BR122023021958A2

BR122023021958A2 - Anticorpos anti-phf-tau, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, bem como métodos envolvendo os referidos anticorpos

Info

Publication number: BR122023021958A2
Application number: BR122023021958-9A
Authority: BR
Inventors: Marc Mercken; Thomas Malia; Marianne Borgers; Kristof Van Kolen
Original assignee: Janssen Biotech, Inc.
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2024-02-20
Also published as: CA3055598A1; EP3596119A1; BR112019019049A2; TWI771389B; CN117209599A; MX2019010922A; AU2018234709A1; MA47789A; KR20190130133A; KR102597462B1; CL2019002566A1; JP2020513804A; US10766953B2; IL268700B1; TW201900682A; ZA202101318B; EP3596119A4; PH12019501973A1; BR122023021947A2; CN110799531A

Abstract

anticorpos anti-phf-tau, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, bem como métodos envolvendo os referidos anticorpos. a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti-phf-tau e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. também são descritos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, composições que compreendem os anticorpos, métodos para produzir os anticorpos e uso dos anticorpos para o tratamento ou a prevenção de condições como taupatias.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-PHF-tau, ácidos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, células recombinantes contendo os vetores, e composições que com preendem os anticorpos. Métodos de produção dos anticorpos, méto dos de uso dos anticorpos para tratar condições que incluem taupati- as, e métodos de uso dos anticorpos para diagnosticar doenças como taupatias são também fornecidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio degenerativo do cérebro caracterizado clinicamente por perda progressiva de memória, cognição, raciocínio, julgamento e estabilidade emocional que gradu almente leva a uma deterioração mental profunda e finalmente à mor te. A DA é uma causa muito comum de insuficiência mental progressi va (demência) em seres humanos idosos e acredita-se que representa a quarta causa médica mais comum de morte nos Estados Unidos. A DA tem sido observada em grupos étnicos em todo o mundo e repre senta um problema de saúde pública atualmente e no futuro.

[0003] O cérebro dos indivíduos com DA apresenta lesões carac terísticas denominadas placas senis (ou amiloides), angiopatia ami- loide (depósitos amiloides em vasos sanguíneos) e emaranhados neurofibrilares. Grandes números dessas lesões, particularmente as placas amiloides e os emaranhados neurofibrilares de filamentos he licoidais pareados (PHF), são geralmente encontrados em várias áreas do cérebro humano importantes para a memória e a função cognitiva em pacientes com DA.

[0004] O cenário de tratamento atual de DA inclui apenas terapias aprovadas para tratar sintomas cognitivos em doentes com demência. Não há terapias aprovadas que modificam ou retardam a progressão da DA. Modificadores potenciais da doença incluem o anticorpo mono clonal anti-Aß humanizado Solanezumabe, da famacêutica Eli Lilly para pacientes com DA leve e um inibidor de pequena molécula de BACE, Verubecestat, da farmacêutica Merck para pacientes com DA leve a moderado. Estas terapias, e a maioria dos outros modificadores po tenciais da doença que podem ser lançados na próxima década, dire cionam o Aß (o componente principal das placas amiloides que são um dos dois sinais patológicos característicos de DA).

[0005] Os emaranhados neurofibrilares, o segundo sinal patológico característico de DA, são compostos principalmente de agregados de proteína tau hiperfosforilada. A principal função fisiológica da tau é a polimerização e estabilização de microtúbulos. A ligação do tau aos microtúbulos ocorre por interações iônicas entre cargas positivas na região de ligação de microtúbulo de tau e cargas negativas na rede de microtúbulos (Butner e Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991). A proteína tau contém 85 sítios de fosforilação possíveis e a fosforilação em muitos desses sítios interfere com a função primária de tau. A tau que se liga à rede de microtúbulos axonais está em um estado de hi- pofosforilação, enquanto a tau agregada na DA é hiperfosforilada, for necendo epitopos exclusivos que são distintos do pool fisiologicamente ativo de tau.

[0006] Foi descrita uma hipótese de transmissão e disseminação de taupatia que é baseada nos estágios de Braak de progressão de taupatia no cérebro humano e de disseminação de taupatia após in jeções de agregados de tau em modelos pré-clínicos de tau (Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009; Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009).

[0007] O desenvolvimento de agentes terapêuticos de prevenção ou remoção de agregação de tau tem sido de interesse por muitos anos e fármacos candidatos, incluindo compostos anti-agregação e inibidores de quinase, entraram em testes clínicos (Brunden et al., Nat Rev Drug Discov. 8:783-93, 2009). Vários estudos foram publicados que mostram os efeitos terapêuticos benéficos da imunização ativa e passiva contra tau em modelos de camundongo transgênicos (Chai et al., J Biol Chem. 286:34457-67, 2011; Boutajangout et al., J Neurochem. 118:658-67, 2011; Boutajangout et al., J Neurosci. 30:16559-66, 2010; Asuni et al., J Neurosci. 27:9115-29, 2007). A atividade foi relatada tanto com anticor pos fosfo-dirigidos (dirigidos contra fosfolipídeos) com anticorpos não- fosfo-dirigidos (Schroeder et al., J Neuroimmune Pharmacol. 11(1):9-25, 2016).

[0008] Apesar do progresso na técnica, ainda há uma necessidade por agentes terapêuticos eficazes que previnem a agregação de tau e a progressão da taupatia para tratar taupatias como DA e outras doen ças neurodegenerativas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção satisfaz essa necessidade fornecendo anticor pos anti-PHF-tau ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que têm alta afinidade de ligação com o filamento helicoidal pareado (PHF)-tau e são seletivos para tau fosforilada. Os anticorpos da in venção foram gerados por adaptação de framework humano (HFA) de anticorpos específicos para PHF-tau de camundongo. Acredita-se que a seletividade dos anticorpos para tau fosforilada permita a eficá cia contra tau patogênica sem interferir com a função de tau normal. A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam os anti corpos, composições que compreendem os anticorpos, e métodos de preparo e uso dos anticorpos. Os anticorpos anti-PHF-tau ou os fra- gmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção inibem as sementes de tau, conforme medido por ensaios celulares com o uso de sementes de tau derivadas de lisados celulares de células HEK ou de lisados de medula espinhal de camundongos transgênicos tau- mutantes. Além disso, um anticorpo quimérico com regiões variáveis de anticorpos anti-PHF-tau da invenção e regiões constantes de Ig de camundongo, como as regiões constantes de IgG2a de camundongo, bloqueou a atividade de semeadura em um modelo de camundongo transgênico tau-mutante in vivo.

[0010] A progressão de taupatia em um cérebro com DA segue padrões distintos e específicos de disseminação. Foi mostrado em modelos pré-clínicos que sementes de fosfo-tau extracelulares podem induzir taupatia em neurônios (Clavaguera et al., PNAS 110(23):9535- 40, 2013). Acredita-se, portanto, que a taupatia pode se disseminar num mecanismo semelhante ao dos príons de uma região do cérebro para a próxima. Este processo de disseminação envolveria uma exter- nalização das sementes de tau que podem ser absorvidas pelos neu rônios vizinhos e induzir ainda taupatia. Sem ater-se à teoria, acredita- se que os anticorpos anti-PHF-tau ou os fragmentos de ligação ao an- tígeno dos mesmos da invenção evitam a agregação de tau ou a dis seminação de taupatia no cérebro pela interação com sementes de fosfo-tau.

[0011] Em um aspecto geral, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou a um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PHF-tau. Em uma modalidade específica, o anti corpoé um anticorpo monoclonal humanizado.

[0012] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refe re a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo fosforilado no domínio rico em prolina da proteína tau. Em um aspecto mais específico, o epitopo fosforilado compreende T212 fos- forilado e/ou T217 fosforilado da proteína tau, e o epitopo fosforilado tendo ou contendo qualquer das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 48, 52 e 54. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção se liga ao epitopo fosforilado que compreende T212 fosfori- lado e T217 fosforilado da proteína tau.

[0013] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, que compreende: (1) as regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada de imunoglobulina (HCDRs) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente, e as regiões determinantes de complementari dade de cadeia leve de imunoglobulina (LCDRs) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente; (2) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente; (3) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (4) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 80, 81 e 9, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (6) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72, 73, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (7) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72 e 73, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (8) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (9) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (10) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; ou (11) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a PHF-tau, de preferência a PHF-tau humana.

[0014] Em um aspecto mais específico, as regiões framework no domínio da região variável da cadeia pesada e no domínio da região va- riável da cadeia leve compreendem sequências de aminoácidos de uma imunoglobulina humana.

[0015] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que compreendem uma região variável de ca deia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 27, 28 e 29 ou uma região VH de qualquer cadeia pesada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 74, 76, e 78, ou uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de poli- peptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de prefe rência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferên cia 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 31, 32, 33 e 34 ou uma região VL de qualquer cadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 75, 77 e 79.

[0016] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de ca deia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao me nos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica a qual quer uma das SEQ ID NOs: 45, 74, 76 e 78; e uma cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 46, 75, 77 e 79.

[0017] De acordo com um outro aspecto específico, os anticorpos monoclonais isolados ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção compreendem ainda uma região constante, como uma região constante de IgG de cadeia pesada de humano ou camun dongo, e uma região constante lambda ou kappa de cadeia leve de anti corpo de humano ou camundongo.

[0018] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um áci do nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal ou frag mento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0019] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um ve tor que compreende um ácido nucleico isolado que codifica um anti corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0020] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0021] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0022] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para reduzir a agregação de tau patológica ou disseminação de taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[0023] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para tratar uma taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêu tica da invenção. A taupatia inclui, mas não se limita a, uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com par- kinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranu clear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emara nhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo- demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler- Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de in clusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, do ença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emara nhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilística (doença do boxe).

[0024] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para produzir um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar uma cé lula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo mo noclonal ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições para pro duzir o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e recuperar o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula ou cultura celular.

[0025] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para produzir uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende combinar o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação o antígeno do mesmo com um veículo farmaceu- ticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0026] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé- todo para detectar a presença de PHF-tau fosforilada em um indivíduo ou um método para diagnosticar uma taupatia em um indivíduo medi ante a detecção da presença de PHF-tau em um indivíduo com o uso de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0027] Outros aspectos, características e vantagens da invenção fica rão evidentes a partir da descrição a seguir, incluindo a descrição detalha da da invenção e suas modalidades preferenciais e as reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] O sumário anteriormente mencionado, bem como a seguin te descrição detalhada da invenção, serão mais bem compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve-se com preender que a invenção não se limita às modalidades precisas mos tradas nos desenhos.

[0029] A Figura 1 mostra a ligação de PT3 expresso recombinan- temente ("R3788") e PT3 expresso por hibridoma ("hyb") com PHF-tau e tau solúvel.

[0030] A Figura 2 mostra a análise western blot de anticorpos mo- noclonais anti-tau de camundongo após SDS-PAGE de tau humano normal recombinante ("NT") e PHF-tau insolúvel em sarcosil ("PT").

[0031] As Figuras 3A a 3E mostram a análise imuno-histoquímica de PT3 no tecido do hipocampo de DA que é anti-amiloide 4G8 positivo. Os anticorpos monoclonais usados foram (A) PT1, (B) PT2, (C) PT3, (D) AT8 e (E) HT7.

[0032] As Figuras 4A a 4E mostram a análise imuno-histoquímica de PT3 no tecido do hipocampo de controle, que é anti-amiloide 4G8 ne gativo. Os anticorpos monoclonais usados foram (A) PT1, (B) PT2, (C) PT3, (D) AT8 e (E) HT7.

[0033] As Figuras 5A a 5B mostram o padrão de coloração especí- fico para fosfo-tau de PT3 em cérebro de camundongo (A) tau nocaute ou (B) de tipo selvagem.

[0034] As Figuras 6A a 6B mostram o padrão de coloração es pecífico para não fosfo-tau de tau-1 em cérebro de camundongo (A) tau nocaute e (B) do tipo selvagem.

[0035] A Figura 7 mostra a estrutura cristalina do complexo de Fab de PT3 + peptídeo T212/pT217-tau, com Fab de PT3 mostrado em uma representação de preenchimento de espaço (cinza claro), e o peptídeo de tau mostrado na representação de bastão (preto).

[0036] A Figura 8 mostra a estrutura cristalina do complexo de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pT217-tau, com PT3 mostrado em fitas (cinza claro) com seus resíduos de parátopo mostrados na represen tação de bastão, e o peptídeo de tau mostrado na representação de bastão (preto).

[0037] A Figura 9 mostra um diagrama de interação para a estru tura de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pT217-tau, com os resíduos de peptídeo mostrados em quadrados pretos com letras brancas, os re síduos VH mostrados em cinza escuro, os resíduos VL mostrados em cinza claro, e em que as linhas pontilhas representam ligações de hidrogênio e as linhas sólidas representam contatos de van der Waals.

[0038] A Figura 10 mostra as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de PT3-HFA, em que as variantes HFA es tão alinhadas com as regiões V parentais de PT3 de camundongo (VH10 e VL7), as CDRs parentais transferidas para FRs humanos estão sublinhadas, e a numeração dos resíduos é sequencial.

[0039] A Figura 11 mostra a estrutura cristalina do complexo de B324 + peptídeo T212/pT217-tau, com B324 mostrado em uma repre sentação de preenchimento de espaço (cinza claro), e o peptídeo de tau mostrado na representação de bastão (preto).

[0040] A Figura 12 mostra a estrutura cristalina do complexo de B324 + peptídeo pT212/pT217-tau, com B324 mostrado em fitas (cinza claro) com seus resíduos de parátopo mostrados na representação de bastão, e o peptídeo de tau mostrado na representação de bastão (pre to). Note que D92(L) e E93(L) não têm densidade eletrônica nos áto mos do grupamento carboxilato da cadeia lateral e CY.

[0041] A Figura 13 mostra um diagrama de interação para a estru tura de B324 + peptídeo pT212/pT217-tau, com os resíduos peptídicos mostrados nas caixas pretas com letras brancas, os resíduos VH mos trados em cinza escuro, os resíduos VL mostrados em cinza claro, e em que as linhas pontilhas representam ligações de hidrogênio e as li nhas sólidas representam contatos de van der Waals.

[0042] A Figura 14 mostra um desenho esquemático do modelo ce lular de biossensor de FRET.

[0043] A Figura 15 mostra a inibição por PT3 de indução de agre gado K18 semeada por homogenatos de células HEK contendo agre gados GFP-tau P301L, conforme determinado com o uso do ensaio de BRET.

[0044] A Figura 16 mostra a inibição por PT3 de indução de agre gado K18 semeada por homogenatos da medula espinhal TgP301S, conforme determinado com o uso do ensaio de FRET.

[0045] A Figura 17 mostra os resultados do ensaio de imunodeple- ção de extrato da espinha dorsal de TgP301S de camundongo, com da dos de 2 experimentos independentes.

[0046] A Figura 18 mostra os resultados ensaio de imunodeple- ção de extrato de cérebro humano com DA com dados de 2 experi mentos (exceto no caso de HT7 e AT8, para os quais n=1). O PT3 inibe a semeadura de tau conforme determinado com o uso do ensaio de FRET.

[0047] As Figuras 19A a19G mostram um desenho esquemático do modelo de injeção em camundongos transgênicos que expressam tau mutante humana P301L. As imagens imuno-histoquímicas (IHC) mostram coloração representativa de AT8 dos hemisférios injetados de camundongos injetados com (A-B) um extrato de controle 3 meses após a injeção, (C-D) ePHF-tau derivada de cérebro com DA um mês após a injeção e (E-F) ePHF-tau derivada de cérebro com DA três me sesapós a injeção. (G) Um histograma mostra dados bioquímicos re-presentativos de camundongos tratados com quantidades crescentes de ePHF.

[0048] A Figura 20 mostra o efeito sobre a agregação de tau da administração periférica (IP) de PT3 seguida de semeadura com PHF-tau derivada de cérebro com DA em camundongos transgênicos que expressam tau mutante humana P301L.

[0049] A Figura 21 mostra o efeito sobre a agregação de tau da coinjeção de doses decrescentes de PT3 seguidas de semeadura com PHF-tau derivada de cérebro com DA em camundongos trans- gênicos que expressam tau mutante humana P310L.

[0050] As Figuras 22A a 22C mostram o efeito sobre a agrega ção de tau de coinjeção combinada com administração periférica IP (via intraperitoneal) de isótipos de PT3 seguida de semeadura com PHF-tau derivada de cérebro com DA em camundongos transgênicos que expressam tau mutante humana P301L. Os camundongos trata dos de acordo com (A) mostram o efeito em (B) no hemisfério injeta do e (C) no hemisfério não injetado.

[0051] As Figuras 23A a 23B mostram os níveis de tau agregadas em homogenatos do cérebro derivados de pacientes com PSP (paralisia supranuclear progressiva) em comparação com os níveis homogenatos de cérebro derivados de pacientes com DA. Os anticorpos monoclonais usados foram (A) AT8 e (B) PT3.

[0052] As Figuras 24A a 24J mostram que a coloração com os anticorpos AT8 (A a C) ou PT3 (D a F) nas crioseções do tecido cere bral de pacientes com DA (A, D) ou pacientes com PSP (B, C, E, F) demonstraram coloração nas regiões anatômicas afetadas em PSP. (G a J) Os controles não mostraram nenhuma coloração.

[0053] As Figuras 25A a 25H mostram sensorgramas de ligação obtidos por SPR para mAbs maturados por afinidade e seus Fabs com PHF-tau. As linhas sólidas (cinza) indicam ajuste cinético com o uso do modelo de ligação bivalente (mAbs) ou o modelo de Langmuir 1:1 (Fabs). (A) mAb B296 (B) mAb B711 (C) mAb B809 (D) mAb B333 (E) Fab de B296 B324(F) Fab de B711 B330(G) Fab de B809 B332 (H) Fab de B333 B331.

[0054] As Figuras 26A a 26B mostram a ligação de PT3-HFA e va riantes maturadas por afinidade ao peptídeo pT212/pT217 em um expe rimento ELISA direto com o uso de (A) mAbs e (B) Fabs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0055] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des critos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada por referência em sua totali dade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, arti gos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descriti vo tem o propósito de fornecer contexto para a invenção. Tal discus são não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assun tos façam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer in venções reveladas ou reivindicadas.

