JP7364268B2 - ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途 - Google Patents
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Description
この出願は、2015年7月15日に出願された米国仮出願第62/192,876号
の優先権を主張するものである。当該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み
込まれている。
本明細書に開示された発明の少なくとも一部は、国務省フルブライト留学生プログラム
からの政府支援(グラントNo.15130816)を受けてなされたものである。した
がって、米国政府は本発明についてある種の権利を有する。
本発明は、標的化された遺伝子編集のためのシステムおよびその関連した用途に関する
。
ルである。これによれば、標的化されたゲノムの位置および/または特定の染色体の配列
を削除し、不活性化し、または修飾することができる。現状のいくつかの方法は、亜鉛フ
ィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(T
ALEN)のような人工的なヌクレアーゼ酵素の使用に依拠している。これらのキメラヌ
クレアーゼは、プログラム可能な、非特異的DNA切断ドメインに連結した配列特異的D
NA結合モジュールを有している。それぞれの新たなゲノム標的が生じると、新規な配列
特異的DNA結合モジュールを有する新たなZFNまたはTALENを設計する必要があ
ることから、カスタム設計によるこれらのヌクレアーゼの調製は高価かつ時間のかかるも
のとなりがちである。また、ZFNおよびTALENの特異性はオフターゲットの切断を
媒介しうるものである。近年開発されたゲノム修飾技術は、細菌の、RNAガイド化DN
Aエンドヌクレアーゼである、規則間隔短鎖反復回文配列クラスター(CRISPR;c
lusters of regularly interspaced short p
alindromic repeats)関連タンパク質9(Cas9)を利用してDN
A標的部位における特異的な二本鎖切断(DSB)を誘導している。このRNA-Cas
9複合体はその同族DNAを認識し、これと塩基対合することでDSBを形成して標的を
切断する。
収集するかということである。今のところ、現状の技術における共通のエフェクターはヌ
クレアーゼであり、これはDNAのDSBをもたらし、これがさらに相同組み換えや非相
同末端結合といった細胞の経路の不活性化を引き起こす。このプロセスは多くの主要な欠
点を抱えている。第1に、末端結合による末端生成物の予期せぬ性質により、DSBが確
率論的で予期できないようなインフレーム変異およびフレームシフト変異の双方を引き起
こし、このことが直接的な臨床適用の用途を制限している。第2に、DSBは染色体転座
のような非局所的な変異原性イベント(これはこの手法の望ましくない結果である)を生
じる可能性を秘めている。インビボではこれらの変化は潜在的に有害なものでありうる。
第3に、修復または修正には通常、DSB媒介性の相同組み換えが必要とされるが、ほと
んどの体組織/体細胞(そこでの治療が最も問題となる)においてその活性は低いか、ま
たは存在しない。
られており、二本鎖切断を引き起こすヌクレアーゼ活性に依拠しない標的化遺伝子修飾の
技術が求められている。
より、上記の要求に対処するものである。
(i)配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(ii)RNAスキャホールドまたはこれをコードするDNAポリヌクレオチドと、
(iii)非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌ
クレオチドと、
を含むシステムが提供される。上記RNAスキャホールドは、(a)標的核酸の配列に相
補的なガイドRNA配列を含む核酸標的化モチーフ、(b)前記配列標的化タンパク質に
結合可能なCRISPRモチーフ、および(c)リクルーティングRNAモチーフを含む
。上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質は、(a)前記リクルーティングRN
Aモチーフに結合可能なRNA結合ドメイン、(b)リンカー、および(c)エフェクタ
ードメインを含む。また、上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質は酵素活性を
有する。
る。好ましくは、上記配列標的化タンパク質はヌクレアーゼ活性を有していないものであ
る。上記配列標的化タンパク質の例としては、化膿連鎖球菌、B群溶血性連鎖球菌、黄色
ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デン
ティコラからなる群から選択される種のdCas9が挙げられる。
RNA結合ドメインは、以下のものからなる群から選択される対でありうる:
(1)テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質またはそのRNA結合部位;
(2)テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質またはそのRNA結合部
位;
(3)MS2ファージオペレーターステムループおよびMS2コートタンパク質(MCP
