EA045921B1 - Способы детекции нейтрализующих антител к лептину - Google Patents
Способы детекции нейтрализующих антител к лептину Download PDFInfo
- Publication number
- EA045921B1 EA045921B1 EA201990720 EA045921B1 EA 045921 B1 EA045921 B1 EA 045921B1 EA 201990720 EA201990720 EA 201990720 EA 045921 B1 EA045921 B1 EA 045921B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- leptin
- labeled
- antibody
- sample
- signal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims description 56
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 204
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 203
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 201
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 201
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 74
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 claims description 61
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 claims description 61
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 24
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 17
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 12
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims description 5
- 201000006641 Acquired generalized lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010053547 Congenital generalised lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006705 Congenital generalized lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 201000000736 Amenorrhea Diseases 0.000 claims description 3
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 claims description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 231100000540 amenorrhea Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010053857 partial lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 108700008455 metreleptin Proteins 0.000 description 41
- 229960000668 metreleptin Drugs 0.000 description 37
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- BZSVVCFHMVMYCR-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-ylpyridine;ruthenium Chemical compound [Ru].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 BZSVVCFHMVMYCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- -1 metreleptin Chemical compound 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Description
Ссылка на связанные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет перед предварительной заявкой с серийным номером 62/393632, поданной 12 марта 2016 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее раскрытие относится к способам детекции нейтрализующих антител к лептину и наборам, которые могут быть использованы для осуществления таких способов. Такие способы и наборы могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к лептину в образце или для выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Метрелептин представляет собой аналог лептина, показанный в качестве вспомогательного средства к диете или в качестве заместительной терапии для лечения осложнений вследствие лептиновой недостаточности у субъектов с врожденной или приобретенной генерализованной липодистрофией. Врожденная генерализованная липодистрофия представляет собой редкое патологическое состояние, характеризующееся почти полным отсутствием жировой ткани в организме и очень мускулистым внешним видом. Жировая ткань присутствует во многих частях тела, в том числе под кожей, и окружает внутренние органы. Она запасает жир в качестве источника энергии и также выполняет функцию амортизации и изоляции тела. Недостаток жировой ткани приводит к запасу жира в других частях тела, таких как печень и мышцы, что приводит к серьезным проблемам со здоровьем. Приобретенная генерализованная липодистрофия представляет собой редкой патологическое состояние, которое возникает в детстве или юности, характеризующееся потерей жировой ткани, затрагивающей значительную площадь тела, в частности, лица, верхних конечностей и нижних конечностей.
Помимо этого, метрелептин изучают в качестве лекарственного средства для лечения других показаний, в том числе частичной липодистрофии, гипоталамической аменореи, неалкогольного стеатогепатоза и других различных гиполептинемических дисметаболических расстройств.
Метрелептин, как правило, вводят с помощью ежедневной подкожной инъекции. В связи с таким повторным введением существует риск того, что у субъектов будут образовываться антитела к метрелептину. Эти антитела могут нейтрализовать метрелептин, делая лечение неэффективным. Более того, они могут нейтрализовать эндогенный лептин, усугубляя заболевание субъектов, которые уже страдают от лептиновой недостаточности. По этой причине в данной области техники существует потребность в способе надежной детекции нейтрализующих антител у субъектов.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретении относится к детекции нейтрализующих антител к лептину.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции нейтрализующих антител к лептину в образце, предусматривающему: (а) инактивацию лептина в образце; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; и (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выявления субъекта, имеющего нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающему (а) инактивацию лептина, присутствующего в образце крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт меченого лептина из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (f) измерение положительного контрольного сигнала, при этом положительный контрольный сигнал образуется в результате завершения этапов (а) - (е), и дополнительно предусматривающему добавление известного количества антитела к лептину на этапе (b); и (g) сравнение сигнала из (е) с сигналом из (f), при этом в случае, если уровень сигнала, измеряемый на этапе (е) равен или меньше, чем уровень сигнала, измеряемого на этапе (f), то субъект считается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающему: (а) инактивацию лептина, присутствующего в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать мечены лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (f) измерение отрицательного контрольного сигнала, при этом указанный отрицательный контрольный сигнал образуется в результате завершение этапов (а) - (е), при этом образец крови, сыворотки крови или плазмы крови не содержит нейтрализующие антитела к лептину; и (g) сравнение процентной разницы сигнала из (е) и сигнала из (f) с границей разделения, при этом в случае, если процентная разница сигнала из (е) и сигнала из (f) больше, чем граница разделения, то субъект счи
- 1 045921 тается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину. В некоторых вариантах осуществления граница разделения находится между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или между приблизительно 5% и 15%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу, который включает определение у субъекта изменения в присутствии нейтрализующих антител к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта с течением времени. В некоторых вариантах осуществления этот способ может быть использован у субъекта, получающего лечение лептином, в котором присутствие нейтрализующих антител в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта может быть определено перед лечением лептином (предварительное лечение) и затем во время или после лечения лептином. Данный способ предусматривает: (1а) инактивацию лептина, присутствующего в первом образце крови, сыворотки крови или плазмы субъекта; (1b) добавление известного количества меченого лептина к первому образцу; (1с) приведение в контакт первого образца, содержащего меченый лептин из (1b) с субстратом, способным связываться с меченым лептином; (Id) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (1е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (2а) инактивацию лептина, присутствующего во втором образце крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта; (2b) добавление известного количества меченого лептина ко второму образцу; (2с) приведение в контакт второго образца, содержащего меченый лептин из (2b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (2d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (2е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (3) сравнение сигнала метки из (2е) с сигналом метки из (1е). В некоторых вариантах осуществления в результате сравнения может определяться процентная разницу между сигналом метки из (2е) и сигналом метки из (1е). В определенных вариантах осуществления процентную разницу можно сравнивать с границей разделения. Граница разделения может находиться между приблизительно 55% и приблизительно 95%, или между приблизительно 60% и приблизительно 90%, например, составлять приблизительно 65%, или приблизительно 85%, или приблизительно 80%.
В определенных вариантах осуществления лептин можно метить пероксидазой хрена или рутения трис-бипиридином.