Definições

[0056] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técni cos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo signifi cado comumente compreendido pelo versado na técnica à qual essa invenção pertence. De outro modo, certos termos utilizados na pre sente invenção têm os significados conforme definidos no relatório descritivo. Todas as patentes, pedidos de patente publicados e publi cações aqui citadas estão aqui incorporados por referência como se aqui fossem apresentados totalmente. É necessário observar que, conforme utilizadas aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as respectivas formas no plural, a menos que o contexto determine claramente de outro modo.

[0057] Exceto onde especificado de outra forma, qualquer valor nu mérico, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, deve ser entendido como sendo modificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipicamente inclui ± 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concen tração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais den tro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas faixas, e fra ções dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0058] Como usado na presente invenção, o termo "isolado" significa um componente biológico (como um ácido nucleico, peptídeo ou proteí na) que foi substancialmente separado, produzido à parte de ou purifica do de outros componentes biológicos do organismo no qual o componen te ocorre naturalmente, ou seja, outro DNA cromossômico ou extracro- mossômico e RNA e proteínas. Ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas que foram "isolados", dessa forma, incluem ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos de purificação padrão. Ácidos nucleicos, peptí- deos e proteínas "isolados" podem ser parte de uma composição e ainda ser isolados se a composição não for parte do ambiente nativo do ácido nucleico, peptídeo ou proteína. O termo também abrange ácidos nuclei- cos, peptídeos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira assim como os ácidos nucleicos sintetizados qui-micamente.

[0059] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo" ou "imunoglobulina"é usado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou anticorpo incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais incluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, hu manos adaptados, humanizados e quiméricos e fragmentos de anticor pos.

[0060] Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias peptídicas que apresentam especificidade de ligação para um antígeno específico. As estruturas de anticorpos são bem conhecidas. As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácidos de domínio cons tante de cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer das cinco principais classes ou subclasses correspondentes. De preferência, os anticorpos da invenção são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos da invenção incluem aqueles que têm variações em sua região de Fc de modo a ter propriedades alteradas em comparação com as regiões de Fc de tipo selvagem que incluem, mas não se limitam a, meia vida estendida, ADCC ou CDC reduzida ou aumentada e funções efetoras de Fc silen ciado. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebra dos podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a sa ber, kappa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Consequentemente, os anticorpos da in venção podem conter um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda. De acordo com modalidades específicas, os anticorpos da in venção incluem regiões constantes de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpos de camundongos ou de seres humanos.

[0061] Em adição aos domínios constantes de cadeia leve e pesa da, os anticorpos contêm regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina con siste em uma região "framework" interrompida por "sítios de ligação ao antígeno". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos e esquemas de numeração da seguinte forma: (i) Kabat: "Regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs"são com base na variabilidade da sequência (Wu e Kabat, J Exp Med. 132:211-50 (1970)). Em geral, o sítio de ligação ao antígeno tem três CDRs em cada região variável (por exemplo, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 na região variável de cadeia pesada (VH) e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 na região variável de cadeia leve (VL)); (ii) Chothia: O termo "região hipervariável", " HVR " ou " HV " se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em estrutura conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia e Lesk, J Mol Biol. 196:901-17, 1987). Em geral, o sítio de ligação ao antígeno tem três regiões hipervariáveis em cada VH (H1, H2, H3) e VL (L1, L2, L3). Os sistemas de numeração bem como as anotações de CDRs e VHS foram revistos por Abhinandan e Martinho (Abhinandan e Martin, Mol Immunol. 45:3832-9, 2008); (iii) IMGT: Uma outra definição das regiões que formam o sítio de ligação a antígeno foi proposta por Lefranc (Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27:55-77, 2003) com base na comparação dos domínios V de imunoglobulinas e receptores das células T. O banco de dados da International ImMunoGeneTics (IMGT) fornece uma nu meração e uma definição padronizadas dessas regiões. A correspon dência entre delineações de CDRs, HVs e IMGT é descrita em Le- franc et al., 2003, Id.; (iv) AbM: Um compromisso entre os esquemas de nume ração Kabat e Chothia é a convenção de numeração AbM descrita por Martin (Martin ACR (2010) Antibody Engineering, eds Konter- mann R, Dubel S (Springer-Verlag, Berlin), Vol 2, pp 33-51). (v) O sítio de ligação ao antígeno pode também ser delinea do com base em "Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Al- magro, Mol Recognit. 17:132-43, 2004), em que SDR, se refere a resí duos de aminoácidos de uma imunoglobulina que estão diretamente envolvidos no contato com antígeno.

[0062] "Framework" ou "sequências de framework"são as sequên cias remanescentes na região variável de um anticorpo diferente daque les definidos para serem as sequências do sítio de ligação ao antígeno. Como a definição exata de um sítio de ligação a antígeno pode ser de terminada por várias delineações, conforme descrito acima, a sequência de framework exata depende da definição do sítio de ligação a antíge- no. As regiões framework (FRs) são as porções mais altamente conser vadas dos domínios variáveis. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, res pectivamente) que geralmente adotam uma configuração de folha-beta, conectados pelas três alças hipervariáveis. As alças hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas muito próximas pela FRs e, com as alças hipervariáveis de outras cadeias, contribuem para a formação de sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos. A análise estrutural dos an ticorpos revelou a relação entre a sequência e o formato do sítio de li-gação formado pelas regiões determinantes de complementaridade (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175-182, 1990). Apesar de sua alta variabilidade da se quência, cinco das seis alças adotam apenas um pequeno repertório de conformações de cadeia principais, chamado "estruturas canônicas". Essas conformações são, em primeiro lugar, determinadas pelo com primento das alças e, em segundo lugar, pela presença de resíduos muito importantes em certas posições nas alças e nas regiões fra mework que determinam a conformação através de seu empacotamen to, a ligação ao hidrogênio ou a capacidade para assumir conformações não usuais de cadeia principal.

[0063] Como usado na presente invenção, o termo "fragmento de ligação de antígeno"se refere a um fragmento de anticorpo como, por exemplo, um diacorpo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um frag mento Fv (dsFv), um fragmento Fv, um dissulfeto estabilizadas frag mento Fv (dsFv), a (dsFv)2, um dsFv biespecífico dsFv-dsFv'), um diacorpo estabilizado por dissulfureto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único (sdab), um dímero de scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo multi- específico formado a partir de uma porção de um anticorpo compre endendo uma ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único cameli- zado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de do mínio bivalente ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno, mas não compreende uma estrutura do anticorpo. Um fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antí- geno ao qual o anticorpo parental ou um fragmento de anticorpo pa rental se liga. De acordo com modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve e um segmento Fd da re gião constante da cadeia pesada. De acordo com outras modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende Fab e F(ab').

[0064] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo não humano que é modificado para aumentar a homologia de sequência àquela de um anticorpo humano, de modo que as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo sejam retidas, mas sua antigenicidade no corpo humano seja reduzida.

[0065] Como usado na presente invenção, o termo "epitopo" se refe re a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina, anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente. Os epitopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos quanto de aminoácidos não contíguos justapostos pela dobra (ou dobramento) ter ciária de uma proteína. Os epitopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição aos solventes desnaturantes, en quanto os epitopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipica mente inclui ao menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoá- cidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinar a conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Consulte, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. 1996).

[0066] Como usado na presente invenção, o termo "tau" ou "proteí na tau" se refere a uma proteína abundante no sistema nervoso central e periférico que tem múltiplas isoformas. No sistema nervoso central (SNC) humano, seis grandes isoformas principais com tamanho na faixa de 352 a 441 aminoácidos de comprimento existem devido ao splicing alternativo (Hanger et al., Trends Mol Med. 15:112-9 (2009)). As isofor mas diferem umas das outras pela inclusão regulada de 0 a 2 inserções N-terminais e 3 ou 4 repetições de ligação de microtúbulos dispostas em tandem e são chamadas de 0N3R (SEQ ID NO: 64), 1N3R (SEQ ID NO: 65), 2N3R (SEQ ID NO: 66), 0N4R (SEQ ID NO: 67), 1N4R (SEQ ID NO: 68) e 2N4R (SEQ ID NO: 69). Como usado na presente inven ção, o termo "tau de controle" se refere à isoforma de tau da SEQ ID NO: 69 que é desprovida de fosforilação e outras modificações pós- traducionais. Como usado na presente invenção, o termo "tau" inclui proteínas que compreendem mutações, por exemplo, mutações pontu- ais, fragmentos, inserções, deleções e variantes juncionais de tau tipo selvagem de comprimento total. O termo "tau"também abrange modifi cações pós-traducionais da sequência de aminoácidos de tau. As modi ficações pós-traducionais incluem, mas não se limitam a, fosforilação.

[0067] A proteína tau se liga aos microtúbulos e regula o transpor te de carga através das células, um processo que pode ser modulado pela fosforilação de tau. Na doença de Alzheimer e distúrbios relacio nados, a fosforilação anormal de tau é prevalente e pensada preceder e/ou desencadear a agregação de tau em fibrilas, denominada fila mentos helicoidais pareados (PHF). O constituinte principal de PHF é a tau hiperfosforilada. Como usado na presente invenção, o termo "fi lamento helicoidal pareado de tau" ou " PHF-tau" se refere a agrega dos tau em filamentos helicoidais pareados. Duas grandes regiões na estrutura de PHF são evidentes em microscopia eletrônica, a cobertura difusa e o filamento do núcleo; sendo que a cobertura difusa é sensível à proteólise e localizada fora dos filamentos, e o núcleo resistente à protease de filamentos forma a cadeia principal de PHFs Proc Natl Acad Sci USA. 85:4884-8, 1988).

[0068] Um "anticorpo humanizado isolado que se liga a PHF-tau" ou um "anticorpo anti-PHF-tau humanizado isolado", como usado aqui, se refere a um anticorpo anti-PHF-tau humanizado que é substancial mente isento de outros anticorpos que têm diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo anti-PHF-tau humanizado iso ladoé substancialmente isento de anticorpos que especificidade se ligam a outros antígenos diferentes de PHF-tau). Um anticorpo anti- PHF-tau humanizado isolado pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (como homólogos de espécies PHF-tau).

[0069] Como usado na presente invenção, o termo "liga-se espe cificamente" ou "ligação específica"se refere à capacidade de um anticorpo anti-PHF-tau da invenção de se ligar a um alvo predetermi nado com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1x10-6 M ou mais forte, por exemplo, de cerca de 1x10-7 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-12 M ou me nos ou cerca de 1x10-13 M ou menos. O termo "KD"é obtido da razão entre Kd e Ka (isto é, Kd/Ka) e é expresso como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determi nados com o uso dos métodos na técnica em vista da presente des crição. Por exemplo, o valor de KD de um anticorpo anti-PHF-tau po de ser determinado com o uso de ressonância de plásmon de super fície, como com o uso de um sistema biossensor, por exemplo, um sistema Biacore®, um instrumento Proteon (BioRad), um instrumento KinExA (Sapidyne), ELISA ou ensaios de ligação competitiva conhe cidos pelas pessoas versadas na técnica. Tipicamente, um anticorpo anti-PHF-tau se liga a um alvo predeterminado (ou seja, PHF-tau) com uma KD que é ao menos dez vezes menor que sua KD para um alvo não específico, conforme medido através da ressonância de plásmon de superfície com o uso de, por exemplo, um Proteon Ins trument (BioRad). Os anticorpos anti-PHF-tau que se ligam especifi camenteà PHF-tau podem, entretanto, ter reatividade cruzada com outros alvos relacionados, por exemplo, com o mesmo alvo prede terminado de outras espécies (homólogos).

[0070] Como usado na presente invenção, o termo "polinucleotí- deo", chamado de "molécula de ácido nucleico", "nucleotídeos"ou "áci dos nucleicos", se refere a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxir- ribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Os "polinucleotídeos"incluem, mas não se limitam, ao DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é a mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, fita dupla, ou uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla. Além dis-so,"polinucleotídeo"refere-se a regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. O termo polinucleotídeo inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com a cadeia principal modificada para estabilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiadas e bases incomuns, como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita no DNA e no RNA; dessa forma, "polinucleotídeo"abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modifica das de polinucleotídeos como tipicamente encontradas na natureza, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de ví rus e células. "Polinucleotídeo" também abrange cadeias relativamente curtas de ácido nucleico, com frequência, chamadas de oligonucleotí- deos.

[0071] Como usado na presente invenção, um "vetor"é um repli con, no qual outro segmento de ácido nucleico pode ser operacional mente inserido de forma a ocasionar a replicação ou a expressão do segmento.

[0072] Como usado na presente invenção, o termo "célula hospe deira" se refere a uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção. A "célula hospedeira" pode ser qualquer tipo de célula, por exemplo, uma célula primária, uma célula em cultura ou uma célula de uma linhagem celular. Em uma modalidade, uma "célu la hospedeira"é uma célula transfectada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em outra modalidade, uma "célula hospedeira"é uma progenia ou uma progenia potencial de tal célula transfectada. A progenia de uma célula pode ou não ser idêntica à célula original, por exemplo, devido a mutações ou influências ambientais que po- dem ocorrer nas gerações subsequentes ou integração da molécula de ácido nucleico no genoma da célula hospedeira.

[0073] O termo "expressão"como usado aqui, se refere à biossín- tese de um produto gênico. Esses termos abrangem a transcrição de um gene no RNA. O termo também abrange a tradução do RNA em um ou mais polipeptídeos e abrange, ainda, todas as modificações pós- transcricionais e pós-traducionais de ocorrência natural. O anticorpo ex presso humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PHF-tau pode estar dentro do citoplasma de uma célula hospe deira, no meio extracelular, como no meio de crescimento de uma cultura celular, ou ancorado à membrana celular.

[0074] Como usado na presente invenção, o termo "veículo"se refere a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabiliza dor, solubilizador, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídio, microesfera, encapsulação em lipossomas ou outro material bem conhecido na téc nica para uso em formulações farmacêuticas. Deve-se compreender que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular. Como usado na presente invenção, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável"se refere a um material não tóxico que não interfere com a eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou com a atividade bioló gica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades específicas, em vista da presente descrição, qualquer veículo farmaceuticamente aceitável adequado ao uso na composição farmacêutica de anticorpo pode ser usado na invenção.

[0075] Com usado na presente invenção, o termo "indivíduo"se refere a um animal e, de preferência, um mamífero. De acordo com modalidades particulares, o indivíduo é um mamífero que inclui um não primata (por exemplo, um camelo, jumento, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato, coelho, porquinho-da- índia ou camundongo) ou um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé ou ser humano). Em modalidades particulares, o indivíduo é um ser humano.

[0076] Como usado na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingrediente ou componente ativo que induz a resposta biológica ou medicinal dese jada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação à finali dade declarada. Por exemplo, testes in vitro podem ser opcionalmente usados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A seleção de uma determinada dose eficaz específica pode ser determinada (por exemplo, através de ensaios clínicos) pelos versados na técnica com base na consideração de vários fatores, incluindo a doença a ser tra tada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do pacien te, o estado imune do paciente e outros fatores conhecidos pelo ver sado na técnica. A dosagem que precisa ser empregada na formula ção também irá depender da via de administração e da gravidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissio nal e as circunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes po dem ser extrapoladas de curvas de resposta à dosagem, derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.

[0077] Como usados na presente invenção, os termos "tratar", "tra tando" e "tratamento" destinam-se a referir a uma melhora ou reversão de ao menos um parâmetro físico mensurável relacionado a uma taupatia que é não necessariamente discernível no indivíduo, mas que pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tra tamento"também podem se referir a causar a regressão, evitar a pro gressão ou, pelo menos, diminuir a progressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "trata mento" referem-se a um alívio, prevenção do desenvolvimento ou iní- cio, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à taupatia. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "trata mento" referem-se à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "trata mento" referem-se a um aumento na sobrevivência de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particu lar, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à eliminação da do ença, distúrbio ou condição no indivíduo.

[0078] Como usado aqui uma "taupatia" abrange qualquer doença neurodegenerativa que envolve a agregação patológica da tau no cé-rebro.Além da DA familiar e esporádica, outras taupatias exemplifi- cadoras são demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, de generaçãocorticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcorti cal, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibrila- res difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, com plexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, síndro- me de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann- Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neu rônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkin- sonismo pós-encefalítico, e encefalopatia traumática crônica, como de mência pugilística (doença do boxe) (Morris et al., Neuron, 70:410-26, 2011).

[0079] Como usado uso na presente invenção, o termo "em com binação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são admi- nistradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 ho ra, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitan temente com, ou posteriormente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minu tos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 ho ras, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo.

Anticorpos anti-PHF-tau

[0080] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mes mos que se ligam a PHF-tau. Tais anticorpos anti-PHF-tau podem ter as propriedades de ligação de um epitopo fosforilado em PHF-tau ou ligação a um epitopo não fosforilado em PHF-tau. Os anticorpos anti- PHF-tau podem ser úteis como agentes terapêuticos, e como reagen tes de pesquisa ou diagnóstico para detectar PHF-tau em amostras biológicas, por exemplo, em tecidos ou células.

[0081] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo no domínio rico em prolina da proteína tau. Em um aspecto mais específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado iso lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um a proteína tau fosforilada em um epitopo que compreende os resí duos T212 e/ou T217 fosforilados. Em um aspecto mais específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epitopo fosfori- lado de qualquer das SEQ ID NOs: 48, 52 e 54. Em um aspecto ainda mais específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal iso lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epitopo fosforilado da SEQ ID NO: 48. O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo humanizado.

[0082] A Tabela 1 mostra as regiões variáveis de cadeia pesada e leve para 5 mAbs humanizados que se ligam a fosfo-tau pela SEQ ID NO. As sequências de cadeia pesada e leve também são mostradas para o mAb humanizado B296. Este mAb foi maturado por afinidade (consulte a Tabela 3).

