ES2959990T3 - Métodos de detección de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporcionan métodos para detectar anticuerpos neutralizantes contra leptinas, incluida la metreleptina, así como para identificar sujetos que tienen dichos anticuerpos neutralizantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de detección de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina
CAMPO DE LA DIVULGACIÓN
La divulgación se refiere a métodos de detección de anticuerpos neutralizantes contra la leptina. Dichos métodos pueden utilizarse para detectar anticuerpos neutralizantes contra la leptina en una muestra, o para identificar a los sujetos que tienen anticuerpos neutralizantes contra la leptina en su sangre, suero o plasma.
ANTECEDENTES
La metreleptina es un análogo de la leptina indicado como complemento de la dieta como terapia sustitutiva para tratar las complicaciones de la deficiencia de leptina en sujetos con lipodistrofia generalizada congénita o adquirida. La lipodistrofia congénita generalizada es una enfermedad rara caracterizada por una falta casi total de tejido adiposo en el cuerpo y un aspecto muy musculoso. El tejido adiposo se encuentra en muchas partes del cuerpo, incluso debajo de la piel y rodeando los órganos internos. Almacena grasa para obtener energía y también amortigua y aísla el cuerpo. La escasez de tejido adiposo provoca el almacenamiento de grasa en otras partes del cuerpo, como el hígado y los músculos, lo que causa graves problemas de salud. La lipodistrofia generalizada adquirida es una enfermedad rara que aparece durante la infancia o la adolescencia, caracterizada por la pérdida de grasa que afecta a grandes zonas del cuerpo, sobre todo la cara, los brazos y las piernas.
Además, la metreleptina se está investigando como tratamiento para otras indicaciones, como la lipodistrofia parcial, la amenorrea hipotalámica, la esteatohepatitis no alcohólica y otros trastornos dismetabólicos hipoleptinémicos.
La metreleptina se administra generalmente mediante inyección subcutánea diaria. Debido a esta administración repetida, existe el riesgo de que los sujetos desarrollen anticuerpos contra la metreleptina. Estos anticuerpos pueden neutralizar la metreleptina, haciendo que el tratamiento sea ineficaz. Es más, pueden neutralizar la leptina endógena, empeorando la enfermedad de los sujetos que ya padecen deficiencia de leptina. Por esta razón, existe la necesidad en la técnica de un método de detección fiable de anticuerpos neutralizantes en sujetos.
Los documentos WO 2011/117084 A1 y FETISSOV SO et al. Autoantibodies against appetite-regulating peptide hormones and neuropeptides: Putative modulation by gut microflora. Nutrition 2008, vol. 24, páginas 348-359 desvelan métodos para la detección de anticuerpos dirigidos contra la leptina que implican la inmovilización de leptina en un soporte sólido, el contacto de la leptina inmovilizada con una muestra de suero humano para capturar anticuerpos dirigidos contra la leptina presentes en ella, y a continuación el contacto de los anticuerpos dirigidos contra la leptina capturados con un anticuerpo de inmunoglobulina antihumana marcado como medio de detección de los anticuerpos dirigidos contra la leptina capturados.
CHAN JL et al. Immunogenicity associated with metreleptin treatment in patients with obesity or lipodystrophy. Clinical Endocrinology 2016, vol. 85, páginas 137-149 desvela un método para la detección de anticuerpos dirigidos contra la metreleptina que consiste en mezclar dos tipos diferentes de conjugados de metreleptina, es decir, uno conjugado con biotina y el otro conjugado con un marcador detectable, con una muestra de suero humano, capturar anticuerpos dirigidos contra la metreleptina unidos a ambos tipos de conjugados de metreleptina en fase sólida mediante biotina de un tipo de conjugados de metreleptina, y detectar los anticuerpos dirigidos contra la metreleptina capturados mediante el marcador detectable del otro tipo de conjugados de metreleptina.
El documento US 2005/209137 A1 desvela un método para detectar un nivel de leptina libre en una muestra de un individuo que comprende poner en contacto la muestra con un dominio de unión al receptor de leptina aviar que está unido a una fase sólida, poner en contacto la fase sólida con un anticuerpo que tiene especificidad de unión a la leptina que está acoplado con un marcador detectable, y detectar dicho marcador que permanece con dicha fase sólida, detectando así el nivel de leptina libre en la muestra.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la detección de anticuerpos neutralizantes contra la leptina.
