da doença. Conforme a forma seca piora, algumas pessoas começam a ter vasos sanguíneos anormais crescendo atrás da mácula. Esses vasos são muito frágeis e irão gotejar fluidos e sangue (portanto degeneração macular úmida), causando dano rápido à mácula. A forma seca de AMD irá em geral inicialmente causar uma visão ligeiramente embaçada. O centro de visão em particular pode então se tornar embaçado e esta região cresce mais larga à medida que a doença progride. Nenhum sintoma pode ser notado se somente um olho é afetado. Na AMD úmida, linhas retas podem aparecer onduladas e a perda de visão central pode ocorrer rapidamente.

[017] A diagnose de degeneração macular tipicamente envolve um exame de vista dilatado, teste de acuidade visual, e uma visão do fundo do olho usando um procedimento chamado fundoscopia para auxiliar na diagnose de AMD, e - se AMD úmida é suspeita - angiografia de fluoresceína pode também ser realizada. Se AMD seca alcança os estágios avançados, não existe nenhum tratamento atual para prevenir a perda de visão. Entretanto, uma alta dose de uma fórmula específica de antioxidantes e zinco pode atrasar ou prevenir AMD intermediária de progredir para o estágio avançado. Mucogen® (injeção de pegaptanib de sódio), fotocoagulação a laser e terapia fotodinâmica pode controlar o crescimento anormal de vasos sanguíneos e sangramento da mácula, o que é útil para algumas pessoas que têm AMD úmida; entretanto, a visão que já está perdida não será restabelecida por estas técnicas. Se a visão já está perdida, existe auxílio de baixa visão que pode ajudar a melhorar a qualidade de vida.

[018] Um dos primeiros sinais de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é o acúmulo de depósitos extracelulares conhecidos como drusas entre a lâmina basal do epitélio da retina pigmentado (RPE) e membrana de Bruch (BM). Estudos recentes conduzidos por Anderson et al. confirmaram que as drusas continham beta amiloide. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243 - 256).

[019] O objetivo da presente invenção é estabelecer uma técnica de detecção altamente sensitiva e concomitantemente robusta que permite determinação quantitativa de variantes Aβ, em particular peptídeos pGlu-Aβ, em amostras biológicas, por exemplo, amostras de soro ou de licor, preferivelmente amostras de soro. Isto é um desafio enorme, levando em consideração à baixa abundância de peptídeos Aβ no sangue. Tendo tal técnica de detecção disponível é, entretanto, um pré-requisito para estudar a eficácia de inibidores de molécula pequena em programas de varredura de fármaco.

[020] A presente invenção fornece novos métodos e composições compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente efetivos, incluindo anticorpos quiméricos e fragmentos dos mesmos, incluindo anticorpos parcialmente ou completamente humanizados e fragmentos dos mesmos, tendo a habilidade de reconhecer especificamente e de se ligar aos epítopos específicos de uma faixa de antígenos β-amiloides, em particular pGlu-Aβ, que podem ser apresentados ao anticorpo em uma forma monomérica, dimérica, trimérica, etc, ou polimérica, na forma de um agregado, fibras, filamentos, ou na forma condensada de uma placa. Os anticorpos capacitados pelos ensinamentos da presente invenção são particularmente úteis para diagnose de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associado à formação da placa amiloide, incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tais como Doença de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); complexo Demência-Parkinson de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo holandês, doença de Parkinson, demência relacionada com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica); Diabetes de Início Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outros, incluindo degeneração macular, para nomear apenas poucos.

[021] Para satisfazer todas as demandas mencionadas acima, uma técnica baseada em ELISA seria especialmente preferível. A tarefa foi iniciada com ELISA de Aβ N3pE, por que para esta variante Aβ um sistema de ELISA já está comercialmente disponível (Kit de Ensaio Amiloide β (N3pE) Humano -IBL, Código N° 27716), o qual é para ser usado como referência e controle de qualidade interno. A captura do peptídeo Aβ N3pE-40 foi feita com o hAβ (x-40) ELISA (HS) de TGC (The Genetics Company, Inc., Wagistrasse 23, 8952 Schlieren, área de Zurich, Suíça), o que deveria facilitar e apressar o processo de desenvolvimento.

Sumário da Invenção

[022] A presente invenção pertence em particular a anticorpos ou variantes dos mesmos, os quais são caracterizados pelo fato de que eles se ligam ao Aβ-peptfdeo com uma alta afinidade. A referida alta afinidade significa no contexto da presente invenção uma afinidade de um valor de KD de 10-7 M ou melhor, preferivelmente um valor de KD de 10-8 M ou melhor, e ainda mais preferencialmente um valor de KD de 109 a 10-12 M.

[023] Em particular o anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal e é selecionado do seguinte grupo Aβ 5-5-6 Aβ 6-1-6 Aβ 17-4-3 Aβ 24-2-3

[024] O anticorpo de acordo com a presente invenção é especialmente útil em um método de diagnóstico para detectar amiloidose, em particular doença de Alzheimer.

Descrição das Figuras Figura 1 A) Detecção de 10 ng/ml de amiloide β N3pE-40 por concentrações crescentes do anticorpo pGlu-6166 (clone 12-1). B) Determinação da concentração mais alta do anticorpo pGlu-6166 (clone 12-1) requerido para a detecção de 10 ng/ml de amiloide β N3pE-40. Figura 2

[025] Análise de Dot Blot dos sobrenadantes da cultura celular do hibridoma de clones que produzem IgG individuais.

Figura 3

[026] Análise PepSpot dos Clones de Célula de Hibridoma pGlu- 6166 e anticorpo IBL-Aβ N3pE.

Figura 4

[027] SDS-PAGE de 12% de 20μg de anticorpo pGlu-6166 e sobrenadantes de cultura de célula de hibridoma.

Figura 5

[028] Análise biacore de sobrenadantes de cultura de célula de hibridoma. Um revestimento de cursos de ligação monitorados é ilustrado graficamente.

Figura 6

[029] Sensogramas de interação do clone 6-1-6 do anticorpo anti- AβN3pE com AβpE3-40.

Figura 7

[030] Sensogramas de interação do clone 24-2-3 do anticorpo anti- AβN3pE com AβpE3-40.

Figura 8

[031] N3pE-ELISA para o clone 6-1-6, curva padrão de AβpE3-40.

Figura 9

[032] Sensogramas do clone 6-1-6 do anticorpo N3pE.

Figura 10

[033] Quantificação de AβpE3-42 usando o método de neutralização por diluição de 1:20 em tampão EIA, titulação de pH com 860 μl de Tris 3,5 M.

Figura 11 Secções de cérebro corado a partir de pacientes com doença de Alzheimer (AD) (A) Cérebro de um paciente com AD esporádica (SAD) corado com um anticorpo 6E10 anti-Aβ, reconhecendo Aβ total, (B) Cérebro de um paciente com AD esporádica (SAD) corado com o clone 24-2-3 do anticorpo N3pE, reconhecendo AβpE3-x, (C) Cérebro de um paciente com AD familiar (FAD) corado com o clone 24-2-3 do anticorpo N3pE, reconhecendo AβpE3-x, Descrição Detalhada da Invenção Definições

[034] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo de forma que eles exibam a atividade biológica desejada. O anticorpo pode ser um IgM, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgD, IgA ou IgE, por exemplo. Preferencialmente, entretanto, o anticorpo não é uma anticorpo IgM.

[035] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente o antígeno de ligação ou parte variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem FAB, Fab', F(ab’)2, e fragmentos Fv: diacorpos; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir fragmentos de anticorpo.

[036] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto pela possibilidade de mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em quantidades mínimas. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados a um único sítio antigênico. Além disso, em contraste ao "anticorpo policlonal", preparações que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Em adição a sua especificidade, os anticorpos monoclonais podem frequentemente ser vantajosos uma vez que eles são sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. O "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante geralmente bem conhecidos. Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.

[037] Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante das cadeias é idêntico a ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de outra espécie ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, de forma que eles exibam a atividade biológica desejada.

[038] Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, FAB, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antígeno) as quais contêm uma sequência mínima derivada a partir de uma imunoglobulina não-humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do receptor são trocados por resíduos do CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de leitura Fv da imunoglobulina humana são trocados por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de leitura (framework) ou de CDR importadas.

[039] Essas modificações são feitas para ainda refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não- humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, veja Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1998): e Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2: 593-596 (1992). O anticorpo humanizado inclui um anticorpo Primatizado® onde a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada a partir de um anticorpo produzido através da imunização de macacos com o antígeno de interesse.

[040] "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, onde esses domínios são apresentados em uma cadeia de polipeptídeo única. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL o que permite o sFv formar a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão de sFv veja Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore Eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

[041] O termo "diacorpos" se refere a fragmentos de anticorpo pequenos com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VD) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VD). Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios de complementaridade de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

[042] Um anticorpo "isolado" é um que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir nos usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para melhor que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido interna ou N-terminal, pelo uso de um sequenciador automático, ou (3) para homogeneidade por SDS- PAGE sob condições redutoras ou não redutoras, usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, corante de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ com células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Ordinariamente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[043] Como usado aqui, as expressões "célula", "linhagem celular", e "cultura celular" são usadas alternadamente e todas estas designações devem incluir a progenia. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem objeto celular primário e cultura derivada do mesmo sem respeito ao número de transferências. Também é entendido que toda a progenia pode não ser precisamente idêntica ao conteúdo do DNA, devido às mutações deliberadas ou inadvertidas. A progenia mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como feita a varredura para a célula originalmente transformada é incluída. Onde designações distintas são pretendidas, isto estará claro a partir do contexto.

[044] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína", como usados aqui, são permutáveis e estão definidos para significar uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação de peptídeo.

[045] Os termos "um", "uma" e "a/o" como usado aqui são definidos para significar "um ou mais’ e incluir o plural, a menos que o contexto seja inapropriado.

[046] A linguagem "doenças e distúrbios que são causados por ou associados a proteínas amiloides ou do tipo amiloide" inclui, mas não está limitada a doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de proteínas do tipo amiloide no estado monomérico, fibrila, ou polimérico, ou qualquer combinação dos três. Tais doenças e distúrbios incluem, mas não estão limitados a, amiloidose, tumores endócrinos, e degeneração macular.

[047] O termo "amiloidose" refere-se a um grupo de doenças e distúrbios associados à formação da placa amiloide, incluindo, mas não limitados a, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, tais doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como Doença de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tais como, por exemplo, deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer esporádica, demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); complexo Demência-Parkinson de Guam; formas familiares da doença de Alzheimer como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD); assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica); miosite de corpo de inclusão (IBM); Diabetes de Início Adulto; e amiloidose cardíaca senil; e várias doenças oculares incluindo degeneração macular, neuropatia ótica relacionada com drusas, e catarata devido ao depósito beta-amiloide.