В некоторых вариантах осуществления инактивация лептина может осуществляться в результате нагревания образца.
В определенных вариантах осуществления субстрат, способный связывать меченый лептин, может содержать (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей из (i). Покрытая матрица может представлять собой покрытую стрептавидином матрицу. Лептиновый рецептор можно метить биотином.
В некоторых вариантах осуществления субстрат, способный связывать меченый лептин, может представлять собой (i) покрытую матрицу, (ii) антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить меткой, подходящей для аффинной очистки; например, лептиновый рецептор можно метить с помощью гексагистидиновой метки. Антитело может иметь подходящую аффинность к метке лептинового рецептора; например, антитело может представлять собой антитело к гексагистидину. Помимо этого антитело можно метить меткой, подходящей для того, чтобы связываться с покрытой матрицей, такой как биотин.
Способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать этап снижения значения рН инактивированного образца (а) в результате добавления кислого раствора, и при этом меченый лептин, добавленный в (b), дополнительно содержит основной раствор, достаточный для нейтрализации значения рН образца после добавления. Кислый раствор может представлять собой раствор уксусной кислоты, такой как 0,8% раствор уксусной кислоты. Основной раствор может представлять собой буфер, такой как 0,125 М Tham-буфер.
В некоторых вариантах осуществления меченый лептин, добавленный на этапе (b), может представлять собой рекомбинантный человеческий лептин. В определенных вариантах осуществления меченый лептин, добавленный на этапе (b), может представлять собой метрелептин.
В некоторых вариантах осуществления детектируемый сигнал образуется на этапе (е) в случае, если концентрация меченого лептина, такого как метрелептин, в образце на этапе (b) составляет от приблизительно 90 нг/мл до приблизительно 120 нг/мл, или от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 110 нг/мл, например, приблизительно 101 нг/мл или приблизительно 109 нг/мл.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу определения восприимчивости субъекта, имеющего связанное с лептином нарушение, к лечению лептином, предусматривающему определение количества нейтрализующих антител к лептину у субъекта, при этом количество антител указывает на невосприимчивость субъекта к терапии лептином. Способы могут предусматривать этап, перечисленный выше. Связанное с лептином нарушение может представлять собой врожденную генерализованную липодистрофию, приобретенную генерализованную липодистрофию, частичную липодистрофию, гипоталамическую аменорею, неалкогольный стеатогепатоз и гиполептинемическое дисметаболическое расстройство.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, который может быть использован для
- 2 045921 детекции нейтрализующих антител к лептину в образце. Набор может содержать (а) меченый лептин и (b) субстрат, способный связывать меченый лептин.
В определенных вариантах осуществления лептин в наборе можно метить пероксидазой хрена или рутения трис-бипиридином.
В некоторых вариантах осуществления субстрат в наборе может содержать (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей из (i). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить биотином. Покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор могут находиться совместно в виде одного компонента в наборе или могут представлять собой отдельные компоненты.
В некоторых вариантах осуществления субстрат в наборе может представлять собой (i) покрытую матрицу, (ii) антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить с помощью метки, подходящей для аффинной очистки; например, лептиновый рецептор можно метить с помощью гексагистидиновой метки. Антитело может иметь подходящую аффинность к метке лептинового рецептора; например, антитело может представлять собой антитело к гексагистидину. Помимо этого антитело можно метить меткой, подходящей для того, чтобы связываться с покрытой матрицей, такой как биотин. Покрытая матрица, антитело и меченый лептиновый рецептор могут находиться совместно в виде одного компонента в наборе или в виде отдельных компонентов.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно может содержать положительный контроль и/или отрицательный контроль.
В некоторых вариантах осуществления набор может дополнительно содержать подкисляющий реагент; например, уксусную кислоту.
В определенных вариантах осуществления набор может дополнительно содержать основной раствор; например, буфер, такой как Tham-буфер.
Краткое описание чертежей
Настоящее раскрытие будет дополнительно объяснено с отсылкой на прилагаемые чертежи. Представленные чертежи не обязательно требуют масштабирования, при этом основная идея, как правило, акцентируется на иллюстрации принципов настоящего раскрытия, а некоторые характеристики могут быть преувеличены для того, чтобы продемонстрировать детали определенных компонентов. Помимо этого, любые измерения, описания и т.п., представленные в чертежах или описанные ниже, предполагают иллюстративный, а не ограничивающий характер. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, раскрываемые в настоящем документе, не должны восприниматься как ограничивающие, а просто иметь иллюстративную основу для объяснения специалисту в данной области техники как использовать способы и наборы, описываемые в настоящем документе.
На фиг. 1А-1В представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае лептина и метрелептина, который включает в себя субстрат, способный связывать меченый лептин, содержащий (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей (i), в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. На фиг. 1А представлены различные компоненты, используемые в анализе, и на фиг. 1В представлено применение анализа.
На фиг. 2 представлен иллюстративный лист данных для представления результатов анализа связывания с рецептором в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 3А-3В представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае лептина и метрелептина, который включает в себя субстрат, способный связывать меченый лептин, содержащий (i) покрытую матрицу, (ii) меченое антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii), в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. На фиг. 3А представлены различные компоненты, используемые в анализе, и на фиг. 3В представлено применение анализа.
На фиг. 4 представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае метрелептина, который включает положительные и отрицательные контроли, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 5 представлен этап кислотной диссоциации для применения в иллюстративном анализе связывания с рецептором в случае метрелептина, в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 6 представлена таблица, которая представляет сигнал, % ингибирования, а а также категорийные данные, собранные в результате анализа образцов от 17 субъектов, некоторые из которых были здоровыми и некоторых из которых были больными и ранее получали лечение лептином.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Способы детекции нейтрализующих антител к лептину.
В настоящем документе описаны способы детекции нейтрализующих антител к лептину в образце. Иллюстративные способы предусматривают этапы (а) инактивации лептина в образце; (b) добавления известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведения в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывания субстрата с
- 3 045921 удалением несвязанного меченого лептина; и (е) измерения сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином.