[0083] A Tabela 2 mostra resíduos do sítio de ligação a antígeno (isto é, regiões CDR) de anticorpos exemplificadores da invenção defi nidos de acordo com os esquemas de numeração de Chothia, ABM, Kabat e IMGT. As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada exemplificadoras são mostradas nas SEQ ID NOs: 26 a 29, e as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve exemplificadoras são mostradas nas SEQ ID NOs: 31 a 34.

[0084] A Tabela 3 mostra as sequências de anticorpos monoclo- nais maturados por afinidade gerados a partir de B296 (isto é, B333, B711 e B809). As sequências da região variável estão sublinhadas nas sequências de cadeia pesada e leve. Os aminoácidos em negrito ami- noácidos nas CDRs dos anticorpos monoclonais maturados por afini dade indicam uma substituição em comparação com a sequência da CDR B296. As sequências da CDR são determinadas vv de numera ção de Kabat. Tabela 1: mAbs de fosfo-tau humanizado

[0085] Os anticorpos humanizados têm resíduos de framework da região variável substancialmente de um anticorpo humano (chamado de anticorpo aceptor) e regiões determinantes de complementaridade substancialmente de um anticorpo não humano (isto é, anticorpo de camundongo), (chamado de imunoglobulina doadora). Consulte Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 86:10029-10033, 1989, WO 90/07861, US5693762, US5693761, US5585089, US5530101 e US5225539. As regiões constantes, se estiverem presentes, são também substancial mente ou inteiramente de uma imunoglobulina humana. Os domínios variáveis humanos são geralmente escolhidos dentre anticorpos huma- nos cujas sequências de framework apresentam um alto grau de identi dade com os domínios murinos da região variável dos quais as CDRs foram derivadas. Os resíduos de framework da região variável de ca deia pesada e leve podem ser derivados das mesmas, ou diferentes, sequências de anticorpos humanos. As sequências de anticorpos hu manos podem ser as sequências de anticorpos humanos de ocorrência natural ou podem ser sequências consenso de vários anticorpos huma nos. (Consulte US 92/22653). Certos aminoácidos dos resíduos de fra mework da região variável humana são selecionados para substituição com base em sua possível influência na conformação de CDR e/ou na ligação ao antígeno. A investigação de tais possíveis influências é por modelagem, análise das características dos aminoácidos em locais es pecíficos, ou observação empírica dos efeitos de substituição ou muta- gênese de aminoácidos específicos.

[0086] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resí duo de framework de murino de região variável e um resíduo de fra mework humano de região variável selecionado, o aminoácido de framework humano deve ser substituído pelo aminoácido de fra mework equivalente a partir do anticorpo de camundongo quando é razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) se liga não covalente ao antígeno diretamente, (2) está em posição adjacente a uma região CDR (3) interage de outro modo interage com uma região CDR (por exemplo, está dentro de cerca de 6 angstroms de uma região CDR), ou (4) participa na interface VL-VH.

[0087] Outros candidatos para substituição são aminoácidos do framework humano aceptores que são incomuns para uma imunoglo- bulina humana naquela posição. Estes aminoácidos podem ser substi tuídos com aminoácidos da posição equivalente do anticorpo de ca mundongo doador ou das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas. Outros candidatos para substituição são ami- noácidos do framework humano aceptores que são incomuns para uma imunoglobulina humana naquela posição. Os frameworks da regi ão variável das imunoglobulinas humanizadas geralmente mostram ao menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de fra mework da região variável humana ou consenso de tais sequências.

[0088] A humanização de anticorpos pode ser realizada com o uso de métodos bem conhecidos, como "resurfacing" de resíduos determi nantes de especificidade (SDRR) (US2010/0261620), (Padlan et al., Mol. Immunol. 28:489-98, 1991), super-humanização (WO 04/006955) e "hu man string content optimization" (US7657380). As sequências de fra mework humanas úteis para enxerto ou humanização podem ser seleci onadas a partir de bases de dados relevantes pelas pessoas versadas na técnica. Os frameworks selecionados podem ser ainda modificados para a preservar ou melhorar a afinidade de ligação por técnicas como aquelas reveladas em Queen et al., 1989, Id. De acordo com modali dadesespecíficas, os métodos para humanizar anticorpos anti-PHF- tau a partir de anticorpos parentais de camundongo incluem aqueles descritos no Exemplo 4 abaixo.

[0089] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, por exemplo pelo método de hibridoma (Kohler e Milstein, Nature. 256:495-7, 1975). Os anticorpos monoclonais quiméricos contendo uma região variável de cadeia leve e cadeia pesada derivados de um anticorpo doador (tipicamente murino) em associação com regiões constantes de cadeia leve e pesada derivados de um anti corpo aceptor (tipicamente uma outra espécie de mamífero como hu mano) podem ser preparados por um método revelado no documento US4816567. Os anticorpos monoclonais enxertados por CDR que têm CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora não humana (tipica mente murina) e as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula sendo derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas podem ser preparados por técnicas conhecidas pelos versados na técnica como a revelada em US5225539. Os anticorpos monoclonais totalmente humanos desprovidos de quaisquer sequências não huma nas podem ser preparados a partir de camundongos transgênicos de imunoglobulina humana por técnicas mencionadas em (Lonberg et al., Nature. 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nat Biotechnol. 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nat Genet. 15:146-56, 1997). Os anticorpos mo- noclonais humanos podem também ser preparados e otimizados a partir de bibliotecas de exibição em fago (Knappik et al., J Mol Biol. 296:57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Methods. 254:67-84, 2001; Shi et al., J Mol Biol. 397:385-96, 2010).

[0090] Os anticorpos monoclonais da presente invenção compre endendo um anticorpo que tem uma HCDR1 de qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 71, 80; uma HCDR2 de qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 72, 81; uma HCDR3 de qualquer das SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 73; uma LCDR1 de qualquer das SEQ ID NOs: 13, 16, 19, 22, 70; uma LCDR2 de qualquer das SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 23; uma LCDR3 de qualquer das SEQ ID NOs: 15, 18, 21, 24. A invenção também abrange anticorpos monoclonais que têm sequências de CDR que são ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idênticas, de preferência ao menos 99% idênticas a uma HCDR1 de qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 71, 80; uma HCDR2 de qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 72, 81; uma HCDR3 de qualquer das SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 73; uma LCDR1 de qualquer das SEQ ID NOs: 13, 16, 19, 22, 70; uma LCDR2 de qualquer das SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 23; uma LCDR3 de qualquer das SEQ ID NOs: 15, 18, 21, 24.

[0091] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a anticorpos humanizados isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que compreendem: (1) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente; (2) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente; (3) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (4) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 80, 81 e 9, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (6) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72, 73, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (7) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72 e 73, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (8) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a se quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (9) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (10) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; ou (11) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao PHF-tau, de preferência, ao PHF-tau humano, e sendo que as regiões framework no domínio da região variável da ca deia pesada e no domínio da região variável da cadeia leve compre endemsequências de aminoácidos de uma imunoglobulina humana.

[0092] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pe sada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais prefe rência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica às SEQ ID NOs: 26, 27, 28 ou 29, ou uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica às SEQ ID NOs: 31, 32, 33 ou 34.

[0093] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pe sada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, com mais preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95% idêntica, e com mais preferência 98% idênti ca, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável em uma cadeia pesada de qualquer das SEQ ID NOs: 74, 76, e 78, ou uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de poli- peptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferên cia ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável em uma cadeia leve de qualquer das SEQ ID NOs: 75, 77 e 79.

[0094] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais prefe rência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 26, e uma regi ão variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 31.

[0095] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção re fere-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais prefe- rência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 28 e uma regi ão variável de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 34.

[0096] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção refe re-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pe sada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferên cia ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 26 e uma região variá vel de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80% do polipeptídeo, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 34.

[0097] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção re fere-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais prefe rência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 28 e uma regi ão variável de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 31.

[0098] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção re fere-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais prefe rência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 27 e uma regi ão variável de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 31.

[0099] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de prefe rência ao menos 85%, com mais preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95% idêntica, e com a máxima preferência 98%, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável na cadeia pesada da SEQ ID NO: 74, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável na cadeia leve da SEQ ID NO: 75.

[0100] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção refe re-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos de ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, com mais preferência ao menos 90%, com mais prefe rência ao menos 95% idêntica, com mais preferência 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável na cadeia pesada da SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável na cadeia leve da SEQ ID NO: 77.

[0101] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção refere-se a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região variável de ca deia pesada tendo a sequência de polipeptídeos de ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, com mais preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95% idêntica, com mais preferência 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável na cadeia pesada da SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica à região variável na cadeia leve da SEQ ID NO: 79.

[0102] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima pre ferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 46. De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado hu manizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que com preende uma cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 45, e uma cadeia leve que tem a sequência de poli- peptídeos da SEQ ID NO: 46.

[0103] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de pre ferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 75. De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado humanizado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, que compreende uma cadeia pesada que tem a se quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 74, e uma cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 75.

[0104] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de pre ferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 77. De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado humanizado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, que compreende uma cadeia pesada que tem a se quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 76, e uma cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 77.

[0105] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 78 e uma cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de pre ferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 79. De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado humanizado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, que compreende uma cadeia pesada que tem a se quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 78, e uma cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 79.

[0106] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região constante de IgG1 de cadeia pesada humana e uma região constante kappa de cadeia leve humana.

[0107] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo isolado humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga à PHF-tau humana com uma constante de dissoci ação (KD) de 5x10-9 M ou menos, de preferência uma KD de 1xio-9 M ou menos ou 1xio-10M ou menos, sendo que KD é medida por análise de ressonância de plasmón de superfície, como pelo uso de um siste ma Biacore ou ProteOn.

[0108] A atividade funcional de anticorpos humanizados e frag mentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à PHF-tau pode ser caracterizada por métodos conhecidos na técnica e conforme descrito na presente invenção. Os métodos para caracterizar anticor pos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à PHF-tau incluem, mas não se limitam a, ensaios de afinidade e especi ficidade, incluindo análise Biacore, ELISA e FACS; análise imuno- histoquímica; ensaios celulares in vitro e ensaios em vivo com injeção para determinar a eficácia dos anticorpos na inibição da semeadura de tau; ensaios de citotoxicidade celular para detectar a presença de ati vidade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e de atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) dos anticorpos; etc. De acordo com modalidades específicas, os métodos para caracterizar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao PHF-tau incluem aqueles des critos nos Exemplos 5, 6, 8 e 9 abaixo. Um anticorpo parental de ca mundongo exemplificador de anticorpos humanizados que se ligam ao PHF-tau mas não controlam tau é o anticorpo PT3, que tem uma regi ão variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 30 (consulte por exemplo, a paten te US n° 9.371.376 que está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade).

[0109] Várias metodologias bem conhecidas podem ser utilizadas para determinar o epitopo de ligação dos anticorpos da invenção. Por exemplo, quando as estruturas de ambos os componentes individuais são conhecidas, a ancoragem de proteína de proteína silico pode ser executada para identificar sítios compatíveis de interação. A troca de hi drogênio deutério (H/D) pode ser executada com o antígeno e o comple xo anticorpo para mapear regiões no antígeno que são ligadas pelo anti corpo. A mutagênese do ponto ou segmento do antígeno pode ser usada para localizar os aminoácidos importantes para a ligação de anticorpo. A estrutura cocristalina de um complexo de anticorpo-antígeno é usada pa ra identificar resíduos que contribuem para o epitopo e o parátopo. De acordo com modalidades específicas, os métodos para determinar o epi- topo de ligação dos anticorpos da invenção incluem aqueles descritos nos Exemplos 2, 3 e 7 abaixo.

[0110] Os anticorpos da invenção podem ser biespecíficos ou mul- tiespecíficos. Um anticorpo biespecífico exemplificador pode se ligar a dois epitopos distintos em PHF-tau ou pode se ligar ao PHF-tau e beta amiloide (Abeta). Um outro anticorpo biespecífico exemplificador pode ligar PHF-tau e um receptor de transcitocose de barreira cerebral en dógenacomo receptor de insulina, receptor de transferência, receptor de fator-1 de crescimento similar à insulina e receptor de lipoproteína. Um anticorpo exemplificador é do tipo IgG1.

[0111] As propriedades de atuador imunológico dos anticorpos da invenção podem ser acentuadas ou silenciadas através de modifica ções Fc por técnicas conhecidas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as funções efetoras de Fc como a ligação de C1q, cito- toxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação descendente de receptores de superfície celular (por exemplo, recep tor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas por meio da modificação dos resíduos no Fc responsável por essas ativi dades. As propriedades farmacocinéticas podem também ser acentu adas por resíduos mutantes no domínio Fc que estendem a meia-vida do anticorpo (Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20:685-91 (2009).

[0112] Além disso, os anticorpos da invenção podem ser modificados após a tradução por processos, como glicosilação, isomerização, deglicosi- lação ou modificação covalente de ocorrência não natural, como a adição de porções de poli(glicol etilênico) (peguilação) e lipidação. Tais modifica ções podem ocorrer in vivo ou in vitro. Por exemplo, os anticorpos da inven ção podem ser conjugados ao poli(glicol etilênico) (PEGuilado) para otimi zar seus perfis farmacocinéticos. A conjugação pode ser realizada por técnicas conhecidas das pessoas versadas na técnica. Foi demonstra do que a conjugação de anticorpos terapêuticos com PEG acentua a farmacodinâmica enquanto não interfere com a função (Knight et al., Plateles. 15:409-18, 2004; Leong et al., Cytokine. 16:106-19, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761-70, 2003).

[0113] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um áci do nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal ou fragmen to de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Será entendido pe los versados na técnica que a sequência de codificação de uma prote ína pode ser alterada (por exemplo, substituída, deletada, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Consequen temente,será entendido pelos versados na técnica que sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção podem ser alterados sem alterar as sequências de aminoácidos das proteínas. Polinucleotí- deos isolados exemplificadores são polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem as CDRs de cadeia pesada de imu- noblogulina HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente, ou polipeptídeos que compreende CDRs de cadeia leve de imunoglobulina LCDR1. LCDR2 e LCDR3 mostrados nas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente. Outros polinucleotí- deos isolados exemplificadores são polinucleotídeos tendo as sequên cias mostradas nas SEQ ID NOs: 36 a 39 ou 41 a 44, que codificam as regiões variáveis de anticorpo da invenção. Outros polinucleotídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferências de có- don em um dado sistema de expressão, codificam os anticorpos da invenção, também estão dentro do escopo da invenção. Os ácidos nu- cleicos isolados da presente invenção podem ser feitas com o uso de técnicas recombinantes ou sintéticas bem conhecida. O DNA que codi fica a anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado com o uso de métodos conhecidos na técnica. Quando uma hibridoma é produzida, tais células podem servir como uma fonte de tal DNA. Al ternativamente,técnicas de exibição em que a sequência de codifica-ção e o produto de tradução são ligados, como bibliotecas de exibição de fago ou ribossomal, podem ser usadas.

[0114] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um ve tor que compreende um ácido nucleico isolado que codifica um anti corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Qualquer vetor conhecido pelos versados na técnica, em vista da presente descrição, pode ser usado, como um plasmídeo, cosmídeo, um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalida des, o vetor é um vetor de expressão recombinante como um plasmí- deo. O vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, elemento de ligação ao ribossoma, terminador, intensifica- dor, marcador de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou reprimível. Vários vetores de expressão capazes de liberar ácidos nucleicos a uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção pa ra a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na célula. Técnicas de clonagem convencionais ou síntese de gene artificiais podem ser usadas para gerar um vetor de expres são recombinante de acordo com as modalidades da invenção.

[0115] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma cé lula hospedeira que compreende um polinucleotídeo isolado que codi fica um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Qualquer célula hospedeira conhecida pelos ver sados na técnica em vista da presente descrição pode ser usada para a expressão recombinante de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetais ou célu las de arquea. As células eucarióticas exemplificadoras podem ser de origem de mamífero, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de mamífero incluem linhagens celulares imortali zadas, como linhagens celulares de hibridoma ou mieloma, como li nhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va, EUA CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC n° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas deri vadas de células de ovário de hamster chinesa (CHO) como CHO-K1 SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) ou DG44.

[0116] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo de produção de um anticorpo monoclonal ou fragmento de liga ção ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar uma célula que compreende um polinucleotídeo que codifica o anti corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo sob condições para produzir um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, e recuperar o anticor po ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula ou cul tura celular (por exemplo, do sobrenadante). Os anticorpos ou frag mentos de ligação ao antígeno dos mesmos expressos podem ser colhidos das células e purificados de acordo com técnicas convencio nais conhecidas na técnica.

Composições farmacêuticas e métodos de tratamento

[0117] Anticorpos anti-PHF-tau da invenção ou fragmentos dos mesmos da invenção podem ser usados para tratar, reduzir ou evitar sintomas em pacientes que têm uma doença neurodegenerativa que envolve agregação patológica de tau dentro do cérebro, ou uma taupa- tia, como pacientes que sofrem de DA.

[0118] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão da invenção e um veícu lo farmaceuticamente aceitável.

[0119] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para tratar ou reduzir sintomas de uma doença, distúrbio ou con dição, como uma taupatia, em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêu tica da invenção.

[0120] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé todo para reduzir a agregação de tau patológica ou disseminação de taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[0121] De acordo com modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-PHF-tau ou fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo. Como usado aqui com referência aos anticorpos anti- PHF-tau humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quan tidade do anticorpo monoclonal anti-PHF-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que resulta no tratamento de uma doença, dis túrbio ou condição; evita ou retarda a progressão da doença, distúrbio ou condição; ou reduz ou alivia completamente os sintomas associa dosà doença, distúrbio ou condição do sistema imune.

[0122] De acordo com as modalidades particulares, uma quantida de terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ii) redu zir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iii) evitar a progressão da doença, dis túrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iv) causar a regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (v) evitar o desenvolvimento ou o início da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vi) evitar a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vii) re duzir a hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (viii) re duzir o período de hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com a doença, dis túrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (xi) inibir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo em um indivíduo; e/ou (xii) melhorar ou aprimorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláti cos e terapêuticos) de outra terapia.