En un aspecto, la invención se refiere a un método de detección de anticuerpos neutralizantes contra la leptina en una muestra, que comprende: (a) inactivar la leptina presente en la muestra; (b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la muestra; (c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta; (d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; y (e) medir la señal de marcaje producida por la leptina marcada unida al sustrato.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para identificar a un sujeto que tiene anticuerpos neutralizantes contra la leptina en sangre, suero o plasma del sujeto, que comprende (a) inactivar la leptina y la leptina presentes en una muestra de sangre, suero o plasma del sujeto; (b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la muestra; (c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta; (d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; (e) medir la señal de marcaje producida por la leptina marcada unida; (f) medir una señal de control positivo, dicha señal de control positivo producida al completar las etapas (a)-(e), y comprendiendo además añadir una cantidad conocida de anticuerpo dirigido contra la leptina en la etapa (b); y (g) comparar la señal de (e) con la señal de (f), en donde si el nivel de señal medido en la etapa (e) es igual o menor que el nivel de señal medido en la etapa (f), entonces el sujeto da positivo para anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de identificación de sujetos que tienen anticuerpos neutralizantes contra la leptina en sangre, suero o plasma del sujeto que comprende: (a) inactivar la leptina presente en una muestra de sangre, suero o plasma del sujeto; (b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la muestra; (c) poner en contacto la muestra que contiene la leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta; (d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; (e) medir la señal de marcaje producida por la leptina marcada unida; (f) medir una señal de control negativo, dicha señal de control negativo producida al completar las etapas (a)-(e), en donde la muestra de sangre, suero o plasma no contiene anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina; y (g) comparar la diferencia porcentual en la señal de (e) y la señal de (f) con un punto de corte, en donde si la diferencia porcentual en la señal de (e) y la señal de (f) es mayor que el punto de corte, entonces el sujeto da positivo para anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina. En algunas realizaciones, el punto de corte se encuentra entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, o entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 30 %, o entre aproximadamente el 5 % y el 15 %.
En ciertas realizaciones, la leptina puede estar marcada con peroxidasa de rábano picante o tris-bipiridina de rutenio.
En algunas realizaciones, la inactivación de la leptina puede llevarse a cabo calentando la muestra.
La matriz recubierta puede ser una matriz recubierta de estreptavidina. El receptor de leptina puede estar marcado con biotina.
En algunas realizaciones, el sustrato capaz de unir la leptina marcada puede comprender (i) una matriz recubierta, (ii) un anticuerpo unido a la matriz de (i), y (iii) un receptor de leptina marcado unido al anticuerpo de (ii). La matriz recubierta puede ser una matriz recubierta de estreptavidina. El receptor de leptina puede estar marcado con un marcador adecuado para la purificación por afinidad; por ejemplo, el receptor de leptina puede estar marcado con un marcador de hexa-histidina. El anticuerpo puede tener una afinidad adecuada por el marcador del receptor de leptina; por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo dirigido contra la hexa-histidina. Además, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador adecuado para unirse a la matriz recubierta, como la biotina.
Los métodos de la presente invención pueden comprender además una etapa de disminución del pH de la muestra inactivada (a) mediante la adición de una solución ácida, y donde la leptina marcada añadida en (b) comprende además una solución básica suficiente para neutralizar el pH de la muestra después de la adición. La solución ácida puede ser una solución de ácido acético, como una de ácido acético al 0,8 %. La solución básica puede ser un tampón, como un tampón Tham 0,125 M.
En algunas realizaciones, la leptina marcada añadida en la etapa (b) puede ser una leptina humana recombinante. En ciertas realizaciones, la leptina marcada añadida en la etapa (b) puede ser metreleptina.
En algunas realizaciones, la señal detectable se genera en la etapa (e) cuando la concentración de leptina marcada, tal como metreleptina, en la muestra en la etapa (b) se encuentra entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 120 ng/ml, o entre aproximadamente 100 ng/ml y aproximadamente 110 ng/ml, tal como aproximadamente 101 ng/ml, o aproximadamente 109 ng/ml.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La presente divulgación se explicará con más detalle haciendo referencia a las figuras de los dibujos adjuntos. Las figuras de los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar los principios de la presente divulgación, y algunas características pueden estar exageradas para mostrar detalles de componentes concretos. Además, todas las medidas, especificaciones y similares que se muestran en las figuras de los dibujos, o que se describen a continuación, tienen carácter ilustrativo y no restrictivo. Por lo tanto, los detalles estructurales y funcionales específicos desvelados en esta invención no se han de interpretar como limitantes, sino meramente como una base representativa para enseñar a un experto en la materia el empleo de los métodos descritos en esta invención.