[048] "Amiloide β, Aβ ou/β-amiloide" é um termo reconhecido na técnica e se refere a proteínas e peptídeos β amiloides, proteína precursora de β amiloide (APP), assim como modificações, fragmentos e quaisquer equivalentes funcionais dos mesmos. Em particular, por amiloide β, como usados aqui, significa qualquer fragmento produzido por clivagem proteolítica de APP, mas especialmente aqueles fragmentos que são envolvidos em ou associados às patologias amiloides incluindo, mas não limitados a, Aβ1-38, Aβ1-40, Aβ1-42. As sequências de aminoácido desses peptídeos Aβ são como a seguir:

[049] Aβ1-42 (SEQ ID N°: 1): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His- Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala- Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

[050] Aβ1-40 (SEQ ID N°: 2): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His- Gln-Lys--Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile- Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

[051] Aβ1-38 (SEQ ID N°: 3): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His- Gln-Lys--Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile- Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

[052] "pGlu-Aβ" ou "Aβ N3pE" se refere a formas N-terminalmente truncadas de Aβ, que começam no resíduo de ácido glutâmico na posição 3 na sequência de aminoácido de Aβ, e onde o referido resíduo de ácido glutâmico é ciclizado para formar um resíduo de ácido piroglutâmico. Em particular, por pGlu-Aβ como usado aqui significa aqueles fragmentos que são envolvidos em ou associados às patologias amiloides incluindo, mas não limitados a Aβ3-38, Aβ3-40, Aβ3-42.

[053] As sequências das formas N-terminalmente truncadas de Aβ, Aβ3-38, Aβ3-40, Aβ3-42 são como a seguir:

[054] Aβ3-42 (SEQ ID N°: 4): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

[055] Aβ3-40 (SEQ ID N°: 5): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-- Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

[056] Aβ3-38 (SEQ ID N°: 6): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-- Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly

[057] Em particular, a presente invenção pertence aos seguintes itens: 1. Anticorpo caracterizado pelo fato de que ele se liga aos peptídeos Aβ ou variantes do mesmo, preferivelmente com alta afinidade. 2. Anticorpo, de acordo com o item 1, onde a referida alta afinidade significa um valor de constante de dissociação (KD) de 10-7 M ou melhor. 3. Anticorpo, de acordo com o item 1 ou 2, onde o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 4. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo tem uma sequência de nucleotídeo selecionada de SEQ ID N°s: 49, 53, 57 e 61, ou uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°s: 50, 54, 58, e 62. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo tem uma sequência de nucleotídeo selecionada de SEQ ID N°s: 51, 55, 59 e 63, ou uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°s: 52, 56, 60, e 64. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 49 ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 50, e onde a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 51, ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 52. 7. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 53 ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 54, e onde a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 55, ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 56. 8. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 57 ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 58, e onde a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 59, ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 60. 9. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 61 ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 62, e onde a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo tem a sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 63, ou a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 64. 10. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde o referido anticorpo é selecionado do seguinte grupo: Aβ 5-5-6 (N° de Depósito DSM ACC 2923) Aβ 6-1-6 (N° de Depósito DSM ACC 2924) Aβ 17-4-3 (N° de Depósito DSM ACC 2925) Aβ 24-2-3 (N° de Depósito DSM ACC 2926) ou variantes funcionais dos mesmos. 11. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde o referido anticorpo é Aβ 6-1-6 (N° de Depósito DSM ACC 2924). 12. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde o referido anticorpo é Aβ 24-2-3 (N° de Depósito DSM ACC 2926). 13. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, onde o referido anticorpo é um anticorpo humanizado ou quimérico, ou um fragmento de anticorpo o qual retenha a alta afinidade. 14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, para o uso na detecção do peptídeo Aβ ou variantes do mesmo. 15. Anticorpo, de acordo com o item 14, onde as referidas variantes são selecionadas a partir do seguinte grupo: pGlu-Aβ3-38 pGlu-Aβ3-40 pGlu-Aβ3-42, e variantes pGlu-Aβ3-x , onde x é um número inteiro entre 10 e 42; preferivelmente 18 e 42, mais preferivelmente 30 e 42. 16. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é humano. 17. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é um diacorpo ou um anticorpo de cadeia única que retenha a alta afinidade. 18. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual se liga ao epítopo ligado pelos anticorpos definidos no item 15. 19. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual possui as regiões de determinação de complementaridade dos anticorpos conforme definido no item 15. 20. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é marcado. 21. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é imobilizado em uma fase sólida. 22. Anticorpo viável a partir de qualquer uma das linhagens celulares do hibridoma DSM ACC 2923, DSM ACC 2924, DSM ACC 2925, DSM ACC 2926. 23. Composição compreendendo o anticorpo como definido em qualquer um dos itens precedentes. 24. Composição, de acordo com o item 23, para o tratamento, prevenção ou impedimento de amiloidose. 25. Composição, de acordo com o item 23 ou 24, onde a referida amiloidose é uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda, doença de Alzheimer e neurodegeneração na Síndrome de Down. 26. Composição, de acordo com o item 23 ou 24, onde a referida amiloidose é doença de Alzheimer esporádica ou demência de Alzheimer Familiar. 27. Composição, de acordo com o item 26, onde a demência de Alzheimer Familiar é Demência Britânica Familiar ou Demência Dinamarquêsa Familiar. 28. Linhagem celular de hibridoma DSM ACC 2923. 29. Linhagem celular de hibridoma DSM ACC 2924. 30. Linhagem celular de hibridoma DSM ACC 2925. 31. Linhagem celular de hibridoma DSM ACC 2926. 32. Uso do anticorpo como definido em qualquer um dos itens de 1 a 22 ou da composição como definida em qualquer um dos itens de 23 a 27 em um método diagnóstico ou terapêutico. 33. Uso, de acordo com o item 32, para o diagnóstico de uma doença ou condição associada à amiloide. 34. Uso, de acordo com o item 33, onde a referida amiloidose é uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda, doença de Alzheimer e neurodegeneração na Síndrome de Down. 35. Uso, de acordo com o item 33, onde a referida amiloidose é doença de Alzheimer esporádica ou demência de Alzheimer Familiar. 36. Uso, de acordo com o item 35, onde a demência de Alzheimer Familiar é Demência Britânica Familiar ou Demência Dinamarquesa Familiar. 37. Método de diagnóstico in vitro para a diagnose de uma doença ou condição associada à amiloide, particularmente doença de Alzheimer, compreendendo as seguintes etapas: pôr em contato um anticorpo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 22 com uma amostra a partir de um indivíduo suspeito de estar afligido com a referida doença ou condição, e detectar a ligação do anticorpo a uma proteína pGlu- amiloide, preferivelmente o peptídeo pGlu-Aβ a partir da amostra. 38. Kit diagnóstico compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 22, e instruções para uso, e - opcionalmente - (a) substância(s) biologicamente ativa(s) adicional(is). 39. Kit diagnóstico, de acordo com o item 32, onde a referida substância biológica adicional é um inibidor de glutamina ciclase. 40. Oligonucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 23 a 48.

[058] Os anticorpos da invenção podem ser úteis para o diagnóstico de amiloidose.

[059] Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados em uma fase sólida tal como uma resina de Sephadex ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é posto em contato com uma amostra contendo o peptídeo Aβ (ou fragmento do mesmo) a ser purificado, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra, exceto o peptídeo Aβ, o qual está ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar o peptídeo Aβ do anticorpo.

[060] Anticorpos antipeptídeo Aβ podem também ser úteis em ensaios de diagnóstico para peptídeo Aβ, por exemplo, detectando sua ocorrência em células, tecidos, ou soro específicos. Assim, os anticorpos podem ser usados no diagnóstico de amiloidose, em particular uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD), ou demências de Alzheimer familiares (FAD), tal como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), e neurodegeneração em Síndrome de Down; preferencialmente doença de Alzheimer.

[061] Para aplicações diagnósticas, o anticorpo tipicamente será marcado com uma fração detectável. Numerosas marcações estão disponíveis que podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I, 3H, e 131I. O anticorpo pode ser marcado com um radioisótopo usando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Gütigen et al., Ed., Wiley-Interscience. Nova Iorque, New York Pubs., (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida usando contagem de cintilação. (b) Marcações fluorescentes tais como quelatos de terra rara (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho do Texas estão disponíveis. As marcações fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpo usando as técnicas apresentadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro. (c) Várias marcações de enzima-substrato estão disponíveis. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma mudança na fluorescência estão descritas acima. O substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz, a qual pode ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um receptor de fluorescência. Exemplos de marcações enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana; Patente Americana No. 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de raiz forte (HRPO), fosfatase alcalina. 0-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases sacarídicas (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. Técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em O’Sullivan et al., Métodos para a Preparação de Conjugados Enzima-Anticorpo para o uso em Imunoensaio Enzimático, em Métodos em Enzima (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, 73: 147-166 (1981).

[062] Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de raiz forte (HRPO) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, onde a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB); (ii) Fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfatase como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferi1-β-D-galactosidase.

[063] Numerosas outras combinações enzima-substrato estão disponíveis para aqueles versados na técnica.

[064] Às vezes, a sonda é indiretamente conjugada com o anticorpo. A pessoa versada na técnica estará ciente das várias técnicas para alcançar isto. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três amplas categorias das marcações mencionadas acima pode ser conjugada com avidina, ou vice versa. A biotina se liga seletivamente à avidina e assim, a sonda pode ser conjugada com o anticorpo nesta maneira indireta. Alternativamente, para alcançar a conjugação indireta da sonda com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcações mencionadas acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo antidigoxina). Assim, a conjugação indireta da sonda com o anticorpo pode ser alcançada.

[065] O anticorpo Aβ não necessita ser marcado, e a presença dos mesmos pode ser detectada usando um anticorpo marcado, o qual se liga ao anticorpo Aβ.

[066] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press. Inc., 1987).

[067] Ensaios de ligação competitiva conta com a habilidade de um padrão marcado para competir com o analito da amostra de teste para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade do peptídeo Aβ na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade do padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade do padrão que se torna ligado, os anticorpos geralmente são insolubilizados antes ou depois da competição, de forma que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrão e analito que permanecem não ligados.

[068] Ensaios de sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epítopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio de sanduíche, o analito da amostra de teste está ligado por um primeiro anticorpo que está imobilizado em um suporte sólido, e desde então um segundo anticorpo se liga ao analito, formando assim um complexo insolúvel de três partes. O segundo anticorpo pode por si só ser marcado com uma fração detectável (ensaios de sanduíche diretos) ou podem ser medidos usando um anticorpo anti-imunoglobulina que seja marcado com uma fração detectável (ensaio de sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo preferível de ensaio de sanduíche é um ensaio de ELISA, em cujo caso a fração detectável é uma enzima.

[069] Para imuno-histoquímica, a amostra de tecido pode ser fresca ou congelada ou pode ser embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo,

Kits de Diagnóstico

[070] Como uma questão de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser fornecido em um kit, isto é, uma combinação de reagentes embaladas em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit irá incluir substratos e co-fatores exigidos pela enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio, ou um tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamente para fornecer concentrações na solução de reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pó seco, usualmente liofilizado, incluindo excipientes os quais, em solução, irão fornecer uma solução reagente tendo a concentração apropriada.

