ES2941740T3

ES2941740T3 - Anticuerpos anti-PD-1 y métodos de tratamiento

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Publication number: ES2941740T3
Application number: ES19703451T
Authority: ES
Inventors: Khaled Ali; Neeraj Agrawal; Gunasekaran Kannan; Ian Foltz; Zhulun Wang; Darren Bates; Marissa Mock; Shunsuke Takenaka
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2023-05-25
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: BR112020014121A2; CA3087273A1; MA51631A; PE20211270A1; WO2019140196A1; JOP20200172A1; CR20200330A; CL2020001820A1; ZA202004735B; TN2020000142A1; IL275096A; EP3737694A1; CN111727197A; CR20210319A; EP3737694B1; CO2020009234A2; PH12020550967A1; US11518808B2; TW201930344A; UY38049A

Abstract

En el presente documento se proporcionan proteínas de unión al antígeno PD-1 y ácidos nucleicos relacionados, vectores, células huésped, kits y composiciones farmacéuticas. Además, se proporcionan métodos para producir proteínas de unión al antígeno PD-1 y métodos para tratar a un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-1 y métodos de tratamiento

Antecedentes

El eje PD-1/PD-L1 está implicado en la supresión de las respuestas inmunitarias de las células T en el cáncer. Los antagonistas de esta vía se han validado clínicamente en varias indicaciones de tumores sólidos. Nivolumab y pembrolizumab son dos de esos inhibidores que se dirigen a la vía PD-1, y cada uno ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el tratamiento del melanoma metastásico. Recientemente, los investigadores han ensayado el paradigma de la inhibición de puntos de control en el contexto de otros tipos de tumores. Si bien se han logrado algunos avances, la terapia de inhibición de puntos de control aún permanece a la sombra de otras opciones de tratamiento del cáncer.

Se están realizando estudios de inhibidores de puntos de control en combinación con otros agentes o se han completado recientemente. La combinación de nivolumab e ipilimumab, un anticuerpo bloqueante del receptor de CTLA-4, por ejemplo, se ensayó en un ensayo clínico de fase III en pacientes con melanoma irresecable en estadio III o IV. En este estudio, el porcentaje de pacientes que lograron una respuesta completa fue el más alto entre los que recibieron la combinación de nivolumab e ipilimumab, superando el resultado que presentaron los del grupo que recibió cualquiera de los medicamentos solos. Actualmente también se están explorando otras combinaciones.

La interleucina-21 (IL-21) es una citocina pleiotrópica derivada de células T que regula la actividad de las células inmunitarias tanto innatas como adaptativas. La IL-21 puede aumentar la supervivencia de las células T y la función efectora. Debido a que juega un papel clave en las respuestas antitumorales y antivíricas, además de ejercer efectos importantes sobre las respuestas inflamatorias que conducen al desarrollo de enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias, la IL-21 ha sido un objetivo atractivo para varias terapias.

Sin embargo, el desarrollo de terapias basadas en IL-21 ha sido complejo. La investigación se ha visto complicada por estudios que muestran que la potenciación, o de forma confusa, la inhibición de la acción de la IL-21 conduce a un efecto terapéutico. Existen desafíos adicionales debido a la amplia expresión del receptor para IL-21 (IL-21R). La IL-21R se expresa no solo en las células T, sino también en las células B, células NK y células mieloides. Por consiguiente, se debe tener cuidado para limitar una activación generalizada de IL-21 en los leucocitos y evitar la posibilidad de toxicidad. La restricción de la señalización de IL-21 debe ser equilibrada y selectiva. La activación de los efectos de la IL-21 debe diseñarse para que se produzca en el momento y lugar correctos.

De hecho, cualquier éxito, especialmente el éxito clínico con fracciones de IL-21 como monoterapia o en combinación con inhibidores de puntos de control, ha sido silenciado. El documento EP2262837 se refiere a proteínas de unión a PD-1. El documento WO 2006/121168 A1 se refiere a anticuerpos monoclonales humanos contra la muerte programada 1 (PD-1) y a métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos anti-PD-1 solos o en combinación con otros agentes inmunoterapéuticos. El documento WO 02/078731 se refiere a la modulación de las interacciones de PD-1 con sus ligandos. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de modalidades de tratamiento que utilicen IL-21, incluyendo modalidades que combinen fracciones de IL-21 con inhibidores de puntos de control. También sigue existiendo la necesidad de terapias con IL-21 combinadas con la inhibición de puntos de control inmunitarios.

Sumario

En el presente documento se describen proteínas de unión al antígeno PD-1 y conjugados y proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1. La presente invención proporciona una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ID NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID NO: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357. La presente invención proporciona además una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación proporciona además ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1) de la presente divulgación. En el presente documento se proporcionan además vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la presente divulgación y las células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona además kits que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), ácido nucleico, vector o célula hospedadora de la presente divulgación, o una combinación de los mismos.

En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), ácido nucleico, vector o célula hospedadora de la presente divulgación, o una combinación de los mismos.

En el presente documento se proporcionan métodos para producir una proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1). El método, en realizaciones ilustrativas, comprende cultivar una célula hospedadora de la presente divulgación para expresar la proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), y recolectar la proteína de unión al antígeno PD-1 expresada (p. ej., un anticuerpo de unión al antígeno PD-1).

En la presente divulgación también se proporcionan usos médicos. Se describe una composición farmacéutica de la presente divulgación para su uso en un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto que lo necesita la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad eficaz para tratar al sujeto. En aspectos ilustrativos, el sujeto tiene un tumor (p. ej., un tumor sólido, una neoplasia hematológica o una neoplasia linfoide) y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto. En otros aspectos ilustrativos, el tumor es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (p. ej., NSCLC en estadio III o IV), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma hepatocelular, cánceres con alta inestabilidad microsatelital (es decir, cánceres con MSI alto), linfoma o leucemia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de ratones BALB/c en los que se han implantado células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores y los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (IP) de 300 |jg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1) los días 12, 15 y 18.

La figura 1B representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de ratones BALB/c en los que se han implantado células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores y los ratones recibieron una inyección IP de 300 jg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18.

La figura 1C representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de ratones BALB/c en los que se han implantado células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores y a los ratones se les administraron 50 jg de IL-21 murina recombinante (rmIL-21) tres veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33

La figura 1D representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de ratones BALB/c en los que se han implantado células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores y a los ratones se les administraron 300 jg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18 y 50 jg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33.

La figura 2 representa un gráfico del porcentaje de supervivencia de los cuatro grupos de ratones BALB/c en los que se implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5. A los ratones del grupo 1 se les administró una inyección intraperitoneal (IP) de 300 jg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1) los días 12, 15 y 18. Los ratones del grupo 2 recibieron una inyección IP de 300 jg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18. Los ratones del grupo 3 recibieron 50 jg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. Los ratones del grupo 4 recibieron 300 jg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18 y 50 jg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. La administración de una combinación de anti-PD-1 y rmIL-21 prolonga significativamente la supervivencia en comparación con la monoterapia con rmIL-21 o anti-PD-1.

La figura 3 es una ilustración de una hipótesis del mecanismo de acción de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo bloqueante de PD-1 fusionado con una muteína de IL-21 (aPD-1:muteína de IL-21). Sin quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que la fusión se une a IL-21R en las células T CD8+ mientras bloquea simultáneamente la transducción de señales entre PD-1 y PD-L1.

La figura 4A es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21. La proteína de fusión no tiene un enlazador. El anticuerpo puede comprender regiones constantes que reducen o eliminan la unión y las funciones efectoras asociadas a Fc (p. ej., carecen de la capacidad de interactuar con los receptores de Fcy (p. ej., SEFL2-2)).

La figura 4B es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21. La proteína de fusión puede comprender un enlazador GGGGS (G4S) entre la región constante de cadena pesada del anticuerpo y la muteína de IL-21. El anticuerpo también puede comprender modificaciones de SEFL2-2.

La figura 4C es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un monómero de muteína de IL-21. La proteína de fusión puede comprender un enlazador G4S entre la región constante de cadena pesada del anticuerpo y la muteína de IL-21. Las cadenas pesadas del anticuerpo comprenden mutaciones de pares de carga (cpm; p. ej., V1, V4, V103 o V131) para ayudar en la asociación preferente de las regiones Fc del heterodímero. El anticuerpo también puede comprender modificaciones de SEFL2-2.

La figura 5A representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T Hut78 PD-1've expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 solo (línea continua con rombos negros), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin enlazador (línea continua con triángulos negros), (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con enlazador (línea discontinua con triángulos blancos), (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin enlazador (línea continua con cuadrados negros), o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador (línea discontinua con cuadrados blancos).

La figura 5B representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T Hut78 PD-1 ve expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 solo (línea continua con rombos negros), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin enlazador (línea continua con triángulos negros), (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con un enlazador (línea discontinua con triángulos blancos), (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin un enlazador (línea continua con cuadrados negros), o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador (línea discontinua con cuadrados blancos).

La Figura 6 representa un gráfico de las concentraciones séricas de una proteína de fusión de homodímero que comprende IL-21 WT fusionada con un mAb anti-PD-1 que se administró por vía intravenosa a 6 animales a una dosis baja (250 pg/kg) o a una dosis alta (1000 pg/kg). Como control se utilizó un dominio de anticuerpo IgG (150 pg/kg).

La figura 7 representa un gráfico de la reducción en veces de la actividad de IL-21 (en relación con la actividad de rhIL-21) por células Hut78 PD-Tve (barras blancas) o células Hut78 PD-1+ve (barras negras) expuestas a muteínas de IL-21 con afinidad reducida por IL-21Ra.

La Figura 8 representa un gráfico de la reducción en veces de la actividad de IL-21 (en relación con la actividad de rhIL-21) por células Hut78 PD-Tve (barras blancas) o células Hut78 PD-1+ve (barras negras) expuestas a muteínas de IL-21 con afinidad reducida por IL-21R^y.

La figura 9A representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T Hut78 PD-1've expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero WT IL-21 (línea discontinua con círculos cerrados), y (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína 51 de IL-21 (R65P) (línea de puntos con triángulos negros).

La figura 9B representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T Hut78 PD-1+ ve expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero WT IL-21 (línea discontinua con círculos cerrados), y (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína 51 de IL-21 (R65P) (línea de puntos con triángulos negros).

La figura 10 representa un gráfico de las concentraciones séricas de una proteína de fusión que comprende (i) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 R76E (línea de puntos con círculos negros), (ii) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 R76A (línea discontinua con triángulos negros), (iii) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 D15N (línea discontinua con X), (iv) un anticuerpo anti-PD-1 (8,25 mg/kg; línea discontinua con rombos blancos), y (v) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 WT (línea continua con cuadrados negros).

La figura 11 representa un gráfico de la IL-2 (pg/ml) secretada por las células de una reacción linfocitaria mixta en función de la concentración de anticuerpos de (i) un anticuerpo anti-PD-1 (línea continua con círculos negros), (ii) una proteína de fusión que comprende homodímero de doble muteína de IL-21 R5Q/R76E (línea discontinua con círculos blancos), (iii) una combinación de mAb anti-PD-1 y rhIL-21 (línea de puntos con cuadrados blancos), (iv) una proteína de fusión que comprende homodímero de muteína sencilla de IL-21 R76E (cuadrados negros), (v) control de IgG (línea de puntos con rombos blancos) y (vi) una rhIL-21 (línea discontinua con triángulos blancos).

La figura 12A representa un gráfico del cambio en veces de la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la actividad STAT3 de células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5E/R76A (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG1 (línea de puntos con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros) o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína sencilla de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La figura 12B representa un gráfico del cambio en veces de MFI de la actividad STAT3 de células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG1 (línea de puntos con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros) o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína sencilla de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La figura 12C representa un gráfico del cambio en veces de MFI de la actividad STAT3 de células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R9E/R76A (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG1 (línea de puntos con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros) o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína sencilla de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La figura 13A representa un gráfico del % de lisis específica por CTL (eje y) frente a relaciones entre células efectoras y diana (eje x) expuestas a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea de puntos con triángulos blancos) o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R5E/R76A (línea discontinua con X).

La figura 13B representa un gráfico del % de lisis específica por CTL expuestos a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea de puntos con triángulos blancos) o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R5Q/R76E (línea discontinua con X).

La figura 13C representa un gráfico del % de lisis específica por CTL expuestos a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea de puntos con triángulos blancos) o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R9E/R76A (línea discontinua con X).

La Figura 14 representa las concentraciones séricas de (i) mAb anti-PD-1 (línea continua con cuadrados negros), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R5Q/R76E (línea continua con círculos negros), (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R76E (línea continua), (iv) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R5E/R76A (línea discontinua con X), (v) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R76A (línea discontinua con rombos negros) o (vi) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de IL-21 R76E (línea continua con triángulos negros).

La figura 15A representa una línea de tiempo del muestreo de células (flechas blancas) y de las administraciones (flechas negras).

La figura 15B representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD4+ (con respecto al día -5) medidas el día 7 en animales que recibieron una dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína sencilla de IL-21 R76E (barra con líneas verticales) o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (cada uno administrado el día 0).

La figura 15C representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD8+ (con respecto al día -5) medidas el día 7 en animales que recibieron una dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína sencilla de IL-21 R76E (barra con líneas verticales) o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (cada uno administrado el día 0).

La figura 15D representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD8+ (con respecto al día -5) medidas el día 21 en animales que recibieron una primera dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína sencilla de IL-21 R76E (barra con líneas verticales) o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (primera dosis administrada el día 0 y segunda dosis administrada el día 8).

La figura 16 representa un gráfico de la expansión de células PD-1+/CD8+ (con respecto al día -5) en función de la ocupación del receptor de PD-1 (RO) en células PD-1+/CD8+. Los mutantes sencillos de IL-21 (801, 802, 807 y 808) se muestran dentro del círculo pequeño y los mutantes dobles de IL-21 (803, 804, 805 y 806) se muestran en el círculo grande. Estos datos demuestran que las propiedades farmacocinéticas superiores de los mutantes dobles permiten una mejor cobertura de la diana y se correlacionan con mejores respuestas farmacodinámicas, medido por la expansión de la población diana de PD-1+. La línea discontinua vertical indica la delimitación general entre mutantes sencillos y dobles.

La figura 17 representa diagramas de flujo de animales individuales tratados con construcciones de homodímero de mutante sencillo (animales 801 y 802), construcciones de homodímero de mutante doble (animales 803 - 806) o construcciones monoméricas de mutante sencillo (animales 807 y 808). Las células T PD-1+ se detectaron mediante anticuerpos de detección competitivos o no competitivos. El porcentaje de cobertura de la diana se calcula como un porcentaje de la relación entre el anticuerpo de PD-1 competitivo y no competitivo. Los datos muestran que todas las construcciones demuestran una cobertura de la diana robusta después de repetir la dosificación el día 21.

La figura 18A representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad STAT3 de células T Hut78 PD-1' ve expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de diez mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R5Q/R76E. Los diez mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con rombos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con triángulos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

La figura 18B representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad STAT3 de células T Hut78 PD-1+ve expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de diez mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R5Q/R76E. Los diez mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con rombos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con triángulos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos). La comparación de la figura 18A con la figura 18B indica que el direccionamiento de PD-1 es necesario para la señalización de pSTAT3 y que la actividad de las muteínas es similar cuando se fusionan con diferentes mAb anti-PD-1.

La figura 19A representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad STAT3 de células T Hut78 PD-1- ve expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de siete mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R9E/R76A. Los siete mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con triángulos blancos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con rombos blancos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

La figura 19B representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad STAT3 de células T Hut78 PD-1+ve expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de siete mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R9E/R76A. La comparación de la figura 19A con la figura 19B indica que el direccionamiento de PD-1 es necesario para la señalización de pSTAT3 y que la actividad de las muteínas es similar cuando se fusionan con diferentes mAb anti-PD-1. Los siete mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con triángulos blancos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con rombos blancos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

Las figuras 20A-20D representan la cantidad de señalización de pSTAT3 observada con varias fusiones de mAb anti-PD-1-muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. La línea continua con círculos negros (parte superior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos con cuadrados negros (parte inferior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 22D4.006 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) utilizado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea de puntos con rombos blancos (parte inferior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las demás líneas son fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21 (con varias mutaciones de pares de carga) en donde los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E o R5Q/R76E. rhIL-21 demuestra actividad en células tanto PD-1_ve como PD-1+ve, las fusiones de muteína doble monoméricas y homodiméricas no pueden demostrar actividad pSTAT3 (basada en IL-21) en células PD-1-ve y las fusiones de muteína doble monoméricas y homodiméricas pueden demostrar actividad pSTAT3 (basada en IL-21) en células PD-1+ve. Por lo tanto, las fusiones monoméricas con mutantes dobles de IL-21 presentan niveles similares de atenuación de la actividad de IL-21 en células PD-1-ve y rescate de la actividad de IL-21 en células PD-1+ve como sus fusiones diméricas homólogas. Las Figuras 20A y 20B son ejecuciones duplicadas del ensayo pSTAT3 en células PD-1-ve. Las Figuras 20C y 20D son ejecuciones duplicadas del ensayo pSTAT3 en células PD-1+ve.

Las Figuras 21A-21D representan los resultados de un ensayo con gen indicador de PD-1 (RGA; figuras 21A y 21B) y un ensayo MLR (figuras 21C y 21D) con las mismas fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21 que se evaluaron en las figuras 20A-20D. Las figuras 21A-21D demuestran que las fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína doble monomérica y dimérica de IL-21 son capaces de inducir la actividad de PD-1. La línea continua con círculos negros (parte inferior de los gráficos) es rhIL-21; la línea con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea discontinua con cuadrados negros (parte superior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 22D4.006 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) utilizado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea de puntos con rombos blancos (parte superior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las demás líneas son fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. Las figuras 21A y 21B son ejecuciones duplicadas del ensayo RGA de PD-1. Las figuras 20C y 20D son ejecuciones duplicadas del ensayo ^mL^r.

Las figuras 22A-22D representan los resultados de los ensayos de pSTAT3 que prueban las mismas construcciones que las de las figuras 20A-20D, con la excepción de que se usa un mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) en las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica y dimérica de IL-21. Los resultados de las figuras 22A-22D son similares a los observados en las figuras 20A-20D. La línea continua con círculos negros (parte superior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos con cuadrados negros (parte inferior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) utilizado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea de puntos con rombos blancos (parte inferior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las demás líneas son fusiones de mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21 (con varias mutaciones de pares de carga) en donde los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E o R5Q/R76E. Las Figuras 22A y 22B son ejecuciones duplicadas del ensayo pSTAT3 en células PD-1've. Las Figuras 22C y 22D son ejecuciones duplicadas del ensayo pSTAT3 en células PD-1+ve.

Las figuras 23A-23D representan los resultados de los ensayos con gen indicador de PD-1 (figuras 23A y 23B) y los ensayos MLR (figuras 23C y 23D) que prueban las mismas construcciones que las de las figuras 21A-21D, con la excepción de que se usa un mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) en las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica y dimérica de IL-21. Los resultados de las figuras 23A-23D son similares a los observados en las figuras 21A-21D. La línea continua con círculos negros (parte inferior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos (parte superior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) utilizado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea de puntos con rombos blancos (parte superior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las demás líneas son fusiones de mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. Las figuras 23A y 23B son ejecuciones duplicadas del ensayo RGA de PD-1. Las figuras 23C y 23D son ejecuciones duplicadas del ensayo ^mL^r.

La figura 24 representa un gráfico de la actividad NFAT/luciferasa de anticuerpos anti-PD-1 purificados en función de la concentración de mAb.

La figura 25A es un gráfico del cambio en veces en el número de células Ki67+/CD3+/CD4+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25B es un gráfico del cambio en veces en el número de células Ki67+/CD3+/CD8+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25C es un gráfico del cambio en veces en el número de células pSTAT3+/CD3+/CD4+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25D es un gráfico del cambio en veces en el número de células pSTAT3+/CD3+/CD8+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25E es un gráfico del cambio en veces en el número de células CD3+/CD4+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25F es un gráfico del cambio en veces en el número de células CD3+/CD8+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25G es un gráfico del cambio en veces en el número de células PD-1+/CD3+/CD4+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25H es un gráfico del cambio en veces en el número de células PD-1+/CD3+/C84+ con respecto al valor de referencia tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25I es un gráfico del cambio en veces en la cantidad de perforina sérica con respecto al valor de referencia tras 72 horas de exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 25J es un gráfico del % de células Ki67+ con respecto al valor de referencia en función del aumento en veces de perforina tras 72 horas de exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La figura 26A es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada del anticuerpo 22D4.017 para el antígeno PD-1 humano.

La figura 26B es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada del anticuerpo 20C1.009 para el antígeno PD-1 humano.

La figura 26C es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada del anticuerpo 20A2.003 para el antígeno PD-1 humano.

La figura 26D es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada de un mAb anti-PD-1 IgG1, para el antígeno PD-1 humano.

La figura 26E es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada de un mAb de PD-1 IgG4 para el antígeno PD-1 humano.

La figura 26F es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada de 22D4.017 para el antígeno PD-1 de mono cynomolgus.

La figura 26G es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada del anticuerpo 20C1.009 para el antígeno PD-1 de mono cynomolgus.

La figura 26H es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada del anticuerpo 20A2.003 para el antígeno PD-1 de mono cynomolgus.

La figura 26I es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada de un mAb anti-PD-1 IgG1 para el antígeno PD-1 de mono cynomolgus.

La figura 26J es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) utilizado para determinar la K^dindicada de un mAb anti-PD-1 IgG4 para el antígeno PD-1 de mono cynomolgus.

La Figura 27 es un gráfico de la Cp (kcal/mol/°C) en función de la temperatura para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017 y 20C1.009.

La Figura 28 es un gráfico de la viscosidad representada frente a la velocidad de cizallamiento para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017 y 20C1.009.

Las figuras 29A-29D son una serie de gráficos que representan la señal en función de la concentración de anticuerpo en (Fig. 29A) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para PD-1, (Fig. 29B) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para TIGIT, (Fig. 29C) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para LAG3 y (Fig. 29D) la línea de células T Hut78 progenitora que no expresa endógenamente PD-1, TIGIT o LAG3.

La figura 30A es una ilustración que resume el diseño experimental del estudio. La figura 30B es un gráfico de actividad in vivo medida por el volumen tumoral (mm3) en función del tiempo (días). Los valores de P se calcularon con Anova unidireccional con la prueba post hoc de Tukey y fueron los siguientes; Día 21: P = 0,0023 (mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A) y P = 0,0056 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A); Día 24: P = 0,0001 (mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A) y P = 0,0001 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A); Día 28: P = 0,0001 (mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A) y P = 0,0012 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A); Día 32: P = 0,0001 (mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A) y P = 0,0001 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A). La figura 30C es una ilustración del mAb PD1 x R9E:R76A (monómero).

Las figuras 30D y 30E representan un resumen del volumen tumoral en la aleatorización (día 17) y antes de tratamiento (figura 30D) y en el día 32 (figura 30E). Los valores de P se calcularon utilizando Anova unidireccional con una prueba post hoc de Tukey. P = 0,0001 (mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A) y P = 0,0001 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A).

La figura 30F es un gráfico de supervivencia de ratones portadores de tumores. Los valores de P de la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) fueron los siguientes; P = 0,0037 (Isotipo frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A), P = 0,0001 (monoterapia con mAb anti-PD-1 frente a mAb anti-PD-1 x monómero R9E:R76A).

La figura 31 es un gráfico que demuestra que la combinación de construcciones de anticuerpos monocatenarios y un anticuerpo anti-PD-1 da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral frente a cualquier agente único.

La figura 32 es un gráfico que demuestra que la combinación de construcciones de anticuerpos monocatenarios y un anticuerpo anti-PD-1 da como resultado una supervivencia mejorada frente cualquier agente único.

Las figuras 33-41 muestran los resultados del ensayo TDCC descrito en el ejemplo 20. En resumen, se incubaron diferentes células diana que sobreexpresan PD-L1 y células T humanas (células efectoras) con una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífica anti-CD3 x anti-TAA (antígeno asociado a tumor) solo, o con la construcción de anticuerpo biespecífica en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 20C1.009. En todos los ensayos, las células pan T humanas se activaron 1:1 con perlas CD3/CD28 durante 48 horas, y el ensayo TDCC se llevó a cabo con una relación entre células efectoras y diana (E:T) de 1:1 y durante un período de 24 horas. Las figuras 33A-41A muestran los datos de un donante de células T representativo, mientras que las figuras 33B-41B muestran los datos de cuatro donantes de células T diferentes. En conjunto, los datos de las figuras 33-41 demuestran una destrucción mejorada de las células diana con las diversas construcciones biespecíficas de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 x anti-TAA cuando se combinan con el anticuerpo anti-PD1 20C1.009.

Figura 33: Células diana: KMS12BM_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 698; TAA: BCMA; análisis mediante FACS. Figura 34: Células diana: U266B1_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 698; TAA: BCMA; análisis mediante FACS. Figura 35: Células diana: U251_EGFRvIII_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 707; TAA: EGFRvIII; análisis mediante CellTiter Glo. Figura 36: Células diana: U87_EGFRvIII_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 707; TAA: EGFRvIII; análisis mediante CellTiter Glo. Figura 37: Células diana: MOLM13_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 704; TAA: FLT3; análisis mediante luciferasa. Figura 38: Células diana: MV411_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 715; TAA: CD33; análisis mediante luciferasa. Figura 39: Células diana: SHP77_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 701; TAA: DLL3; análisis mediante luciferasa. Figura 40: Células diana: C42b_luc_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 721; TAA: PSMA; análisis mediante Steady Glo. Figura 41: Células diana: NUGC4_PD-L1; construcción de anticuerpo biespecífica: SEQ ID NO: 724; TAA: Muc17; análisis mediante luciferasa.

Descripción detallada

Sigue existiendo la necesidad de nuevos enfoques de potenciación inmunitaria que puedan desplegar el sistema inmunitario contra las células cancerosas de una manera segura y eficaz, especialmente a la luz del hecho de que los enfoques de inmunoterapia actuales son eficaces solo en una minoría de pacientes y pueden tener toxicidades significativas y, a menudo, impredecibles. En un aspecto, la nueva clase de moléculas de fusión bifuncionales que comprenden un anticuerpo dirigido a PD-1 que puede bloquear la interacción PD-1/PD-L1, fusionado con una muteína de interleucina-21 de afinidad atenuada modificada por ingeniería genética divulgada en el presente documento aborda esta necesidad. Las fusiones de anticuerpos/citocinas descritas en el presente documento superan las barreras significativas asociadas con las terapias de citocinas, permitiendo, entre otras cosas, una dosificación similar a un anticuerpo y el suministro selectivo de la citocina IL-21 de una manera dirigida a PD-1. Cuando se fusionan con un anticuerpo anti-PD-1, las muteínas de IL-21 pueden activar y expandir selectivamente las células T que expresan PD-1 in vivo. Por consiguiente, las fusiones de anticuerpo/citocina descritas en el presente documento pueden mejorar y ampliar la utilidad de las terapias anti-PD-1 que se están probando actualmente en el escenario clínico.

La combinación de citocinas y agonistas o antagonistas de receptores co-inhibidores sigue siendo un desafío debido a los riesgos de toxicidad creciente y a la necesidad de un diseño de ensayo clínico complejo (véase, p. ej., Ott et al., J Immunother Cancer 5, 16 (2017); y Hermel et al., Cancer Metastasis Rev 36, 43-50 (2017)). Con respecto a las citocinas, también existe la posibilidad de la activación de vías de retroalimentación inhibidoras que pueden conducir a la supresión inmunológica (véase, p. ej., Portielje et al, Clin Cancer Res 9 , 76-83 (2003); Wan et al., Immunity 38, 514-527 (2013); y Mooradian et al., Oncoimmunology 7, e1423172 (2018)). La interleucina-21 (IL-21) es una citocina de tipo I y un miembro de la familia de citocinas de cadena gamma (cadena cg) del receptor común de citocinas que se ha convertido en una terapia inmunológica prometedora para el tratamiento del cáncer. La IL-21 se produce por células T CD4 activadas y células T citolíticas naturales (NKT) y emite señales a través de un complejo de receptor heterodimérico compuesto por una subunidad discreta del receptor de IL-21 (IL-21R) que se asocia con la cadena gamma común (véase, p. ej., Spolski et al., Nat Rev Drug Discov 13, 379-395 (2014)). La activación del complejo IL-21R conduce a la activación de la vía de señalización JAK/STAT. IL-21R se expresa ampliamente en células hematopoyéticas, incluidos los linfocitos T y B, células citolíticas naturales (NK) y células mieloides. Aunque no es un factor de crecimiento o diferenciación esencial, la IL-21 es un potente mitógeno y factor de supervivencia para las células NK y las células T activadas. La IL-21 puede ayudar a la diferenciación de células T CD4 (+) auxiliares 17 (Th17) así como de células T auxiliares foliculares (Tfh) y puede antagonizar la diferenciación de células T reguladoras (Treg). Además, la IL-21 puede aumentar la supervivencia de las células T CD8 y conserva un fenotipo de células T menos activado pero más persistente, lo que permite un mejor control de tumores y virus.

Un aspecto desafiante de la inmunoterapia con citocinas es que, además de activar las células inmunitarias para potenciar las respuestas inmunitarias, la misma citocina también puede activar vías contrarreguladoras. Por ejemplo, ^{IL-2 e}IFN^{y que pueden activar respuestas inmunitarias protectoras, así como respuestas de células T reguladoras y}vías inhibidoras (tales como PD-L1), respectivamente. En las células dendríticas (DC), la IL-21 puede inhibir tanto la maduración como la activación de DC, puede inducir la apoptosis de las CD convencionales, puede inhibir potentemente el cebado de las células T en cultivos mixtos y puede desempeñar un papel en la inducción de la tolerancia. En los seres humanos, la IL-21 se ha ensayado como una citocina libre no dirigida en varias indicaciones de cáncer, pero a pesar de los prometedores datos preclínicos y los primeros datos clínicos de fase I, el desarrollo de este enfoque no ha progresado más allá de los ensayos de fase II (véase, p. ej., Thompson et al., J Clin Oncol 26, 2034-2039 (2008); y Davis et al., Clin Cancer Res 15, 2123-2129 (2009)). En modelos preclínicos más recientes, la combinación de la citocina IL-21 recombinante con antagonistas de receptores co-inhibidores (p. ej., anti-CTLA-4 y anti-PD-1) ha demostrado que la IL-21 puede ampliar la eficacia de estos tratamientos. Tales combinaciones se están ensayando ahora en el escenario clínico, aunque aún no se ha demostrado la eficacia clínica (Lewis et al., Oncoimmunology 7, e1377873 (2017)).

Sin quedar ligado a teoría alguna, las fusiones de anticuerpo/citocina descritas en el presente documento están diseñadas para utilizar la actividad inmunopotenciadora de la IL-21 (que puede ser un requisito previo para abordar la toxicidad y la supresión inmunológica inespecífica), para maximizar la eficacia y mejorar la viabilidad de la dosificación en el escenario clínico.

IL-21 y muteínas de IL-21

La interleucina-21 (IL-21) es una citocina expresada por células T, células B, células NK y células mieloides, y regula la actividad de las células inmunitarias tanto innatas como adaptativas y mejora la supervivencia y la función efectora de las células T. En varios ensayos clínicos de Fase I y II se incluye la IL-21 como producto de investigación para el tratamiento de cánceres, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias, entre las que se incluyen, melanoma, carcinoma de células renales, leucemia mieloide aguda, linfoma no hodgkiniano, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide.

La IL-21 tiene una estructura de haz de cuatro hélices y existe como monómero. En los seres humanos, se conocen dos isoformas de IL-21, cada una de las cuales deriva de una molécula precursora. La primera isoforma de IL-21 comprende 162 aminoácidos (aa), de los que los primeros 29 forman el péptido señal; y la segunda isoforma de IL-21 comprende 153 aa, de los que los primeros 29 forman el péptido señal como en la primera isoforma. Las secuencias de aminoácidos de la primera y segunda isoformas de IL-21 (incluido el péptido señal) se proporcionan en el presente ^{documento como}S^eQ ^{ID NO: 258 y SEQ ID NO: 259, respectivamente.}

La IL-21 se une al receptor heterodimérico de IL-21 (IL-21R) expresado en la superficie de células T, B y NK. El IL-21R es similar en estructura al receptor de IL-2 y al receptor de IL-15, porque cada uno de estos receptores de citocinas ^{comprende una cadena gamma común}(^yc). ^{Además de yc}, ^{el IL-21R comprende una cadena alfa que es importante}para la unión a la IL-21. Hay dos isoformas de la cadena alfa del receptor de IL-21 humano: la isoforma 1 y la isoforma 2. Las secuencias de aminoácidos de la isoforma 1 y la isoforma 2 se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 256 y 261, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena gamma común humana se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 257.

Cuando la IL-21 se une a IL-21R, se activa la vía de señalización Jak/STAT para activar los genes diana. Si bien la señalización inducida por IL-21 puede ser terapéuticamente deseable, se necesita una cuidadosa consideración del tiempo y la ubicación de la señalización, dado el amplio perfil de expresión de la IL-21 y debido al hecho de que la IL-21 tiene la capacidad de potenciar las respuestas de las células T CD8, así como de suprimir la presentación de antígenos y el cebado de las células T. Los datos presentados en el presente documento por primera vez respaldan el uso de muteínas de IL-21 cuidadosamente diseñadas para lograr la señalización de IL-21 en el momento y lugar apropiados.

En el presente documento se describen muteínas de IL-21 que comprenden al menos una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, que se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la muteína de IL-21 comprende al menos una y no más de 34 sustituciones de aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender al menos una y no más de X sustituciones de aminoácidos, en donde X es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 10 aminoácidos, 15 aminoácidos, 20 aminoácidos o 25 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 7 aminoácidos o no más de 5 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (s Eq ID NO: 1) en 3, 4, 5 o 6 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 3 a 6 aminoácidos o en 1 a 5 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en uno o dos aminoácidos.

La muteína de IL-21 puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde la SEQ ID NO: 2 es QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), en donde X representa cualquier aminoácido y en donde la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

Por lo tanto, la muteína de IL-21 puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 2, en donde la SEQ ID NO: 2 difiere de la SEQ ID NO: 1 en al menos un aminoácido en una posición designada por X en la SEQ ID NO: 2. La muteína de IL-21 que comprende la SEQ ID NO: 2 puede tener al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la IL-21 de tipo silvestre, y la o las sustituciones de aminoácidos se producen dentro de la mitad N-terminal de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 5-25 u 8-23 (ambas inclusive), de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la IL-21 de tipo silvestre, y la o las sustituciones de aminoácidos se producen dentro de la mitad C-terminal de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 100-133 u 109-123 (ambas inclusive), de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la IL-21 de tipo silvestre, y la o las sustituciones de aminoácidos se producen en el tercio central de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 55-85 u 65-80 (ambas inclusive), de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

También se describen en el presente documento muteínas de IL-21 que comprenden solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, que se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácidos puede ubicarse en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71,72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 o 123, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácidos puede ubicarse en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 o 123, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-21 y 23-37.