Las FIG. 1A-1B muestran un ensayo de unión a receptor ilustrativo para leptina y metreleptina que implica un sustrato capaz de unir la leptina marcada, que comprende (i) una matriz recubierta, y (ii) un receptor de leptina marcado unido a la matriz de (i), según la invención. La FIG. 1A describe los diversos componentes utilizados en el ensayo, y la FIG. 1B ilustra la aplicación del ensayo.
La FIG. 2 presenta una hoja de datos ilustrativa para presentar los resultados de un ensayo de unión a receptor según realizaciones de la invención.
Las FIG. 3A-3B muestran un ensayo ilustrativo de unión a receptor para la leptina y metreleptina que implica un sustrato capaz de unir la leptina marcada, que comprende (i) una matriz recubierta, (ii) un anticuerpo unido a la matriz de (i), y (iii) un receptor de leptina marcado unido al anticuerpo de (ii), según realizaciones de la invención. La FIG. 3A describe los diversos componentes utilizados en el ensayo, y la FIG. 3B ilustra la aplicación del ensayo.
La FIG. 4 representa un ensayo ilustrativo de unión a receptor para la metreleptina que incluye controles positivos y negativos, según realizaciones de la invención.
La FIG. 5 representa una etapa de disociación ácida para su uso en un ensayo ilustrativo de unión a receptor para la metreleptina, según realizaciones de la invención.
La FIG. 6 es una tabla que presenta la señal, el porcentaje de inhibición, así como datos categóricos recogidos del análisis de muestras de 17 sujetos, algunos de los cuales estaban sanos y otros enfermos y habían sido tratados previamente con leptina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Métodos de detección de anticuerpos neutralizantes contra la leptina
En el presente documento se describen métodos para detectar anticuerpos neutralizantes contra la leptina en una muestra que comprenden las etapas de (a) inactivar la leptina presente en la muestra; (b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la muestra; (c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta; (d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; y (e) medir la señal de marcaje producida por la leptina marcada unida al sustrato.
Los términos "método" y "ensayo" se utilizan indistintamente en el presente documento.
Se contempla que los métodos desvelados en el presente documento puedan utilizarse para detectar anticuerpos neutralizantes contra la leptina de cualquier especie, incluyendo leptinas humanas, de ratón, de rata y de otras especies heterólogas de origen natural, así como leptina madura producida recombinantemente. Por ejemplo, la leptina es el producto polipeptídico del gen ob como se describe en la Publicación Internacional N.° WO 96/05309, y en la Patente Estadounidense N.° 6.309.853. Los métodos de la invención también pueden usarse para detectar anticuerpos neutralizantes contra fragmentos biológicamente activos de leptina, agonistas, análogos de agonistas, variantes, proteínas de fusión, leptina quimérica y otros derivados de la misma, como aquellos compuestos desvelados en la Patente estadounidense N.° 5.521.283, Patente estadounidense N.° 5.532.336, Patente estadounidense N.° 5.552.522, Patente estadounidense N.° 5.552.523, Patente estadounidense N.° 5.552.524, Patente estadounidense N.° 5.554.727, Patente estadounidense N.° 5.559.208, Patente estadounidense N.° 5.580.954, Patente estadounidense N.° 5.594.101, Patente estadounidense N.° 5.691.309, Patente estadounidense N.° 5.756.461, Patente estadounidense N.° 5.851.995, Patente estadounidense N.° 5.935.810, Patente estadounidense N.° 6.001.968, Patente estadounidense N.° 6.309.853, Patente estadounidense N.° 6.309.853, Patente estadounidense N.° 6.350.730, Patente estadounidense N.° 6.420.339, Patente estadounidense N.° 6.429.290, Patente estadounidense N.° 6.541.033, Patente estadounidense N.° 6.936.439, Patente estadounidense N.° 7.112.659, Patente estadounidense N.° 7.183.254, Patente estadounidense N.° 7.208.577, Patente estadounidense N.° 8.080.254, Patente estadounidense N.° 8.394.765, Publicación estadounidense N.° 2016/0083446, Publicación PCT N.° WO 00/09165, Publicación PCT N.° WO 00/20872, Publicación PCT N.° WO 00/21574, Publicación PCT N.° WO 00/47741, Publicación PCT N.° WO 04/39832, Publicación PCT N.° WO 09/64298, Publicación PCT N.° WO 96/05309, Publicación PCT N.° WO 96/22308, Publicación PCT N.° WO 96/23517, Publicación PCT N.° WO 96/40912, Publicación PCT N.° WO 97/02004, Publicación PCT N.° WO 97/06816, Publicación PCT N.° WO 97/18833, Publicación PCT N.° WO 97/38014, Publicación PCT N.° WO 98/08512, Publicación PCT N.° WO 98/12224, Publicación PCT N.° WO 98/28427, Publicación PCT N.° WO 98/46257, Publicación PCT N.° WO 98/55139, Publicación PCT N.° WO 2012/050925, Publicación PCT N.° WO 2012/050930, y Publicación PCT N.° WO 2013/009539. En ciertas realizaciones, los métodos de la invención pueden utilizarse para detectar anticuerpos neutralizantes contra la metreleptina.