)またはそのRNA結合部位;
(4)PP7ファージオペレーターステムループおよびPP7コートタンパク質(PCP
)またはそのRNA結合部位;
(5)SfMuファージComステムループおよびComRNA結合タンパク質またはそ
のRNA結合部位;並びに、
(6)非天然のRNAアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのRNA結
合部位。
は0~100(例えば、1~100、5~80、10~50および20~30)のアミノ
酸長でありうる。上記酵素活性は、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デ
メチラーゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性
、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トラ
ンスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ
活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性でありうる。ある実施形態では、上
記酵素活性は脱アミノ化活性(例えば、シトシン脱アミノ化活性もしくはアデノシン脱ア
ミノ化活性)、メチルトランスフェラーゼ活性またはデメチラーゼ活性である。上記RN
A結合ドメインは、Cas9、その機能的等価物およびそのRNA結合ドメインのいずれ
でもない。
酸、当該核酸を含む発現ベクター、または当該核酸を含む宿主細胞もまた、提供される。
。この方法は、上記標的核酸を、上記システムの構成要素(i)~(iii)に接触させ
ることを含む。当該標的核酸は、細胞中に存在するものでありうる。当該標的核酸は、R
NAであってもよいし、染色体外のDNAであってもよいし、染色体上のゲノムDNAで
あってもよい。当該細胞は、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、
体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊
椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウ
シの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、
非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択されうる。
。当該ヒトまたは非ヒトの被験体は、遺伝子の遺伝子変異を有している。ある実施形態で
は、上記被験体は当該遺伝子変異に起因する障害または当該障害を有するリスクを抱えて
いるものである。この場合、上記部位特異的な修飾は、上記遺伝子変異を修正するか、ま
たは上記遺伝子の発現を不活性化する。他の実施形態では、上記被験体は病原体を有して
いるか、または当該病原体に曝露されるリスクを抱えているものであり、上記部位特異的
な修飾は、上記病原体の遺伝子を不活性化する。
供する。当該システムは、再構成および/または希釈のための試薬、並びに核酸またはポ
リペプチドを宿主細胞中に導入するための試薬からなる群から選択される1つ以上の構成
要素をさらに含んでもよい。
の範囲の記載から、本発明の他の特徴、目的および利点については明らかとなるものと思
われる。
Bと、これによるDSB誘導性の相同組み換えに基づくものである。ほとんどの体細胞に
おいて相同組み換えの活性は低いかまたは存在しないことから、ほとんどの疾患において
、体組織での病理学的な遺伝子変異の治療的な修正のためのこれらの技術の用途は制限さ
れている。
れた遺伝子またはRNA転写物の編集を可能とするプラットフォームまたはシステムに基
づくものである。このシステムはヌクレアーゼ活性に基づくものではなく、DSBを生成
するものでもなく、DSB媒介性の相同組み換えに依拠するものでもない。さらに、当該
プラットフォームのRNAスキャホールドの設計はモジュラー式であり、これによって任
意の所望のDNA配列またはRNA配列を極めてフレキシブルで簡便な方式により標的化
することが可能となる。本質的に、このアプローチによれば、幹細胞などの体細胞におけ
る実質的にいかなるDNA配列またはRNA配列に対しても、DNAまたはRNAの編集
酵素を導くことが可能である。標的のDNA配列またはRNA配列を正確に編集すること
を通じて、当該酵素は、遺伝子疾患においては変異した遺伝子を修正し、ウイルス感染細
胞においてはウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因タンパク
質の発現を防止し、がんにおいてはがん原性タンパク質をサイレンシングすることができ
る。また、このアプローチは生体外で幹細胞または前駆細胞のゲノムを編集することによ
る細胞ベースの治療にも用いられうる。治療用途のほかにも、上記システムは、強力な研
究ツールとして任意の有機体のゲノムの標的化された修飾に広く適用可能である。
本発明の一形態によれば、遺伝子編集プラットフォームが提供され、これによって現状
のヌクレアーゼおよびDSB依存的なゲノム工学技術および遺伝子編集技術における上述
したような制限が克服される。当該プラットフォームはCasRcureシステムまたは
CRCシステムと称されるが、3つの機能的な構成要素を備えている:(1)配列の標的
化のために設計された、ヌクレアーゼを含まないCRISPR/Casベースのモジュー