[071] O kit de diagnóstico de acordo com a invenção pode conter uma substância biologicamente ativa adicional como descrito abaixo. Especialmente preferidos para o uso no kit diagnóstico são os inibidores de glutaminil ciclase.

[072] O kit de diagnóstico da invenção é especialmente útil para a detecção e o diagnóstico de doenças e condições associadas a amiloide, em particular doenças neurodegenerativas selecionadas a partir do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente doença de Alzheimer.

[073] A presente invenção pertence em particular aos anticorpos que são caracterizados pelo fato de que se ligam ao peptídeo Aβ com uma alta afinidade. A presente invenção também pertence aos anticorpos que são caracterizados pelo fato de que se ligam aos peptídeos Aβ ou variantes dos mesmos com uma alta finidade. A referida alta afinidade significa no contexto da presente invenção, uma afinidade de um valor de KD de 10-7 M ou melhor, preferencialmente um valor de KD de 10-8 M ou melhor, e ainda mais preferencialmente um valor de KD de 10-9 M - 10-12 M. Portanto, os anticorpos inventivos se ligam ao peptídeo Aβ com uma afinidade mais alta do que os anticorpos previamente conhecidos.

[074] Em particular, o anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal e é selecionado a partir do grupo a seguir Aβ 5-5-6 (DSM ACC 2923) Aβ 6-1-6 (DSM ACC 2924) Aβ 17-4-3 (DSM ACC 2925) Aβ 24-2-3 (DSM ACC 2926)

[075] O anticorpo de acordo com a presente invenção é especialmente útil em um método diagnóstico para detectar amiloidose, em particular, uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente doença de Alzheimer.

[076] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo pode ser humanizado ou é um anticorpo quimérico ou é um anticorpo humano.

[077] Além disso, o anticorpo conforme selecionado a partir do grupo mencionado acima, também pode ser uma variante funcional do referido grupo.

[078] No contexto da presente invenção, uma variante de um peptídeo p-Glu-Aβ é em particular p-Glu-Aβ3-38, p-Glu-Aβ3-40, p-Glu-Aβ3-42

[079] Variantes adicionais de peptídeos Aβ são todas as variantes p-Glu-Aβ3-x, as quais têm mostrado acumular no cérebro como uma consequência da doença de Alzheimer ou doença de Alzheimer precedente. X é definido como um número inteiro entre 10 e 42, por exemplo, no p-Glu-Aβ3-42 acima, "42" seria o número inteiro para "x".

[080] No contexto da presente invenção, uma "variante funcional" do anticorpo inventivo é um anticorpo que retém as capacidades de ligação, em particular as capacidades de ligação com alta afinidade ao peptídeo p-Glu-Aβ3-x, ou variante funcional do mesmo. A provisão de tais variantes funcionais é conhecido na técnica e abrange as possibilidades mencionadas acima, as quais foram indicadas sob a definição de anticorpos e fragmentos dos mesmos.

[081] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, como definido acima.

[082] Em outra modalidade preferida, o anticorpo inventivo é um anticorpo que se liga ao epítopo que é ligado pelos anticorpos como definido acima, em particular o anticorpo 5-5-6, o anticorpo 6-1-6, o anticorpo 17-4-3, e o anticorpo 24-2-3.

[083] Em outra modalidade preferida, o anticorpo da invenção é um anticorpo que tem regiões de determinação de complementaridade (CDRs) dos anticorpos definidos acima. Preferencialmente, o anticorpo pode ser marcado; marcações possíveis são aquelas conforme mencionadas acima e todas aquelas conhecidas por uma pessoa versada na técnica dos usos diagnósticos de anticorpos em particular.

[084] Preferencialmente, o anticorpo é imobilizado em uma fase sólida.

[085] A presente invenção também abrange um anticorpo que é obtenível a partir da linhagem celular de hibridoma 6-1-6 (DSM ACC 2924).

[086] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende o anticorpo conforme definido acima. Em particular, a referida composição é uma composição para uso diagnóstico, especialmente para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente doença de Alzheimer; em particular pela detecção do peptídeo Aβ ou variantes do mesmo em uma amostra biológica.

[087] Em outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção e como descrito aqui antes ou um fragmento do mesmo, exibe uma afinidade de ligação a um oligômero, fibra, fibrila ou filamento Aβ, o qual é pelo menos 2 vezes, particularmente pelo menos 4 vezes, particularmente pelo menos 10 vezes, particularmente pelo menos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, mas especialmente pelo menos 25 vezes mais alta do que a afinidade de ligação a um monômero Aβ.

[088] Em ainda outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo é fornecido como descrito antes aqui, cujo anticorpo substancialmente se liga ao agregado Aβ, incluindo placas Aβ, nos mamíferos, particularmente o cérebro humano, mas, preferencialmente, não demonstra qualquer reatividade cruzada significativa com a proteína precursora amiloide (APP).

[089] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, ou o anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, é fornecido como descrito antes aqui, cujo anticorpo substancialmente se liga ao amiloide polimérico solúvel, particularmente amiloide β (Aβ), incluindo monômeros Aβ, nos mamíferos, particularmente o cérebro humano, mas, preferencialmente, não demonstra qualquer reatividade cruzada significativa com a proteína precursora amiloide (APP).

[090] A presente invenção também se refere a formas humanizadas dos anticorpos como definido acima, composições compreendendo os referidos anticorpos humanizados e o uso das referidas composições para o tratamento de amiloidose, especialmente para o tratamento de doença neurodegenerativa em um mamífero, em particular em um ser humano. A referida doença neurodegenerativa é em particular selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down. Preferencialmente, a referida doença neurodegenerativa é doença de Alzheimer.

[091] A presente invenção também é direcionada às seguintes linhagens celulares de hibridoma 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3 e 24-2-3.

[092] A presente invenção também pertence ao uso do anticorpo ou da composição compreendendo o anticorpo, ambos conforme definido acima, para o uso em um método de diagnóstico in vitro. Em particular, este método diagnóstico é direcionado para a diagnose de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente doença de Alzheimer; especialmente pela detecção do peptídeo Aβ ou variantes do mesmo em uma amostra biológica.

[093] Preferivelmente, a referida amostra é uma amostra de soro.

[094] De acordo com outra modalidade preferida, a referida amostra é uma amostra de licor ou de fluido cerebrospinal (CSF).

[095] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção pertence ao seguinte método:

[096] Método de diagnóstico in vitro ou in situ para a diagnose de uma doença ou condição associada à amiloide, preferivelmente doença de Alzheimer, compreendendo as seguintes etapas:

[097] Pôr em contato um anticorpo de acordo com a invenção com uma amostra, preferencialmente selecionada de uma amostra de soro, licor ou CFS, mais preferencialmente uma amostra de soro; ou uma parte do corpo ou área do corpo específica de um indivíduo suspeito de ser afligido com a referida condição ou doença, e

[098] Detectar a ligação do anticorpo a uma proteína pGlu- amiloide, preferencialmente o peptídeo pGlu-Aβ, a partir da amostra.

[099] Mais particularmente, a invenção se refere a um método para a diagnose de uma doença ou condição associada à amiloide, preferencialmente doença de Alzheimer, compreendendo detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo para uma proteína pGlu-amiloide, preferencialmente o peptídeo pGlu-Aβ, em uma amostra ou in situ o que inclui as etapas de (a) trazer a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específica suspeita de conter a proteína amiloide em contato com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui, e/ou uma parte funcional do mesmo, cujo anticorpo se liga ao peptídeo pGlu-Aβ; (b) permitir o anticorpo e/ou parte funcional do mesmo, a se ligar ao peptídeo pGlu-Aβ para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do peptídeo pGlu-Aβ na amostra ou parte ou área do corpo específica.

[0100] Também é compreendido um método para determinar a extensão da carga da placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais compreendendo (a) obter uma amostra representativa do tecido e/ou fluidos corporais sob investigação; (b) testar a referida amostra para a presença de proteínas amiloides com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui, e/ou uma parte funcional do mesmo; (c) determinar a quantidade de anticorpo ligado à proteína; e (d) calcular a carga da placa no tecido e/ou fluidos corporais.

[0101] Em particular, a invenção se refere a um método para determinar a extensão da carga da placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, onde a formação do complexo imunológico na etapa c) é determinada de tal forma que a presença ou ausência do complexo imunológico correlaciona com a presença ou ausência da proteína amiloide, em particular peptídeos pGlu-Aβ.

[0102] Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma composição compreendendo o anticorpo de acordo com a presente invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui incluindo quaisquer anticorpos funcionalmente equivalentes ou quaisquer derivados ou partes funcionais do mesmo, em uma quantidade terapeuticamente efetiva, em particular uma composição que é uma composição farmacêutica opcionalmente ainda compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0103] Em outra modalidade da invenção, a referida composição compreende o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Ainda compreendida pela invenção é uma mistura compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui incluindo quaisquer anticorpos funcionalmente equivalentes ou quaisquer derivados ou partes funcionais do mesmo, em uma quantidade terapeuticamente efetiva e, opcionalmente, uma substância biologicamente ativa adicional e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[0104] Em particular, a invenção se refere a uma mistura, onde a substância biologicamente ativa adicional é um composto usado na medicação de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associadas a amiloide ou proteínas do tipo amiloide tal como a proteína Aβ envolvida em doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo consistindo em deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente doença de Alzheimer.

[0105] Em outra modalidade da invenção, a outra substância ou composto biologicamente ativo também pode ser um agente terapêutico que pode ser usado no tratamento de amiloidose causada por amiloide β ou pode ser usado na medicação de outros distúrbios neurológicos.

[0106] A outra substância ou composto biologicamente ativo pode exercer seu efeito biológico pelo mesmo ou por mecanismo similar que o anticorpo de acordo com a invenção ou por um mecanismo de ação não relacionado ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou não relacionados.

[0107] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir intensificadores de transmissão de nêutrons, fármacos psicoterapêuticos, inibidores de acetilcolina esterase, bloqueadores de canal de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizadores benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, intensificadores de estocagem e liberação, agonistas do receptor pós-sináptico de acetilcolina, inibidores de monoamina oxidase-A ou -B, antagonistas do receptor de N-metil-D- aspartato glutamato, fármacos antiinflamatórios não esteroidais, antioxidantes, e antagonistas do receptor serotonérgico. Mais particularmente, a invenção se refere a uma mistura compreendendo pelo menos um composto selecionado do grupo consistindo em compostos efetivos contra estresse oxidativo, compostos antiapoptóticos, quelantes metálicos, inibidores do reparo de DNA tal como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1-propanossulfônico (3 APS), 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores de α-secretase, inibidores de β- e Y-secretase, proteínas tau, neurotransmissores, quebradores de folha β, atrativos para limpeza de beta amiloide/componentes de depleção celular, inibidores de beta amiloide truncadas no N-terminal incluindo amiloide beta 3-42 piroglutamada, tais como inibidores de glutaminil ciclase, moléculas anti-inflamatórias, ou inibidores de colinesterase (ChEIs) tais como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina, agonistas M1 e outros fármacos incluindo qualquer fármaco amiloide ou modificadora de tau, e suplementos nutritivos, junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[0108] A invenção ainda se refere a uma mistura, onde o composto é um inibidor de colinesterase (ChEIs), particularmente uma mistura, onde o composto é um selecionado do grupo consistindo em tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacina e memantina.

