ES2928176T3

ES2928176T3 - Métodos para mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes

Info

Publication number: ES2928176T3
Application number: ES18738591T
Authority: ES
Inventors: Eric Kmiec; Michael Vidne; Gabi Tarcic; Brett Sansbury
Original assignee: Christiana Care Gene Editing Inst LLC; F O R E Biotherapeutics Ltd
Current assignee: Christiana Care Gene Editing Inst LLC; F O R E Biotherapeutics Ltd
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2022-11-16
Anticipated expiration: 2038-01-09
Also published as: EP3568470A1; EP3568470A4; CA3048501A1; IL267470B1; JP2020503899A; IL267470A; EP3568470B1; AU2018208463A1; US20190359973A1; IL267470B2; US20200370035A1; WO2018132390A1; JP7308380B2

Abstract

La invención se refiere a métodos para realizar mutagénesis dirigida al sitio in vitro de un gen o genes objetivo. En otro aspecto, la invención incluye kits de mutagénesis dirigida al sitio in vitro que comprenden una partícula de ribonucleótido (RNP), un oligonucleótido, un tampón, un extracto libre de células y material instructivo para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes Referencia cruzada a la solicitud relacionada

La presente solicitud reclama prioridad bajo 35 USC § 119(e) a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/444,629, presentada el 10 de enero de 2017, la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/514,494, presentada el 2 de junio de 2017, y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/533,170, presentada el 17 de julio de 2017.

Antecedentes de la invención

Creciente evidencia indica que el crecimiento de tipos de cáncer patológicamente idénticos en cada paciente individual es alimentado por diferentes conjuntos de mutaciones inductoras. La necesidad de identificar estos inductores surge de la necesidad reconocida de adaptar la terapia y programar la vigilancia futura. Un gran avance en el diagnóstico de los pacientes es el uso de la secuenciación de próxima generación para identificar las mutaciones que provocan cáncer. Sin embargo, se necesita la caracterización funcional de las mutaciones en los pacientes y su sensibilidad a diferentes fármacos de terapia dirigida.

Una forma posible de abordar este problema es monitorear los niveles de actividad de las vías de señalización por medio de un ensayo basado en células transfectadas. Como plataforma funcional, este sistema revela vías activadas independientemente del tipo de mutación, es decir, si se trata de una mutación conocida o de una variante de importancia desconocida (VUS). Una etapa central en este proceso es la síntesis de las mutaciones del paciente en plásmidos, listos para expresarse en células vivas que luego se someten a prueba en el ensayo. Actualmente, se carece de herramientas in vitro para generar mutaciones de manera automatizada y robusta. En su lugar, se usa una mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR, pero este método requiere múltiples etapas de PCR y, por lo tanto, requiere mucho tiempo.

Como alternativa al prolongado procedimiento en serie asociado con los métodos basados en PCR, se necesita una técnica que permita una mutagénesis precisa y rápida de numerosas mutaciones al mismo tiempo. Uno de los métodos de edición de genes más avanzado y prometedor es CRISPR/Cas9. Este sistema se construye ya sea mediante el uso de un sistema a base de plásmido a partir del cual se expresan los ARN guía y Cas9 o mediante el uso de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) en el que los ARN guía se acoplan con la proteína Cas9 purificada antes de su inclusión en la mezcla de reacción.

El documento WO 2015/123339 describe métodos y vectores para la manipulación de cromosomas dentro de marcos abiertos de lectura. El documento WO 2015/123339 describe métodos que comprenden la introducción de componentes del sistema CRISPR, lo que incluye la nucleasa Cas9 asociada a CRISPR y un ARN guía específico de secuencia (ARNg), en las células, lo que da como resultado rupturas de la doble cadena dirigidas por secuencia mediante el uso de la capacidad del sistema CRISPR para inducir dichas rupturas.

El documento CN 105132451 describe métodos y productos para la edición de genes. El documento CN 105132451 describe una unidad de transcripción única CRISPR/Cas9 para la modificación dirigida de un vector estructural y su aplicación. La unidad de transcripción única CRISPR/Cas9 está diseñada para la modificación genética dirigida a eucariotas.

Rivera-Torres y otros (2017) PLoS One., 12(1): 1-18, informan sobre la mutagénesis mediante la edición de genes con la ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células destinadas a la reparación de mutaciones puntuales dirigida por oligonucleótidos de ADN monocatenario cortos.

El documento US 2003/0199091 describe métodos para potenciar la alteración de secuencias de ácidos nucleicos mediada por oligonucleótidos in vivo, ex vivo e in vitro mediante el uso de células o extractos con niveles o actividad alterados de al menos una proteína del grupo de epistasis de RAD52, el grupo de reparación de errores de apareamiento o el grupo de reparación por escisión de nucleótidos.

Existe una necesidad insatisfecha en la técnica de una técnica in vitro rápida y robusta que permita la generación simultánea de mutaciones sin necesidad de secuenciación. La presente invención satisface esta necesidad.

Resumen de la invención

Como se describe en la presente descripción, la presente invención se refiere a un kit y métodos para la mutagénesis in vitro.

Un aspecto de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo. En una modalidad, el método comprende incubar una mezcla que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un primer plásmido, un oligonucleótido y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. La RNP comprende un crARN y una enzima Cas9. La RNP puede comprender además un tracrARN. El tracrARN puede hibridarse con el crARN. El primer plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo, y el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado, lo que genera por tanto un segundo plásmido mutado. El segundo plásmido se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. Se selecciona al menos una célula de la pluralidad de células que no son de la línea germinal en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

Otro aspecto de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una pluralidad de secuencias objetivo. El método comprende incubar una mezcla que comprende una pluralidad de partículas de ribonucleótidos (RNP), una pluralidad de primeros plásmidos, una pluralidad de oligonucleótidos y un extracto libre de células. En una modalidad, la pluralidad de RNP comprende una pluralidad de tracrARN, una pluralidad de crARN y una enzima Cas9, en donde la pluralidad de tracrARN se hibrida con la pluralidad de crARN. En una modalidad, la primera pluralidad de plásmidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de la pluralidad de secuencias objetivo. En una modalidad, la pluralidad de oligonucleótidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que son complementarias a la pluralidad de secuencias objetivo pero contienen al menos un nucleótido incorrectamente apareado por secuencia objetivo, lo que genera por tanto una pluralidad de segundos plásmidos mutados. En una modalidad, la pluralidad de segundos plásmidos mutados se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona la pluralidad de células en donde se ha producido mutagénesis in vitro en las secuencias objetivo.

En otro aspecto, la invención incluye un kit de mutagénesis in vitro para una secuencia objetivo que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un oligonucleótido, un plásmido, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes La RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas. El plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de una secuencia objetivo. El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero que contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado con respecto a la secuencia objetivo en la misma.

Otro aspecto más de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una primera mezcla que comprende una RNP aislada y un plásmido. En una modalidad, la RNP comprende un crARN y una enzima Cpfl, en donde el crARN es complementario a la secuencia objetivo. En una modalidad, la RNP genera una ruptura de la doble cadena en el plásmido. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte de Cpfl. En una modalidad, se genera un plásmido recircularizado. En una modalidad, el plásmido recircularizado se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

En otro aspecto, la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una mezcla que comprende una RNP aislada, un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. En una modalidad, se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

En otro aspecto más, la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una primera mezcla que comprende una primera RNP aislada, una segunda RNP aislada y un plásmido. En una modalidad, la primera RNP comprende un crARN complementario a una primera secuencia objetivo y una primera enzima Cpfl. En una modalidad, la segunda RNP comprende un segundo crARN complementario a una segunda secuencia objetivo y una segunda enzima Cpfl. En una modalidad, la primera RNP genera una primera ruptura de la doble cadena en el plásmido y la segunda RNP genera una segunda ruptura de la doble cadena en el plásmido.

La invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una mezcla que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un primer plásmido, un oligonucleótido y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. La RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas. El primer plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo. El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero que contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado. Por tanto, se genera un segundo plásmido mutado. El segundo plásmido se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. Se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

Otro aspecto de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una pluralidad de secuencias objetivo que comprende incubar una mezcla que comprende una pluralidad de partículas de ribonucleótidos (RNP), una pluralidad de primeros plásmidos, una pluralidad de oligonucleótidos y un extracto libre de células. En una modalidad, la pluralidad de RNP comprende una pluralidad de tracrARN, una pluralidad de crARN y una endonucleasa Cas. En una modalidad, la pluralidad de tracrARN se hibrida con la pluralidad de crARN. En una modalidad, la primera pluralidad de plásmidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de la pluralidad de secuencias objetivo. En una modalidad, la pluralidad de oligonucleótidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que son complementarias a la pluralidad de secuencias objetivo pero que contienen al menos un nucleótido incorrectamente apareado por secuencia objetivo. En una modalidad, se genera una pluralidad de segundos plásmidos mutados. En una modalidad, la pluralidad de segundos plásmidos se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona la pluralidad de células en donde se ha producido mutagénesis in vitro en las secuencias objetivo.

Otro aspecto más de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una primera mezcla que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP) y un plásmido. En una modalidad, la RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas, en donde el crARN es complementario a la secuencia objetivo. En una modalidad, la RNP genera una ruptura de la doble cadena en el plásmido. En una modalidad, el oligonucleótido bicatenario comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte de la RNP. En una modalidad, se genera un plásmido recircularizado. En una modalidad, el plásmido recircularizado se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo. Aún otro aspecto de la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una pluralidad de secuencias objetivo que comprende incubar una mezcla que comprende una pluralidad de partículas de ribonucleótidos (RNP), una pluralidad de primeros plásmidos, una pluralidad de oligonucleótidos y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. En una modalidad, la pluralidad de RNP comprende una pluralidad de tracrARN, una pluralidad de crARN y una endonucleasa Cas. En una modalidad, la pluralidad de tracrARN se hibrida con la pluralidad de crARN. En una modalidad, la primera pluralidad de plásmidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos de la pluralidad de secuencias objetivo. En una modalidad, la pluralidad de oligonucleótidos comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que son complementarias a la pluralidad de secuencias objetivo pero que contienen al menos un nucleótido incorrectamente apareado por secuencia objetivo. En una modalidad, se genera una pluralidad de segundos plásmidos mutados. En una modalidad, la pluralidad de segundos plásmidos se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona la pluralidad de células en donde se ha producido mutagénesis in vitro en las secuencias objetivo.

En otro aspecto más, la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo que comprende incubar una mezcla que comprende una RNP aislada, un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. En una modalidad, la RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas, en donde el crARN es complementario a la secuencia objetivo. En una modalidad, la RNP genera una ruptura de la doble cadena en el plásmido. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte de la RNP. En una modalidad, se genera un plásmido recircularizado. En una modalidad, el plásmido recircularizado se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. En una modalidad, se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

Otro aspecto de la invención incluye un kit de mutagénesis in vitro para una secuencia objetivo que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un oligonucleótido, un plásmido, un tampón, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes y material instructivo para el uso del mismo. La RNP comprende un tracrARN, un crARN y una endonucleasa Cas. El plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de una secuencia objetivo. El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero que contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado con respecto a la secuencia objetivo en la misma.

Otro aspecto más de la invención incluye un kit de mutagénesis in vitro para una secuencia objetivo que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un oligonucleótido, un plásmido, un tampón, un extracto de células y material instructivo para el uso del mismo. En una modalidad, la RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas, en donde el crARN es complementario a la secuencia objetivo. En una modalidad, el oligonucleótido comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte de la RNP.

En diversas modalidades de los aspectos anteriores o cualquier otro aspecto de la invención descrito en la presente descripción, la mutagénesis in vitro comprende al menos una mutación en la secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo seleccionada del grupo que consiste en una modificación, una eliminación y una inserción de una sola base de nucleótido. En otra modalidad, el extracto de células se deriva de al menos una célula seleccionada del grupo que consiste en HEK, HUH-7, DLD1, HCT116 y S. cerevisiae.

En una modalidad, la mezcla se incuba a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 120 minutos. En otra modalidad, cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 bases. En otra modalidad más, cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de aproximadamente 72 bases. En aún otra modalidad, cada oligonucleótido comprende además independientemente un enlace terminal modificado químicamente. En una modalidad, el enlace terminal modificado químicamente comprende una modificación 2'-O-metilo.

En ciertas modalidades, el oligonucleótido comprende además un sitio de restricción Notl. En una modalidad, la selección comprende digerir la célula con una enzima NotI.

En ciertas modalidades, el kit o método de la invención comprende además una segunda RNP que comprende un segundo crARN complementario a una segunda secuencia objetivo.

En ciertas modalidades, la endonucleasa Cas se selecciona del grupo que consiste en Cas9, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, T7, spCas9, Cpfl, Cpf2, CasY, CasX y saCas9.

Breve descripción de los dibujos

Con el propósito de ilustrar la invención, se representan en los dibujos ciertas modalidades de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones e instrumentaciones precisas de las modalidades representadas en los dibujos.

La Figura 1 es un esquema que representa un método de ensamblaje de RNP ilustrativo usado en la presente invención.

La Figura 2 es una imagen de gel que muestra la escisión del ADN por un complejo de RNP purificado.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento diseñado para mostrar la especificidad de la escisión dirigida por RNP.

La Figura 4 es una imagen de gel que demuestra la actividad enzimática después de sustraer los componentes individuales del complejo RNP.

La Figura 5 es una imagen de gel que demuestra la actividad del extracto libre de células de mamífero sobre el producto de la escisión por RNP.

La Figura 6 es un esquema que muestra la estrategia de inicialización y validación del sistema de lectura genética de la presente invención.

Las Figuras 7A-7D son un conjunto de imágenes que presentan nucleótidos objetivo para dos lecturas genéticas ilustrativas demostradas en la presente invención. La Figura 7A muestra el primer sistema de lectura: conversión de sensibilidad a la kanamicina en resistencia a la kanamicina mediante la corrección de un residuo G a un residuo T en el plásmido pKan. La Figura 7B muestra el otro plásmido, que no contiene un gen de resistencia a los antibióticos para una fácil selección, pero que porta un gen de resistencia a la ampicilina en forma de tipo salvaje para el cribado de células que han recibido el plásmido después de la transformación. En este caso, el objetivo es un gen de eGFP que porta un codón de terminación con lo cual la conversión de la tercera base, G, a una C, genera la eGFP de tipo salvaje. La Figura 7C ilustra un panel de secuencias que muestran la base objetivo en el sistema de mutagénesis in vitro de eGFP. Los clones de plásmido de partida enumerados como Q, R, S, T y U representan secuencias de referencia para la base objetivo que, en este caso, es G. La conversión a C (secuencia de tipo salvaje) produce el resultado previsto y se ilustra en la parte superior. La Figura 7D ilustra la secuencia de ADN del objetivo de kanamicina mutante y la conversión de sensibilidad a la kanamicina a resistencia a la kanamicina (G a C). La composición de una mezcla de reacción típica se proporciona más abajo. Las Figuras 8A-8B son una serie de imágenes que presentan resultados de secuenciación de ADN representativos de ADN plasmídico modificado in vitro y aislado de clones.