También se describen en el presente documento muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 o 123, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73 y 76, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 9, 73 y 76, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Al menos una de las dos sustituciones de aminoácidos puede estar ubicada en la posición 76, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 199-208 y 210-212.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, y la o las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas). Como se utiliza en el presente documento, el término "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, p. ej., tamaño, carga, hidrofobia, hidrofilia y/o aromaticidad, e incluye intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

I. Restos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Restos polares, cargados negativamente y sus amidas y ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico y ácido homocisteico;

III. Restos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)

IV. Restos grandes, alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína

V. Restos grandes, aromáticos: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, y la o las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos no conservativas. Como se utiliza en el presente documento, el término "sustitución de aminoácidos no conservativa" se define en el presente documento como la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades diferentes, p. ej., tamaño, carga, hidrofobia, hidrofilia y/o aromaticidad, e incluye intercambios fuera de los cinco grupos anteriores.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, y el aminoácido de sustitución es un aminoácido natural. Por "aminoácido natural" o "aminoácido estándar" o "aminoácido canónico" se entiende uno de los 20 alfa aminoácidos que se encuentran en los eucariotas codificados directamente por los codones del código genético universal (Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Arg, His, Lys, Asp, Glu). La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo silvestre, y el aminoácido de sustitución es un aminoácido no estándar o un aminoácido que no se incorpora en las proteínas durante la traducción. Los aminoácidos no estándar incluyen, pero sin limitación: selenocisteina, pirrolisina, ornitina, norleucina, p-aminoácidos (p. ej., p-alanina, ácido p-aminoisobutírico, p-fenilalanina, p-homofenilalanina, ácido p-glutámico, p-glutamina, phomotriptófano, p-leucina, p-lisina), homo-aminoácidos (p. ej., homofenilalanina, homoserina, homoarginina, monocisteína, homocistina), W-metil aminoácidos (p. ej., L-abrina, W-metil-alanina, W-metil-isoleucina, W-metil-leucina), ácido 2-aminocaprílico, ácido 7-aminocefalosporánico, ácido 4-aminocinámico, ácido alfaaminociclohexanopropiónico, ácido amino-(4-hidroxifenil)acético, ácido 4-amino-nicotínico, ácido 3-aminofenilacético y similares.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116 y 119 de la SEQ ID NO: 1, y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos alifáticos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución un aminoácido alifático.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos está en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120 o 123 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos ácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120 o 123 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución un aminoácido ácido.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 9, 73, 76, 109, 113 o 116 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos básicos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1 y el aminoácido en la posición 5, 9, 73, 76, 109, 113 o 116 de la SEQ ID NO: 1 es un aminoácido básico.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 70 o 76 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos aromáticos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 8, 9, 70 o 76 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución un aminoácido aromático.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos que comprenden una amida de cadena lateral. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución es un aminoácido que comprende una amida de cadena lateral.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos que comprenden un hidroxilo de cadena lateral. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución es un aminoácido que comprende un hidroxilo de cadena lateral.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77 u 80 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución iminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77 u 80 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido de sustitución un aminoácido que comprende un iminoácido.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), estando la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 5, 9, 15, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el o los aminoácidos de sustitución aminoácidos que comprenden una cadena lateral que contiene azufre. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, estando la sustitución de aminoácidos en la posición 5, 9, 15, 76, 116 o 119 de la SEQ ID NO: 1 y siendo el aminoácido sustituto un aminoácido que comprende un aminoácido que comprende una cadena lateral que contiene azufre.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), en donde la al menos una sustitución de aminoácidos se muestra en la Tabla A.

TABLA A

continuación

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1 y la sustitución de aminoácidos es una que se muestra en la Tabla A. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1 y las sustituciones de aminoácidos son dos de las que se muestran en la Tabla A.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que se muestra en la Tabla B.

TABLAB

(continuación)

(continuación)

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 47, 48, 51, 61, 62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254 o 283. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 47, 48, 51,61, 62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254 o 283.

Además se describen en el presente documento muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones de aminoácidos se producen en dos de las posiciones 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73 y 76 de la SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones se producen en un par de posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5 y 76; 9 y 76; 15 y 70; 15 y 71; 15 y 72; 15 y 73; 70 y 73; 70 y 76; 71 y 73; 71 y 76; 72 y 73; 72 y 76; y 73 y 76. La IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 199-208 y 210-212. Además se describen en el presente documento muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones de aminoácidos se producen en dos de las posiciones 5, 9, 73 y 76 de la SEQ ID NO: 1. Una de las sustituciones puede producirse en la posición 76 de la SEQ ID NO: 1. El aminoácido de sustitución en la posición 76 de la SEQ ID NO: 1 puede ser un aminoácido alifático o un aminoácido ácido. El aminoácido alifático puede ser alanina. El aminoácido ácido puede ser ácido aspártico o ácido glutámico. El aminoácido ácido puede ser ácido glutámico. La muteína de IL-21 puede comprender un aminoácido de sustitución en la posición 76 y un aminoácido alifático o un aminoácido ácido en la posición 5, 9 o 73 de la SEQ ID NO: 1. El aminoácido de sustitución en la posición 5, 9 o 73 puede ser un aminoácido alifático, un aminoácido ácido o un aminoácido con una amida de cadena lateral. El aminoácido alifático puede ser alanina, el aminoácido ácido es ácido glutámico y el aminoácido con una amida de cadena lateral es glutamina. La muteína de IL-21 puede comprender un aminoácido de sustitución en la posición 76 de la SEQ ID NO: 1 (opcionalmente, un aminoácido alifático o un aminoácido ácido) y un aminoácido de sustitución en la posición 5 o 9 (de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1).

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: mostradas en la Tabla C.

TABLA C

continuación

La muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 213-219 y 227-248. La IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 213-219 y 227-248.

Longitud del péptido

Las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento pueden comprender una cadena principal peptídica de cualquier número de aminoácidos, es decir, puede ser de cualquier longitud peptídica. En algunas realizaciones, los péptidos descritos en el presente documento tienen aproximadamente la misma longitud que la SEQ ID NO: 1, es decir, son de 133 (de ± aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de ± aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de ± aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o de ± aproximadamente 1 a aproximadamente 5) aminoácidos de longitud. El péptido puede tener más de 133 aminoácidos de longitud al estar fusionado con otra cadena polipeptídica, p. ej., una cadena pesada de anticuerpo que comprende de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 aminoácidos, una cadena ligera de anticuerpo que comprende de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 aminoácidos, como se describe adicionalmente en el presente documento.

Modificaciones adicionales del péptido

Como alternativa o adicionalmente, la muteína de IL-21 puede lipidarse (p. ej., miritoilarse, palmitoilarse), glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, acilarse, acetilarse, ciclarse o convertirse en una sal de adición de ácido, y/o puede dimerizarse o polimerizarse opcionalmente, o conjugarse, como se describe adicionalmente en el presente documento.

Sales farmacéuticamente aceptables

La muteína de IL-21 puede estar en forma de una sal, p. ej., una sal farmacéuticamente aceptable. Dichas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación de la muteína de IL-21 o se pueden preparar por separado haciendo reaccionar una función de base libre con un ácido adecuado. Los ejemplos de ácidos que se pueden emplear para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, un ácido inorgánico, p. ej., ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y un ácido orgánico, p. ej., ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico.

Las sales de adición de ácido representativas incluyen, pero sin limitación, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, alcanforato, alcanfor sulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato (isetionato), lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftaleno sulfonato, oxalato, palmitoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenosulfonato y undecanoato.

Las sales de adición de bases pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y la purificación de la muteína de IL-21 o haciendo reaccionar una fracción que contiene ácido carboxílico con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o con amonio o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, sales de cationes basados en metales alcalinos o metales alcalinotérreos tales como litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, y similares, y amoníaco cuaternario no tóxico y cationes de amina, incluido el amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, trietilamonio, dietilamonio y etilamonio, entre otros. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina y similares.

Además, los grupos básicos que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes activos tales como haluros de alquilo inferior tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; haluros de arilalquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De este modo se obtienen productos solubles o dispersables en agua o aceite.

Purificación

Las muteínas de IL-21 se pueden purificar. El término "purificado", tal como se usa en el presente documento, significa que ha aumentado la pureza, en donde "pureza" es un término relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. La pureza del compuesto (p. ej., en la composición) puede ser de al menos o de aproximadamente un 50 %, al menos o aproximadamente un 60 %, al menos o aproximadamente un 70 %, al menos o aproximadamente un 80 %, al menos o aproximadamente un 90 %, al menos o aproximadamente un 95 %, o al menos o aproximadamente un 98 % o es de aproximadamente un 100 %.

Peptidomiméticos

La muteína de IL-21 puede ser un peptidomimético, o al menos una porción de la muteína puede ser un peptidomimético. En la técnica se conocen los peptidomiméticos así como los métodos para prepararlos. Véase, por ejemplo, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, Volúmenes 1 y 2, ed., Abell, A., JAI Press Inc., Greenwich, CT, 2006. El peptidomimético puede ser un peptidomimético de péptido D que comprende aminoácidos de isómero D. El peptidomimético puede ser un peptoide en el que la cadena lateral de un aminoácido está conectada al átomo de nitrógeno alfa de la cadena principal del péptido. Se conocen en la técnica métodos para preparar peptoides. Véase, p. ej., Zuckermann et al., JACS 114(26): 10646-10647 (1992) y Design, Synthesis, and Evaluation of Novel Peptoids, Fowler, Sarah, Universidad de Wisconsin-Madison, 2008. El peptidomimético puede ser un péptido p que comprende aminoácidos p que tienen su grupo amino unido al carbono p en lugar de al carbono alfa. Se conocen en la técnica métodos para preparar péptidos p. Véase, por ejemplo, Seebach et al., Helvetica Chimica Acta 79(4): 913-941 (1996).

Características de unión

Las muteínas de IL-21 pueden unirse al receptor de IL-21 (IL-21R) con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de tipo silvestre por el IL-21R. Las muteínas de IL-21 pueden unirse al IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por el IL-21R humano. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena alfa del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena alfa del IL-21R humano. Las muteínas de IL-21 que se unen a la cadena alfa del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena alfa del IL-21R humano pueden contener una, dos o más sustituciones ubicadas en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79 y 80, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos específicas que se pueden realizar en tales posiciones se analizan en el presente documento (véanse, p. ej., las Tablas A, B y C).

Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena gamma del IL-21R humano. Las muteínas de IL-21 que se unen a la cadena gamma del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena gamma del IL-21R humano pueden contener una, dos o más sustituciones ubicadas en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 y 123, de acuerdo con la numeración de posición de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos específicas que se pueden realizar en tales posiciones se analizan en el presente documento (véanse, p. ej., las Tablas A, B y C).

Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena alfa del IL-21 R humano. Las muteínas de IL-21 pueden unirse al IL-21R de mono cynomolgus con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de mono cynomolgus de tipo silvestre por el IL-21R de mono cynomolgus. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena alfa del IL-21R de mono cynomolgus con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de mono cynomolgus de tipo silvestre por la cadena alfa del IL-21 R de mono cynomolgus. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma del IL-21R de mono cynomolgus con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de mono cynomolgus de tipo silvestre por la cadena gamma del IL-21R de mono cynomolgus. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma del IL-21R de mono cynomolgus con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de mono cynomolgus de tipo silvestre por la cadena alfa del IL-21 R de mono cynomolgus.

Las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento se unen a IL-21R de manera no covalente y reversible. La fuerza de unión de las muteínas a IL-21 R puede describirse en términos de su afinidad, una medida de la fuerza de interacción entre el sitio de unión de la muteína y el IL-21R. Las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento pueden tener una alta afinidad por IL-21R y, por lo tanto, se unirán a una mayor cantidad de IL-21 R en un período de tiempo más corto que las muteínas de IL-21 de baja afinidad. Las muteínas de IL-21 pueden tener baja afinidad por IL-21R y, por lo tanto, se unirán a una cantidad menor de IL-21 R en un período de tiempo más largo que las muteínas de IL-21 de alta afinidad. La muteína de IL-21 puede tener una constante de asociación de equilibrio, KA, que es de al menos 10⁵M^-1, al menos 10⁶M^-1, al menos 10⁷M^-1, al menos 10⁸M^-1, al menos 10⁹M^{' 1}o al menos 10¹⁰M^-1. Como entiende el experto en la materia, la KA puede verse influenciada por factores entre los que se incluyen el pH, la temperatura y la composición del tampón.

La fuerza de unión de la muteína de IL-21 a IL-21R puede describirse en términos de su sensibilidad. La K^des la constante de disociación de equilibrio, una relación de koff/kon, entre la muteína de IL-21 e IL-21R. La K^dy la KA están inversamente relacionadas. El valor de K^destá relacionado con la concentración de la muteína (la cantidad de muteína necesaria para un experimento particular) y, por lo tanto, cuanto menor sea el valor de K^d(menos concentración se necesita) mayor será la afinidad de la muteína. La fuerza de unión de la muteína de IL-21 a IL-21 R se puede describir en términos de la K^d. La K^dde las muteínas de IL-21 puede ser de aproximadamente 10^_1M, aproximadamente 10^{‘ 2}M, aproximadamente 10^-3M, aproximadamente 10^{‘ 4}M, aproximadamente 10^{‘ 5}M, aproximadamente 10^{‘ 6}M, o menos. La K^dde las muteínas de IL-21 puede ser micromolar, nanomolar, picomolar o femtomolar. La K^dde las muteínas de IL-21 puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente 10^{‘ 4}a 10^{‘ 6}M, o 10^{‘ 7}a 10^{‘ 9}M, o 10^{‘ 10}a 10^{‘ 12}M, o 10^{‘ 13}a 10^{‘ 15}M. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21R humano con una K^dque es mayor que o es de aproximadamente 0,04 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21R humano con una K^dde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 20 nM, de 0,02 nM a 20 nM, de 0,05 nM a 20 nM, de 0,05 nM a 15 nM, de 0,1 nM a 15 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 1 nM a 10 nM o de 5 nM a 10 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21R de mono cynomolgus con una K^dque es mayor que o es de aproximadamente 0,055 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21R de mono cynomolgus con una K^dde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 20 nM, de 0,02 nM a 20 nM, de 0,05 nM a 20 nM, de 0,05 nM a 15 nM, de 0,1 nM a 15 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 1 nM a 10 nM o de 5 nM a 10 nM.

La muteína de IL-21 puede presentar una reducción en la afinidad de unión por la cadena a del IL-21R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína (por ejemplo, sencilla o doble) que presenta una reducción de aproximadamente 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000 veces o más en la afinidad de unión por la cadena a de IL-21R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que presenta una reducción en la afinidad de unión por la cadena a de IL-21R.

La reducción anterior en la afinidad de unión de la muteína de IL-21 (p. ej., muteína sencilla o doble) puede dar como resultado una afinidad reducida por la cadena a de IL-21R en comparación con la afinidad de aproximadamente 0,025 nM de IL-21 humana de tipo silvestre por la cadena a de IL-21R. Por consiguiente, una reducción de 2 veces en la afinidad como se ha analizado anteriormente daría como resultado una muteína de IL-21 con una afinidad de aproximadamente 0,05 nM por la cadena a de IL-21 R. Por lo tanto, la muteína de IL-21 (por ejemplo, sencilla o doble) puede tener una afinidad de aproximadamente 0,05, 0,125, 0,25, 0,375, 0,5, 0,625, 0,75, 0,875, 1,0, 1,125, 1,25, 1,375, 1,5, 1,625, 1,75, 1,875, 2,0, 2,125, 2,25, 2,375, 2,5, 2,625, 2,75, 2,875, 3,0, 3,125, 3,25, 3,375, 3,5, 3,625, 3,75, 4,375, 5, 5,625, 6,25, 6,875, 7,5, 8,125, 8,75, 9,375, 10,0, 10,625, 11,25, 11,875, 12,5, 13,125, 13,75, 14,375, 15,0, 15,625, 16,25, 16,875, 17,5, 18,125, 18,75, 19,375, 20,0, 20,625, 21,25, 21,875, 22,5, 23,125, 23,75, 24,375, 25 nM o mayor por la cadena a de IL-21R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que presenta una afinidad de unión reducida por la cadena a de IL-21R.

La muteína de IL-21 puede presentar una reducción en la actividad medida por un ensayo de fosforilación de STAT3 in vitro. La muteína de IL-21 puede ser una muteína (por ejemplo, sencilla o doble) que presenta una reducción de aproximadamente 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000 veces o más en la actividad medida por un ensayo de fosforilación de STAT3. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que presenta la reducción de la actividad medida mediante un ensayo de fosforilación de STAT3.

Conjugados de muteína de IL-21

También se describen en el presente documento conjugados que comprenden una o más de las muteínas de IL-21 unidas a una fracción heteróloga. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fracción heteróloga" es sinónimo de la expresión "fracción conjugada" y se refiere a cualquier molécula (química o bioquímica, natural o no codificada) que sea diferente de las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento. Las fracciones conjugadas ilustrativas que se pueden unir a cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas en el presente incluyen, pero sin limitación, un péptido o polipéptido heterólogo (que incluye, por ejemplo, una inmunoglobulina o una porción de la misma (p. ej., región variable, CDR o región Fc)), un agente de direccionamiento, un marcador de diagnóstico tal como un radioisótopo, fluoróforo o marcador enzimático, un polímero que incluye polímeros solubles en agua u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Se describe un conjugado que comprende una muteína de IL-21 de la presente divulgación y una inmunoglobulina. El conjugado puede comprender una o más de las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento y uno o más de: un péptido (que es distinto de las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento), un polipéptido, una molécula de ácido nucleico, un anticuerpo o fragmento del mismo, un polímero, un punto cuántico, una molécula pequeña, una toxina, un agente de diagnóstico, un hidrato de carbono, un aminoácido.

El conjugado puede comprender una muteína de IL-21 como se describe en el presente documento y una fracción heteróloga que es un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido distinto de cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento), y el conjugado es un polipéptido de fusión o proteína de fusión o un proteína quimérica o polipéptido quimérico. En el presente documento se proporcionan descripciones adicionales de tales conjugados bajo el título "Proteínas de fusión".

La fracción heteróloga se puede unir a través de un enlace no covalente o covalente a la muteína de IL-21 de la presente divulgación. El enlace entre la muteína de IL-21 y la fracción heteróloga puede lograrse a través de enlaces químicos covalentes, p. ej., enlaces peptídicos, enlaces disulfuro, y similares, o a través de fuerzas físicas, tales como interacciones electrostáticas, de hidrógeno, iónicas, de van der Waals o hidrófobas o hidrófilas. Se puede usar una diversidad de sistemas de acoplamiento no covalentes, entre los que se incluyen, p. ej., biotina-avidina, ligando/receptor, enzima/sustrato, ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico, lípido/proteína de unión a lípido, compañeros de moléculas de adhesión celular; o cualquiera de los compañeros de unión o fragmentos de los mismos que tienen afinidad entre sí.

La muteína de IL-21 se puede unir a una fracción conjugada a través de un enlace covalente directo al hacer reaccionar restos de aminoácidos específicos de la muteína de IL-21 con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los restos N- o C-terminales de estos aminoácidos específicos. Los grupos reactivos en la muteína de IL-21 o la fracción conjugada incluyen, p. ej., un grupo aldehído, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino. Los agentes de derivatización incluyen, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica. Como alternativa, las fracciones conjugadas se pueden unir a la muteína de IL-21 indirectamente a través de portadores intermedios, tales como portadores de polisacáridos o polipéptidos. Los ejemplos de portadores de polisacáridos incluyen aminodextrano. Los ejemplos de portadores polipeptídicos adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, copolímeros de los mismos, y polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, p. ej., serinas, que confieren propiedades de solubilidad deseables al portador cargado resultante.

Los restos de cisteinilo la mayoría de las veces reaccionan con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético, cloroacetamida para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos de histidilo se derivatizan por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de parabromofenacilo; la reacción se lleva a cabo preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los restos lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobenceno sulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y una reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los restos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de los restos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

Se puede realizar la modificación específica de restos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en restos de tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más habitualmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en restos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones de amonio.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), desamidación de asparagina o glutamina, acetilación de la amina N-terminal y/o amidación o esterificación del grupo ácido carboxílico C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar química o enzimáticamente glucósidos a la muteína de IL-21. El o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).

La fracción heteróloga se puede unir a la muteína de IL-21 a través de un enlazador. El enlazador puede comprender una cadena de átomos de 1 a aproximadamente 60, o de 1 a 30 átomos o más, de 2 a 5 átomos, de 2 a 10 átomos, de 5 a 10 átomos o de 10 a 20 átomos de longitud. Los átomos de la cadena pueden ser todos átomos de carbono. Los átomos de la cadena en la cadena principal del enlazador se pueden seleccionar del grupo que consiste en C, O, N y S. Los átomos de la cadena y los enlazadores se pueden seleccionar de acuerdo con su solubilidad esperada (hidrofilia) para proporcionar un conjugado más soluble. El enlazador puede proporcionar un grupo funcional que está sujeto a escisión por una enzima u otro catalizador o condiciones hidrolíticas que se encuentran en el tejido u órgano o célula diana. La longitud del enlazador puede ser lo suficientemente larga para reducir el potencial de impedimento estérico. Si el enlazador es un enlace covalente o un enlace de peptidilo y el conjugado es un polipéptido, el conjugado completo puede ser una proteína de fusión. Dichos enlazadores de peptidilo pueden tener cualquier longitud. Los enlazadores de peptidilo ilustrativos tienen de aproximadamente 1 a 50 aminoácidos de longitud, de 5 a 50, de 3 a 5, de 5 a 10, de 5 a 15 o de 10 a 30 aminoácidos de longitud, y son flexibles o rígidos. El enlazador puede ser un péptido que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 aminoácidos. El enlazador puede ser un péptido que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 aminoácidos, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 aminoácidos. Se conocen enlazadores peptídicos adecuados en la técnica. Véase, p. ej., Chen et al., Adv Drug Delivery Reviews 65(10): 1357-1369 (2013); Arai et al., Protein Eng Des Sel 14(8): 529-532 (2001); y Wriggers et al., Curr Trends in Peptide Science 80(6): 736-746 (2005). El enlazador puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 262).

Proteínas de fusión

La muteína de IL-21 se puede unir a un polipéptido que es distinto de cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento, y el conjugado puede ser un polipéptido de fusión o proteína de fusión o una proteína quimérica o polipéptido quimérico. Por consiguiente, en el presente documento se describen polipéptidos de fusión o proteínas de fusión que comprenden una muteína de IL-21 y un polipéptido o péptido heterólogo. La proteína de fusión puede comprender una muteína de IL-21 unida a una proteína de unión a antígeno. La proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o inmunoglobulina, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un producto de proteína de anticuerpo.

En conjunto, los anticuerpos forman una familia de proteínas plasmáticas conocidas como inmunoglobulinas y comprenden dominios de inmunoglobulina. (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999. Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que tiene un formato de inmunoglobulina convencional, que comprende cadenas pesadas y ligeras, y que comprende regiones variables y constantes. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser una IgG que es una estructura en "forma de Y" de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (típicamente con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (típicamente con un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Un anticuerpo tiene una región variable y una región constante. En formatos de IgG, la región variable es generalmente de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos, comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), es el principal responsable del reconocimiento de antígenos y varía sustancialmente entre otros anticuerpos que se unen a antígenos diferentes. La región constante permite que el anticuerpo reclute células y moléculas del sistema inmunitario. La región variable está formada por las regiones N-terminales de cada cadena ligera y cadena pesada, mientras que la región constante está formada por las porciones C-terminales de cada una de las cadenas pesada y ligera. (Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).

La estructura general y las propiedades de las CDR de anticuerpos se han descrito en la técnica. En resumen, en un armazón de anticuerpo, las CDR están incrustadas dentro de un marco en la región variable de cadena pesada y ligera donde constituyen las regiones principalmente responsables de la unión y el reconocimiento del antígeno. Una región variable normalmente comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de un marco (que recibe el nombre de regiones marco 1-4, FR1, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al., 1991; véase también Chothia y Lesk, 1987, supra).

Los anticuerpos pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, entre las que se incluyen, pero sin limitación IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las IgM tiene subclases, entre las que se incluyen, pero sin limitación, IgM1 e IgM2. Las realizaciones de la presente divulgación incluyen todas esas clases o isotipos de anticuerpos. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda, p. ej., una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, p. ej., una región constante de cadena pesada humana de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu. Por consiguiente, en realizaciones ilustrativas, el anticuerpo es un anticuerpo de isotipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, incluyendo cualquiera de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede comprender una secuencia que es sustancialmente similar a la de un anticuerpo natural producido por un mamífero, p. ej., ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano y similares. En este sentido, el anticuerpo puede considerarse un anticuerpo de mamífero, p. ej., un anticuerpo de ratón, anticuerpo de conejo, anticuerpo de cabra, anticuerpo de caballo, anticuerpo de pollo, anticuerpo de hámster, anticuerpo humano, y similares. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene dominios de dos o más anticuerpos diferentes. Un anticuerpo quimérico puede, por ejemplo, contener los dominios constantes de una especie y los dominios variables de una segunda, o más generalmente, puede contener tramos de secuencia de aminoácidos de al menos dos especies. Un anticuerpo quimérico también puede contener dominios de dos o más anticuerpos diferentes dentro de la misma especie. El término "humanizado", cuando se usa en relación con anticuerpos, se refiere a anticuerpos que tienen al menos regiones CDR de una fuente no humana que se modifican por ingeniería genética para tener una estructura y una función inmunológica más similares a las de los anticuerpos humanos verdaderos que los anticuerpos de la fuente original. Por ejemplo, la humanización puede implicar el injerto de una CDR de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en un anticuerpo humano. La humanización también puede implicar sustituciones de aminoácidos seleccionados para hacer que una secuencia no humana sea más similar a una secuencia humana.

Un anticuerpo puede dividirse en fragmentos mediante enzimas, tales como, p. ej., papaína y pepsina. La papaína escinde un anticuerpo para producir dos fragmentos Fab y un solo fragmento Fc. La pepsina escinde un anticuerpo para producir un fragmento F(ab')²y un fragmento pFc'. La proteína de fusión puede comprender un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" se refiere a una porción de una molécula de anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno del anticuerpo y también se conoce como "fragmento de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno". El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno puede ser un fragmento Fab o un fragmento F(ab')².

La arquitectura de los anticuerpos se ha explotado para crear una gama cada vez mayor de formatos alternativos que abarcan un intervalo de pesos moleculares de al menos aproximadamente 12-150 kDa y tiene un intervalo de valencias (n) desde monoméricos (n = 1) hasta diméricos (n = 2), triméricos (n = 3), tetraméricos (n = 4) y potencialmente superiores; dichos formatos alternativos se denominan en el presente documento "productos de proteína de anticuerpo". Los productos de proteína de anticuerpo incluyen aquellos basados en la estructura completa del anticuerpo y aquellos que imitan fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad total de unión al antígeno, p. ej., scFv, Fab y VHH/VH (analizados más adelante). El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno más pequeño que conserva su sitio de unión al antígeno completo es el fragmento Fv, que consiste íntegramente en regiones variables (V). Se utiliza un enlazador peptídico de aminoácidos flexible y soluble para conectar las regiones V a un fragmento scFv (fragmento monocatenario variable) para la estabilización de la molécula, o se añaden los dominios constantes (C) a las regiones V para generar un fragmento Fab [del inglés, fragment, antigen-binding]. Tanto los fragmentos scFv como los Fab se pueden producir fácilmente en células hospedadoras, p. ej., células hospedadoras procariotas. Otros productos de proteínas de anticuerpo incluyen scFv estabilizado con enlaces disulfuro (ds-scFv), Fab monocatenario (scFab), así como formatos de anticuerpos di- y multiméricos tales como dia-, tria- y tetracuerpos, o minicuerpos (miniAb) que comprenden diferentes formatos que consisten en scFv unidos a dominios de oligomerización. Los fragmentos más pequeños son VHH/VH de Ab de cadena pesada de camélidos, así como Ab de dominio único (sdAb). El bloque de construcción que se usa con más frecuencia para crear nuevos formatos de anticuerpos es el fragmento de anticuerpo de dominio variable (V) monocatenario (scFv), que comprende dominios V de la cadena pesada y ligera (dominio VH y VL) unidos por un enlazador peptídico de ~15 restos de aminoácidos. Otro producto de proteína de anticuerpo es una fusión de pepticuerpo o péptido-Fc. La estructura de un pepticuerpo consiste en un péptido biológicamente activo injertado en un dominio Fc. Los pepticuerpos están bien descritos en la técnica. Véase, p. ej., Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).

Otros productos de proteínas de anticuerpo incluyen un anticuerpo monocatenario (SCA); un diacuerpo; un tricuerpo; un tetracuerpo; anticuerpos biespecíficos o triespecíficos, y similares. Los anticuerpos biespecíficos se pueden dividir en cinco clases principales: BsIgG, IgG con anexiones (appended IgG), fragmentos de BsAb, proteínas de fusión biespecíficas y conjugados de BsAb. Véase, p. ej., Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015).

La proteína de fusión puede comprender uno cualquiera de estos productos de proteína de anticuerpo. La proteína de fusión puede comprender uno cualquiera de un scFv, Fab VHH/VH, fragmento Fv, ds-scFv, scFab, anticuerpo dimérico, anticuerpo multimérico (p. ej., un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo), miniAb, pepticuerpo VHH/VH de anticuerpo de cadena pesada de camélido, sdAb, diacuerpo; un tricuerpo; un tetracuerpo; un anticuerpo biespecífico o triespecífico, BsIgG, IgG con anexiones (appended IgG), fragmento de BsAb, proteína de fusión biespecífica y conjugado de BsAb.

La proteína de fusión puede comprender un producto de proteína de anticuerpo en forma monomérica o en forma polimérica, oligomérica o multimérica. Cuando el anticuerpo comprende dos o más fragmentos distintos de regiones de unión a antígeno, el anticuerpo puede considerarse biespecífico, triespecífico, multiespecífico o bivalente, trivalente o multivalente, dependiendo del número de epítopos distintos que son reconocidos y unidos por el anticuerpo.

El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o producto de proteína de anticuerpo puede unirse a un antígeno tumoral. El antígeno tumoral puede ser un antígeno derivado de una proteína vírica, un antígeno derivado de mutaciones puntuales o un antígeno codificado por un gen de la línea germinal del cáncer. El antígeno tumoral puede ser p53, KRAS, NRAS, MAGEA, MAGEB, MAGEC, BAGE, GAGE, LAGE/NY-ESO1, SSX, tirosinasa, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, TRP2, CEA, RAGE-1, HER2/NEU, WT1. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o producto de proteína de anticuerpo de la proteína de fusión puede unirse a un agente de inmunoterapia o es un agente de inmunoterapia, como se describe en el presente documento. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o producto de proteína de anticuerpo de la proteína de fusión puede unirse a una citocina, linfocina, factor de crecimiento o factor hematopoyético, como se describe en el presente documento.

La proteína de fusión puede comprender una citocina (por ejemplo, una muteína de IL-21 descrita en el presente documento) y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo, que se une a una proteína de la vía de puntos de control inmunitarios, un antígeno tumoral, una citocina, linfocina, factor de crecimiento u otro factor hematopoyético, incluyendo pero sin limitación cualquiera de los descritos en el presente documento. La proteína de fusión puede comprender una citocina (por ejemplo, una muteína de IL-21 descrita en el presente documento) y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo, que se une a una proteína de la vía de puntos de control inmunitarios seleccionada del grupo que consiste en: CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CEACAM-1, TIGIT, LAG3, CD112, CD112R, CD96, TIM3, BTLA, o receptor coestimulador: ICOS, OX40, 41BB, CD27, GITR.

La proteína de fusión puede comprender una citocina y un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que se une a una proteína de la vía de puntos de control inmunitarios. Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, citocinas que potencian las respuestas de tipo TH-1; y citocinas que activan STAT 1, 3, 4 o 5. La citocina puede ser una interleucina. La citocina puede ser una interleucina que potencia la actividad de las células T, tal como, por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 o IL-21. Tales citocinas pueden modificarse (p. ej., mediante mutaciones) para atenuar su afinidad por su receptor respectivo. Tales muteínas pueden presentar perfiles de seguridad mejorados al reducir las interacciones no deseadas e inespecíficas. Por lo tanto, las citocinas se pueden modificar para generar muteínas de IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 o IL-21. La citocina puede ser una muteína de IL-21 descrita en el presente documento. Los anticuerpos adecuados (o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos) que se unen a una proteína de la vía de puntos de control inmunitarios incluyen, por ejemplo, los que se unen a CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, TIGIT, LAG3, CD112, TIM3, BTLA, o receptor coestimulador: ICOS, OX40, 41BB o GITR. El anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede unirse a PD-1 (p. ej., PD-1 humano).

La proteína de fusión puede ser una proteína de fusión multiespecífica que comprende una citocina, un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) y al menos una fracción de direccionamiento adicional. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión triespecífica que comprende una citocina, un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) y una fracción de direccionamiento adicional.

La proteína de fusión puede comprender una muteína de IL-21 descrita en el presente documento y un antagonista de unión a PD-1. La expresión "antagonista de unión a PD-1" se refiere a una molécula que reduce, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. El antagonista de unión a PD-1 puede ser una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. El antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. Un antagonista de unión a PD-1 puede reducir la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de la señalización mediada por proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T a través de PD-1 para hacer que una célula T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). El antagonista de unión a PD-1 puede ser un anticuerpo anti-PD-1. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 incluyen nivolumab (BMS-936558), pembrolizumab (MK-3475), BMS 936558, BMS-936559, TSR-042 (Tesaro), ePDR001 (Novartis) y pidilizumab (C^t-011). Se proporcionan ejemplos específicos adicionales de antagonistas de unión a PD-1 infra.

El antagonista de unión a PD-1 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de unión a antígeno que se une a PD-1. La proteína de unión al antígeno puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un producto de proteína de anticuerpo, que se une a PD-1.

La proteína de fusión puede comprender una muteína de IL-21, como se describe en el presente documento, y un anticuerpo anti-PD-1 (como se describe en el presente documento), un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser una IgG monoclonal. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede ser monovalente o bivalente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede unirse a PD-1 humano, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 263. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede unirse a PD-1 de mono cynomolgus, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 264. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede unirse tanto a PD-1 humano como a PD-1 de mono cynomolgus. La proteína de fusión puede comprender una muteína de IL-21 (como se describe en el presente documento) y un anticuerpo anti-PD-1 (como se describe en el presente documento).