Los métodos contemplados para inactivar la leptina incluyen la inactivación por calor, así como el tratamiento con inhibidores químicos de la leptina, incluyendo venenos químicos de la leptina, siempre que los inhibidores o venenos puedan ser inactivados antes de la adición de leptina marcada.
Se contempla que la leptina marcada pueda ser cualquier forma de leptina, análogo de leptina, quimera de leptina o proteína de fusión, o derivado de la misma, incluyendo los compuestos enumerados anteriormente. Se contempla que la leptina marcada pueda estar marcada con cualquier marcador capaz de producir una señal convenientemente cuantificada. Los marcadores pueden ser fluorescentes, incluidos marcadores fluorescentes de resolución temporal. Algunos ejemplos son la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y la tris-bipiridina de rutenio, entre otros marcadores conocidos en la técnica. Un experto en la materia comprenderá que el método de detección de la señal producida por la leptina marcada unida a sustrato dependerá de la naturaleza del marcador.
El sustrato utilizado para entrar en contacto con la leptina marcada que contiene la muestra comprende (i) una matriz recubierta; y (ii) un receptor de leptina marcado unido a la matriz. En algunas realizaciones, la matriz recubierta es una matriz recubierta de estreptavidina. En ciertas realizaciones, el receptor de leptina está marcado con biotina. Por ejemplo, el receptor de leptina puede unirse a la matriz a través de la biotina. Se entiende que la matriz recubierta puede estar unida por más de un receptor de leptina marcado. En ciertas realizaciones, un análogo del receptor de leptina puede estar unido a la matriz.
Alternativamente, el sustrato puede comprender: (i) una matriz recubierta; (ii) un anticuerpo unido a la matriz; y (iii) un receptor de leptina marcado unido al anticuerpo. En algunas realizaciones, la matriz recubierta es una matriz recubierta de estreptavidina. En ciertas realizaciones, el receptor de leptina puede estar marcado con cualquier marcador adecuado para su purificación por afinidad. Por ejemplo, el marcador puede ser un marcador de hexa-histidina. En algunas realizaciones, el anticuerpo, que puede denominarse "anticuerpo de captura del receptor de leptina", es cualquier anticuerpo con una afinidad adecuada por el marcador del receptor de leptina. Por ejemplo, el anticuerpo de captura del receptor de leptina puede ser un anticuerpo dirigido contra la hexa-histidina, si el receptor de leptina tiene un marcador de hexa-histidina. El anticuerpo de captura del receptor de leptina también puede estar marcado con un marcador adecuado para unirse a la matriz, por ejemplo, biotina. En ciertas realizaciones, un análogo del receptor de leptina puede estar unido a la matriz.
La matriz utilizada en la presente invención puede ser un soporte sólido al que se une un receptor de leptina marcado o un anticuerpo. La matriz puede ser apropiada para medir la señal producida por la leptina marcada. Ejemplos de una matriz incluyen, pero no se limitan a, los pocillos de una placa, como una placa de microtitulación, y perlas. En ciertas realizaciones, la matriz puede ser una placa multipocillo Meso Scale Discovery (MSD).
En ciertas realizaciones, la muestra utilizada en los presentes métodos para detectar anticuerpos neutralizantes contra la leptina puede seleccionarse de sangre, suero o plasma de un sujeto. El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un ser humano.
En un aspecto de la invención, los métodos contemplados en la presente invención pueden utilizarse para identificar sujetos que tengan anticuerpos neutralizantes en, por ejemplo, su sangre, suero o plasma. Se contempla que puedan identificarse individuos que tengan anticuerpos neutralizantes para cualquier leptina o análogo de la leptina. Los individuos positivos para los anticuerpos neutralizantes pueden identificarse comparando la señal producida por la leptina marcada con los datos de los controles positivos y/o negativos. Cuando el control es un control positivo, se contempla que cuando la señal es menor o igual que la señal del control positivo, la muestra se puntuará como positiva para anticuerpos neutralizantes. Cuando el control es un control negativo, se calculará la diferencia porcentual entre la señal de la muestra y la señal del control, y la diferencia porcentual se comparará con un punto de corte, y si es mayor que el punto de corte, se diagnostica que el sujeto tiene anticuerpos neutralizantes contra la leptina analizada.