La Figura 9 es una imagen de gel que ilustra la optimización de las condiciones de reacción.

Las Figuras 10A-10C ilustran un mecanismo propuesto no limitante de inserción de NotI. La Figura 10A muestra el sitio de corte de la enzima de restricción NotI. La Figura 10B muestra el sitio de corte de la doble cadena escalonado por RNP Cpf1-1228 en el gen lacZ, indicado mediante flechas. El segmento de inserción de NotI duplicado se incorpora a la secuencia del gen mediante el uso de brazos complementarios a los salientes producidos por la escisión de Cpfl. La Figura 10C muestra las etapas indicadas de la reacción in vitro usada en la presente descripción para incorporar la inserción de NotI en un segmento génico.

Las Figuras 11A-11B ilustran un ensayo de digestión con NotI para confirmar la inserción del sitio NotI. El plásmido aislado a partir de las reacciones de inserción de NotI duplicado in vitro se transformó en E. coli competente DH5a. La Figura 11A muestra los resultados de una mezcla de ADN de colonias bacterianas sometida a digestión con la enzima NotI. La Figura 11B muestra los resultados del ADN de colonias bacterianas individuales sometido a digestión con la enzima NotI.

La Figura 12 ilustra los ensayos de control con NotI para confirmar la inserción del sitio NotI. Sin la adición de CFE y ligasa a las reacciones de inserción de NotI in vitro, no se observa actividad de escisión después de que el ADN de colonia bacteriana se somete a la digestión con la enzima NotI, lo que indica que no se ha producido la inserción de NotI. Reacciones adicionales muestran que las inserciones de NotI se observaron con una frecuencia más baja cuando cualquiera de los oligonucleótidos NotI monocatenarios, NotI-S o NotI-NS, se incorporaron en las reacciones in vitro en lugar del inserto de NotI duplicado.

La Figura 13 ilustra un ensayo de digestión con NotI para confirmar la inserción del sitio NotI mediante el uso de ssODN NotI-S. El plásmido aislado de las reacciones de inserción con oligonucleótido NotI monocatenario NotI-S in vitro se transformó en E. coli competente DH5a. El ADN de colonias bacterianas mezclado e individual se sometió a digestión con enzima Notl. ADN que contiene sitios de corte Notl que muestran actividad de escisión después de la digestión con NotI se indican mediante una estrella.

La Figura 14 ilustra un ensayo de digestión con NotI para confirmar la inserción del sitio NotI mediante el uso de ssODN NotI-NS. El plásmido aislado a partir de las reacciones de inserción con oligonucleótido Notl monocatenario NotI-NS in vitro se transformó en E. coli competente DH5a. El ADN de colonias bacterianas mezclado e individual se sometió a digestión con enzima NotI. ADN que contiene sitios de corte NotI que muestran actividad de escisión después de la digestión con NotI se indican mediante una estrella.

La Figura 15 ilustra el análisis de secuenciación que muestra dos clones que contienen una inserción de sitio NotI perfecta en el sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 16 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra dos clones que contienen una única inserción del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 1 pb en el sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 17 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra un clon que contiene una única inserción del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 6 pb aguas arriba del sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 18 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra un clon que contiene una única inserción del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 7 pb aguas arriba del sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 19 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra un clon que contiene una única inserción del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 9 pb aguas arriba del sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 20 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra un clon que contiene una única inserción del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 7 pb aguas abajo del sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 21 ilustra múltiples inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra tres clones que contienen inserciones duplicadas del sitio NotI que también han sufrido una eliminación de 1 pb en el sitio de corte de RNP Cpfl.

La Figura 22 ilustra inserciones de NotI que contienen eliminaciones. El análisis de secuenciación muestra un clon que contiene una inserción triple del sitio NotI que también ha sufrido una eliminación de 1 pb en el sitio de corte de RNP Cpfl.

Las Figuras 23A-23B son una serie de imágenes que ilustran un protocolo experimental de edición de genes in vitro y las herramientas usadas en la presente descripción. La Figura 23A muestra que las RNP Cas9 o Cpfl forman un complejo y se añaden a una primera mezcla de reacción de escisión in vitro con ADN plasmídico. El ADN plasmídico se recupera y se añade a una segunda mezcla de reacción de recirculación in vitro con extracto de células. Una vez completada la reacción, el ADN plasmídico se recupera de la reacción y se transforma en E. coli competente. A continuación, se aísla el ADN de las células transformadas y se secuencia para identificar las modificaciones realizadas in vitro. La Figura 23B muestra una variedad de sitios de RNP Cas9 y Cpfl en la región del gen lacZ de pHSG299. Se muestran un sitio de unión de Cas9 y cinco sitios de unión de Cpfl. El sitio de Cpfl usado para las reacciones in vitro descritas en la presente descripción se indica dentro de un recuadro, y el sitio de corte asociado se marca mediante una flecha escalonada.

Las Figuras 24A-24C son una serie de imágenes de gel que ilustran la escisión por RNP y la actividad del extracto libre de células in vitro. La Figura 24A muestra que se logró la escisión de pHSG299 mediante el uso de Cas9 de tipo salvaje, Cas9 nickasa y cinco RNP Cpfl, cada uno con secuencias de crARN distintas. Las diversas conformaciones de los productos de escisión del ADN se pueden distinguir por el grado de migración del ADN superenrollado, lineal y mellado con nickasa a través del gel de agarosa, como se muestra a la derecha. La Figura 24B muestra las actividades de escisión relativas de Cas9 y Cpfl evaluadas en condiciones de reacción in vitro con cantidades crecientes de RNP que varían de 0,1 - 50 pmol. La Figura 24C muestra cantidades crecientes de extractos libres de células de tres fuentes de líneas celulares de mamíferos (HCT 116-19 (colon), HEL 92.1.7 (eritroblasto) y HEK-293 (riñón)) que se añadieron a reacciones de escisión in vitro que contenían un RNP Cpfl, ADN plasmídico y cantidades crecientes del respectivo extracto libre de células. A medida que se aumentó la cantidad de cada extracto libre de células, se generaron fragmentos de ADN en el sitio de corte de RNP a medida que los extremos de ADN expuestos se degradaron y la actividad de la reacción era visible como líneas corridas que se deslizaban por los carriles de gel.

Las Figuras 25A-25C son una serie de imágenes que ilustran la actividad in vitro de RNP Cas9 y Cpfl. La Figura 25A muestra la frecuencia de alteración del a Dn por RNP Cas9 y Cpfl como porcentaje del número de secuencias de ADN alteradas detectadas con relación al número total de secuencias analizadas de colonias bacterianas transformadas con ADN plasmídico recuperado a partir de reacciones in vitro. Los sitios Cpfl y Cas9 se muestran a lo largo de la región del gen lacZ con los sitios de escisión asociados marcados con flechas escalonadas y rectas, respectivamente. Se muestra la secuencia de tipo salvaje de la región del gen lacZ. La Figura 25B muestra tres secuencias representativas del número total evaluadas a partir de reacciones in vitro que contienen RNP Cas9 sin alteración del ADN alrededor del sitio de escisión. La Figura 25C muestra cinco secuencias representativas del número total de secuencias evaluadas a partir de reacciones in vitro que contienen RNP Cpfl que presentan una variedad de alteraciones del ADN alrededor del sitio de escisión.

Las Figuras 26A-26D son una serie de imágenes que ilustran un mecanismo propuesto y la verificación de la inserción de fragmentos NotI duplicados. La Figura 26A es una ilustración del sitio de corte de restricción NotI. La Figura 26B muestra el sitio de escisión de la doble cadena escalonado de RNP Cpfl en el gen lacZ indicado mediante flechas. El fragmento Notl duplicado se inserta en la secuencia génica mediante el uso de dos brazos complementarios a los salientes producidos mediante la escisión por Cpfl. La Figura 26C muestra las etapas indicadas de la reacción in vitro que inserta el fragmento NotI en la región del gen lacZ. La Figura 26D muestra ADN plasmídico aislado a partir de colonias bacterianas seleccionadas transformadas con plásmidos recuperados de reacciones de inserción de fragmentos NotI duplicados in vitro sometidos a digestión con enzima NotI para confirmar la integración del sitio NotI en la región del gen lacZ. Se llevó a cabo un control adicional para confirmar que en ausencia del extracto libre de células modificado como componente de la mezcla de reacción in vitro; no se produciría la inserción del fragmento NotI.

Las Figuras 27A-27D son una serie de trazos que ilustran secuencias con inserción de fragmentos NotI duplicados. Se muestra la secuencia de la región del gen lacZ de tipo salvaje y de colonias bacterianas seleccionadas transformadas con ADN plasmídico recuperado de reacciones de inserción de fragmentos NotI duplicados in vitro. La Figura 27A muestra que el análisis de secuenciación reveló dos secuencias que contenían una inserción perfecta del fragmento NotI en el sitio de escisión. La Figura 27B muestra tres secuencias que contenían dos inserciones de fragmentos del sitio NotI acompañadas de una eliminación de 1 pb aguas arriba del sitio de escisión. La Figura 27C muestra una secuencia que contenía tres inserciones de fragmentos del sitio NotI acompañadas de una eliminación de 1 pb aguas arriba y una eliminación de 7 pb aguas abajo del sitio de escisión. La Figura 27D muestra una secuencia que no contenía una inserción de fragmento del sitio NotI en el sitio de escisión.

Las Figuras 28A-28D son una serie de imágenes que ilustran un mecanismo propuesto y la verificación de la inserción de la molécula NotI monocatenaria. La Figura 28A es una ilustración del sitio de corte de restricción NotI. La Figura 28B muestra el sitio de escisión de la doble cadena escalonado de RNP Cpfl en el gen lacZ indicado por flechas. Las moléculas NotI monocatenarias se insertan en una de las dos cadenas, la cadena sentido (S) o la cadena sin sentido (NS), mediante el uso de brazos complementarios a los salientes producidos por la escisión por Cpfl. La Figura 28C muestra ADN plasmídico mezclado y aislado de colonias bacterianas seleccionadas transformadas con plásmidos recuperados de reacciones de NotI monocatenario in vitro sometido a digestión con enzima NotI para confirmar la integración del sitio NotI en la región del gen lacZ. La Figura 28D muestra cuatro secuencias representativas de ADN plasmídico aislado de colonias bacterianas seleccionadas transformadas con plásmido recuperado de cada una de las reacciones de inserción de NotI-S y NotI-NS monocatenarios in vitro.

Las Figuras 29A-29D son una serie de imágenes que ilustran la inserción de fragmentos de 186 pb mediante el uso de dos enzimas Cpfl. La Figura 29A muestra dos nucleasas Cpfl, que cortan en sitios diferentes, que se usaron para escindir un fragmento del plásmido original y reemplazarlo con un fragmento de 186 pares de bases, creado mediante la hibridación de dos oligonucleótidos complementarios con salientes complementarios. Las Figuras 29B-29C muestran las secuencias obtenidas para la reacción in vitro con lectura en bacterias. La Figura 29D ilustra el tipo de resultados obtenidos, lo que incluye principalmente eliminaciones y un clon con inserción exitosa.

La Figura 30 ilustra reacciones de inserción o reemplazo y un evento de eliminación. Se genera una inserción en la que una RNP Cpfl crea una ruptura de ADN bicatenario escalonada y después se inserta un fragmento de ADN bicatenario en el sitio de ruptura, lo que extiende el segmento de ADN original. Se produce un evento de eliminación cuando una RNP Cpfl genera una ruptura de ADN bicatenario escalonada y los extremos expuestos se extirpan antes de volver a ligar el ADN. Una reacción de reemplazo se produce cuando dos RNP Cpfl generan distintos sitios de escisión bicatenarios escalonados a lo largo de un segmento de gen, después de lo cual se elimina el segmento entre los dos sitios de escisión, que se muestra mediante un *, y se inserta un fragmento de ADN bicatenario que reemplaza el segmento de ADN original.

La Figura 31 ilustra la actividad de RNP Cpfl in vitro. La frecuencia de alteración del ADN por la RNP Cpfl se muestra como un porcentaje del número de secuencias de ADN alteradas detectadas con relación al número total de secuencias analizadas de colonias bacterianas transformadas con ADN plasmídico recuperado de reacciones in vitro. El sitio Cpfl se muestra a lo largo de la región del gen lacZ con los sitios de escisión asociados marcados por una flecha roja escalonada a lo largo de la región del gen lacZ de tipo salvaje. Las cinco secuencias que se muestran son representativas del número total de secuencias evaluadas a partir de reacciones in vitro que contienen RNP Cpfl que muestran una variedad de alteraciones del ADN alrededor del sitio de escisión.

Las Figuras 32A-32B son una serie de imágenes que muestran secuencias adicionales de ADN plasmídico aislado de colonias bacterianas seleccionadas transformadas con plásmido recuperado de la reacción de NotI-S monocatenario in vitro.

Las Figuras 33A-33C son una serie de imágenes que muestran el reemplazo de bases en el gen lacZ.