La fuerza de unión del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 a PD-1 puede describirse en términos de la K^d. La K^ddel anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento puede ser de aproximadamente 10'1 M, aproximadamente 10'2 M, aproximadamente 10'3 M, aproximadamente 10'4 M, aproximadamente 10'5 M, aproximadamente 10'6 M, aproximadamente 10'7 M, aproximadamente 10'8 M, aproximadamente 10'9 M, o menos. La K^ddel anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser micromolar, nanomolar, picomolar o femtomolar. La K^ddel anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente 10'4 a 10'6 M, o de 10'7 a 10'9 M, o de 10'10 a 10'12 M, o de 10'13 a 10'15 M. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener alta afinidad por PD-1 humano, PD-1 de mono cynomolgus o ambos. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una K^dpara PD-1 humano de menos de 100 pM, opcionalmente, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una K^dpara PD-1 humano dentro de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 20 pM o menor de aproximadamente 10 pM. El anticuerpo anti-PD-1, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una K^dpara PD-1 de mono cynomolgus de menos de 100 pM, opcionalmente, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 75 pM. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una K^dpara PD-1 de mono cynomolgus dentro de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 20 pM o menor de 10 pM.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede ser un antagonista de unión a PD-1 que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede bloquear la unión de PD-1 a su ligando PD-L1 o PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede inhibir al menos el 50 % de las interacciones de unión entre PD-1 y PD-L1 o PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede presentar al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 % o al menos aproximadamente un 70 % de inhibición de la interacción de unión entre PD-1 y PD-L1 o PD-L2.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede inhibir la producción de IL-2 mediada por PD-1 por células T en una reacción linfocitaria mixta (MLR). La CI⁵⁰del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede estar dentro de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 5 nM. La CI⁵⁰del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede ser menor de 2 nM o menor de 1 nM. La CI⁵⁰del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede ser de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 2 nM.

La proteína de unión al antígeno PD-1 comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ID NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID NO: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, (véase la Tabla ^d) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, (véase la Tabla D) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374 y 384, (véase la Tabla D) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 y 385, (véase la Tabla D) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 y 386, (véase la Tabla D) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 y 387, (véase la Tabla D) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos, tres, cuatro, cinco o seis cualesquiera de (a)-(f). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas CDR.

TABLA D

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuestas en la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC expuestas en la Tabla D. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas CDR.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende 3, 4, 5 o las 6 secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NO: en una sola columna de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por las SEQ ID NO: de una sola columna de la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de las CDR de HC designadas por las SEQ ID NO: en la misma columna única o en otra columna única de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender cada una de las secuencias de aminoácidos de las CDR de HC designadas por las SEQ ID NO: de una sola columna de la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de las CDR de LC designadas por las SEQ ID NO: en la misma columna única o en otra columna única de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 312-317; (b) las SEQ ID NO: 322-327; (c) las SEQ ID NO: 332-337; (d) las SEQ ID NO: 342-347; (e) las SEQ ID NO: 352-357; (f) las SEQ ID NO: 362-367; (g) las SEQ ID NO: 372-377; y (h) las SEQ ID NO: 382-387. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender las 6 secuencias de aminoácidos de CDR de la Tabla D para uno cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006 o 22D4.017. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas CDR.

Las secuencias de aminoácidos de la Tabla D pueden estar separadas por al menos uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) aminoácidos intermedios. Puede haber de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de CDR1 de LC y CDR2 de LC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de CDR2 de LC y CDR3 de LC. Puede haber de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de CDR1 de LC y CDR2 de LC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de CDR2 de LC y CDR3 de LC. Puede haber de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de CDR1 de HC y CDR2 de HC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de CDR2 de HC y CDR3 de HC. Puede haber de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de CDR1 de HC y CDR2 de HC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de CDR2 de HC y CDR3 de HC.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378 y 388, (véase la Tabla E) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379 y 389, (véase la Tabla E) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones variables.

TABLA E

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ ID NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y 339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID NO: 368 y 369; (g) las SEQ ID NO: 378 y 379; y (h) las SEQ ID NO: 388 y 389.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 y 390, (véase la Tabla E) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381 y 391, (véase la Tabla E) o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones variables.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ ID NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones.

Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) pueden comprender un conjunto de mutaciones de pares de carga, como se describe en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) pueden comprender mutaciones de pares de carga seleccionadas de las mutaciones de pares de carga V1, V103 y V131.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es similar a una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, siempre que la proteína de unión a antígeno conserve sustancialmente su función biológica, p. ej., su capacidad para unirse a PD-1, p. ej., PD-1 humano, o PD-1 de mono cynomolgus, o para disminuir, bloquear, inhibir, anular o interferir con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1 o PD-L2.

Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere solo en 1,2, 3, 4, 5, 6 o más aminoácidos, en relación con la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, difiriendo dicha variante de secuencia únicamente en uno o dos aminoácidos, con respecto a la secuencia mencionada. La proteína de unión a antígeno puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos que se producen fuera de las CDR, p. ej., las una o más sustituciones de aminoácidos se producen dentro de la o las regiones marco de la cadena pesada o ligera. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos siempre que la proteína de unión a antígeno conserve las secuencias de aminoácidos de las seis CDR. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más sustituciones de aminoácidos conservativas, en relación con la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.

Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene más de o aproximadamente un 30 %, más de o aproximadamente un 50 %, o más de o aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia con la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. Una proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o tiene más de un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. Una proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o tiene más de un 90 % de identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. Una proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente.

Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, teniendo dicha secuencia variante al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia, en relación con la secuencia mencionada anteriormente. Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, teniendo dicha secuencia variante al menos o aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia, en relación con la secuencia mencionada anteriormente. Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, teniendo dicha secuencia variante al menos o aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, en relación con la secuencia mencionada anteriormente. Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, teniendo dicha secuencia variante al menos o aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia, en relación con la secuencia mencionada anteriormente.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de SEQ ID NO en una sola columna de la Tabla D y al menos una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (p. ej., al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 312-387. En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de un conjunto de secuencias seleccionadas de: (a) las Se Q ID NO: 312-317; (b) las SEQ ID NO: 322-327; (c) las SEQ ID NO: 332 337; (d) las SEQ ID NO: 342-347; (e) las SEQ ID NO: 352-357; (f) las SEQ ID NO: 362-367; (g) las SEQ ID NO: 372 377; y (h) las SEQ ID NO: 382-387, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (p. ej., al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias del conjunto. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) comprende cuatro secuencias de SEQ ID NO: 312-317, concretamente, las SEQ ID NO: 312-315, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende dos secuencias variantes: teniendo una secuencia variante al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 316 y teniendo la otra secuencia variante al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 317. Un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones.

En el presente documento se describe un producto de anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente ^{un 95 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las}S^eQ ^{ID NO: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358,}359, 368, 369, 378, 379, 388 y 389. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con (a) las SEQ ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ ID NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y 339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID NO: 368 y 369; (g) las SEQ ID NO: 378 y 379; y (h) las SEQ ID NO: 388 y 389. Un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias: una secuencia de la Tabla E y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358, 359, 368, 369, 378, 379, 388 y 389. En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias: una ^{secuencia seleccionada de (a) las}S^eQ ^{ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ i}D ^{NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y}339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID NO: 368 y 369; (g) las SEQ ID NO: 378 y 379; y (h) las SEQ ID NO: 388 y 389, y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con una secuencia de (a) - (u). Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 318 y puede comprender además una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (p. ej., al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 319. Un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de ^{identidad de secuencia con cualquiera de las}S^eQ ^{ID NO: 320, 321, 330, 331, 340, 341, 350, 351, 360, 361, 370, 371,}380, 381, 390 y 391. Un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ ID NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391. Un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias: una secuencia de la Tabla E y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 320, 321,330, 331, 340, 341,350, 351,360, 361,370, 371,380, 381,390 y 391. En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende un par de secuencias: una secuencia seleccionada de (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ iD NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391, y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con una secuencia de (a) - (u). Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 320 y puede comprender además una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente un 70 % (p. ej., al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 321. Un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos, en relación con el homólogo natural, para mejorar la semivida/estabilidad o para hacer que el anticuerpo sea más adecuado para la expresión/fabricabilidad (p. ej., como una proteína de fusión con la muteína IL-21). El anticuerpo anti-PD-1 puede diseñarse para prevenir o reducir la interacción entre el anticuerpo anti-PD-1 y los receptores de Fc. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser un anticuerpo sin función efectora estable (SEFL) que comprende una región constante que carece de la capacidad de interactuar con los receptores de Fcy. Los anticuerpos SEFL son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Liu et al., J Biol Chem 292: 1876-1883 (2016); y Jacobsen et al., J. Biol. Chem. 292: 1865-1875 (2017). El anticuerpo SEFL puede comprender una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema EU: L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C y/o K334C. El anticuerpo SEFL puede comprender N297G. El anticuerpo SEFL puede comprender A287C, N297G y L306C. El anticuerpo SEFL puede comprender R292C, N297G y V302C (es decir, SEFL2-2).

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender otras modificaciones de extensión de la semivida (HLE). La modificación de HLE se puede producir en la región constante de cadena pesada y puede comprender una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema EU: M252Y, S254T y T256E. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o dos de M252Y, S254T y T256E. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender las tres de M252Y, S254T y T256E. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 545 o SEQ ID NO: 547 o SEQ ID NO: 549 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 545 o SEQ ⁱD NO: 547 o SEQ ID NO: 549. La modificación de HLE se puede producir en la región constante de cadena pesada y puede comprender una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema EU: L309D, Q311H y N434S. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una, dos o las tres de L309D, Q311H y N434S. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender las tres de L309D, Q311H y N434S. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 544 o SEQ ID NO: 546 o SEQ ID NO: 548 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 544 o SEQ ID NO: 546 o SEQ ID NO: 548.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender modificaciones SEFL2-2 y modificaciones de HLE. Las modificaciones de HLE pueden comprender una o dos o las tres de M252Y, S254T y T256E. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 551 o SEQ ID NO: 553 o SEQ ID NO: 555 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 551 o SEQ iD NO: 553 o SEQ ID NO: 555. Las modificaciones de Hl E pueden comprender una o dos o las tres de L309D, Q311H y N434S. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 550 o SEQ ID NO: 552 o SEQ ID NO: 554 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 550 o SEQ ID NO: 552 o SEQ ID NO: 554. La cadena pesada puede comprender adicionalmente mutaciones de pares de carga como se describe a continuación.

En las células eucariotas, se producen dos tipos de reacciones de glicosilación: (1) N-Glicosilación, en la que se unen glicanos a la asparagina de la secuencia de reconocimiento Asn-X-Thr/Ser, donde "X" es cualquier aminoácido excepto prolina, y la (2) O-glicosilación en la que los glicanos se unen a serina o treonina. La N-glicosilación comienza en el retículo endoplásmico (ER), donde un conjunto complejo de reacciones da como resultado la unión de una estructura central de glicano compuesta esencialmente por dos restos de GlcNAc y tres restos de Man. El complejo de glicano formado en el RE se modifica por la acción de enzimas en el aparato de Golgi. Si el sacárido es relativamente inaccesible para las enzimas, por lo general permanece en la forma HM original. Si las enzimas pueden acceder al sacárido, muchos de los restos de Man se escinden y el sacárido se modifica adicionalmente, dando como resultado la estructura de N-glicanos de tipo complejo. Por ejemplo, la manosidasa-1 ubicada en el cis-Golgi, puede escindir o hidrolizar un glicano HM, mientras que la fucosiltransferasa FUT-8, ubicada en el Golgi medio, fucosila el glicano (Hanrue Imai-Nishiya (2007), BMC Biotechnology, 7:84). El anticuerpo anti-PD-1 puede estar N-glicosilado, p. ej., comprende uno o más restos de azúcar (p. ej., glicanos, sacáridos) unidos covalentemente a un aminoácido específico de la cadena pesada. El anticuerpo anti-PD-1 puede no estar glicosilado o puede no contener restos de azúcar (p. ej., glicanos, sacáridos) unidos covalentemente a un aminoácido específico de la cadena pesada.

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, y además comprende un enlazador. El enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. Por lo tanto, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 287, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 287. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con la Lys C-terminal cortada o eliminada. En este sentido, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que carece de la Lys C-terminal y puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 285, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 285. En general, la lisina C-terminal de un anticuerpo se escinde por la carboxipeptidasa durante la expresión. Una región constante de cadena pesada que carece de la Lys C-terminal evita ventajosamente que la carboxipeptidasa actúe sobre la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que carece de la Lys C-terminal y además puede comprender un enlazador. El enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. Por lo tanto, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 286, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 286. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, y con una o más mutaciones SEFL que previenen o reducen la interacción entre el anticuerpo anti-PD-1 y los receptores de Fc, que incluyen, pero sin limitación, L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C y/o K334C. Las mutaciones SEFL pueden ser mutaciones SEFL2-2: R292C, N297G y V302C, de modo que el anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 265, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 265. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2 y con la Lys C-terminal cortada o eliminada. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ iD NO: 266. En aspectos ilustrativos, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2, la Lys C-terminal cortada o eliminada, y un enlazador. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 267. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2 y con un enlazador sin la Lys C-terminal cortada. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 282.

La muteína de IL-21 puede unirse a la región Fc del anticuerpo anti-PD-1. La muteína de IL-21 puede unirse a una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. La muteína de IL-21 se puede unir al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo.

La proteína de fusión puede comprender solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21). La muteína de IL-21 se puede unir al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21, la Fc del anticuerpo puede comprender modificaciones diseñadas para impulsar la heterodimerización de las dos cadenas pesadas (una cadena pesada fusionada con la muteína de IL-21 y una cadena pesada que carece de la muteína de IL-21). Tales modificaciones incluyen mutaciones de Fc tales como botón en ojal (knobs-into-holes), Duocuerpos (DuoBodies), Azymetric, par de carga, HA-TF, SEEDbody y modificaciones con afinidad diferencial por la proteína A. Véase, p. ej., Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2, Parte A), 2015, pág. 95-106. Las mutaciones de botón en ojal incluyen T366W en la primera cadena pesada y T366S, L368A y/o Y407V en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Ridgway et al., Protein Eng., 9 (1996), pág. 617-621; y Atwell et al., J. Mol. Biol., 270 (1997), pag. 26-35. Las mutaciones DuoBody incluyen F405L en la primera cadena pesada y K409R en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110 (2013), pag. 5145-5150. Las mutaciones Azymetric incluyen T350V, L351Y, F405A y/o Y407V en la primera cadena pesada y T350V, T366L, K392L y/o T394W en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Von Kreudenstein et al., mAbs, 5 (2013), pag. 646-654. Las mutaciones HA-TF incluyen S364H y/o F405A en la primera cadena pesada y Y349T y/o T394F en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Moore et al., mAbs, 3 (2011), pag. 546-557. Las mutaciones SEEDbody incluyen mutaciones de quimera IgG/A en la primera cadena pesada y mutaciones de quimera IgG/A en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Davis et al., Protein Eng. Des. Sel., 23 (2010), pag. 195-202. Las mutaciones de afinidad diferencial de proteína A incluyen H435R en una cadena pesada y ninguna mutación en la otra cadena pesada. Véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 8.586.713.

En un ejemplo particular, las mutaciones son mutaciones de pares de carga. Los siguientes son ejemplos de tales mutaciones de pares de carga, numeradas de acuerdo con el sistema de EU. Las mutaciones de pares de carga incluyen K409D en la primera cadena pesada y D399K en la segunda cadena pesada; K392D en la primera cadena pesada y E356K en la segunda cadena pesada; o tanto K409D como K392D en la primera cadena pesada y tanto D399K como E356K en la segunda cadena pesada (la última denominada "V1" en el presente documento). Véase, p. ej., Gunasekaran et al., J Biol Chem 285: 19637-19646 (2010). En otro ejemplo particular, las mutaciones del par de cargas incluyen K439D, K392D y K409D en la primera cadena pesada; y E356K y D399K en la segunda cadena pesada (indicada en el presente documento como "V103"). En otro ejemplo particular, las mutaciones del par de carga incluyen K360E, K370E, K392E y K409D en la primera cadena pesada; y E357K y D399K en la segunda cadena pesada (indicada en el presente documento como "V131"). Las mutaciones de pares de carga también pueden incluir K370D en la primera cadena pesada y E357K en la segunda cadena pesada; o las tres de K409D, K392D y K370D en la primera cadena pesada y las tres de D399K, E357K y E356K en la segunda cadena pesada (la última denominada "V4" en el presente documento). Otras mutaciones de pares de carga adicionales también incluyen D221E, P228E y/o L368E en la primera cadena pesada y D221R, P228R y/o K409R en la segunda cadena pesada. Véase, p. ej., Strop et al., J. Mol. Biol., 420 (2012), pag. 204-219.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V1, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K409D y K392D (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 294, 296 o 298), o la cadena pesada que contiene las mutaciones ^{D399K y}E356^{k (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 295, 297 o 299. La muteína de i}L-21 ^{puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K y E356K.}

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V4, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K409D, K392D y K370D (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 288, 290 o 292), o la cadena pesada que contiene las ^{mutaciones D399K,}E357^{k y E356K (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ}ID NO: 289, 291 o 293). La muteína de lL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K, D357K y E356K.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V103, la muteína de ^{IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K439D,}K392^{d y K409D (p. ej., la muteína de IL-}21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 472, 474 o 476), o la cadena pesada que contiene las mutaciones E356K y D399K (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 473, 475 o 477). La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones E356K y D399K.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V131, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K360E, K370E, K392E y K409D (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 478, 480 o 482), o la cadena pesada que contiene las mutaciones E357K y D399K (p. ej., la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 479, 481 o 483). La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones E357K y D399K.

Por lo tanto, el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un conjunto de mutaciones de pares de carga, como se describe en el presente documento. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender mutaciones de pares de carga seleccionadas de las mutaciones de pares de carga V1, V103 y V131.

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con una o más mutaciones de pares de carga, p. ej., las mutaciones de pares de carga V1, V4, V103 o V131. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V1, en donde una primera región constante de cadena pesada comprende mutaciones K409 y K392D y una segunda región constante de cadena pesada comprende mutaciones D399K y E356K. Dicha primera región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 294 y dicha segunda región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 295. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 296 y 297, respectivamente. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada y un enlazador de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 298 y 299, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V1 y mutaciones SEFL2-2. Dicha primera región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V1 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 306 y dicha segunda región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V1 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 307. Se contemplan otras variaciones adicionales de dichas cadenas pesadas primera y segunda, entre las que se incluyen, p. ej., cadenas pesadas con la Lys C-terminal cortada o eliminada (SEQ ID NO: 308 y 309) y con la Lys C-terminal cortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 310 y 311).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V4, en donde una primera región constante de cadena pesada comprende mutaciones K409, K392D y K370D y una segunda región constante de cadena pesada comprende mutaciones D399K, E356K y E357K. Dicha primera región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 288 y dicha segunda región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 289. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 290 y 291, respectivamente. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada y un enlazador de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 292 y 293, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V4 y mutaciones SEFL2-2. Dicha primera región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V4 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 300 y dicha segunda región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V4 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 301. Se contemplan otras variaciones adicionales de dichas cadenas pesadas primera y segunda, entre las que se incluyen, p. ej., cadenas pesadas con la Lys C-terminal cortada (SEQ ID NO: 302 y 303) y con la Lys C-terminal cortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 304 y 305).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V103, en donde una primera región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 484 y una segunda región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 485. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 486 y 487, respectivamente. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada y un enlazador de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 488 y 489, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V103 y mutaciones SEFL2-2. Dicha primera región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V103 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 484 y dicha segunda región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V103 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 485. Se contemplan otras variaciones adicionales de dichas cadenas pesadas primera y segunda, entre las que se incluyen, p. ej., cadenas pesadas con la Lys C-terminal cortada (SEQ ID NO: 486 y 487) y con la Lys C-terminal cortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 488 y 489).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V131, en donde una primera región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 478 y una segunda región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 479. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 480 y 481, respectivamente. Dichas regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada y un enlazador de manera que las regiones constantes de cadena pesada primera y segunda pueden comprender las SEQ ID NO: 482 y 483, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V131 y mutaciones SEFL2-2. Dicha primera región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V131 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 490 y dicha segunda región constante de cadena pesada que comprende las mutaciones de pares de carga V131 y mutaciones SEFL2-2 puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 491. Se contemplan otras variaciones adicionales de dichas cadenas pesadas primera y segunda, entre las que se incluyen, p. ej., cadenas pesadas con la Lys C-terminal cortada (SEQ ID NO: 492 y 493) y con la Lys C-terminal cortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 494 y 495).

La proteína de fusión puede comprender más de una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un dímero de muteína de IL-21 o un multímero de muteína de IL-21). La proteína de fusión puede comprender 2, 3 o 4 (o más) muteínas de IL-21. Cuando la proteína de fusión comprende más de una muteína de IL-21, cada muteína de IL-21 puede comprender la misma estructura, p. ej., la misma secuencia de aminoácidos. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de IL-21 o un homomultímero de IL-21. Cada muteína de IL-21 de la proteína de fusión puede comprender una estructura diferente, p. ej., una secuencia de aminoácidos diferente. La proteína de fusión puede comprender un heterodímero de IL-21 o un heteromultímero de IL-21. La proteína de fusión puede comprender dos muteínas de IL-21, en donde la primera muteína de IL-21 está unida al extremo C de la primera cadena pesada de anticuerpo, y la segunda muteína de IL-21 está unida al extremo C de la segunda cadena pesada de anticuerpo. Cada muteína de IL-21 puede tener la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, es un homodímero de muteína de IL-21). La primera muteína de IL-21 puede tener una secuencia de aminoácidos diferente con respecto a la segunda muteína de iL-21 (p. ej., es un heterodímero de muteína de IL-21).

Con respecto a las proteínas de fusión que comprenden una o más muteínas de IL-21, cada muteína de IL-21 puede unirse a una de las cadenas pesadas del anticuerpo con o sin un enlazador. La muteína de IL-21 se puede unir al extremo C-terminal de una de las cadenas pesadas de anticuerpo a través de un enlazador y el enlazador es un péptido. El péptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). La muteína de IL-21 se puede unir directamente al extremo C de una de las cadenas pesadas del anticuerpo sin un enlazador.

La proteína de fusión puede comprender una sola muteína de IL-21 que se une directamente al extremo C de una de las cadenas pesadas del anticuerpo anti-PD-1. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos indicada en la Tabla 4 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 4. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos indicada en la Tabla 5 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 5. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos indicadas en la Tabla 7 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 7. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos indicadas en una cualquiera de las Tablas 6 y 8-14 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en estas Tablas. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 159, 161, 238, 241.242 o 244. La muteína de IL-21 se puede unir directamente al anticuerpo anti-PD-1 y no comprender un enlazador peptídico.

La proteína de fusión puede comprender dos muteínas de IL-21, en donde cada una de las cuales se une directamente al extremo C-terminal de una cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 y ambas tienen la misma secuencia de aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos indicada en la Tabla 4 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 4. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos indicada en la Tabla 5 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 5. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos indicadas en la Tabla 7 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en la Tabla 7. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos indicadas en una cualquiera de las Tablas 6 y 8-14 o una secuencia de una SEQ ID NO: indicada en estas Tablas. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 159, 161, 237, 238, 241 y 244. La muteína de IL-21 se puede unir directamente al anticuerpo anti-PD-1 y puede no comprender un enlazador peptídico.

La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita en el presente documento fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita en el presente documento. La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita en el presente documento, que no está glicosilada, fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita en el presente documento. La proteína de fusión puede comprender una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282, 284-311, 472-495 y 544-555, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ⁱD NO: 265-267, 282, 284-311, 472-495 y 544-555, fusionada con una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283. La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 268-281, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 268-281.

La proteína de fusión puede comprender una construcción como se describe en la figura 4A, 4B o 4C. La proteína de fusión puede comprender (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito en el presente documento; y (ii) una muteína de IL-21 descrita en el presente documento. La proteína de fusión puede comprender (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito en el presente documento; (ii) una mutación de pares de carga descrita en el presente documento; y (iii) una muteína de IL-21 descrita en el presente documento (véase, p. ej., la figura 4C). La proteína de fusión comprende (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito en el presente documento, en donde las secuencias de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) no comprenden una lisina C-terminal; (ii) una mutación de pares de carga descrita en el presente documento; y (iii) una muteína de IL-21 descrita en el presente documento.

La proteína de unión al antígeno PD-1 comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ID NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID NO: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de c DR2 de HC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de c DR3 de HC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de c DR3 de LC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos o más de (a)-(f). Un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla D. Una proteína de unión a antígeno puede comprender 3, 4, 5 o 6 de las secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NO: en una sola columna de la Tabla D. Un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 312-317; (b) las SEQ ID NO: 322-327; (c) las SEQ ID NO: 332-337; (d) las SEQ ID NO: 342-347; (e) las SEQ ID NO: 352-357; (f) las SEQ ID NO: 362-367; (g) las SEQ ID NO: 372-377; y (h) las SEQ ID NO: 382-387. Un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender dichas regiones.

En realizaciones ilustrativas, la proteína de unión al antígeno PD-1 comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla E o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378 y 388, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en la Tabla E o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379 y 389, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). Un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ ID NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y 339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID NO: 368 y 369; (g) las SEQ ID NO: 378 y 379; y (h) las SEQ ID NO: 388 y 389. La región constante de anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282 y 284-311, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282 y 284 311, fusionada con una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-21,23-56, 58-112, 114 208, 210-222, 224-255 y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283. Una proteína de unión a antígeno puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ ID NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391. En el presente documento se describe una proteína de fusión que comprende (I) un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ ID NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391 y (II) una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224 255 y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283.

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 562 o de las SEQ ID NO: 361 y 563. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 562). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 563).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres Cd R de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 564 o de las SEQ ID NO: 361 y 565. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 564). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 565).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres Cd R de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 566. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 566).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres C^dR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 567. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 567).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres C^dR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de iL-21 se une a una cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 568. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 568 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres Cd R de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las s Eq ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., es decir, el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 569. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 569 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres Cd R de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las s Eq ID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V131 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 570. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 570 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres C^dR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 571. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 571 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres C^dR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las s Eq ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 572. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 572 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355 357), las tres Cd R de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las ^sE^qID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 361 y 573. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 573 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 496 o de las SEQ ID NO: 389 y 519. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 496). Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 519).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 497 o de las SEQ ID NO: 389 y 498. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo la muteína de IL-21 fusionada a la cadena pesada la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 497). Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 498).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos ^r9^ey R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 499. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 499).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos r 9e y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 500. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 500).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones Se Fl2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 501. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 501 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las S^eQ ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 502. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 502 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones Se Fl2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las Se Q ID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V131 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 503. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 503 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 504. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las S^eQ ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 505. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 505 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las S^eQ ID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V131 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 389 y 506. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 507 o de las SEQ ID NO: 369 y 508. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 507). Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 508).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4A, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (p. ej., SEQ ID NO: 265 o 266), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 509 o de las SEQ ID NO: 369 y 510. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 509). Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesadamuteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 510).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos ^r9^ey R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 511. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 511).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero como se muestra en la figura 4B, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (p. ej., SEQ ID NO: 267), en donde cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos ^r9^ey R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 512. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 513. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 513 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones Se Fl2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las Se Q ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 514. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 514 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las S^eQ ID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V131 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 515. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 515 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 561).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (p. ej., de las SEQ ID NO: 306 y 307 o de las SEQ ID NO: 308 y 309), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 309), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 516. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 516 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (p. ej., de las SEQ ID NO: 484 y 485 o de las S^eQ ID NO: 486 y 487), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V103 E356K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 487), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 517. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 517 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de región constante que comprenden mutaciones S^eF^l2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (p. ej., de las SEQ ID NO: 490 y 491 o de las S^eQ ID NO: 492 y 493), en donde el monómero de muteína de IL-21 se une a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga V1 E357K y D399K (p. ej., el monómero de muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 493), y en donde la muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 369 y 518. Dicha proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 518 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 561).

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, y un anticuerpo anti-PD-1 que comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 544-555. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NO: 362-364), y una secuencia de región constante de cadena pesada de Se Q ID NO: 525 o 527.

También se describe en el presente documento una proteína de fusión que comprende un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 544-555. Dicha proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NO: 382-384), y una secuencia de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO 529 o 531.

La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 544-555. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la figura 4C, en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NO: 352-354), y una secuencia de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO 521 o 523.

Proteínas de unión a antígeno

La presente divulgación proporciona proteínas de unión al antígeno PD-1 que comprenden (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ⁱD NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID NO: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357. En aspectos ilustrativos, la proteína de unión al antígeno PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento. También se describe un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos o más de (a)-(f). En aspectos ilustrativos, el anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla D y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla D. Una proteína de unión a antígeno puede comprender al menos 3, 4 o 5 de las secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NO: en una sola columna de la Tabla D.

También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 que comprende seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID ⁿO: 312-317; (b) las SEQ ID NO: 322-327; (c) las SEQ ID NO: 332-337; (d) las SEQ ID NO: 342-347; (e) las SEQ ID NO: 352-357; (f) las SEQ ID NO: 362-367; (g) las SEQ ID NO: 372-377; y (h) las SEQ ID NO: 382-387. Las secuencias de aminoácidos de la Tabla D pueden estar separadas por al menos uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) aminoácidos intermedios. Se describe un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla E o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378 y 388, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en la Tabla E o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379 y 389, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). Se describe un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ ID NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y 339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID N^o: 368 y 369; (g) las SEQ ID N^o: 378 y 379; y (h) las SEQ ⁱD NO: 388 y 389. Se describe un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 que comprende (I) un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 318 y 319; (b) las SEQ ID NO: 328 y 329; (c) las SEQ ID NO: 338 y 339; (d) las SEQ ID NO: 348 y 349; (e) las SEQ ID NO: 358 y 359; (f) las SEQ ID NO: 368 y 369; (g) las SEQ ID NO: 378 y 379; y (h) las SEQ ID NO: 388 y 389 y (II) una región constante que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282, 284-311, 472-495 y 544-555. Se describe una proteína de unión a antígeno que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 320 y 321; (b) las SEQ ID NO: 330 y 331; (c) las SEQ ID NO: 340 y 341; (d) las SEQ ID NO: 350 y 351; (e) las SEQ ID NO: 360 y 361; (f) las SEQ ID NO: 370 y 371; (g) las SEQ ID NO: 380 y 381; y (h) las SEQ ID NO: 390 y 391. Se describe una proteína de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una o más de las SEQ ID NO: anteriores.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo anti-PD-1, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

También se describen conjugados que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 descrita en el presente documento y una fracción heteróloga. La fracción heteróloga puede ser cualquier molécula que sea diferente de la proteína de unión al antígeno PD-1. La fracción heteróloga, puede ser un péptido o polipéptido heterólogo, un agente de direccionamiento, una etiqueta de diagnóstico, un polímero, un ácido nucleico, un punto cuántico, una molécula pequeña, una toxina, un hidrato de carbono, un aminoácido u otro agente terapéutico o de diagnóstico. La fracción heteróloga puede ser una muteína de IL-21 como se describe en el presente documento.

También se describen proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 descrita en el presente documento y un polipéptido o péptido heterólogo. El polipéptido heterólogo puede ser una muteína de IL-21 como se describe en el presente documento.

Métodos de fabricación de anticuerpos

En la técnica se conocen métodos adecuados para fabricar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y productos de proteínas de anticuerpos. Por ejemplo, se describen métodos estándar de hibridoma para producir anticuerpos en, p. ej., Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y ^cA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5.a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En el presente documento se proporciona un método ilustrativo para preparar anticuerpos monoclonales anti-PD-1 de la presente divulgación en la sección de EJEMPLOS.

Dependiendo de la especie hospedadora, se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica que conduce a una mayor producción de anticuerpos por parte del hospedador. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, los de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Son adyuvantes humanos potencialmente útiles BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

En la Tabla F se resumen otros métodos de producción de anticuerpos.

TABLA F

Los métodos para ensayar la capacidad de los anticuerpos para unirse a PD-1, independientemente de cómo se produzcan los anticuerpos, son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión de anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia de Western, inmunoprecipitación, SPR y ensayos de inhibición competitiva (véase, p. ej., Janeway e t a l., infra, y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2002/0197266, y la sección anterior relacionada con los ensayos de competición). En la técnica se conocen otros ensayos de unión, por ejemplo, ensayos de unión competitiva o ensayos de competición, que ensayan la capacidad de un anticuerpo para competir con un segundo anticuerpo por la unión a un antígeno, o a un epítopo del mismo, y se pueden utilizar para ensayar la capacidad de un anticuerpo para unirse a PD-1. Véase, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US20140178905, Chand e t a l., Biologicals 46: 168-171 (2017); Liu e t a l., Anal Biochem 525: 89-91 (2017); y Goolia e t a l., J Vet Diagn Invest 29(2): 250-253 (2017). Asimismo, en la técnica se conocen otros métodos para comparar dos anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (SPR). La SPR se puede utilizar para determinar las constantes de unión del anticuerpo y el segundo anticuerpo y se pueden comparar las dos constantes de unión.

F ra cc io n e s h e te ró lo g a s : p o lím e ro s , ca rb oh id ra to s , líp id o s y a g e n te s te ra p é u tico s

El conjugado descrito en el presente documento comprende una muteína de IL-21 unida a un polímero. El polímero puede seleccionarse del grupo que consiste en: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos y derivados de los mismos incluyendo, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, incluidos poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo), polímeros de polivinilo, incluidos alcoholes polivinílicos, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poli(acetato de vinilo) y polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas, incluida la alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxi-propil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa y sal sódica de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos, incluido el polietilenglicol), poli(óxido de etileno) y poli(tereftalato de etileno) y poliestireno. El polímero puede ser un polialquilenglicol, incluido, por ejemplo, polietilenglicol (PEG).

El conjugado puede comprender una muteína de IL-21 unida a un carbohidrato. El carbohidrato puede ser un monosacárido (p. ej., glucosa, galactosa, fructosa), un disacárido (p. ej., sacarosa, lactosa, maltosa), un oligosacárido (p. ej., rafinosa, estaquiosa) o un polisacárido (p. ej., almidón, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, callosa, laminarina, xilano, manano, fucoidano o galactomanano).

La fracción heteróloga puede ser un lípido. El lípido puede ser un ácido graso, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-aciletanolamina), glicerolípido (p. ej., gliceroles mono-, di- o trisustituidos), glicerofosfolípido (p. ej., fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolípido (p. ej., esfingosina, ceramida), lípido de esterol (p. ej., esteroide, colesterol), lípido de prenol, sacarolípido o un policétido, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina liposoluble, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, un fosfolípido.

El conjugado puede comprender una muteína de IL-21 unida a un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser cualquiera de los conocidos en la técnica. El agente terapéutico puede ser un agente de inmunoterapia en la medida en que el agente estimule una respuesta inmunitaria. El agente de inmunoterapia puede ser una vacuna contra el cáncer. El agente de inmunoterapia puede ser un anticuerpo monoclonal. El agente de inmunoterapia puede ser un inhibidor de puntos de control inmunitarios, p. ej., un inhibidor de CTLA4, PD-1, PD-L1. El anticuerpo monoclonal puede ser específico para una proteína en una vía de puntos de control inmunitarios. La proteína de la vía de puntos de control inmunitarios puede ser, por ejemplo, CTLA4, PD-1, PD-L1, B7-H3, B7H4 o TIM3. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se pueden conjugar con atezolizumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, BMS-936558, MK3475, CT-011, AM-224, MDX-1105, IMP321, MGA271.