Термин способ и анализ используются в настоящем документе взаимозаменяемо.
Предполагается, что способы, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к лептину любого вида, в том числе встречающимся в природе человеческим, мышиным, крысиным лептинам и лептинам других гетерологичных видов, а рекомбинантно продуцируемого зрелого лептина. Например, лептин представляет собой полипептидный продукт, например, гена ob, описанного в международной публикации № WO 96/05309 и патенте США № 6309853, каждое из которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Способы настоящего изобретения могут также быть использованы для детекции нейтрализующих антител к биологически активным фрагментам, агонистам, аналогам агонистов, вариантам, слитым белкам лептина, химерному лептину и другим их производным, таким как таковые, раскрытые в патенте США № 5521283, патенте США № 5532336, патенте США № 5552522, патенте США № 5552523, патенте США № 5552524, патенте США № 5554727, патенте США № 5559208, патенте США № 5580954, патенте США № 5594101, патенте США № 5691309, патенте США № 5756461, патенте США № 5851995, патенте США № 5935810, патенте США № 6001968, патенте США № 6309853, патенте США № 6309853, патенте США № 6350730, патенте США № 6420339, патенте США № 6429290, патенте США № 6541033, патенте США № 6936439, патенте США № 7112659, патенте США № 7183254, патенте США № 7208577, патенте США № 8080254, патенте США № 8394765, публикации США № 2016/0083446, публикации согласно РСТ № WO 00/09165, публикации согласно РСТ № WO 00/20872, публикации согласно РСТ № WO 00/21574, публикации согласно РСТ № WO 00/47741, публикации согласно РСТ № WO 04/39832, публикации согласно РСТ № WO 09/64298, публикации согласно РСТ № WO 96/05309, публикации согласно РСТ № WO 96/22308, публикации согласно РСТ № WO 96/23517, публикации согласно РСТ № WO 96/40912, публикации согласно РСТ № WO 97/02004, публикации согласно РСТ № WO 97/06816, публикации согласно РСТ № WO 97/18833, публикации согласно РСТ № WO 97/38014, публикации согласно РСТ № WO 98/08512, публикации согласно РСТ № WO 98/12224, публикации согласно РСТ № WO 98/28427, публикации согласно РСТ № WO 98/46257, публикации согласно РСТ № WO 98/55139, публикации согласно РСТ № WO 2012/050925, публикации согласно РСТ № WO 2012/050930 и публикации согласно РСТ № WO 2013/009539; все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей. В определенных вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к метрелептину.
Предполагаемые способы инактивации лептина включают в себя инактивацию нагреванием, а также обработку химическими ингибиторами лептина, в том числе химическими ядами лептина, при условии, что ингибиторы или яды могут быть инактивированы перед добавлением меченого лептина.
Предполагается, что меченый лептин может представлять собой любую форму лептина, аналог лептина, химеру лептина или слитый белок или его производное, в том числе таковые соединения, перечисленные выше. Предполагается, что меченый лептин можно метить любой меткой, способной приводить к образованию удобным образом количественно определяемого сигнала. Метки могут представлять собой флуоресцентные метки, в том числе флуоресцентные метки с временным разрешением. Примеры могут включать в себя пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и рутения трис-бипиридин, среди других меток, известных в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет понятно, что способ детекции сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином, будет зависеть от природы метки.
Предполагается, что субстрат, используемый для приведения в контакт с содержащим образец меченым лептином, может содержать (i) покрытую матрицу; и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу. В определенных вариантах осуществления лептиновый рецептор метят биотином. Например, лептиновый рецептор может быть связан с матрицей с помощью биотина. Подразумевается, что покрытая матрица может быть связана с более чем одним меченым лептиновым рецептором. В определенных вариантах осуществления аналог лептинового рецептора может быть связан с матрицей.
В альтернативном случае предполагается, что субстрат может содержать: (i) покрытую матрицу; (ii) антитело, связанное с матрицей; и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу. В определенных вариантах осуществления лептиновый рецептор можно метить любой меткой, подходящей для аффинной очистки. Например, метка может представлять собой гексагистидиновую метку. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое может называться иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору, представляет собой любое антитело с подходящей аффинностью к метке лептинового рецептора. Например, иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору может представлять собой антитело к гексагистидину, в случае, если лептиновый рецептор имеет гексагистидиновую метку. Иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору можно также метить меткой, подходящей для связывания с матрицей, например, биотином. В определенных вариантах осуществления аналог лептинового рецептора может быть связан с матрицей.
- 4 045921
Матрица, используемая в настоящем документе, может представлять собой твердую подложку, с которым связан меченый лептиновый рецептор или антитело. Матрица может быть подходящей для измерения сигнала, образуемого меченым лептином. Примеры матрицы включают в себя без ограничения лунки планшета, такого как микротитровальный планшет, и гранулы. В определенных вариантах осуществления матрица может представлять собой многолуночный планшет Meso Scale Discovery (MSD).
В определенных вариантах осуществления образец, используемый в способах настоящего изобретения для детекции нейтрализующих антител к лептину, может быть выбран из крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта. Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек.
В одном аспекте настоящего изобретения способы, предполагаемые в настоящем документе, могут быть использованы для выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела, например, в крови, сыворотке крови или плазме крови. Предполагается, что индивидуумы, имеющие нейтрализующие антитела к лептину или аналогу лептина, могут быть выявлены. Индивидуумы, которые являются положительными в отношении нейтрализующих антител, могут быть выявлены в результате сравнения сигнала, образуемого меченым лептином, с положительными и/или отрицательными контрольными данными. В случае, если контроль представляет собой положительный контроль, предполагается, что в случае, если сигнал меньше или равен положительному контрольному сигналу, то образец может рассматриваться в качестве положительного в отношении нейтрализующих антител. В случае, если контроль представляет собой отрицательный контроль, то будет рассчитана процентная разница между сигналом образца и контрольным сигналом, процентную разницу будут сравнивать с границей разделения и в случае, если она больше, чем граница разделения, то субъекту ставят диагноз наличия нейтрализующих антител к исследуемому лептину.