La Figura 33A muestra un reemplazo de 81 bases. Se muestran dos sitios de unión de RNP Cpfl separados por 81 pares de bases a lo largo de la secuencia del gen lacZ de tipo salvaje con los dos sitios de corte escalonados resultantes ilustrados por dos flechas escalonadas. A continuación, se elimina el segmento de ADN entre los dos sitios de corte y se integra un fragmento de reemplazo de 81 bases duplicado en el gen en los sitios de corte. La secuencia del gen lacZ de tipo salvaje se muestra encima de la secuencia de un reemplazo perfecto de 81 bases. Los recuadros indican el sitio de la enzima de restricción NotI insertado y la secuencia del código de barras (TT). La Figura 33B muestra un reemplazo de 136 bases. Se muestran dos sitios de unión de RNP Cpfl separados por 136 pares de bases a lo largo de la secuencia del gen lacZ de tipo salvaje con los dos sitios de corte escalonados resultantes ilustrados por dos flechas escalonadas. A continuación, se elimina el segmento de ADN entre los dos sitios de corte y se integra un fragmento de reemplazo de 136 bases duplicado en el gen en los sitios de corte. La secuencia del gen lacZ de tipo salvaje se muestra encima de la secuencia de un reemplazo perfecto de 136 bases. Los recuadros indican el sitio de la enzima de restricción Notl insertado y la secuencia del código de barras (AA/TT). La Figura 33C muestra un reemplazo de 186 bases. Se muestran dos sitios de unión de RNP Cpfl separados por 177 pares de bases a lo largo de la secuencia del gen lacZ de tipo salvaje con los dos sitios de corte escalonados resultantes ilustrados por dos flechas escalonadas. A continuación, se elimina el segmento de ADN entre los dos sitios de corte y se integra un fragmento de reemplazo de 186 bases duplicado en el gen en los sitios de corte. La secuencia del gen lacZ de tipo salvaje se muestra encima de la secuencia de un reemplazo perfecto de 186 bases. Los recuadros indican el sitio de la enzima de restricción NotI insertado y la secuencia del código de barras (GGG).

La Figura 34 muestra secuencias adicionales de inserciones de fragmentos de longitudes variables en el gen lacZ. El sitio de corte de RNP Cpf1-1228 se ilustra a lo largo de la secuencia de la región del gen lacZ de tipo salvaje. Se muestran las secuencias de reacciones de inserción in vitro que contienen fragmentos de ADN de 17, 36, 45 y 81 bases duplicados que dan como resultado inserciones imperfectas. Estas secuencias procedían de colonias bacterianas seleccionadas que se transformaron con ADN plasmídico aislado.

Las Figuras 35A-35B ilustran secuencias adicionales de reemplazos de segmentos de longitudes variables en el gen lacZ. Se muestran dos sitios Cpfl a lo largo de la secuencia de la región del gen lacZ de tipo salvaje para las reacciones de sustitución de segmentos de 17, 45, 81, 136 y 186 bases. Estas secuencias se seleccionaron de colonias bacterianas transformadas con ADN plasmídico aislado, que demuestran reacciones de sustitución in vitro imperfectas que contienen fragmentos de ADN de 17, 45, 81, 136 y 186 bases duplicados.

Las Figuras 36A-36D son una serie de imágenes que ilustran la mutagénesis dirigida al sitio en el gen KRAS. La Figura 36A muestra un mapa de plásmido representativo para pKRAS que contiene el gen de resistencia a la kanamicina y el gen KRAS de interés. Se observan variaciones mutacionales para las mutaciones G12D y G13D en comparación con la secuencia de tipo salvaje del gen KRAS. La Figura 36B muestra dos RNP Cpfl separadas por 114 bases de a lo largo de la región del gen KRAS que abarca los sitios de las mutaciones G12D y G13D. Se muestran representaciones de las variaciones de mutación simple y mutación doble incorporadas en los fragmentos de reemplazo de 114 bases duplicados. La Figura 36C muestra la secuencia de la región del gen KRAS de tipo salvaje y se muestran colonias bacterianas seleccionadas transformadas con ADN plasmídico aislado de una reacción de reemplazo in vitro perfecta que contiene las tres variaciones de mutaciones del fragmento de ADN de 114 bases duplicado con las mutaciones específicas incorporadas indicadas dentro del recuadro rojo. La Figura 36D muestra la confirmación de que no se produjeron efectos fuera del objetivo mediante una vista alineada del plásmido que contenía el fragmento de mutación G12D/G13D perfectamente reemplazado (línea gris continua) con el plásmido KRAS de tipo salvaje (línea negra doble continua), que indica que los únicos errores de apareamiento observados son los dos cambios de pares de bases previstos que se producen como resultado de las mutaciones G12D y G13D, que se muestran dentro del recuadro.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica para someter a prueba la presente invención, en la presente descripción se describen materiales y métodos ilustrativos. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante.

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Aproximadamente", como se usa en la presente descripción cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ±20 % o ±10 %, con mayor preferencia ±5 %, incluso con mayor preferencia ±1 %, y aún con mayor preferencia ±0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos.

Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad" se refiere a la abundancia o cantidad de un constituyente en una mezcla.

Como se usa en la presente descripción, el término "pb" se refiere a un par de bases.

El término "complementario" se refiere al grado de alineamiento antiparalelo entre dos cadenas de ácido nucleico. La complementariedad completa requiere que cada nucleótido esté enfrente de su opuesto. Ninguna complementariedad requiere que cada nucleótido no esté enfrente de su opuesto. El grado de complementariedad determina la estabilidad de las secuencias para estar juntas o aparearse/hibridarse. Además, diversas funciones de reparación del ADN, así como también funciones reguladoras, se basan en la complementariedad de los pares de bases.

El término "CRISPR/Cas" o "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas" o "CRISPR" se refiere a loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases seguidas de segmentos cortos de ADN espaciador a partir de exposiciones previas a un virus o plásmido. Las bacterias y las arqueas han desarrollado defensas inmunitarias adaptativas denominadas sistemas CRISPR/asociados a CRISPR (Cas) que usan ARN corto para dirigir la degradación de ácidos nucleicos extraños. En las bacterias, el sistema CRISPR proporciona inmunidad adquirida contra el ADN extraño invasor a través de la escisión del ADN guiada por ARN.

"Endonucleasa Cas" se refiere a una enzima endonucleasa asociada a CRISPR. Un ejemplo no limitante de una endonucleasa Cas es Cas9. Otras endonucleasas Cas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Cpfl, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, T7, spCas9, Cpf2, CasY, CasX y/o saCas9. El sistema "CRISPR/Cas9" o "edición de genes mediada por CRISPR/Cas9" se refiere a un sistema CRISPR/Cas de tipo II que se ha modificado para la edición/manipulación por ingeniería genética del genoma. Típicamente, se compone de un ARN "guía" (ARNg) y una endonucleasa asociada a CRISPR no específica (Cas9). "ARN guía (ARNg)" se usa indistintamente en la presente descripción con "ARN guía corto (ARNgc)". El ARNgc es un ARN sintético corto compuesto por una secuencia de "andamio" necesaria para la unión a Cas9 y una secuencia "espadadora" o "de direccionamiento" de ~20 nucleótidos definida por el usuario que define el objetivo genómico que se va a modificar. El objetivo genómico de Cas9 se puede cambiar mediante el cambio de la secuencia de direccionamiento presente en el ARNg.

"Codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y generalmente se proporciona en los listados de secuencias, como la cadena no codificante, usada como la plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, puede denominarse que codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

Como se usa en la presente descripción, "endógeno" se refiere a cualquier material procedente de un organismo, célula, tejido o sistema, o producido en su interior.

Como se usa en la presente descripción, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión", como se usa en la presente descripción, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular inducida por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, virus Sendai, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Homóloga", como se usa en la presente descripción, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN, dos moléculas de ARN, una molécula de ADN y una molécula de ARN, una molécula de ADN y una molécula de ARNgc, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero con una longitud de diez subunidades) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50 % homólogas; si el 90 % de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) coinciden o son homólogas, las dos secuencias son 90 % homólogas.

"Identidad", como se usa en la presente descripción, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, particularmente entre dos moléculas de aminoácidos, tal como, entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando dos secuencias de aminoácidos tienen los mismos residuos en las mismas posiciones; por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas polipeptídicas está ocupada por una arginina, entonces estas son idénticas en esa posición. La identidad o el grado en que dos secuencias de aminoácidos tienen los mismos residuos en las mismas posiciones en un alineamiento se expresa a menudo como un porcentaje. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos es una función directa del número de posiciones coincidentes o idénticas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero con una longitud de diez aminoácidos) de las posiciones en dos secuencias son idénticas, las dos secuencias son 50 % idénticas; si el 90 % de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) coinciden o son idénticas, las dos secuencias de aminoácidos son 90 % idénticas.

Como se usa en la presente descripción, un "material instructivo" incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la invención. El material instructivo del kit de la invención puede, por ejemplo, adherirse a un contenedor que contenga el ácido nucleico, el péptido y/o la composición de la invención o enviarse junto con un contenedor que contenga el ácido nucleico, el péptido y/o la composición. Alternativamente, el material instructivo puede enviarse por separado del contenedor con la intención de que el receptor use el material instructivo y el compuesto de manera cooperativa.

Por el término "modificado", como se usa en la presente descripción, se entiende un estado o estructura cambiados de una molécula o célula de la invención. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, lo que incluye química, estructural y funcionalmente. Las células pueden modificarse mediante la introducción de ácidos nucleicos. Una "mutación", como se usa en la presente descripción, es un cambio en una secuencia de ADN que da como resultado una alteración de una secuencia de referencia dada (que puede ser, por ejemplo, una muestra de ADN recolectada anteriormente del mismo sujeto). La mutación puede comprender la eliminación y/o inserción y/o duplicación y/o sustitución de al menos una base de ácido desoxirribonucleico tal como una purina (adenina y/o timina) y/o una pirimidina (guanina y/o citosina). Las mutaciones pueden o no producir cambios perceptibles en las características observables (fenotipo) de un organismo (sujeto).

Por "ácido nucleico" se entiende cualquier ácido nucleico, ya sea compuesto de desoxirribonucleósidos o ribonucleósidos, y ya sea compuesto de enlaces fosfodiéster o enlaces modificados tales como fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato con puente, metileno fosfonato con puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, enlaces fosforotioato o sulfona con puente, y combinaciones de dichos enlaces. El término ácido nucleico también incluye específicamente ácidos nucleicos compuestos por bases distintas de las cinco bases de origen biológico (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo).

En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que aparecen comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

A menos que se especifique de cualquier otra manera, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede, en alguna versión, contener uno o más intrones.

El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 100 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza a "T".

Como se usa en la presente descripción, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto que comprende residuos de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación sobre el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en la presente descripción, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de estos.

El término "polinucleótido" incluye ADN, ADNc, ARN, híbrido ADN/ARN, ARN antisentido, ARNip, miARN, ARNsno, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, tanto cadenas con sentido como antisentido, y pueden modificarse química o bioquímicamente para contienen bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, sintéticas o semisintéticas. También, incluidas dentro del alcance de la invención, están las alteraciones de un gen de tipo salvaje o sintético, lo que incluye, pero no se limita a, la eliminación, inserción, sustitución de uno o más nucleótidos o la fusión con otras secuencias de polinucleótidos.

Se usa en la presente descripción la notación convencional para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótidos monocatenaria es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de una secuencia de polinucleótidos bicatenaria se denomina dirección 5'.

Un "cebador" es un oligonucleótido, generalmente con una longitud de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos, que es capaz de hibridarse de una manera específica de secuencia con la secuencia objetivo y extenderse durante la PCR.

El término "promotor", como se usa en la presente descripción, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

Una "muestra" o "muestra biológica", como se usa en la presente descripción, significa un material biológico de un sujeto, lo que incluye, pero no se limita a, órganos, tejidos, exosomas, sangre, plasma, saliva, orina y otros fluidos corporales. Una muestra puede ser cualquier fuente de material obtenido a partir de un sujeto.

El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Un "sujeto" o "paciente", como se usa en la presente descripción, puede ser un mamífero humano o no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ganado y mascotas, tales como mamíferos ovinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y murinos. Preferentemente, el sujeto es humano.

Un "gen tomado como objetivo", "secuencia objetivo" o "secuencia objetivo", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se toma como objetivo específicamente para la mutagénesis. La secuencia de ácido nucleico que se toma como objetivo puede estar en una región codificante (gen) o no codificante de un genoma.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", como se usa en la presente descripción, se refiere a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o se introduce en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una que se ha transfectado, transformado o transducido con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su progenie.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores, lo que incluye, pero no se limita a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido o un virus que se replica de forma autónoma. El término también debe interpretarse como que incluye compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tal como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus Sendai, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

Intervalos: a lo largo de esta descripción, diversos aspectos de la invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los subintervalos posibles, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha descrito específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como también los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

La invención se refiere a un método novedoso para realizar mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes. En ciertas modalidades, la invención incluye un kit de mutagénesis dirigida al sitio in vitro que comprende una partícula de ribonucleótidos (RNP), un oligonucleótido, un tampón, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes y material instructivo para su uso.

La invención incluye un método para realizar mutagénesis in vitro. En modalidades, el método comprende incubar una mezcla que comprende la r Np , un primer plásmido, un oligonucleótido, un tampón y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes, lo que forma por tanto un segundo plásmido mutado. En aún otras modalidades, el método comprende aislar el segundo plásmido. El método comprende administrar el segundo plásmido aislado a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. El método comprende además seleccionar de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro del gen objetivo. La RNP se puede ensamblar al hibridar tracrARN con crARN y después combinar con Cas9. El plásmido contiene un gen objetivo. El gen objetivo puede ser cualquier gen en una célula. En una modalidad, el gen objetivo es EGFP.

En otras modalidades, el método comprende incubar una primera mezcla que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP) y un plásmido, en donde la RNP comprende un crARN y una enzima Cpfl, en donde el crARN es complementario al gen tomado como objetivo, y en donde la RNP genera una ruptura de la doble cadena en el plásmido. En aún otras modalidades, el método comprende administrar el plásmido recircularizado a una pluralidad de células y seleccionar de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en el gen tomado como objetivo.

En ciertas modalidades, la invención incluye un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo, que comprende incubar una mezcla que comprende una RNP aislada, un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes. La RNP comprende un crARN y una enzima Cpfl. El crARN es complementario a la secuencia objetivo, y la RNP genera una ruptura de la doble cadena en el plásmido. El oligonucleótido monocatenario comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte Cpfl. Se genera un plásmido recircularizado y se administra a una pluralidad de células que no son de la línea germinal. Se selecciona de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.

En ciertas modalidades, el oligonucleótido bicatenario comprende un sitio de restricción NotI.

Las células se pueden seleccionar mediante el uso de cualquier medio estándar conocido por un experto en la técnica. En una modalidad, la selección puede comprender digerir la célula con una enzima NotI para confirmar que se ha producido una mutagénesis in vitro. El extracto libre de células se puede derivar de cualquier célula o línea celular conocida en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, HEK, HUH-7, DLD1, HCT116 y S. cerevisiae. En la presenta descripción se demuestra un nuevo sistema en el que una partícula RNP contiene crARN y/o tracARN como entidades separadas, similar a lo que se encuentra en los sistemas naturales y las bacterias. Acoplado con la proteína Cas9 o Cpfl, este sistema aumenta la eficacia y la precisión, lo que reduce la preocupación por la mutagénesis fuera del sitio. Son posibles una serie de capacidades para la síntesis de mutaciones, que van desde mutaciones puntuales de una sola base, eliminaciones o inserciones de una sola base, pequeñas inserciones o eliminaciones y pequeños duplicados dentro de la región codificante de los genes objetivo.