El agente terapéutico puede ser una citocina, linfocina, factor de crecimiento o factor hematopoyético eficaz para inhibir la metástasis tumoral y/o que tiene un efecto antiproliferativo en al menos una población celular. Estas citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u otros factores hematopoyéticos incluyen, pero sin limitación: M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFa, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina. Otros factores de crecimiento adicionales para usar en la presente invención incluyen angiogenina, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteína morfogénica ósea, receptor IB de proteína morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor a del factor neutrófico ciliar, factor quimiotáctico de neutrófilos 1 inducido por citocinas, neutrófilos inducidos por citocinas, factor quimiotáctico 2 a, factor quimiotáctico de neutrófilos 2 p inducido por citocinas, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, atrayente de neutrófilos derivado de células epiteliales, receptor a 1 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, receptor a 2 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento p, proteína relacionada con el crecimiento ^y, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre, receptor del factor de células madre, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo I, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo II, receptor del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de las mismas. El agente terapéutico puede comprender un anticuerpo específico para una cualquiera de las citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u otros factores hematopoyéticos mencionados anteriormente.

Ácidos nucleicos

También se describen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de IL-21 de la presente divulgación, un conjugado que comprende una muteína de IL-21, o una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 seguida de una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de IL-21 de la presente divulgación. La secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada y la secuencia de nucleótidos que codifica la muteína de IL-21 pueden flanquear una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). Es posible que el ácido nucleico no comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico y la secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 esté en tándem con la secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de IL-21.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de IL-21 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico de SEQ ID NO: 262 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 262.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita en el presente documento fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita en el presente documento. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267 y 282, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267 y 282, fusionada con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 y 283. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 268-281, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 268-281.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de una cualquiera de las SEQ ID No : 265-267, 282, 284-311, 472-495 y 544-555, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, o tiene más de aproximadamente un 90 % (p. ej., aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282, 284-311, 472-495 y 544-555.

También se describen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteínas de unión al antígeno PD-1 de la presente divulgación. La secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia que codifica una CDR de cadena pesada o una CDR de cadena ligera, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera o una secuencia de cadena pesada o una secuencia de cadena ligera. Véase la Tabla G proporcionada a continuación. La secuencia de nucleótidos puede comprender una cualquiera de las SEQ ID NO: 392 471. También se describen pares de secuencias de nucleótidos que comprenden (a) las SEQ ID NO: 398 y 399, (b) las SEQ ID NO: 408 y 409, (c) las SEQ ID NO: 418 y 419, (d) las SEQ ID NOS: 428 y 429, (e) las SEQ ID NOS: 438 y 439, (f) las SEQ ID NOS: 448 y 449, (g) las SEQ ID NOS: 458 y 459 o (h) las SEQ ID NO: 468 y 469. También se describen pares de secuencias de nucleótidos que comprenden (a) las SEQ ID NO: 400 y 401, (b) las SEQ ID NO: 410 y 411, (c) las SEQ ID NO: 420 y 421, (d) las SEQ ID NOS: 430 y 431, (e) las SEQ ID NOS: 440 y 441, (f) las SEQ ID NOS: 450 y 451, (g) las SEQ ID NOS: 460 y 461 o (h) las SEQ ID NO: 470 y 471.

TABLA G

continuación

La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión o conjugado de la presente divulgación. "Ácido nucleico", como se utiliza en el presente documento, incluye "polinudeótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, o formas modificadas de los mismos, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos (p. ej., aislados y/o purificados) a partir de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de las proteínas o polipéptidos de unión a antígeno de la presente divulgación. El ácido nucleico puede no comprender ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. El ácido nucleico puede comprender una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Los ácidos nucleicos pueden ser recombinantes. Como se utiliza en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos a moléculas de ácidos nucleicos que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i) anteriormente. Para los fines de la presente invención, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en reacciones de síntesis química y/o de ligadura enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilamometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracilo-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la presente divulgación se pueden comprar en empresas, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

Vectores

Los ácidos nucleicos pueden incorporarse en un vector. En este sentido, en el presente documento se describen vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos. El vector puede ser un vector de expresión recombinante. Para los fines de la presente invención, la expresión "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótido o polinucleótido modificado genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedadora, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector entra en contacto con la célula en condiciones suficientes para expresar el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. Los vectores descritos en el presente documento no se producen de forma natural integralmente. Sin embargo, pueden producirse de forma natural partes de los vectores. Los vectores pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, pero sin limitación ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte a partir de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores pueden comprender enlaces internucleotídicos naturales o no naturales, o ambos tipos de enlaces. Los nucleótidos alterados o los enlaces internucleotídicos no naturales no pueden obstaculizar la transcripción o replicación del vector.

El vector puede ser cualquier vector adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier hospedador adecuado. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión, o ambas cosas, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo formado por la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJoIIa, CA), la serie pET (Novagen, Madison, w I), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden utilizar vectores de bacteriófagos, tales como AGTIO, AGTl 1, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANMl 149. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen pB101, pBI101.2, pBll01.3, pB1121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunos aspectos, el vector es un vector vírico, p. ej., un vector retrovírico.

Los vectores pueden prepararse mediante las técnicas convencionales de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra. Pueden prepararse construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, de forma que contengan un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Se pueden obtener sistemas de replicación, p. ej., a partir de ColEl, el plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.

El vector puede comprender secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y de terminación de la transcripción y la traducción, que son específicos del tipo de hospedador (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según corresponda y teniendo en cuenta si el vector es de ADN o de ARN.

El vector puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de los hospedadores transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a los antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxótrofo para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia al histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector puede comprender un promotor nativo o normativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de la misma), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica la IL-21, el conjugado o la proteína de fusión. La selección de promotores, p. ej., fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico de fases del desarrollo, está dentro de la capacidad normal del experto en la materia. De modo similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de la experiencia del experto en la materia. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Células hospedadoras

En el presente documento se describen células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico o vector descrito en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector descrito en el presente documento y que sea capaz de producir un producto de expresión codificado por el ácido nucleico (p. ej., ARNm, proteína). La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier fase del desarrollo.

La célula puede ser una célula eucariota, incluida, pero sin limitación, una célula de levadura, una célula de hongos filamentosos, una célula de protozoos, una célula de alga, una célula de insecto o una célula de mamífero. Tales células hospedadoras se describen en la técnica. Véase, p. ej., Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013). Las células eucariotas pueden ser células de mamífero. Las células de mamífero pueden ser células de mamífero no humano. Las células pueden ser células de ovario de hámster chino (CHO) y derivadas de las mismas (por ejemplo, CHO-K1, CHO pro-3, CS9), células de mieloma de ratón (p. ej., NS0, GS-NS0, Sp2/0), células modificadas por ingeniería genética para ser deficientes en la actividad dihidrofolatorreductasa (DHFR) (p. ej., DUKX-X11, DG44), células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) o derivadas de las mismas (p. ej., He k 293T, HEK293-EBNA), células de riñón de mono verde africano (p. ej., células COS, células VERO), células de cáncer de cuello uterino humano (p. ej., HeLa), células epiteliales de osteosarcoma de hueso humano U2-OS, células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinómicas A549, células de fibrosarcoma humano HT1080, células de tumor cerebral de ratón CAD, células de carcinoma embrionario P19, células de fibroblastos de embrión de ratón NIH 3T3, células de fibroblastos de ratón L929, células de neuroblastoma de ratón N2a, células de cáncer de mama humano MCF-7, células de retinoblastoma Y79, células de retinoblastoma humano SO-Rb50, células cancerosas de hígado humano Hep-G2, células de mieloma B de ratón J558L o células de riñón de cría de hámster (BHK) (Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013)). La célula hospedadora puede ser CS9 (una línea de células CHO).

Con el fin de amplificar o replicar el vector, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, p. ej., una célula bacteriana.

También se describe en el presente documento una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende los vectores descritos, además de al menos otra célula, que no comprende ninguno de los vectores. Como alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, comprendiendo la población principalmente células hospedadoras (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector. La población puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedadora que comprende un vector, de manera que todas las células de la población comprenden el vector. La población de células puede ser una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector como se describe en el presente documento.

Composiciones farmacéuticas

En el presente documento se describen composiciones que comprenden una muteína de IL-21, un conjugado que comprende la muteína de IL-21, una proteína de fusión que comprende la muteína de IL-21 y un polipéptido, una proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado que comprende la proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), una proteína de fusión que comprende la proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un ácido nucleico, vector o célula hospedadora, como se describe en el presente documento, o una combinación de los mismos. Las composiciones pueden comprender la muteína IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora de la presente divulgación, o una combinación de los mismos, en forma aislada y/o purificada. La composición puede comprender un solo tipo (por ejemplo, estructura) de una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora de la presente divulgación, o comprende una combinación de dos o más tipos diferentes (p. ej., estructuras diferentes) de muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1, conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células hospedadoras como se describe en el presente documento.

La composición puede comprender agentes que mejoran las características químico-físicas de la muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora, p. ej., a través de la estabilización, por ejemplo, de la muteína de IL-21 o proteína de fusión a ciertas temperaturas (por ejemplo, temperatura ambiente), aumento de la vida útil, reducción de la degradación, p. ej., la degradación mediada por proteasa de oxidación, aumento de la semivida, por ejemplo, de la muteína de IL-21 o proteína de fusión, etc. La composición puede comprender cualquiera de los agentes divulgados en el presente documento como una fracción heteróloga o una fracción conjugada, opcionalmente, en mezcla con las muteínas de IL-21, conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células hospedadoras como se describe en el presente documento.

La composición puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1 (p. ej., anticuerpos anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células hospedadoras como se describen en el presente documento (en lo sucesivo, "agentes activos") se formulan en una composición farmacéutica que comprende el agente activo, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En este sentido, también se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden un agente activo (es decir, cualquiera de las muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1 (p. ej., anticuerpos anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células hospedadoras de la presente divulgación), estando prevista dicha composición farmacéutica para la administración a un sujeto, p. ej., un mamífero.

El agente activo puede estar presente en la composición farmacéutica a un nivel de pureza adecuado para la administración a un paciente. El agente activo puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 %, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener un agente activo a una concentración de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 30,0 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales, tales como suero salino tamponado con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua o agua/aceite y diversos tipos de agentes humectantes. El término también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los EE. UU. o enumerados en la Farmacopea de los EE. UU. para su uso en animales, incluyendo seres humanos.

La composición farmacéutica puede comprender cualquier ingrediente farmacéuticamente aceptable, incluidos, por ejemplo, agentes acidificantes, aditivos, adsorbentes, propulsores de aerosol, agentes de desplazamiento de aire, agentes alcalinizantes, agentes antiapelmazantes, anticoagulantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, antisépticos, bases, aglutinantes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes de recubrimiento, agentes colorantes, desecantes, detergentes, diluyentes, desinfectantes, disgregantes, agentes dispersantes, agentes potenciadores de la disolución, tintes, emolientes, agentes emulsionantes, estabilizadores de emulsión, materiales de relleno, agentes formadores de películas, potenciadores del sabor, agentes saborizantes, potenciadores del flujo, agentes gelificantes, agentes de granulación, humectantes, lubricantes, mucoadhesivos, bases de pomadas, pomadas, vehículos oleaginosos, bases orgánicas, bases de pastillas, pigmentos, plastificantes, agentes abrillantadores, conservantes, agentes secuestrantes, penetrantes en la piel, agentes solubilizantes, disolventes, agentes estabilizantes, bases de supositorios, agentes tensioactivos, surfactantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes terapéuticos, agentes espesantes, agentes de tonicidad, agentes de toxicidad, agentes de aumento de la viscosidad, agentes absorbentes de agua, codisolventes miscibles en agua, ablandadores de agua o agentes humectantes. Véase, p. ej., the Handbook of Pharmaceutical Excipients, tercera edición, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, Londres, UK, 2000). Remington's Pharmaceutical Sciences, decimosexta edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980).

La composición farmacéutica puede comprender materiales de formulación que no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas comprenden un agente activo y una o más sales farmacéuticamente aceptables; polioles; tensioactivos; agentes de equilibrio osmótico; agentes de tonicidad; antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes para proporcionar volumen; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; analgésicos; o agentes farmacéuticos adicionales. La composición farmacéutica puede comprender uno o más polioles y/o uno o más tensioactivos, opcionalmente, además de uno o más excipientes, incluyendo pero sin limitación, sales farmacéuticamente aceptables; agentes de equilibrio osmótico (agentes de tonicidad); antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes para proporcionar volumen; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; y analgésicos.

La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En tales realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero sin limitación, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina ); agentes antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes, agentes aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos, tales como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferentemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edición, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para conseguir un pH fisiológicamente compatible. En algunas realizaciones, el pH de la composición farmacéutica puede estar comprendido entre, por ejemplo, aproximadamente 4 o aproximadamente 5 y aproximadamente 8,0 o aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,5 o aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,5. El pH de la composición farmacéutica puede estar comprendido entre 5,5 y 7,5.

Vías de administración

El principio activo, o la composición farmacéutica que lo comprende, puede administrarse al sujeto a través de cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, el agente activo se puede administrar a un sujeto a través de la administración parenteral, nasal, oral, pulmonar, tópica, vaginal o rectal. El siguiente análisis de las vías de administración se proporciona simplemente para ilustrar realizaciones ilustrativas y de ninguna manera debe interpretarse como una limitación del alcance.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El término "parenteral" significa que la administración no se realiza a través del canal alimentario sino por alguna otra vía, tal como subcutánea, intramuscular, intraespinal o intravenosa. El agente activo de la presente divulgación se puede administrar con un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, tal como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, tal como 2,2-dimetil-153-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres de ácido graso o glicéridos, o glicéridos de ácido graso acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites, que se pueden usar en formulaciones parenterales incluyen aceites derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen de cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen metales alcalino grasos, amonio y sales de trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos, tales como, por ejemplo, alquilo, arilo y sulfonatos de olefina, alquilo, olefina, éter y sulfatos de monoglicéridos y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de amina grasa, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-p-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales pueden contener de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 25 % en peso del agente activo en solución. Se pueden usar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de desde aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones variará habitualmente de desde aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 % en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilenglicolsorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes precintados unidosis o multidosis, tales como ampollas y viales y pueden conservarse en estado criodesecado (liofilizado), que requiere únicamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea en algunos aspectos se preparan a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

Las formulaciones inyectables están de acuerdo con la presente divulgación. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, p. ej., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986).

Dosis

Se cree que los agentes activos descritos en el presente documento son útiles en los métodos para inhibir la señalización de PD-1, al mismo tiempo que proporcionan señalización de IL-21, como se describe en el presente documento, y por lo tanto se cree que son útiles en métodos para tratar o prevenir una o más enfermedades, p. ej., cánceres. La cantidad o dosis del agente activo administrado debe ser suficiente para producir, p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del agente activo como se describe en el presente documento debe ser suficiente para tratar el cáncer como se describe en el presente documento en un período de aproximadamente 1 a 4 minutos, de 1 a 4 horas o de 1 a 4 semanas o más, p. ej., de 5 a 20 o más semanas, desde el momento de la administración. El período de tiempo podría ser aún más prolongado. La dosis estará determinada por la eficacia del agente activo en particular y el estado del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) a tratar.

En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la presente invención, se podría utilizar un ensayo, que comprende comparar la medida en la que se trata el cáncer tras la administración de una dosis dada del agente activo de la presente divulgación a un mamífero entre un conjunto de mamíferos, administrándose una dosis diferente del agente activo a cada conjunto, para determinar una dosis inicial a administrar a un mamífero. La medida en la que se trata el cáncer con la administración de una determinada dosis se puede representar mediante, por ejemplo, la citotoxicidad del agente activo o la medida de regresión tumoral lograda con el agente activo en un modelo de xenoinjerto de ratón. En la técnica se conocen métodos para medir la citotoxicidad de las proteínas de fusión y métodos para ensayar la regresión tumoral.

La dosis del agente activo de la presente divulgación también estará determinada por la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un agente activo particular de la presente divulgación. Normalmente, el médico encargado del tratamiento decidirá la dosificación del agente activo de la presente divulgación con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una diversidad de factores, tales como la edad, el peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el sexo, el agente activo de la presente divulgación a administrar, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad que se esté tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la presente divulgación, la dosis del agente activo de la presente divulgación puede ser de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,001 g/kg de peso corporal/día, o de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal/día.

Formulaciones de liberación controlada

Los agentes activos descritos en el presente documento se pueden modificar en una forma de depósito, de tal forma que la manera en que el agente activo como se describe en el presente documento se libera en el cuerpo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 4.450.150). Las formas de depósito de agentes activos pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los agentes activos y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en donde el agente activo se encapsula o se difunde por todo el material y/o se libera mediante la degradación del material no poroso. A continuación, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del cuerpo del sujeto y el agente activo se libera del implante a una velocidad predeterminada.

La composición farmacéutica que comprende el agente activo puede modificarse para tener cualquier tipo de perfil de liberación in vivo. La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación inmediata, liberación controlada, liberación sostenida, liberación prolongada, liberación retardada o liberación bifásica. En la técnica se conocen métodos de formulación de péptidos para liberación controlada. Véase, por ejemplo, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) y las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; y WO 1999/040942.

Las presentes composiciones pueden comprender además, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o se pueden administrar en una forma de liberación prolongada para proporcionar un almacenamiento y/o efecto de la administración prolongados.

Combinaciones

Las proteínas de fusión o proteínas de unión a antígenos (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas en el presente documento puede administrarse solas y, como alternativa, pueden administrarse en combinación con otro agente terapéutico, p. ej., otro agente activo de la invención de diferente tipo (por ejemplo, estructura). El otro agente terapéutico puede tener como objetivo tratar o prevenir el cáncer. El otro agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico. El otro agente terapéutico puede ser un agente utilizado en radioterapia para el tratamiento del cáncer. Por consiguiente, las proteínas de fusión o proteínas de unión a antígenos (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos de coordinación de platino, inhibidores de la topoisomerasa, antibióticos, alcaloides antimitóticos y difluoronucleósidos. Una proteína de fusión de IL-21 descrita en el presente documento (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con una muteína de IL-21) puede combinarse con una proteína de unión a antígeno (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1).

Cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006, 22D4.017 puede administrarse en combinación con una proteína de fusión de IL-21 descrita en el presente documento, incluida, por ejemplo: una proteína de fusión que comprende un homodímero o monómero seleccionado de:

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 496);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo la muteína de IL-21 fusionada con la cadena pesada la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 497);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 498);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 499);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 500);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 501 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 555);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 502 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 503 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 555);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 505 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 507);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 508);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 509);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 510);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 511);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprendiendo cada fusión de cadena pesada-muteína de IL-21 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 513 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 514 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 515 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 516 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 517 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559); o

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) y dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes (de las que una está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 518 y la otra no está fusionada con una muteína de IL-21 y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

Las proteínas de fusión o proteínas de unión a antígenos (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética. Se ha demostrado que las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética poseen las cualidades deseadas en los tratamientos terapéuticos, particularmente en oncología. Dos tipos principales de células inmunitarias modificadas por ingeniería genética son las que contienen receptores de antígenos quiméricos (denominados "CAR" o "CAR-T") y receptores de células T ("TCR"). Estas células modificadas por ingeniería genética están genomodificadas para dotarlas de especificidad antigénica mientras conservan o mejoran su capacidad para reconocer y destruir una célula diana. Los receptores de antígenos quiméricos pueden comprender, por ejemplo, (i) un componente específico de antígeno ("molécula de unión a antígeno"), (ii) uno o más dominios coestimuladores, y (iii) uno o más dominios activadores. Cada dominio puede ser heterogéneo, es decir, compuesto por secuencias derivadas de diferentes cadenas proteicas. Las células inmunitarias que expresan receptores de antígenos quiméricos (tales como las células T) pueden usarse en diversas terapias, incluyendo terapias contra el cáncer. Se apreciará que pueden utilizarse polipéptidos coestimuladores como se definen en el presente documento para potenciar la activación de células que expresan CAR contra antígenos diana y, por lo tanto, aumentar la potencia de la inmunoterapia adoptiva. Las células T pueden modificarse por ingeniería genética para que posean especificidad para una o más dianas deseadas. Por ejemplo, las células T se pueden transducir con ADN u otro material genético que codifique una molécula de unión a antígeno, tal como uno o más fragmentos variables monocatenarios ("scFv") de un anticuerpo, junto con una o más moléculas de señalización y/o uno o más dominios de activación, tales como CD3 zeta.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética (tales como CAR o TCR), pueden tener especificidad para DLL3. Delta-like 3 (DLL3) es un miembro de la familia de ligandos Delta/Serrate/Lag-2 para el receptor Notch y se cree que desempeña un papel en la señalización de Notch. DLL3 es un ligando inhibidor de la vía de señalización de Notch que normalmente se expresa exclusivamente en las membranas intracelulares (Geffers et al. (2007) J Cell Biol; 178: 465-76), y como se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 62/655725. Los receptores de antígenos quiméricos de la invención típicamente comprenden: (i) una molécula de unión a antígeno específica de DLL3, (ii) uno o más dominios coestimuladores, y (iii) uno o más dominios activadores. Se apreciará que cada dominio puede ser heterogéneo, estando de esta manera compuesto por secuencias derivadas de diferentes cadenas de proteínas.

El receptor de antígeno quimérico puede comprender una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3, en donde la molécula de unión a antígeno comprende al menos uno de: (a) una CDR1 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de SYYWT (SEQ ID NO: 42) o GYYMH (SEQ ID NO: 730) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de la de YIYYSGTTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 731) o WIDPNSGDTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 732) o WINPNSGDTSYAQRFLG (SEQ ID NO: 733) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (c) una CDR3 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de IAVRGFFFDY (SEQ ID NO: 734) o DPNRRSWYYGMDV (SEQ ID NO: 735) o EDDSSWYGSFDY (SEQ ID NO: 736) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (d) una CDR1 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de RASQSVs Ss YLA (SEQ ID NO: 737) o QASQDIRNYLN (Se Q ID NO: 738) o RASQGIRNYLG (SEQ ID NO: 739) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (e) una CDR2 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de GASTRAT (SEQ ID NO: 740) o DASNLET (SEQ ID NO: 741) o AASSLQS (SEQ ID NO: 742) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (f) una CDR3 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de QQYGTSPLT (SEQ ID NO: 743) o QHYDNLPLTF (SEQ ID NO: 744) o LQHDSDLRTF (SEQ ID NO: 745) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos.

El receptor de antígeno quimérico puede comprender una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a DLL3, en donde la molécula de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de la construcción de uno de los clones 1H2.1, 8D2 y 6B2, mostrados en la Tabla H:

Tabla H

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética (tales como CAR o TCR), pueden tener especificidad para FLT3. La tirosina cinasa 3 similar a Fms (FLT3), también conocida como cinasa de hígado fetal 2 (FLK-2), cinasa de células madre humanas 1 (SCK-1) o antígeno de grupo de diferenciación (CD135), es un receptor tirosina cinasa hematopoyético que fue clonado por dos grupos independientes en la década de 1990. El gen de FLT3, ubicado en el cromosoma 13q12 en los seres humanos, codifica una proteína receptora proteína tirosina cinasa de clase III que comparte homología con otros miembros de la familia de clase III, incluido el receptor del factor de células madre (c-KIT), el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (FMS) y el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), y se describe con más detalle en el documento WO2017173410. Los receptores de antígenos quiméricos típicamente comprenden: (i) una molécula de unión a antígeno específica de FLT3, (ii) uno o más dominios coestimuladores, y (iii) uno o más dominios activadores. Se apreciará que cada dominio puede ser heterogéneo, estando de esta manera compuesto por secuencias derivadas de diferentes cadenas de proteínas.

También se describe un receptor de antígeno quimérico que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a FLT3, en donde la molécula de unión a antígeno comprende al menos uno de: (a) una CDR1 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos NARMGVS (SEQ ID NO: 752) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos HIFSNAEKSYRTSLKS (SEQ ID NO: 753) o la secuencia de aminoácidos HIFSNDEKTYSTSLKS (SEQ ID NO: 754) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (c) una CDR3 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos IPGYGGNGDYHYYGMDV (SEQ ID NO: 755) o la secuencia de aminoácidos IPYYGSGSHNYGMDV (SEQ ID NO: 756) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (d) una CDR1 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos RASQGIRNDLG (SEQ ⁱD NO: 757) o la secuencia de aminoácidos R^aS^qDIRNDFG (SEQ ID NO: 758) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (e) una CDR2 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos ASSTLQS (SEQ ID NO: 759) o la secuencia de aminoácidos AASTLQS (SEQ ID NO: 760) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos; (f) una CDR3 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos LQHNNFPWT (SEQ iD NO: 761) o la secuencia de aminoácidos LQYNTYPWT (SEQ ID NO: 762) en no más de 3, 2, 1 o 0 restos de aminoácidos.

El receptor de antígeno quimérico puede comprender una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a FLT3, en donde la molécula de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de la construcción de uno de los clones 10E3, 8B5, 4E9 y 11F11, mostrados en la Tabla I:

Tabla

continuación

También se describen polinucleótidos que codifican los receptores de antígenos quiméricos y vectores que comprenden los polinucleótidos. El vector puede ser, por ejemplo, un vector retrovírico, un vector de a Dn , un plásmido, un vector de ARN, un vector adenovírico, un vector asociado a adenovirus, un vector lentivírico, o cualquier combinación de los mismos. También se describen células inmunitarias que comprenden los vectores. El vector lentivírico puede ser un vector pGAR, tal como el que se muestra en la publicación WO2017173410.

Las células inmunitarias ilustrativas incluyen, pero sin limitación, células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas o células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas.

Cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006 y 22D4.017 puede administrarse en combinación con una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que comprende una construcción de receptor de antígeno quimérico como se muestra anteriormente. Cualquiera de las proteínas de fusión de IL-21 descritas en el presente documento puede administrarse en combinación con una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que comprende una construcción de receptor de antígeno quimérico como se muestra anteriormente. Al dirigirse a DLL3, tales combinaciones se pueden usar para tratar una diversidad de tipos de tumores, incluidos, pero sin limitación, suprarrenal, de hígado, de riñón, de vejiga, de mama, gástrico, de ovario, de cuello uterino, uterino, esofágico, colorrectal, de próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata), pancreático, de pulmón (microcítico y no microcítico), de tiroides, carcinomas, sarcomas, glioblastomas, tumores de cabeza y cuello, carcinoma neuroendocrino macrocítico (CNEM), cáncer medular de tiroides, glioblastoma, cáncer de próstata neuroendocrino, (NEPC), cáncer gastroenteropancreático (GEP) de alto grado y melanoma maligno. En una realización particular, el tipo de tumor es cáncer de pulmón microcítico. Al dirigirse a FLT3, tales combinaciones se pueden usar para tratar una diversidad de tipos de tumores, incluidos, pero sin limitación, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mieloide crónica atípica, leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia megacarioblástica aguda, síndrome mielodisplásico (MDS), trastorno mieloproliferativo, neoplasia mieloide, sarcoma mieloide) o combinaciones de los mismos. Otras enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, psoriasis, alergias, asma, enfermedad de Crohn, IBD, IBS, fibromialga, mastocitosis y enfermedad celíaca. El tipo de tumor puede ser AML.

Las proteínas de fusión o proteínas de unión a antígenos (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con un virus oncolítico. Los virus oncolíticos han demostrado actividad anticancerosa en una diversidad de tipos de tumores. La inmunoterapia oncolítica es una modalidad de tratamiento que utiliza virus oncolíticos competentes en la replicación que infectan y dañan selectivamente los tejidos cancerosos sin causar daño a los tejidos normales. Los estudios en curso están utilizando una diversidad de virus modificados por ingeniería genética que no se limitan al virus del herpes simple (HSV), vaccinia y reovirus.

El virus oncolítico puede proceder de una cepa del virus del herpes simple 1 (HSV-1) o del herpes simple 2 (HSV-2), o de un derivado de los mismos, preferentemente HSV-1. Los derivados incluyen recombinantes intertipo que contienen ADN de las cepas HSV-1 y HSV-2. Dichos recombinantes intertipo se describen en la técnica, por ejemplo, en Thompson et al., (1998) Virus Genes 1(3); 275286 y Meignier et al., (1998) J. Infect. Dis.159; 602614.

Las cepas del virus del herpes simple pueden proceder de aislados clínicos. Estas cepas se aíslan a partir de individuos infectados, tales como los que tienen herpes labial recurrente. Los aislados clínicos pueden examinarse para determinar la capacidad o característica deseada, tal como una mayor replicación en el tumor y/u otras células in vitro y/o in vivo en comparación con las cepas estándar de laboratorio, como se describe en las Patentes de EE. UU. N.° 7.063.835 y 7.223.593. El virus del herpes simple puede ser un aislado clínico de un herpes labial recurrente. Otras cepas adicionales del virus del herpes simple 1 incluyen, pero sin limitación, la cepa JS1, cepa 17+, cepa F, cepa KOS y cepa Patton.

Los ejemplos de genes de HSV que se pueden modificar incluyen genes de virulencia que codifican proteínas tales como ICP34.5 (y34.5). ICP34.5 actúa como factor de virulencia durante la infección por HSV, limita la replicación en células que no se dividen y hace que el virus no sea patógeno. Otro gen del HSV que puede modificarse es el gen que codifica ICP47. ICP47 regula negativamente la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I en la superficie de las células hospedadoras infectadas y la unión del MHC de clase I al transportador asociado con la presentación de antígenos (TAP). Estas acciones bloquean el transporte de péptidos antigénicos en el retículo endoplásmico y la carga de moléculas del MHC de clase I. Otro gen del HSV que se puede modificar es ICP6, la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa, involucrada en el metabolismo de nucleótidos y la síntesis de ADN viral en células que no se dividen, pero no en células en división. También puede modificarse (además o como alternativa a los genes mencionados anteriormente) la timidina cinasa, responsable de fosforilar aciclovir a aciclovirmonofosfato, la proteína transactivadora de viriones vmw65, la glicoproteína H, vhs, ICP43 y genes tempranos inmediatos que codifican ICP4, ICP27, ICP22 y/o ICP0.

También se describen cepas del virus del herpes y cómo preparar estas cepas en las Patentes de EE. UU. N.° 5.824.318; 6.764.675; 6.770.274; 7.063.835; 7.223.593; 7.749.745; 7.744.899; 8.273.568; 8.420.071; y 8.470.577; Publicaciones de la OMPI N.° WO199600007; WO199639841; WO199907394; WO200054795; WO2006002394; andWO201306795; Patentes Chinas N.° CN128303, CN10230334 y CN10230335; Varghese y Rabkin, (2002) Cancer Gene Therapy 9:967-97 y Cassady and Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108.

El virus oncolítico puede ser talimogén laherparepvec (IMLYGIC®), derivado de una cepa clínica (HSV-1 cepa JS1) depositada en la colección europea de cultivos celulares (ECAAC) con el número de acceso 01010209. En el talimogén laherparepvec, los genes virales de HSV-1 que codifican ICP34.5 e ICP47 se han delecionado funcionalmente. La deleción funcional de ICP47 conduce a una expresión temprana de US 11, un gen que promueve el crecimiento del virus en las células tumorales sin disminuir la selectividad tumoral. La secuencia codificante del GM-CSF humano, se ha insertado en el genoma viral en los antiguos sitios de ICP34.5 (véase Liu et al., Gene Ther 10: 292-303, 2003).

Otros ejemplos de virus oncolíticos incluyen RP1 (HSV-1/ICP34.5VICP47VGM-CSF/GALV-GP R(-); RP-2 (VHS-1/ICP34.5VICP47VGM-CSF/GALV-GP R(-)/agente de unión anti-CTLA-4; y RP3 (HSV-1/ICP34.5VICP47VGM-CSF/GALV-GPR(-)/agente de unión anti-CTLA-4/ligandos coestimuladores (p. ej., CD40L, 4-1BBL, GITRL, OX40L, ICOSL)). En estos virus oncolíticos, GALV (virus de la leucemia del simio gibón) se ha modificado con una deleción específica del péptido R, dando como resultado GALV-GP R(-). Dichos virus oncolíticos se analizan en los documentos WO2017118864, WO2017118865, WO2017118866, WO2017118867 y WO2018127713A1.

Otros ejemplos adicionales de virus oncolíticos incluyen NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, Brainwel™ y Heapwel™, Cavatak® (virus coxsackie, CVA21), HF-10, Seprehvir®, Reolysin®, enadenotucirev, ONCR-177 y los descritos en los documentos USP 10.105.404, WO2018006005, WO2018026872A1 y WO2017181420.

Cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006 y 22D4.017 puede administrarse en combinación con un virus oncolítico como talimogén laherparepvec. Cualquiera de las proteínas de fusión de IL-21 descritas en el presente documento puede administrarse en combinación con un virus oncolítico tal como el talimogén laherparepvec. Tales combinaciones se pueden usar para tratar una diversidad de tipos de tumores, incluidos, pero sin limitación, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama (p. ej., cáncer de mama triple negativo), cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cáncer gastroesofágico (por ejemplo, adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas), cáncer de pulmón no microcítico y carcinoma de células renales de células claras. El tipo de tumor puede ser melanoma.

Kits

También se describen en el presente documento kits que comprenden una muteína de IL-21, Proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una combinación de los mismos. El kit puede comprender al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una combinación de los mismos, en un recipiente. Dicha al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora como se describe en el presente documento, pueden proporcionarse en el kit como una forma farmacéutica. Para los fines del presente documento, "forma farmacéutica" se refiere a una cantidad discreta dispersada en un vehículo adecuado. La forma farmacéutica puede ser la cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto un efecto deseado, p. ej., el tratamiento de un cáncer. El kit puede comprender varias formas farmacéuticas, p. ej., un suministro semanal o mensual de formas farmacéuticas, opcionalmente, cada una de las cuales está envasada individualmente o separada de otras formas farmacéuticas. Los componentes del kit/forma farmacéutica pueden envasarse con instrucciones para la administración a un paciente. El kit puede comprender uno o más dispositivos para la administración a un paciente, p. ej., una aguja y una jeringa, y similares. Dicha al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una combinación de los mismos, pueden estar preenvasado en una forma lista para usar, p. ej., una jeringa, una bolsa intravenosa, etc. La forma lista para usar puede ser para un solo uso. El kit puede comprender múltiples formas listas para usar de un solo uso de al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora de la presente divulgación. El kit puede comprender además otros agentes terapéuticos o de diagnóstico o vehículos farmacéuticamente aceptables (p. ej., disolventes, tampones, diluyentes, etc.), incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento.

Métodos de fabricación

Las muteínas de IL-21 pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Se describen métodos adecuados de síntesis de polipéptidos de novo en, por ejemplo, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y en la Patente de EE.UU. N.° 5.449.752. En el presente documento se exponen otros métodos ilustrativos adicionales para preparar los péptidos descritos en el presente documento.