[0109] Em uma modalidade adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[0110] Em uma modalidade adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender um inibidor de glutaminil ciclase junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[0111] Inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2005/075436, em particular exemplos 1-141 como mostrado nas páginas 31-40. A síntese dos exemplos 1-141 é mostrada nas páginas 40-48 do WO 2005/075436. A descrição do WO 2005/075436 em relação aos exemplos 1-141, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0112] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/055945, em particular exemplos 1-473 como mostrado nas páginas 46-155. A síntese dos exemplos 1-473 é mostrada nas páginas 156-192 do WO 2008/055945. A descrição do WO 2008/055945 em relação aos exemplos 1-473, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0113] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/055947, em particular exemplos 1-345 como mostrado nas páginas 53-118. A síntese dos exemplos 1-345 é mostrada nas páginas 119-133 do WO 2008/055947. A descrição do WO 2008/055947 em relação aos exemplos 1-345, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0114] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/055950, em particular exemplos 1-212 como mostrado nas páginas 57-120. A síntese dos exemplos 1-212 é mostrada nas páginas 121-128 do WO 2008/055950. A descrição do WO 2008/055950 em relação aos exemplos 1-212, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0115] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/065141, em particular exemplos 1-25 como mostrado nas páginas 56-59. A síntese dos exemplos 1-25 é mostrada nas páginas 60-67 do WO 2008/065141. A descrição do WO 2008/065141 em relação aos exemplos 1-25, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0116] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/110523, em particular exemplos 1-27 como mostrado nas páginas 55-59. A síntese dos exemplos 1-27 é mostrada nas páginas 59-71 do WO 2008/110523. A descrição do WO 2008/110523 em relação aos exemplos 1-27, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0117] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128981, em particular exemplos 1-18 como mostrado nas páginas 62-65. A síntese dos exemplos 1-18 é mostrada nas páginas 65-74 do WO 2008/128981. A descrição do WO 2008/128981 em relação aos exemplos 1-18, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0118] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128982, em particular exemplos 1-44 como mostrado nas páginas 61-67. A síntese dos exemplos 1-44 é mostrada nas páginas 68-83 do WO 2008/128982. A descrição do WO 2008/128982 em relação aos exemplos 1-44, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0119] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128983, em particular exemplos 1-30 como mostrado nas páginas 64-68. A síntese dos exemplos 1-30 é mostrada nas páginas 68-80 do WO 2008/128983. A descrição do WO 2008/128983 em relação aos exemplos 1-30, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0120] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128984, em particular exemplos 1-36 como mostrado nas páginas 63-69. A síntese dos exemplos 1-36 é mostrada nas páginas 69-81 do WO 2008/128984. A descrição do WO 2008/128984 em relação aos exemplos 1-36, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0121] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128985, em particular exemplos 1-71 como mostrado nas páginas 66-76. A síntese dos exemplos 1-71 é mostrada nas páginas 76-98 do WO 2008/128985. A descrição do WO 2008/128985 em relação aos exemplos 1-71, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0122] Outros inibidores preferidos de glutaminil ciclase estão descritos em WO 2008/128986, em particular exemplos 1-7 como mostrado nas páginas 65-66. A síntese dos exemplos 1-7 é mostrada nas páginas 66-73 do WO 2008/128986. A descrição do WO 2008/128986 em relação aos exemplos 1-7, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada aqui por referência.

[0123] Em ainda outra modalidade da invenção, misturas são fornecidas compreendendo "antipsicóticos atípicos" tais como, por exemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos, incluindo alucinações, delusões (delírios), distúrbios de pensamento (manifestados por incoerência marcada, descarrilhamento, tangencialidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, assim como anedonia, embotamento afetivo, apatia, e recolhimento social, junto com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[0124] Em uma modalidade específica da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção e como descritas antes aqui compreendem o anticorpo e a substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[0125] Outros compostos que podem ser adequadamente usados em misturas em combinação com o anticorpo de acordo com a presente invenção estão descritos em WO 2008/065141 (veja especialmente as páginas 37/38), incluindo inibidores PEP (páginas 43/44), LiCl, inibidores de dipeptidil aminopeptidases, preferencialmente inibidores de DP IV ou enzimas do tipo DP IV (veja páginas 48/49); inibidores de acetilcolinesterase (ACE) (veja página 47), intensificadores PIMT, inibidores de beta secretase (veja página 41), inibidores de gama secretases (veja páginas 41/42), inibidores de endopeptidase neutra, inibidores de fosfodiesterase-4 (PDE-4) (veja páginas 42/43), inibidores de TNFalfa, antagonistas do receptor muscarínico M1 (veja página 46), antagonistas do receptor NMDA (veja páginas 47/48), inibidores do receptor sigma-1, antagonistas de histamina H3 (veja página 43), agentes imunomoduladores, agentes imunossupressores, ou agentes selecionados do grupo consistindo em antegreno (natalizumab), Neurelan (fampridina-SR), campath (alemtuzumab), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (tiplimotida), paclitaxel, Anergix.MS (AG 284), SH636, Diferina (CD 271, adapaleno), BAY 361677 (interleucina-4), inibidores de metaloproteinase de matriz (por exemplo, BB 76163), interferon-tau (trofoblastina) e SAIK-MS; anticorpos beta amiloides (veja página 44); antagonistas de MCP-1 (veja páginas 44/45), inibidores de deposição de proteína amiloide (veja 42) e inibidores de síntese de beta amiloide (veja página 42), cujo documento está incorporado aqui por referência.

[0126] Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma mistura compreendendo o anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui e/ou a substância biologicamente ativa em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[0127] A invenção ainda se refere ao uso de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui e/ou uma parte funcional do mesmo e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo o referido anticorpo, para o preparo de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação da placa amiloide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como as doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como Doença de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); complexo Demência-Parkinson de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica); Diabetes de Início Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outros, incluindo degeneração macular.

[0128] Também compreendido pela presente invenção é um método para o preparo de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui e/ou uma parte funcional do mesmo e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo o referido anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, particularmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva, para o uso em um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação da placa amiloide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como as doenças incluindo, mas não limitadas a, deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tais como Demência Britânica Familiar (FBD) ou Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração na Síndrome de Down, demência de corpo de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Demência-Parkinson de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início Adulto, amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular compreendendo formular um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.

[0129] Ainda compreendido pela presente invenção é um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação da placa amiloide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como as doenças incluindo, mas não limitadas a, deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tais como Demência Britânica Familiar (FBD) ou Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração na Síndrome de Down, demência de corpo de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Demência-Parkinson de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas do tipo amiloide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início Adulto, amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular, pela administração de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, mas particularmente um anticorpo humanizado e/ou uma parte funcional do mesmo, ou uma composição ou mistura compreendendo tal anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, a um animal ou um humano afetado por tal distúrbio compreendendo administrar o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[0130] É também um objeto da invenção fornecer um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associadas à formação da placa amiloide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como as doenças incluindo, mas não limitadas a, deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tais como Demência Britânica Familiar (FBD) ou Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração na Síndrome de Down; particularmente uma doença ou condição caracterizada por uma perda de capacidade de memória cognitiva pela administração a um animal, particularmente um mamífero ou um humano, um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito aqui.

[0131] Em uma modalidade específica, a invenção fornece um método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva, mas, particularmente, para restabelecer a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, sofrendo de uma deficiência de memória, administrando a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como descrito antes aqui.

[0132] É outro objeto da invenção fornecer uma composição terapêutica e um método para produzir tal composição, assim como um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação da placa amiloide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como as doenças incluindo, mas não limitadas a, deficiência cognitiva branda (MCI), doença de Alzheimer (AD), como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tais como Demência Britânica Familiar (FBD) ou Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração na Síndrome de Down; particularmente uma doença ou condição caracterizada por uma perda de capacidade de memória cognitiva, usando um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito antes aqui.

[0133] Em particular, a invenção refere-se ao tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, sofrendo de uma condição associada à amiloide caracterizada por uma perda de capacidade de memória cognitiva que leva à retenção de capacidade de memória cognitiva.

EXEMPLOS 1. Material e Métodos 1.1. Produção de Anticorpos Camundongos

[0134] Para a produção de hibridomas, camundongos BALB/C fêmeas (Charles River) de 8 semanas de idade foram usados.

Linhagem celular de mieloma

[0135] Para a geração dos hibridomas, a linhagem celular de mieloma SP2/0-Ag14 de Deutshe Stammsammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen foi usada.

Antígeno

[0136] O peptídeo pGlu-6166 (sequência pGlu-FRHDSGC, SEQ ID N°: 65) foi usado.

Estratégia

[0137] Como um imunógeno, o peptídeo foi acoplado à tiroglobulina bovina (BTG, SIGMA) através dos grupos maleimida de três ligantes diferentes. Os três ligantes de comprimento diferente foram usados a partir do éster de N-[e-maleimidacaproilóxi] succinimida (EMCS), succiminidil-4-(N-maleimidametil)- ciclo-hexano-1-carbóxi-(6-amidoca- proato) (LCSMCC) e éster de N-[b-maleimidapropilóxi] succinimida (BMPS).

[0138] Para a detecção dos anticorpos gerados, o mesmo peptide foi conjugado à albumina de soro bovino (BSA, SIGMA) através de grupos maleimida a partir de succinimidil-6-[(b-maleimida-propiona- mida)hexanoato] (SMPH).

Métodos Conjugação do peptídeo para imunização

[0139] A conjugação foi realizada em duas etapas através de grupos SH a partir do resíduo de cisteína do peptídeo.

1. Maleilação da proteína-veículo

[0140] 2 a 5 mg do respectivo ligante (50 mg/ml em N- metilpirrolidona, NMP) foi adicionado a 2 ml da solução de proteína- veículo (10 mg/ml em NaHCO3 0,1 mM, pH 8,0). A mistura reacional foi incubada por 1 h em temperatura ambiente (TA). A mistura reacional foi a seguir dessalinizada usando uma coluna Sephadex G-50 (1,5 x 14 cm), que foi equilibrada com fosfato de sódio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8.

2. Acoplamento do BTG maleilado com o peptídeo

[0141] 250 μl da solução do peptídeo (10 mg/ml em água bidestilada) foi misturado com 2 ml de uma solução contendo as proteínas-veículo maleiladas (2,5 mg/ml) em fosfato de sódio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8 e incubado por duas horas a 4°C e 4 horas adicionais em TA. Os grupos maleimida não reagidos foram bloqueados pela adição de 2-mercaptoetanol até uma concentração de 10 mM e incubação durante a noite a 4°C. O conjugado resultante foi dialisado contra fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 a 4°C (3 vezes troca de tampão, corte MW 10.000).