Las etapas fundamentales para este nuevo ensayo se establecieron y validaron para una amplia gama de mutaciones en la secuencia de ADN. Esto se centró principalmente en aumentar la eficacia y la eficiencia de la creación de mutaciones puntuales en genes objetivo específicos. Además, se usa una partícula de tipo RNP más universal que amplía la versatilidad del ensayo y permite una mutagénesis precisa en múltiples sitios simultáneamente dentro de la región codificante del gen.

Estructura y composición de oligonucleótidos para diversas modificaciones en genes objetivo

Los oligonucleótidos monocatenarios son moléculas de ADN sintético bien estudiadas y útiles para la edición de genes porque se puede incorporar una gran cantidad de modificaciones y variaciones químicas en su composición. Algunas de estas modificaciones permiten una mayor afinidad de unión a un ADN objetivo dúplex, lo que garantiza que el intermediario de reacción crítico, el bucle D, sea lo suficientemente estable como para dirigir el intercambio genético. Pueden usarse varias clases de modificaciones químicas en este estudio para que la alteración genética deseada en el gen objetivo se cree con una mayor eficiencia. En ciertas modalidades, las modificaciones, eliminaciones o inserciones de una sola base de nucleótido se ejecutan mediante un oligonucleótido con una longitud de aproximadamente 72 bases que porta enlaces terminales modificados químicamente para evitar la digestión por nucleasas en el extracto libre de células. Este oligonucleótido caballo de batalla está diseñado para que se una en perfecto registro homólogo y complementariedad con la secuencia del gen objetivo, excepto por un único error de apareamiento que se crea en el nucleótido en el gen objetivo designado para el cambio. El par de bases incorrectamente apareado se corrige con la máxima eficiencia cuando se crea en la base central del oligonucleótido durante el alineamiento de las cadenas complementarias. Para las alteraciones del gen objetivo en las que se desean sustituciones de nucleótidos dobles o pequeñas inserciones o eliminaciones, se utilizan dos tipos de modificaciones químicas en el oligonucleótido de direccionamiento. Ambas están diseñadas para aumentar la afinidad por el objetivo de modo que la sección del gen tomado como objetivo se pueda eliminar o se puedan colocar pequeñas inserciones dentro de la secuencia del gen. Las modificaciones químicas que aumentan la afinidad de unión y el apareamiento estable de ADN entre un donante de oligonucleótidos monocatenarios entrante (ssODN) y el dúplex a medida que se incorpora a la hélice se sintetizan solas o en combinación en el oligonucleótido de direccionamiento.

El grupo de modificaciones 2'-O-(metilo, fluoro, etc.) ofrece un aumento significativo en la afinidad de unión con objetivos en ARN y ADN y también se ha demostrado que aumenta la resistencia a la digestión por nucleasas tanto en condiciones libres de células como después de la microinyección en las células. Típicamente, se incorporan una serie de modificaciones 2'-O-metilo (que varían de 3 a 5) en los brazos izquierdo y/o derecho del vector caballo de batalla (72-mer), así como también dentro de la base en el centro de la molécula que rodea el sitio objetivo. Otra modificación 2' que mejora la afinidad de unión por el ADN es la adición de un grupo fluoro a las bases designadas en el oligonucleótido. Una vez más, se colocan una serie de bases modificadas con grupos fluoro en los brazos 3' y 5', así como también en la región central del vector de direccionamiento. El ácido nucleico enlazado (LNA) se ha convertido en una modificación destacada para aumentar la afinidad de unión. El LNA es un ácido nucleico bicíclico que une el 2'-O al 4'C para crear un puente de metileno que bloquea de manera efectiva la estructura en una conformación de azúcar 3'. Dado que la longitud del oligonucleótido puede extenderse desde aproximadamente 72 a aproximadamente 200 bases, donde el producto final deseado es una inserción de 20 bases, las secciones laterales del oligonucleótido pueden portar una serie de estas modificaciones para mejorar la estabilidad de unión al objetivo. Lo mismo es cierto en el caso de que el objetivo sea eliminar 20 bases. En ciertas modalidades, el oligonucleótido de direccionamiento tiene una longitud de 52 bases y porta secciones laterales de restos químicos que mejoran la avidez de unión. En ciertas modalidades, el oligonucleótido tiene una longitud de entre 25 y 200 bases, y cualquiera y todos los números intermedios. De esta manera, pueden crearse modificaciones genéticas más allá de la sustitución de una sola base con una eficiencia relativamente alta e identificarse a través del enfoque de direccionamiento dual indicado en la presente descripción.

Los oligonucleótidos pueden manipularse por ingeniería genética para que tengan una longitud de entre aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, o aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 125 nucleótidos, o aproximadamente 60 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, o aproximadamente 70 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos. El oligonucleótido puede tener aproximadamente 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200 nucleótidos, o cualquier número de nucleótidos intermedios. En una modalidad, el oligonucleótido tiene una longitud de más de 60 nucleótidos. En otra modalidad, el oligonucleótido tiene una longitud de más de 70 nucleótidos. En aún otra modalidad, el oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 72 nucleótidos. En todavía otra modalidad, el oligonucleótido tiene una longitud de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 bases.

Fuentes de extracto libre de células

Existen una serie de fuentes para los extractos de células que proporcionan la actividad enzimática para la edición de genes ubicados en vectores de expresión u objetivos episomales. Si bien la tendencia podría ser aislar y purificar extractos nucleares de células de mamífero únicamente, los extractos de células enteras que contienen actividades citoplasmáticas permiten un mayor nivel de edición de genes y, por tanto, se utilizan en los experimentos descritos en la presente descripción. Los extractos libres de células de mamífero se pueden obtener de cualquier tipo de célula, lo que incluye, pero no se limita a, las células HEK, HUH-7, DLD1, HCT116 y S. cerevisiae. Las dos últimas se originan a partir de células de cáncer de colon, mientras que el primero se origina del hígado. Cada línea celular ha demostrado ser una rica fuente de extractos de células que pueden catalizar la actividad de edición de genes. Se conoce que estas líneas celulares son deficientes en una o más actividades de reparación de errores de apareamiento de proteínas que, aunque algo contradictorio, en realidad permite niveles más altos de edición de genes. Cuando un oligonucleótido entrante crea un error de apareamiento con el gen objetivo, para permitir el intercambio, la inserción o la eliminación de nucleótidos, la tendencia natural de una vía de reparación de errores de apareamiento de tipo salvaje es reconocer y desestabilizar ese apareamiento. Se llevaron a cabo extensos estudios genéticos y bioquímicos para demostrar que el intercambio de nucleótidos inducido por ssODN en el sitio objetivo se potencia en dichos fondos de células mutantes (Dekker y otros, Nucleic Acids Res. 31(6) e27). La preparación y utilización de extractos libres de células de levadura, principalmente S. cerevisiae, para permitir la modificación genética de vectores de expresión proporciona un enfoque innovador para modificar objetivos episomales. La variedad de fondos genéticos en S. cerevisiae, notablemente manejable genéticamente, proporciona una rica fuente de actividad enzimática que podría ser más eficiente en la ejecución de reparaciones de una sola base, eliminaciones de segmentos pequeños, inserciones de segmentos pequeños o duplicaciones de fragmentos de genes. Por tanto, en dependencia del objetivo, la cepa adecuada se puede utilizar como fuente para el extracto libre de células para lograr el éxito de la manera más validada y rápida.

Suplementación del extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de enzimas

En ciertas modalidades, la modificación química del oligonucleótido proporciona la estrategia más eficiente para producir una amplia gama de modificaciones genéticas apropiadas. Sin embargo, si una serie particular de alteraciones genéticas se vuelve problemática, pueden usarse extractos de células suplementados con herramientas genéticas adicionales. Se dispone de una amplia variedad de constructos de expresión de CRISPR/Cas9 que se expresan altamente en líneas celulares de mamíferos. Los ejemplos no limitantes de estos constructos incluyen el plásmido p42230, que contiene una SpCas9 con optimización de codones humana y un sitio de inserción para el ARN guía quimérico, y otros constructos con un vector de cadena principal pX330 (Addgene). Un constructo CRISPR/Cas9 particular puede transfectarse en células de mamífero y expresarse antes de preparar un extracto libre de células, lo que enriquece de esta manera la actividad enzimática de la edición de genes. Sin desear limitarse a una teoría específica, la suplementación del extracto libre de células puede ayudar a dirigir el oligonucleótido a un sitio específico e indirectamente potenciar la frecuencia de edición del gen objetivo. En ciertas modalidades, si el objetivo experimental es la simple eliminación o inserción de un segmento de ADN del gen objetivo, puede ser preferible utilizar el extracto libre de células suplementado con una función CRISPR/Cas9 inicialmente para permitir la generación de esa alteración genética. Se ha realizado una serie innovadora de experimentos en los que se insertó una molécula larga de ADN monocatenario en un gen de mamífero, en marco, para etiquetar el gen desactivado (Miura y otros, Sci Rep. 2015, 5 de agosto; 5:12799). Dicho enfoque también puede usarse in vitro mediante el uso de extractos libres de células.

Kits

En ciertos aspectos, la invención proporciona kits de mutagénesis in vitro para una secuencia objetivo. En una modalidad, el kit comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un oligonucleótido bicatenario, un plásmido, un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes y, preferentemente, comprende además material instructivo para su uso. La RNP comprende un crARN y una enzima Cpfl, en donde el crARN es complementario a la secuencia objetivo, y el oligonucleótido bicatenario comprende salientes 5' complementarios al sitio de corte de Cpfl. En ciertas modalidades, el oligonucleótido bicatenario comprende un sitio de restricción NotI.

El crARN es complementario al gen objetivo y el oligonucleótido monocatenario comprende un sitio de restricción NotI y salientes 5' complementarios al sitio de corte de Cpfl.

Los kits pueden comprender además una segunda RNP que comprende un segundo crARN complementario a una segunda secuencia objetivo.

CRISPR/Cas

El sistema CRISPR/Cas es un sistema fácil y eficiente para inducir alteraciones genéticas dirigidas. El reconocimiento del objetivo por parte de la proteína Cas9 requiere una secuencia "semilla" dentro del ARN guía (ARNg) y una secuencia de motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que contiene un trinucleótido conservada aguas arriba de la región de unión al ARNg. De esta manera, el sistema CRISPR/CAS puede manipularse por ingeniería genética para escindir prácticamente cualquier secuencia de ADN mediante el rediseño del ARNg para su uso en líneas celulares (tales como las células 293T), células primarias y células T CAR. El sistema CRISPR/CAS puede apuntar simultáneamente a múltiples loci genómicos al coexpresar una sola proteína Cas9 con dos o más ARNg, lo que hace que este sistema sea especialmente adecuado para la edición de genes múltiple o la activación sinérgica de genes objetivo.

Un ejemplo de un sistema CRISPR/Cas usado para inhibir la expresión génica, CRISPRi, se describe en la Publicación de Estados Unidos núm.: 2014/0068797. CRISPRi induce una alteración genética permanente que utiliza la endonucleasa Cas9 guiada por ARN para introducir rupturas de la doble cadena de ADN que desencadenan vías de reparación propensas a errores que dan como resultado mutaciones de desplazamiento de marco. Una Cas9 catalíticamente muerta carece de actividad endonucleasa. Cuando se coexpresa con un ARN guía, se genera un complejo de reconocimiento de ADN que interfiere específicamente con el alargamiento transcripcional, la unión de la ARN polimerasa o la unión del factor de transcripción. Este sistema CRISPRi reprime eficientemente la expresión de los genes tomados como objetivo.

La alteración del gen por CRISPR/Cas se produce cuando una secuencia de ácido nucleico guía específica para un gen objetivo y una endonucleasa Cas se introducen en una célula y forman un complejo que permite que la endonucleasa Cas introduzca una ruptura de la doble cadena en el gen objetivo. El sistema CRISPR puede comprender un vector de expresión, tal como, pero no limitado a, un vector pAd5F35-CRISPR. El vector de expresión Cas puede inducir la expresión de la endonucleasa Cas9. También pueden usarse otras endonucleasas, lo que incluye, pero no se limita a, T7, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, otras nucleasas conocidas en la técnica y cualquiera de sus combinaciones. En ciertas modalidades, Cas9 incluye además spCas9, Cpfl, Cpf2, CasY, CasX y/o saCas9.

La inducción del vector de expresión Cas puede comprender exponer la célula a un agente que activa un promotor inducible en el vector de expresión Cas. Por tanto, el vector de expresión Cas incluye un promotor inducible, tal como uno que sea inducible por la exposición a un antibiótico (por ejemplo, por tetraciclina o un derivado de la tetraciclina, por ejemplo, doxiciclina). Sin embargo, debe apreciarse que pueden usarse otros promotores inducibles. El agente inductor puede ser una condición selectiva (por ejemplo, exposición a un agente, por ejemplo, un antibiótico) que da como resultado la inducción del promotor inducible. Esto da como resultado la expresión del vector de expresión Cas.

La secuencia de ácido nucleico guía es específica para un gen y apunta a ese gen para rupturas de la doble cadena inducidas por la endonucleasa Cas. La secuencia de la secuencia de ácido nucleico guía puede estar dentro de un loci del gen. En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico guía tiene al menos una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más nucleótidos.

La secuencia de ácido nucleico guía puede ser específica para cualquier gen, tal como un gen que reduciría la inmunogenicidad o reduciría la sensibilidad a un microambiente inmunosupresor. La secuencia de ácido nucleico guía incluye una secuencia de ARN, una secuencia de ADN, una combinación de las mismas (una secuencia de combinación de ARN-ADN) o una secuencia con nucleótidos sintéticos. La secuencia de ácido nucleico guía puede ser una sola molécula o una molécula doble. La secuencia de ácido nucleico guía puede comprender un único ARN guía.