En las Figuras 1A-1B y 3A-3B se ilustran realizaciones del método que incluyen un control negativo. Estas figuras demuestran cómo puede producirse la unión entre la leptina/metreleptina marcada y los receptores de leptina, y/o entre los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina/metreleptina y los receptores de leptina, para dar lugar a una diferencia porcentual en la señal que sea menor que el punto de corte, o igual o mayor que el punto de corte.
El punto de corte puede estar comprendido entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, o entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 30 %, o aproximadamente el 20 %. Por ejemplo, el punto de corte puede ser aproximadamente el 5 %, o aproximadamente el 6 %, o 7 %, o aproximadamente el 8 %, o aproximadamente el 9 %, o aproximadamente el 10 %, o aproximadamente el 11 %, o aproximadamente el 12 %, o aproximadamente el 13 %, o aproximadamente el 14 %, o aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 16 %, o aproximadamente el 17 %, o aproximadamente el 18 %, o aproximadamente el 19 %, o aproximadamente el 20 %, o aproximadamente el 21 %, o aproximadamente el 22 %, o aproximadamente el 23 %, o aproximadamente el 24 %, o aproximadamente el 25 %, o aproximadamente el 26 %, o aproximadamente el 27 %, o aproximadamente el 28 %, o aproximadamente el 29 %, o aproximadamente el 30 %, o aproximadamente el 31 %, o aproximadamente el 32 %, o aproximadamente el 33 %, o aproximadamente el 34 %, o aproximadamente el 35 %, o aproximadamente el 36 %, o aproximadamente el 37 %, o aproximadamente el 38 %, o aproximadamente el 39 %, o aproximadamente el 40 %.
En ciertas realizaciones, el punto de corte puede diferir si el sujeto tiene un nivel normal de leptina, o si el sujeto tiene una deficiencia de leptina. En ciertas realizaciones, un sujeto tiene una deficiencia de leptina si tiene una concentración sérica que es de aproximadamente 16 ng/ml o inferior para una mujer y de aproximadamente 7 ng/ml o inferior para un hombre; una concentración sérica que es de aproximadamente 8 ng/ml o inferior para una mujer y de aproximadamente 5 ng/ml o inferior para un hombre; o de aproximadamente 5 ng/ml o inferior para una mujer, y de aproximadamente 3 ng/ml o inferior para un hombre. O bien, un sujeto tiene una deficiencia de leptina si tiene una concentración sérica dentro del percentil 15, o el percentil 10, o el percentil 8, o el percentil 2, o el percentil 1 según NHANES III. Alternativamente, un sujeto tiene una deficiencia de leptina si tiene una concentración sérica que está dentro de un percentil específico ajustado por el IMC, sexo y/u otros factores, como una concentración sérica dentro del percentil 10, o el percentil 5, o el percentil 3, o el percentil 2, según NHANES III, ajustado por el IMC.
En ciertas realizaciones en las que el sujeto no tiene una deficiencia de leptina, el punto de corte estará entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, o entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 30 %, o en algunas realizaciones entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 15 %, tal como aproximadamente el 10,2 % si se detectan anticuerpos neutralizantes contra la leptina (por ejemplo, si el sujeto estaba siendo tratado con leptina), o aproximadamente el 7,89 % si se detectan anticuerpos neutralizantes contra la metreleptina (por ejemplo, si el sujeto estaba siendo tratado con metreleptina). En ciertas realizaciones en las que el sujeto tiene una deficiencia de leptina, el punto de corte estará entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, o entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 30 %, o en algunas realizaciones entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 15 %, tal como aproximadamente el 10,2 % si se detectan anticuerpos neutralizantes contra la leptina (por ejemplo, si el sujeto estaba siendo tratado con leptina), o aproximadamente el 9,66 % si se detectan anticuerpos neutralizantes contra la metreleptina (por ejemplo, si el sujeto estaba siendo tratado con metreleptina).
La Figura 2 presenta una hoja de datos ilustrativa para su uso con los métodos de la invención.