Conjugação do Peptídeo para ELISA

[0142] A conjugação foi realizada em duas etapas através dos grupos SH a partir do resíduo de cisteína do peptídeo.

1. Maleilação da proteína-veículo

[0143] 2 mg de SMPH (50 mg/ml em N-metilpirrolidona, NMP) foi adicionado a 2 ml da solução de proteína-veículo (BSA, 10 mg/ml em NaHCO3 0,1 mM, pH 8,0). A mistura reacional foi incubada por uma hora em temperatura ambiente (TA). A mistura reacional foi então dessalinizada usando uma coluna Sephadex G-50 (1,5 x 14 cm), que foi equilibrada com fosfato de sódio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8.

2. Acoplamento do BTG maleilado com o peptídeo

[0144] 100 μl da solução do peptídeo (10 mg/ml em fosfato de sódio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8) foi misturado com 1 ml de uma solução contendo as proteínas-veículo maleiladas (2,5 mg/ml) em fosfato de sódio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8 e incubado por duas horas a 4°C e 4 horas adicionais em TA. Os grupos maleimida não reagidos foram bloqueados pela adição de 2-mercaptoetanol até uma concentração de 10 mM e incubação durante a noite a 4°C. O conjugado resultante foi dialisado contra fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 a 4°C (3 vezes troca de tampão, corte MW 10.000).

Imunização

[0145] Cinco camundongos foram imunizados intraperitonealmente por 39 dias. Para a imunização, uma emulsão água-em-óleo consistindo em partes iguais da solução de antígeno (consistindo em partes iguais dos três conjugados-BTG-peptídeo diferentes) e adjuvantes de Freundt completos ou incompletos foi usada.

Fusão

[0146] Três dos camundongos imunizados foram sacrificados por incubação de CO2. Os baços foram retirados e homogeneizados sob condições estéreis. Células do baço e células de mieloma SP2/0 foram lavadas diversas vezes em Meio de Dulbecco Modificado por Eagle (DMEM, SIGMA) e fundidas na proporção de 2,3 células do baço : 1 célula SP2/0 usando polietilenoglicol 3350 (1 ml 50% (w/v)). Manipulação adicional dos hibridomas fundidos foi realizada de acordo com as metodologias padrão.

ELISA

[0147] Um ELISA direcionado a IgG foi usado para selecionar o sobrenadante da cultura celular. O teste foi realizado em placas de microtitulação de poliestirol de 96 poços (Greiner, Cat. No. 655061). As placas foram revestidas com o peptídeo BSA-pGlu-6166. 100 μl do sobrenadante de cultura celular não diluído foram adicionados a cada poço e incubado por uma hora em TA. O sobrenadante das células SP2/0 foi usado como controle negativo. O sobrenadante das células do baço foi usado como controle positivo.

[0148] Os poços positivos foram detectados usando IgG de cabra anticamundongo, que foi conjugado com fosfatase alcalina. A densidade ótica (OD) foi medida em um Leitor de Microplaca Dynex Opsys MR a 405 nm.

Seleção de células de hibridoma que produzem anticorpo estável

[0149] Células a partir dos poços positivos foram transferidas para placas de 24 poços e cultivadas por diversos dias. As células foram novamente transferidas e testadas para ligação com BSA-pGlu-6199 e reatividade cruzada no ELISA. Os poços positivos foram usados para crio-conservação das linhagens de célula de hibridoma.

Clonagem através de diluição limitada

[0150] Duas etapas de clonagem consecutivas foram realizadas a fim de separar as células produtoras de anticorpo das células não produtoras e para assegurar que as células selecionadas são monoclonais. Ambas as etapas de clonagem foram realizadas de acordo com o método de diluição limitada.

Crioconservação

[0151] Hibridomas selecionados foram crio-conservados usando DMSO e métodos padrões.

1.2. Ensaios de ELISA

[0152] A captura de Aβ N3pE-40 foi realizada usando hAβ (x-40) ELISA (HS) a partir de TGC (The GENETICS Company; Suiça), basicamente de acordo com as instruções do fabricante.

[0153] A detecção de anticorpos biotinilados para Aβ N3pE (pGlu- 6166) foi gerada. Onde indicado, o anticorpo Aβ N3pE IBL HRP- conjugado foi usado como controle positivo (disponível somente em combinação com o Kit de Ensaio IBL ELISA de Amiloide β (N3pE) Humano). Os peptídeos Aβ N3pE-40 correspondentes (alíquotas de 50 μg em hexafluorisopropanol (HFIP) estocado a -80°C) foram sintetizados. Imediatamente antes do uso, HFIP foi evaporado e o peptídeo foi diluído com Tris/HCl 100 mM, pH 10,4 para 1 μg/μl. Esta solução de estoque foi ainda diluída com diluente de anticorpo TGC. Captura e detecção subsequentes foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

1.3. Análise PepSpot®

[0154] Especificidade e integridade biológica dos anticorpos Aβ N3pE e sobrenadantes de cultura celular foram determinadas usando a tecnologia PepSpot® de JPT Peptide Technologies GmbH, Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 Berlim, Alemanha.

[0155] Membranas PepSpot® correspondentes foram preparadas em JPT. O princípio deste método foi introduzido e descrito antes por Kramer et al. 1997 Cell 91, 799 - 809.

[0156] Para a análise, as membranas foram bloqueadas por duas horas com TBST-M (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween20 0,005% + leite desnatado) em temperatura ambiente com agitação suave. As membranas foram incubadas durante a noite a 4°C em uma plataforma de agitação com os sobrenadantes da cultura celular individual diluído em volumes iguais de TBST-M. Anticorpo anticamundongo secundário conjugado com fosfatase alcalina foi usado para detecção de sinal, seguindo procedimentos padrões.

1.4. Análise DotBlot

[0157] Um protocolo DotBlot simples foi realizado para obter informação sobre a sensibilidade do anticorpo Aβ N3pE e sobrenadantes de cultura celular dirigido ao respectivo peptídeo nativo. Para este fim, o peptídeo Aβ N3pE-40 em concentrações descendentes (1000 ng - 8 ng) foi pontuado sobre peças pequenas de membrana de nitrocelulose, e procedimento experimental subsequente foi realizado como para as membranas PepSpot®.

1.5. SDS PAGE

[0158] Géis de SDS Poliacrilamida a 12% foram espalhados seguindo protocolos padrões. 15 μl dos sobrenadantes de cultura celular e 10 μg de anticorpo biotinilado foram separados em um gel de SDS poliacrilamida. A eletroforese foi realizada por duas horas em uma constante de 100 V.

1.6. Análise BIACORE

[0159] O peptídeo Aβ N3pE-40 (controle positivo) e o peptídeo Aβ N3E-40 (controle negativo) foram acoplados em um chip BIACORE CM5. Chips não modificados são usados para determinar valores brancos. A associação e dissociação do anticorpo biotinilado diluído de 20 μg/ml para 1 μg/ml em diluente TGC foi monitorado para permitir a determinação subsequente do respectivo valor de KD. Desta forma, as características de ligação dos sobrenadantes de cultura celular individual também foram determinadas.

1.6.1 Afinidade dos clones 6-1-6 e 24-2-3 do anticorpo Aβ N3pE específico

[0160] O clone 6-1-6 do anticorpo purificado foi diluído em tampão HBS-EP (Biacore) até 100, 50, 30, 20, 15, 10, 7, 4, 2, 1 nM. A afinidade foi determinada usando um Biacore 3000 com Chip CM5, no qual Aβ N3pE-40 foi imobilizado. O sistema correu com 30 μl/min. Os efeitos de volume medidos e ligação não específica à superfície do chip foram corrigidos pela subtração do sinal do fluxo celular 4, no qual Aβ N3pE- 40 foi imobilizado, e o fluxo celular vazio 3. A associação (10 minutos) foi obtida pela injeção de 300 μl de cada concentração. A dissociação foi observada durante 10 min. Moléculas de anticorpo remanescentes forem removidas pela injeção de 5 μl de HCl 0,1 M. Para cada concentração de anticorpo, a associação e dissociação foi gravada. A determinação da taxa de associação e de dissociação e a constante de dissociação foram realizadas por um encaixe simultaneamente global da fase de associação e dissociação para todas as concentrações de anticorpo gravadas, usando o modelo de "Analito Bivalente".

1.7. Sequenciamento das regiões variáveis do anticorpo

[0161] Cultivo de Células de Hibridoma:

[0162] As células de hibridoma foram crescidas em D-MEM (+ L- Glutamina, + Na-Piruvato, Glicose 4,5 g/l, Gibco) com a adição de FBS 15%, MEM-NEA 1% (aminoácidos não essenciais, Gibco), Gentamicina 50 μg/ml (Gibco) e β-mercaptoetanol 50 μM a 37°C e CO2 5%. O subcultivo ocorreu após 3-4 dias dependendo da densidade celular. As células foram semeadas em uma concentração de 0,5 x 106 células/ml, a separação ocorreu em uma densidade celular de 2-5 x 106 células/ml.

[0163] Síntese de cDNA e Transcrição Reversa:

[0164] RNA total foi isolado a partir de 2 x 106 células de acordo com o manual do Kit de Isolamento NucleospinRNA (Mecherey-Nagel). 100 ng de RNA foram aplicados para a síntese de DNA usando o iniciador Oligo (dT)15 (Promega) e Transcriptase Reversa SuperScript III (Invitrogen).

[0165] Amplificação por PCR de Regiões Variáveis de Cadeia Leve e Pesada:

[0166] Regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas a partir do cDNA modelo usando uma DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (NEW ENGLAND BioLabs) com o iniciador MHCG1 (no caso do clone 5-5-6 e 6-1-6) e MHCG2b (clone 17-4-3 e 24-2-3) em combinação com os iniciadores MHV1-12. Para a amplificação das regiões variáveis de cadeia leve, o iniciador MKC em combinação com os iniciadores MKV1-MKV11 foram usados. As sequências dos iniciadores são mostradas na tabela 1.

[0167] Clonagem dos produtos de PCR em pJET1.2:

[0168] Regiões variáveis de cadeia leve e pesada, amplificadas por PCR, foram clonadas em pJET1.2/vetor embotado de acordo com o protocolo do Kit de Clonagem PCR CloneJET® (Fermentas). O sequenciamento ocorreu com iniciadores de sequenciamento pJET1.2. T bela 1: Sequências iniciadoras para a amplificação por PCR das regiões variáveis de cadeia leve e pesada.