En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la cual se diseña una secuencia guía que tenga alguna complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente la complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada con una secuencia objetivo y que forma un complejo con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o ambas cadenas en o cerca (por ejemplo, dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases) de la secuencia objetivo. Al igual que con la secuencia objetivo, se cree que no se necesita una complementariedad completa, siempre que sea suficiente para ser funcional. La secuencia tracr puede tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de complementariedad de secuencia a lo largo de la longitud de la secuencia pareja de tracr cuando está óptimamente alineada. Pueden introducirse en una célula huésped uno o más vectores que inducen la expresión de uno o más elementos de un sistema CRISPR, de manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirige la formación de un complejo CRISPR en uno o más sitios objetivo. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía enlazada a una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr podrían estar cada una unidas operativamente a elementos reguladores separados en vectores separados. Alternativamente, dos o más de los elementos expresados a partir de los mismos o diferentes elementos reguladores pueden combinarse en un solo vector, con uno o más vectores adicionales que proporcionan cualquiera de los componentes del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un solo vector pueden disponerse en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento ubicado 5' con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificante de un elemento puede ubicarse en la misma cadena o en la opuesta de la secuencia codificante de un segundo elemento, y orientarse en la misma dirección o en dirección opuesta. Un solo promotor puede inducir la expresión de un transcripto que codifica una enzima CRISPR y una o más de la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr (opcionalmente unida operativamente a la secuencia guía) y una secuencia tracr incorporada dentro de una o más secuencias de intrones (por ejemplo, cada en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón, o todas en un solo intrón).

La enzima CRISPR puede ser parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios proteicos heterólogos (por ejemplo, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteína adicional y, opcionalmente, una secuencia enlazadora entre dos dominios cualesquiera. Los ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de escisión de ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Los dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en el documento US20110059502.

Puede usarse una enzima CRISPR etiquetada para identificar la ubicación de una secuencia objetivo.

Pueden usarse métodos de transferencia de genes basados en virus y no virales convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos objetivo. Dichos métodos pueden usarse para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema CRISPR a células en cultivo o en un organismo huésped. Los sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, un transcripto de un vector descrito en la presente descripción), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico en complejo con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Otro modo de suministro para CRISPR/Cas9 comprende una combinación de ARN y proteína Cas9 purificada en forma de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) de ARN guía-Cas9 (Lin y otros, 2014, ELife 3:e04766). Los sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después del suministro a la célula (Anderson, 1992, Science 256:808-813; y Yu y otros, 1994, Gene Therapy 1:13-26).

El CRISPR/Cas puede derivarse de un sistema CRISPR/Cas de tipo II. En otras modalidades, el sistema CRISPR/Cas se deriva de una proteína Cas9. La proteína Cas9 puede ser de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus u otras especies.

En general, las proteínas CRISPR/Cas comprenden al menos un dominio de reconocimiento de ARN y/o de unión al ARN. Los dominios de reconocimiento de ARN y/o de unión al ARN interactúan con el ARN guía. Las proteínas CRISPR/Cas también pueden comprender dominios de nucleasa (es decir, dominios de ADNasa o ARNasa), dominios de unión al ADN, dominios de helicasa, dominios de ARNsa, dominios de interacción proteína-proteína, dominios de dimerización, así como también otros dominios. Las proteínas CRISPR/Cas pueden modificarse para aumentar la afinidad y/o especificidad de unión de ácidos nucleicos, alterar una actividad enzimática y/o cambiar otra propiedad de la proteína. La proteína similar a CRISPR/Cas de la proteína de fusión puede derivarse de una proteína Cas9 de tipo salvaje o fragmento de la misma. El CRISPR/Cas puede derivarse de proteína Cas9 modificada. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 puede modificarse para alterar una o más propiedades (por ejemplo, actividad de nucleasa, afinidad, estabilidad, etc.) de la proteína. Alternativamente, los dominios de la proteína Cas9 que no están implicados en la escisión guiada por ARN pueden eliminarse de la proteína de manera que la proteína Cas9 modificada sea más pequeña que la proteína Cas9 de tipo salvaje. En general, una proteína Cas9 comprende al menos dos dominios de nucleasa (es decir, ADNasa). Por ejemplo, una proteína Cas9 puede comprender un dominio de nucleasa de tipo RuvC y un dominio de nucleasa de tipo HNH. Los dominios RuvC y HNH trabajan juntos para cortar cadenas simples para crear una ruptura de la doble cadena en el ADN (Jinek y otros, 2012, Science, 337:816-821). En ciertas modalidades, la proteína derivada de Cas9 puede modificarse para que contenga solo un dominio de nucleasa funcional (ya sea un dominio de nucleasa de tipo RuvC o de tipo HNH). Por ejemplo, la proteína derivada de Cas9 puede modificarse de manera que uno de los dominios de nucleasa se elimine o mute de manera que ya no sea funcional (es decir, la actividad de nucleasa está ausente). En algunas modalidades en las que uno de los dominios de nucleasa está inactivo, la proteína derivada de Cas9 es capaz de introducir una mella en un ácido nucleico bicatenario (dicha proteína se denomina "nickasa"), pero no escinde el ADN bicatenario. En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, cualquiera o todos los dominios de nucleasa pueden inactivarse mediante una o más mutaciones de eliminación, mutaciones de inserción y/o mutaciones de sustitución mediante el uso de métodos bien conocidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR y síntesis génica total, así como también otros métodos conocidos en la técnica. Un vector puede inducir la expresión del sistema CRISPR. La técnica está repleta de vectores adecuados que son útiles en la presente invención. Los vectores a utilizar son adecuados para la replicación y, opcionalmente, la integración en células eucariotas. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada. Los vectores de la presente invención también pueden usarse para protocolos de suministro de genes estándar de ácidos nucleicos. Los métodos para el suministro de genes se conocen en la técnica, tal como en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,399,346, 5,580,859 y 5,589,466. .

Además, el vector puede proporcionarse a una célula en forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales se conoce bien en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook y otros (4a edición, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 2012), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus Sindbis, gammaretrovirus y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y Patente de los Estados Unidos núm. 6,326,193).

Ejemplos experimentales

A continuación se describen los materiales y métodos empleados en estos experimentos.

Preparación del extracto libre de células: Se preparó un extracto libre de células a partir de 200 millones de células HCT116-19 de acuerdo con la técnica descrita en Cole-Strauss y otros, 1999. Nucl. Acids Res. 27 (5), 1323-1330. El extracto resultante se dividió en alícuotas inmediatamente y se almacenó a -80 °C. Se cultivaron células HEK293 (ATCC, American Type Cell Culture) y se cosecharon 8 * 106 células y se lavaron inmediatamente en tampón hipotónico frío (HEp Es 20 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM y sacarosa 250 mM). Las células se centrifugaron, lavaron y resuspendieron en tampón hipotónico frío sin sacarosa, seguido de incubación en hielo durante 15 minutos antes de lisarse mediante 25 golpes de un homogeneizador Dounce. La fracción citoplasmática del lisado celular enriquecido se incubó en hielo durante 60 minutos y se centrifugó durante 15 minutos a 12000 g, 4 °C. A continuación, el sobrenadante se dividió en alícuotas y se congeló inmediatamente a -80 °C. Las concentraciones del extracto libre de células se determinaron mediante el uso de un ensayo Bradford.

Construcción de la RNP: Los componentes Cas9 y tracrARN: crARN se ensamblaron como un complejo RNP para acomodar ocho reacciones a 10 pmol por reacción.

Reacciones in vitro: En ciertas modalidades, las reacciones se prepararon con los componentes que se muestran en la Tabla 1 y se incubaron a 37 °C durante 120 minutos. En ciertas modalidades, las mezclas de reacción de escisión de ADN in vitro contenían 250 ng de ADN plasmídico pHSG299 (Takara Bio Company, Shiga, Japón) o pKRAS6163 y 10 pmol de RNP mezclados en un tampón de reacción (NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM, MgCl2 10 mM, 100 ug/ml de BSA) a un volumen final de 20 ul. Cada reacción se incubó durante 15 minutos a 37 °C, después de lo cual se aisló el ADN de las mezclas de reacción y se purificó mediante el uso de columnas giratorias de sílice. Las reacciones de recirculación in vitro secundarias contenían ADN aislado de la reacción de escisión inicial y 175 ug de extracto libre de células suplementado con ligasa mezclados en un tampón de reacción (TRIS 20 mM, MgCl2 15 mM, DTT 0,4 mM y ATP 1,0 mM) llevadas a un volumen final de 35 ul. Cada reacción se incubó durante 15 minutos a 37 °C. Para las reacciones que incluían fragmentos de sustitución o inserción duplicados, se añadieron 100 pmol a la mezcla de reacción final. A continuación, se purificó el ADN de la mezcla de reacción final mediante el uso de columnas giratorias de sílice (Qiagen, Hilden, Alemania).

Tabla 1: Reacciones in vitro

Aislamiento de ADN plasmídico: Después de la incubación, cada mezcla de reacción se diluyó con tampón PB en una relación 1:5. El ADN plasmídico se aisló mediante el uso de columnas giratorias de membrana de sílice de acuerdo con el protocolo Miniprep QIAprep de Qiagen y se eluyó en 10 pl de agua. Los rendimientos del plásmido por Miniprep variaron de 620 ng - 1,8 pg, y las mezclas de control produjeron mayores rendimientos del plásmido que las mezclas de todos los componentes.

Transformación de plásmidos aislados en células competentes: Se realizaron ocho transformaciones mediante el uso de los 10 pl de las variadas concentraciones de ADN plasmídico completo aislado de cada una de las ocho mezclas de reacción. Las transformaciones se realizaron de acuerdo con el protocolo de la técnica de choque térmico indicado por el protocolo de E. coli químicamente competente TOP 10 OneShot de Invitrogen.

Siembra en placas de células transformadas y selección por kanamicina: Las células transformadas se sembraron en placas con kanamicina después de diluciones 1:5 y 1:100 y se incubaron durante la noche para permitir el crecimiento de colonias resistentes a la kanamicina. Después de la incubación, se seleccionaron 30 colonias en 8 de las placas diluidas 1:100, con favorecimiento de las últimas tres reacciones de todos los componentes, se sellaron y enviaron para secuenciación.

Transformación, selección, aislamiento y análisis de ADN: El ADN plasmídico recuperado de reacciones in vitro se transformó en E. coli competente DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) o TOP10 One Shot (Thermo Fisher Scientific Wilmington, DE) por medio de la metodología de choque térmico. Las células competentes se incubaron en hielo durante 30 minutos, se sometieron a choque térmico durante 20 segundos a 42 °C, se colocaron en hielo durante 2 minutos y se incubaron a 37 °C en 1 ml de medio SOC durante 1 hora a 225 rpm. Las células competentes sin diluir se sembraron en placas en medio que contenía kanamicina y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se seleccionaron colonias individuales resistentes a la kanamicina y se aisló el ADN plasmídico mediante el kit Miniprep QIAprep Spin (Qiagen, Hilden, Alemania). Las modificaciones del ADN plasmídico seleccionado de colonias bacterianas se evaluaron después de la secuenciación del ADN (GeneWiz, South Plainfield, NJ). El análisis de secuencias y los patrones de alteración se evaluaron mediante el uso del programa informático SnapGene para alinear las secuencias de muestra con una secuencia de tipo salvaje de los plásmidos relevantes.

A continuación se describen los resultados de los experimentos.

Ejemplo 1: Actividad in vitro de CRISPR/Cas9 ensamblado en un complejo de ribonucleoproteína (RNP) en plantillas de ADN purificado

Para el ensamblaje de RNP, se hibridaron tracrARN y (cr)isprARN por separado seguido de la adición de la proteína Cas9 purificada (Figura 1). Las condiciones de ensamblaje de RNP y Cas9 se proporcionaron por IDT (Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IA).

La actividad de escisión del ADN del complejo de RNP purificado se muestra en la Figura 2. La reacción se basa en el uso de una molécula de plásmido de ADN superhelicoidal que contiene el gen eGFP, que contiene la secuencia objetivo designada para la escisión por RNP. Después del carril del marcador de MW, el carril 1 muestra ADN plasmídico purificado en forma superhelicoidal. Los carriles 2-5 muestran los productos de las mezclas de reacción que contienen cantidades crecientes del complejo de RNP. Incluso en el nivel más bajo, se observó escisión del ADN bicatenario. Al nivel excesivo de 50 pmol, la actividad de escisión del ADN en realidad se bloquea debido, con toda probabilidad, a la enorme cantidad de proteína Cas9 en la reacción. Esta titulación proporcionó la confirmación de que la RNP usada en el kit de mutagénesis in vitro cortaba el ADN de manera eficiente.

Se diseñó un experimento para mostrar la especificidad de la escisión dirigida por RNP (Figura 3). El ADN genómico se aisló de células HCT116-19 no tratadas y se usó PCR para generar un amplicón de 605 pb, que rodea la secuencia del gen eGFP mutante integrado. El amplicón se combinó con 25 pmol y 50 pmol de complejo de RNP respectivamente y se incubó durante 40 minutos a 37 °C. En la reacción completa, se generaron dos productos con tamaños consistentes con los fragmentos previstos a partir del sitio de corte específico diseñado para el complejo de RNP. Como control, el complejo de RNP se incubó con un amplicón generado a partir del gen HBB con una longitud de 345 pares de bases a partir de la línea celular K562. Se realizó una digestión de control en el amplicón de 345 bases con la enzima de restricción Ddel. El fragmento de 345 pares de bases fue resistente a la digestión por parte de la RNP, que se diseñó para escindir el objetivo eGFP (y lo hizo con éxito en otra parte en la presente descripción). La digestión con la enzima de restricción, Ddel, sirvió como control positivo para garantizar que el producto de la PCR pudiera escindirse. Se realizaron reacciones enzimáticas que demostraron actividad enzimática en la que se excluyeron componentes individuales del complejo RNP (Figura 4). La actividad de escisión del ADN fue más eficaz cuando estaban presentes todos los componentes de la RNP (Figura 4, carril 3). Se sometió a prueba la actividad del extracto libre de células de mamífero sobre el producto de la escisión por RNP. Es importante destacar que en una reacción que incluyó 10 |jg de extracto libre de células, se observó un poco de recircularización del plásmido (Figura 5, carril 3). En este caso particular, el extracto libre de células catalizó la recircularización parcial del plásmido linealizado. Sin desear limitarse a una teoría específica, el plásmido linealizado con toda probabilidad es la plantilla para el intercambio de nucleótidos. Este experimento demostró que el ADN superhelicoidal puede ser escindido con éxito por la partícula RNP y procesarse parcialmente de nuevo hacia la forma circular por el extracto libre de células. Es importante destacar que la plantilla de ADN procesada por la RNP se mantuvo estable en el extracto libre de células en dosificaciones funcionales.