Варианты осуществления способа, включающего отрицательный контроль, показаны на фиг. 1А-1В и 3А-3В. На этих фигурах показано, как может возникать связывание между меченым лептином/метрелептином и лептиновым рецепторами, и/или между нейтрализующими антителами к лептину/к метрелептину и лептиновыми рецепторами, с образованием процентной разницы сигнала, которая меньше, чем граница разделения, или равна или больше, чем граница разделения.
Граница разделения может находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 10% и приблизительно 30%, или составлять приблизительно 20%. Например, граница разделения может составлять приблизительно 5%, или приблизительно 6%, или приблизительно 7%, или приблизительно 8%, или приблизительно 9%, или приблизительно 10%, или приблизительно 11%, или приблизительно 12%, или приблизительно 13%, или приблизительно 14%, или приблизительно 15%, или приблизительно 16%, или приблизительно 17%, или приблизительно 18%, или приблизительно 19%, или приблизительно 20%, или приблизительно 21%, или приблизительно 22%, или приблизительно 23%, или приблизительно 24%, или приблизительно 25%, или приблизительно 26%, или приблизительно 27%, или приблизительно 28%, или приблизительно 29%, или приблизительно 30%, или приблизительно 31%, или приблизительно 32%, или приблизительно 33%, или приблизительно 34%, или приблизительно 35%, или приблизительно 36%, или приблизительно 37%, или приблизительно 38%, или приблизительно 39% или приблизительно 40%.
В определенных вариантах осуществления граница разделения может отличаться в случае, если субъект имеет нормальный уровень лептина, или в случае, если субъект имеет лептиновую недостаточность. В определенных вариантах осуществления субъект имеет лептиновую недостаточность, в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке, которая составляет приблизительно 16 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 7 нг/мл или ниже для мужчины; концентрацию в сыворотке, которая составляет приблизительно 8 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 5 нг/мл или ниже для мужчины; или приблизительно 5 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 3 нг/мл или ниже для мужчины. В противном случае субъект имеет лептиновую недостаточность в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке в пределах 15-го процентиля, или 10-го процентиля, или 8-го процентиля, или второго процентиля, или первого процентиля в соответствии с NHANES III. В альтернативном случае субъект имеет лептиновую недостаточность в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке, которая находится в пределах определенного процентиля, скорректированного на BMI, пол и/или другие факторы, такие как концентрация в сыворотке в пределах 10-го процентиля, или 5-го процентиля, или 3-го процентиля, или 2-го процентиля в соответствии с NHANES III, скорректированного на BMI.
В определенных вариантах осуществления, в случае, если субъект не имеет лептиновой недостаточности, граница разделения будет находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или в некоторых вариантах осуществления между приблизительно 5% и приблизительно 15%, например, составлять приблизительно 10,2% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к лептину (например, если субъект получал лечение лептином), или составлять приблизительно 7,89% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к метрелептину (например, если субъект получал лечение метрелептином). В определенных вариантах осуществления, в случае, если субъект имеет лептиновую недостаточность, граница разделения будет находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или в некоторых вариантах осуществления между приблизительно 5% и приблизительно 15%, на
- 5 045921 пример, составлять приблизительно 10,2% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к лептину (например, если субъект получал лечение лептином), или составлять приблизительно 9,66% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к метрелептину (например, если субъект получал лечение метрелептином).
На фиг. 2 представлен иллюстративный лист данных для применения в соответствии со способами настоящего изобретения.
В одном аспекте способы, предполагаемые в настоящем документе, могут быть использованы для определения у субъекта изменения в присутствии нейтрализующих антител к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта с течением времени. Например, способы могут быть использованы у субъекта, получающего лечение лептином, в целях определения изменения в наличии нейтрализующих антител в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта, перед лечением лептином и затем во время или после лечения лептином. Примеры видов лечения лептином известны в данной области техники. Способ может предусматривать: (1а) инактивацию лептина, присутствующего в первом образце крови, сыворотки крови или плазмы субъекта; (1b) добавление известного количества меченого лептина к первому образцу; (1с) приведение в контакт первого образца, содержащего меченый лептин из (1b) с субстратом, способным связываться с меченым лептином; (1d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (1е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (2а) инактивацию лептина, присутствующего во втором образце крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта; (2b) добавление известного количества меченого лептина ко второму образцу; (2с) приведение в контакт второго образца, содержащего меченый лептин из (2b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (2d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (2е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (3) сравнение сигнала метки из (2е) с сигналом метки из (1е). В некоторых вариантах осуществления в результате сравнения может определяться процентная разницу между сигналом метки из (2е) и сигналом метки из (1е). В определенных вариантах осуществления процентную разницу можно сравнивать с границей разделения. Граница разделения может находиться между приблизительно 55% и приблизительно 95%, или между приблизительно 60% и приблизительно 90%. Примеры могут включать в себя приблизительно 60%, или приблизительно 61%, или приблизительно 62%, или приблизительно 63%, или приблизительно 64%, или приблизительно 65%, или приблизительно 66%, или приблизительно 67%, или приблизительно 68%, или приблизительно 69%, или приблизительно 70%, или приблизительно 71%, или приблизительно 72%, или приблизительно 73%, или приблизительно 74%, или приблизительно 75%, или приблизительно 76%, или приблизительно 77%, или приблизительно 78%, или приблизительно 79%, или приблизительно 80%, или приблизительно 81%, или приблизительно 82%, или приблизительно 83%, или приблизительно 84%, или приблизительно 85%, или приблизительно 86%, или приблизительно 87%, или приблизительно 88%, или приблизительно 89% или приблизительно 90%. В определенных вариантах осуществления граница разделения может быть использована для определения того, необходимо ли субъекту продолжать лечение или будет ли субъект восприимчив к лечению. Например, в случае, если процентная разница равна или меньше границы разделения, то можно определить, что субъект должен прекратить лечение или что субъект будет невосприимчив к лечению.