Las muteínas de IL-21 descritas en el presente documento pueden ser sintetizadas comercialmente por empresas, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), Multiple Peptide Systems (San Diego, CA), Peptide 2.0 Inc. (Chantilly, VA) y American Peptide Co. (Sunnyvale, CA). En este sentido, las muteínas de IL-21 pueden ser sintéticas, recombinantes, aisladas y/o purificadas.

Las muteínas de IL-21 se pueden producir de forma recombinante usando un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido usando métodos recombinantes estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994.

En el presente documento se describen métodos para preparar una muteína de IL-21. El método puede comprender cultivar una célula hospedadora como se describe en el presente documento para expresar la muteína de IL-21 y recolectar la muteína de IL-21 expresada.

En el presente documento también se describen métodos para producir una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21. El método puede comprender cultivar una célula hospedadora como se describe en el presente documento para expresar la proteína de fusión y recolectar la proteína de fusión expresada.

El método puede comprender cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o muteína de IL-21 como se describe en el presente documento para expresar la proteína de fusión o muteína de IL-21. La célula hospedadora puede ser cualquiera de las células hospedadoras descritas en el presente documento. La célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste en: células CHO, células NS0, células COS, células VERO y células BHK. La etapa de cultivar una célula hospedadora puede comprender cultivar la célula hospedadora en un medio de crecimiento para apoyar el crecimiento y la expansión de la célula hospedadora. El medio de cultivo puede aumentar la densidad celular, viabilidad y productividad del cultivo en el momento oportuno. El medio de crecimiento puede comprender aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, glucosa y suero como fuente de factores de crecimiento, hormonas y factores de unión. El medio de crecimiento puede ser un medio completamente definido químicamente que consiste en aminoácidos, vitaminas, oligoelementos, sales inorgánicas, lípidos e insulina o factores de crecimiento similares a la insulina. Además de aportar los nutrientes, el medio de crecimiento también ayuda a mantener el pH y la osmolaridad. Varios medios de cultivo se comercializan y se describen en la técnica. Véase, p. ej., Arora, "Cell Culture Media: A Review" MATER METHODS 3:175 (2013).

El método para preparar una muteína de IL-21 o proteína de fusión como se describe en el presente documento puede comprender el cultivo de la célula hospedadora en un medio de alimentación. El método puede comprender el cultivo en un medio de alimentación en un modo de lote alimentado. En la técnica se conocen métodos de producción de proteínas recombinantes. Véase, p. ej., Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAbs 2(5): 466-477 (2010).

El método para producir una muteína o proteína de fusión de IL-21 puede comprender una o más etapas para purificar la muteína o proteína de un cultivo celular o el sobrenadante del mismo y, preferentemente, recuperar la proteína purificada. El método puede comprender una o más etapas de cromatografía, p. ej., cromatografía de afinidad (p. ej., cromatografía de afinidad con proteína A), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba. El método puede comprender la purificación de la proteína usando una resina de cromatografía de afinidad de Proteína A.

El método puede comprender además etapas para formular la proteína purificada, etc., obteniendo así una formulación que comprende la proteína purificada. Dichas etapas se describen en Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel y Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010.

Métodos de uso

En el presente documento se describen adicionalmente métodos de tratamiento. Estos métodos pueden ser un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una composición farmacéutica como se describe en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar al sujeto.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son útiles para inhibir la señalización de PD-1 y/o activar la señalización de IL-21. Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, [1] la actividad inhibidora de PD-1 de las composiciones proporcionadas en la presente invención permite que tales entidades sean útiles en métodos para mejorar la actividad de las células T y mejorar la respuesta inmunitaria, y, en particular, una respuesta inmunitaria contra un tumor o cáncer; y/o [2] la actividad activadora de IL-21 de las composiciones proporcionadas en el presente documento permite que dichas entidades mejoren la supervivencia y la función efectora de las células T, restringe la diferenciación terminal y la pérdida del potencial replicativo, promueve la longevidad de las células T cambiando las células efectoras activadas hacia un fenotipo de células T más vírgenes (p. ej., al mejorar la expresión de CCR7) y mejora la citotoxicidad contra las células diana (p. ej., cancerosas) (p. ej., al aumentar la producción de IFNy y granzima B).

Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos para mejorar la actividad de las células T en un sujeto, mejorar la supervivencia y la función efectora de las células T, restringir la diferenciación terminal y la pérdida del potencial replicativo, promover la longevidad de las células T y mejorar la citotoxicidad contra las células diana (p. ej., cancerosas). Los métodos pueden comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica descrita en el presente documento en una cantidad eficaz. La actividad de las células T o la respuesta inmunitaria pueden estar dirigidas contra una célula cancerosa o un tejido canceroso o una célula tumoral o un tumor. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria innata. La respuesta inmunitaria que se mejora puede ser una respuesta inmunitaria mediada por células T.

Como se utiliza en el presente documento, el término "mejorar" y las palabras derivadas del mismo pueden no ser una mejora o un aumento del 100 % o completo. Más bien, existen diversos grados de tratamiento, de los cuales un experto en la materia reconoce que tienen un beneficio o efecto terapéutico potencial. En este sentido, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden mejorar, p. ej., la actividad de las células T o mejorar una respuesta inmunitaria, en cualquier cantidad o nivel. La mejora proporcionada por los métodos descritos en el presente documento puede ser al menos o aproximadamente un 10 % de mejora (por ejemplo, al menos o aproximadamente un 20 % de mejora, al menos o aproximadamente un 30 % de mejora, al menos o aproximadamente un 40 % de mejora, al menos o aproximadamente un 50 % de mejora, al menos o aproximadamente un 60 % de mejora, al menos o aproximadamente un 70 % de mejora, al menos o aproximadamente un 80 % de mejora, al menos o aproximadamente un 90 % de mejora, al menos o aproximadamente un 95 % de mejora, al menos o aproximadamente un 98 % de mejora).

En la técnica se conocen métodos para medir la actividad de las células T y las respuestas inmunitarias. La actividad de las células T se puede medir mediante, por ejemplo, un ensayo de citotoxicidad, tal como los descritos en Kabat et al., PLoS ONE 5(7): e11867 (2010). Otros ensayos de actividad de las células T se describen en Bercovici et al., Clin Diagn Lab Immunol. 7(6): 859-864 (2000). Se describen métodos para medir las respuestas inmunitarias, p. ej., en Macatangay et al., Clin Vaccine Immunol 17(9): 1452-1459 (2010) y Clay et al., Clin Cancer Res.7(5):1127-35 (2001).

Además, en el presente documento se describen métodos para tratar a un sujeto con cáncer y métodos para tratar a un sujeto con un tumor sólido. El método puede comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica descrita en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar el cáncer o el tumor sólido en el sujeto. El cáncer que puede tratarse por los métodos descritos en el presente documento puede ser cualquier cáncer, p. ej., cualquier crecimiento o tumor maligno causado por una división celular anormal y descontrolada que puede extenderse a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo. El cáncer puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, del conducto anal o del anorrecto, cáncer ocular, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, de las fosas nasales o del oído medio, cáncer de boca, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello del útero, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma hodgkiniano, cáncer de la hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de la nasofaringe, linfoma no hodgkiniano, cáncer ovárico, cáncer de páncreas, peritoneo, epiplón y cáncer mesentérico, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de riñón (p. ej., carcinoma de células renales (RCC), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. En aspectos particulares, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cánceres de cabeza y cuello, ovario, cuello uterino, vejiga y esófago, pancreático, cáncer gastrointestinal, gástrico, de mama, cánceres de endometrio y colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, vejiga, cáncer de pulmón, p. ej., cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar. En realizaciones particulares, el tumor es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama triple negativo y cáncer gástrico. En aspectos ilustrativos, el sujeto tiene un tumor (p. ej., un tumor sólido, una neoplasia hematológica o una neoplasia linfoide) y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto. En otros aspectos ilustrativos, el tumor es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama, melanoma, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer gástrico, linfoma o leucemia, y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar", así como las palabras relacionadas con el mismo, no implican necesariamente el tratamiento del 100 % o completo. Más bien, existen diversos grados de tratamiento, de los cuales un experto en la materia reconoce que tienen un beneficio o efecto terapéutico potencial. En este sentido, los métodos de tratamiento de cánceres descritos en el presente documento pueden proporcionar cualquier cantidad o cualquier nivel de tratamiento. Además, el tratamiento proporcionado por el método descrito puede incluir el tratamiento de una o más condiciones o síntomas o signos del cáncer que se está tratando. Asimismo, el tratamiento proporcionado por los métodos descritos puede abarcar la ralentización de la progresión del cáncer. Por ejemplo, los métodos pueden tratar el cáncer en virtud de mejorar la actividad de las células T o una respuesta inmunitaria contra el cáncer, reducir el crecimiento de tumores o cánceres, reducir la metástasis de las células tumorales, aumentar la muerte celular de células tumorales o cancerosas, y similares. Los métodos pueden tratar retrasando la aparición o recurrencia del cáncer 1 día, 2 días, 4 días, 6 días, 8 días, 10 días, 15 días, 30 días, dos meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 4 años o más. Los métodos pueden tratar de manera que aumente la supervivencia del sujeto.

Sujetos

El sujeto puede ser un mamífero, incluidos, pero sin limitación, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos, mamíferos del orden Carnivora, incluidos felinos (gatos) y cánidos (perros), mamíferos del orden Artiodactyla, incluidos bovinos (vacas) y porcino (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluidos equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, ceboides o simioides (simios inferiores) o del orden Anthropoids (seres humanos y simios superiores). El mamífero puede ser un ser humano.

Realizaciones ilustrativas

En realizaciones ilustrativas, la presente divulgación proporciona una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ID NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID n O: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357. En determinados aspectos, la proteína de unión al antígeno PD-1 comprende un par de secuencias de aminoácidos: las SEQ ID NO: 358 y 359. En casos ilustrativos, la proteína de unión al antígeno PD-1 comprende una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 265-267, 282, 284-311. En algunos aspectos, la proteína de unión al antígeno PD-1 comprende un par de secuencias de aminoácidos: las SEQ ID NO: 360 y 361.

También se describe un conjugado que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores y una fracción heteróloga. También se describe un polipéptido de fusión o una proteína de fusión que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores y un polipéptido o péptido heterólogo. En realizaciones ilustrativas, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores. En casos ilustrativos, el ácido nucleico comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 432-442. La presente divulgación, en realizaciones ilustrativas, proporciona un vector que comprende el ácido nucleico, como se ha descrito anteriormente, así como una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o el vector, como se ha descrito anteriormente. También se proporciona un kit que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, o un ácido nucleico, vector, o célula hospedadora, o una combinación de los mismos, y un recipiente. La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que, en realizaciones ilustrativas, comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, o un ácido nucleico, vector o célula hospedadora, o una combinación de los mismos, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La presente divulgación proporciona además un método para preparar una proteína de unión al antígeno PD-1, en donde, en realizaciones ilustrativas, el método comprende cultivar la célula hospedadora como se describe en este párrafo, para expresar la proteína de unión al antígeno PD-1 y recolectar la proteína de unión al antígeno PD-1 expresada. La presente divulgación proporciona además la proteína de unión al antígeno PD-1 para su uso en un método para tratar a un sujeto que lo necesita. En aspectos ilustrativos, el sujeto tiene un tumor sólido y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor sólido en el sujeto. Opcionalmente, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en: cánceres de cabeza y cuello, ovario, cuello uterino, vejiga y esófago, pancreático, cáncer gastrointestinal, gástrico, de mama, cánceres de endometrio y colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, de vejiga, cáncer de pulmón, p. ej., cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar.

También se describen en el presente documento:

1. Una combinación que comprende:

(i) un anticuerpo anti-PD-1, en donde dicho anticuerpo anti-PD-1 comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia;

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID n O: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia;

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID ⁿO: 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia;

(d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia;

(e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia;

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos, tres, cuatro, cinco o seis cualesquiera de (a)-(f); y

(ii) una construcción de anticuerpo monocatenario que comprende:

(a) un primer dominio en el formato de un scFv que se une a CD3,

(b) un segundo dominio en el formato de un scFv que se une a un antígeno asociado a un tumor; y, opcionalmente,

(c) un tercer dominio que proporciona una semivida media sérica prolongada, preferentemente un dominio basado en Fc.

2. La combinación de 1, en donde:

el anticuerpo anti-PD-1 comprende: una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 352, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 353, una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 354, una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 355, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 356, y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 357;

(ii) el anticuerpo anti-PD-1 tiene una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 358 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la SEC ID NO: 359; o

(iii) tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 361.

3. La combinación de 1 o 2, en donde el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción de anticuerpo monocatenario se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD33, PSMA, BCMA, FLT3, EGFRvIII, DLL3, MUC17 y EpCAM.

4. Un kit que comprende la combinación de uno cualquiera de 1 a 3.

5. La combinación de uno cualquiera de 1 a 3 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto que lo necesita la combinación.

6. La combinación para su uso de acuerdo con 5, en donde el sujeto tiene un cáncer y la combinación se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el cáncer en el sujeto.

7. La combinación de uno cualquiera de 1 a 3 para uso terapéutico.

8. La combinación de uno cualquiera de 1 a 3 para su uso en el tratamiento de cánceres.

9. La combinación para su uso de acuerdo con 6, o la combinación para su uso de 7 u 8, en donde

(a) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es CD19 y el cáncer es leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante o refractario, linfoma de células del manto o linfoma folicular;

(b) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es CD33 y el cáncer es leucemia mieloide aguda;

(c) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es PSMA y el cáncer es cáncer de próstata;

(d) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es BCMA y el cáncer es mieloma múltiple;

(e) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es FLT3 y el cáncer es leucemia mieloide aguda;

(f) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es EGFRvIII y el cáncer es glioblastoma;

(g) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es DLL3 y el cáncer es cáncer de pulmón microcítico;

(h) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es MUC17 y el cáncer es cáncer gastrointestinal;

(i) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es EpCAM y el cáncer es cáncer de pulmón (adenocarcinoma y células pequeñas), cáncer gastrointestinal, adenocarcinoma de la unión gastroesofágica, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata refractario a hormonas, cáncer ovárico, neoplasia maligna de nasofaringe, cáncer de colon, cáncer pancreático o carcinoma esofágico; o

(j) el antígeno asociado al tumor del segundo dominio de la construcción del anticuerpo monocatenario es CLND18.2 y el cáncer es cáncer gastrointestinal.

10. La combinación para el uso de 9, en donde:

(a) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (a) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 709, 710, 711, preferentemente la SEQ ID NO: 709;

(b) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (b) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 712-717, preferentemente de las SEQ ID NO: 712 y 715;

(c) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (c) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 718-723, preferentemente de las SEQ ID NO: 718 y 721;

(d) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (d) tiene la secuencia de aminoácidos de las ^sE^qID NO: 695-700, preferentemente de las SEQ ID NO: 695 y 698;

(e) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (e) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 704-706, preferentemente la SEQ ID NO: 704;

(f) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (f) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 707 y 708, preferentemente la SEQ ID NO: 707;

(g) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (g) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 701-703, preferentemente la SEQ ID NO: 701;

(h) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (h) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 724-726, preferentemente la SEQ ID NO: 724; o

(i) la construcción de anticuerpo monocatenario de acuerdo con (i) tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 727-729, preferentemente de la SEQ ID NO: 727.

Debido a la naturaleza de los al menos dos constituyentes de la combinación, particularmente su actividad farmacéutica, la combinación también puede denominarse combinación terapéutica. La combinación puede estar en forma de una composición farmacéutica. Las definiciones relacionadas con una composición farmacéutica proporcionada anteriormente en el presente documento se aplican mutatis mutandis también a este aspecto como si se mencionara específicamente a continuación. La combinación puede estar en forma de un kit que comprende al menos dos constituyentes de la combinación. El kit puede permitir la administración simultánea y/o secuencial de los constituyentes de la combinación. Las definiciones relacionadas con un kit proporcionadas en el presente documento (en la sección titulada "Kits") anterior se aplican mutatis mutandis también a este aspecto como si se mencionara específicamente a continuación.

El anticuerpo anti-PD-1 puede ser el anticuerpo anti-PD-1 como se ha descrito anteriormente en el presente documento en relación con otros aspectos de la invención, es decir, cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 descritos anteriormente en el presente documento que se definen por la presencia de uno o más de los identificadores de secuencia de aminoácidos enumerados en las Tablas D y E. En consecuencia, el producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender las CDR que se muestran en la Tabla D y/o comprende combinaciones de secuencias de región variable de cadena ligera (LC) y secuencias de región variable de cadena pesada (HC), o combinaciones de secuencia de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) como se muestra en la Tabla E como se ha definido anteriormente en el presente documento. El anticuerpo anti-PD-1 para la combinación puede ser 20C1.009, en donde dicho anticuerpo anti-PD-1 comprende: una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 352, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 353, una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 354, una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 355, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 356, y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 357. El anticuerpo anti-PD-1 puede tener una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HC) que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 358 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LC) que comprende o consiste en la SEC ID NO: 359; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 361.

La construcción de anticuerpo monocatenario puede ser una construcción biespecífica de anticuerpo monocatenario. La construcción de anticuerpo para la combinación con el anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) puede tener el formato de una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico.

La construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico a la que se hace referencia en el presente documento puede caracterizarse además porque un enlazador peptídico está situado entre el primer y el segundo dominio. Por tanto, es un polipéptido monocatenario o una construcción de anticuerpo monocatenario que comprende,

a) un primer dominio en el formato de un scFv,

b) un enlazador peptídico, preferentemente un enlazador de glicina/serina,

c) un segundo dominio en el formato de un scFv; y, opcionalmente,

(d) un tercer dominio que proporciona una semivida media sérica prolongada, preferentemente un dominio basado en Fc.

Por tanto, una construcción de anticuerpo monocatenario indica una sola cadena polipeptídica que comprende (al menos) dos dominios en el formato de un scFv (también denominados dominios de unión). En línea con lo anterior, cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH o H") y una región variable de una cadena ligera de anticuerpo ("región VL o L"), en donde la construcción de anticuerpo monocatenario se une específicamente a CD3 ya un antígeno asociado a tumores (TAA) a través de los dominios de unión. Los dos dominios de unión pueden estar enlazados entre sí por un enlazador, preferentemente un enlazador peptídico. Un ejemplo no limitativo de un enlazador peptídico es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) y sus repeticiones. La región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo pueden unirse entre sí a través de un enlazador peptídico, por ejemplo del tipo descrito y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso lo suficientemente largo como para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se emparejen entre sí de tal manera que, conjuntamente, sean capaces de unirse específicamente a las dianas respectivas del primer y segundo dominios de unión, particularmente CD3 y un TAA. Como ejemplo, se describen construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD19 x anti-CD3 con gran detalle en los documentos WO 99/54440 y WO 2004/106381 y WO2008/119565. Para disipar cualquier duda, la construcción de anticuerpo monocatenario incluye al menos dos dominios de unión, pero puede incluir dominios de unión adicionales y/o dominios funcionales alternativos. Por lo tanto, se abarcan construcciones de anticuerpos monocatenarios triespecíficos o multiespecíficos, y las construcciones de anticuerpos monocatenarios no están limitadas. Dado que las construcciones de anticuerpos monocatenarios comprenden un dominio que se une a un antígeno asociado a tumores (también denominado en el presente documento 'TAA") y otro dominio que se une a CD3, no existen de forma natural, y son marcadamente diferentes en su función de los productos naturales. Una construcción de anticuerpo monocatenario es, por lo tanto, una molécula "híbrida" artificial que comprende al menos dos dominios de unión distintos con diferentes especificidades.

Como se describe anteriormente en el presente documento, un dominio de la construcción de anticuerpo monocatenario se une a CD3. Más preferentemente, se une a CD3 en la superficie de una célula T. Además, se prevé que el dominio se una a CD3 humano, preferentemente a CD3 humano en la superficie de una célula T. También se prevé que el dominio se una a CD3 épsilon. Más preferentemente, se une al CD3 épsilon humano, p. ej. a CD3 épsilon humano en la superficie de una célula T. En la SEQ ID NO: 577 se representa una secuencia de aminoácidos preferida para el dominio extracelular de CD3 épsilon humano.

Un dominio de la construcción de anticuerpo monocatenario puede unirse a CD3 épsilon humano (o CD3 épsilon humano en la superficie de una célula T) y CD3 épsilon de Callithrix jacchus o saimirí sciureus. También se prevé que dicho dominio se una a un epítopo extracelular de CD3 épsilon, preferentemente a un epítopo extracelular de CD3 épsilon humano. También se prevé que dicho dominio se una a un epítopo extracelular de la cadena de CD3 épsilon humana y de Macaca. Un epítopo preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los restos de aminoácidos 1 27 del dominio extracelular de c D3 épsilon humano (véase la SEQ ID NO: 578). Incluso más específicamente, el epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Se describen agentes de unión que tienen tales características con detalle en el documento WO 2008/119567.

Se conocen anticuerpos o construcciones de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra CD3 (humano) o específicamente contra CD3 épsilon, y sus CDR, Las secuencias de VH y VL pueden servir como base para el dominio de unión a CD3 de la construcción de anticuerpo monocatenario. Por ejemplo, Kung et al. informaron en 1979 del desarrollo de OKT3 (Ortho Kung T3), el primer mAb que reconoce CD3 (específicamente, la cadena épsilon de CD3) en células T humanas. OKT3 (muromonab) fue el primer anticuerpo monoclonal de origen murino disponible para terapia en seres humanos. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 más nuevos incluyen otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), foralumab y visilizumab, todos dirigidos a la cadena épsilon de CD3. También se están desarrollando y ensayando (pre)clínicamente construcciones de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra una diana (cáncer) y CD3, y su dominio de unión a CD3 (CDR, VH, VL) puede servir como base para el dominio de unión a CD3 de la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, blinatumomab, solitomab (MT110, AMG 110), catumaxomab, duvortuxizumab, ertumaxomab, mosunetuzumab, FBTA05 (Bi20, TPBs05), CEA-TCB (RG7802, RO6958688), AFM11 y MGD006 (S80880). Se describen otros ejemplos de dominios de unión a CD3, p. ej. en los documentos US 7.994.289 B2, US 7.728.114 B2, US 7.381.803 B1, US 6.706.265 B1.

Para la construcción del anticuerpo monocatenario, se prevé que el dominio que se une a CD3 comprenda una región VL que comprenda CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 590, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 591 y la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 592;

(b) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 647, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 648 y la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 649; y

(c) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 669, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 670 y la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 671.

Para la construcción del anticuerpo monocatenario, también se prevé que el dominio que se une a CD3 comprenda una región VH que comprenda CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 582, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 583 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 584;

(b) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 593, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO:594 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 595;

(c) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 605, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 606 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 607;

(d) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 616, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 617 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 618;

(e) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 627, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 628 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 629;

(f) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 639, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 640 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 641;

(g) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 650, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 651 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 652;

(h) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 661, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 662 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 663;

(i) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 672, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 673 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 674; y

(j) la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 687, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 688 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 689.

Adicionalmente, para la construcción del anticuerpo monocatenario, se prevé que el dominio que se une a CD3 comprenda una región VL que comprenda CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 y una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 579, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 580, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 581, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 582, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 583 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 584;

(b) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 590, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 591, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 592, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 593, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 594 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 595;

(c) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 602, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 603, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 604, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 605, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 606 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 607;

(d) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 613, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 614, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 615, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 616, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 617 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 618;

(e) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 624, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 625, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 626, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 627, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 628 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 629;

(f) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 636, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 637, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 638, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 639, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 640 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 641;

(g) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 647, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 648, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 649, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 650, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 651 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 652;

(h) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 658, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 659, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 660, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 661, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 662 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 663;

(i) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 669, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 670, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 671, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 672, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 673 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 674; y

(j) la CDR-L1 representada en la SEQ ID NO: 684, la CDR-L2 representada en la SEQ ID NO: 685, la CDR-L3 representada en la SEQ ID NO: 686, la CDR-H1 representada en la SEQ ID NO: 687, la CDR-H2 representada en la SEQ ID NO: 688 y la CDR-H3 representada en la SEQ ID NO: 689.

Para la construcción del anticuerpo monocatenario se prevé que el dominio que se une a CD3 comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL representada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 677 y SEQ ID NO: 678.

También se prevé que el dominio que se une a CD3 comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH representada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID n O: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 690 y SEQ ID NO: 691.

En realizaciones específicas, la construcción de anticuerpo monocatenario se caracteriza por un dominio que se une a CD3 que comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una región VL representada en la SEQ ID NO: 587 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 585 o 586;

(b) una región VL representada en la SEQ ID NO: 598 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 596 o 597;

(c) una región VL representada en la SEQ ID NO: 610 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 608 o 609;

(d) una región VL representada en la SEQ ID NO: 621 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 619 o 620;

(e) una región VL representada en la SEQ ID NO: 632 o 633 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 630 o 631;

(f) una región VL representada en la SEQ ID NO: 644 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 642 o 643;

(g) una región VL representada en la SEQ ID NO: 655 o 633 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 653 o 654;

(h) una región VL representada en la SEQ ID NO: 666 o 599 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 664 o 665;

(i) una región VL representada en la SEQ ID NO: 677 o 678 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 675 o 676;

(j) una región VL representada en la SEQ ID NO: 692 o 678 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 690 o 691; y

(k) una región VL representada en la SEQ ID NO: 682 y una región VH representada en la SEQ ID NO: 681.

Preferentemente, la construcción de anticuerpo monocatenario descrita anteriormente se puede caracterizar por el dominio que se une a CD3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 588, 589, 600, 601.611,612, 622, 623, 634, 635, 645, 646, 656, 657, 667, 668, 679, 680, 683, 693 y 694.

La construcción de anticuerpo monocatenario puede comprender un dominio que proporciona una semivida sérica prolongada. Los ejemplos de medios o dominios para prolongar la semivida en suero de las construcciones de anticuerpos monocatenarios incluyen péptidos, proteínas o dominios de proteínas, que se fusionan o se unen de otro modo a las construcciones de anticuerpos. El grupo de los péptidos, las proteínas o los dominios de proteínas incluyen péptidos que se unen a otras proteínas con un perfil farmacocinético preferido en el cuerpo humano, tales como la albúmina sérica (véase el documento WO 2009/127691). Un concepto alternativo de dichos péptidos que prolongan la semivida incluye péptidos que se unen al receptor de Fc neonatal (FcRn, véase el documento WO 2007/098420), que también se puede usar en las construcciones de anticuerpos de la presente invención. El concepto de unir dominios más grandes de proteínas o proteínas completas incluye la fusión de albúmina sérica humana, variantes o mutantes de albúmina sérica humana (véanse los documentos WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) o dominios de las mismas, así como la fusión de una región constante de inmunoglobulina (dominio Fc) y variantes de la misma. Dichas variantes de dominios Fc se denominan dominios basados en Fc y pueden, p. ej. optimizarse/modificarse para permitir el emparejamiento deseado de dímeros o multímeros, para anular la unión al receptor de Fc (por ejemplo, para evitar la ADC^co CDC) o por otras razones. Otro concepto conocido en la técnica para prolongar la semivida de sustancias o moléculas en el cuerpo humano es la pegilación de esas moléculas (tales como las construcciones de anticuerpos descritas en el presente documento).

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios pueden unirse (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) con un compañero de fusión (tal como una proteína, polipéptido o péptido), p. ej., con el propósito de prolongar la semivida en suero de la construcción. Estos compañeros de fusión se pueden seleccionar de albúmina sérica humana ("HSA" o "HALB") así como variantes de secuencia de la misma, péptidos que se unen a HSA, péptidos que se unen a FcRn ("FcRn BP") o construcciones que comprenden una región Fc (derivada de anticuerpo). En general, los compañeros de fusión pueden unirse al extremo N o al extremo C de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención, ya sea directamente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) o a través de un enlazador peptídico como (GGGGS)n (en donde "n" es un número entero de 2 o mayor, p. ej., 2, 3 o 4).

La construcción de anticuerpo monocatenario puede comprender (además del primer y segundo dominio) un tercer dominio, en conceto un dominio basado en Fc como se describe en el documento WO 2017/134140 que prolonga la semivida en suero, que comprende dos monómeros polipeptídicos, comprendiendo cada uno una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en donde dichos dos monómeros polipeptídicos se fusionan entre sí a través de un enlazador peptídico. Se prevé que dicho tercer dominio comprenda, en un orden N-terminal a C-terminal: bisagra-CH2-CH3-enlazador-bisagra-CH2-CH3. También se prevé que los dominios primero y segundo de la construcción de anticuerpo monocatenario se fusionen con el tercer dominio a través de un enlazador peptídico.

Una "bisagra" es una región bisagra de IgG. Esta región se puede identificar por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse, p. ej., las posiciones de Kabat 223-243. En línea con lo anterior, el requisito mínimo para una "bisagra" son los restos de aminoácidos correspondientes al tramo de secuencia de D231 a P243 de IgG¹de acuerdo con la numeración de Kabat. Los términos "CH2" y "CH3" se refieren a las regiones constantes 2 y 3 de cadena pesada de inmunoglobulina. Estas regiones también se pueden identificar por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse, p. ej., las posiciones de Kabat 244-360 para CH2 y las posiciones Kabat 361-478 para CH3. Se entiende que existe alguna variación entre las inmunoglobulinas en términos de su región Fc de IgG¹, región Fc de IgG², región Fc de IgG3, región Fc de IgG4, región Fc de IgM, región Fc de IgA, región Fc de IgD y región Fc de IgE (véase, p. ej., Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). El término región Fc se refiere a las dos últimas regiones constantes de cadena pesada de IgA, IgD e IgG, y las tres últimas regiones constantes de cadena pesada de IgE e IgM. La región Fc también puede incluir la bisagra flexible N-terminal con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, la región Fc puede incluir la cadena J. Para la IgG, la región Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dos primeros dominios y CH2. Aunque los límites de la región Fc de una inmunoglobulina pueden variar, un ejemplo de una porción Fc de cadena pesada de IgG humana que comprende una bisagra funcional, los dominios CH2 y c H3 se pueden definir, p. ej. para comprender los restos de D231 (del dominio bisagra) a P476 (del extremo C-terminal del dominio CH3), o de D231 a L476, respectivamente, para IgG4, en donde la numeración está de acuerdo con Kabat.

Por lo tanto, la construcción de anticuerpo monocatenario a la que se hace referencia en el presente documento puede comprender, en un orden N- a C-terminal:

(a) el primer dominio;

(b) un enlazador peptídico;

(c) el segundo dominio;

(d) un enlazador peptídico;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende un dominio bisagra, CH2 y CH3);

(f) un enlazador peptídico; y

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende un dominio bisagra, CH2 y CH3).

La combinación del anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) con construcciones de anticuerpos monocatenarios es especialmente ventajosa, ya que se pudo demostrar que las construcciones de anticuerpos monocatenarios mostraban una eficacia superior en la destrucción de células cuando se utilizaban en combinación con anticuerpos anti-PD-1 definidos en el presente documento anteriormente (tales como 20C1.009). Se pudo observar una mejora en la eficacia de destrucción celular para diferentes células diana, por ejemplo, cuando las células diana procedían de una neoplasia sólida o hemo y también cuando las células procedían de tipos de tumores que normalmente no se reconocen como sensibles al tratamiento anti-PD-1 (tales como, por ejemplo, p. ej., células tumorales de próstata; figuras 40A y 40B), así como cuando las células T no están limitadas (relación E:T de 1:1), lo que sugiere que la combinación del anticuerpo anti-PD-1 y una construcción de anticuerpo biespecífico monocatenario será eficaz incluso en indicaciones caracterizadas por una abundancia de células T. Asimismo, la mejora podría mostrarse en construcciones de anticuerpos monocatenarios independientemente de si las construcciones contenían o no un dominio de prolongación de la semivida, tal como una porción basada en Fc. Además, podría demostrarse que las construcciones de anticuerpos monocatenarios inducen de manera uniforme la expresión de PD-1 en las células diana.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios que se combinarán con el anticuerpo anti-PD-1 (tal como 20C1.009) pueden ser construcciones de anticuerpos monocatenarios que tengan (al menos) un dominio de unión a TAA dirigido contra los TAA seleccionados del grupo que consiste en CD19, CD33, PSMA, Bc MA, FLT3, EGFRvIII, DLL3, MUC17, CLND18.2 y EpCAM. Las construcciones de anticuerpos monocatenarios para la combinación con el anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, 20C1.009) pueden ser construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD19 x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD33 x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-PSMA x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-BCMA x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-FLT3 x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EGFRvIII x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-DLL3 x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-MUC17 x anti-CD3, construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CLND18.2 x anti-CD3 y construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EpCAM x anti-CD3.

También se describe un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto que lo necesita la combinación descrita en el presente documento. El sujeto puede tener un cáncer y la combinación puede administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el cáncer en el sujeto. Por lo tanto, dicha combinación es para uso terapéutico y es para uso en el tratamiento del cáncer. Las definiciones de tratamiento, administración y cáncer (incluido cualquiera de los tipos de cáncer enumerados) proporcionadas en el presente documento anteriormente se aplican mutatis mutandis a este aspecto como si se mencionaran específicamente a continuación.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD19 x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante o refractario, linfoma de células del manto y/o linfoma folicular. La justificación para el tratamiento de dichos cánceres con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD19 x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD19 x anti-CD3 preferidas se proporciona en los documentos WO 99/54440 y WO 17/134140.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD33 x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p.

ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y el síndrome mielodisplásico. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD33 x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-CD33 x anti-CD3 preferidas se describe en los documentos WO 2008/119567 y WO 2017/134140.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-PSMA x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento del cáncer de próstata. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-PSMA x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-PSMA x anti-CD3 preferidas se describe en los documentos WO 2010/037836 y WO 2017/134158.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-BCMA x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento del mieloma múltiple. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-BCMA x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-BCMA x anti-CD3 preferidas se describe en los documentos WO 2013/072406 y WO 2017/134134.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-FLT3 x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y el síndrome mielodisplásico. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-FLT3 x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-FLT3 x anti-CD3 preferidas se describe en el documento WO 2017/021362.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EGFRvIII x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento del glioblastoma. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EGFRvIII x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EGFRvIII x anti-CD3 preferidas se describe en el documento WO 2017/021370.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-DLL3 x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento del cáncer microcítico de pulmón y tumores neuroendocrinos que expresan DLL3. La justificación para el tratamiento de dicho cáncer con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-DLL3 x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-DLL3 x anti-CD3 preferidas se describe en el documento WO 2017/021349.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-MUC17 x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento de cánceres gastrointestinales. La justificación para el tratamiento de dichos cánceres con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-MUC17 x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-MUC17 x anti-CD3 preferidas se describe en el documento PCT/US18/68118.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EpCAM x anti-CD3 combinadas con un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) pueden usarse para el tratamiento del cáncer de pulmón (adenocarcinoma y microcítico), cáncer gastrointestinal, adenocarcinoma de la unión gastroesofágica, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata refractario a hormonas, cáncer ovárico, neoplasia maligna de nasofaringe, cáncer de colon, cáncer de páncreas o carcinoma de esófago. La justificación para el tratamiento de dichos cánceres con construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EpCAM x anti-CD3 así como construcciones de anticuerpos monocatenarios anti-EpCAM x anti-CD3 preferidas se describe en el documento WO 2005/040220.