1.8 Aplicação do clone 6-1-6 do anticorpo para ELISA de N3pE.

[0169] Uma placa maxisorb de 96 poços (Nunc) foi revestida com captura de anticorpo pela incubação de 100 μl por poço de 2 μg/ml de anticorpo 4G8 anti-Aβ, diluído em D-PBS, durante a noite a 4°C. A placa foi selada. A solução de revestimento foi removida e a superfície da placa foi bloqueada com 200 μl por poço de Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (sem Tween-20) por duas horas em temperatura ambiente. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. O peptídeo padrão AβpE3-40 foi diluído em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20) até 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 pg/ml. 100 μl de cada concentração e 100 μl do tampão de diluição (Branco) foram pipetados sobre a placa.

[0170] A placa foi selada e incubada a 4°C por duas horas. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. 100 μl da solução do conjugado enzima-anticorpo de detecção, que contém 1 μg/ml do clone 6-1-6 do anticorpo AβN3pE específico e 2 μg/ml do conjugado Estreptavidina-HRP (Sigma) dissolvido em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20), foi pipetado em cada poço. A placa foi selada e incubada a 4°C por uma hora. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. Em cada poço, 100 μl da solução do substrato SureBlue (KPL) são pipetados e a placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi finalizada pela adição de 100 μl por poço de H2SO4 1M. A absorbância foi medida com TECAN Sunrise a 450 nm corrigida pela absorbância a 540 nm.

1.9 Investigação de reatividade cruzada, analisada através de ELISA e Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR)

[0171] ELISA:

[0172] Uma placa maxisorb de 96 poços (Nunc) foi revestida com captura de anticorpo pela incubação de 100 μl por poço de 2 μg/ml de anticorpo 4G8 anti-Aβ, diluído em D-PBS, durante a noite a 4°C. A placa foi selada. A solução de revestimento foi removida e a superfície da placa foi bloqueada com 200 μl por poço de Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (sem Tween-20) por duas horas em temperatura ambiente. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. O peptídeo padrão AβpE3-40 e outros peptídeos Aβ (2-40, 3-40, 4-40, 1-42, 3-42, e pE11-40) foram diluídos em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20) até 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5. 100 μl de cada concentração e 100 μl do tampão de diluição (Branco) foram pipetados sobre a placa. A placa foi selada e incubada a 4°C por duas horas. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. 100 μl da solução do conjugado enzima-anticorpo de detecção, que contém 1 μg/ml do clone 6-1-6 do anticorpo AβN3pE específico e 2 μg/ml do conjugado Estreptavidina-HRP (Sigma) dissolvido em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20), foi pipetado em cada poço. A placa foi selada e incubada a 4°C por uma hora. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. Em cada poço, 100 μl da solução do substrato SureBlue (KPL) são pipetados e a placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi finalizada pela adição de 100 μl por poço de H2SO4 1M. A absorbância foi medida com TECAN Sunrise a 450 nm corrigida pela absorbância a 540 nm.

[0173] SPR:

[0174] Embora em diferentes espécies Aβ, a reatividade cruzada para outros peptídeos pGlu, que ocorrem no corpo humano, também foi determinada. Isto foi feito pela ressonância de plasmon de superfície. A seguir, os peptídeos ou sua região N-terminal foram imobilizados na superfície de Chips CM5:

[0175] MCP1, MCP2, gastrina grande, gonadoliberina, neurotensina, orexina A, fibronectina, colágeno 1 e TRH. Como controle positivo, a ligação ao AβpE3-40 também foi analisada. Os clones 6-1-6 e 24-2-3 do anticorpo N3pE foram diluídos em HBS-EP (Biacore) até 25 μg/ml. A ligação foi observada usando um Biacore 3000 com diversos Chips CM5, sobre os quais os respectivos peptídeos (no fluxo celular 2, 3 e 4) foram imobilizados. O sistema correu com 20 μl/min. A medida dos efeitos de volume e ligação não específica à superfície do chip foi corrigida pela subtração do sinal do fluxo celular 2, 3 e 4, nos quais os peptídeos testados foram imobilizados, e o fluxo celular 1 vazio. A associação (9 minutos) foi obtida pela injeção de 180 μl dos clones 6-16 e 24-2-3 do anticorpo, respectivamente. A dissociação foi observada durante 9 minutos. As moléculas de anticorpo remanescentes foram removidas pela injeção de 5 μl de HCl 0,1 M. Para cada interação do anticorpo com os peptídeos diferentes a associação e dissociação foi gravada. A reatividade cruzada foi determinada pela avaliação da fase de associação relativa à taxa e ao sinal no final. Os valores para todos os peptídeos pGlu foram comparados com o sinal para AβpE3-40.

1.10 Otimização e validação de ELISA N3pE para análise cerebral

[0176] O ELISA N3pE desenvolvido deveria ser usado para análise da concentração de AβpE3-42 no cérebro de camundongos transgênicos. Geralmente, o hemisfério e a haste do cérebro foram separadamente analisados em relação ao conteúdo de AβpE3-42. O cérebro do camundongo foi homogeneizado em 500 μl de solução de SDS 2% com inibidor de protease em um homogeneizador Precelly (Peqlab) usando contas de cerâmica. A suspensão foi pipetada das contas e transferida para um tubo de centrífuga. As contas foram lavadas novamente com 250 μl de solução de SDS 2% com inibidor de protease e a solução foi transferida para um tubo de centrífuga. Os 750 μl da suspensão de cérebro em SDS foi sonificada em gelo triturado por 20 segundos. A amostra foi centrifugada por uma hora a 4°C com 75000xg. Depois disso, o sobrenadante foi removido, tomado em alíquota e estocado até a análise de ELISA a -80°C. O comprimido insolúvel de SDS remanescente foi misturado com 150 μl de ácido fórmico 70% e sonificado em gelo triturado por 20 segundos. Imediatamente após a sonificação, a solução foi neutralizada com 2850 μl de Tris 1 M, que era o método antigo, ou 2850 μl de tampão EIA (PBS+10 mg/ml BSA + 0,05% de Tween-20) + 860 μl de Tris 3,5 M para neutralização, representando o método novo. As amostras da fração do ácido fórmico foram estocadas até ELISA a -80°C. ELISA N3pE foi realizado pelo seguinte protocolo:

[0177] Uma placa maxisorb de 96 poços (Nunc) foi revestida com captura de anticorpo pela incubação de 100 μl por poço de 2 μg/ml de anticorpo 4G8 anti-Aβ, diluído em D-PBS, durante a noite a 4°C. A placa foi selada. A solução de revestimento foi removida e a superfície da placa foi bloqueada com 200 μl por poço de Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (sem Tween-20) por duas horas em temperatura ambiente. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. O peptídeo padrão AβpE3-42 foi diluído em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20) (método antigo) ou tampão EIA (método novo) até 1029,2, 514,6, 257,3, 128,65, 64,32, 31,16, 16,08 pg/ml. 100 μl de cada concentração e 100 μl do tampão de diluição (Branco) foram pipetados sobre a placa. As amostras de SDS foram derretidas, diluídas a 1:25 e 1:100, respectivamente, em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20) (método antigo) ou tampão EIA (método novo) e pipetadas na placa de ELISA. As amostras de ácido fórmico (método antigo: ácido fórmico/Tris; método novo: ácido fórmico/tampão EIA/Tris) foram derretidas, e não diluídas, pipetadas na placa de ELISA. A placa foi selada e incubada a 4°C por duas horas. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. 100 μl da solução do conjugado enzima-anticorpo de detecção, que contém 1 μg/ml do clone 6-1-6 do anticorpo AβN3pE específico e 2 μg/ml do conjugado Estreptavidina-HRP (Sigma) dissolvido em Bloqueador de ELISA livre de Proteína PIERCE (com Tween-20), foi pipetado em cada poço. A placa foi selada e incubada a 4°C por uma hora. Depois disso, a placa foi lavada 6 vezes com TBS+0,05% (v/v) de Tween-20. A solução de lavagem remanescente foi removida pelo escoamento da placa. Em cada poço, 100 μl da solução do substrato SureBlue (KPL) são pipetados e a placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi finalizada pela adição de 100 μl por poço de H2SO4 1M. A absorbância foi medida com TECAN Sunrise a 450 nm corrigida pela absorbância a 540 nm.

1.11 Aplicação dos clones do anticorpo N3pE para imuno-histoquímica

[0178] Secções do cérebro humano (córtex) fixadas em formalina e embebidas em parafina foram tratadas como se segue: 1. Desparafinizar e reidratar as secções (imobilizadas nas lâminas): a. Incubar as lâminas em Histoclear ou xileno por 3 minutos b. Remover a solução de limpeza c. Incubar as lâminas novamente em Histoclear ou xileno por 3 minutos d. Incubar as lâminas em em Histoclear ou xileno 1:1 com etanol 100% por 3 minutos e. Incubar as lâminas em etanol 100% por 3 minutos, remover a solução f. Incubar as lâminas novamente em etanol 100% por 3 minutos g. Incubar as lâminas em etanol 95% por 3 minutos h. Incubar as lâminas em etanol 70% por 3 minutos i. Incubar as lâminas em etanol 50% por 3 minutos j. Incubar as lâminas em água destilada por 3 minutos 2. Extinguir a atividade da peroxidase endógena:

[0179] Incubar as lâminas com 99 ml de metanol + 1 ml de peróxido de hidrogênio 30% por 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Lavar as lâminas com água: 2x 5 minutos. 4. Remover a água nas lâminas individuais e colocar as lâminas em uma prateleira de lâmina em uma câmara de umidade para prevenir que as secções sequem.

[0180] Cobrir as secções com ácido fórmico 88% em temperatura ambiente por 10 minutos sob capela. Rinsar em água diversas vezes e permitir agitar em um prato de coloração preenchido com água por 10 minutos. 5. Bloquear em soro de cavalo 10% por 20 minutos em temperatura ambiente. 6. Agitar para fora (ou aspirar) a solução de bloqueio e aplicar o anticorpo primário (clone 6 ou 24 do anticorpo N3pE) durante a noite a 4°C. 7. Lavar as lâminas separadamente com TBS por 10 minutos para evitar o arraste de uma lâmina para outra. 8. Adição de um anticorpo secundário biotinilado (anticamundongo de cabra da Vector Laboratories): 9 ml TBS, 1 ml soro de cabra, 45 μl de anticorpo secundário). Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. 9. Lavar as lâminas separadamente com TBS por 10 minutos para evitar o arraste de uma lâmina para outra. 10. Adição de solução ABC (10 ml TBS, 100 μl de soro de cavalo, 90 μl do componente A, 90 μl do componente B). Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. 11. Lavar as lâminas com Tris 50 mM: 2x 10 minutos. 12. Reação de cor: Incubar as secções com solução DAB (20 mg de DAB de Sigma em 100 ml de Tris 50 mM, filtrado, e adicionar 33 μl de peroxidase de hidrogênio 33%). Usar microscópio para observar a reação de cor. O produto reacional é colorido de marrom. Finalizar a reação colocando as lâminas dentro de pratos de coloração contendo água. 13. Lavar as lâminas com água por 10 minutos. 14. Corar com contraste com hematoxilina, lavando com água. 15. Desidratar e limpar: Seguir a etapa 1 em ordem reversa (por exemplo, água, etanols para histoclean 100%). 16. Lamínula com permount (Fisher Scientific). Secar as lâminas no ar. Limpar as lâminas com navalha e etanol.