Ejemplo 2: Mutagénesis in vitro

La estrategia de inicialización y validación del sistema de lectura genética para la presente invención se representa en la Figura 6. La reacción completa se muestra a partir del ensamblaje de la partícula RNP seguido de la adición del oligonucleótido monocatenario, el extracto libre de células y la plantilla de ADN plasmídico superhelicoidal que porta el gen objetivo; en este ejemplo no limitante, el gen eGFP. La reacción tiene lugar durante 40 a 60 minutos, después de lo cual el plásmido tomado como objetivo se aísla mediante el uso de un protocolo mini-prep de ADN estándar. A continuación, la población de plásmidos se transforma en Escherichia coli mediante el protocolo de choque térmico y las células sembradas en placas de agar cargadas con ampicilina. El gen de resistencia a la ampicilina de tipo salvaje está contenido dentro del plásmido original y, por tanto, se pueden seleccionar colonias bacterianas que crecen a partir de una sola célula bacteriana transformada que porta la resistencia a la ampicilina. Las colonias resistentes a la ampicilina se seleccionan, generalmente 50 a la vez, y se procesan para la secuenciación del ADN. La reacción de control se muestra debajo de las placas en la secuencia de ADN que contiene el gen eGFP con el gen resaltado. Para los experimentos demostrados en la presente descripción, el codón TAG fue tomado como objetivo para la conversión a TAC.

En el presente estudio se utilizan dos lecturas genéticas. La primera es la conversión de la sensibilidad a la kanamicina en resistencia a la kanamicina a través de la corrección de un residuo G a un residuo T en el plásmido pKan (Figura 7A). El otro plásmido no contiene un gen de resistencia a los antibióticos para una fácil selección, pero porta un gen de resistencia a la ampicilina en forma salvaje para seleccionar células que han recibido el plásmido después de la transformación (Figura 7B). En este caso, el objetivo es un gen de eGFP que porta un codón de terminación con lo cual la conversión de la tercera base, G, a una C, genera la eGFP de tipo salvaje. Ambos plásmidos se usan para demostrar la versatilidad de este sistema frente a la selección de resistencia a los antibióticos o a través del cribado de colonias y la secuenciación directa del ADN no seleccionado.

El extracto libre de células es capaz de catalizar una reparación de una sola base a niveles bajos, como lo evidencia una variedad de combinaciones sometidas a prueba (Tabla 2). La adición de componentes para la edición de genes individualmente, lo que incluye la RNP o el oligonucleótido, no cataliza la mutagénesis específica de sitio ni la conversión del plásmido pKan. La adición simultánea de la RNP, el oligonucleótido monocatenario y el extracto libre de células catalizó un aumento muy significativo en la conversión del plásmido sensible pKan en plásmido resistente pKan. Se llevaron a cabo cuatro experimentos por triplicado para generar los datos que se presentan en la Tabla 3; se presenta el intervalo promedio de números de colonias.

Tabla 2: Resultados de un ensayo de mutagénesis in vitro mediante el uso de RNP, oligonucleótido monocatenario y el extracto libre de células que actúa sobre el plásmido pKan

Una alteración o mutagénesis de una sola base en la conversión de peGFP- a peGFP+ requirió todos los componentes de la reacción, lo que incluye la RNP, el oligonucleótido monocatenario y el extracto libre de células (Tabla 3). En ausencia del ADN monocatenario o la RNP, el extracto libre de células no catalizó eventos mutagénicos dentro del gen eGFP (sin selección). Las secuencias en las Figuras 8A-8B ilustran que se crearon mutaciones puntuales, eliminaciones e inserciones en nueve de las 100 colonias analizadas. Se observaron tres colonias que portan la corrección exacta dentro de las 100 colonias resistentes a amp. Esta es una mutagénesis dirigida al sitio sin selección. Estos resultados demostraron la notable versatilidad del sistema in vitro en el sentido de que la sustitución de bases, la eliminación de bases y las inserciones de bases pueden catalizarse mediante este sistema in vitro dentro de la misma mezcla de reacción. Por tanto, se pueden realizar múltiples tipos de mutaciones específicas dentro del mismo gen en el mismo sitio objetivo, separarse y aislarse como moléculas de plásmido individuales después de la selección.

Tabla 3: Resultados de los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido peGFP

Los resultados de secuenciación del ADN representativos de ADN plasmídico modificado in vitro y aislado de clones se muestran en las Figuras 8A-8B. La numeración es aleatoria ya que estos clones no se aislaron en ningún orden específico. El clon 1 ilustra un plásmido aislado que no porta cambios genéticos. La base tomada como objetivo, TAG, permaneció intacta. La mayoría de los clones no tuvieron cambios en el sitio objetivo. El clon 2 contenía una eliminación limpia que rodeaba el sitio objetivo. El clon 5 contenía una mutación puntual cambiada con éxito; TAG a TAC. El clon 6 contenía el mismo cambio G-C excepto que también contenía una eliminación de dos bases aguas arriba del sitio objetivo. El clon 12 contenía de nuevo una C perfectamente modificada en el sitio objetivo de la tercera base del codón de parada, TAG. Estos experimentos demuestran la reacción de mutagénesis dirigida al sitio. Lo que es importante e interesante es que dentro de la misma población de clones aislados, se podría obtener una variedad de secuencias de ADN específicamente sometidas a mutagénesis en la misma reacción, lo que incluye el cambio de mutación puntual deseado. Esto no es posible con ningún otro ensayo de mutagénesis in vitro.

Ejemplo 3: Optimización de las condiciones de reacción y desarrollo de metodologías alternativas para mejorar la frecuencia y la precisión

La proteína Cas9 contiene dos dominios nucleolíticos enterrados dentro de los dominios de unión de la proteína intacta. La ingeniería genética llevada a cabo en Cas9 ahora ha generado dos variaciones de la proteína de tipo salvaje; Cas9 inactiva, a menudo denominada Cas9 muerta (dCas9) y nickasa, una enzima en la que uno de los dos dominios de nucleasa se ha alterado a inactividad. La enzima conserva la capacidad de escindir una de las dos cadenas de la doble hélice. Ambas variantes de Cas9 se pueden someter a prueba de manera metódica dentro del ensayo de mutagénesis in vitro para mejorar la frecuencia y la versatilidad de la reacción general. La razón es que la introducción de una sola ruptura o el desenrollamiento de la hélice de ADN en el sitio tomado como objetivo de la mutagénesis por parte del oligonucleótido puede mejorar la especificidad y la eficiencia de la reacción general. El proceso de optimización comenzó al examinar la interacción de la dCas9 y la nickasa en el ADN superhelicoidal. Como se ilustra en la Figura 9, dCas9 se unió y retrasó la migración del ADN superhelicoidal a través del gel de agarosa. La adición de nickasa convirtió el ADN superhelicoidal en una forma circular abierta o mellada con nickasa del ADN. A medida que aumentaba la dosificación de nickasa, aparecieron otras formas de ADN en el gel, particularmente como un complejo de movimiento lento que se visualizaba justo debajo de los pocillos de carga del gel. En el caso de las reacciones de dCas9, se observó el cambio de banda del ADN superhelicoidal en el carril 1. El carril 2 presentó una mezcla de reacción que contenía BSA, como sugirió el fabricante. En estas condiciones, se observó una masa molecular de movimiento rápido que migraba por delante del sustrato superhelicoidal, así como también una molécula de movimiento más lento que migraba un poco más lentamente a través del gel (esta banda superior coincidía con el patrón de migración previsto en la hoja de especificaciones proporcionada por el fabricante). Los dos tipos de Cas9 modificadas demostraron una clara interacción con el ADN y pueden evaluarse para determinar la actividad de edición de genes después de ensamblarse en el complejo RNP en el ensayo de mutagénesis in vitro.

Ejemplo 4: Modificación de genes objetivo mediante el uso de un sistema de extracto libre de células, una RNP, un oligonucleótido y un vector de expresión de plásmido

La presente invención proporciona un método novedoso para modificar genes objetivo y utiliza un sistema de extracto libre de células, una RNP, un oligonucleótido y un vector de expresión de plásmido. Los vectores de expresión contienen el gen de interés (gen objetivo) y, en ciertas modalidades, un gen de kanamicina mutado que sirve como marcador de corrección para la selección de plásmidos alterados genéticamente. La alteración del gen, dirigida mediante oligonucleótidos específicos, se mide mediante el uso de una lectura genética en E. coli. En esta modalidad, un gen mutante que confiere resistencia a la kanamicina insertado en el constructo de expresión se toma como objetivo conjuntamente para la corrección mediante un oligonucleótido estándar con una longitud de 72 bases que porta enlaces fosforotioato específicos. La edición de genes se produce en un extracto libre de células, generado a partir de células de mamíferos o levaduras, y la expresión del gen de kanamicina reparado se mide por la aparición de colonias bacterianas resistentes a la kanamicina en placas de agar. Para la resistencia a la kanamicina, el objetivo es convertir un par de bases G/C (mutante) en la posición 4021 del gen, en un par de bases C/G (funcional) simultáneamente con la alteración genética en el gen objetivo. A continuación, los plásmidos aislados se someten a electroporación en E. coli que carece de una proteína RecA funcional. Se utilizan para esta lectura cepas bacterianas deficientes en la recombinación homóloga y la reparación de errores de apareamiento, ya que estas bacterias no catalizan la sustitución de nucleótidos objetivo por sí mismas. Esta estrategia minimiza los niveles de fondo y permite una identificación más eficiente de los plásmidos que portan la alteración del gen tomado como objetivo específico. El aislamiento y la secuenciación del ADN de los plásmidos de E. coli confirman la alteración genética a través de la selección inicial de resistencia a la kanamicina, lo que indica que se ha producido una actividad de edición de genes en ese plásmido.

Ejemplo 5: Inserción de nucleótidos

El mismo flujo de trabajo de reacción básico descrito en la presente descripción se utilizó para la inserción de nucleótidos: escisión de ADN catalizada por una partícula RNP, adición de ADN donante, en este caso un fragmento bicatenario prehibridado, seguido de la adición de un extracto libre de células de mamífero generado a partir de células HEK293 suplementadas con ADN ligasa añadida exógenamente. El objetivo aquí era insertar un fragmento bicatenario de 15 bases en el sitio de escisión de RNP en contraposición a la intención en ejemplos anteriores de crear una ruptura de la doble cadena para ejecutar la eliminación de secuencias de ADN contenidas dentro del plásmido. Esta demostración amplía la aplicabilidad del ensayo de mutagénesis in vitro para la edición de genes al ámbito de la inserción de genes o ADN, una barrera importante que se debe cruzar para la reacción in vitro.

Los detalles de la reacción en sí misma son los siguientes (Figura 10A-10C): Se diseñaron dos oligonucleótidos monocatenarios complementarios (5-AATGGTTGCGGCCGC-3' (SEQ ID NO: 1) y 5-CCATTGCGGCCGCAA-3' (SEQ ID NO: 2)) para ser duplicados para un inserto de sitio de restricción NotI, cada uno con salientes 5' complementarios a uno de los dos salientes generados en el sitio de corte escalonado de RNP Cpfl. Se configuró una reacción in vitro para generar una ruptura escalonada de la doble cadena en el ADN plasmídico que incluía ADN plasmídico superenrollado y RNP Cpf1. Esta reacción se incubó durante 15 minutos a 37 °C. El ADN linealizado generado a partir de la primera reacción se aisló y purificó mediante el uso de una columna de membrana de sílice y se añadió a una segunda reacción in vitro para insertar la inserción del sitio de restricción NotI duplicado que incluía el ADN linealizado purificado, el inserto del sitio NotI y un CFE HEK modificado que incluía ligasa. Esta reacción se incubó durante 15 minutos a 37 °C.

A continuación, el ADN recircularizado generado a partir de la segunda reacción se aisló y purificó mediante el uso de una columna de membrana de sílice y se transformó en E. coli competente DH5a. Las bacterias se sembraron en placas de agar que contenían el antibiótico kanamicina y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se recogieron colonias individuales de placas de toda la noche y se cultivaron en caldo que contenía antibiótico kanamicina en una incubadora con agitación a 37 °C durante 16 horas. El ADN superenrollado de los cultivos de toda la noche se aisló y se incluyó en un ensayo de digestión con NotI y el ADN linealizado que contenía el inserto NotI se visualizó en un gel de agarosa. A continuación, el ADN que mostraba la escisión por la enzima NotI se sometió a amplificación por PCR y se secuenció para confirmar la inserción del sitio NotI.

Se realizaron análisis de escisión con enzimas de restricción, RFLP y de secuencia de ADN del ADN plasmídico purificado que se había sometido a digestión de restricción con NotI. Los resultados ilustraron la linealización del ADN plasmídico circular. El sitio de restricción NotI no aparece dentro del plásmido y, por tanto, la linealización solo podría haber ocurrido si el fragmento se hubiera insertado con éxito a través del proceso de edición de genes in vitro (Figuras 11A-14). Los análisis de la secuencia de ADN confirmaron la inserción del fragmento bicatenario en el sitio preciso previsto y dirigido por la partícula RNP (Figuras 15-22). Se observaron varias secuencias de ADN distintas, algunas de las cuales exhiben una inserción perfecta y limpia del fragmento previsto.

Ejemplo 6: Escisión y modificación del ADN inducida por partículas RNP Cas9 o Cpf1

En la presente descripción se construyó un sistema libre de células completamente integrado para estudiar el proceso de edición de genes. La Figura 23A ilustra la inicialización de la reacción mediante el uso de Cas9 o Cpfl ensamblados en una partícula RNP para dirigir la escisión específica de sitio del ADN plasmídico, seguido de la adición de un extracto libre de células de mamífero suplementado con ADN ligasa. La reacción se incubó a 37 °C durante 15 minutos y el ADN plasmídico se recuperó y transformó en E. coli para la posterior selección de colonias y análisis del ADN plasmídico. El extracto libre de células proporciona las actividades catalíticas, lo que incluye la extirpación, fosforilación y ligadura de ADN, entre otras, necesarias para el procesamiento del plásmido linealizado. En presencia de ADN donante añadido exógenamente, se pueden insertar fragmentos de ADN con precisión en el sitio de escisión.

Una variedad de sitios de Cas9 y Cpfl se tomaron como objetivo a lo largo de la región del gen lacZ dirigido por las secuencias de ARN guía apropiadas que se muestran en la Figura 23B. El sitio Cpfl usado principalmente en estos experimentos está rodeado por un cuadro con el sitio de corte asociado ilustrado por una flecha escalonada. El sitio Cas9 usado en este estudio está ilustrado por la barra que representa la posición de la unión de crARN. El gen lacZ incorporado en el plásmido pHSG299 proporciona una plantilla atractiva para este ensayo porque la destrucción del gen lacZ a través de la eliminación o inserción de ADN puede dar como resultado la producción de una proteína pgalactosa no funcional incapaz de metabolizar X-gal. Cuando se introducen plásmidos que contienen un gen lacZ alterado en bacterias cultivadas en presencia de X-gal, se observa un cambio bien establecido en el color, de azul a blanco.