En otro aspecto, los métodos contemplados en la presente invención pueden utilizarse para determinar en un sujeto un cambio en la presencia de anticuerpos neutralizantes contra la leptina en sangre, suero o plasma del sujeto a lo largo del tiempo. Por ejemplo, los métodos pueden utilizarse en un sujeto sometido a tratamiento con leptina para evaluar un cambio en la presencia de anticuerpos neutralizantes en la sangre, suero o plasma del sujeto antes del tratamiento con leptina y a continuación durante o después del tratamiento con leptina. Los ejemplos de tratamientos con leptina son conocidos en la técnica. El método puede comprender: (1a) inactivar la leptina presente en una primera muestra de sangre, suero o plasma del sujeto; (1b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la primera muestra; (1c) poner en contacto la primera muestra que contiene leptina marcada de (1b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada; (1d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; (1e) medir la señal de marcador producida por la leptina marcada unida; (2a) inactivar la leptina presente en una segunda muestra de sangre, suero o plasma del sujeto; (2b) añadir una cantidad conocida de leptina marcada a la segunda muestra; (2c) poner en contacto la segunda muestra que contiene leptina marcada de (2b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada; (2d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; (2e) medir la señal de marcador producida por la leptina marcada unida; (3) comparar la señal de marcador de (2e) con la señal de marcador de (1e). En algunas realizaciones, la comparación puede consistir en determinar la diferencia porcentual entre la señal de marcador de (2e) y la señal de marcador de (1e). En ciertas realizaciones, la diferencia porcentual puede compararse con un punto de corte. El punto de corte puede estar comprendido entre aproximadamente el 55 % y aproximadamente el 95 %, o entre aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 90 %. Los ejemplos incluyen aproximadamente el 60 %, o aproximadamente el 61 %, o aproximadamente el 62 %, o aproximadamente el 63 %, o aproximadamente el 64 %, o aproximadamente el 65 % o aproximadamente el 66 %, o aproximadamente el 67 %, o aproximadamente el 68 %, o aproximadamente el 69 % o aproximadamente el 70 %, o aproximadamente el 71 %, o aproximadamente el 72 %, o aproximadamente el 73 % o aproximadamente el 74 %, o aproximadamente el 75 %, o aproximadamente el 76 %, o aproximadamente el 77 % o aproximadamente el 78 %, o aproximadamente el 79 %, o aproximadamente el 80 %, o aproximadamente el 81 % o aproximadamente el 82 %, o aproximadamente el 83 %, o aproximadamente el 84 %, o aproximadamente el 85 % o aproximadamente el 86 %, o aproximadamente el 87%o aproximadamente el 88 %, o aproximadamente el 89 % o aproximadamente el 90 %. En ciertas realizaciones, el punto de corte puede utilizarse para determinar si el sujeto debe continuar el tratamiento, o si el sujeto responderá al tratamiento. Por ejemplo, si la diferencia porcentual es igual o inferior al punto de corte, puede determinarse que el sujeto debe interrumpir el tratamiento, o que el sujeto no responderá al tratamiento.
Los métodos contemplados pueden comprender además una etapa de disociación, para disociar cualquier anticuerpo neutralizante en la muestra de cualquier leptina que pueda estar presente en la muestra. Dicha etapa de disociación puede llevarse a cabo disminuyendo el pH de la muestra tras la neutralización de la leptina. Los reactivos adecuados para acidificar la muestra serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, por ejemplo, puede utilizarse ácido acético, como una solución de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 1 % de ácido acético, o de aproximadamente el 0,8 % de ácido acético. Otros reactivos adecuados que pueden utilizarse para acidificar la muestra serán conocidos por un experto en la materia. T ras la acidificación de la muestra, que disocia todo anticuerpo neutralizante de las leptinas que pueda estar presente en la muestra, se puede añadir leptina marcada junto con una solución básica suficiente para neutralizar el pH de la muestra. Se contempla que la solución que contiene la leptina marcada puede ser un tampón, de tal manera que cuando se añade a la muestra, el pH de la muestra se eleva a aproximadamente 7, tal como 7,4, permitiendo que cualquier anticuerpo neutralizante presente en la muestra se una a la leptina marcada. Los tampones adecuados incluyen el tampón Tham de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,15 M, o de aproximadamente 0,12 M a aproximadamente 0,14 M, o de aproximadamente 0,124 M o 0,125 M. Otros tampones adecuados que pueden devolver el pH de la muestra a alrededor de la neutralidad serán conocidos por un experto en la materia.
Las señales producidas por los marcadores pueden medirse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los dispositivos adecuados que pueden medir las señales serán conocidos por un experto en la materia.