2. Resultados 2.1 Produção de anticorpos

[0181] Seis clones foram isolados que produzem estavelmente anticorpos contra o peptídeo pGlu-6166-BSA: clones 1-8-12, 5-5-6, 6-16, 12-1-8, 17-4-3 e 24-2-3. Esses clones foram submetidos à caracterização adicional.

2.2 Determinação da Concentração de Anticorpo Requerida:

[0182] A intensidade dos sinais nos ensaios de ELISA correlaciona não somente com a concentração do analito/variante Aβ, mas é também fortemente dependente da concentração do anticorpo distribuído. Uma vez que as variantes Aβ estão somente presentes em baixa concentração nas amostras de soro, é necessário determinar as concentrações de anticorpo que são capazes de detectar baixas concentrações das variantes Aβ correspondentes. Kits de ELISA Aβ comercialmente disponíveis têm um limite de detecção especificado direcionado a Aβ na faixa baixa de pg. Nas curvas padrões a concentração mais alta é geralmente 500 pg/ml. Informação geral sobre a concentração de anticorpo distribuído é tipicamente carente em folhas de dados/manuais de instrução, entretanto, devido à informação adicional como forma derivável a partir da literatura geral 1 μg/ml de anticorpo é usado como uma falha.

[0183] Em uma primeira série de experimentos, não foi possível detectar 500 pg/ml de Aβ N3pE-40 com o anticorpo conjugado com biotina p-Glu-6166 12-1 correspondente. De fato, concentrações relativamente altas de Aβ N3pE (10 ng/ml) foram requeridas para obter sinais com 1 μg/ml de anticorpo (veja figura 1A: barra central). A intensidade deste sinal foi tremendamente evidenciada pelo aumento da concentração do anticorpo para 10 μg/ml (veja figura 1A: barra esquerda). Até 20 μg/ml de anticorpo, a intensidade do sinal pode ser ainda elevada (veja figura 1B). Além desta concentração nenhum outro aumento na intensidade do sinal pode ser alcançado. Portanto, 20 μg/ml de anticorpo foi usado para determinar o limite de detecção para o anticorpo pGlu-6166.

2.3 Análise de DotBlot

[0184] O anticorpo pGlu-6166 Aβ N3pE-x foi escolhido no processo de varredura porque o clone da célula original (designado 12-1-8) exibiu forte ligação em direção ao peptídeo tomado para imunização e muito baixa reatividade cruzada (veja tabela 2). Tabela 2: Resultados de varredura demonstrando sinais em ensaios de ELISA obtidos com diversos sobrenadantes de clone de célula hibridoma.

[0185] Em nenhuma etapa de varredura, interagindo com o comprimento completo, o peptídeo Aβ N3pE-40 nativo havia sido incluído até agora. Portanto, o conjunto de clones de célula hibridoma pGlu6166 disponível foi triado para clones expressando anticorpos que devem exibir uma afinidade mais alta para o peptídeo Aβ N3pE-40 nativo.

[0186] Como visto na figura 2, os clones celulares poderiam ser identificados aqueles que de fato exibem sensibilidade mais alta direcionada ao peptídeo Aβ N3pE-40 nativo de comprimento completo. Enquanto o clone do anticorpo pGlu-6166 12-1 poderia somente detectar 1 μg do peptídeo, os clones 6-1-6 e 24-2-3 também dão sinais com tão pouco quanto 8 ng do peptídeo. Então, os clones 6-1-6 e 24-23 são 125 vezes mais sensíveis. Com esses clones, um limite de detecção de 8 pg/ml do peptídeo Aβ N3pE-40 em um ELISA correspondente poderia ser atingível.

2.4 . Análise de PepSpot

[0187] A especificidade foi checada então por análise de PepSpot para comparar o anticorpo pGlu-6166 Aβ N3pE-x biotinilado com clones de célula de hibridoma. Na tabela 3, todos os peptídeos são listados os quais correspondem a pontos na membrana PepSpot. Como visto na figura 3, os clones 6-1-6 e 24-2-3 de pglu-6166 não produzem mais sinais cruzados do que o clone 12-1 do anticorpo pGlu-6166. Todos os clones investigados reconheceram primariamente o número do ponto 6, o ponto Aβ N3pE-x específico (pEFRHD..., isto é, SEQ ID N°: 12), seguido pelo pelos pontos número 5 (EFRHD..., SEQ ID N°: 11) e 7 (FRHD..., SEQ ID N°: 13). Um sinal fraco também foi alcançado com um número de ponto 4 (AEFRHD..., SEQ ID N°: 10). Tabela 3: Sequências de peptídeos Aβ pontuados sobre as Membranas PepSpot® (JPT Peptide Technologies GmbH) e a detecção por clones de célula hibridoma pGlu-6166.

pE na tabela 3 significa pGlu, piroglutamato. iD na tabela 3 significa isoAsp, isoaspartato.

2.5 . Análise de SDS-PAGE

[0188] A integridade biológica de sobrenadantes do anticorpo Aβ- N3pE e de cultura de célula de hibridoma foi determinada rudemente por análise de SDS-PAGE (para detalhes veja Material & Métodos, acima).

[0189] Como visto na figura 4, todas as amostras carregadas sobre o gel revelou bandas agudas sem manchas, indicando a integridade dos sobrenadantes do anticorpo pGlu-6166 12-1 e do clone de célula hibridoma.

2.6 . Análise de BIACORE

[0190] Com a análise DotBlot, diferenças significativas em sensibilidade em direção ao peptídeo Aβ N3pE-40 dos sobrenadantes do clone de célula hibridoma comparado ao anticorpo pGlu-6166 biotinilado, foram diagnosticadas. Entretanto, com este método somente um resultado de ponto final é monitorado. A análise de Biacore, por outro lado, permite resolução em tempo real do curso de ligação de um dado anticorpo.

[0191] A fim de checar se uma ligação fraca do anticorpo pGlu-6166 12-1 foi um resultado de uma baixa associação ao peptídeo Aβ N3pE- 40, uma análise de Biacore foi realizada como descrito em Materiais e Métodos, acima.

[0192] Monitorando o curso de ligação de concentrações crescentes do peptídeo pGlu-6166 permitiu o cálculo do valor de KD de 30 nM. Uma comparação do sobrenadante do clone de célula de hibridoma 12-1 com o sobrenadante do clone celular 6-1-6 revelou diferenças impressionantes nas características de ligação. A associação do clone 6-1-6 foi aproximadamente 5 vezes mais alta do que a observada com o clone 12-1. Mais marcadamente, entretanto, é a diferença no comportamento de dissociação. Enquanto o clone 6-1-6 dificilmente se dissocia do peptídeo Aβ N3pE-40, 12-1 é prontamente retirado por lavagem dentro de poucos minutos. Portanto, a ligação fraca do clone 12-1 é muito provavelmente que seja a consequência da "taxa de dissociação" observada. Esta hipótese é ainda suportada pela descoberta que o clone 24-3-2, o qual gera resultados particularmente vantajosos na análise DotBlot, exibe uma associação muito lenta ao peptídeo Aβ N3pE-40, mas, ao contrário do clone 12-1, não possui nenhuma "taxa de dissociação" observável (veja também a figura 5). 2.6.1 Afinidade do clone 6-1-6 e 24-2-3 do anticorpo específico AβN3pE

[0193] Para o clone 6-1-6 do anticorpo N3pE a taxa de associação, taxa de dissociação e constante de dissociação foram calculadas por um ajuste global de todos os sensogramas mostrados na figura 6.

[0194] A taxa de associação foi calculada com 1,67e5 M-1s-1, a taxa de dissociação com 2,63e-4 s-1 e a constante de dissociação com 1,57 nM.

[0195] Para o clone 24-2-3 do anticorpo N3pE a taxa de associação, taxa de dissociação e constante de dissociação foram calculadas por um ajuste global de todos os sensogramas mostrados na figura 7.

[0196] A taxa de associação foi calculada com 3,25e3 M-1s-1, a taxa de dissociação com 3,29-4 s-1 e a constante de dissociação com 101 nM. 2.7 Sequenciamento das regiões variáveis do anticorpo

[0197] As seguintes sequências foram identificadas: 2.7.1 Clone 5-5-6 Parte variável da cadeia leve, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 49) ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGGAAAAACCTAITTGAATTGG TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGIGCAAGGTACACATTTTCCA TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCAT Parte variável da cadeia leve, sequência de proteína (SEQ ID N°: 50) MVSSAQFLFLLVLWIQETNGDWMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNW LLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFP FTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPP Parte variável da cadeia pesada, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 51) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAG GTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCC TGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTATACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCAT GGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAGTGGTGTTACTAGGTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATG GAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTACAAGAGAGGCTAAA CGGGAGTGGGACGAGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA ACGACACCCCCATCTGTCTA Parte variável da cadeia pesada, sequência de proteína (SEQ ID N°: 52) MGWSGVFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSH GKNLEWIGLINPYSGVTRYNQKFKGKATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSV 2.7.2 Clone 6-1-6 Parte variável da cadeia leve, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 53) ATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGACGGAAAAACCTATTTGAATTGG TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCA TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAG Parte variável da cadeia leve, sequência de proteína (SEQ ID N°: 54) MVSTAQFLFLLVLWIQETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNW LLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFP FTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPS Parte variável da cadeia pesada, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 55) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTATCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCC AGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGC T TC T GGT TAC T CAT T CAC T GGC TACAC CAT GAAC T GGGT GAAGCAGAGCCAT GGAAAGAACC T T GAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGTTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCA AGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATC TGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGAGAGGCTAAACGGGAGTGGGACGAGACTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG Parte variável da cadeia pesada, sequência de proteína (SEQ ID N°: 56) MGWSGVFIFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSH GKNLEWIGLINPYNGVTRYNQKFKGKATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL 2.7.3 Clone 17-4-3 Parte variável da cadeia leve, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 57) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGGTGTTCTGGATTCCTGTTTCCAGCAGTGATGTTG TGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAG ATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCA GGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGT TCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCT GGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTG GAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT Parte variável da cadeia leve, sequência de proteína (SEQ ID N°: 58) MKLPVRLLVLVFWIPVSSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWY LQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPP TFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS Parte variável da cadeia pesada, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 59) ATGGACTTTGGGCTCAGCTTACTTATTTTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAG GTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACGGAATGGCGTGGGTTCGACAGGCTCCA GGGAAGGGGCCTGAGTGGGTAGCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCTACTATGCA GACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTG GAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAGGTATGACTAC GATAATATCTTGGACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCC TCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTG Parte variável da cadeia pesada, sequência de proteína (SEQ ID N°: 60) MDFGLSLLIFVLILKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAP GKGPEWVAFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARYDY DNIL DYVMDYWGQGT SVTVS SAKT T PP SVY PL 2.7.4 Clone 24-2-3 Parte variável da cadeia leve, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 61) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAAGGGTGATGTTGTGCTGA CCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTCAAG TCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAG TCTCCAAAGCGCCTAATCTATGTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTG GCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGT TTATTATTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATA AAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT Parte variável da cadeia leve, sequência de proteína (SEQ ID N°: 62) MKLPVRLLVLWIQETKGDVVLTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQ RPGQSPKRLIYWSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPFTF GSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS Parte variável da cadeia pesada, sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 63) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTC AGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGC TTCTGGCTATATATTCAATAACTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGTCAGGGTCTT GAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGGAAGTTCAAGGGTA AAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATC TGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGATATATTGTTTATTGGGGCCAAGGGACT CTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG Parte variável da cadeia pesada, sequência de proteína (SEQ ID N°: 64) MGWSGVFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYIFNNYWINWVKQRP GQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGY IVYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL

2.8 Aplicação do clone de anticorpo 6-1-6 para ELISA de N3pE

[0198] O protocolo de ELISA N3pE final foi testado levando em consideração o limite de quantificação (LOQ) e a razão sinal-para-ruído (S/N). A curva padrão de ELISA é mostrada na figura 8. O formato da curva padrão parece muito bom especialmente para a faixa de concentração baixa, o que mostra uma dependência quase linear de absorbância. Baseado nesta curva padrão o LOQ é determinado com 3,125 pg/ml com um S/N = 1,3.