Предполагаемые способы могут дополнительно предусматривать этап диссоциации, в целях диссоциации любых нейтрализующих антител в образце из любого лептина, который может присутствовать в образце. Указанный этап диссоциации может осуществляться в результате снижения значения рН образца после нейтрализации лептина. Подходящие реагенты для подкисления образца будут полностью очевидны специалисту в данной области техники, например, может быть использована уксусная кислота, например, раствор с содержанием от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% уксусной кислоты, или приблизительно 0,8% раствор уксусной кислоты. Другие подходящие реагенты, которые могут быть использованы для подкисления образца, известны специалисту в данной области техники. После подкисления образца, который диссоциирует любые нейтрализующие антитела из лептинов, которые могут присутствовать в образце, меченый лептин может быть добавлен совместно с основным раствором, достаточным для нейтрализации значения рН образца. Предполагается, что раствор, содержащий меченый лептин, может представлять собой буфер, такой, чтобы при добавлении его к образцу, значение рН образца повышалось до примерно 7, например, 7,4, обеспечивая связывание любых нейтрализующих антител, присутствующих в образце, с меченым лептином. Подходящие буферы включают в себя Thamбуфер от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,15 М, или от приблизительно 0,12 М до приблизительно 0,14 М, или приблизительно 0,124 М или 0,125 М. Другие подходящие буферы, которые могут возвращать значение рН образца к состоянию около нейтральности, известны специалисту в данной области техники.
Сигналы, образуемые метками, могут быть измерены с помощью способов, известных в данной области техники. Например, подходящие устройства, которые могут измерять сигналы, известны специалисту в данной области техники.
Предполагается, что определение того, имеет или не имеет субъект нейтрализующие антитела к лептину, может быть использовано для прогноза того, будет ли субъект восприимчив к лечению лепти
- 6 045921 ном, например, предполагается, что субъект с высокими уровнями нейтрализующих антител будет невосприимчив к лечению лептином.
Наборы.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор, содержащий компоненты для осуществления способов настоящего изобретения. Такой набор может содержать меченый лептин и субстрат, способный связывать меченый лептин, как описано выше, для применения в способах настоящего изобретения. Например, в некоторых вариантах осуществления лептин можно метить пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или рутения трис-бипиридином. В определенных вариантах осуществления лептин представляет собой метрелептин.
В определенных вариантах осуществления субстрат может представлять собой покрытую матрицу, как описано выше, такую как покрытую стрептавидином матрицу, и меченый лептиновый рецептор. Лептиновый рецептор можно метить биотином. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор могут храниться в наборе по отдельности. В других вариантах осуществления меченый лептиновый рецептор может быть связан с матрицей.
В некоторых вариантах осуществления субстрат может представлять собой покрытую матрицу, такую как покрытую стрептавидином матрицу; антитело; и меченый лептиновый рецептор. Лептиновый рецептор можно метить любой меткой, подходящей для аффинной очистки, такой как гексагистидиновой меткой. В некоторых вариантах осуществления антитело, т.е., иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору, представляет собой любое антитело с подходящей аффинностью к метке лептинового рецептора. Например, иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору может представлять собой антитело к гексагистидину, в случае, если лептиновый рецептор имеет гексагистидиновую метку. Иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору можно также метить меткой, подходящей для связывания с матрицей, такой как, биотином. В некоторых вариантах осуществления антитело может быть связано с матрицей, и/или меченый лептиновый рецептор может быть связан с антителом. В других вариантах осуществления покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор находятся в наборе по отдельности.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит положительный контроль, такой как антитело к лептину или антитело к метрелептину.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит отрицательный контроль.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или несколько подкисляющих реагентов. Например, подкисляющий реагент может представлять собой уксусную кислоту, такую как раствор от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% уксусной кислоты, или приблизительно 8% раствор уксусной кислоты.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит основной раствор, такой как буфер. Соответствующие буферы включают в себя Tham-буфер от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,15 М, или от приблизительно 0,12 М до приблизительно 0,14 М, или приблизительно 0,124 М или 0,125 М.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции для работы с компонентами набора.
Примеры
Следующие примеры никоим образом не предусматривают ограничение объема настоящего изобретения, а представлены для иллюстрации аспектов раскрываемых способов. Многие другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники.
Пример 1.
Рассматриваемые образцы можно исследовать следующим образом в целях определения уровня нейтрализующих антител, которые они содержат (см. также фиг. 4).
1. Покрытые стрептавидином планшеты блокировали с помощью Superblock в течение 1 часа.
2. Рассматриваемые образцы инактивировали нагреванием.
3. Лептин или метрелептин, меченые рутения (Ru) сульфометкой, добавляли к каждому образцу. Образцы положительного контроля готовили путем добавления лептина или метрелептина, меченого Ru сульфометкой, и положительного контрольного антитела к лептину muLEP13-11.03. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.
4. Планшеты со стрептавидином промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Меченое биотином антитело к гексагистидину, разбавленное в PBS, добавляли к планшетам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
5. Планшеты промывали PBS и разведенный меченый гептагистидином белок лептинового рецептора добавляли к планшетам и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа.
6. Планшеты промывали PBS, исследуемые и контрольные образцы (из этапа 2, приведенного выше) добавляли к планшетам и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
7. Планшеты промывали PBS и считывали на ридере MSD ESL.
Измеряли максимальный сигнал для лунок отрицательного контроля, содержащих лептин и метрелептин, но не нейтрализующее антитело. Процентное ингибирование рассчитывали путем вычитания
- 7 045921 разницы между максимальным сигналом и измеряемым сигналом для каждого образца и деления этого числа на максимальный сигнал. Процентное ингибирование затем сравнивали с границей разделения, как описано в примере 3.
Пример 2.
Необязательный этап кислотной диссоциации можно осуществлять в результате модификации процедуры, описанной в примере 1, следующим образом (см. также фиг. 5).
1. После инактивации нагреванием образцы инкубировали в 0,8% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре в течение одного часа с диссоциацией любых связанных антител в образце.
2. Лептин или метрелептин, меченые сульфометкой, разводили в 0,124 М растворе Tham-буфера, который нейтрализует уксусный образец при добавлении, способствуя связыванию антител.
Было определено, что чувствительность анализа связывания с рецептором, описанного выше, составляла 109 нг/мл в случае антител к метрелептину и 101 нг/мл в случае антител к лептину. Предел детекции в случае сопоставимого клеточного анализа с нейтрализующими антителами составлял 251 нг/мл.