Además, las construcciones de anticuerpos monocatenarios a las que se hace referencia en el presente documento pueden ser construcciones bivalentes y polivalentes/multivalentes, así como construcciones biespecíficas y poliespecíficas/multiespecíficas, que se unen específicamente a dos, tres o más estructuras antigénicas, a través de distintos dominios de unión. Tales construcciones pueden tener más valencias de unión que especificidades, p. ej. en caso de que tenga dos dominios de unión para la primera diana y un dominio de unión para la segunda diana (CD3), o viceversa, en cuyo caso la construcción es trivalente y biespecífica. En general, el término "biespecífico", como se usa en relación con la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico a la que se hace referencia en el presente documento, incluye el significado de que dicha construcción se une a (al menos) dos antígenos diferentes, uno de los cuales es CD3 y otro es un TAA.

Las construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos descritas en el presente documento son preferentemente "construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos generadas "in vitro"' y/o "construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos recombinantes". Como se utiliza en el presente documento, la expresión "generado "in vitro"" se refiere a una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico de acuerdo con la definición anterior en la que todo o parte del dominio de unión o de una región variable (p. ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunitarias, p. ej., en una presentación en fagos in vitro, en un chip de proteínas o en cualquier otro método en el que las secuencias de aminoácidos candidatas puedan ensayarse en cuanto a su capacidad para unirse a un antígeno. Por lo tanto, este término excluye preferentemente secuencias generadas únicamente por reordenamiento genómico en una célula inmunitaria en un animal. Se prevé que el primer y/o segundo dominio de la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico se produzca o se pueda obtener mediante métodos de presentación en fagos o de cribado de bibliotecas en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo preexistente (monoclonal) en un armazón. Una "construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico recombinante" es una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico generada o producida utilizando (entre otras) la tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.

Se prevé que las construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos sean monoclonales. Como se utiliza en el presente documento, los anticuerpos o construcciones de anticuerpos que se denominan "monoclonales" (mAb) se obtienen a partir de una población de anticuerpos/construcciones de anticuerpos sustancialmente homogéneas, es decir, los anticuerpos individuales/construcciones de anticuerpos incluidos en la población son idénticos (en particular con respecto a su secuencia de aminoácidos) excepto por posibles mutaciones naturales y/o modificaciones postraduccionales (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en escasas cantidades. Los anticuerpos/construcciones de anticuerpos monoclonales son altamente específicos, al dirigirse contra un solo epítopo dentro del antígeno, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que generalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (o epítopos) diferentes. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, por lo que no se contaminan por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo/construcción de anticuerpo como obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por cualquier método concreto.

El término "epítopo" puede referirse en este caso a la parte o región del antígeno que es reconocida/reconocida inmunoespecíficamente por el dominio de unión. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, el término epítopo también se denomina algunas veces "estructura antigénica" o "determinante antigénico". La parte del dominio de unión que se une al epítopo se denomina parátopo. Se cree que la unión específica se logra mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por lo tanto, la unión se logra como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como el resultado de posibles modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del parátopo con su determinante antigénico puede dar como resultado una simple unión de dicho sitio al antígeno. En algunos casos, la interacción específica puede dar como resultado alternativa o adicionalmente el inicio de una señal, p. ej. debido a la inducción de un cambio en la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

Los métodos para producir construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos son bien conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, se sabe que en el caso del "Fv monocatenario" (scFv), los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, pero se pueden juntar, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador artificial, como se ha descrito anteriormente, que les permite formar una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente; véase, p. ej., Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se evalúan para determinar su función del mismo modo que los anticuerpos completos o IgG. Un fragmento variable monocatenario (scFv) es, por tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, generalmente conectada con un péptido enlazador corto. El enlazador es habitualmente rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o también en treonina para la solubilidad (como se ha descrito en el presente documento anteriormente). Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y de la introducción del enlazador.

Las técnicas descritas para producir construcciones de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otros documentos, la patente de EE. UU. 4.946.778, Kontermann y Dubel (2010), loc. cit. and Little (2009), loc. cit.) se pueden adaptar para producir construcciones de anticuerpos monocatenarios que reconocen específicamente una o más dianas elegidas.

Pueden modificarse por ingeniería genética fragmentos variables monocatenarios bivalentes (también llamados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o di-scFv) que tienen el formato (scFv)²mediante la unión de dos moléculas de scFv (p. ej., con enlazadores como se ha descrito anteriormente). La unión se puede realizar mediante la producción de una sola cadena polipeptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciéndose scFv en tándem (véase, p. ej., Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244).

También se prevé que la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico descrita en el presente documento tenga, además de su función para unirse a las moléculas diana, en concreto, el antígeno asociado a tumores (TAA) y CD3, una función adicional. En este formato, la construcción de anticuerpo puede ser una construcción de anticuerpo trifuncional o multifuncional al dirigirse a las células diana a través de la unión de TAA, mediar la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión a CD3 y proporcionar una función adicional tal como medios o dominios para mejorar o prolongar la semivida en suero, un dominio constante de Fc totalmente funcional o modificado que media en la ADCC a través del reclutamiento de células efectoras, un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o un radionúclido, un dominio adicional para unirse a un TAA adicional, etc.

Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar la presente divulgación y de ningún modo para limitar su alcance.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra que la terapia combinada que comprende un anticuerpo de PD-1 bloqueante e IL-21 recombinante es superior a la monoterapia correspondiente.

En un estudio preclínico, se compararon los efectos de un tratamiento combinado de un anticuerpo de PD-1 monoclonal bloqueante e IL-21 murina recombinante (rmIL-21) con los efectos del tratamiento de monoterapia con el anticuerpo de PD-1 bloqueante o la rmIL-21.

El día 1, se implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en ratones BALB/c para iniciar el crecimiento tumoral. El día 12, se midieron los tumores y los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (10 ratones por grupo): el grupo 1 recibió una inyección intraperitoneal (IP) de 300 |jg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1), El grupo 2 recibió una inyección IP de 300 jg de un anticuerpo de PD-1 bloqueante, El grupo 3 recibió 5o jg de rmIL-21 y el grupo 4 recibió tanto el anticuerpo de PD-1 bloqueante (300 jg ) como rmIL-21 (50 jg). Los grupos 1,2 y 4 recibieron anticuerpos una vez cada 3 días y los grupos 3 y 4 recibieron rmIL-21 3 veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33.

Durante todo el estudio se controló el volumen tumoral. Como se muestra en las figuras 1A-1D, la mayor medida para el aumento del tamaño tumoral se observó para el grupo 1 y la menor medida para el grupo 4.

Supervivencia, lo medido por el análisis de Mantel-Cox de rango logarítmico de Kaplan Meier fue el criterio principal de valoración de este estudio. Como se muestra en la figura 2 y en la Tabla 1, el porcentaje de supervivencia y la mediana de supervivencia fue mayor para el grupo 4. De manera destacable, dos sujetos estaban libres de tumor en el grupo 4 (Tabla 1).

TABLA 1

Estos resultados demuestran que una combinación de un anticuerpo de PD-1 monoclonal bloqueante y mIL-21 recombinante proporciona una ventaja de supervivencia superior frente a cualquiera de los componentes administrados solos como monoterapia.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra el diseño y la construcción de múltiples plataformas destinadas a proporcionar una combinación de inhibición de PD-1 y señalización de IL-21.

Los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 demuestran las ventajas de un enfoque combinatorio de señalización de IL-21 e inhibición de PD-1 para el tratamiento de sujetos con tumores. Sin embargo, se requería una cuidadosa consideración de cómo se debería suministrar la IL-21 debido a la capacidad de las IL-21 tanto para potenciar las respuestas de células T CD8 como para suprimir la presentación de antígenos y el cebado de células T. Además, IL-21R se expresa ampliamente en tejidos humanos (por ejemplo, por células presentadoras de antígenos (APC), células NK, B y T), por lo que se requiere una consideración cuidadosa para evitar efectos inespecíficos (p. ej., actividad de IL-21 fuera del entorno tumoral) y eliminación de IL-21 cuando se une a su receptor en diferentes tejidos.

Se ideó un enfoque doble para abordar las consideraciones anteriores. En primer lugar, se generaron muteínas de IL-21 con actividad atenuada, a través de la unión reducida de las muteínas de IL-21 a IL-21R. Se imaginó que tales muteínas de IL-21 tendrían una actividad reducida cuando se difundieran por todo el cuerpo, pero que tal actividad sería "rescatada" si las muteínas de IL-21 pudieran concentrarse en células T diana (por ejemplo, en un cáncer). Es decir, las muteínas de IL-21, una vez presentes y concentradas en las células diana, en el agregado, presentarían actividad terapéutica de IL-21. En segundo lugar, las muteínas de IL-21 se fusionaron con un brazo de direccionamiento, tal como un anticuerpo monoclonal, para dirigir las muteínas de IL-21 a células relevantes (p. ej., células cancerosas). Para llevar las muteínas de IL-21 a una célula cancerosa diana, se fusionaron con un mAb anti-PD-1. El uso de un mAb anti-PD-1 tuvo el efecto beneficioso adicional de prevenir la señalización a través de PD-1/PD-L1 (actuando así como un inhibidor de puntos de control).

Sin quedar ligados a teoría particular alguna, se planteó la hipótesis de que una proteína de fusión que comprendiera un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con una muteína de IL-21 proporcionaría una respuesta más duradera contra las células destinadas a la destrucción. Por ejemplo, [1] las células T CD8+ que expresan PD-1 se unirían al mAb anti-PD-1 de la proteína de fusión, y [2] la unión simultánea de la muteína IL-21 de la proteína de fusión al receptor de IL-21 expresado por las células T CD8+ conduciría a una mayor proliferación de las células T, así como a una mayor producción y secreción de IFNy por parte de las células T, lo que mejoraría la citotoxicidad global contra las células diana. Además, se planteó la hipótesis de que las vías de señalización intracelular activadas por IL-21 evitarían la diferenciación terminal y la pérdida asociada de la función efectora y la apoptosis. Véase la figura 3.

Otras consideraciones de diseño adicionales incluyeron la valencia del mAb (por ejemplo, mAb monovalente o bivalente), requisito para la función efectora de Fc, sitio para la fusión de citocinas (extremo C o N de mAb), inclusión de un enlazador y reparación de sitios de modificación o recorte secundarios previstos.

Se consideraron varios formatos de proteínas de fusión y se clonaron y expresaron cuatro construcciones de fusión para experimentos de prueba de concepto. Se fusionó IL-21 de tipo silvestre (WT) con el extremo C de una IgG de un mAb de PD-1 bivalente como (1) un homodímero de IL-21 sin ningún enlazador; (2) un homodímero de IL-21 con un enlazador GGGGS (SEQ ID NO: 262); (3) un monómero de IL-21 sin ningún enlazador, pero con mutaciones de pares de carga en Fc de IgG para impulsar la heterodimerización; y (4) un monómero de IL-21 con un enlazador GGGGS (SEQ ID NO: 262) y mutaciones de pares de carga. Las cuatro construcciones de proteínas de fusión incluyeron las siguientes modificaciones en la región Fc de mAb, numeradas según el sistema EU: N297G, R292C, V302C (mutaciones SEFL2-2). Las mutaciones de pares de carga utilizadas fueron las mutaciones V1 (es decir, K409D y K392D en una cadena pesada y D399K y E356K en la otra cadena pesada). Las cuatro construcciones de proteínas de fusión se diseñaron para eliminar una lisina C-terminal para evitar el recorte.

Las construcciones de fusión se cribaron con respecto a la actividad de IL-21 en ensayos celulares utilizando dos variantes (PD-1+ve y PD-1've) de una línea de células T Hut78 positiva para IL-21R (IL-21 R+). En cada línea celular, se midió la fosforilación de STAT3 como una medida sustituta de la actividad de IL-21. Las dos variantes de células Hut78 se expusieron a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola, (ii) mAb anti-PD-1 solo, (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con un enlazador, (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin enlazador, (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin enlazador. Los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 y las CE50 de cada molécula para la señalización de STAT se muestran en las figuras 5^ay 5B y en la Tabla 2, respectivamente.

TABLA 2

Como se muestra en la figura 5A y la Tabla 2 (columna central), la proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 con un homodímero de IL-21 mostró una potencia 10 veces menor en relación con la rhIL-21 en células PD-1've. La rhIL-21 también fue más potente en comparación con la proteína de fusión que comprende el monómero de IL-21. A pesar de tener solo una fracción de IL-21, la proteína de fusión monomérica mostró mayor potencia con respecto al homodímero que tenía dos fracciones de IL-21. Estos resultados sugieren que el monómero presenta una mayor actividad de IL-21 en células PD-1've y/o sugieren que el formato de proteína de fusión de homodímero puede conferir una atenuación parcial de la actividad de IL-21 (p. ej., posiblemente a través de interacciones estéricas entre fracciones de IL-21).

Este estudio también permitió la evaluación del enlazador entre la porción de IL-21 y el extremo C de IgG. Como se muestra en la Tabla 2 (columna central) y las figuras 5A y 5B (línea continua = sin enlazador; línea de puntos = enlazador), la presencia de un enlazador no parece afectar a la actividad de IL-21. Por consiguiente, todas las construcciones futuras se realizaron sin el enlazador para reducir la cantidad de secuencias no nativas en las proteínas de fusión.

El efecto de la expresión de PD-1 sobre la actividad de IL-21 se evaluó comparando los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 entre las células PD-1've y las células PD-1+ve. Como se muestra en la figura 5B, la actividad de IL-21 de cada una de las proteínas de fusión de homodímero y monómero de IL-21 en células PD-1+ve era esencialmente la misma.

En conjunto, estos resultados demuestran que la señalización de IL-21, en ausencia de expresión de PD-1 en una célula diana, se puede atenuar fusionando iL-21 a un mAb anti-PD-1. Además, la señalización de IL-21 de una IL-21 fusionada con un mAb anti-PD-1 se rescata en células que expresan PD-1.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra el diseño, construcción y caracterización de múltiples muteínas de IL-21.

Para comprender mejor el perfil farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) de la proteína de fusión, se ensayó una proteína de fusión que comprendía una IgG fusionada con un homodímero de IL-21 WT in vivo en un monos cynomolgus.

La proteína de fusión de homodímero que comprendía IL-21 WT fusionada con un mAb anti-PD-1 se administró por vía intravenosa a 6 animales en una dosis baja (250 pg/kg) o una dosis alta (1000 pg/kg). Como control se utilizó un dominio de anticuerpo IgG (150 pg/kg). Se midieron las concentraciones séricas a lo largo del tiempo y se determinaron la Cmáx, AUCúltima, semivida (ti^{/ 2}), Vss y Cl. Los resultados se muestran en la figura 6 y la Tabla 3.

TABLA 3

En relación con el control de IgG (datos no mostrados), la proteína de fusión de homodímero que comprendía un mAb anti-PD-1 e IL-21 WT presentó una mayor eliminación (aclaramiento) y exposiciones más bajas. Así se determinó que, para mejorar la exposición de la proteína de fusión y minimizar los efectos de IL-21 inespecíficos (es decir, minimizar la señalización de IL-21 en las células inmunitarias que no expresan el receptor PD-1), se necesitaría mutagénesis de IL-21 para atenuar la señalización a través de IL-21R. Por consiguiente, se diseñó una proteína de fusión que comprendía una IL-21 mutada para unirse con menos fuerza a IL-21R en células que no expresan PD-1. Se planteó la hipótesis de que la proteína de fusión se uniría primero a la diana con PD-1 (al unirse al anticuerpo anti-PD-1) con alta afinidad, lo que luego impulsaría la segunda interacción de menor afinidad entre la muteína de IL-21 y el IL-21R (cadena alfa). En ausencia del receptor PD-1, se planteó la hipótesis de que las proteínas de fusión no se unirían a las células que no expresan el receptor PD-1, independientemente de la expresión de IL-21R.

Se utilizó ingeniería genética guiada por estructuras para crear un panel de 141 muteínas de IL-21, teniendo cada una de ellas una única sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de IL-21 WT. Cada muteína se diseñó para tener una afinidad reducida por la subunidad alfa de IL-21R (101 muteínas) o la subunidad gamma de IL-21R (40 muteínas). Cada muteína del panel se expresó como una proteína de fusión con un mAb PD-1 (PD-1 x muteína de IL-21) y posteriormente se evaluó su capacidad para unirse a IL-21R usando el sistema FortéBio Octet® (Pall FortéBio; Fremont, CA) y se examinó la actividad usando la línea de células T IL-21R+ (Hut78) usando la fosforilación de STAT3 como sustituto de la actividad de IL-21. Para seleccionar muteínas que tuvieran el menor potencial de actividad inespecífica, los criterios de selección se establecieron en una atenuación superior a 20 veces en la señalización de IL-21 frente a rhIL-21 a 3,7 nM en células PD-1've.

En la Tabla 4 se muestra una lista completa de las 141 muteínas.

TABLA 4

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Los resultados ilustrativos de los ensayos de fosforilación de STAT3 utilizando muteínas de IL-21 se muestran en la figura 7 (muteínas con afinidad reducida por IL-21 Ra) y la figura 8 (muteínas con afinidad reducida por IL-21Ry). Como se muestra en estas figuras, varias muteínas demostraron una atenuación de más de 20 veces en la actividad de IL-21 en células PD-1-ve pero conservaron la actividad en células PD-1+ve. Como se muestra en las figuras 9A-9B, el mutante 51 (R65P) (triángulos negros) fue uno de esos mutantes que demostró una reducción de más de 20 veces en la actividad de IL-21 en las células PD've pero presentó un nivel de actividad de IL-21 que fue similar al logrado por rhIL-21 en células que expresan PD-1. En la Tabla 5 se proporciona una lista de ejemplos de muteínas seleccionadas para una atenuación superior a 20x de la señal STAT3 en células bajas/negativas para PD-1.

TABLA 5

continuación

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra la selección de muteínas de IL-21 candidatas para su uso en la construcción de proteínas de fusión y el ensayo in vivo de las mismas.

Se aumentó la escala de las 22 muteínas de IL-21 con mejor comportamiento para realizar más pruebas. Basándose en estos ensayos adicionales (en los ensayos de pSTAT3 Hut78 como se describe en el presente documento), se seleccionaron cuatro proteínas de fusión candidatas para que la colección de cuatro presentara un intervalo de atenuación (cambio de potencia, con respecto a rhIL-21, en el ensayo pSTAT3 Hut78). El mutante C10 (D15N) representó la muteína de baja atenuación, El mutante 77 (R76A) representó la muteína de atenuación intermedia y los mutantes 79 y 78 (R76E y R76D, respectivamente) representaron la muteína de atenuación alta. De los cuatro, tres fueron ampliados para un estudio in vivo en monos cynomolgus para evaluar las propiedades farmacocinéticas de las construcciones de proteína de fusión de muteína. Se administraron dosis únicas (10 mg/kg) de mutante 79 (R76E), mutante 77 (R76A) o mutante C10 (D15N) por vía intravenosa (en embolada) a monos cynomolgus no tratados previamente y se recogieron las concentraciones séricas durante un período de diez días. Con fines comparativos, se administraron dosis de un mAb anti-PD-1 y una proteína de fusión que comprendía el mAb anti-PD-1 y la IL-21 WT (individualmente) a monos cynomolgus mediante administración intravenosa en embolada. El estudio se realizó con dos controles: el mAb anti-PD-1 solo y la construcción de proteína de fusión que comprendía el mAb anti-PD-1 y la IL-21 WT. Como se muestra en la figura 10, cada una de las proteínas de fusión de mAb anti-PD-1-muteína de IL-21 presentó un perfil farmacocinético alterado, en comparación con el mAb anti-PD-1 progenitor (triángulos negros). La Tabla 6 proporciona las propiedades farmacocinéticas ajustadas por análisis no compartimental.

TABLA 6

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de doble mutante de IL-21 y la expresión y caracterización de proteínas de fusión que comprenden homodímeros de doble mutante de IL-21 (a menos que se especifique lo contrario).

Se seleccionaron tres muteinas que tienen una sola sustitución de aminoácido, incluyendo el mutante n.° 77 (R76A) y el mutante n.° 79 (R76E), para modificación adicional por ingeniería genética basándose en datos de actividad celular (p. ej., la mayor atenuación de actividad en células Hut78 T PD-1-ve) y la fabricabilidad. Se utilizó ingeniería genética guiada por estructuras para generar una mutación adicional dentro de la secuencia mutante única de IL-21 (es decir, para generar un mutante doble) para atenuar aún más la unión de citocinas a la cadena alfa de IL-21R (IL-21Ra). La secuencia mutante doble se fusionó con la secuencia de un mAb anti-PD-1 y las proteínas de fusión se expresaron y ensayaron en ensayos celulares. En la Tabla 7 se proporciona una lista de las proteínas de fusión mutantes dobles preparadas y ensayadas.

TABLA 7

Como se deseaban proteínas de fusión mutantes dobles con propiedades de alta atenuación, el criterio de selección se fijó en una potencia (CE⁵⁰) superior a 1000 nM en células T Hut78 positivas para IL-21 R, negativas para PD-1 (PD-1've), con respecto a la potencia de rhIL-21. Además, como ocurría con las muteínas que contenían una sola sustitución de aminoácidos, las proteínas de fusión mutantes dobles se caracterizaron por la unión a IL-21R (ForteBio Octet). Finalmente, las proteínas de fusión mutantes dobles se caracterizaron con respecto a la actividad de PD-1 usando un ensayo del gen indicador de PD-1 Jurkat. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8

Hu = Humano; Cyno = mono cynomolgus

CE50 pSTAT3 (cambio de 2,5 veces)

Octet: unión a IL-21 R-his Cyno y humano monovalente

Como se muestra en la Tabla 8, las proteínas de fusión mutantes dobles presentaron una actividad de IL-21 muy baja en las células T que expresaban niveles bajos de PD-1 (p. ej., por debajo de los niveles detectables de PD-1) pero conservaron una actividad de IL-21 significativa en las células que expresaban PD-1. Las proteínas de fusión mutantes dobles mostraron una unión débil a IL-21R (Kd > 300 nM), pero conservaron la capacidad de unirse a PD-1 y bloquear la señalización de PD-1.

EJEMPLO 6

Este ejemplo demuestra un ensayo in vitro de células primarias que compara una proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 y un homodímero mutante doble de IL-21 o un homodímero mutante único de IL-21.

Una proteína de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 e IL-21 con sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E se ensayó en un ensayo in vitro de células primarias (una reacción linfocitaria mixta (MLR)). La MLR comprendía una población mixta de células IL-21R+, incluidas células dendríticas (DC) que expresan IL-21R pero no expresan PD-1, células T que expresan PD-1 y células T que no expresan PD-1. La MLR se expuso a (i) la proteína de fusión que comprende las sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E, (ii) la proteína de fusión que comprende solo la sustitución de aminoácido R76E, (iii) IL-21 humana recombinante (rHu IL-21), (iv) mAb anti-PD-1, (v) una combinación de rHu IL-21 y mAb anti-PD-1, o (vi) una IgG de control.

Como se muestra en la figura 11, rhIL-21 suprimió la función de DC y es dominante sobre la respuesta de PD-1 cuando se codosifican. La proteína de fusión que comprende la muteína doble de IL-21 con actividad atenuada presentó una actividad inespecífica reducida. Asimismo, cada una de rhIL-21 y la proteína de fusión que comprende solo la sustitución de aminoácidos R76E mostró una actividad inespecífica significativa en las CD y suprimió la producción de citocinas. Por el contrario, el mAb de PD-1 y la proteína de fusión que comprende las sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E solo suministraron señales de IL-21 en células T PD-1+ve diana (y no en células dendríticas PD-1've) y conservaron la capacidad (a través del brazo de PD-1) para aumentar la producción de citocinas. Por consiguiente, estos resultados sugieren que las proteínas de fusión que comprenden el doble mutante de IL-21 tienen reducida la inmunosupresión y los impactos perjudiciales sobre el cebado de DC y pueden permitir el reclutamiento de nuevos clones de células T y respuestas inmunitarias antitumorales más duraderas.

EJEMPLO 7

Este ejemplo demuestra la actividad de diferentes proteínas de fusión que comprenden muteínas dobles de IL-21 (homodímeros) y un mAb anti-PD-1 en linfocitos T citotóxicos primarios (CTL). Se midió la fosforilación endógena de STAT3 en CTL primarios (líneas de CTL reactivas con CMV de un donante humano) mediante FAC y se utilizó como una medida de la señalización de IL-21. Después de dejar en reposo los CTL durante 48 horas (para reducir la expresión de PD-1), las células se expusieron (durante 10 min) a (i) una proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 R5E/R76A (triángulos blancos en el gráfico de la izquierda), (ii) una proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (triángulos blancos en el gráfico central), (iii) una proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 R9E/R76A (triángulos blancos en el gráfico de la derecha), (iv) un control de IgG1 (rombos negros en cada gráfico), (v) rhIL-21 (cuadrados blancos en cada gráfico), (vi) un mAb anti-PD-1 (línea de puntos en cada gráfico), (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con círculos negros en cada gráfico), o (viii) una proteína de fusión que comprende una muteína única de IL-21 R76E (rombos blancos en cada gráfico). Los resultados se muestran en las figuras 12A-12C. La actividad de IL-21 de cada proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 se representa frente a la actividad lograda con (iv) un control de IgG1, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1, (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1, y (viii) una proteína de fusión que comprende una muteína única de IL-21 R76E. Este ensayo de células primarias demuestra que las fusiones de mutantes dobles estimulan débilmente la señalización de STAT3 inducida por IL-21 en CTL en reposo (que expresan niveles bajos de PD-1). La actividad de IL-21 se atenúa más con las fusiones de doble muteína (y es similar a lo que se observa con el mAb anti-PD-1 y el control de IgG1), presentando la fusión de mutante único una atenuación moderada de la actividad de IL-21, y teniendo la combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 una actividad similar a rhIL-21.

También se exploró el efecto de proteínas de fusión que comprendían un mAb anti-PD-1 y homodímeros de muteína doble de IL-21 sobre la función de citotoxicidad celular mediada por CTL tras la estimulación crónica. Los CTL se activaron con CD3/CD28 y se expusieron a (i) una proteína de fusión que comprendía la muteína doble de IL-21 R5E/R76A, (ii) una proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E, (iii) una proteína de fusión que comprendía una muteína doble de IL-21 R9E/R76A, (iv) una IgG4 de control, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1, o (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1. Después de siete días de estimulación, las células se cocultivaron con una línea de células cancerosas de melanoma pulsada con péptido CMV y se midió la citotoxicidad. En las figuras 13A-13C se muestran los resultados de este ensayo.

Como se muestra en las figuras 13A-13C, las proteínas de fusión son capaces de mantener la función de CTL de una manera superior en comparación con la monoterapia con mAb anti-PD-1. Las proteínas de fusión de muteínas de IL-21 pueden mantener la función de citotoxicidad celular mediada por CTL tras la estimulación crónica. Estos resultados apoyan la idea de que IL-21 puede mantener la función de CTL en condiciones de activación crónica como se observa en el cáncer. La administración de IL-21 a las células T específicas del antígeno PD-1+ puede mantener selectivamente la función de una población de células T que impulsa la eficacia terapéutica.

EJEMPLO 8

Este ejemplo demuestra la farmacocinética in vivo con las construcciones de muteína doble.

Se administraron proteínas de fusión que comprendían un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 o una muteína única de IL-21 a monos cynomolgus no tratados previamente mediante administración intravenosa en embolada para caracterizar la exposición al fármaco. La Tabla 9 muestra la dosis de cada construcción administrada a los animales. Se ensayó la variante de muteína única (IL-21 R76E) in vivo como un homodímero y monómero para comprender mejor cómo se puede mejorar aún más la exposición.

En la figura 14 se muestran los perfiles de concentración sérica-tiempo para el mAb PD-1 y las fusiones PD-L-IL-21 después de la administración intravenosa en embolada a monos cynomolgus no tratados previamente con las exposiciones a fármacos observadas la primera semana después de la administración enumeradas en la Tabla 9.

TABLA 9

continuación

Como se muestra en la Tabla 9, la proteína de fusión monomérica R76E presentó una exposición superior tras la dosificación intravenosa en comparación con la proteína de fusión homodimérica R76E. Las proteínas de fusión que comprendían las muteínas dobles de IL-21 (RSQ/R76E y RSE/R76A) observaron mayores exposiciones que las construcciones de proteínas de fusión de homodímero de muteína única progenitora (R76E y R76A, respectivamente) (figura 14; Tabla 9).

También se ensayaron los parámetros farmacodinámicos (PD) in vivo en monos cynomolgus. La expresión de PD-1 se determinó utilizando anticuerpos no competitivos para PD-1 y este muestreo de PD-1 se produjo el día -5, el día 7 y el día 21. A los animales se les administró una primera dosis de (i) una proteína de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y un homodímero de una muteína única de IL-21 R76E, (ii) una proteína de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y un monómero de una muteína única de IL-21 R76E, o (iii) una proteína de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E el día 1 y una segunda dosis el día 8. Véase la figura 15A.

Las figuras 15B-15D muestran el cambio en veces en las células positivas para PD-1/positivas para CD4 (en relación con el día - 5) medido el día 7 (figura 15B), el cambio en veces en las células positivas para PD-1/positivas para CD8 (en relación con el día -5) medido el día 7 (figura 15C), y el cambio en veces en células positivas para PD-1/positivas para CD8 (en relación con el día -5) medido el día 21 (figura 15D).

Como se muestra en las figuras 15B-15D, incluso una sola dosis de la proteína de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y un mutante doble de IL-21 expande las células T PD-1+/CD8+ periféricas. Este estudio demostró que las proteínas de fusión mutantes dobles son capaces de expandir significativamente las células T CD8 PD-1+ de manera superior a las variantes progenitoras de muteína única.

Los biomarcadores de PD también se examinaron en busca de diferencias y los datos sugieren que la construcción monomérica tiene una cobertura de dianas y respuestas de PD más bajas tras la administración de una sola dosis, pero cambios equivalentes en PD y cobertura de dianas con la administración de múltiples dosis. Estos datos sugieren que las propiedades PK de las proteínas de fusión pueden mejorarse aún más con un formato monomérico.

Como se muestra en la figura 16, la ocupación del receptor (RO) en las células CD8+ generalmente se correlacionaba con la expansión de las células T CD8 PD-1+ para los mutantes dobles (Animales 803, 805, 806). Las construcciones de homodímero de mutante único (Animales 801, 802) no lograron expandir las células T CD8 PD-1+, probablemente debido a sus propiedades farmacocinéticas relativamente pobres. De manera destacable, las construcciones de muteína doble, que tienen propiedades farmacocinéticas más deseables, expandieron las células T CD8 PD-1+ y las respuestas PD se correlacionaron con la cobertura de dianas. Los datos sugieren que las proteínas de fusión mutantes dobles pueden expandir una población de células T relevante que se sabe que está involucrada en la inmunidad antitumoral protectora.

La figura 17 muestra que la cobertura de la diana de PD-1 en células T CD8+ después de la dosificación repetida es similar a lo que se observa para un mAb anti-PD-1 (no se muestran los datos del mAb anti-PD-1). En conjunto, con respecto a los mutantes dobles, las figuras 16 y 17 respaldan la idea de que la modulación de la población diana (células T CD8 PD-1+) requiere una cobertura de dianas suficiente y que la cobertura de dianas mejorada se correlaciona con respuestas farmacodinámicas mejoradas.

EJEMPLO 9

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de proteínas de fusión que comprende diferentes mAb anti-PD-1 fusionados con diferentes muteínas dobles homodiméricas de IL-21.

Se generó un panel de mAb anti-PD-1 y se ensayó como se describe en el Ejemplo 12 y se fusionaron mAb principales con ciertas muteínas dobles de IL-21. Doce proteínas de fusión que comprendían muteínas dobles homodiméricas de IL-21 y mAb anti-PD-1 se ensayaron para determinar la actividad de IL-21 en células T Hut78 tanto PD-1've como PD-1+ve usando el ensayo de fosforilación de STAT3, unión de IL-21R y unión de PD-1 utilizando el ensayo ForteBio Octet, actividad de PD-1 usando el ensayo de indicador de PD-1 Jurkat y actividad in vitro utilizando el ensayo MLR (reacción linfocitaria mixta). Estos experimentos se llevaron a cabo tal como se describe esencialmente en los ejemplos anteriores.

En las Tablas 10-12 se proporciona una lista de las doce proteínas de fusión que comprendían un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 y sus actividades medidas en estos ensayos.

TABLA 10

TABLA 11

Unión a IL-21R unión a PD-1

continuación

TABLA 12

Actividad de PD-1 MLR

La mayoría, si no todos los candidatos, se comportaron tan bien, si no mejor, que dos mAb anti-PD-1. Varios demostraron potencias para la actividad de PD-1 y en el ensayo MLR que eran mayores o iguales a la potencia del mAb anti-PD-1.

De los 12 candidatos, dos fueron seleccionados para estudios adicionales. Uno de los dos tenía la muteína doble de IL-21 que comprendía mutaciones R5Q/R76E y el segundo tenía la muteína doble de IL-21 que comprendía mutaciones R9E/R76A. Se usaron diferentes mAb anti-PD-1 del panel de mAb PD-1 para preparar una proteína de fusión con una de las dos muteínas de IL-21. Se usaron diez mAb anti-PD-1 en las proteínas de fusión R5Q/R76E, incluyendo los mAb anti-PD-1 20A2.003 (línea con rombos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con triángulos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos). Se usaron siete mAb anti-PD-1 en las proteínas de fusión R9E/R76A, incluyendo los mAb anti-PD-1 20A2.003 (línea con triángulos blancos, 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con rombos blancos) y 22D4.006 (línea con círculos blancos). Se analizó la actividad de IL-21 de las proteínas de fusión utilizando el ensayo de fosforilación de STAT3, como se describe esencialmente en el presente documento. Las figuras 18A-18B y 19A-19B muestran las actividades en células T HUT78 PD-1-ve y PD-1+ve, en relación con las señales de rhIL-21 (línea rosa fuerte). Como se muestra en estas figuras, las proteínas de fusión presentaron una atenuación >1000x en células T HUT78 PD-1-ve pero conservaron la potencia en células T HUT78 PD-1 ve.

EJEMPLO 10

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de proteínas de fusión que comprende diferentes mAb anti-PD-1 fusionados con diferentes muteínas dobles monoméricas y homodiméricas de IL-21.

Se generó un panel de proteínas de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 monomérica u homodimérica. En la Tabla 13 se proporciona una lista de las proteínas de fusión que comprenden un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21.