Las Figuras 24A-24C demuestran la actividad in vitro de las partículas RNP ensambladas. Primero, la Figura 24A ilustra una reacción simple en la que la escisión de pHSG299 superenrollado es inducida por variantes de RNP in vitro. La actividad de nucleasa en pHSG299 es evidente en cada uno de los sitios de escisión de Cpfl variables, así como también en los sitios de escisión por Cas9 nickasa de tipo salvaje y asociados. En segundo lugar, en la Figura 24B se presenta una dependencia de la dosis tanto para Cas9 como para Cpfl, donde Cpfl muestra la escisión del ADN superenrollado a un nivel de picomoles más bajo. La actividad de escisión por RNP Cas9 reveló un límite "umbral" para la escisión del ADN en el que no se observó la linealización completa del ADN superenrollado hasta que estuvieron presentes 5 pmol de RNP. Comenzó a aparecer una banda de ADN lineal muy leve en presencia de 2 pmol y todas las reacciones con 5 pmol o más mostraron que casi todo el ADN se escindió por completo. Por el contrario, la actividad de escisión por RNP Cpfl reveló más de un aumento por "gradiente" en la escisión del ADN. Comenzó a aparecer una banda de ADN lineal muy leve en presencia de tan solo 0,5 pmol de RNP y aumentó progresivamente hasta que estuvo presente 1 pmol y todas las reacciones con 2 pmol o más mostraron que casi todo el ADN se escindió por completo. La diferencia en los patrones de escisión observados entre Cas9 y Cpfl in vitro puede reflejar la actividad catalítica potenciada de Cpfl dentro de este sistema. Estos resultados demostraron la utilidad tanto de Cas9 como de Cpfl en combinación con ARN guía específico para actuar como una herramienta genética para la modificación estructural del ADN.

Anteriormente se utilizó un extracto libre de células de mamíferos para investigar el mecanismo y la regulación de la edición de genes dirigida por ssODN (Engstrom y otros, BioEssays 31, 159-168 (2009)). Gran parte de los datos que condujeron a la dilucidación y reconstrucción de esa vía de edición de genes se originaron a partir de estudios realizados in vitro (Cole-Strauss. y otros Nucleic Acids Res. 27, 1323-30 (1999)). Se empleó el mismo flujo de trabajo experimental en el desarrollo del sistema de edición de genes dirigido por CRISPR libre de células. La Figura 24C ilustra la actividad catalítica del extracto sobre el ADN linealizado generado por Cpfl (ver la Figura 24B). Los extractos, preparados a partir de fuentes celulares, presentaron grados variables de actividad de extirpación del ADN en el plásmido linealizado. Cada fuente de extracto proporcionó niveles adecuados de actividad de nucleasa que redujeron el tamaño del plásmido linealizado en función del aumento de la concentración del extracto. La actividad exhibida por un extracto preparado a partir de células HEK-293 fue de particular interés porque se cree que estas células tienen niveles apropiados de actividades enzimáticas de reparación y recombinación del ADN.

Ejemplo 7: Eliminación de ADN específica dirigida por componentes de edición de genes en un sistema libre de células

Como se describe en la presente descripción, se estableció un sistema de edición de genes basado en CRISPR que podría usarse para dilucidar las vías moleculares y los circuitos reguladores que rodean la modificación del genoma en células humanas. Con este fin, se aprovechó la actividad de escisión del ADN en pHSG299 en una reacción in vitro en la que participaron RNP Cas9, pHSG299 y el extracto libre de células de mamífero. El objetivo principal fue crear una eliminación específica en el sitio de ruptura seguida de recirculación y lectura genética en bacterias. La Figura 25A indica el objetivo genético con las herramientas genéticas asociadas y la Figura 25B ilustra los resultados. A pesar de los esfuerzos concertados y los análisis de 18 clones, no se identificaron moléculas de plásmido modificadas que portaran eliminaciones de secuencia generadas a partir de reacciones catalizadas por RNP Cas9. Se llevaron a cabo varios experimentos preliminares en los que se combinó la actividad de nucleasa de una partícula RNP Cas9 con dos exonucleasas separadas, T7 y Exo I. En solo un caso con una combinación única de enzimas se observó una secuencia de ADN extirpada; esta reacción no fue robusta. Este resultado negativo puede deberse al hecho de que la escisión por Cas9 da como resultado la generación de rupturas de ADN bicatenario de extremos romos que podrían ser menos susceptibles a la extirpación de ADN in vitro, a diferencia de la in vivo.

A continuación, esta reacción se repitió y la nucleasa Cpfl sustituyó a Cas9. La Figura 25C demuestra la edición exitosa de genes del gen lacZ en pHSG299. Se encontró que múltiples clones bacterianos transformados con plásmido recuperado de la reacción in vitro albergaban eliminaciones de secuencia que rodeaban el sitio objetivo, indicado por la flecha escalonada en la Figura 25A. Se muestran paneles de secuencias representativos para demostrar el tipo de eliminaciones en ADN que se encontraron dentro de la población clonal, lo que incluye los clones en los que se encontró que las secuencias de ADN no estaban alteradas. Veintidós de las cuarenta y una secuencias analizadas mostraron alteraciones en el ADN que rodean el sitio de escisión creado por la RNP Cpfl. Estos datos demostraron el desarrollo de un sistema experimental en el que Cpfl cataliza la edición de genes in vitro. Los plásmidos modificados en colonias bacterianas exhibieron diversos tonos de azul; se encontraron eliminaciones de ADN en colonias de color blanco, azul pálido y azul oscuro. Por tanto, las colonias azules no se pudieron eliminar del proceso de cribado y no se pudo descartar que estas colonias contuvieran secuencias de ADN alteradas.

Ejemplo 8: Inserción de ADN donante específico dirigida por RNP en un sistema libre de células

El sistema experimental se amplió al intentar llevar a cabo la inserción de ADN mediante reparación dirigida por homología (HDR) en el sitio de escisión de Cpfl designado. Para hacerlo, se sintetizaron dos moléculas de ADN cortas y complementarias que, tras la hibridación, crearon un fragmento de ADN bicatenario que contenía un sitio de escisión para la enzima de restricción NotI, sin un sitio inherente en pHSG299. El sitio de restricción NotI y el sistema experimental se muestran en las Figuras 26A y 26B, respectivamente, y el protocolo experimental se indica en la Figura 26C. En un esfuerzo por examinar eventos discretos de edición de genes, las regiones homólogas entre los brazos integrados del fragmento añadido exógenamente y la región del gen lacZ nativo se distinguieron mediante la inclusión de un "código de barras" de dos pares de bases (TT: AA) en una posición aguas arriba con respecto al sitio NotI. Como etapa intermedia, y para comprobar la presencia del fragmento insertado, se aisló ADN plasmídico de colonias bacterianas seleccionadas y se digirió con la enzima de restricción NotI. Como se muestra en la Figura 26D, NotI digirió varias muestras de ADN plasmídico purificado, lo que generó ADN plasmídico linealizado como se previó; la inserción del fragmento fue dependiente de la presencia de extracto libre de células dentro de la mezcla de reacción, ya que no se observó escisión por NotI en su ausencia.

Las muestras de ADN plasmídico que presentaban restricción por NotI se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron para verificar la inserción de ADN. Las Figuras 27A-27C muestran la matriz de patrones de inserción de fragmentos de ADN encontrados dentro de la población positiva a NotI con la secuencia de tipo salvaje presentada encima de los paneles de secuencia. La Figura 27A muestra las secuencias de varios clones que contienen una inserción precisa y perfecta en el sitio de escisión designado. Se encontró que aproximadamente el 15 % del ADN plasmídico, aislado a partir de colonias transformadas con ADN y recuperado de reacciones in vitro que contenían el fragmento de inserción NotI duplicado, contenía la inserción perfecta. Otros patrones de inserción incluían uno en el que se observaron dos inserciones de fragmentos NotI acompañadas de una eliminación de un solo par de bases (Figura 27B); en las tres secuencias, la eliminación de una base se produjo en el último nucleótido situado en el extremo saliente 5' aguas arriba del sitio de inserción. La Figura 27C muestra una secuencia de ADN en la que tres inserciones de fragmentos NotI acompañadas de múltiples eliminaciones rodean el fragmento NotI insertado; una eliminación de un solo par de bases aguas arriba del primer fragmento insertado y una eliminación de siete pares de bases aguas abajo del tercer fragmento insertado. Aproximadamente el 8 % del ADN plasmídico no tenía alteración en la secuencia de ADN como se observa en la Figura 27D.

Ejemplo 9: Inserción de ADN específica promovida por moléculas de ADN monocatenario

Se examinó la posibilidad de que la HDR y la inserción de fragmentos pudieran ser dirigidos por moléculas de ADN monocatenario, en lugar de por el fragmento de ADN bicatenario hibridado. Las Figuras 28A y 28B proporcionan un diagrama de las moléculas monocatenarias usadas en este experimento y su orientación/posición con respecto al sitio objetivo; estas moléculas monocatenarias comprendían el fragmento bicatenario usado en los experimentos anteriores descritos en la presente descripción (ver la Figura 26B). Cada molécula tiene un saliente de diez bases, con una región de cinco bases complementaria a los salientes del sitio de corte escalonado de Cpfl. De acuerdo con el mismo protocolo experimental indicado en la Figura 4C, el ADN purificado recuperado a partir de las mezclas de reacción se transformó en células bacterianas y se aisló el ADN plasmídico de colonias bacterianas seleccionadas. La digestión de restricción con NotI se llevó a cabo en las muestras de ADN aisladas y los resultados se presentan en la Figura 28C. Centrado primero en los plásmidos de ADN aislados a partir de una reacción que contiene el oligonucleótido monocatenario que se integra en la cadena sentido, NotI-S, se observó que varios productos que contienen una inserción pueden escindirse mediante la digestión con la enzima NotI. Las muestras de una reacción que contenía el oligonucleótido monocatenario, NotI-NS, que se integra en la cadena sin sentido, también generaron moléculas de producto que portaban el sitio de restricción NotI. En conjunto, se observó una población de moléculas de plásmido que se pueden escindir con éxito mediante incubación con NotI, lo que indica la inserción exitosa de al menos parte de la molécula de ADN monocatenario que contiene el sitio NotI.

La secuenciación del ADN se llevó a cabo en la región de interés para las muestras de plásmido positivas para NotI recuperadas de ambas reacciones de inserción de moléculas de ADN monocatenario in vitro. En la Figura 28D se representa un panel representativo para cada una. Los datos de secuenciación confirmaron el análisis RFLP y revelaron una población heterogénea de insertos de secuencia dentro de ambas categorías de clones. Es importante destacar que en el 50 % de las secuencias analizadas a partir de reacciones inducidas por NotI-S, se observó una inserción individual perfecta de la molécula prevista. No se detectó la inserción perfecta del fragmento cuando NotI-NS sirvió como la molécula donante monocatenaria. En todos los casos en los que no se detectó una inserción perfecta, cada clon contenía una cantidad variable de modificación del ADN, a menudo en forma de eliminación. El sesgo de cadena exhibido en esta reacción dirigida por HDR probablemente proporcionará información sobre el mecanismo de inserción de fragmentos en la edición de genes in vitro.

Ejemplo 10: Inserción de fragmento de 186 pb

En este experimento, se usaron dos nucleasas Cpfl, que cortan en diferentes sitios, para escindir un fragmento del plásmido original y reemplazarlo con un fragmento de 186 pares de bases, creado mediante la hibridación de dos oligonucleótidos complementarios con salientes complementarios como se indica en la Figura 29A. Las secuencias presentadas en las Figuras 29B-29C muestran las secuencias obtenidas para la reacción in vitro con lectura en bacterias. La Figura 29D ilustra el tipo de resultados obtenidos, lo que incluye principalmente eliminaciones y un clon con inserción exitosa. Es importante destacar que mientras los datos anteriores presentados en la presente descripción usaron solo una enzima Cpfl, en este experimento se usaron con éxito dos enzimas Cpfl para retirar un fragmento de un plásmido e insertar con éxito un fragmento de ADN donante de tamaño similar.

Ejemplo 11: Inserción de ADN específica de sitio

La actividad de escisión de ADN específica de sitio de un complejo RNP, que contiene la nucleasa Cpfl, se combinó con un extracto libre de células de mamífero que puede catalizar la extirpación de ADN, la inserción de ADN y el reemplazo de segmentos génicos dentro de un plásmido mediante el uso de fragmentos de ADN donante (Figura 23A). El ADN plasmídico que contenía modificaciones dirigidas por CRISPR se recuperó de reacciones in vitro y se transformó en E. coli competente que después se sembró en placas con agar cargadas con kanamicina. El ADN plasmídico modificado se identificó inicialmente a través de la resistencia a los antibióticos y cambios fenotípicos (es decir, color) y/o directamente mediante análisis de secuencias de ADN. Se utilizaron dos sistemas de direccionamiento; el plásmido pHSG299 que contiene una copia intacta y funcional del gen lacZ y el plásmido pKRAS6163 que contiene una copia intacta y funcional del oncogén KRAS. Las reacciones de inserción o reemplazo que se producen dentro del gen lacZ dan como resultado un cambio de color de azul a blanco, indicativo de la actividad de edición del gen. La inserción o el reemplazo en pKRAS6163 requieren el análisis de la secuencia de ADN para identificar la actividad de edición de genes exitosa.

Este sistema in vitro demostró una gran versatilidad al permitir la inserción de un fragmento de ADN donante en un único sitio de escisión de RNP Cpfl o el reemplazo de un segmento génico con un fragmento de ADN donante mediante la acción de dos complejos de RNP Cpfl en distintos sitios de escisión. Además, este sistema también produjo moléculas de plásmido que contenían eliminaciones específicas de sitio a través de la extirpación de los extremos del ADN creados por la acción del complejo RNP. Por tanto, una multiplicidad de reacciones de edición de genes se produjeron simultáneamente, lo que recapitula competitivamente cómo actúan las herramientas de edición de genes cuando se introducen en las células. Estas tres vías se representan esquemáticamente en la Figura 30; la inserción requirió un solo corte y el reemplazo requirió un doble corte en el sitio objetivo. Tanto en las reacciones de inserción como de reemplazo, el patrón de escisión distinto de las RNP Cpfl dio como resultado salientes de ADN en los extremos 5' en cada sitio de corte. A continuación, se generaron fragmentos de ADN donante mediante el diseño de dos oligonucleótidos complementarios que, una vez hibridados, albergaban el fragmento de inserción o sustitución bicatenario flanqueado en cada extremo 5' por salientes de 5 bases con homología con los extremos escalonados. La homología de los salientes de 5 bases entre los fragmentos de ADN donante y los sitios de escisión de Cpfl facilitó la integración de los fragmentos durante las reacciones de inserción y sustitución.