[0123] De acordo com modalidades específicas, a doença, distúr- bio ou condição a ser tratada é uma taupatia. De acordo com modali dades mais específicas, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, inclui, mas não se limita a, doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neu- rofibrilares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, sín- drome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann- Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica, ou demência pugilística (doença do boxe).

[0124] Um fenotipo de comportamento relacionado a taupatia in clui, mas não se limita a, disfunção cognitiva, alteração e desinibição precoces da personalidade, apatia, abulia, mutismo, apraxia, perseve- ração, movimentos/comportamentos estereotipados, hiperoralidade, desorganização, incapacidade de planejar ou organizar tarefas se quenciais, egoísmo/insensibilidade, traços antissociais, uma falta de empatia, hesitação, discurso agramático com frequentes erros parafrá- sicos mas com compreensão relativamente preservada, prejuízo da compreensão e dificuldades para encontrar as palavras, instabilidade lentamente progressiva da marcha, retropulsões, congelamento, que das frequentes, rigidez axial não responsiva à levodopa, paralisia su pranuclear do olhar, sacadas em onda quadrada, sacadas verticais lentas, paralisia pseudobulbar, apraxia dos membros, distonia, perda sensorial cortical, e tremor responsivo rigidez axiais, paralisia supranu clear do olhar, onda quadrada corrompas, lento saccades verticais, paralisia pseudobulbar, membro apraxia, distonia, perda sensorial cor- ticais, e tremores.

[0125] Os pacientes passíveis de tratamento incluem, mas não se limitam a, indivíduos assintomáticos em risco de DA ou outras taupatia, bem como pacientes atualmente mostrando sintomas. Os pacientes pas síveis de tratamento incluem indivíduos que têm um risco genético co nhecido de DA, como uma história familiar de DA ou presença de fatores de risco genético no genoma. Os fatores de risco exemplificadores são mutações na proteína precursora amiloide (APP), especialmente na posi ção 717 e nas posições 670 e 671 (mutações Hardy e Swedish, respecti vamente). Outros fatores de risco são mutações nos genes de presenili- na PS1 e PS2 e em ApoE4, histórico familiar de hipercolesterolemia ou ateroesclerose. Os indivíduos atualmente sofrendo de DA podem ser re conhecidos a partir de característica demência pela presença dos fatores de risco descritos acima. Além disso, uma série de testes de diagnóstico estão disponíveis para identificar os indivíduos que têm DA. Estes inclu emmedição dos níveis de fluido cerebroespinhal-tau e Abeta 42. Níveis elevados de tau e diminuídos de Abeta 42 significam a presença de DA. Os indivíduos que sofrem de DA podem também ser diagnostica dos por DA e critérios de associação de distúrbios relacionados.

[0126] Os anticorpos anti-PHF-tau da invenção são adequados tanto como agentes terapêuticos e profiláticos para tratar ou evitar do enças neurodegenerativas que envolvem agregação patológica da tau, como DA ou outras taupatias. Em pacientes assintomáticos, o trata mento pode começar em qualquer idade (por exemplo, cerca de 10, 15, 20, 25, 30 anos). Normalmente, no entanto, não é necessário inici ar o tratamento até que um paciente atinja cerca de 40, 50, 60 ou 70 anos. O tratamento tipicamente envolve múltiplas dosagens durante um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado por testes de anticorpo, ou respostas de células T ou células B ativadas ao agente terapêutico ao longo do tempo. Se a resposta falhar, uma dose de re forço pode ser indicada.

[0127] Em aplicações profiláticas, as composições ou medicamen tosfarmacêuticos são administrados a um paciente suscetível a, ou de outro modo em risco de, DA em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou retardar o início da doença, in cluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da do ença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresen tados durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito de, ou que já sofre de tal distúrbio, como uma doença, em uma quantidade suficiente para reduzir, interromper, ou desacelerar quaisquer dos sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais). A administração de um agente terapêutico pode reduzir ou eliminar disfunção cognitiva leve em pacientes que ainda não desenvolveram a patologia característica de Alzheimer.

[0128] A quantidade terapeuticamente eficaz ou a dosagem pode variar de acordo com vários fatores, como a doença, distúrbio ou con dição a ser tratada, os meios de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medi camentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são idealmente tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.

[0129] Os anticorpos da invenção podem ser preparados na forma de composições farmacêuticas contendo uma quantidade terapeuti- camente eficaz do anticorpo como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução sali na a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. Elas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceu- ticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas, como agentes tamponantes e ajustadores de pH, estabilizan- tes, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração dos anti corpos da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar ampla mente, isto é, desde menor que cerca de 0,5%, habitualmente a ou ao menos cerca de 1% até tanto quanto 15% ou 20%, em peso, e será sele cionada principalmente com base na dosagem exigida, nos volume de flu ido, nas viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de ad ministração selecionado.

[0130] O modo de administração para uso terapêutico dos anticor pos da invenção pode ser qualquer via adequada que libere o agente ao hospedeiro. Por exemplo, as composições descritas na presente invenção podem ser formuladas de modo a serem adequadas para a administração parenteral, por exemplo, intradérmica, via intramuscular, intraperitoneais, intravenosa, subcutânea, intranasal ou administração intracraniana, ou eles podem ser administrados no fluido cerebroespi- nhal do cérebro ou na espinha dorsal.

[0131] O tratamento pode ser dado em um esquema de dose úni ca, ou como um cronograma de doses múltiplas em que um curso primário de tratamento pode ser com 1 a 10 doses separadas, segui do de outras doses administradas em intervalos de tempo subse quentesnecessários para manter e/ou reforçar a resposta, por exem plo, a 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma ou mais doses subsequentes após vários meses. Exemplos de crono- gramas de tratamento adequados incluem: (i) 0, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses, ou outros crono- gramas suficientes para obter as respostas desejadas que se espera reduzam os sintomas da doença, ou reduzir a gravidade da doença.

[0132] Os anticorpos da invenção podem ser liofilizados para arma zenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Es-tatécnica mostrou-se eficaz com preparações de proteínas convencio nais e as técnicas de reconstituição e de liofilização conhecidas na téc nica podem ser utilizadas.

[0133] De acordo com modalidades específicas, uma composição usada no tratamento de uma taupatia pode ser usado em combinação com outros agentes que são eficazes para o tratamento de doenças neu- rodegenerativas relacionados. No caso de DA, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes que reduzem ou evitam a deposição de beta amiloide (Abeta). É possível que as patologi as de PHF-tau e Abeta sejam sinérgicas. Portanto, a terapia de combina ção que direciona a depuração de ambos PHF-tau e Abeta e patologias relacionadas a Abeta ao mesmo tempo pode ser mais eficaz do que o direcionamento de cada um individualmente. No caso da doença de Par kinson e doenças neurodegenerativas associadas, a modulação imuno- lógica para limpar formas agregadas da proteína alfa-sinucleína é tam bém uma terapia emergente. Uma terapia de combinação que tem como alvo a remoção de ambas as proteínas tau e alfa-sinucleína simultanea mente pode ser mais eficaz do que direcionar qualquer proteína individu almente.

[0134] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um méto do de produção de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende combinar um anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo com um veículo farmaceutica- mente aceitável para obter a composição farmacêutica.

Métodos de diagnóstico e kits

[0135] Os anticorpos monoclonais anti-PHF-tau da invenção podem ser usados em métodos de diagnóstico de DA ou outras taupatias em um indivíduo.

[0136] Dessa forma, em um outro aspecto geral, a invenção se refere a métodos para detectar a presença de PHF-tau em um indiví duo ou métodos para diagnosticar taupatias em um indivíduo median te a detecção da presença de PHF-tau em um indivíduo com o uso de um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0137] A tau fosforilada pode ser detectada em uma amostra bio lógica de um indivíduo (por exemplo, amostra de sangue, soro, plas ma, fluido intersticial, fluido cerebroespinhal) pelo contato da amostra biológica com o reagente anticorpo de diagnóstico, e detectar a liga ção do anticorpo reagente de diagnóstico com a tau fosforilada na amostra do indivíduo. Ensaios para realizar a detecção incluem mé todos bem conhecidos como ELISA, imuno-histoquímica, western blot, ou imageamento in vivo. Um anticorpo de diagnóstico exemplifi- cador é o anticorpo PT3 da invenção.

[0138] Anticorpos de diagnóstico ou reagentes similares podem ser administrados através de injeção intravenosa no corpo do pacien te, ou diretamente no cérebro por qualquer via adequada que libere o agente ao hospedeiro. A dosagem do anticorpo deve estar dentro das mesmas faixas dos métodos de tratamento. Tipicamente, o anticorpo é marcado, embora em alguns métodos, o anticorpo primário com afinidade pela tau fosforilada seja não marcado, e um agente de mar cação secundário é usado para se ligar ao anticorpo primário. A esco lha da marcação depende dos meios de detecção. Por exemplo, um marcador fluorescente é adequado para detecção óptica. O uso de marcadores paramagnéticos é adequado para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Marcadores radioativos podem também ser detectados com o uso de PET ou SPECT.

[0139] O diagnóstico é feito comparando-se o número, tamanho, e/ou a intensidade de PHF-tau marcada, agregados de tau, e/ou ema ranhados neurofibrilares em uma amostra do indivíduo ou no indivíduo, aos valores de base correspondentes. Os valores da linha de base po dem representar os níveis médios em uma população de indivíduos saudáveis. Os valores da linha de base podem também representar níveis anteriores determinados no mesmo indivíduo.

[0140] Os métodos de diagnóstico descritos acima podem também ser usados para monitorar a resposta do indivíduo à terapia mediante a detecção da presença de tau fosforilada em um indivíduo antes, durante ou após o tratamento. Uma diminuição nos valores em relação à linha de base sinaliza uma resposta positiva ao tratamento. Os valores podem também aumentar temporariamente em fluidos biológicos conforme o tau patológico é eliminado do cérebro.

[0141] A presente invenção é ainda direcionada a um kit para exe cutar os métodos de diagnóstico e monitoramento descritos acima. Ti-picamente, tais kits contêm um reagente de diagnóstico, como os anti corpos da invenção, e, opcionalmente, um marcador detectável. O an ticorpo de diagnóstico em si pode conter o marcador detectável (por exemplo, molécula fluorescente, biotina, etc.) que é detectável direta mente ou por meio de uma reação secundária detectável (por exem plo,reação com estreptavidina). Alternativamente, um segundo rea gente contendo o marcador detectável pode ser usado, sendo que o segundo reagente tem especificidade de ligação para o anticorpo pri mário. Em um kit diagnóstico adequado para medir PHF-tau em uma amostra biológica, os anticorpos do kit podem ser fornecidos pré- ligados a uma fase sólida, como aos poços de uma placa de microtitu- lador.

[0142] O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo refe rências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publi cados, e todos os pedidos de patentes copendentes) ao longo deste pedido estão aqui expressamente incorporadas a título de referência. Modalidades

[0143] A descrição também fornece as seguintes modalidades não limitadoras.

[0144] A modalidade 1 é um anticorpo monoclonal isolado ou fra gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo fosforilado no domínio rico em prolina da proteína tau.

[0145] A modalidade 2 é um anticorpo monoclonal isolado ou fra gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo fosforilado que compreende T212 fos- forilado da proteína tau, de preferência, o anticorpo monoclonal isola do ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epi- topo fosforilado tendo ou contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.

[0146] A modalidade 3 é um anticorpo monoclonal isolado ou fra gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo fosforilado que compreende T217 fos- forilado da proteína tau, de preferência, o anticorpo monoclonal isola do ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epi- topo fosforilado tendo ou contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52.

[0147] A modalidade 4 é um anticorpo monoclonal isolado ou fra gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau fosforilada em um epitopo fosforilado que compreende T212 fosfo- rilado e T217 fosforilado da proteína tau, de preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epitopo fosforilado tendo ou contendo a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 48.

[0148] A modalidade 5 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag mento de ligação a antígeno que compreende: (1) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente; (2) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente; (3) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (4) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente, e LCDR1, LCDR3 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente; (5) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 80, 81 e 9, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (6) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72, 73, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 70, 20 e 21, respectivamente; (7) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 71, 72 e 73, respectivamente e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (8) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (9) HCDR1 HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (10) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; ou (11) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de uma região VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de uma região VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a PHF-tau, e sendo que as regiões framework no domínio da região variá vel da cadeia pesada e no domínio da região variável da cadeia leve compreendem sequências de aminoácidos a partir de uma imunoglobuli- na humana.

[0149] A modalidade 6 é um anticorpo monoclonal isolado ou fra gmento de ligação a antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica às SEQ ID NOs: 26, 27, 28 ou 29, ou uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica às SEQ ID NOs: 31, 32, 33 ou 34.

[0150] A modalidade 7 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag mento de ligação a antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idênti ca, e com a máxima preferência 100% idêntica às SEQ ID NOs: 74, 76, e 78, ou uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência ao menos 85%, de prefe rência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à região variável em uma cadeia leve de qualquer das SEQ ID NOs: 75, 77 e 79.

[0151] A modalidade 8 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag mento de ligação a antígeno que compreende: (1) uma VH que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e a VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (2) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e uma VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (3) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26 e uma VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (4) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e uma VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (5) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27 e uma VL tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; (6) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 74 e uma VL tendo a sequência de polipeptídeos da cadeia leve da SEQ ID NO: 75; (7) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 76 e uma VL tendo a sequência de polipeptí- deos da cadeia leve da SEQ ID NO: 77; ou (8) uma VH tendo a sequência de polipeptídeos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 78 e uma VL tendo a sequência de polipeptí- deos da cadeia leve da SEQ ID NO: 79.

[0152] A modalidade 9 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag mento de ligação ao antígeno compreendendo uma cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80, de preferência, ao me nos 85%, com mais preferência ao menos 90%, com mais preferência ao menos 95% idêntica, com amis preferência ao menos 98% idêntica, com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 45 e uma ca deia leve que tem a sequência ao menos 80% do polipeptídeo, de pre ferência ao menos 85%, de preferência ao menos 90%, com mais pre ferência ao menos 95%, com mais preferência ao menos 98% idêntica, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 46.

[0153] A modalidade 10 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra gmento de ligação de antígeno de qualquer das modalidades 1 a 9, que compreende uma região constante de IgG1 de cadeia pesada humana e uma região constante kappa de cadeia leve humana.

[0154] A modalidade 11 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra gmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 10, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se liga a PHF-tau humano com um KD de 5x10—9 M ou menos, de preferência um KD de 1xio—9 Mou menos ou lxio-10Mou menos, sendo que a KD é medida por análise de ressonância de plásmon de superfície, como pelo uso de um sistema Biacore.

[0155] A modalidade 12 é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno de qual quer das modalidades 1 a 12.

[0156] A modalidade 13 é um vetor que compreende o ácido nu- cleico isolado da modalidade 12.

[0157] A modalidade 14 é uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico da modalidade 13.

[0158] A modalidade 15 é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11 e um veículo farma- ceuticamente aceitável.

[0159] A modalidade 16 é um método para reduzir a agregação patológica de tau ou a disseminação de taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a com posição farmacêutica da modalidade 15.

[0160] A modalidade 17 é um método de tratamento de uma taupatia, em um indivíduo que necessita do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da modalidade 15.

[0161] A modalidade 18 é o método da modalidade 17, que com preende ainda administrar ao indivíduo um agente adicional para tratar a taupatia no indivíduo que precisa do mesmo.

[0162] A modalidade 19 é um método para tratar uma taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 15, sendo que a taupatia é selecionada do grupo que consiste em taupatia ser selecio nada do grupo que consiste em doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neu- rofibrilares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, sín- drome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann- Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilística (doença do boxe).

[0163] A modalidade 20 é o método da modalidade 19, que com preende ainda administrar ao indivíduo um agente adicional para tratar a taupatia no indivíduo que precisa do mesmo.

[0164] A modalidade 21 é um método para produzir o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das mo dalidades 1 a 11, que compreende cultivar uma célula que compre ende um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento de li gação a antígeno sob condições para produzir o anticorpo ou frag mento de ligação a antígeno, e recuperar o anticorpo ou o fragmentos de ligação ao antígeno da célula ou cultura celular.

[0165] A modalidade 22 é um método para produzir uma composi ção farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal ou frag mento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11, que compreende combinar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0166] A modalidade 23 é um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11 para uso no tratamento de uma taupatia, em um indivíduo que preci sa do mesmo.

[0167] A modalidade 24 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag mento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11 ou da composição farmacêutica da modalidade 15 para uso no tratamento de uma taupatia, como doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cro mossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degenera çãocorticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demên cia apenas com emaranhados, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, complexo esclerose late ral amiotrófica-parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosi- te por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múlti plos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cere bral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalo- patia traumática crônica, ou demência pugilística (doença do boxe), em um indivíduo que precisa do mesmo.

[0168] A modalidade 25 é um uso de um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modali dades 1 a 11 para a fabricação de um medicamento no tratamento de uma taupatia em um indivíduo que precisa do mesmo.

[0169] A modalidade 26 é um uso de um anticorpo monoclonal iso lado ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11 para a fabricação de um medicamento para tratar uma taupatia, com doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, de mência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, de mência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica- parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por cor pos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sis temas,doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefa- lopatia traumática crônica, ou demência pugilística (doença do boxe), em um indivíduo que precisa do mesmo.

[0170] A modalidade 27 é um método para detectar a presença de tau fosforilada em uma amostra biológica de um indivíduo, que com preende colocar a amostra biológica em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11, e detectar a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com a PHF-tau na amostra do indivíduo.

[0171] A modalidade 28 é o método da modalidade 27, em que a amostra biológica é um sangue, soro, plasma, fluido intersticial ou amostra de fluido espinal cerebral.

[0172] A modalidade 29 é um método para diagnosticar uma taupatia em um indivíduo mediante a detecção da presença de tau fosforilada em uma amostra biológica do indivíduo, que compreende colocar a amostra biológica em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer das modalidades 1 a 11, e detectar a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com o PHF-tau na amostra do indivíduo.