TABLA 13

continuación

Se analizó la actividad de IL-21 de las proteínas de fusión en células T Hut78 tanto PD-1've como PD-1+ve usando el ensayo de fosforilación de STAT3, unión de IL-21R y unión de PD-1 utilizando el ensayo ForteBio Octet, actividad de PD-1 usando el ensayo de indicador de PD-1 Jurkat y actividad in vitro utilizando el ensayo MLR. Estos experimentos se llevaron a cabo tal como se describe esencialmente en los ejemplos anteriores. Las actividades medidas en estos ensayos in vitro se muestra en las figuras 20-23.

Las figuras 20A-20D representan la cantidad de señalización de pSTAT3 observada con varias fusiones de mAb anti-PD-1-muteína doble de IL-21 monomérica u homodimérica. La señalización de pSTAT3 estimulada con rhIL-21 se muestra en la línea con círculos negros en la parte superior de los gráficos, mientras que la señalización de pSTAT3 estimulada con un control de IgG1 se muestra en la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) y con un control de IgG2 se muestra en la línea con X (parte inferior de los gráficos). La señalización de pSTAT3 estimulada con mAb anti-PD-1 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) se muestra en la línea de puntos con cuadrados negros (parte inferior de los gráficos). La señalización de pSTAT3 estimulada con mAb anti-PD-1 de control se muestra en la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea de puntos con rombos blancos (parte inferior de los gráficos), mientras que las demás líneas representan la señalización de pSTAT3 lograda tras la estimulación con fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble de IL-21 monomérica o dimérica (con varias mutaciones de pares de carga) en donde los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E o R5Q/R76E. Como se muestra en este conjunto de figuras, rhIL-21 demuestra actividad en células tanto PD-1've como PD-1+ve. Por el contrario, las fusiones de muteína doble monomérica y homodimérica pueden demostrar actividad de pSTAT3 (basada en IL-21) solo en células PD-1+ve y no en células PD-1've. Por lo tanto, las fusiones monoméricas con mutantes dobles de IL-21 presentan niveles similares de atenuación de la actividad de IL-21 en células PD-1've y rescate de actividad de IL-21 en células PD-1+ve como sus fusiones diméricas homólogas.

Las proteínas de fusión evaluadas en las figuras 20A-20D se ensayaron en un ensayo de gen informador de PD-1 (R^gA; figuras 21A y 21B) y un ensayo MLR (figuras 21C y 21D). Los resultados mostrados en las figuras 21A-21D demuestran que las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica y dimérica de IL-21 son capaces de inducir la actividad de PD-1.

Los resultados de los ensayos de pSTAT3 que ensayan las mismas construcciones de fusiones de mAb anti-PD-1 -muteína doble monomérica y dimérica de IL-21 que las de las figuras 20A-20D, excepto con un mAb anti-PD-1 diferente, se muestran en las figuras 22A-22D. Los resultados de las figuras 22A-22D son similares a los observados en las figuras 20A-20D.

Los resultados de los ensayos de gen indicador de PD-1 y MLR que ensayan las mismas construcciones de fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica y dimérica de IL-21 que las de las figuras 21A-21D, excepto con un mAb anti-PD-1 diferente, se muestran en las figuras 23A-23D.

Estos datos demuestran que una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 puede no requerir una configuración de homodímero para la atenuación parcial. Se seleccionaron las siguientes muteínas dobles (fusionadas como monómeros u homodímeros) con un mAb anti-PD-1 (Tabla 14) para una evaluación adicional.

TABLA 14

continuación

Los datos basados en células sugieren que estas muteínas, cuando se fusionan con un anticuerpo de PD-1, pueden dirigirse selectivamente a las células T (demostrado usando líneas de células T) que expresan el receptor PD-1. Estas moléculas bifuncionales de PD-1 x IL-21 tienen propiedades únicas adquiridas de cada brazo de la molécula de fusión (mAb anti-PD-1 y muteína de IL-21).

EJEMPLO 11

En los ejemplos se utilizaron los siguientes materiales y métodos.

Generación de fusiones de Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21

Se clonaron secuencias recombinantes de Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21 en pTT5 para expresión transitoria en HEK293-6E o un vector que contenía un casete de selección de antibiótico para la expresión estable en células CHO-K1. Las producciones de expresión se realizaron durante 5-7 días a 36 °C y el sobrenadante se recogió para su purificación. Todos los lotes de proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A (Mab Select SuRe) seguido de intercambio catiónico (SP Sepharose HP) e intercambio de tampón (UF/DF) en tampón A5.2Su. Todos los lotes tenían >95 % del pico principal por cromatografía de exclusión por tamaño con endotoxina <0,2 UE/mg (Endosafe LAL, Charles River).

Ensayos del gen informador de PD-1 Jurkat

Se cocultivaron células efectoras estables GloResponse Jurkat NFAT-/uc2/PD-1 (Promega, n.° CS187102) y la línea celular estable CHO PD-L1 (Promega, n.° CS178103) en una proporción de 1,25:1 en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 6 horas a 37 °C, con 5 % de Co 2. Se midió la luminiscencia usando el sistema de ensayo Bio-Glo Luciferase (Promega, n.° G7940).

Ensayos de fosforilación de STAT3

pSTAT3 AlphaScreen. A continuación, se sembraron líneas celulares HuT78 progenitora y HuT78 PD-1 estables en placas separadas a 40.000 células por pocillo en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 40 minutos a 37 °C, con 5 % de CO². Los niveles de Pstat3 Tyr705 se midieron con el kit de ensayo AlphaLisa Surefire Ultra Pstat3 (Tyr705) (Perkin Elmer, n.° ALSU-PST3-A10K).

Ensayo HTRF fosfo-STAT3. Las células se privaron de suero durante la noche en medio RPMI 1860 complementado con L-glutamina al 1 % (HyClone, n.° de Cat. SH30034.01). A continuación, las células se resuspendieron en solución salina equilibrada de Hanks sin rojo fenol, sin calcio ni magnesio (HBSS; ThermoFisher, n.° de Cat. 14175095) a 2,5 x 106 células/ml y se sembraron 8 ul/pocillo en una placa blanca de pequeño volumen de 384 pocillos (Perkin Elmer, n.° de Cat. 6008289). A continuación, las células se estimularon con 4 ul/pocillo de moléculas de muteína de IL-21 diluidas en HBSS a 37 °C durante 40 minutos. La fosforilación de STAT3 se detectó utilizando el kit de ensayo HTRF® fosfor-STAT3 (Tyr705) de acuerdo con la recomendación del fabricante (Cisbio, n.° de Cat. 64NT3PEH). La señal de FRET del ensayo se detectó utilizando el lector de placas Multilabel EnVision (Perkin Elmer). Los datos se analizaron determinando primero la relación de HTRF según lo recomendado por Cisbio y después calculando el número de veces con respecto a los valores de fondo utilizando datos de células no estimuladas. Para cada experimento, se representaron las curvas de dosificación y la potencia de una molécula dada se representa como la concentración a la que se observó un número de veces con respecto al valor de fondo definido.

Reacción linfocitaria mixta (MLR)

Se obtuvieron leucopaks de pares de donantes no coincidentes de AllCells Inc. Se aislaron células T de donante utilizando el kit de aislamiento de células T Pan (Milteny Biotec, n.° 130-096-535) y se aislaron monocitos de un donante no coincidente se aislaron utilizando el kit de aislamiento Pan Monocyte (Miltenyi Biotec, n.° 130-096-537). Los monocitos se maduraron adicionalmente durante 10 días utilizando el kit de diferenciación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos CellXVivo (R&D Systems, n.° CDK004). Las células Pan-T se cocultivaron con monocitos maduros en una relación de 10:1 en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 72 horas a 37 °C, con 5 % de CO2. Los niveles de IL-2 en el sobrenadante se midieron mediante ELISA (Mesoscale Discoveries, n.° K151QQD-4).

Ensayos de unión de IL-21R y PD-1

Afinidad de unión a IL-21R humano y de mono cynomolgus: Se ensayaron reactivos recombinantes IL-21R-FLAG-His monovalente e IL-21 R-Fc bivalente pero produjeron resultados muy similares (dentro de ~2-3 veces). Los reactivos de IL-21R soluble recombinante se biotinilaron mínimamente y se capturaron en puntas Streptavidin SAX a un nivel de carga de 2,0 nm. A continuación, las puntas se incubaron en pocillos en los que las muestras de anticuerpo PD-1-IL-21 se diluyeron en serie 3 veces. Para fusiones de IL-21 de tipo silvestre, la concentración máxima de la muestra fue de 10 nM, mientras que para las fusiones de muteína de IL-21, la concentración máxima de la muestra fue de 300 nM. Se utilizó un tiempo de asociación de 20 minutos y un tiempo de disociación de 1,5 horas para maximizar la curvatura en los gráficos de unión con el fin de obtener ajustes cinéticos precisos.

Afinidad de unión a PD-1 humano y de mono cynomolgus: La afinidad de unión a PD-1 humano y de mono cynomolgus se analizó capturando primero las muestras de anticuerpo PD-1-IL-21 a través del acoplamiento de amina EDC-NHS a puntas AR2G; la carga de la muestra fue típicamente a pH 6 durante 2000 segundos, seguida de inactivación con etanolamina 1 M para inmovilizar al menos un nivel de 2 nm. Una vez inmovilizadas las muestras, las puntas se incubaron en pocillos que contenían una dilución en serie de 3 veces de receptores recombinantes solubles de PD-1(1-170)-FLAG-His humano o PD-1(1-167)-FLAG-His de mono cynomolgus. En ambos casos, la concentración máxima de PD-1 fue de 30 nM. Se utilizaron asociación durante 300 segundos y disociación durante 500 segundos, ya que produjeron suficiente curvatura para ajustes cinéticos precisos.

Las afinidades de unión a IL-21R humano/mono cynomolgus y PD-1 humano/mono cynomolgus anteriores se cuantificaron con instrumentos ForteBio Octet HTX y RED384. En todos los casos, se utilizó el tampón de muestra Octet estándar para la dilución de la muestra y para todas las etapas de valor de referencia de unión, asociación y disociación (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, 0,10 mg/ml de BSA, Triton X-100 al 0,13 % (v/v).

Todos los datos sin procesar de ForteBio se procesaron de la siguiente manera utilizando el software de análisis de datos de instrumentos estándar (v9 y v10): (a) dos curvas de punta de referencia que tenían diana inmovilizada pero sin interacción (es decir, solo tampón) se promediaron y se restaron de las curvas de puntas de muestra restantes en la misma columna; (b) las curvas de asociación y disociación se aislaron y alinearon con el eje Y; (c) se alinearon las etapas intermedias de asociación y disociación; (d) se implementó el filtrado Savitzky-Golay para reducir el ruido de la señal y (e) el conjunto resultante de curvas de asociación y disociación para cada interacción muestra-diana se ajustó globalmente con un solo modelo de unión 1:1 para determinar los valores medidos de la constante de tasa de asociación ka y las constantes de tasa de disociación kd; la constante de disociación de equilibrio K^dse calculó como una relación de las constantes de las tasas de disociación y asociación (= kd/ka).

EJEMPLO 12

Este ejemplo describe la generación de mAb anti-PD-1 para su uso en las proteínas de fusión que comprenden muteínas de IL-21.

Generación de Respuestas Inmunitarias anti-PD-1

Cepas de ratón

Se generaron anticuerpos completamente humanos contra PD-1 humano mediante la inmunización de ratones transgénicos XENOMOUSE® (Patentes de EE. UU. N.° 6.114.598; 6.162.963; 6.833.268; 7.049.426; 7.064.244; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green y Jakobovits, 1998, J. Ex. Med, 188:483-495; Kellerman y Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002). Para estas inmunizaciones se utilizaron animales de las cepas XMG4-K y XMG4-KL XENOMOUSE®.

Inmunizaciones

Se utilizó una vía de inmunización basada en células para generar respuestas inmunitarias anti-PD-1 humano. Se transfectaron de forma transitoria células CHO-S con PD-1 humano fusionado a través de un enlazador Gly-Ser-Ser a una etiqueta de epítopo de células T E3K o con PD-1 de mono cynomolgus como fuente de inmunógeno. Los animales se inmunizaron con cualquiera de estas células CHO transfectadas transitoriamente mezcladas con Alum con CpG-ODN, 13 veces durante 8 semanas usando inyecciones TIP (base de la cola e intraperitoneal). El refuerzo inicial estaba compuesto por 4 millones de células que expresaban PD-1 humano, mientras que los refuerzos posteriores contenían 2 millones de células que expresaban PD-1 humano o de mono cynomolgus. Se realizaron un total de 9 inmunizaciones con PD-1 humano (1-6, 8, 10 y 13) y las 4 inmunizaciones restantes se realizaron con PD-1 de mono cynomolgus. Se extrajo sangre de los animales después del 10° refuerzo para evaluar los títulos específicos de PD-1.

Los títulos séricos específicos de PD-1 se supervisaron mediante análisis FACS de células vivas en un citómetro de flujo Accuri. En resumen, se transfectaron células HEK293 de forma simulada o se transfectaron transitoriamente con PD-1 humano o de mono cynomolgus. El suero de los animales inmunizados se diluyó 100 veces y se incubó en las células transfectadas durante 1 hora en hielo. A continuación, las células se lavaron para eliminar los anticuerpos no unidos y se incubó sobre las células un anticuerpo específico anti-Fc humano secundario marcado con Cy5 durante 15 minutos adicionales a 4 grados. Las células se lavaron una vez para eliminar el anticuerpo secundario no unido y la señal fluorescente de las células se cuantificó mediante FACS. Se usaron animales con los títulos nativos de suero específicos de antígeno más altos dirigidos contra PD-1 humano y de mono cynomolgus para la generación de hibridomas (Kohler y Milstein, 1975).

Preparación de anticuerpos monoclonales

Generación de hibridomas

Se identificaron animales que presentaban títulos séricos adecuados y se obtuvieron linfocitos del bazo y/o de los ganglios linfáticos de drenaje. Los linfocitos agrupados (de cada recolección) se disociaron del tejido linfoide moliéndolos en un medio adecuado (por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células B se seleccionaron y/o expandieron usando métodos estándar y se fusionaron con un compañero de fusión adecuado usando técnicas conocidas en este campo.

Generación de preparación de membrana:

se transfectaron 20 millones de células 293T con pTT5-mini4:huPD-1::GSS:E3K utilizando el reactivo de transfección 293fectin™ (Thermo Fisher, Cat: 12347019). Veinticuatro horas después de la transfección, las células 293T se biotinilaron incubándolas en PBS de pH 8,6 que contenía EZ-Link™ NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Fisher Cat: 21343) a 400 |jg/ml durante 30 minutos. Después, las células se lavaron en PBS de pH neutro y posteriormente se resuspendieron en tampón hipotónico que contenía inhibidor de proteasa sin EDTA y triton X100 al 10 %. Las células se rompieron bombeándolas repetidamente a través de una jeringa con una aguja de calibre 26. Los fragmentos de células se sedimentaron mediante centrifugación a 12000 G durante 20 minutos. A continuación, se recogió el sobrenadante que contenía partículas de membrana y se lavó 3 veces con PBS en una columna de centrífuga Amicon Ultracel 100k (Millipore, n.° de Cat. UFC810024) para eliminar el detergente. A continuación, las preparaciones de membrana se analizaron en resultados de seguimiento (células de hibridoma de control positivo con especificidad para PD-1) para comprobar la unión de la preparación de membrana correlacionada con IgG. A continuación, la preparación de membrana se dividió en alícuotas y se congeló a -20 grados centígrados hasta su uso.

Tinción específica de antígeno de células de hibridoma:

Las células de hibridoma se retiraron del matraz y se lavaron en tampón FACS estéril (2 % de FBS PBS). A continuación, las células se mezclaron con preparación de membrana PD-1 (diluida 1:10 en tampón FACS, 1 ml de volumen de reacción, p. ej. 100 j l de preparación de membrana en 900 j l de tampón FACS) y se incubaron a 4 grados centígrados durante 1 hora. Las células se lavaron de nuevo en tampón FACS y se tiñeron con 1 ml de cóctel de detección que contenía 5 jg/m l de fragmento F(ab')2, IgG antihumana de cabra, específico de Fc, conjugado con conjugado con Alexa Fluor 488 (Jackson, Cat: 109-546-098) y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647 (Jackson, Cat: 016-600-084) y después se incubaron a 4 grados centígrados durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron nuevamente en tampón FACS, se resuspendieron en medio y después se pasaron por un filtro de células de 40 micrómetros para eliminar las células agregadas. Las células específicas de antígeno se clasificaron utilizando BD FACSAria 3 seleccionando la población que presentaba fluorescencia Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 (células IgG+ y de unión a antígeno).

Las células clasificadas se dejaron cultivar durante unos días en medios de hibridoma. Se extrajo una pequeña muestra de las células enriquecidas y se analizó la unión a la preparación de membrana PD-1 usando las mismas condiciones de tinción que se han mencionado anteriormente. Después de confirmar el enriquecimiento exitoso de células específicas de PD-1, los hibridomas se clasificaron de forma individual en placas de microtitulación de 384 pocillos utilizando BD FACSAria 3. Después de 2 semanas de cultivo, se recogieron los sobrenadantes de las placas de microtitulación y se cribaron con respecto a la unión de PD-1.

Selección inicial de anticuerpos de unión específica a PD-1

Mediante Cell Insight se analizaron los sobrenadantes de hibridoma agotados para determinar su unión a PD-1 humano expresado transitoriamente en células HEK293. En resumen, se transfectaron transitoriamente células HEK293 con una construcción de expresión de mamífero que codifica PD-1 usando 293Fectin. Al día siguiente, se añadieron 15 j l de medio de hibridoma agotado a cada pocillo de una placa FMAT de 384 pocillos. Después, se mezclaron las células HEK293 transfectadas (0,27 millones/ml), la tinción nuclear Hoechst 33342 (7,5 jg/m l) y un anticuerpo de detección secundario (0,75 jg/m l - IgG anti-humana de cabra (H+L) Alexa 488 (Jackson ImmunoResearch)) y se añadieron 30 j l de esta mezcla a cada pocillo de una placa FMAT de 384 pocillos. Después de ~3 horas, el sobrenadante se aspiró utilizando un lector de placas AquaMax y se añadieron 30 |jl de tampón FACS a cada pocillo utilizando un instrumento multigota. Las placas se colocaron en un agitador Big Bear Plate para distribuir uniformemente las células en el pocillo y después se leyeron en la plataforma Cell Insight utilizando Cell Health Bio-App. Este análisis condujo a la identificación de 383 anticuerpos específicos de antígeno de esta recolección.

Ensayo de indicador de PD-1 humano/NFAT-luciferasa en Jurkat

Se cultivaron células Jurkat que expresan de forma estable PD-1 humano e indicador de NFAT-luciferasa (Promega) en medio RPMI 1640 (Sigma) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), HEPES 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 500 jg/m l de geneticina (Gibco Life Technologies), 100 jg/m l de higromicina B (Invitrogen) a 37 °C/5 % de CO². Se cultivaron células Jurkat que expresan de forma estable PD-1 de mono cynomolgus e indicador de NFAT-luciferasa (Promega) en medio RPMI 1640 (Sigma) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), HEPES 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 200 jg/m l de higromicina B (Invitrogen), 300 jg/m l de zeocina (Invitrogen) a 37 °C/5 % de CO². Se cultivó la línea de células clonales 99 de ovario de hámster chino (CHO) que expresa de forma estable PD-L1 humano (Promega) en mezcla de nutrientes F12 HAM (Sigma), 10 % de suero bovino fetal, HEPES 10 mM, 250 jg/m l de geneticina, 200 jg/m l de higromicina B a 37 °C/5 % de CO². El día del experimento, las células Jurkat NFAT-luciferasa/PD-1 y las células CHO Clon 99 PD-L1 (separadas con tripsina) se centrifugaron a 200 x g durante 5 minutos y se resuspendieron en medio de ensayo (medio RPMI 1640, suero bovino fetal al 2 %, HEPES 15 mM). Las moléculas de ensayo se diluyeron y titularon utilizando el tampón de ensayo en placas de ensayo de fondo negro/transparente de 384 pocillos (Corning). Las células preparadas se sembraron a 40.000 células/pocillo en total mezclando primero las células preparadas en una relación 1:1 y luego añadiendo la mezcla de células a las placas de ensayo. Las placas se incubaron durante 18 a 24 horas a 37 °C/5 % de CO². La cantidad de luciferasa producida se midió con el reactivo Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega), después de lo cual las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y se detectó la luminiscencia con un lector de placas EnVision (PerkinElmer). Para el ensayo de un solo punto, primero se cuantificaron las muestras de ESN, se normalizaron y se ensayaron a 0,5 jg/ml. Para la determinación de la potencia, las muestras de ESN o los anticuerpos purificados se titularon tres veces en serie en medios de ensayo y se usaron para tratar células indicadoras de PD-1 humanas o de mono cynomolgus. El número de anticuerpos que muestran la actividad deseada durante el cribado de concentración única y la clasificación de potencia se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15

La actividad de los anticuerpos anti-PD-1 purificados (n=1 para el ensayo de PD-1 humano mostrado) se muestra en la figura 24 y la potencia de los anticuerpos anti-PD-1 purificados en los ensayos de indicador de PD-1 humano y de mono cynomolgus se enumeran en la Tabla 16.

TABLA 16

Rescate molecular y secuenciación de anticuerpos antagonistas de PD-1

Se purificó el ARN (total o ARNm) a partir de pocillos que contenían células de hibridoma productoras de anticuerpos antagonistas de PD-1 utilizando un Qiagen RNeasy mini o el kit Invitrogen mRNA catcher plus. El ARN purificado se usó para amplificar los genes de región variable (V) de cadena pesada y ligera del anticuerpo usando la síntesis de ADNc mediante transcripción inversa, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La cadena pesada gamma del anticuerpo completamente humano se obtuvo usando el kit de PCR con transcriptasa inversa Qiagen One Step (Qiagen). Este método se usó para generar la primera cadena de ADNc a partir del molde de ARN y después para amplificar la región variable de la cadena pesada gamma usando PCR multiplex. El cebador específico de la cadena gamma 5' hibridó con la secuencia señal de la cadena pesada del anticuerpo, mientras que el cebador 3' hibridó con una región del dominio constante gamma. La cadena ligera kappa completamente humana se obtuvo usando el kit de PCR con transcriptasa inversa Qiagen One Step (Qiagen). Este método se usó para generar la primera cadena de ADNc a partir del molde de ARN y después para amplificar la región variable de la cadena ligera kappa usando PCR multiplex. El cebador específico de la cadena ligera kappa 5' hibridó con la secuencia señal de la cadena ligera del anticuerpo, mientras que el cebador 3' hibridó con una región del dominio constante kappa. La cadena ligera lambda completamente humana se obtuvo usando el kit de PCR con transcriptasa inversa Qiagen One Step (Qiagen).

Este método se usó para generar la primera cadena de ADNc a partir del molde de ARN y después para amplificar la región variable de la cadena ligera lambda usando PCR multiplex. El cebador específico de la cadena ligera lambda 5' hibridó con la secuencia señal de la cadena ligera, mientras que el cebador 3' hibridó con una región del dominio constante lambda.

El ADNc amplificado se purificó enzimáticamente usando exonucleasa I y fosfatasa alcalina y el producto de PCR purificado se secuenció directamente. Las secuencias de aminoácidos se dedujeron bioinformáticamente a partir de las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos. Se completaron dos ciclos independientes de amplificación por RT-PCR y secuenciación para cada muestra de hibridoma con el fin de confirmar que cualquier mutación observada no era consecuencia de la PCR. A continuación, se analizaron las secuencias de aminoácidos obtenidas para determinar el origen de la secuencia de la línea germinal de los anticuerpos e identificar las desviaciones de la secuencia de la línea germinal. Se indica una comparación de cada una de las secuencias de cadena ligera y pesada con sus secuencias de línea germinal originales. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos secuenciados se alinearon y estos alineamientos se usaron para agrupar los clones por similitud.

Ensayos de unión de células primarias

La unión de los sobrenadantes de hibridoma a PD-1 expresado por células primarias humanas y de mono cynomolgus se analizó mediante citometría de flujo. Para el ensayo de unión a células primarias humanas, se descongelaron células T humanas purificadas (Biological Specialty Corp.) y se suspendieron a una concentración de 2,5 x 106 células/ml. Las células T se estimularon con 5 ug/ml de anti-CD3 humano clon OKT3 (eBioscience) y 1 pg/ml de anti-CD28 humano (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37 °C/5 % de CO²en una placa que había sido recubierta previamente con 5 pg/ml de Fc de IgG anti-ratón (Pierce). Después de 72 horas, las células se retiraron, se lavaron y se suspendieron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml con 10 ng/ml de IL-2 (Pepro Tech). A continuación, las células se incubaron durante otras 48 horas a 37 °C/5 % de CO². Para el ensayo de unión a células primarias de mono cynomolgus, se descongelaron PBMC de mono cynomolgus (SNBL) y se suspendieron en una concentración entre 4 x 106 y 5 x 106 células/ml. Las PBMC se estimularon con 1 pg/ml de anti-CD3 humano clon SP34 (BD Pharmingen) y 1 pg/ml de anti-CD28 humano (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37 °C/5 % de CO²en una placa que había sido recubierta previamente con 5 pg/ml de Fc de IgG anti-ratón (Pierce). Después de 72 horas, las células se retiraron, se lavaron y se suspendieron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml con 20 ng/ml de IL-2 (Pepro Tech). A continuación, las células se incubaron durante otras 48 horas a 37 °C/5 % de CO². Después de la última incubación, las células se prepararon para citometría de flujo mediante incubación con sobrenadantes de hibridoma normalizados, anticuerpos de control positivo y anticuerpos de control de isotipo a una concentración final de 1 pg/ml. Para la detección secundaria se utilizó fragmento F(ab')²de IgG anti-humana de cabra (H+L) AffiniPure conjugado con Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoReserach) a 5 pg/ml y para la tinción de células vivas/muertas se utilizó YoPro1 8,25 nM (Invitrogen). A continuación, las células se procesaron en un citómetro de flujo BD FACSCanto II para detectar la unión del anticuerpo anti-PD-1. Los resultados se expresan como media geométrica FACS de células que expresan PD-1 y los datos se muestran en la Tabla 17.

TABLA 17

Ensayo competitivo de receptor - ligando

A continuación, se ensayó la capacidad de los sobrenadantes de hibridoma de unión a PD-1 para bloquear la unión del ligando a PD-1. Se realizaron ensayos de unión competitiva en las muestras de sobrenadante de hibridoma específico de antígeno utilizando FACS en células HEK293 que expresaban transitoriamente PD-1 humano de la siguiente manera. Se mezclaron células HEK293 que expresaban PD-1 humano con la muestra de anticuerpos (sobrenadantes de hibridoma específicos para PD-1) y se incubaron durante 1 hora a 4 °C y después se lavaron dos veces. Posteriormente, las células con la muestra unida se incubaron con huPD-L1-Fc-Alexa647 o huPD-L2-Fc-Alexa 647 (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 45 minutos a 4 °C. A continuación se añadió la tinción de viabilidad celular 7-AAD y las células se incubaron durante 15 minutos más a 4 °C, se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón FAC^s. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo BD Accuri™ y un automuestreador Intellicyt HyperCyt. Los datos de la Tabla 18 reflejan el porcentaje de inhibición de la unión de PD-L1 o PD-L2 humanos a p D-1 humano a 1 ug/ml.

TABLA 18

Análisis com etitivo de^ anticuer os anti-PD-1 con unión de PD-L1 o PD-L2 a PD-1

continuación

Análisis de deficiencias de afinidad

Se evaluaron las medidas cinéticas de varios de los anticuerpos utilizando el método KinExA®. Este método implica la determinación basada en soluciones de medidas de afinidad formal en equilibrio.

Se recubrieron perlas de poli(metacrilato de metilo) o PMMA con PD-1 humano biotinilado mediante el primer recubrimiento por adsorción de las perlas de PMMA con BSA biotinilado, Neutravidina y después con PD-1 biotinilado.

Los experimentos KinExA se realizaron utilizando un sistema de inmunoensayo de flujo automatizado, KinExA 3200, en el que perlas acopladas con PD-1 sirvieron como fase sólida. En resumen, se incubó una cantidad constante de mAb anti-hPD-1 (3 nM, 1 nM o 100 pM) con concentraciones de titulación de h-PD-1 o cy-PD-1 a partir de 100 nM en tampón de muestra (PBS con 0,1 % de BSA para reducir la unión no específica). Los complejos antígeno/anticuerpo se incubaron a TA durante 48 horas a 72 horas para permitir que se alcanzara el equilibrio. La mezcla se extrajo a través de las perlas acopladas a PD-1 para acumular el anticuerpo no unido. Se variaron los volúmenes y caudales de la mezcla dependiendo de la señal específica obtenida en cada experimento.

El mAb capturado se detectó utilizando soluciones que contenían un anticuerpo secundario, Ab IgG anti-Hu de cabra (H+L)-Alexa647 en el tampón de muestra. Las señales unidas se convirtieron en valores relativos como una proporción de control en ausencia de hu- o cy-PD-1. Se midieron dos réplicas de cada muestra para todos los experimentos de equilibrio. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de los datos utilizando un modelo de unión homogéneo de un sitio contenido en el software de análisis de n-curvas KinExA. El software calcula la Kd y determina el intervalo de confianza del 95 % ajustando los puntos de datos a una curva de Kd teórica. El intervalo de confianza del 95 % se proporciona como Kd baja y Kd alta.

Confirmación de actividad de anticuerpos purificados en ensayo MLR

Se descongelaron células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros humanos (Astarte) y se diferenciaron en células dendríticas maduras mediante cultivo en IL-4, GM-CSF y TNF-a durante 72 horas usando el kit de diferenciación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos CellXVivo (R&D Systems n.° CDK004). Se eliminaron las células no adherentes y débilmente adherentes, se combinaron y centrifugaron para sedimentar las células. Después de retirar los medios, las células se resuspendieron en medio X-Vivo-15 a 400x10A3 células/ml y se añadieron células dendríticas a cada célula de una placa de 96 pocillos (20k células en 50 pl). Las células T humanas (Astarte) se descongelaron rápidamente y se lavaron en medio X-Vivo-15. Las células se resuspendieron a 2 x 10A6 células/ml y se añadieron 100 pl a cada pocillo (200k células/100 pl). Se diluyeron anticuerpos y se añadieron a cada pocillo en un volumen total de 50 pl. La mezcla se incubó durante tres días a 37 grados. En ese momento, las células se centrifugaron y se usaron 175 pl para medir la producción de IL2 como una medida de la proliferación de células T usando el kit IL-2 V-Plex (MSD) según las recomendaciones del fabricante.

TABLA 20

EJEMPLO 13

Cuando fue posible, se modificaron por ingeniería genética las secuencias de dominio variable anti-PD-1 A-1 (20A2), A-3 (20C1) y A-2 (22D4) para eliminar los motivos que tenían riesgo de degradación de la cadena lateral. Estos motivos de aminoácidos incluyen: (1) secuencias "NG" y "NT" de CDR propensas a la desamidación de asparagina, (2) secuencias "DG", "DH", "DS" y "DT" de CDR propensas a la isomerización del ácido aspártico, (3) y triptófanos de CDR3 propensos a la oxidación. Normalmente, las identidades de sustitución derivaron de secuencias de la línea germinal o de mAb de unión a PD-1 relacionados con la secuencia. Para los casos en los que la bioinformática o los análisis estructurales no proporcionaron una identidad de sustitución clara, se seleccionaron tipos de restos químicamente similares al resto progenitor.

También se eliminaron los motivos de secuencia de dominio variable que incumplían las tendencias de covarianza de restos por pares basadas en el alineamiento de múltiples secuencias. La corrección de los incumplidores de la covarianza por pares mediante la sustitución con tipos de restos de la línea germinal o relacionados con la línea germinal puede conducir a una mejor fabricabilidad debido al aumento de los niveles de expresión de mAb y las estabilidades biofísicas. Véase, Kannan, G. Method of Correlated Mutational Analysis to Improve Therapeutic Antibodies. Solicitud de Patente de EE. UU. PCT/US2012/028596, presentada el 9 de marzo de 2012. Las identidades de sustitución para los incumplidores de la covarianza se seleccionaron utilizando un enfoque similar al utilizado para corregir los sitios de degradación, como se ha analizado anteriormente.

La modificación por ingeniería genética de 20A2 condujo a 20A2.003. La modificación por ingeniería genética de 20C1 condujo a 20C1.006 y 20C1.009. La modificación por ingeniería genética de 22D4 condujo a 22D4.006 y 22D4.017.

EJEMPLO 14

Se evaluó la actividad in vivo de la proteína de fusión que comprendía el anticuerpo anti-PD-1 22D4.017 fusionado con un monómero de doble muteína de IL-21 que comprende las mutaciones R9E y R76A ("[22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero)") en monos cynomolgus no humanos no tratados previamente. Un primer grupo de monos recibió el anticuerpo anti-PD-1 22D4.017 solo (no fusionado con una muteína de IL-21), y un segundo grupo de monos recibió la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] ( monómero). Los parámetros farmacodinámicos (PD) se supervisaron mediante FACS en sangre periférica e incluyeron la dinámica de las células inmunitarias y la fosforilación del factor de transcripción STAT3 (pSTAT3) en linfocitos. También se examinaron las citocinas séricas y la perforina mediante el ensayo multiplex de perfilado multianalito (MAP) Millipore Milliplex®. Se realizó un análisis previo a la dosis de los parámetros de sangre periférica para permitir la normalización de los conjuntos de datos al valor de referencia. La dosificación comenzó el día 1. Se extrajeron sangre y suero en puntos de tiempo fijos predeterminados.

A pesar de la activación de Ki67 [figuras 25A y 25B] y STAT3 [figuras 25C y 25D] en las células T, no se observó un aumento significativo en la población total de células T en los grupos a los que se administró el anticuerpo 22D4.017 o la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) [figuras 25A y 25B], lo que sugiere que ambos tratamientos fueron insuficientes por sí mismos para inducir la expansión de la población total de células T [figura 25E y 25F]. Estos datos respaldan la idea de que el bloqueo sistémico de la señalización de PD-1 puede tener un impacto más global en la población total de células T, incluida la activación de la señalización de STAT3 y Ki67, pero que estos cambios pueden ser insuficientes por sí mismos para manifestar un rendimiento funcional significativo (como también se evidencia por el fracaso de la monoterapia con anti-PD-1 o los tratamientos con proteínas de fusión para inducir una expansión de células T más generalizada).

Para comprender mejor cómo los cambios en la señalización proximal podrían afectar específicamente a las células T que expresan PD-1, y debido a que las células T PD-1(+) reflejan solo una pequeña fracción de la población total de células T en la sangre periférica, estas células se examinaron más directamente seleccionando células T CD4 y CD8 PD-1(+) usando un mAb de detección de PD-1 no competitivo [figuras 16 y 17]. Después de una leve reducción inicial en el número absoluto de células PD-1(+) circulantes, esta población se mantuvo estable en el grupo de anticuerpos [22D4.017]. Por el contrario, después de una reducción inicial en el número de células T CD4 y CD8 PD-1(+) en sangre periférica, hubo un rebote significativo (por encima del valor de referencia) en el número de células PD-1(+) observadas a las 336 horas posteriores a la dosificación en la población del grupo de tratamiento con proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) [figura 25G]. Por lo tanto, a pesar de la ausencia de una expansión significativa de la población total, estos datos sugieren que el número de células T PD-1(+) aumenta selectivamente tras la administración de la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero).