Como se describe en la presente descripción, se estableció un sistema de edición de genes basado en CRISPR que podría usarse para dilucidar las vías moleculares y los circuitos reguladores que rodean la modificación del genoma en células humanas. Se utilizó Cpfl para iniciar la escisión del ADN superenrollado seguido de la adición del extracto libre de células como se describe en la presente descripción. La Figura 31 ilustra la edición exitosa de genes del gen lacZ en pHSG299. Se descubrió que varios clones bacterianos transformados con plásmido recuperado de la reacción in vitro albergaban eliminaciones de secuencia que rodeaban el sitio objetivo, indicado por la flecha escalonada. Veintidós de las cuarenta y una secuencias analizadas mostraron alteraciones en el ADN a través de la extirpación del ADN que rodea el sitio de escisión creado por RNP Cpfl. Estos datos demostraron que la eliminación de ADN específica de sitio, catalizada por Cpfl, puede llevarse a cabo en este sistema in vitro.

Se exploró la posibilidad de que este sistema pudiera reflejar la reacción que se lleva a cabo en células de mamíferos en donde tiene lugar la reparación dirigida por homología, catalizada por un fragmento de ADN monocatenario. Las plantillas de ADN monocatenario de los sustratos preferidos para la reparación dirigida por homología y la incorporación exitosa de estos fragmentos se han visto de manera reproducible, ya sea a través de un alineamiento impreciso o preciso. Mediante el diseño de un sistema que pudiera recapitular estas reacciones en un entorno controlable, podría identificarse y dilucidarse la función de algunos de los factores que controlan la reparación dirigida por homología en células de mamífero. Las Figuras 28A-28B proporcionan un diagrama de la estrategia experimental y las moléculas monocatenarias usadas en este experimento, lo que incluye su orientación con respecto al sitio de inserción objetivo. Cada molécula tiene un saliente de diez bases, con una región de cinco bases complementaria a los salientes del sitio de corte escalonado de Cpfl. En un esfuerzo por examinar eventos discretos de edición de genes, las regiones homólogas entre los brazos integrados del fragmento añadido exógenamente y la región del gen lacZ nativo se distinguieron mediante un "código de barras" de dos pares de bases (TT:AA) incluido en una posición aguas arriba con respecto al sitio NotI. Como etapa intermedia, y para comprobar la presencia del fragmento insertado, se aisló ADN plasmídico a partir de colonias bacterianas seleccionadas y se digirió con la enzima de restricción NotI. De acuerdo con el mismo protocolo experimental descrito en la Figura 23A, el ADN purificado recuperado a partir de las mezclas de reacción se transformó en células bacterianas y después se aisló el ADN plasmídico de colonias bacterianas seleccionadas. La digestión de restricción con Notl se llevó a cabo en las muestras de ADN aislado (Figura 28C) y los aislados de ADN clonal que se escindieron por la enzima de restricción se procesaron para el análisis de la secuencia de ADN. En la Figura 28D se representa un panel representativo para cada una. Los datos adicionales de la secuencia de ADN se muestran en las Figuras 32A-32B. Los datos de secuenciación confirmaron el análisis RFLP y revelaron una población heterogénea de insertos de secuencia dentro de ambas categorías de clones. Es importante destacar que en el 50 % de las secuencias analizadas a partir de reacciones inducidas por el oligonucleótido monocatenario que se integra en la cadena sentido, NotI-S, se observó una inserción única perfecta de la molécula prevista. Cuando el oligonucleótido monocatenario que se integra en la cadena sin sentido, NotI-NS, sirvió como la molécula donante, no se detectó la inserción perfecta del fragmento. En todos los casos en los que no se detectó una inserción perfecta, cada clon contenía una cantidad variable de modificación del ADN, a menudo en forma de eliminación.

Ejemplo 12: Reemplazo de un segmento de gen específico de sitio

En la presente descripción se demostró que tanto la eliminación específica de sitio, que tal vez refleja una reacción de unión de extremos no homólogos, como la inserción específica de sitio del fragmento de ADN monocatenario, que tal vez refleja la reparación dirigida por homología, eran posibles en este sistema in vitro. Se sometió a prueba la capacidad del sistema para respaldar catalíticamente el reemplazo preciso de un segmento de un gen. Un objetivo a largo plazo de la edición de genes es reemplazar con éxito una copia funcional del gen desactivado o un exón disfuncional. Se llevó a cabo la misma estrategia de reacción que se realizó para la evaluación de la inserción (ver la Figura 23A), excepto que en esta reacción se usaron dos RNP Cpfl para generar dos cortes en diferentes posiciones a lo largo del gen lacZ para extraer un segmento del gen. Se diseñaron reacciones separadas para reemplazar segmentos de genes de 81, 136 y 177 pares de bases y se añadieron poblaciones individuales de fragmentos de ADN donante de 81, 136 y 186 bases, respectivamente, a cada una de las reacciones de reemplazo separadas. Con respecto a las reacciones que contenían el fragmento donante de ADN de 81 bases, el 20 % de las colonias recuperadas contenían un reemplazo perfecto, en marco, que conserva la región codificante del gen lacZ (Figura 33A). El sesenta y seis por ciento de las reacciones de reemplazo de 136 bases dieron como resultado plásmidos que contenían un reemplazo perfecto (Figura 33B) y el 10 % de las reacciones de reemplazo de 186 bases albergaban plásmidos que portaban un reemplazo perfecto (Figura 33C). Se incorporó un código de barras, AA/TT/GGG, en cada uno de los fragmentos de ADN donante para garantizar que la homología de los salientes 5' fuera distinguible del segmento de gen nativo. El mismo experimento también se llevó a cabo con fragmentos de ADN donante con longitudes de 17, 36 y 45 bases; ninguno de estos fragmentos de ADN donante produjo reemplazos precisos (Figura 35A) aunque sí generaron reemplazos imprecisos de longitudes y composición variables. Estos resultados demostraron que este sistema de edición de genes in vitro puede catalizar reemplazos perfectos de segmentos de genes con fragmentos de ADN donante de longitudes que varían de aproximadamente 81 a 186 bases. También es importante tener en cuenta que también se encontraron eliminaciones específicas de sitio en la población de plásmidos aislados producidos a partir de reacciones que contenían segmentos de ADN donante (Figura 35B), lo que confirma el hecho de que tanto las reacciones de eliminación/extirpación como las de reemplazo tenían lugar en el mismo sistema in vitro.

Ejemplo 13: Mutagénesis dirigida al sitio

El éxito del reemplazo de ADN de una sección del gen lacZ con un alto grado de precisión impulsó someter a prueba una aplicación única de la edición de genes in vitro. Se observó un reemplazo perfecto del segmento de gen con una frecuencia notable, particularmente cuando se usaron fragmentos de ADN donante con longitudes entre 81-186 bases. Se decidió dirigirse al gen KRAS y rediseñar por ingeniería genética mutaciones oncogénicas bien conocidas que se encuentran dentro de la región codificante. Dos mutaciones prominentes aparecieron dentro de los primeros 13 codones; en la posición 35, una transversión de G a Bioensayos cambia el aminoácido producido a partir de estos codones de glicina a ácido aspártico. (Figura 36A). En el codón adyacente 13, una segunda transversión de G a A convierte de nuevo una glicina en un residuo de ácido aspártico. Cada una de estas mutaciones, ya sea como cambios en un solo sitio o como un cambio en un sitio doble, puede tener un impacto severo en redirigir la función de la proteína KRAS. Por lo tanto, las tres mutaciones se generaron en una única mezcla de reacción al combinar tres fragmentos de ADN donante que portaban las mutaciones G12D, G13D y una combinación de G12D y G13D (Figura 36B). Se utilizó un fragmento de ADN donante de 114 bases porque los resultados de la reacción de optimización indicaron que se podía lograr un reemplazo exitoso y eficiente con fragmentos que variaban de 81 a 186 bases (Figura 33A-33C). La reacción se llevó a cabo como se describe en la Figura 23A con un cambio: se mantuvo la relación molar entre el fragmento de ADN donante y la RNP, de modo que en esta reacción, solo estaba presente en la reacción el 33 % de cada uno de los tres fragmentos donantes diferentes. Los resultados se presentan en la Figura 36C. La mutagénesis específica de sitio del gen KRAS se aisló y confirmó mediante el análisis del ADN plasmídico aislado independientemente de 14 colonias bacterianas. Dentro de esta población, se encontraron tanto mutaciones individuales como la mutación doble; se encontró que el 78 % de los plásmidos secuenciados contenían las mutaciones individuales o la mutación doble y el 50 % se reemplazó perfectamente. Estos resultados revelaron que puede usarse esta reacción de edición de genes in vitro para el reemplazo preciso combinado de segmentos de gen y generar una población de mutaciones específicas de sitio a partir de una sola mezcla de reacción. Además, para confirmar que esta reacción es realmente específica de sitio y no genera mutaciones fuera del sitio no deseadas dentro de la región codificante del gen KRAS, los plásmidos se secuenciaron aguas arriba y aguas abajo más allá de la región codificante del gen KRAS. El mapa de la estrategia de

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para realizar la mutagénesis in vitro de una secuencia objetivo, el método comprende:

incubar una mezcla que comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un primer plásmido, un oligonucleótido y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes, en donde la RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas,

en donde el primer plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo, y en donde el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado,

lo que genera por tanto un segundo plásmido mutado;

administrar el segundo plásmido a una pluralidad de células que no son de la línea germinal; y seleccionar de la pluralidad de células al menos una célula en donde se ha producido mutagénesis in vitro en la secuencia objetivo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la endonucleasa Cas se selecciona del grupo que consiste en Cas9, Cas3, Cas8a, Cas8b, CaslOd, Csel, Csyl, Csn2, Cas4, CaslO, Csm2, Cmr5, Fokl, T7, Cpfl, Cpf2, CasY y CasX, preferentemente, en donde la endonucleasa Cas9 es spCas9 o saCas9.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la RNP comprende además un tracrARN, preferentemente, en donde un solo constructo de ARN comprende el tracrARN y el crARN.
4. El método de la reivindicación 1, en donde cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 bases, preferentemente, en donde cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de aproximadamente 72 bases.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la mutagénesis in vitro comprende al menos una mutación en la secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo seleccionada del grupo que consiste en una modificación, una eliminación y una inserción de una sola base de nucleótido.
6. El método de la reivindicación 1, en donde cada oligonucleótido comprende además independientemente un enlace terminal modificado químicamente.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el extracto de células se selecciona del grupo que consiste en extracto de células completas, extracto libre de células, extracto nuclear y extracto citoplasmático, preferentemente:

en donde el extracto de células es un extracto de células eucariotas, preferentemente:

en donde el extracto de células eucariotas es un extracto de células de mamífero, con mayor preferencia, en donde el extracto de células de mamífero se deriva de al menos una célula seleccionada del grupo que consiste en HEK, HUH-7, DLD1 y HCT116; o

en donde el extracto de células eucariotas se deriva de S. cerevisiae.
8. El método de la reivindicación 1, en donde:

(a) la mezcla comprende (i) una pluralidad de RNP, cada RNP comprende un crARN complementario a una secuencia objetivo diferente en comparación con los crARN de otras RNP de la pluralidad, y (ii) una pluralidad de oligonucleótidos, cada oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo diferente en comparación con otros oligonucleótidos de la pluralidad y que contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado en comparación con su secuencia objetivo diferente;

(b) se genera una pluralidad de segundos plásmidos;

(c) la pluralidad de segundos plásmidos se administra a la pluralidad de células; y

(d) se ha producido mutagénesis in vitro en las diferentes secuencias objetivo,

preferentemente:

en donde el primer plásmido comprende una o más secuencias de nucleótidos de las diferentes secuencias objetivo; o

que comprende además una pluralidad de plásmidos, cada plásmido comprende una o más secuencias de nucleótidos de las diferentes secuencias objetivo.
9. El método de la reivindicación 1, que comprende además una segunda RNP que comprende un segundo crARN complementario a una segunda secuencia objetivo.
10. Un kit de mutagénesis in vitro para una secuencia objetivo, el kit comprende una partícula de ribonucleótidos aislada (RNP), un oligonucleótido, un plásmido y un extracto de células que tiene actividad enzimática para la edición de genes,

en donde la RNP comprende un crARN y una endonucleasa Cas,

en donde el plásmido comprende una secuencia de nucleótidos de una secuencia objetivo, y en donde el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo pero que contiene al menos un nucleótido incorrectamente apareado con la secuencia objetivo en el mismo,

preferentemente:

en donde la endonucleasa Cas se selecciona del grupo que consiste en Cas9, Cas3, Cas8a, Cas8b, CaslOd, Csel, Csyl, Csn2, Cas4, CaslO, Csm2, Cmr5, Fokl, T7, Cpf1, Cpf2, CasY y CasX, con mayor preferencia, en donde la endonucleasa Cas9 es spCas9 o saCas9.
11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además una segunda RNP que comprende un segundo crARN complementario a una segunda secuencia objetivo.
12. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la RNP comprende además un tracrARN, preferentemente, en donde un solo constructo de ARN comprende el tracrARN y el crARN.
13. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, en donde cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 bases, preferentemente, en donde cada oligonucleótido tiene independientemente una longitud de aproximadamente 72 bases.
14. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, en donde cada oligonucleótido comprende además independientemente un enlace terminal modificado químicamente.
15. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el extracto de células se selecciona del grupo que consiste en extracto de células completas, extracto libre de células, extracto nuclear y extracto citoplasmático, preferentemente:

en donde el extracto de células es un extracto de células eucariotas, preferentemente:

en donde el extracto de células eucariotas es un extracto de células de mamífero, con mayor preferencia, en donde el extracto de células de mamífero se deriva de al menos una célula seleccionada del grupo que consiste en HEK, HUH-7, DLDI y HCT116; o

en donde el extracto de células eucariotas se deriva de S. cerevisiae.