Exemplos

[0173] Os exemplos a seguir da invenção são fornecidos para ilustrar ainda a natureza da invenção. Deve-se compreender que os exemplos a seguir não limitam a invenção e que o escopo da inven ção é determinado pelas reivindicações em anexo.

Exemplo 1 - Caracterização de anticorpo

[0174] O PT3 e um conjunto de anticorpos derivados da imuniza ção de um camundongo Balb/c com PHF-tau enriquecido (ePHF-tau) de cérebro com DA foi testado quanto à seletividade alvo para fosfo- tau versus não fosfo-tau em um ensaio imunoabsorvente ligado a en zima direta (ELISA), Western blot e imuno-histoquímica (IHC). O PT3 é um anticorpo derivado de hibridoma de camundongo que tem a se quência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25 e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 30. As sequências da CDR para os domínios VH e VL de PT3 são mostrados na patente US n° 9.371.376. O PT3 foi humanizado com o uso do método de adaptação de framework hu-mano (HFA) (consulte o Exemplo 4) para gerar anticorpos anti-fosfo- tau humanizados da invenção (consulte as Tabelas 1 e 2). O B296 humanizado tem as mesmas sequências da CDR que PT3. O mAb B296 humanizado foi maturado por afinidade para gerar anticorpos adicionais da invenção (consulte a Tabela 3).

ELISA

[0175] O PT3 recombinante como IgG1 de camundongo (mIgG1) foi avaliado quanto à ligação com PHF-tau e tau do tipo selvagem hu mano recombinante em formato ELISA. Este PT3 derivado recombi- nantemente foi comparado com o PT3 purificado derivado de hibrido- ma. Os resultados demonstraram curvas de titulação de ligação com- paráveis entre bateladas de anticorpos derivados de hibridoma purifi cados e PT3 recombinantemente derivados (Figura 1). Forte ligação esta va presente no PHF-tau, e ligação mínima estava presente no tau solúvel nas concentrações mais altas.

Western Blot

[0176] A análise Western blot foi realizada com PT3 contra tau humana recombinante, não fosforilada, purificada e PHT-tau insolúvel em sarcosil preparadas de cérebro com DA. O PT3 mostrou uma reatividade sele tiva com PHF-tau, similar aos anticorpos de referência fosfo-seletivos AT8 pS202/pT205/pS208 (Mercken et al., ACTA Neuropathol. 84(3):265-72, 1992; Malia et al., Proteins. 84:427-434, 2016) e AT100 pT212/pS214 (Mercken et al., 1992, Id.; Hoffmann et al., Biochemistry. 36(26):8114-24, 1997) (Figura 2). O anticorpo de referência fosfo- independente HT7 (Mercken, Ph.D. Thesis: University of Antwerp, Wilrijk- Antwerp, 1991) reagiu com tau recombinante e PHF-tau. BT2, que é di-recionado a um epitopo que é fosfo-sensível, reagiu apenas com tau re- combinante não fosforilada em S199/S202 (Mercken, 1991, Id.). Em ou tros experimentos de western blot, o PT3 mostrou uma fraca reatividade com o tau recombinante mesmo quando transferido ("blotted") a uma concentração mais alta.

Imuno-histoquímica em cérebro humano

[0177] Análise imuno-histoquímica foi realizado em seções do cérebro com DA e de controle que foram embebidas em parafina e fixadas em formalina para confirmar a reatividade com taupatia in si tu. O PT3 mostrou um padrão de reatividade similar, mas mais forte, ao controle positivo, anticorpo diagnóstico taupatia-específico de refe rência AT8 (Figura 3). Nenhuma reação significativa com tau normal no cérebro de controle foi detectada sob essas condições experimen tais (Figura 4).

Imuno-histoquímica em camundongos do tipo nocauteados ("knock-out" do tipo selvagem e nocauteados tau

[0178] A análise de IHC foi realizada com PT3 em cérebro de ca mundongo nocauteado de tipo selvagem e knockout tau. A análise de IHC com PT3 em cérebro de camundongo do tipo selvagem indica que um grupamento selecionado de tau do tipo selvagem pode ser observado sob condições de conservação ótima do epitopo. O padrão de coloração de PT3 revela uma localização somatodentritica (Figura 5, seta), reminis- cente da coloração descrita na literatura para anticorpos anti-fosfo-tau em tecido derivado de biópsia em seres humanos e ratos (Matsuo et al., Neuron. 13(4):989-1002, 1994). O padrão típico de coloração axonal não- fosfo para tau, conforme observado com o anticorpo tau-1 (Figura 6, se ta) não está presente, indicando que PT3 tem reatividade limitada com o pool fisiologicamente importante de tau ligado a microtúbulo. A ausência de reatividade em o tau nocautear Animais confirma o tau especificidade do PT3 padrão de coloração.

[0179] A presença de fosforilação no epitopo de PT3 (pT212/pT217, consulte o Exemplo 2) no cérebro de camundongo do tipo selvagem é suportada pela detecção de fosforilação no camun dongo homólogo de T212 e T217 em análise por espectrometria de massa por Morris et al. (Nat Neurosci. 18(8):1183-9, 2015). Sugere que o epitopo de PT3 também estará presente em um estágio inicial de fosforilação da tau e formação do agregado, que seria preferível para um epitopo do anticorpo terapêutico.

Avaliação da ligação por ressonância de plásmon de superfície (SPR, "surface plasmon resonance")

[0180] As interações com PHF-tau e tau recombinante foram avali adas por SPR em instrumentos ProteOn (Bio Rad, Hercules, CA, EUA) e Biacore (Biacore, Uppsala, Suécia) para anticorpos anti-PHF-tau PT1 e PT3. O anticorpo tau total HT7 foi testado como um controle positivo, e AT8 foi testado como um anticorpo anti-PHF-tau de referência.

[0181] As Tabelas 4 e 5 mostram resultados representativos da avaliação de afinidade dos anticorpos com PHF-tau e tau recombinan- te. O anticorpo monoclonal PT3 mostrou ligação muito apertada ao PHF-tau (Tabela 4). Tabela 4. Afinidades medidas com ProteOn SPR para hibridoma e mAbs e Fabs recombinantes com PHF-tau hyb, mAb expresso por hibridoma; rec, mAb recombinante; a Os valores de KD em parênteses foram obtidos por exclusão da concentração de mAb injetada de 75 nM.

[0182] A afinidade de ligação aparente (KD) de PT3-mG2a recom- binante foi igual a ou mais forte que 16 pM com velocidades de disso ciação muito lentas. Apenas uma ligação muito fraca ao tau recombi- nante foi observada para PT3 expresso por hibridoma em uma de qua tro réplicas (Tabela 5). Tabela 5: Afinidades medidas com SPR/Biacore para hibridoma e mAbs e Fabs recombinantes com tau recombinante hyb, mAb expresso por hibridoma; rec, recombinante; a Testado em ProteOn com tau recombinante da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA) (0,12 a 75 nM nas diluições 5x) que foi posteriormen- te determinado como sendo agregado. Para todas as outras amostras testadas, tau recombinante gerado in-house foi usado no Biacore.

[0183] Devido à natureza multimérica/agregada do PHF-tau com múltiplas cópias do epitopo e a natureza bivalente das IgGs, a afinidade dos anticorpos monoclonais foi influenciada pela avidez nesse formato de estudo. A afinidade de Fab fornece informações sobre a afinidade intrín seca do anticorpo. O Fab de PT3 mostrou uma forte afinidade de ligação intrínseca com PHF-tau (KD, = 63 pM) e uma taxa de dissociação lenta (Tabela 4). A reatividade do Fab com tau recombinante em SPR Biacore estava abaixo do limite de detecção sob as condições da análise (Tabela 5).

[0184] Os estudos de caracterização demonstraram que PT3 se liga seletivamente a PHF-tau e que PT3 tem uma alta afinidade em relação ao PHF-tau derivado do cérebro com DA.

Exemplo 2 - Mapeamento do epitopo de PT3

[0185] O epitopo de PT3 foi determinado por ressonância de plás- mon de superfície (ProteOn) com um painel de fosfopeptídeos represen tados na Tabela 6.

[0186] Materiais e Métodos.O Fab de PT3 (B187) foi produzido co mo uma versão quimérica com uma região variável de camundongo e uma região constante IgG1/K humana, com uma etiqueta His6x no termi nal C da cadeia pesada (VH10, SEQ ID NO: 25) e VL7 (SEQ ID NO: 30). O Fab foi produzido por expressão temporária em células HEK-293, puri ficado por cromatografia de afinidade com níquel, e dialisado em 20 mM de Tris, pH 7,4, 50 mM de NaCl (Sino Biologicals).

[0187] A afinidade de ligação do Fab de PT3 em relação a cada um do catorze fosfopeptídeos tau mostrados na Tabela 6 foi avaliada por ressonância de plasmón de superfície (SPR) com o uso de Bio Rad ProteOn XPR36. Os peptídeos foram sintetizados por métodos químicos convencionais (New England Peptide) com biotina de cadeia curta e uma porção PEG4 no terminal N. O peptídeo radbiotinilado foi capturado em um chip de biossensor NLC revestido com neutravidina e um fluxo de Fab de PT3 escorreu sobre superfície para medir parâmetros cinéticos.

[0188] Todos os experimentos foram realizados a 25°C com o uso de solução salina tamponada com fosfato, pH de 7,4, 0,005% de Tween- 20 (PBST), que foi usado como tampão de corrida e tampão e diluição de amostra. Antes de executar as amostras, o chip NLC foi condicionado NLC executando STFT sobre a superfície do chip durante 1 horas. Apro-ximadamente 5 a 10 RU de peptídeo foi capturado na superfície do cir cuito integrado por diluição do peptídeo para 10 ng/mL em PBST e inje ção sobre os canais de fluxo a 30 µL/min durante 100 segundos. Dilui ções seriais de Fab PT3 (1,1 a 90 nM) foram analisadas e, com a exce ção do peptídeo-8, cada concentração foi medida em duplicata. Após a captura de peptídeos, a titulação de anticorpo foi injetada a 60 µL/min por 3 minutos (fase de associação), seguido de 300 segundos de tampão apenas (fase de dissociação).

[0189] Os dados foram duplamente referenciados por subtração da resposta interposta e as curvas geradas pela injeção de tampão apenas. A superfície do chip foi regenerada com o uso de uma única injeção de 0,85% de ácido fosfórico a 30 µL/min durante 100 segun dos de tempo de contato, seguido de quatro injeções de tampão de corrida antes da próxima injeção de titulação de anticorpos. O pro cessamento dos dados e a análise cinética foram feitas com o uso de software do instrumento. Os dados foram analisados com o uso de um modelo de ligação simples Langmuir 1:1.

[0190] Resultados. As constantes de velocidade de cinética e afi nidades de ligação de equilíbrio para o Fab de PT3 são mostradas na Tabela 6. Tabela 6: Dados de afinidade de ProteOn SPR para ligação de Fab PT3 aos peptídeos Para n=2, a faixa é relatada; Para o peptídeo-3, n=3, o desvio padrão é relatado; Para o peptídeo-8, n=1, nenhuma média ou faixa é relatada; *** A menos que observado, todos os peptídeos incluem resíduos de tau 204 a 225 (isoforma 2N4R) e contêm uma porção de biotina de cadeia curta (SCBiot) e dPEG4 no N-terminal e uma amida no C- terminal ; # O peptídeo-11 inclui os resíduos de tau 202 a 220 (isoforma 2N4R).

[0191] O Fab de PT3 mostrou ligação aos peptídeos fosforilados nanomolares em T212 ou T217, e a ligação de Fab PT3 foi reforçada quando ambos T212 e T217 foram fosforilados. A melhor ligação de Fab PT3 foi com peptídeos contendo pT212 e/ou pT217. O Fab de PT3 ligado com afinidade similar ao peptídeo de tau fosforilado em T212/T217 (peptídeo-2) e ao peptídeo de tau fosforilado em T212/S214/T217 (peptídeo-1), demonstrou que a fosforilação adicional em S214 não acentua a ligação do Fab de PT3. O Fab de PT3 apresentou apenas uma ligação muito fraca com o peptídeo pS214-tau (peptídeo-9). Pouco ou nenhum efeito de ligação foi observado quando S210 foi fosfori- lado sozinho ou em combinação com outros resíduos fosforilados. A fosfo- rilação em T220 pareceu contribuir para a perda de atividade de ligação para Fab de PT3 (peptídeo-9 em comparação com o peptídeo-13). Ne nhuma atividade de ligação foi detectada para Fab de PT3 contra pep- tídeo tau não fosforilado (peptídeo-C). PT3 se liga a um fosfoepítopo no domínio rico em prolina de tau.

[0192] Os estudos de ligação sugerem que o epitopo de PT3 in clui pT212 e pT217, e que um epitopo de ligação máxima de PT3 in clui pT212/pT217 tau duplamente fosforilado. O epitopo de PT3 é dis tinto de outros epitopos relatados para anticorpos anti-tau fosfo- dependente, como AT8 (pS202/pT205/pS208; Malia et al., 2016 Id.), AT180 (pT231; Goedert et al., Biochemical J. 301(Pt3):871-877), AT270 (pT181; Goedert et al., Id.), PHF1 (pS396/pS404; Otvos et al., J Neurosci Res. 39(6):669-73, 1994), 12E8 (pS262; Seubert et al., J Biol Chem. 270(32):18917-22, 1995), anticorpo anti-tau pS422 (Collin et al., Brain. 137(Pt 10):2834-46, 2014), e anticorpo anti-tau pS409 (Lee et al., Cell Rep. 16(6):1690-700, 2016).

Exemplo 3 - Estrutura cristalina do complexo de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pT217-tau

[0193] As coestruturas do Fab de PT3 (B187) com dois fosfopep- tídeos tau foram determinadas por cristalografia de raios de X, que levou à identificação do epitopo tau e do parátopo de PT3.

[0194] Preparação e cristalização da amostra. Os peptídeos para cristalização foram sintetizadas por New England Peptides e tinham as seguintes sequências: Ac-GSRSR(pT)P(pS)LP(pT)PPT-OH (SEQ ID NO: 61) que corresponde aos resíduos 207 a 220 de tau-441 (isoforma 2N4R) fosforilados nos resíduos T212, S214 e T217 (peptídeo pT212/pS214/pT217-tau) e Ac-SR(pT)PSLP(pT)PPTRE-OH (SEQ ID NO: 62), que corresponde aos resíduos 210 a 222 fosforilados em T212 e T217 (peptídeo pT212/pT217-tau). Os peptídeos liofilizados foram dis solvidos em 100 mM de Tris, pH 8,5 a cerca de 55 mg/mL.

[0195] O Fab de PT3 foi concentrado até 19,64 ou 17,76 mg/mL e misturado com um excesso molar de 10,7 ou 9,3 vezes do peptídeo pT212/pS214/pT217-tau ou do peptídeo pT212/pT217-tau para trazer a concentração final do complexo final para 16,9 e 16,7 mg/mL em 20 mM de Tris, e pH 7,5, 100 mM ou 50 mM de NaCl, respectivamente. A cristalização foi realizada com telas in-house e PEGs (Qiagen) com o uso do robô de cristalização Mosquito, e mistura de 150 nL do comple xo e 150 nL de solução de reservatório. Os cristais para difração foram obtidos nas seguintes condições: Complexo de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pS214/pT217-tau em 0,1 M de acetato, pH 4,5, 18% de PEG 3350, 0,2 MgCl2, e complexo de Fab PT3 + peptídeo pT212/pT217-tau em 20% de PEG 3350, 0,2 M de fosfato de amônio (monobásico).

[0196] Coleta de dados e determinação da estrutura. Um cristal do complexo de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pS214/pT217--tau foi cole- tado de 0,1 M de acetato, pH 4,5, 18% de PEG 3350, 0,2 M de MgCl2 (licor mãe) e misturado com solução crioprotetora composta do licor mãe suplementado com 20% de glicerol. O cristal foi resfriado rapida mente em nitrogênio líquido, e os dados foram coletados em um gera dor de raios X de microfoco Rigaku MicroMaxTM- 007HF equipado com óptica confocal OsmicTM Varimax™, detector CCD Saturno 944, e um sistema de crioresfriamento X-stream™ 2000 (Rigaku).

[0197] Os dados foram processados com XDS (Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66(Pt 2):125-32, 2010). A substituição molecular foi realizada com faser McCoy et al., J Appl Crystallogr. 40(Pt 4):658-674, 2007) na suite de programas PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66(Pt 2):213-21, 2010) com o uso de Fab H3-23:L1-39 (PDB ID: 5I19) Fab como o modelo de busca. Phenix.xtriage identificou a geminação pseudomeroédrica no cristal com 7% de fração geminada. O refinamento foi feito usando-se refino das geminações para a maioria das construções de modelo. O modelo de construção foi com Coot (Emsley e Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60(Pt 12 Pt 1):2126-32, 2004) e o refinamento foi com phenix.refine (Adams et al., 2010, Id.). A fase final do refinamento foi sem refinamento duplo, uma vez que foi posteriormente determinado esse refinamento duplo não melhorou os mapas. Os dados e as esta tísticas de refinamento são mostrados na Tabela 7. Tabela 7: Dados de raios de X e estatísticas de refinamento Os valores do envoltório de alta resolução são indiciados em parêntesis.

[0198] Um cristal único do complexo PT3 Fab + peptídeo T212/pT217-tau foi extraído da gota de cristalização, imerso durante alguns segundos na solução do reservatório (20% de PEG 33500, 0,2 M de fosfato de amônio (monobásico)) suplementado com 20% de gli- cerol e resfriado rapidamente em nitrogênio líquido. Os dados foram coletados na linha de luz 17-ID-B IMCA-CAT, Advanced Photon Source (Argonne, IL, EUA) a 100 K. As intensidades de difração foram coleta das em um detector de Pilatus 6M em uma rotação de 180° com um tempo de exposição de 0,5 seg por imagem de meio grau. Os dados foram processados com XDS (Kabsch, 2010, Id.) na resolução máxima de 2,0 Â. A estrutura foi determinada por substituição molecular com o programa Phaser (McCoy et al., 2007, Id.) usando a estrutura de PT3 Fab + peptídeo pT212/pS214/pT217-tau como modelo de busca. O refi no da estrutura foi realizado com phenix.refine com o uso de NCS (Adams et al., 2010, Id. Os ajustes de modelo foram feitos com o uso do programa Coot (Emsley e Cowtan, 2004, Id.). A coleta de dados de rai os X e estatísticas de refino são dadas na Tabela 7. As distâncias de contato intermoleculares foram calculadas com CONTACT (Collaborati ve Computational Project, número 4, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50(Pt 5):760-3, 1994) usando-se um corte de distância de 4,0 Â e ins pecionado visualmente com Pymol.