Пример 3.
Границы разделения рассчитывали на основе процентного ингибирования сигнала от лептина и метрелептина у больных субъектов, которые имели предшествующее лечение метрелептином, и здоровых субъектов, не получавших лечения. Граница разделения в случае ингибирования связывания с лептином у здоровых и ранее получавших лечение больных субъектов составляла 10,18% ингибирования. Граница разделения в случае ингибирования связывания с метрелептином у больных субъектов, которые ранее получали лечение, составляла 9,66% ингибирования, а у нормальных субъектов она составляла 7,89% ингибирования. Все границы разделения устанавливали таким образом, чтобы они давали 1% доли ложных распознаваний сигнала. Данные о границах разделения представлены на фиг. 6.
Таблица 1 Обобщение границ разделения в случае лептина и метрелептина как для нормальных, так и для больных субъектов
| Лептин | Метрелептин | ||
| Максимальный сигнал от лептина, НК | Граница разделения | Максимальный сигнал от метрелептина, НК | Границы разделения |
| 5911 | Определенный во время валидации (10,2 как для патологического состояния, так и для нормы) 1 % доли ложных распознаваний сигнала | 2203,5 | Определенные во время валидации (9,66, патологическое состояние, 7,89, норма) 1% доли ложных распознаваний сигнала |
Пример 4.
Образцы от 17 пациентов исследовали в отношении ингибирования сигнала от лептина и метрелептина в соответствии со способами, описанными выше. Данные представлены на фиг. 6 и в табл. 2-4.
Два контрольных моноклональных нейтрализующих антитела к лептину использовали в концентрациях как 156 нг/мл (положительный контроль (низкая)) или 5000 нг/мл (положительный контроль (высокая)). Контрольные данные представлены на фиг. 6 и в табл. 3. Ингибирование обоими антителами было в значительной степени однородным, что указывало на надежность анализа.
Образцы с ингибированием более, чем граница разделения, относили к положительной категории, в то время как таковые с ингибированием ниже границы разделения относили к отрицательной категории. См. фиг. 6 и табл. 4.
- 8 045921
Таблица 2
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином, полученный из образцов от 17 пациентов
| Лептин | Метрелептин | ||||
| Максимальный сигнал от лептина, ОК | Граница разделения | Максимальный сигнал от метрелептина, ОК | Границы разделения | ||
| 5911 | Определенный во время валидации (10,18 как для патологического состояния, так и для нормы) 1% доли ложных распознаваний сигнала | 2203,5 | Определенные во время валидации (9,66, патологическое состояние, 7,89, норма) 1% доли ложных распознаваний сигнала | ||
| II) образца | Источник | Сигнал | % ингибирования | Сигнал | % ингибирования |
| Образец 1 | Предварительно е лечение | 5745,0 | 2,81 | 2138,0 | 2,97 |
| Образец 2 | 5548,0 | 6,14 | 2104,5 | 4,49 | |
| Образец 3 | 5027,5 | 14,95 | 1878,5 | 14,75 | |
| Образец 4 | 2150,0 | 63,63 | 724,0 | 67,14 | |
| Образец 5 | 599,5 | 89,86 | 211,5 | 90,40 | |
| Образец 6 | 5585,5 | 5,51 | 2154,0 | 2,25 | |
| Образец 7 | 481,5 | 91,85 | 205,5 | 90,67 | |
| Образец 8 | 6085,5 | -2,95 | 2319,0 | -5,24 | |
| Образец 9 | Нормальное состояние без болезни | 5833,5 | 1,31 | 2261,0 | -2,61 |
| Образец 10 | 5530,5 | 6,44 | 2206,0 | -0,11 | |
| Образец 11 | 5856,0 | 0,93 | 2342,0 | -6,29 | |
| Образец 12 | 5669,5 | 4,09 | 2284,5 | -3,68 | |
| Образец 13 | 5833,0 | 1,32 | 2304,5 | -4,58 | |
| Образец 14 | 6382,0 | -7,97 | 2283,5 | -3,63 | |
| Образец 15 | 6225,0 | -5,31 | 2249,5 | -2,09 | |
| Образец 16 | 5715,5 | 3,31 | 2225,0 | -0,98 | |
| Образец 17 | 5995,5 | -1,43 | 2334,0 | -5,92 |
- 9 045921
Таблица 3
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином высокими и низкими дозами моноклональных нейтрализующих антител к лептину положительного контроля
| Лептин | Метрелептин | |||||
| Максимальн ый сигнал от лептина, ОК | Граница разделения | Максимальн ый сигнал от метрелептина, ОК | Границы разделения | |||
| 5911 | Определенный во время валидации (10,18 как для патологическо го состояния, так и для нормы) 1% доли ложных распознаваний сигнала | 2203,5 | Определенные во время валидации (9,66, патологическо е состояние, 7,89, норма) 1% доли ложных распознаваний сигнала | |||
| П) образца Положительн ый контроль (низкая) | Источник = моноклональн ые антитела | Сигнал 1804,0 | % ингибирован ня 30,52 | Сигнал 622,0 | % ингибирован ня 28,23 | |
| 156 нг/мл | 1 | |||||
| 2 | 1847,2 | 31,25 | 639,7 | 29,03 | ||
| Положительн ый контроль (высокая) | 5000 нг/мл | 1 | 5770,3 | 97,62 | 2177,9 | 98,84 |
| 2 | 5755,5 | 97,37 | 2177,3 | 98,81 |
- 10 045921
Таблица 4
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином, а также диагностированная категория (положительная или отрицательная в случае нейтрализующих антител к лептину) для образцов от 17 пациентов
| Лептин Метрелептин Максима ,, „ Максимальн льныи „ ыи сигнал от сигнал от метрелептина лептина, ок ,ок | Результаты Лептин | Результаты Метрелептин | ||||||
| Категори я | % ингибиро вания | Категори я | % ингибиро вания | |||||
| 5911 | 2203,5 | |||||||
| ID образца | Источник | Сигнал | Сигнал | |||||
| 1 | Предваритель ное лечение | 5745,0 | 2138,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | |
| 2 | 5548,0 | 2104,5 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 3 | 5027,5 | 1878,5 | Положите льная | 15,0 | Положите льная | 14,8 | ||
| 4 | 2150,0 | 724,0 | Положите льная | 63,6 | Положите льная | 67,1 | ||
| 5 | 599,5 | 211,5 | Положите льная | 89,9 | Положите льная | 90,4 | ||
| 6 | 5585,5 | 2154,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 7 | 481,5 | 205,5 | Положите льная | 91,9 | Положите льная | 90,7 | ||
| 8 | 6085,5 | 2319,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 9 | Нормальное состояние без болезни | 5833,5 | 2261,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | |
| 10 | 5530,5 | 2206,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 11 | 5856,0 | 2342,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 12 | 5669,5 | 2284,5 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 13 | 5833,0 | 2304,5 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 14 | 6382,0 | 2283,5 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 15 | 6225,0 | 2249,5 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 16 | 5715,5 | 2225,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| 17 | 5995,5 | 2334,0 | Отрицател ьная | - | Отрицател ьная | - | ||
| Положит | 156 | 1 | 1804,0 | 622,0 | 30,5 | 28,2 | ||
| ельный контроль (низкая) | нг/мл | Положите льная | Положите льная | |||||
| 2 | 1847,2 | 639,7 | Положите льная | 31,3 | Положите льная | 29,0 | ||
| Положит ельный контроль (высокая) | 5000 нг/мл | 1 | 5770,3 | 2177,9 | Положите льная | 97,6 | Положите льная | 98,8 |
| 2 | 5755,5 | 2177,3 | Положите льная | 97,4 | Положите льная | 98,8 |
Включение в описание изобретения сведений путем ссылки.