2.9 Investigação de reatividade cruzada, analisado através de ELISA e SPR

[0199] ELISA:

[0200] A reatividade cruzada para outras variantes Aβ foi determinada usando o N3pE-ELISA. Os dados brutos são mostrados na tabela 4. Tabela 4: Dados brutos de N3pE-ELISA com o clone 6-1-6: Teste de reatividade cruzada

[0201] Somente para AβpE3-40 uma dependência de absorbância a partir da concentração foi observada. Todas as variantes Aβ testadas mostraram reatividade cruzada abaixo de 1%, exceto para Aβ3-40. O sinal (corrigido pelo branco) para 800 pg/ml foi cerca de 2,7% do sinal para AβpE3-40. Este é um valor muito bom, considerando que o N- terminal para ambos os peptídeos tem os mesmos aminoácidos, exceto o primeiro, este é ciclizado no caso de AβpE3-40. No geral, o clone 6 do anticorpo Aβ N3pE, o qual é geralmente usado para ELISA, é muito altamente específico para o N-terminal de peptídeos Aβ começando com pGlu na posição 3.

[0202] SPR:

[0203] A reatividade cruzada dos clones 6-1-6 e 24-2-3 para outros peptídeos pGlu não-Ae foi analisada por ressonância de plasmon de superfície. Ao invés de AβpE3-40, o qual mostra um sensograma de ligação típico, todos os outros peptídeos pGlu testados mostraram quase nenhuma interação com os clones 6-1-6 e 24-2-3, respectivamente, veja também a figura 9 (dados somente mostrados para o clone 6-1-6). Os sensogramas dos peptídeos pGlu foram comparados com o sensograma para AβpE3-40. As reatividades cruzadas estimadas foram todas abaixo de 1%. Um resumo de todos os peptídeos analisados é mostrado na tabela 5. Tabela 5: Reatividade cruzada estimada dos clones 6-1-6 e 24-2-3 para outros peptídeos pGlu.

[0204] Todos os experimentos confirmaram o fato de que os clones 6-1-6 e 24-2-3 do anticorpo N3pE são específicos para o epítopo N- terminal de AβpE3-x. Nenhum outro pGlu N-terminal foi reconhecido nem outras variantes de peptídeo Aβ, que não sustentam um resíduo pE N-terminal.

2.10 Otimização e validação de ELISA de N3pE para a análise do cérebro

[0205] A concentração de AβpE3-42 na haste do cérebro de camundongo foi analisada dependendo do método usado. As amostras foram derivadas a partir de camundongos transgênicos (tg) superexpressando o AβQ3-42 humano no cérebro, o qual é ciclizado pelo QC para AβpE3-42. As amostras foram comparadas a partir de camundongos transgênicos heterozigóticos (tg het) e camundongos transgênicos homozigóticos (tg hom) e a partir de camundongos não transgênicos, do tipo selvagem (wt). Os camundongos usados para a geração da amostra foram produzidos como descrito em WO2009034158.

[0206] Para todas as amostras de experimentos adicionais e padrões foram diluídos no tampão EIA. Em uma próxima etapa, o método de neutralização para analisar amostras de fração de ácido fórmico foi otimizado, isto é, a neutralização foi ELISA de N3pE. O ELISA de N3pE resultante e desenvolvido aqui funciona bem, ele detecta níveis significativos de AβpE3-42 humano nos cérebros dos camundongos tg hom, níveis significativamente mais baixos de AβpE3-42 humano nos cérebros dos camundongos tg het, e nenhum AβpE3-42 humano nos cérebros dos camundongos wt (veja figura 10). ELISA de acordo com a presente invenção libera altos sinais e consequentemente um LOQ muito aceitável e, portanto, adequado para a análise de amostras de ácido fórmico, em particular de amostras de cérebro em ácido fórmico.

2.11 Aplicação de clones de anticorpo N3pE para himuno-histoquímica

[0207] Com os anticorpos N3pE da presente invenção, AβpE3-xfoi corado em secções cerebrais de pacientes no estágio avançado da doença de Alzheirmer esporádica (SAD) e as formas familiares da doença de Alzheimer (FAD), isto é, pacientes que sofrem de uma mutação no gene de presenilina 1 (PS1). As secções de cérebro coradas são mostradas na figura 11. A figura 11 mostra que os anticorpos N3pE da presente invenção são adequados para himuno- histoquímica. Os anticorpos especificamente detectam pGlu-Aβ no cérebro de pacientes com SAD e FAD. Os anticorpos N3pEnão mostram nenhum sinal de fundo nas imagens, o que prova que a ligação específica mostrada pelas análises de ELISA e SPR.

3. Depósitos

[0208] Os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente Aβ N3pE-x, foram gerados. Atualmente, todos os anticorpos monoclonais correspondentes expressando as linhagens de célula de hibridoma 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3, e 24-2-3 foram depositados de acordo com o Tratado de Budapeste e estão disponíveis no Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) em Braunschweig, DE, com uma data de depósito de 17 de junho de 2008, e com os respectivos números de depósito. (clone 5-5-6) : DSM ACC2923 (clone 6-1-6) : DSM ACC2924 (clone 17-4-3) : DSM ACC2925 (clone 24-2-3) : DSM ACC2926.

[0209] A especificidade desses anticorpos pelas suas respectivas sequências-alvo puderam ser confirmadas. Para Aβ N3pE-x, alta afinidade dos clones de anticorpo pode ser identificada o que deveria dar fortes sinais em uma configuração de ELISA com um limite de detecção esperado na faixa pg baixa.

4. Sumário

[0210] O objetivo principal da presente invenção foi o estabelecimento de uma técnica de detecção altamente sensível e robusta que permite a determinação quantitativa de variantes Aβ em amostras biológicas.

[0211] Preferivelmente, uma técnica baseada em ELISA deveria ser perseguida. A tarefa foi iniciada com ELISA de Aβ N3pE, por causa de sua variante Aβ, um sistema de ELISA apropriado estava prontamente comercialmente disponível (IBL). Este sistema foi usado como referência e controle de qualidade interno.

[0212] A aplicabilidade do anticorpo pGlu-6166 na configuração do ensaio de ELISA escolhido foi investigado. Para obter sinais claramente mensuráveis, altas concentrações de anticorpo são necessárias para serem empregadas (20 μg/ml). Clones do anticorpo Aβ N3pE-x de alta afinidade poderiam ser identificados. Um limite de detecção na faixa pg baixa (3-8 pg/ml)pode ser alcançado com esses clones.

Claims (29)

1. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma cadeia leve compreendendo uma parte variável, a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreendendo um polipeptídeo (a) codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 61 ou (b) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 62; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo uma parte variável; a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreendendo um polipeptídeo (a) codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 63 ou (b) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 64, em que o anticorpo isolado se liga a um peptídeo Aβ ou uma variante do mesmo.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga a um peptídeo Aβ com um valor de constante de dissociação (KD) de pelo menos 10-7 M.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia leve; a cadeia leve compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 61, ou tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 62.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada; a cadeia pesada compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 63, ou tendo um aminoácido sequência selecionada de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 64.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia leve; a cadeia leve compreende uma parte variável; a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 49 ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50; o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada; a cadeia pesada compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 51, ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia leve; a cadeia leve compreende uma parte variável; a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 53 ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54; o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada; a cadeia pesada compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 55, ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia leve; a cadeia leve compreende uma parte variável; a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 57 ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58; o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada; a cadeia pesada compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 59, ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo isolado compreende uma cadeia leve; a cadeia leve compreende uma parte variável; a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 61 ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62; o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada; a cadeia pesada compreende uma parte variável; e a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 63, ou tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ab 5-5-6 (N° de Depósito DSM ACC 2923); Ab 6-1-6 (N° de Depósito DSM ACC 2924); Ab 17-4-3 (N° de Depósito DSM ACC 2925); e Ab 24-2-3 (N° de Depósito DSM ACC 2926).

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é Ab 6-1-6 (N° de Depósito DSM ACC 2924).

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é Ab 24-2-3 (N° de Depósito DSM ACC 2926).

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado ou quimérico, ou um fragmento de anticorpo.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um diacorpo ou um anticorpo de cadeia única.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo de um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: pGlu-Ab3-38; pGlu-Ab3-40; pGlu-Ab3-42; e pGlu-Ab3-x variantes, em que x é um número inteiro entre 10 e 42.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região determinante de complementaridade que se liga a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: pGlu-Ab3-38; pGlu-Ab3-40; pGlu-Ab3-42; e pGlu-Ab3-x variantes, em que x é um número inteiro entre 10 e 42.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é imobilizado em uma fase sólida.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é obtido a partir de qualquer uma das linhagens celulares de hibridoma DSM ACC 2923, DSM ACC 2924, DSM ACC 2925 ou DSM ACC 2926.

21. Linhagem celular de hibridoma, caracterizada pelo fato de ser selecionada a partir de grupo que consiste em DSM ACC 2923; DSM ACC 2924; DSM ACC 2925; e DSM ACC 2926.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 e instruções de uso e, opcionalmente, pelo menos uma substância biologicamente ativa adicional.

24. Kit de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma substância biologicamente ativa adicional compreende um inibidor de glutaminil ciclase.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que x é um número inteiro entre 18 e 42.

26. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que x é um número inteiro entre 30 e 42.

27. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que x é um número inteiro entre 18 e 42.

28. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que x é um número inteiro entre 30 e 42.

29. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição ou de um kit para diagnóstico ou tratamento.

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