[0199] Análise estrutural. A estrutura de Fab de PT3 Fab com o peptídeo pT212/pS214/pT217-tau foi determinada em uma resolução de 2,5 Â. Existem três cópias do complexo por unidade assimétrica conforme descrito abaixo para a estrutura de Fab de PT3 + peptídeo pT212/pT217-tau. A estrutura mostra que PT3 não interage com o fosfato de pS214 quando T212 e T217 são também quando fosforila- dos (dados não mostrados), que é apoiado pelo mapeamento dos fosfopeptídeos por ProteOn (Exemplo 2).

[0200] A estrutura de Fab de PT3 com o peptídeo pT212/pT217-tau foi determinada por cristalografia de raios X em uma resolução de 2,0 Â (Figura 7). Existem três cópias do complexo na unidade assimétrica (có pia 1: cadeias A, C, E; cópia 2: cadeias B D, F; cópia 3: cadeias H, L, P) consistindo em cadeias pesadas A, C, e H, cadeias leves B, D, e L, e cadeias de peptídeo E, F, e P. As três cópias foram muito similares - as regiões variáveis estavam dentro de 0,3 Â rmsd. As Figuras 7 a 8 são da cópia 3 (cadeias H, L, P). Conforme visto na Figura 7, as ca deias de Fab pesadas e leves formam um bolso de ligação rasa, e o peptídeo se deposita através do Fab. O fosfopeptídeo de tau está em uma conformação estendida com características consistentes com a estrutura secundária hélice poliprolin-II.

[0201] Resíduos de paratopo de Fab de PT3 e de epitopo de pep- tídeo de pT212/pT217-tau que compreendem a interface de interação são mostrados nas Figuras 8 e 9, e na Tabela 8. A interface entre PT3 e seu epitopo de peptídeo é composta de interações van der Waals e eletrostáticas, que se estendem a partir dos resíduos de peptídeo 211 a 221. A estrutura do Fab de PT3 no complexo com o peptídeo pT212/pT217-tau mostra que o epitopo inclui os fosfatos de pT212 e pT217. O grupo hidroxila da cadeia pesada Y32 forma uma ligação de hidrogênio importante com um oxigênio do fosfato de pT212. O grupo hidroxila da cadeia lateral de T28 (VH) também forma uma ligação de hidrogênio com um oxigênio do fosfato de pT212. A cadeia pesada K53 forma uma importante interação de ponte salina com pT217. A cadeia pesada W99 forma interações hidrofóbicas com os resíduos da cadeia lateral de L215 e P216 do peptídeo. O resíduo da cadeia pesa da W104 tem interações extensivas com o peptídeo e também faz par te da interface VH/VL. A cadeia leve Y32 forma uma interação hidrofó- bica com P219. As interações eletrostáticas com os fosfatos de pT212 e pT217 são críticas para a seletividade de PT3 para fosfo-tau, e as interações hidrofóbicas ainda contribuem para a alta afinidade de PT3 para pT212/pT217-tau (Exemplo 5) e PHF-tau (Exemplos 1 e 6). Tabela 8: Epitopo e parátopo de PT3 Fab + peptídeo pT212/pT217-tau. Os resíduos de Fab de PT3 VH ou VL que interagem com resíduos de peptídeo pT212/pT217-tau são indicados. As interações de ligação ao hidrogênio são indicadas em negrito.

Exemplo 4 - Adaptação de framework humano para PT3

[0202] O anticorpo anti-tau de camundongo PT3 foi humanizado com o uso do método de adaptação de framework humano (HFA) (Fransson et al., J Mol Biol. 398(2):214-31, 2010). Para a adaptação de framework humano, as CDRs foram definidas de acordo com Martin (Martin e Thornton, J Mol Biol. 263(5):800-15, 1996). Para encontrar a melhor combinação de HC e LC humanizadas, várias sequências da região V pesada e leve humana foram selecionadas para o teste. Quatro regiões variáveis de cadeia pesada de PT3 adaptadas a um framework humano e quatro regiões variáveis de cadeia leve de PT3 adaptadas a um fra mework humano foram projetadas e geradas como IgG1 de cadeia pe sada humana completa e moléculas kappa de cadeia leve humana (Figu ra 10). Com base na similaridade de sequência com a VH e VL de PT3 de camundongo em apenas as regiões framework (FR), genes variáveis (V) na linhagem germinativa humana (4 para VH: IGHV3-23*01, IGHV3- 33*01, IGHV3-11*01 e IGHV1-3*01; 4 para VL: IGVK1-16*01, IGVK1- 16*01+, IGKV1-39*01 e IGKV2-24*01) foram selecionados para produzir variantes VH e VL adaptadas a um framework humano. VL78 (IGVK1- 16*01+) é um mutante de ponto único de VL77 (IGVK1-16*01) e contém uma mutação D56S para eliminar um risco potencial de isomerização. Os nomes dos 16 anticorpos monoclonais da variante HFA resultantes da combinação das quatro HC-HFA e quatro moléculas de LC-HFA são mostrados na Tabela 9. Tabela 9: Variantes de PT3-HFA. B234 contém as regiões variáveis do camundongo parental e foi incluído como um controle positivo. O gene da linhagem germinativa humana correspondente é indicado entre pa rênteses. VL78 (IGVK1-16*01+) contém uma mutação de ponto único de VL77 (IGVK1-16*01).

[0203] A clonagem e a síntese de DNA para o painel de 16 variantes HFA-PT3 (hIgG1/K) foram realizadas por métodos-padrão. O DNA foi transfectado em células HEK (Expi293) por protocolos padrão, e os so- brenadantes celulares foram coletados após 5 dias em cultura. O sobre- nadante clarificado foi purificado com o uso de uma Protein BioSolutions ProteinMaker (Gaithersburg, MD, EUA) para purificação paralela de alto rendimento pela captura de IgG na resina MabSelectSure Protein A pré- equilibrada em 1x dPBS, pH 7,2. Após a lavagem da coluna com 1x de dPBS, pH 7,2, o anticorpo monoclonal foi eluído com o uso de 0,1 M de acetato de sódio, em pH 3,5. As frações de eluição foram neutralizadas pela adição de 2,5% M de Tris-HCl, pH 7,2 a 20% em volume, e a formu lação de proteína final foi 0,08 M Na de acetato de Na, 0,5 M de Tris HCl, pH 7,1.

[0204] A avaliação inicial do painel de HFA foi com base no rendi mento da purificação, perfil de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC), ligação a PHF-tau em ensaios de ligação ELISA e caracterização biofísica.

[0205] O Fab de B296 (B324) e o Fab de B252 (B326) também foram gerados por pareamento das regiões variáveis de HC e LC dos anticorpos monoclonais correspondentes com uma IgG1 huma- na/região constante K e uma etiqueta 6xHis no terminal C da cadeia pesada. B324 e B326 foram expressos em células HEK (Expi293) e purificados por um método similar conforme descrito (Zhao et al., Pro tein Expr Purif. 67(2):182-9, 2009).

Exemplo 5 - Caracterização de anticorpos PT3-HFA por SPR em fos- fopeptídeos

[0206] Um subconjunto de variantes de anticorpos monoclonais de ressonância de plasmón de superfície selecionados com base em ca-racterização biofísica e ligação por ELISA ao PHF, foram analisados por ressonância de plásmon de superfície (SPR) com um instrumento ProteOn XPR36 para ligação aos seguintes fosfopeptídeos: peptídeo pT212/pT217-tau (peptídeo-2, SEQ ID NO: 48) e peptídeo pT212-tau (peptídeo-8, SEQ ID NO: 54). Todos os experimentos foram realizados a 25°C com o uso de PBST, pH 7,4, (Bio-Rad Cat# 176-2720), que foi usado como tampão de corrida e tampão de diluição de amostra.

[0207] Ligação de anticorpo/peptídeo monoclonal. Após o pré- condicionamento com PBST, uma superfície do biossensor foi preparada revestindo-se um chip sensor GLC Biorad com Fc anti-humano (Jackson 109-005 -098) a uma densidade de aproximadamente 6.500 RU. A IgG humana foi acoplada por amina à superfície do chip com o uso de EDC/NHS e, então, lavada com etanolamina. Os anticorpos foram diluí dos a 2 µg/mL em PBST e injetados sobre a superfície por 5 minutos a 30 µL/min para alcançar uma densidade máxima de 900 a 1000 RU. Os peptídeos foram injetados como analitos a 60 µL/min por 3 min, seguido de 5 min de dissociação. O peptídeo-2 foi diluído em PBST para gerar uma série de concentração 3x (0 a 30 nM) e medido em duplicata. Medições únicas de ligação do anticorpo monoclonal ao peptídeo-8 foram feitas na faixa de concentração 0 a 100 nM.

[0208] Ligação de Fab/peptídeo. O peptídeo biotinilado foi captu rado em um chip de biossensor NLC revestido com neutravidina pré- condicionados com PBST, e o Fab foi passado sobre a superfície para os medir parâmetros cinéticos. Aproximadamente 5 a 10 RU de peptí- deo foram capturados na superfície do chip por diluição do peptídeo para 10 ng/mL em PBST e injeção sobre os canais de fluxo a 30 µL/min durante 100 s. As diluições seriais de Fab de PT3 (1,1 nM para 90 nM) foram injetadas a 60 µL/min durante 3 minutos (fase de associ ação), seguido de 300 seg de tampão apenas (fase de dissociação).

[0209] Dupla referência aos dados foi feita por subtração da res posta interposta, e as curvas geradas pela injeção de tampão apenas. A superfície do chip foi regenerada com 0,85% de ácido fosfórico, se guido de injeção de PBST antes da próxima injeção de titulação de anticorpos. O processamento e a análise dos dados foram feitos com o uso de um software. Os dados foram ajustados com o uso de um mo delo de ligação simples Langmuir 1:1.

[0210] As constantes de taxa cinética e as afinidades de ligação de equilíbrio para IgGs de PT3-GHA em relação ao peptídeo-8 são mostradas na Tabela 10. B234 contém as regiões variáveis de PT3 de camundongo e a região constante de IgG1/Khumana. Dentre as variantes humanizadas, B296 mostrou a ligação mais forte com o peptídeo-8 (pT212-tau). Tabela 10: Dados de afinidade de ProteOn SPR para ligação do painel de mAb de PT3-HFA ao peptídeo-8 n=2 para todos os anticorpos

[0211] As constantes de taxa cinética e as afinidades de ligação de equilíbrio para IgGs de PT3-GHA em relação ao peptídeo-2 são mos tradas na Tabela 11. B252 e B296 mostraram a ligação mais forte com o peptídeo-2 (pT212/pT217-tau), com valores médios de KD e de 172 e 190 pM, respectivamente. Tabela 11: Dados de afinidade de ProteOn SPR para ligação do painel de mAb de PT3-HFA ao peptídeo-2 n=2 para todos os anticorpos

[0212] A afinidade dos Fabs de B296 e B252 foi medida no peptí- deo pT212/pT217-tau (peptídeo-2) por ProteOn e comparada ao Fab parental de camundongo B187 (Tabela 12). Houve um aumento de 2,7 a 5,1x na taxa de dissociação e um aumento de 3,5 a 5,6x nos valores de KD para os Fabs-HFA comparados ao camundongo paren tal. O Fab de B296 (B324) mostrou uma afinidade maior pelo peptí- deo pT212/pT217-tau do que o Fab de B252 (B326), e também uma velocidade de dissociação mais lenta. Tabela 12: Dados de afinidade de ProteOn SPR pelos Fabs de PT3- HFA que se ligam ao peptídeo-2 n=2 para todos os Fabs

Exemplo 6 - Caracterização de anticorpos PT3-HFA por SPR em PHF- tau e tau recombinante

[0213] Um subconjunto de anticorpos monoclonais de PT3-HFA foi testado quanto à ligação a PHF-tau isolado do cérebro com doen ça de Alzheimer. Todas as interações foram estudadas a 25°C usan do PBS a pH 7,4, suplementado com 3 mM de EDTA, e 0,005% de Tween-20 como o tampão de corrida e do sistema. HT7 (Pierce, catá logo #MN1000), um anticorpo anti-tau de camundongo, foi usado co mo um controle positivo.

[0214] A interação dos anticorpos monoclonais anti-tau com PHF- tau foi analisada por ProteOn com o uso de uma superfície do biossen sor preparada por acoplamento por captura de PHF-tau com o uso de HT7 como o reagente de captura. PHF-tau foi preparada por duas cen trifugações a 5.000xg a 5°C durante 10 min; o sobrenadante da segun- da centrifugação foi então diluído 1/40 em tampão de corrida. Para pre parar o chip, o HT7 foi imobilizado covalentemente à superfície de um chip sensor GLC (ProteOn) de acordo com as instruções do fabricante para química de acoplamento de amina (~5.000 unidades de resposta (RU)). O tampão de acoplamento foi acetato de sódio a 10 mM, pH 4,5. Após a imobilização de HT7, PHF-tau foi injetada e capturada (~300 RU) por HT7. Após a captura, PHF-tau foi covalentemente imobilizada ao chip do senso por ativação do chip de acordo com as instruções do fabricante para química de acoplamento de amina. Os sítios reativos restantes foram bloqueados pela injeção de etanolamina. Após a prepa ração e estabilização da superfície modificada de PHF-tau e da superfí cie de referência (não contendo antígeno), os anticorpos anti-tau foram diluídos no tampão de corrida e injetados em solução (0,12 a 75 nM nas diluições 5x). A associação foi monitorada durante 3 minutos (120 µL injetados a 40 µL/minuto). A mistura foi agitada durante 15 minutos. A regeneração da superfície do sensor foi realizada com o uso de 10 mM Gly pH 2,0. Os dados para anticorpos monoclonais foram ajustados com o uso de um modelo de ligação bivalente no qual a afinidade apa rente (KD) foi relatada como a razão de koff/kon. Um modelo de ligação Langmuir 1:1 foi usado para a análise cinética dos Fabs.

[0215] A maioria dos anticorpos monoclonais de HFA reteve uma ligação forte similar à do anticorpo monoclonal PT3 parental de camun dongo, na faixa de 27 a 165 pM (Tabela 13). B252 e B296, os dois anti corpos monoclonais HFA do topo, apresentaram afinidades de 32 e 27 pM, respectivamente. B235 foi o anticorpo monoclonal que apresentou a afinidade mais fraca (165 pM) dentre os anticorpos desse painel. B324 (Fab de B296) e B326 (Fab de B252) foram avaliados quanto à ligação com PHF-tau e mostram uma KD, 2,5 e 3,3 vezes mais fraca, respecti vamente, do que o Fab de PT3 parental de camundongo de B187. B324 mostrou uma afinidade 1,3 vezes mais forte (KD) e uma taxa de dissocia- ção 1,7 vezes mais lenta de vezes do que B326. As afinidades de Fab foram mais fracas do que seu anticorpo monoclonal correspondente, su gerindo avidez para o anticorpo monoclonal em relação ao PHF-tau. B352, uma variante de IgG4 de B296 com as mesmas regiões variáveis, também foi testado quanto à ligação a PHF-tau e a afinidade (43 pM) foi de 2 vezes àquela de B296 (Tabela 11). Tabela 13: Afinidades medidas com ProteOn SPR para mAbs e Fabs de PT3-HFA com PHF-tau mAbs: n=2 com 3 réplicas em cada experimento Fabs: n=2 com 2 réplicas em cada experimento B352: n=2 com 4 réplicas em cada experimento

[0216] A interação dos anticorpos e Fabs monoclonais anti-tau com tau de controle expresso recombinantemente (isoforma de tau humana 2N4R 441 aa, etiqueta His6x no terminal N, SEQ ID NO: 63) foi estudada com um Biacore T200. Uma superfície do biossensor foi preparada pelo acoplamento de um anticorpo (Ab) anti-IgG humana específico de IgG ou anti-Fd à superfície de um chip de sensor CM5 de acordo com as instru ções do fabricante para a química de acoplamento de amina (~6.500 unidades de resposta (RU). O tampão de acoplamento foi acetato de só dio a 10 mM, pH 4,5. Os anticorpos anti-tau foram diluídos no tampão de corrida e injetados para obter uma captura de ao menos 5 RU. A captura de anticorpos ou Fabs monoclonais anti-tau foi seguida de injeção de tau de controle expresso recombinantemente em solução (0,12 a 75 nM nas diluições 5x). A associação foi monitorada durante 3 minutos (150 µL de injetados a 50 µL/minuto). A dissociação foi monitorada até se observar uma diminuição de ao menos 5% do sinal para uma determinação de taxa de dissociação adequada. A regeneração da superfície do sensor foi obtida com 0,85% de ácido fosfórico seguido de 50 mM de NaOH. Os dados para os anticorpos e os Fabs monoclonais foram ajustados usan do se um modelo de ligação de Langmuir 1:1 se ligação foi observada.

[0217] Nenhum dentre B324 e B326 mostrou ligação significativa ao tau de controle. B296 também não mostrou nenhuma ligação com o tau de controle.

Exemplo 7 - Estrutura cristalina do complexo de B324 + peptídeo pT212/pT217-tau

[0218] A coestrutura de B324 com o peptídeo pT212/pT217-tau (SEQ ID NO: 62) foi determinada por cristalografia de raios X, o que levou à identificação do epitopo tau e do parátopo B324 (e B296).