Во всем настоящем раскрытии были сделаны ссылки и цитаты на другие документы, такие как патенты, патентные заявки, патентные публикации, журналы, книги, периодические издания, исследования, веб-контенты. Все такие документы включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
-
Claims (17)
- Эквиваленты.Различные модификации настоящего изобретения и многие дополнительные его варианты осуществления, помимо таковых, представленных и описанных в настоящем документе, будут очевидны специалистам в данной области из полного содержания этого документа, в том числе ссылок на научную и патентную литературу, цитируемую в настоящем документе. Рассматриваемый материал содержит содержат важную информацию, иллюстрацию и руководство, которые могут быть адаптированы для осуществления на практике настоящего изобретения в его различных вариантах осуществления и их эквивалентах.Вышеизложенное описание представлено для четкости понимания и исходя из него не следует понимать никаких излишних ограничений, поскольку модификации в пределах объема настоящего изобретения могут быть очевидными специалистам в данной области техники.Во всем настоящем описании и последующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, выражение содержать и его варианты, такие как содержит и содержащий следует понимать как включение указанного целого числа или этапа или группы целых чисел или этапов, но не исключения любого другого целого числа или этапа или группы целых чисел или этапов.Во всем настоящем описании, если композиции описаны как содержащие компоненты или вещества, предполагается, что композиции могут также состоять по сути из или состоять из любой комбинации упоминаемых компонентов или веществ, если не описано иное. Аналогичным образом, в случае, если способы описаны как включающие определенные этапы, предполагается, что способы также состоят по сути из или состоят из любой комбинации упоминаемых этапов, если не описано иное. Настоящее изобретении, иллюстративным образом раскрытое в настоящем документе, подходящим образом можно применять на практике в отсутствие любого элемента или этапа, который специально не раскрыт в настоящем документе.Практическое применение способа, раскрытого в настоящем документе, и его отдельных этапов, может осуществляться вручную и/или с помощью автоматизации, обеспечиваемой электронным оборудованием. Несмотря на то, что способы были описаны с отсылкой на определенные варианты осуществления, специалист в данной области техники легко поймет, что могут быть использованы другие пути осуществления действий, связанных со способами. Например, порядок различных этапов может быть изменен без отклонения от объема или идеи способа, если не описано иное. Помимо этого, некоторые из отдельных этапов, можно комбинировать, не предусматривать или дополнительно подразделять на дополнительные этапы.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ детекции нейтрализующих антител к лептину в образце крови, сыворотки крови или плазмы крови, предусматривающий этапы:(a) инактивации лептина, присутствующего в образце;(b) добавления известного количества меченого лептина к образцу;(c) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин, причем указанный субстрат, способный связываться с меченым лептином, содержит (i) покрытую матрицу, связанную с меченым лептиновым рецептором, или (ii) покрытую матрицу, антитело, связанное с указанной покрытой матрицей, и меченый лептиновый рецептор, связанный с указанным антителом;(d) промывания субстрата с удалением несвязанного меченого лептина;(e) измерения сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином;(f) измерения отрицательного контрольного сигнала, образуемого в результате завершения этапов (а)-(е) в контрольном образце крови, сыворотки крови или плазмы крови, который не содержит нейтрализующих антител к лептину; и (g) сравнение сигнала из (е) с сигналом из (f), при этом в случае, если уровень сигнала, измеряемого на этапе (е), больше или равен уровню сигнала, измеряемого на этапе (f), то образец не содержит нейтрализующих антител к лептину, а в случае, если уровень сигнала, измеряемого на этапе (е), меньше, чем уровень сигнала, измеряемого на этапе (f), то образец содержит нейтрализующие антитела к лептину.
- 2. Способ выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающий этапы:(a) инактивации лептина, присутствующего в образце крови, сыворотки крови или плазмы субъекта;(b) добавления известного количества меченого лептина к образцу;(c) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин, причем указанный субстрат, способный связываться с меченым лептином, содержит (i) покрытую матрицу, связанную с меченым лептиновым рецептором, или (ii) покрытую матрицу, антитело, связанное с указанной покрытой матрицей, и меченый лептиновый рецептор, связанный с указанным антителом;(d) промывания субстрата для удаления несвязанного меченого лептина;- 12 045921 (e) измерения сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином;(f) измерения положительного контрольного сигнала, образуемого в результате завершения этапов (а)-(е), и дополнительно предусматривающее добавление известного количества антитела к лептину на этапе (b); и (g) сравнение сигнала из (е) с сигналом из (f), при этом в случае, если уровень сигнала, измеряемого на этапе (е) равен или меньше, чем уровень сигнала, измеряемого на этапе (f), то субъект считается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину.