Para determinar un posible impacto funcional de la expansión de las células T PD-1(+), se examinó una relación entre la expansión de las células T CD4/8 PD-1(+) y la perforina sérica. En efecto, los datos sugieren que existe una relación positiva entre estos dos parámetros: la perforina sérica es más alta en animales a los que se les administró la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero), que experimentaron un aumento significativo en las células T PD-1(+) de sangre periférica [figura 25I].

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que, aunque la exposición sistémica de la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) no logró manifestar un aumento en la población total de células T, el bloqueo de PD-1 y el suministro simultáneo de la señal de IL-21 en la misma célula (que expresa PD-1) es suficiente para inducir la expansión de la población. Esto también se correlaciona con un aumento de la perforina sérica [figura 25I].

EJEMPLO 15

El siguiente ejemplo demuestra las afinidades de unión de varios anticuerpos anti-PD-1.

Las afinidades de unión del anticuerpo anti-PD-1::OCteto de PD-1 se caracterizaron como sigue. Para cuantificar la afinidad de unión K^d(constante de disociación de equilibrio) entre los anticuerpos anti-PD-1 y PD-1 soluble humano y de macaco cynomolgus, se midieron las constantes de tasa de asociación y disociación utilizando un instrumento Pall® ForteBio® Octet® RED384 en modo de 16 puntas o un instrumento Pall® Octet® HTX en modo de 96 puntas. En todos los casos, se utilizaron puntas de biosensores de fibra óptica reactivas con amina de segunda generación (AR2G) para capturar covalentemente los anticuerpos a niveles de carga finales entre 2,5 y 4 nm. El método de ensayo de unión utilizó las siguientes etapas de inmovilización: (1) equilibrio en agua, 60 segundos; (2) activación con hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) reciente 20 mM mezclado con N-hidroxisulfosuccinimida 10 mM (sulfo-NHS), 600 segundos; (3) inmovilización de anticuerpos 20 nM diluidos en tampón acetato 10 mM pH 6,0, 2000 segundos; (4) inactivación con etanolamina 1 M, 300 segundos; y finalmente (5) una incubación de referencia en tampón de procesamiento Octet (TRIS pH 7,510 mM, NaCl 150 mM, CaCh 1 mM, 0,13 % (v/v) de Triton X-100 y 0,10 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 60 segundos. Todos los experimentos se realizaron con las placas de muestra negras de 384 pocillos sugeridas por el fabricante (100 pl de volumen por pocillo) a 27 °C y 1000 RPM.

Para cada interacción Ab::PD-1, se inmovilizó igualmente una columna de ocho puntas como se ha descrito anteriormente con el mismo anticuerpo. Se usaron tres puntas para unir una serie de diluciones de tres puntos de PD-1(1-170)-FLAG-His humano soluble, se usaron tres puntas más para unir una serie de dilución de tres puntos de PD-1(1-167)-FLAG-His de mono cynomolgus soluble y después se expusieron las dos puntas restantes (con Ab inmovilizado como el resto de las puntas en la columna) al tampón Octet® para que pudieran ser puntas de referencia. Todas las puntas de fibra óptica se utilizaron una vez y luego se desecharon; es decir, sin regeneración. Se generaron curvas de unión de PD-1 humano y de mono cynomolgus creando una serie de diluciones en serie de 1:3 veces del receptor PD-1 soluble en tampón de procesamiento Octet; las concentraciones finales de PD-1 fueron 30, 10 y 3,3 nM (excepto para el mAb anti-PD-1 IgG4 que tenía una concentración de PD-1 de 33, 11, 3,7 nM). Los biosensores de fibra óptica con los anticuerpos inmovilizados se incubaron en los pocillos que contenían las series de diluciones en serie de PD-1 durante 300 segundos (etapa de asociación) y luego se trasladaron a pocillos con el tampón de procesamiento solamente durante 500 segundos (etapa de disociación).

Los datos de partida se procesaron con el software de análisis de datos del instrumento (v10). Para cada columna de sensores, la señal de unión de los dos sensores de referencia se promedió y se restó de los seis sensores de muestra restantes. A continuación, los datos restados de la referencia se procesaron con las opciones de software predeterminadas: eje Y alineado con el valor de referencia, corrección entre etapas para la disociación y finalmente se procesaron con un filtro Savitzky-Golay. Los datos finales procesados para cada unión de anticuerpo a tres concentraciones de PD-1 humano o tres concentraciones de PD-1 de mono cynomolgus se ajustaron globalmente a un modelo de unión 1:1 y se representaron gráficamente. Todos los gráficos muestran tanto los datos procesados como el ajuste al modelo de unión 1:1. Se utilizó el ajuste del modelo de unión 1:1 para determinar la constante de tasa de asociación (ka; unidades M 'V ) y la constante de tasa de disociación (kd; unidades s_1). Después se calculó la constante de disociación de equilibrio (K^d; unidades nanomolar (nM) = 1 x 10'9 Mol/l) como una relación de kd/ka.

La figura 26 muestra los perfiles de unión para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003, ensayados junto con dos mAb anti-PD-1 (un mAb anti-PD-1 IgG1 y un mAb anti-PD-1 IgG4). Los perfiles de unión se determinaron utilizando el sistema FortéBio Octet®. La unión se muestra frente a receptores PD-1 humanos y de mono cynomolgus.

Como se muestra en las figuras 26A-26E, los anticuerpos 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003 de PD-1 presentaron valores de K^dque fueron de 2 a 14 veces mayores que los de anticuerpos comercializados cuando se ensayaron contra la proteína PD-1 humana. Además, el análisis de la reactividad cruzada de la proteína PD-1 de mono cynomolgus con los anticuerpos 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003 mostró una afinidad general similar, mientras que los anticuerpos comercializados mostraron una diferencia de afinidad de aproximadamente 2 veces (figura 26F-26J).

EJEMPLO 16

El siguiente ejemplo demuestra la estabilidad de varios anticuerpos anti-PD-1.

La estabilidad conformacional térmica de los anticuerpos anti-PD-1 se caracterizó como se indica a continuación. Se evaluó la estabilidad térmica de los anticuerpos 20C1.009 y 22D4.017 mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). La DSC es una técnica que mide las capacidades caloríficas en función de la temperatura. La señal de la célula de muestra se compara con una célula de referencia que carece de la proteína. A medida que aumenta la temperatura de las células, se mide la entalpía y la temperatura de fusión, la anchura del pico, para cada transición de desplegamiento. Esto proporciona información sobre la estabilidad térmica y la estructura de orden superior de la proteína, incluyendo la estabilidad térmica de los dominios proteicos. La figura 27 representa un termograma de DSC de cada anticuerpo anti-PD-1 a 1 mg/ml en A52SuT y la Tabla 21 proporciona la Tm para cada anticuerpo analizado.

TABLA 21

Adicionalmente se determinó la viscosidad utilizando un cono y una placa (TA Instruments, New Castle, DE) midiendo la resistencia al flujo debida a las fuerzas de fricción entre las moléculas. Se aplicó un procedimiento de barrido de flujo de 100 a 1000 s-1 utilizando una placa de cono de 1,988° de 20 mm y una placa Peltier Steel - 990918. La viscosidad se midió en Pa ■ s, donde 1 m Pa ■ s = 1 cP a 1000 s-1. Se midió la viscosidad de cada anticuerpo a 70 y 150 mg/ml con tensioactivo al 0,01 % añadido al tampón de formulación (A52Su). Todas las muestras se midieron a temperatura ambiente. Los datos de viscosidad (velocidad de cizallamiento 1000) se muestran en la figura 28 y se proporcionan en la Tabla 22.

TABLA 22

Las propiedades de estabilidad de un anticuerpo son factores importantes que se tienen en cuenta durante el desarrollo de candidatos terapéuticos. Por ejemplo, la propensión de un anticuerpo a agregarse (formación de grandes complejos en solución que pueden conducir a la precipitación) puede afectar a la vida útil, al modo de administración (p. ej., i.v. frente a subcutáneo) y a la actividad de la molécula. Normalmente, las propiedades de termoestabilidad y viscosidad de un anticuerpo son buenos indicadores de la capacidad de un anticuerpo para mantener la integridad estructural a altas temperaturas y altas concentraciones. Como demuestran los datos anteriores, 20C1.009 presenta propiedades de estabilidad que lo hacen particularmente adecuado como un agente terapéutico que se puede administrar tanto i.v. como mediante administración subcutánea (y de alta concentración).

EJEMPLO 17

Este ejemplo demuestra la actividad de IL-21 provocada por varias proteínas de fusión.

Se prepararon varias proteínas de fusión que comprendían una muteína de IL-21 y se ensayaron con respecto a la actividad de IL-21 utilizando el ensayo pSTAT3 AlphaLISA®. Una comprendía un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TIGIT, mientras que una segunda comprendía un mAb anti-LAG3. Se generaron cuatro líneas celulares para su uso en estos experimentos: (A) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para PD-1, (B) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para TIGIT, (C) una variante de la línea de células T Hut78 que es positiva para LAG3 y (D) la línea de células T Hut78 progenitora que no expresa endógenamente PD-1, TIGlT o LAG3. Las cuatro líneas celulares se expusieron a (i) rhIL-21 sola, (ii) mAb anti-PD-1 solo, (iii) mAb anti-TIGIT solo, (iv) mAb anti-LAG3 solo, (v) mAb anti-PD-1 fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (monómero), (vi) mAb anti-TIGIT fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (dímero) y (vii) mAb anti-LAG3 fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (dímero).

Los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 y las CE50 de cada molécula para la señalización de STAT se muestran en las figuras 29A-29D y en la Tabla 23, respectivamente.

TABLA 23

Como se muestra en las figuras 29A-29D y en la Tabla 23, las proteínas de fusión anti-TIGIT y anti-LAG3 presentaron una potencia significativamente reducida (anti-TIGIT) o ninguna potencia medible (anti-LAG3) en comparación con rhIL-21.

EJEMPLO 18

Se utilizaron ratones NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wj1/SzJ (Jax número de stock 005557) a las 6-8 semanas de edad. Como se muestra en la figura 30A, el día 0, los animales fueron reconstituidos con 2,5 x 106 CTL recién descongelados en 100 |jl en PBS, 2 x 105 EU de IL-2 (Peprotech, n.° de catálogo 200-02-1mg, n.° de lote 11172) en BSA al 0,02 % en PBS en 100 j l mediante inyección intraperitoneal. Además, a los ratones se les injertó 1 x 106 células de melanoma (PD-L1+) humanas que expresaban péptido CMV (SKMEL-30-Luc) modificadas por ingeniería genética para expresar un antígeno modelo (CMV-SKMEL-30-Luc, expresando antígenos peptídicos (pp65m 1E1 y UL138) derivados de citomegalovirus, CMV) en 100 j l en una mezcla 50:50 de factor de crecimiento Matrigel reducido (Corning) y RPMI sin suero por vía subcutánea en el flanco posterior derecho. Los animales recibieron dos refuerzos adicionales de IL-2 el día 2 y el día 11. El día 17, se determinaron los volúmenes tumorales, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de estudio y se iniciaron los tratamientos: Isotipo 300 jg IP Q3Dx3 (BioXCell), mAb anti-PD-1 (quimera que consiste en una región variable de anti-PD1 humano y una región constante de IgG1 de ratón) 300 jg IP Q3Dx3, mAb anti-PD-1 x monómero de proteína de fusión R9E:R76A (quimera que consiste en una región variable de anti-PD-1 humano, una región constante de IgG1 de ratón y una fusión del extremo C de la variante de IL-21 humana R9E:R76A) 363 jg IP Q3DX3. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana. Todos los estudios experimentales se realizaron según protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Amgen. Los animales se alojaron en instalaciones acreditadas por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (en Amgen) en alojamientos con microaislamiento ventilados sobre lecho de mazorca de maíz. Los animales tuvieron acceso ad libitum a alimento peletizado estéril y agua purificada por ósmosis inversa y se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas con acceso a oportunidades de enriquecimiento del entorno.

A los ratones humanizados (generados como se ha descrito anteriormente) se les injertó células de melanoma (PD-L1+) humanas (SKMEL-30-Luc) modificadas por ingeniería genética para expresar un antígeno modelo (CMV-SKMEL-30-Luc, que expresa antígeno peptídico derivado de citomegalovirus, CMV). Los ratones se trataron con [1] un mAb anti-PD-1 quimérico humano-ratón, con un dominio variable que reconoce PD-1 humano y una región Fc constante de IgG1 de ratón; o [2] una proteína de fusión que consiste en el mismo mAb anti-PD-1 progenitor y una IL-21 humana monomérica R9E:R76A (de la que se muestra un esquema en la figura 30C). En la Tabla 24 se muestra un resumen de atributos de las moléculas.

TABLA 24

El mismo día del injerto del tumor, los ratones recibieron CTL específicos de antígeno transferidos adoptivamente (CMV) que tienen una potente citotoxicidad in vitro contra las células cancerosas que expresan el antígeno. En este modelo, el fracaso de los CTL reactivos a los tumores para controlar el crecimiento del cáncer conduce al desarrollo de tumores progresivos que son palpables el día 17. La administración terapéutica (en ratones con tumores establecidos de ~100 mm3) con un anticuerpo de control de isotipo o un mAb anti-PD-1 no logró resolver la enfermedad ni tuvo ningún impacto perceptible en el crecimiento del tumor (figuras 30D-30E)). Por el contrario, la administración terapéutica de una proteína de fusión PD1 x IL-21 (Tabla 24), tiene un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento tumoral y mejora la supervivencia global (figuras 30B, 30E y 30F). En conjunto, los datos de los presentes inventores respaldan la idea de que la activación crónica de las células T puede conducir a una respuesta inmunitaria antitumoral disminuida, y que la administración de una proteína de fusión que consiste en una fracción de IL-21 dirigida a PD-1 puede prolongar significativamente la función de los CTL y apoyar un control tumoral superior en un modelo de ratón que es refractario a la monoterapia con mAb anti-PD-1.

EJEMPLO 19

Generación de líneas celulares de sobreexpresión de PD-L1.

Se sembraron células GP2-293 en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 %, 1 % de Pen/Estrep, 1 % de HEPES y 1 % de GlutaMAX. Las células se pusieron con una confluencia del 75 % en placas de 10 cm y se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO²durante la noche. A la mañana siguiente, las células se sometieron a transfección. Al tubo A, se añadieron 45 j l de Lipofectamine 3000 y 500 j l de medio OptiMEM. Al tubo B, se añadieron 15 |jg de plásmido MSCV_GFP_PD-L1, 1,8 jg de plásmido VSV-g, 30 j l de reactivo P3000 y 500 j l de medio OptiMEM. Los tubos A y B se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió el contenido del tubo B al tubo A y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se añadió gota a gota a placas de células GP2-293 que se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO²durante la noche. A la mañana siguiente, el medio se retiró y se reemplazó con 10 ml de medio de cultivo fresco. Esa tarde, las células diana se pusieron con una confluencia del 75 % en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO²durante la noche. A la mañana siguiente, se recogieron los sobrenadantes víricos de células GP2-293 y se centrifugaron (5 minutos, 1200 rpm). Los sobrenadantes se recogieron en un tubo nuevo y se añadió polibreno a 1:1000. Se retiraron los medios de las placas que contenían células diana y se añadieron 2 ml de sobrenadante vírico. Para las células en suspensión, se centrifugaron 1E6 células a 1500 rpm durante 5 minutos, se resuspendieron en 500 j l de RPMI complementado con suero bovino fetal al 10 % y pen/estrep al 1 %, y se sembraron en placas de 6 pocillos a las que se añadieron 2 ml de sobrenadante vírico. Las placas que contenían células diana y sobrenadantes víricos se centrifugaron durante 1,5 horas a 1200 x g a 32 °C y luego se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO². Se añadió medio de cultivo después de 5 horas. Cuatro días después, las células se analizaron para determinar la expresión de GFP y PD-L1 mediante citometría de flujo con un FACSymphony. PD-L1 se detectó usando un anticuerpo conjugado con PE, clon 29E.2A3. Las células positivas para la expresión de PD-L1 <70 % se clasificaron en un clasificador BD Melody.

EJEMPLO 20

Combinación de TDCC con 20C1.009.

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de células T (TDCC): Se diluyeron moléculas de BiTE® en medios de cultivo celular (RPMI, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, GlutaMAX 1X, Pen/Estrep 1X), diluidos en serie (1:3, 22 en total) y se transfirieron a placas negras de 384 pocillos de fondo transparente utilizando un robot de manipulación de líquidos Bravo. Las células pan T humanas (n = 4), preactivadas con CD3/CD28 Dynabeads (1:1, 48 horas), se separaron de las perlas usando un imán y se diluyeron en medios de cultivo celular. Se evaluó la expresión de PD-1 en una alícuota de células T activadas de cada donante mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron como se ha descrito anteriormente y los datos se recopilaron en un citómetro de flujo FACSymphony y se analizaron utilizando FlowJo v10.1. Las células T activadas (2500 células/20 jl; 4 filas/donante) seguidas de células diana que sobreexpresan PD-L1 se sembraron en placas de ensayo de 384 pocillos (2500 células/20 jl; placa completa) de tal manera que la relación final entre efector y célula diana (E:T) fuera 1:1. Se añadió 20C1.009 (10 jg/m l final en 5 j l ) a 2 filas de cada donante de células T. Las placas se cubrieron con tapas MicroClime y se incubaron a 37 °C, con CO²al 5 % durante 24 horas. Para ensayos con células diana que expresaban luciferasa, Se añadieron 30 j l de reactivo Steady-Glo, Bright-Glo u One-Glo (Promega). Las placas con células diana adherentes que no expresaban luciferasa se lavaron con PBS para eliminar las células T utilizando un lavador de placas EL406 y se añadieron 25 j l de reactivo Cell Titer Glo. Las placas se incubaron con reactivo durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La luminiscencia se detectó utilizando un lector de placas BioTek Neo. La citotoxicidad específica se calculó en relación con las células diana incubadas con células T sin BiTE. Se usó el software Graphpad Prism para trazar las curvas de dosis y calcular los valores de CE50 con ajuste de curva de pendiente variable de cuatro parámetros.

Las figuras 33-41 muestran los resultados del ensayo TDCC descrito anteriormente. Las figuras 33A-41A muestran los datos de un donante de células T representativo, mientras que las figuras 33B-41B muestran los datos de cuatro donantes de células T diferentes. En conjunto, los datos de las figuras 33-41 demuestran una destrucción mejorada de las células diana con las diversas construcciones biespecíficas de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 x anti-TAA cuando se combinan con el anticuerpo anti-PD1 20C1.009.

EJEMPLO 21

Expresión de PD-1 inducida por construcción de anticuerpos monocatenarios en células T.

Se diluyeron construcciones de anticuerpos monocatenarios en medios de cultivo celular (RPMI, suero bovino fetal inactivado con calor al 10 %, GlutaMAX 1X, Pen/Estrep 1X) a 50 nM y se diluyeron en serie (1:5, 9 en total). Se sembraron diluciones en serie por duplicado en placas de ensayo (40 jl). Se utilizaron placas de 96 pocillos de fondo plano para las líneas de células diana adherentes. Se usaron placas de 96 pocillos de fondo redondo para las líneas de células diana en suspensión. Se añadieron células pan T humanas descongeladas y resuspendidas en medio de cultivo celular (80 j l de 0,625E6 células/ml) a las placas de ensayo seguidas de líneas celulares diana (80 j l de 0,125E6 células/ml). Las placas se cubrieron con tapas MicroClime y se incubaron a 37 °C, con CO²al 5 % durante 48 horas. Los ensayos cultivados en placas de fondo plano se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para permitir la transferencia de células T a placas FACS de fondo redondo. Estas placas de ensayo y las de fondo redondo se centrifugaron (3 minutos, 1500 rpm, TA) y se desecharon los sobrenadantes del cultivo celular. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de bloqueo (50 j l de PBS/FBS al 2 %, suero normal de cabra al 2 %, suero normal de ratón 2 %, bloqueante de Fc humano al 2 %) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió cóctel de anticuerpos (60 ul de PE-Cy7 anti-CD3, PerCPCy5.5 anti-CD8, BUV395 anti-CD4, FITC antiCD69, PE anti-CD25, BV650 anti-PD-1) y las placas se incubaron a 4 °C, en la oscuridad, durante 20 minutos. Las células se lavaron con 200 ul de PBS/FBS al 2 % y se centrifugaron durante 3 minutos a 1500 rpm a 4 °C. Las células se resuspendieron en 90 j l de PBS/FBS al 2 % con Sytox Blue (1:200). Los datos se recogieron en un citómetro de flujo FACSCalibur y se analizaron usando FlowJo v10.1.

EJEMPLO 22

Eficacia del anticuerpo anti-PD-1 combinado con construcciones de anticuerpos monocatenarios en estudios in vivo de modelo tumoral singénico.

Las células tumorales singénicas diseñadas para expresar antígenos reconocidos por construcciones de anticuerpos monocatenarios se inyectaron por vía subcutánea en el flanco inferior de ratones modificados por ingeniería genética para expresar tanto PD-1 humano como CD3 humano. El tratamiento con: [1] un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009); [2] una construcción de anticuerpo monocatenario (p. ej., cualquiera de las construcciones de anticuerpo monocatenario descritas en el presente documento); o [3] tanto un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) como una construcción de anticuerpo monocatenario se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen de 50-150 mm3 y se continuó durante aproximadamente 14 días. Las construcciones de anticuerpos monocatenarios se administraron mediante inyección intravenosa cada 7 días para un total de dos dosis a niveles de dosis que variaban entre 50 y 1000 jg/kg. El anticuerpo anti-PD-1 se administró mediante inyección intraperitoneal a un nivel de dosis de 300 jg cada 3 días para un total de tres dosis. El volumen del tumor se evaluó por medición con calibradores.

La combinación de un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) con un anticuerpo monocatenario produce una mayor reducción del tumor que el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 o la construcción de anticuerpo monocatenario solos.

EJEMPLO 23

Evaluación del crecimiento tumoral en un modelo de tumor de ratón subcutáneo (SC).

Eficacia de agente único y combinación: se inyectaron SC células de melanoma de ratón (células B16F10 modificadas por ingeniería genética para expresar constitutivamente EpCAM humano (huEpCAM)) en el flanco derecho de ratones (3 x 105 células/ratón) que expresaban CD3^ehumano. El volumen tumoral (mm3) se midió usando calibradores electrónicos dos veces por semana (Q2W). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 90 mm3, los animales se aleatorizaron en grupos (10 ratones por grupo) de modo que el volumen tumoral promedio al comienzo de la administración del tratamiento fuera uniforme en todos los grupos de tratamiento. Después, a los animales se les administró por vía intravenosa (IV) dos dosis de construcción de anticuerpo monocatenario huEpCAM HLE (huEpCAM HLE BiTE®) o construcción de anticuerpo monocatenario de control (EGFRvlII HLE BiTE®; BiTE® de Control) con 1 semana de diferencia. El anticuerpo anti-PD-1 se administró por vía intraperitoneal (IP) Q3D para 3 dosis, comenzando el mismo día que el tratamiento con la construcción de anticuerpos monocatenarios. Los signos clínicos, los cambios de peso corporal y el crecimiento tumoral se midieron 2 veces por semana hasta la finalización del estudio.

Análisis del volumen tumoral: los datos de eficacia in vivo con agente único se analizaron mediante RMANOVA seguido de la corrección de Dunnett. Los datos de eficacia in vivo de la combinación se analizaron mediante RMANOVA por cada agente único frente a combinación. Estos datos demuestran que la combinación de construcciones de anticuerpos monocatenarios y un anticuerpo anti-PD-1 da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral frente a cualquier agente único. Véase la figura 31.

Análisis de supervivencia: los datos de eficacia in vivo se analizaron mediante el análisis de Kaplan-Meier de la mediana de supervivencia de los ratones tratados con agentes únicos o agente único frente a combinación. Estos datos demuestran que la combinación de construcciones de anticuerpos monocatenarios y un anticuerpo anti-PD-1 da como resultado una supervivencia mejorada frente cualquier agente único. Véase la figura 32.

Cuidado animal. Los ratones hembra Balb/c (Charles 127 River Laboratories, Wilmington, MA), 6-8 semanas de fueron atendidos de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". Los animales se alojaron en instalaciones acreditadas por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (en Amgen) en alojamientos con microaislamiento ventilados sobre lecho de mazorca de maíz. Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Genentech. Los animales tuvieron acceso ad libitum a alimento peletizado estéril y agua purificada por ósmosis inversa y se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas con acceso a oportunidades de enriquecimiento del entorno.

EJEMPLO 24

Eficacia de anticuerpos anti-PD-1 combinados con construcciones de anticuerpos monocatenarios en estudios in vivo de modelo tumoral de mezcla humano.

Se mezclaron células cancerosas humanas que expresaban antígenos reconocidos por construcciones de anticuerpos monocatenarios con células T CD3+ humanas activadas en una relación de 5 x 1061 x 106 células respectivamente. Las células se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos atímicos hembra. El volumen tumoral (mm3) se midió usando calibradores electrónicos dos veces por semana (Q2W). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de aproximadamente 150 mm3, los animales se aleatorizaron en grupos (10 ratones por grupo) de modo que el volumen tumoral promedio al comienzo del tratamiento fuera uniforme en todos los grupos de tratamiento. Después, a los animales se les administró por vía intravenosa (i.v.) dos dosis de construcción de anticuerpo monocatenario HLE o construcción de anticuerpo monocatenario de control con 1 semana de diferencia. El anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) se administró por vía intraperitoneal (i.p.) Q3D para 3 dosis, comenzando el mismo día que el tratamiento con la construcción de anticuerpos monocatenarios. Los signos clínicos, los cambios de peso corporal y el crecimiento tumoral se midieron 2 veces por semana hasta la finalización del estudio.

Activación de células T CD3+. Se descongelaron 1 x 106 células T humanas y se añadieron perlas de estimulación de células T para inducir la expansión de las células T. Se añadió IL-2 al medio tres días después a 5 pg/ml y las células se expandieron en medio que contenía IL-2 durante dos semanas. Las células T activadas se recolectaron y las perlas se retiraron con imanes.

Análisis estadístico.

Análisis del volumen tumoral: los datos de eficacia in vivo con agente único se analizaron mediante RMANOVA seguido de la corrección de Dunnett. Los datos de eficacia in vivo de la combinación se analizaron mediante RMANOVA por cada agente único frente a combinación.

Análisis de supervivencia: los datos de eficacia in vivo se analizaron mediante el análisis de Kaplan-Meier de la mediana de supervivencia de los ratones tratados con agentes únicos o agente único frente a combinación.

La combinación de un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., 20C1.009) con un anticuerpo monocatenario produce una mayor reducción del tumor que el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 o la construcción de anticuerpo BiTE® solos.

EJEMPLO 25

Eficacia de las células CAR T dirigidas contra DLL3 combinadas con anticuerpo anti-PD-1 en un modelo de xenoinjerto in vivo

Se implantaron células cancerosas humanas que expresaban antígenos DLL3 reconocidos por células CAR T dirigidas contra DLL3 (usando una cualquiera de las ^sE^qID NO: 746-751) por vía subcutánea en ratones beige SCID (5 x 106 células/ratón) el día 0. El volumen tumoral (mm3) se midió usando calibradores dos veces por semana (Q2W). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 75-100 mm3, los animales se aleatorizaron en grupos (9-10 ratones por grupo) de modo que el volumen tumoral promedio al comienzo del tratamiento fuera uniforme en todos los grupos de tratamiento. Después, a los animales se les administró por vía intravenosa (IV) una dosis de células CAR T (1 x 107 células CAR T específicas de antígeno o 1 x 107 células CAR T de control) en un volumen de 200 pl. El anticuerpo anti-PD-1 se administró por vía intraperitoneal (IP) Q3D a 300 pg para 3 dosis, comenzando el mismo día que el tratamiento con células CAR T. Los signos clínicos, los cambios de peso corporal y el crecimiento del tumor se midieron dos veces por semana hasta la finalización del estudio (~ 45 días).

EJEMPLO 26

Evaluación in vitro de la citotoxicidad mediada por células CAR T contra DLL3 en combinación con un anticuerpo anti-PD-1

Se sembraron células CAR T (2500 células/20 pl; 4 filas/donante) dirigidas contra DLL3 (usando una cualquiera de las SEQ ID NO: 746-751) y células diana que sobreexpresaban PD-L1 en placas de ensayo de 384 pocillos (2500 células/20 pl) de modo que la relación final entre efector y célula diana (E:T) fuera 1:1. Se añadió AMG 404 (10 pg/ml final en 5 pl). Las placas se cubrieron con tapas MicroClime y se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO2 durante 24 horas. A continuación, Se añadieron 30 pl de reactivo Steady-Glo, Bright-Glo u One-Glo (Promega). Las placas se incubaron con reactivo durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La luminiscencia se detectó utilizando un lector de placas BioTek Neo. La citotoxicidad específica se calculó en relación con las células diana incubadas con células T sin BiTE. Se usó el software Graphpad Prism para trazar las curvas de dosis-respuesta y calcular los valores de CE50 con ajuste de curva de pendiente variable de cuatro parámetros.

EJEMPLO 27

Eficacia de las células CAR T dirigidas contra FLT3 combinadas con anticuerpo anti-PD-1 en un modelo de xenoinjerto in vivo

Se implantaron células cancerosas humanas que expresaban antígenos contra FLT3 reconocidos por células CAR T dirigidas contra FLT3 (usando una cualquiera de las SEQ ID NO: 763-774) por vía subcutánea en ratones beige SCID (5 x 106 células/ratón) el día 0. El volumen tumoral (mm3) se midió usando calibradores dos veces por semana (Q2W). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 75-100 mm3, los animales se aleatorizaron en grupos (9-10 ratones por grupo) de modo que el volumen tumoral promedio al comienzo del tratamiento fuera uniforme en todos los grupos de tratamiento. Después, a los animales se les administró por vía intravenosa (IV) una dosis de células CAR T (1 x 107 células CART específicas de antígeno o 1 x 107 células CART de control) en un volumen de 200 pl. El anticuerpo anti-PD-1 se administró por vía intraperitoneal (IP) Q3D a 300 pg para 3 dosis, comenzando el mismo día que el tratamiento con células CAR T. Los signos clínicos, los cambios de peso corporal y el crecimiento del tumor se midieron dos veces por semana hasta la finalización del estudio (~ 45 días).

EJEMPLO 28

Evaluación in vitro de la citotoxicidad mediada por células CAR T contra FLT3 en combinación con un anticuerpo anti-PD-1

Se sembraron células CAR T (2500 células/20 pl; 4 filas/donante) dirigidas contra FLT3 (usando una cualquiera de las SEQ ID NO: 763-774) y células diana que sobreexpresaban PD-L1 en placas de ensayo de 384 pocillos (2500 células/20 pl) de modo que la relación final entre efector y célula diana (E:T) fuera 1:1. Se añadió AMG 404 (10 pg/ml final en 5 pl). Las placas se cubrieron con tapas MicroClime y se incubaron a 37 °C, con 5 % de CO2 durante 24 horas. A continuación, se añadieron 30 pl de reactivo Steady-Glo, Bright-Glo u One-Glo (Promega). Las placas se incubaron con reactivo durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La luminiscencia se detectó utilizando un lector de placas BioTek Neo. La citotoxicidad específica se calculó en relación con las células diana incubadas con células T sin BiTE. Se usó el software Graphpad Prism para trazar las curvas de dosis-respuesta y calcular los valores de CE50 con ajuste de curva de pendiente variable de cuatro parámetros.

Se ha de interpretar que el uso de los términos "un", "uno/una" y "el/la" y las referencias similares en el contexto de la descripción de la divulgación (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende(n)", "que tiene(n)", "que incluye(n)", y "que contiene(n)" se han de interpretar como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye(n), pero sin limitación"), salvo que se indique lo contrario.

La enumeración de intervalos de valores en el presente documento, solo pretende servir como método abreviado para referirse individualmente a cada uno de los distintos valores que se encuentren dentro del intervalo y cada punto final, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado y punto final se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara de forma individual en el presente documento.

Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje ilustrativo (p. ej., "tal como") proporcionados en el presente documento, tiene por objeto simplemente ilustrar mejor la divulgación y no plantea una limitación en el alcance de la divulgación a menos que se declare lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva ha de interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la divulgación.

En el presente documento se describen realizaciones preferidas de esta divulgación, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la divulgación. Las variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen dichas variaciones según convenga, y también pretenden que la divulgación se ponga en práctica de una manera distinta a la descrita específicamente en el presente documento. Por consiguiente, la divulgación incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto mencionada en las reivindicaciones adjuntas a la misma como se permite por la normativa aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas las posibles variaciones de los mismos está abarcado por la divulgación a menos que se indique lo contrario o el contexto lo contradiga claramente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ ID NO: 352; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC que comprende la SEQ ID NO: 353; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC que comprende la SEQ ID NO: 354; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) que comprende la SEQ ID NO: 355; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC que comprende la SEQ ID NO: 356; y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC que comprende la SEQ ID NO: 357.

2. La proteína de unión al antígeno PD-1 de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No : 359.

3. La proteína de unión al antígeno PD-1 de la reivindicación 2, que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 265 o SEQ ID NO: 266.

4. El dominio de unión al antígeno PD-1 de la reivindicación 2 o 3, que comprende una región constante de cadena ligera kappa.

5. La proteína de unión al antígeno PD-1 de la reivindicación 4, que comprende una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 361.

6. La proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 361.

7. Una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 360 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 361.

8. La proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo.

9. La proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que es un anticuerpo.

10. La proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que es un producto de proteína de anticuerpo, opcionalmente, un scFv.

11. Una proteína de unión al antígeno PD-1 codificada por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 440 y 441.

12. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 432-441.

14. Un par de ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos de (a) las SEQ ID NO: 438 y 439 o (b) las SEQ ID NO: 440 y 441.

15. Un vector o vectores que comprenden el o los ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14.

16. Una célula hospedadora que comprende el o los ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o el vector o vectores de la reivindicación 15.

17. Un kit que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el o los ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, el vector o vectores de la reivindicación 15, la célula hospedadora de la reivindicación 16, o una combinación de los mismos, y un recipiente.

18. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el o los ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, el vector o vectores de la reivindicación 15, la célula hospedadora de la reivindicación 16, o una combinación de los mismos, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en donde la composición comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. Un método para fabricar una proteína de unión al antígeno PD-1 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 16 para expresar la proteína de unión al antígeno PD-1 y recolectar la proteína de unión al antígeno PD-1 expresada.

21. La proteína de unión al antígeno PD-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita.

22. La proteína de unión al antígeno PD-1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el sujeto tiene cáncer.