[0219] Preparação e cristalização da amostra. B324, que é o Fab de B296 com VH92 e VL77, foi produzido por expressão temporária em células HEK 293, e purificado por cromatografia de afinidade com níquel, SEC, e troca iônica em um tampão final de 20 mM de MES, pH 6,0, 0,2 M de NaCl. O peptídeo pT212/pT217-tau (SEQ ID NO: 62), descrito no Exemplo 3, foi usado para cocristalização. Para a prepara ção do complexo de Fab B324 + peptídeo pT212/pT217-tau, um ex cesso molar de 10 vezes do peptídeo foi adicionado.

[0220] A cristalização do Fab B324 + peptídeo pT212/pT217-tau foi realizada a 9 a 18 mg/mL em 20 mM de MES, pH 6,0, 0,2M de NaCl. A triagem de cristalização inicial foi realizada com o robô de cristalização Mosquito pelo método de difusão de vapor em gota sen tada a 20°C com o uso de duas telas in-house e PEGs (QIAGEN). Os cristais apareceram a partir de 0,1 M de acetato de sódio, pH 4,6, 20% de PEG 10K e as sementes foram produzidas por homogeneiza ção mecânica com um kit SeedBead (Hampton Research) para uso em triagem de otimização adicional.

[0221] Coleta de dados e determinação da estrutura. Um cristal apareceu a partir de 0,1 M de acetato de sódio, pH 5,5, 37% de PEG200, e o mesmo foi coletado e resfriado rapidamente em nitrogê niolíquido sem crioproteção para coleta de dados por difração de rai os X. Os dados de cristalografia foram coletados na Advanced Pho ton Source (Argonne, IL, EUA) na linha de luz IMCA-CAT 17-ID-B a 100 K. As intensidades de difração foram coletadas em um detector Pilatus 6M em uma rotação de 180° com uma exposição de 0,5 seg por imagem de meio grau. Os dados foram processados com XDS (Kabsch, 2010, Id.) na resolução máxima de 2,6 Â. A estrutura crista lina por raios X de B324 X no complexo com peptídeo pT212/pT217-o foi resolvida por substituição molecular com Phaser (de McCoy et al., 2007, Id.) com o uso de uma estrutura de Fab relacionada como um modelo de busca e refinada com Refmac (Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53(Pt 3):240-55, 1997) (Tabela 14). As distâncias de contato intermolecular foram calculadas com CONTACT (Collaborative Computational Project, 1994, Id.) com o uso de um cor te de distância de 4,0 Â e inspecionadas visualmente com Pymol. Tabela 14: Dados de raios X

[0222] Análise estrutural. A estrutura geral da interação de B324 + peptídeo pT212/pT217-tau é mostrada na Figura 11. O peptídeo pT212/pT217-tau se ajuste em um sulco formado na interface da VH e VL de B324. A interface entre B324 e o peptídeo pT212/pT217-tau é compreendida de interações de van der Waals e eletrostáticas, que se estendem a partir dos resíduos de peptídeo 211 a 221 (Figura 12). As seguintes CDRs estão envolvidas na ligação direta com o peptídeo pT212/pT217-tau: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L3. A es trutura de B324 no complexo com o peptídeo pT212/pT217-tau mostra que o epitopo inclui os fosfatos de pT212 e pT217. Um diagrama da inte ração dos resíduos de Fab B324 e resíduos de peptídeo p212/pT217-tau é mostrado na Figura 13. Alguns das principais interações são conforme exposto a seguir: cada um dentre o grupo hidroxila de Y32 da VH e o grupo hidroxila de T28 da VH forma ligações de hidrogênio com diferen tesoxigênios de fosfato de pT212; há interações hidrofóbicas entre as cadeias laterais Y32 da VH e W99 da VH e os grupos metila de L215 do peptídeo de tau; o K53 da VH forma uma interação de ponte salina com o resíduo de peptídeo tau pT217; a cadeia lateral W104 da VH forma uma interação hidrofóbica com o grupo metila de pT217 e uma interação de empilhamento CH-p com P218, e faz parte da interface de VH/VL; a in- dolamida de W104 da VH forma uma ligação de hidrogênio com a hidro- xila de T220 da cadeia lateral; há uma interação hidrofóbica entre a ca deia lateral Y32 e P219 da VL; há uma interação hidrofóbica entre L96 e o grupo metila de T220 de VL; e uma interação hidrofóbica é formada pela cadeia lateral F94 da VL e o grupo metila de T220. As interações eletrostáticas com os fosfatos de pT212 e pT217 são críticas para a sele-tividade de B324 para fosfo-tau, e as interações hidrofóbicas ainda con tribuem para a alta afinidade de B324 para o peptídeo pT212/pT217-tau (Exemplo 5) e PHF-tau (Exemplo 6). O epitopo e parátopo de PT3 e B324 de camundongo são muito similares, indicando que nem o epitopo nem o parátopo são significativamente alterados após a humanização (Figuras 9 e 13, Tabelas 8 e 15). Tabela 15: Epitopo e parátopo de B324+peptíde opT212/pT217-tau. Resíduos de B324 de VH ou VL que interagem com resíduos de peptí deo tau pT212/pT217 são indicados. As interações de ligação ao hidro gênio são indicadas em negrito.

Exemplo 8 - Teste funcional em ensaios celulares

[0223] O PT3 foi testado quanto à inibição da semeadura de tau em dois tipos de ensaios celulares: ensaios de coincubação e ensaios de depleção. Ambos os tipos de ensaio fazem uso de células HEK que expressam dois fragmentos de tau K18 marcados com cromóforo que geram um sinal quando em estreita proximidade, por exemplo, devido a agregação. Quando as células são tratadas com sementes de tau agregado e fosforilado de comprimento total derivado de diferentes fontes, um agregado de K18 é induzido que pode ser quantificado pela alteração da razão de transferência de energia de ressonância por bio- luminescência (isto é, ensaio BRET) ou pela contagem de células posi- tivas à transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) com o uso de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) (isto é, ensaio FRET; Figura 14) (Holmes et al.,2014, PNAS 111(41):E4376-85).

Ensaio de coincubação de homogenatos de células HEK (ensaio BRET)

[0224] Homogenatos contendo sementes de tau para a coincubação foram gerados a partir de uma linhagem celular HEK que superexpres- sam GFP-tauP301L estável que contém tau de comprimento GFP- marcado agregado induzido por K18. As células recipientes foram células HEK que expressam de modo estável K18/P301L-NanoLuc e K18/P301L-HaloTag. As sementes de tau foram coincubadas com o anti corpo de teste e as células HEK contendo cromóforo-K18 receptoras du rante 72 h. A formação do agregado de K18 foi medida pela alteração da razão BRET (590 nm/450 nm). O PT3 bloqueou a indução agregada em 46,97% a 300 nM, 18,02% a 30 nM e 12,57% a 3 nM (Figura 15).

Ensaio de coincubação da medula espinhal (ensaio FRET)

[0225] Homogenatos contendo sementes de tau para a coincuba- ção foram gerados da medula espinhal de animais transgênicos P301S de 22 a 23 semanas de idade que contêm tau humano trans- gênico agregado. Para sensibilidade aumentada, as células recipien tes usadas no ensaio foram células HEK que expressaram de modo estável K18/P301S-YFP e K18/P301S-CFP. As sementes de tau fo ram coincubadas com o anticorpo de teste e as células HEK conten docromóforo-K18 receptoras durante 72 h. A formação do agregado de K18 foi medida pela contagem de células FRET-positivas por FACS. O PT3 bloqueou a indução agregada em 34,03% a 300 nM, 37,02% a 30 nM e 30,68% a 3 nM (Figura 16).

Ensaios celulares de imunodeficiência

[0226] Ensaios de imunodepleção foram realizados para investigar se o valor de inibição percentual máximo estava relacionado à densida de dos epitopos nas sementes ou ao número de sementes que contêm o epitopo de PT3. Nos ensaios de imunodepleção, as sementes de tau foram incubadas com anticorpo de teste e removidas da solução com microesferas de proteína G. O sobrenadante esgotado foi testado quan to à capacidade de semeadura residual nas células HEK contendo cro- móforo-K18 e analisado por FACS, conforme anteriormente descrito (Holmes et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 111(41):E4376-85, 2014).

[0227] Homogenatos contendo sementes de tau para a imunode- pleção foram gerados da medula espinhal de animais transgênicos P301S de 22 a 23 semanas de idade (Figura 17) ou de tecido de cé rebro com DA humano criopreservado (Figura 18). No ensaio de imu- nodepleção de cérebro com DA humano, o sobrenadante após a de- pleção foi testado na presença do reagente de transfecção Lipofec- tamine2000 para obter uma janela de análise aceitável. A semeadura de tau poderia ser quase completamente (>90%) esgotada com PT3 nos extratos da medula espinhal extratos tanto quanto nos homoge- natos totais de cérebro com DA humano (Figuras 17 e 18).

Resultados

[0228] O PT3 inibiu as sementes de tau derivadas de lisatos de célu las HEK e lisatos da medula espinhal de TYgP301S. A inibição máxima obtida nos ensaios foi diferente para diferentes anticorpos anti-fosfo-tau e para as diferentes sementes (Tabela 16). Os valores de inibição obser vados para PT3 a 300 nM foram 46,97 ± 5,87% para sementes de célu las HEK, e 34,03 ± 2,05% para extratos da medula espinhal de TgP301S. Os diferentes valores de inibição máxima de anticorpos fosfo-tau nos di ferentes ensaios de células podem apontar para diferenças no status da fosforilação das sementes de tau usadas. As sementes de tau geradas na medula espinhal de TgP301S são de origem neuronal e espera-se que tenham mais similaridades com as sementes de PHF-tau do que com as sementes de tau de origem de células HEK, e isso poderia expli car as eficácias genericamente mais altas observadas com os anticorpos de fosfo-tau contra os extratos do cordão espinhal em comparação com os lisatos de células HEK.

[0229] A semeadura de tau poderia ser quase completamente esgotada com PT3 nos extratos de medula espinhal e nos homoge- natos de cérebro humano com DA, e esse resultado sugere que a falta de inibição completa nos experimentos de coincubação com o material de semeadura da medula espinhal não foi resultante da pre sença de sementes desprovidas de epitopos de PT3 mas sim da densidade limitada dos epitopos nas sementes. Tabela 16: Resumo dos resultados dos testes funcionais nos ensaios celulares A unidade é a % de controle negativo, média de diferentes experi mentos; a concentração do anticorpo em todos os ensaios foi 300 nM exceto por a inibição em 166,67 nM e b inibição a 89,99 nM.

[0230] O mecanismo de ação da terapia com anticorpos tau é ain da uma questão de debate e múltiplos mecanismos têm sido propos tos. Recentemente, a depuração mediada por anticorpos de sementes extracelulares por células microgliais foi sugerida como um mecanismo de ação dominante (Funk et al., J Biol Hem. 290(35):21652-62, 2015 e McEwan et al., 2017, PNAS 114:574-9). Neste contexto, a imunode- pleção do material de semeadura derivado de cérebro humano pode ser considerada o resultado celular mais translacional, e a alta eficácia do anticorpo de camundongo parental PT3 nesse tipo de ensaio celu- lar sugere que as versões de HFA de PT3 serão agentes terapêuticos eficazes.

Exemplo 9 - Eficácia de PT3 de murino no modelo de injeção de ePHF in vivo

[0231] Para avaliar a eficácia do anticorpo tau in vivo, camundongos que apresentam patologia de tau cerebral são sistemas de modelo es senciais (Julien et al., Methods Mol Biol. 849:473-91, 2012). Vários des ses modelos foram descritos, e eles podem ser genericamente divididos em três grupos: 1) camundongos transgênicos tau que superexpressam tau WT ou mutante (por exemplo, P301L ou P301S) com os mutantes que mostram patologia grave após 5 a 9 meses, dependendo da cepa (Allen et al., J Neurosci. 22(21):9340-51, 2002; Scattoni et al., Behav Brain Res. 208(1):250-7, 2010; Terwel et al., J Biol Chem. 280(5):3963-73, 2005; Yoshiyama et al., Neuron. 53(3):337-51, 2007); 2) camundongos com expressão espaço-temporalmente regulada de tau mutante (por exemplo, P301L) (Liu et al., Brain Imaging Behav. 6(4):610-20, 2012) ou fragmento pró-agregante (por exemplo, K18) (Mocanu et al., J Neurosci. 28(3):737-48, 2008); e 3) camundongos com expressão de tau mutante e de APP que apresentam placa e pa tologias de tau (Oddo et al., J Neurochem. 102(4):1053-63, 2007).

[0232] Embora os camundongos que expressam tau mutante de senvolvam uma patologia forte, o início da patologia pode variar entre os animais, causando variabilidade nos estudos, e a contribuição rela tiva da agregação e disseminação de tau autônomo celular para o si nal de agregação de tau total não é clara. Portanto, modelos que po dem ser usados para eficazmente estudar a semeadura e dissemina ção de tau (por exemplo, de Calignon et al., 2012, Neuron. 73(4):685- 97, 2012; Liu et al., Id.) são de grande valor. O valor translacional de tais modelos é ainda reforçado pela constatação de que a injeção de camundongos ALZ17 (uma cepa que expressa tau humana normal) com homogenatos de cérebro derivados de diferentes taupatias induz a formação de inclusões de tau com uma morfologia que se asseme lha a taupatia no cérebro humano. Por exemplo, a injeção de camun dongos com material de amostras de doença por grãos argirofílicos resultou em depósitos com uma estrutura esferoidal ou semelhante a vírgula característica da própria doença, e a patologia de tau similar à DA foi observada em camundongos injetados com material com DA (Clavaguera et al., 2013, PNAS 110(23):9535-40).

[0233] Dessa forma, foi estabelecido um modelo de injeção de camundongos transgênicos P301L, em que um fragmento pró- agregante de tau, como fibrilas sintéticas de K18 (Li e Lee, Biochemis try. 45(51):15692-701, 2006) é injetado ou sementes de PFH-tau deri vadas de cérebro com DA humano são injetadas em regiões corticais ou do hipocampo de modelos de camundongos transgênicos P301 em uma idade na qual a agregação autônoma celular não se iniciou. O modelo de injeção visa mimetizar o componente crítico de semeadura extracelular de disseminação de tau. A semente de K18 ou PHF-tau semente injetada induz taupatia no local da injeção e, em menor grau, na região conectada contralateral (Peeraer et al., Neurobiol Dis. 73:83 95, 2015). O modelo permite testar o potencial anti-semeadura de an ticorpos, como os anticorpos anti-tau da invenção, quando coinjetados com as sementes de PHF-tau derivado do cérebro ou com as fibrilas K18 (Iba et al., 2015, J Neurosci. 33(3):1024-37, 2013; Iba et al., Acta Neuropathol. 130(3):349-62).

[0234] Um esquema do modelo de injeção de camundongo trans- gênico P301L é mostrado na Figura 19. Resumidamente, a injeção cortical de uma fração insolúvel em sarcosil de cérebro com DA post mortem desencadeia um aumento progressivo lento de agregação de tau. No hemisfério injetado, os primeiros sinais são medidos 1 mês após a injeção e continuam por mais 3 meses após a injeção. Cinco meses após a injeção, alguns animais começam a formar emaranha dos desencadeados pela mutação P301L (Terwel et al., 2005, Id.). Os níveis de coloração de AT8 aumentam entre 1 e 3 meses (Figuras 19C a D e 19E a F) e, portanto, experimentos de eficácia do anticorpo são analisados 2 meses após a coinjeção. Ainda, a injeção hipocam- pal de uma fração insolúvel em sarcosil de cérebro com DA post mortem desencadeia um aumento progressivo dependente de dose de agregação de tau medido pela análise de MesoScale Discoveries (MSD) da fração insolúvel em sarcosil dos hemisférios injetados (Fi gura 19G).

Tratamento animal e injeções intracranianas

[0235] Para estudos de injeção, foram usados na cirurgia camun dongos transgênicos com tau-P301L, que expressam a isoforma mais longa de tau humana com a mutação P301L (tau-4R/2N-P301L) (Terwel et al., 2005, Id.) com 3 meses de idade. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com protocolos aprovados pelo comitê de ética local. Para a cirurgia estereotáxica, os camundongos receberam uma injeção unilateral (hemisfério direito) no córtex (AP +2,0, ML +2,0 de bregma, DC, 2,7 mm da dura-máter) ou no hipocampo (AP -2,0, ML +2,0 (do bregma), DV 1,8 mm de (da dura)) 3 µL (velocidade de 0,25 µL/min) com uma preparação insolúvel em sarcosil de tecido de DA post-mortem (filamentos helicoidais pareados enriquecidos, ePHF) na presença ou ausência de anticorpos monoclonais. No caso de injeções intraperitone- ais (IP) com anticorpos ou solução salina, os tratamentos (20 mg/kg, 2x/semana) foram iniciados 1 semana antes da injeção intracraniana e continuaram até os camundongos serem sacrificados para dissecção (2 meses após a injeção intracraniana).

Procedimento de extração

[0236] O tecido de camundongo do hemisfério injetado foi pesado e homogeneizado em 6 volumes de tampão de homogeneização (10 mM de Tris HCl (pH 7,6). O homogenato foi centrifugado a 27 000 x g durante 20 minutos, e após a coleta de uma alíquota do sobrenadante resultante (homogenato total), 1% de N-lauroilsarcosina foi adicionado. Após 90 mi nutos (900 rpm, 37°C), as soluções foram novamente centrifugadas a 184 000 x g durante 1 hora. Os sobrenadantes foram mantidos como fra ção solúvel em sarcosil, enquanto o pélete contendo o material insolúvel em sarcosil foi ressuspenso em tampão de homogeneização.