- 3. Способ выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающий этапы:(a) инактивации лептина, присутствующего в образце крови, сыворотки крови или плазмы;(b) добавления известного количества меченого лептина к образцу;(c) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин, причем указанный субстрат, способный связываться с меченым лептином, содержит (i) покрытую матрицу, связанную с меченым лептиновым рецептором, или (ii) покрытую матрицу, антитело, связанное с указанной покрытой матрицей, и меченый лептиновый рецептор, связанный с указанным антителом;(d) промывания субстрата для удаления несвязанного меченого лептина;(e) измерения сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином;(f) измерения отрицательного контрольного сигнала, образуемого в результате завершения этапов (а)-(е), при этом образец крови, сыворотки крови или плазмы крови не содержит нейтрализующие антитела к лептину; и (g) сравнения процентной разницы сигнала из (е) и сигнала из (f) с границей разделения, при этом в случае, если процентная разница сигнала из (е) и сигнала из (f) больше, чем граница разделения, то субъект считается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину.
- 4. Способ по п.3, где граница разделения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 30%.
- 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где лептин является меченым пероксидазой хрена или рутения трис-бипиридином.
- 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где этап инактивации (а) осуществляют путем нагревания образца.
- 7. Способ по п.1, где покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу.
- 8. Способ по п.7, где лептиновый рецептор, связанный с матрицей, или антитело, связанное с матрицей, метят биотином.
- 9. Способ по любому из пп.7-8, где субстрат содержит покрытую матрицу, антитело, связанное с указанной покрытой матрицей, и меченый лептиновый рецептор, связанный с указанным антителом, и где лептиновый рецептор, связанный с антителом, метят меткой, подходящей для аффинной очистки, и антитело имеет подходящую аффинность к метке лептинового рецептора.
- 10. Способ по п.9, где лептиновый рецептор, связанный с матрицей, метят гексагистидиновой меткой, и антитело представляет собой антитело к гексагистидину.
- 11. Способ определения восприимчивости субъекта, имеющего связанное с лептином нарушение, к лечению лептином, предусматривающий определение количества нейтрализующих антител к лептину у субъекта, детектируемых способом по п.1, при этом указанное количество антител указывает на невосприимчивость субъекта к терапии лептином.
- 12. Способ по п.11, где связанное с лептином нарушение выбирают из группы, состоящей из врожденной генерализованной липодистрофии, приобретенной генерализованной липодистрофии, частичной липодистрофии, гипоталамической аменореи, неалкогольного стеатогепатоза и гиполептинемического дисметаболического расстройства.
- 13. Набор для применения в детекции нейтрализующих антител к лептину в образце крови, сыворотки крови или плазмы крови, содержащий меченый лептин и субстрат, способный связывать меченый лептин, где субстрат, способный связывать меченый лептин, содержит:(а) i. покрытую матрицу;ii. меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей из (i); или (b) i. покрытую матрицу;ii. антитело, связанное с матрицей из (i); и iii. меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii).
- 14. Набор по п.13, где лептин является меченым пероксидазой хрена или рутения трисбипиридином.
- 15. Набор по п.13, где покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу.
- 16. Набор по п.15, где лептиновый рецептор, связанный с матрицей, или антитело, связанное с матрицей, является меченым биотином.
- 17. Набор по любому из пп.15 или 16, где субстрат содержит покрытую матрицу, антитело, связанное с указанной покрытой матрицей, и меченый лептиновый рецептор, связанный с указанным антите--
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/393,632 | 2016-09-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045921B1 true EA045921B1 (ru) | 2024-01-18 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200378988A1 (en) | Methods of detecting anti-leptin neutralizing antibodies | |
| JP5555846B2 (ja) | 急性中枢神経障害の予後判定方法 | |
| US9068988B2 (en) | Compositions and methods of detecting TIABs | |
| JP5737673B2 (ja) | アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法及びその利用 | |
| KR20100128281A (ko) | 바이오마커 와이케이엘-40의 수준을 측정함으로써 발견되는 생존 예후에 따른 심혈관계 질환에 걸린 개체들의 분류 방법 | |
| JP5222138B2 (ja) | 脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（ａ−ｆａｂｐ、ｆａｂｐ４、ｐ２）の濃度を測定する方法 | |
| TW201033616A (en) | Urine and serum biomarkers associated with diabetic nephropathy | |
| JP2019529904A5 (ru) | ||
| Song et al. | Chip-based cartilage oligomeric matrix protein detection in serum and synovial fluid for osteoarthritis diagnosis | |
| JP6733889B2 (ja) | 細胞分化ポテンシャル判定法 | |
| EA045921B1 (ru) | Способы детекции нейтрализующих антител к лептину | |
| KR20100127210A (ko) | 비특이적 질환용 일반 마커로서의 ｙｋｌ-40 | |
| US20120178112A1 (en) | Method of detecting skeletal muscle damage | |
| CN105807067A (zh) | 一种检测阿尔兹海默综合症ncam2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法 | |
| CN104105967B (zh) | 生腱蛋白c及其在类风湿关节炎的用途 | |
| EP3298028B1 (en) | Method for detecting and measuring endogenous complexes as a new tumour marker | |
| JP2009128178A (ja) | 身体活動レベルの検出方法及び検出用キット | |
| JP2022021363A (ja) | 睡眠障害を判定するためのバイオマーカー | |
| EP2526423A1 (en) | Methods&devices for diagnosing cardiac disorders | |
| Bartl et al. | Laboratory Investigations in Osteoporosis: Are They Needed? | |
| Potts Jr | Clinical applications of parathyroid hormone assays | |
| DE102015108523A1 (de) | Peptid-Biomarker für Krebs | |
| CN106459166A (zh) | 检测肉瘤转移的方法和生物标记物 |