Se contempla que la determinación de si un sujeto tiene o no anticuerpos neutralizantes contra la leptina puede utilizarse para predecir si el sujeto responderá al tratamiento con leptina, por ejemplo, cabría esperar que un sujeto con altos niveles de anticuerpos neutralizantes no respondiera al tratamiento con leptina.
EJEMPLOS
Los ejemplos que siguen no pretenden en modo alguno limitar el alcance de esta invención, sino que se proporcionan para ilustrar aspectos de los métodos desvelados. Muchas otras realizaciones de esta invención serán evidentes para un experto en la materia.
Ejemplo 1
Las muestras de los sujetos pueden analizarse del siguiente modo para determinar el nivel de anticuerpos neutralizantes que contienen (véase también la Figura 4):
1. Placas recubiertas de estreptavidina se bloquean con Superblock durante 1 hora.
2. Las muestras se inactivan por calor.
3. A cada muestra se le añade leptina o metreleptina sulfomarcada con rutenio (Ru). Las muestras de control positivo se preparan añadiendo leptina o metreleptina sulfomarcadas con Ru y el anticuerpo de control positivo dirigido contra la leptina muLEP13-11.03. Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. 4. Las placas de estreptavidina se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El anticuerpo dirigido contra la hexa-histidina marcado con biotina y diluido en PBS se añade a las placas y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
5. Las placas se lavan con PBS, se añade a las placas la proteína del receptor de leptina marcada con heptahistidina diluida y las placas se incuban a temperatura ambiente durante una hora.
6. Las placas se lavan con PBS, se añaden a las placas las muestras de ensayo y de control (de la etapa 2 anterior) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
7. Las placas se lavan con PBS y se leen en el lector MSD ESL.
Se mide la señal máxima de los pocillos de control negativo que contienen leptina y metreleptina, pero no anticuerpo neutralizante. Se calcula el porcentaje de inhibición restando la diferencia entre la señal máxima y la señal medida para cada muestra, y dividiendo ese número por la señal máxima. El porcentaje de inhibición se compara entonces con un punto de corte, como se describe en el Ejemplo 3.
Ejemplo 2
Puede realizarse una etapa opcional de disociación ácida modificando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 como sigue (véase también la Figura 5):
1. Tras la inactivación térmica, las muestras se incuban en una solución de ácido acético al 0,8 % a temperatura ambiente durante una hora para disociar los anticuerpos unidos a la muestra.
2. La leptina o metreleptina sulfomarcadas se diluyen en una solución tampón Tham 0,124 M, que neutraliza la muestra acética al añadirla, permitiendo la unión del anticuerpo.
Se determinó que la sensibilidad del ensayo de unión al receptor descrito anteriormente era de 109 ng/ml para los anticuerpos contra la metreleptina y de 101 ng/ml para los anticuerpos contra la leptina. El límite de detección para un ensayo comparable de anticuerpos neutralizantes basado en células fue de 251 ng/ml.
Ejemplo 3
Los puntos de corte se calcularon basándose en el porcentaje de inhibición de la señal de leptina y metreleptina en sujetos enfermos que habían recibido tratamiento previo con metreleptina y en sujetos normales no enfermos. El punto de corte para la inhibición de la unión de la leptina en sujetos normales y enfermos previamente tratados fue del 10,18 % de inhibición. El punto de corte para la inhibición de la unión de la metreleptina en sujetos enfermos que habían recibido tratamiento previo fue del 9,66 % de inhibición, y en sujetos normales fue del 7,89 % de inhibición. Todos los puntos de corte se fijaron para obtener una tasa de falsos positivos del 1 %. Los datos de los puntos de corte se presentan en la Figura 6.
T l 1. R m n l n r r l L in l M r l in r n rm l nf rm .
Ejemplo 4
Se analizaron muestras de 17 pacientes para la inhibición de la señal de leptina y metreleptina según los métodos descritos anteriormente. Los datos se presentan en la Figura 6 y en las Tablas 2-4.
Se utilizaron dos anticuerpos neutralizantes monoclonales de control dirigidos contra la leptina a concentraciones de 156 ng/ml (control positivo (bajo)) o 5000 ng/ml (control positivo (alto)). Los datos de control se presentan en la Figura 6 y en la Tabla 3. La inhibición por ambos anticuerpos fue notablemente consistente, lo que demuestra la robustez del ensayo.
Las muestras con una inhibición superior al punto de corte se asignaron a la categoría positiva, mientras que las muestras con una inhibición inferior al punto de corte se asignaron a la categoría negativa. Véase la Figura 6 y la Tabla 4.