Análise bioquímica

[0237] O anticorpo de revestimento (anticorpo anti-AT8 ou um anti corpo tau total) foi diluído em PBS (1 µg/mL) e aliquotado em placas MSD (30 uL por poço) (L15XA, Mesoscale Discoveries), que foram in cubadas de um dia para o outro a 4°C. Após a lavagem com 5 x 200 µL de PBS/0,5% de Tween-20, as placas foram bloqueadas com 0,1% de caseína em PBS e lavadas novamente com 5 x 200 µL de PBS/0,5% de Tween-20. Após a adição das amostras e padrões (ambos diluídos em 0,1% de caseína em PBS), as placas foram incubadas de um dia para o outro a 4°C. Subsequentemente, as placas foram lavadas com 5 x 200 µL de PBS/0,5% Tween-20, e anticorpo de detecção conjugado SUL- FO-TAG™ em 0,1% de caseína em PBS foi adicionado e incubado du rante 2 h à temperatura ambiente e com agitação a 600 rpm. Após uma lavagem final (5 x 200 µL de PBS/0,5% Tween-20), 150 µL de 2X de tampão T foram adicionados e as placas foram lidas com um imageador MSD. Os sinais brutos foram normalizados contra uma curva padrão que consistia em 16 diluições de uma preparação insolúvel em sarcosil de cérebro com DA post-mortem (ePHF) e foram expressos como uni dades arbitrárias (AU, "arbitrary units") de ePHF. A análise estatística (ANOVA com Bonferroni pós-teste) foi realizada com o software Gra phPad Prism.

Resultados

[0238] A atividade de PT3 de camundongo sob o modelo de coin- jeção cortical (Figura 19) foi confirmada em quatro estudos indepen dentes. Os camundongos foram dosados perifericamente de acordo com a Tabela 17 e os resultados são mostrados na Figura 20. Além disso, o aprimoramento do modelo (Figura 19D) permitiu reduzir a dose de ePHF-tau e a dose do anticorpo coinjetado, conforme mos trado na Tabela 18, com os resultados mostrados na Figura 21. Com o uso dessa dose mais baixa de ePHF-tau, verificou-se que o PT3 também tem um efeito significativo na redução de tau agregada quando administrada perifericamente (P<0,0001; Figura 21). Tabela 17: Dose periférica Tabela 18: Dosagem de coinjeção

[0239] A coinjeção de isotipos de ePHF e PT3, incluindo a variante IgG2a PT3-HFA (que contém as regiões variáveis VH92 (SEQ ID NO:27) e VL77 (SEQ ID NO:31) nas regiões constantes de mIgG2a/kappa) de acordo com o layout na Figura 19A, atenuou a agregação de tau induzida por ePHF em camundongos P301L (Figura 22). As injeções foram feitas no córtex. (não no hipocampo). O efeito foi observado no hemisfério injetado (dados bioquímicos, Figura 22B) e no hemisfério não injetado (coloração IHCAT100, Figura 22C). Am bos os isótipos IgG2a e IgG1 reduziram significativamente a indução de taupatia quando coinjetados com o PHF-tau derivado de cérebro com DA (p<0,0001). Os resultados foram confirmados em IHC no he misfério contralateral.

[0240] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a modalidades específicas da mesma, ficará evidente para o versado na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas na mesma sem que se afaste do espírito e do escopo da inven ção.

Exemplo 10 - Comparação entre tau de PSP e tau de DA

[0241] A paralisia supranuclear progressiva (PSP) é um distúrbio neurodegenerativo raro e fatal caracterizado por parkinsonismo, ins tabilidade postural e quedas, paralisia supranuclear do olhar, e de mência (Steele et al., 1964, Archives of Neurology 10:333-359). Pato logicamente existe um acúmulo preferencial de tau com 4 repetições (4R) no tronco cerebral e gânglios basais bem como outras regiões do cérebro (Dickson DW. Handbook of Clinical Neurology 2008;89:487-491; Williams & Lees, 2009, The Lancet Neurology 8:270-279). Dada a ausência de outras patologias como amiloide, a PSP é considerada uma taupatia primária, e os dados do modelo animal sugerem que a tau de PSP pode passar por semeadura aná loga àquela que hipoteticamente ocorre em DA (Clavaguera et al. 2013,PNAS 110:9535-9540; Sanders et al., 2014, Neuron 82:1271 1288). Como tal, a PSP pode ser tratada com o anticorpo da inven ção. Uma série de experimentos foi realizada para caracterizar as semelhanças da tau de PSP e a PHF-tau de DA.

Métodos

[0242] Tecido do cérebro humano: Tecidos criopreservados de duas regiões do cérebro tipicamente altamente afetadas de pacientes com PSP (n=5) diagnosticados clinicamente (núcleo caudado = CAU e putâmen = PUT) e de uma região cerebral menos afetada (giro frontal superior = GFS) e das mesmas regiões cerebrais para dois pacientes de controle (=GFS) foram obtidos do banco de cérebros dos Países Baixos. O tecido foi usado para análise com os ensaios de agregação e na coloração de imuno-histoquímica descritos abaixo. Tecido crio- preservado de 9 pacientes esporádicos com DA foi obtido junto à Uni versidade de Pennsylvania (EUA) e usado para análise com ensaios de agregação. Tecido criopreservado de 1 paciente com DA foi obtido junto à Universidade de Newcastle e usado para coloração de imu- nohistoquímica.

[0243] Homogeneização do tecido cerebral: O tecido criopreser- vado foi homogeneizado em 10 mM de Tris 150 mM de NaCl, pH 7,4, filtro: 0,22 µm + inibidores de protease isentos de mini EDTA comple tos (Roche, cat # 11 836 170 001) com um homogeneizador "dounce" a 1000 rpm durante 10 golpes para obter 10% w/v de homogenatos. Os homogenatos foram centrifugados a 27.000xg, 10 min a 4°C e o sobrenadante foi armazenado em alíquotas a -80°C até ser usado.

[0244] Ensaios de agregação:Um imunoensaio MSD em sanduíche específico para agregação foi realizado no qual os anticorpos de fosfo- tau AT8 e PT3 foram usados como anticorpos de captura e detecção. O anticorpo de revestimento foi diluído em PBS (1 µg/mL) e aliquotado em placas MSD (30 uL por poço) (L15XA, Mesoscale Discoveries) que fo ram incubadas a 4°C. Após a lavagem com 5 x 200 µL de PBS/0,5% de Tween-20, as placas foram bloqueados com 0,1% de caseína em PBS e lavadas novamente com 5 x 200 µL de PBS/0,5% de Tween-20. Após a adição das amostras e padrões (ambas diluídas em 0,1% de caseína em PBS) as placas foram incubadas a 4°C. Subsequentemente, as pla cas foram lavadas com 5 x 200 µL de PBS/0,5% Tween-20, e o anticor po de detecção conjugado SULFO-TAG™ em 0,1% de caseína em PBS foi adicionado e incubado durante 2 h à temperatura ambiente e com agitação a 600 rpm. Após uma lavagem final (5 x 200 µL de PBS/0,5% de Tween-20), 150 µL de 2X de tampão T foram adicionados e as pla cas foram lidas com um imageador MSD. Os sinais em bruto são nor malizados contra uma curva padrão que consiste em 7 diluições de um homogenato de cérebro dom DA total e expressos como valores inter- polados como percentagem desse padrão.

[0245] Imuno-histoquímica:O tecido criopreservado de cérebro humano foi cortado com um criostato (20 µm de espessura) e armaze nado a -80°C antes do uso. As seções foram secas, seguido de fixa ção com formalina, bloqueio de peroxidase endógena com 3% de pe- róxido de hidrogênio (DAKO, Glostrup, Dinamarca, S2023) e permea- bilização em PBS1x + 0,3% de Triton X-100 durante 1 hora. Os anti corpos primários (PT3 0,4 µg/mL; AT8 0,4 µg/mL) foram diluídos em diluente de anticorpo com componentes redutores de fundo (DAKO, S3022) e aplicados às seções durante 1 hora. Após lavagem extensi va, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário anti- camundongo conjugado com HRP (Envision, DAKO, K4000), seguin do-se de marcação com diaminobenzidina cromogênica (DAKO, K4368). As lâminas foram contracoradas com hematoxilina, desidrata das e montadas com meio de montagem orgânico (Vectamount, Vec tor labs, Burlingame, CA, EUA, H-5000). Uma imagem foi realizada com um equipamento NanoZoomer Hamamatsu 2,0 rs (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japão).

Resultados

[0246] Ensaios de agregação: Ensaios de agregação foram reali zados para caracterizar o grau de fosforilação da tau de PSP. Os agregados reativos de PT3 estavam presentes em cérebro com PSP, embora os níveis de agregação foram inferiores no cérebro com DA (Figura 23). Os resultados obtidos com o anticorpo de referência AT8 foram semelhantes aos observados com PT3. Esses resultados suge rem que todos os sítios de fosforilação avaliados com o uso de vários anticorpos fosfo-tau estão presentes na tau de PSP embora haja pou cos agregados de tau em PSP em comparação com DA.

[0247] Imuno-histoquímica: A marcação com o anticorpo PT3 so bre crioseções de DA ou do PSP cérebro demonstrou coloração nas regiões anatômicas (isto é, caudados e putamen) afectados em PSP (FIG. 24). As marcas neuropatológicas de PSP, incluindo neurônios tau+ e astrócitos com tufos, foram detectadas pelo anticorpo de fosfo- tau PT3. Os resultados obtidos com AT8 foram similares aos observa dos com PT3.

Conclusões

[0248] Os dados disponíveis sugerem que PT3 se liga à tau de PSP.

Exemplo 11 - Maturação de afinidade de PT3-HFA Caracterização de ligação de SPR de anticorpos maturados por afinidade com PHF-tau

[0249] Os anticorpos monoclonais maturados por afinidade foram testados quanto à ligação a PHF-tau isolado de cérebro com doença de Alzheimer. Estudos de cinética e afinidade de ligação foram reali zados com o uso do sistema ProteOn XPR36Tri (Bio Rad, Hercules, CA, EDUA) a 25°C com PBS pH 7,4, suplementado com 3 mM de EDTA e 0,005% de Tween-20 como tampão de funcionamento ou de sistema.

[0250] Um chip sensor GLC foi covalentemente imobilizado com um anticorpo anti-tau de camundongo, HT7 (ThermoFisher, catálogo # MN1000) usando-se o protocolo recomendado pelo fornecedor para química de acoplamento de amina (~5000 unidades de resposta, RU). O tampão de acoplamento foi 10 mM de acetato de sódio com pH 4,5. O PHF-tau foi preparado por centrifugação dupla a 5000xg e 5°C duran te 10 minutos. O sobrenadante da segunda centrifugação foi diluído em tampão de corrida (1/125) e acoplado por captura à superfície imobili zada HT7 (~300 RU). Após o acoplamento de captura, a superfície foi ativada e desativada para gerar uma superfície de PHF-tau homogênea para estudos de ligação de anticorpo. Os anticorpos anti-tau e seus Fabs (preparados em tampão de corrida, 0,024 a 75 nM em diluições de 50 vezes) foram injetados a 50 µL/min sobre a superfície de PHF-tau para medir a ligação. Os perfis de associação e dissociação foram mo nitorados por 4 minutos e 2 horas, respectivamente. Após a dissocia ção, o sensor chip foi regenerado com o uso de múltiplas injeções de 10 mM de glicina fr pH de 2,0 e tampão de corrida. Uma superfície de refe rência (sem qualquer PHF-tau) foi usada para monitorar a ligação não específica dos mAbs ou Fabs injetados. O anticorpo HT7 foi usado co mo um controle positivo. Os sensorgramas de ligação para mAbs foram ajustados com o uso de um modelo de ligação bivalente em que a liga ção acionada por avidez ou afinidade aparente (KD) foi relatada como a razão entre a taxa de dissociação e a taxa de associação (koff/kon). Um modelo de ligação de Langmuir 1:1 foi usado para análise cinética de Fabs.

[0251] O anticorpo humano parental (B296) mostrou uma forte liga ção com PHF-tau (KD =6,2 pM) e foi dominado por uma taxa de dissoci ação muito lenta, em que não mais que 5% de dissociação do mAb foi observada durante 2 horas (Tabela 19, Figura 25). Os anticorpos matu- rados por afinidade mostraram um aprimoramento na ligação com PHF- tau com afinidades na faixa de 1,8 a 2,5 pM. B711 e B809 mostraram um aprimoramento de 3 vezes nas taxas de associação em compara ção com o anticorpo parental, as taxas de dissociação, entretanto, fo ram virtualmente indistinguíveis entre todos os anticorpos (Figura 25). Os Fabs, de modo geral, mostraram uma ordem de magnitude mais fra ca de ligação a PHF-tau em comparação com seus mAbs correspon dentes, sugerindo uma ligação induzida por avidez dos mAbs a PHF- tau. O B324 (Fab do mAb parental, B296), ligou-se a PHF-tau com uma afinidade intrínseca de 63,2 PM. Os Fabs dos mAbs maturados por afi nidade mostraram um aprimoramento similar de afinidades com valores na faixa de 15,6 a 31 pM. Os dois Fabs, B330 (Fab de B711) e B332 (Fab de 809), mostraram, além disso, uma melhoria similar de 3 a 4 ve- zes taxas de associação que seus mAbs correspondentes. Tabela 19: Cinética de ligação de ProteOn SPR e afinidades de mAbs maturados por afinidade e seus Fabs com PHF-tau N = 2 a 3 réplicas dentro de um experimento. Valores reportados como média ± DP (ou faixa)

Ligação ao fosfopeptídeo por ELISA

[0252] A ligação ao peptídeo fosfo-tau foi analisada por ELISA, em que o peptídeo (10 ng/mL) foi diretamente revestido à placa de um dia para o outro. Após a lavagem da placa e bloqueio com 0,1% de caseína em PBS, as placas foram incubadas com diferentes concentrações de HFA-PT3 (B296) e variantes maturadas por afinidade de mAbs HFA-PT3 (B809, B333 e B711) (Figura 26A). Após a incubação com anticorpos, as placas foram lavadas e 50 µL por poço de anticorpo anti-Fab marcado com HRPO (laboratórios de inóculo celular Jackson (diluído 1:10000 em tampão de bloqueio). Após uma outra etapa de lavagem, a detecção foi feita com TMB "uma etapa" (Thermo Scientific) de acordo com as instru ções dos fabricantes. As placas foram analisadas em leitora EnVision® 2102 Multilabel Reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). As curvas de ligação foram geradas com o uso do software GraphPad Prism7.0. A par tir das curvas de ligação na Figura 26A pode-se ver que o B296 apresen tou a afinidade mais baixa enquanto o B711 mostrou uma ligação mais potentes em comparação com B296 mas também com B333 e B809. Isso sugere que B711 é o anticorpo PT3 humanizado com a maior afini- dade para o peptídeo pT217. Um experimento similar com Fabs (Figura 26B) demonstrou que M333 (a Fab de B711) tinha ligação peptídica simi lar em comparação com B187, o Fab da molécula de PT3 parental. No vamente, M324 (Fab de B296, HFA-PT3) apresentou ligação mais fraca em comparação com Fab parental e variantes maturadas por afinidade de PT3-HFA. Tabela 20: Sumário dos resultados da ligação de pT217 com ELISA N = 2 réplicas em ao menos 2 experimentos. Valores reportados como média ± DP. 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Claims

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a PHF-tau, caracterizado por compreender: a) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, b) CDR2 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, c) CDR3 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, d) CDR1 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, e) CDR2 de uma região variável de cadeia leve compreen dendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compre ender: a) CDR1 da região variável da cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, b) CDR2 da região variável da cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, c) CDR3 da região variável da cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, d) CDR1 da região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, e) CDR2 da região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 da região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

3. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compre ender uma região constante de IgG1 de cadeia pesada humana e uma região constante de kappa de cadeia leve humana.

4. Ácido nucleico isolado, caracterizado por codificar o anti corpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno, como definido na reivindicação 2.

5. Vetor, caracterizado por compreender um ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 4.

6. Célula hospedeira, caracterizada por compreender um ácido nucleico, como definido na reivindicação 5.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno, como definido na reivindicação 2, e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

8. Método para produzir o anticorpo monoclonal ou do fra gmento de ligação a antígeno, como definido na reivindicação 2, ca racterizado por compreender cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno sob condições para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou da cultura celular.

9. Método para detectar a presença de PHF-tau em uma amostra biológica de um indivíduo, caracterizado por compreender co locar a amostra biológica em contato com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno como definido na reivindicação 2 e detectar a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ao PHF-tau na amostra do indivíduo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue, soro, plasma, fluido intersticial, ou fluido cérebro-espinhal.

11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a PHF-tau, caracterizado por compreender: a) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, b) CDR2 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, c) CDR3 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, d) CDR1 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, e) CDR2 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

12. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender: a) CDR1 da região variável de cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, b) CDR2 da região variável de cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, c) CDR3 da região variável de cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, d) CDR1 da região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, e) CDR2 da região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 da região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

13. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a PHF-tau, caracterizado por compreender: a) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71, b) CDR2 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, c) CDR3 de uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73, d) CDR1 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, e) CDR2 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 de uma região variável de cadeia leve que com preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por com preender: a) CDR1 de região variável da cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:71, b) CDR2 de região variável de cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, c) CDR3 de região variável de cadeia pesada com a se quência de aminoácidos da SEQ ID NO:73, d) CDR1 de região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, e) CDR2 de região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, e f) CDR3 de região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

15. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno, caracterizado por compreender uma região variável de ca- deia pesada com a sequência polipeptídica de aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO:74 e uma região variável de cadeia leve com a sequência polipeptídica de aminoácidos 1-107 da SEQ ID NO:75.

16. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno caracterizado por compreender uma região variável de ca deia pesada com a sequência polipeptídica de aminoácidos 1-118 da SEQ ID NO:76 e uma região variável de cadeia leve com a sequência polipeptídica de aminoácidos 1-107 da SEQ ID NO:77.

17. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada com a sequência polipeptídica da SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve com a sequência polipeptídica da SEQ ID NO:31.

18. Ácido nucleico isolado caracterizado por codificar um anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno, como de finido na reivindicação 17.

19. Vetor, caracterizado por compreender um ácido nuclei- co isolado, como definido na reivindicação 18.

20. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o ácido nucleico, como definido na reivindicação 19.

21. Composição farmacêutica, caracterizada por compre ender um anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno, como definido na reivindicação 17, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.

22. Método de produção do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação a antígeno, como definido na reivindicação 17, caracterizado por compreender cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno sob condições para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou da cultura celular.