Tabla 3. Datos de señal y porcentaje de inhibición de la unión de leptina y metreleptina por dosis altas y bajas de anticuerpos neutralizantes monoclonales de control positivo dirigidos contra la leptina.__________________________
L in M r l in
Tabla 4. Datos de la señal, y porcentaje de inhibición de la unión de leptina y metreleptina, y categoría diagnosticada
continuación
A lo largo de esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
A lo largo de la memoria descriptiva, cuando se describe que las composiciones incluyen componentes o materiales, se contempla que las composiciones también puedan consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de los componentes o materiales enumerados, a menos que se describa lo contrario. Del mismo modo, cuando se describe que los métodos incluyen etapas particulares, se contempla que los métodos también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de las etapas recitadas, a menos que se describa lo contrario. La invención ilustrada en el presente documento puede ponerse en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o etapa que no esté específicamente desvelado en el presente documento.
La práctica de un método desvelado en el presente documento, y sus etapas individuales, pueden realizarse manualmente y/o con la ayuda o automatización proporcionada por equipos electrónicos. Aunque los procesos se han descrito con referencia a realizaciones particulares, una persona con conocimientos ordinarios en la materia apreciará fácilmente que se pueden utilizar otras formas de realizar los actos asociados a los métodos. Por ejemplo, el orden de varias etapas puede cambiarse sin apartarse del alcance del método, a menos que se describa lo contrario. Además, algunas de las etapas individuales pueden combinarse, omitirse o subdividirse en etapas adicionales.
Claims (12)
1. Un método de detección de anticuerpos neutralizantes contra la leptina en una muestra que comprende las etapas de:
(a) inactivar la leptina presente en la muestra;
(b) añadir a la muestra una cantidad conocida de leptina marcada;
(c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta;
(d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida; y
(e) medir la señal de marcador producida por la leptina marcada unida al sustrato.
2. Un método de identificación de sujetos que tienen anticuerpos neutralizantes contra la leptina en sangre, suero o plasma del sujeto que comprende las etapas de:
(a) inactivar la leptina y la leptina presentes en la muestra de sangre, suero o plasma del sujeto;
(b) añadir a la muestra una cantidad conocida de leptina marcada;
(c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta;
(d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida;
(e) medir la señal de marcador producida por la leptina marcada unida;
(f) medir una señal de control positivo, dicha señal de control positivo producida al completar las etapas (a)-(e), y que además comprende añadir una cantidad conocida de anticuerpo dirigido contra la leptina en la etapa (b); y (g) comparar la señal de (e) con la señal de (f), en donde si el nivel de señal medido en la etapa (e) es igual o menor que el nivel de señal medido en la etapa (f), entonces el sujeto da positivo para anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina.
3. Un método de identificación de sujetos que tienen anticuerpos neutralizantes contra la leptina en sangre, suero o plasma del sujeto que comprende las etapas de:
(a) inactivar la leptina presente en la muestra de sangre, suero o plasma;
(b) añadir a la muestra una cantidad conocida de leptina marcada;
(c) poner en contacto la muestra que contiene leptina marcada de (b) con un sustrato capaz de unir la leptina marcada, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende una matriz recubierta y un receptor de leptina marcado unido a la matriz recubierta;
(d) lavar el sustrato para eliminar la leptina marcada no unida;
(e) medir la señal de marcador producida por la leptina marcada unida;
(f) medir una señal de control negativo, dicha señal de control negativo producida al completar las etapas (a)-(e), en donde la muestra de sangre, suero o plasma no contiene anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina; y
(g) comparar la diferencia porcentual en la señal de (e) y la señal de (f) con un punto de corte, en donde si la diferencia porcentual en la señal de (e) y la señal de (f) es mayor que el punto de corte, entonces el sujeto da positivo para anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el punto de corte se encuentra entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la leptina está marcada con peroxidasa de rábano picante o trisbipiridina de rutenio.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de inactivación (a) se realiza calentando la muestra.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la matriz recubierta es una matriz recubierta de estreptavidina.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el receptor de leptina está marcado con biotina.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho sustrato capaz de unir la leptina marcada comprende:
(i) una matriz recubierta;
(ii) un anticuerpo unido a la matriz de (i); y
(iii) un receptor de leptina marcado unido al anticuerpo de (ii).
10. El método de la reivindicación 9, en el que el receptor de leptina está marcado con un marcador de hexa-histidina y el anticuerpo es un anticuerpo dirigido contra la hexa-histidina.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en el que el anticuerpo está marcado con un marcador adecuado para unirse a la matriz recubierta.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la leptina marcada añadida en la etapa (b) es metreleptina marcada.
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