ル;(2)当該プラットフォームを標的配列へと導くとともに修正モジュールを動員する
mためのRNAスキャホールドベースのモジュール;および(3)シトシンデアミナーゼ
類(例えば、活性化誘導シトシンデアミナーゼ(AID)等)などの、エフェクター修正
モジュールとしての非ヌクレアーゼDNA/RNA修飾酵素、である。CasRcure
システムによれば、これらが一体となって、特定のDNA/RNA配列へのアンカリング
、フレキシブルかつモジュラー式のエフェクターDNA/RNA修飾酵素の特定配列への
動員、および遺伝子情報(特に、点変異)を修正するための体細胞において活性な細胞経
路の誘導、が可能となる。
テムは、図1Aに示される3つの構造的および機能的な構成要素を備えている:(1)配
列標的化モジュール(例えば、dCas9タンパク質);(2)配列の認識およびエフェ
クターの動員のためのRNAスキャホールド(ガイドRNAモチーフ、CRISPR R
NAモチーフおよびリクルーティングRNAモチーフを含むRNA分子);並びに(3)
エフェクター(リクルーティングRNAモチーフに結合する小タンパク質に融合した、A
IDなどの非ヌクレアーゼDNA修飾酵素)、である。これらの3つの構成要素は、単一
の発現ベクター中に、または2つもしくは3つの異なる発現ベクター中に構築されうる。
これらの3つの特定の構成要素の全体性および組み合わせにより、技術的なプラットフォ
ームが構成される。
RNAスキャホールド媒介性の動員システム(CRC)に対し、Cas9のエフェクター
タンパク質への直接的な融合(BE3)。後述する実施例に示されている結果から、RN
Aスキャホールド媒介性の動員は、直接的な融合と比較して、染色体外の標的(図6Cお
よび図6D)並びに内在性の遺伝子(図7B)の双方においてより効率的であることがわ
かる。また、上記CRCシステムはDNA修復酵素であるUNGの阻害に依拠していない
のに対し、BE3は強力なUNG阻害剤ペプチド(UGI)を用いるものである。広範囲
のまたは局所的なDNA修復の阻害は、望ましくない、制御不能な、潜在的に有害な結果
をもたらす可能性がある。そして、CRCシステムのモジュラー式の設計によれば、フレ
キシブルなシステムの構築が可能となる。モジュールは互換性を有しており、異なるモジ
ュールの多数の組み合わせも容易に達成可能である。これに対して、直接的な融合の場合
、新たなモジュールを構築するには常に新たな融合プロセスを必要とする。さらに、RN
Aスキャホールド媒介性の動員によれば、エフェクタータンパク質のオリゴマー化を促進
しやすいのに対し、直接的な融合では立体障害のためにオリゴマーの形成は不可能である
。
上記システムの配列標的化のための構成要素は、細菌の種に由来するCRISPR/C
asシステムに基づくものである。本来の機能的な細菌のCRISPR-Casシステム
は3つの構成要素を必要とする:ヌクレアーゼ活性を提供するCasタンパク質と、CR
ISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)と称
される2つの短い非コードRNA種であり、この2つのRNA種はいわゆるガイドRNA
(gRNA)を形成する。タイプIIのCRISPRは最もよく特徴付けられているシス
テムの1つであり、4つの連続したステップにより標的化されたDNAの二本鎖切断を引
き起こす。第1に、2つの非コードRNA(pre-crRNAおよびtracrRNA
)がCRISPR遺伝子座から転写される。第2に、tracrRNAがpre-crR
NA分子の繰り返し領域にハイブリダイズし、独自のスペーサー配列を有する成熟crR
NA分子へのpre-crRNA分子の成熟を媒介する。第3に、成熟crRNA:tr
ancrRNA複合体(すなわち、いわゆるgRNA)がCasヌクレアーゼ(Cas9
など)に対し、crRNA上の上記スペーサー配列と標的DNA(これは3ヌクレオチド
(nt)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する)上のプロトスペーサー配
列の相補鎖との間のワトソン-クリック塩基対を介したDNAの標的化を指示する。PA
M配列はCas9の標的化に必須である。最後に、Casのヌクレアーゼが標的DNAの
切断を媒介することにより、標的部位内において二本鎖切断を引き起こす。その本来の文
脈において、CRISPR/Casシステムは、度重なるウイルス感染から細菌を保護す
る適応免疫機構として機能し、PAM配列は自己/非自己の認識シグナルとして作用し、
Cas9タンパク質はヌクレアーゼ活性を有している。CRISPR/Casシステムは
、インビトロおよびインビボの双方において、遺伝子編集のための非常に大きな可能性を
有することが判明している。
すなわち、変異体Casタンパク質(例えば、そのヌクレアーゼ触媒ドメインに変異を有
することでヌクレアーゼ活性を持たないdCas9タンパク質、または触媒ドメインの1
つに部分的に変異を有することでDSBを生成するためのヌクレアーゼ活性を持たないn
Cas9など)は、短い(典型的には20ヌクレオチド長の)スペーサー配列を含みCa
sタンパク質をその標的であるDNA配列またはRNA配列へと導く非コードRNAスキ
ャホールド分子を特異的に認識する。後者は3’PAMの横に位置している。
PR関連タンパク質またはCRISPRタンパク質との語は互換的に使用可能であり、R
NAによりガイドされるDNA結合を伴うCRISPR-CasのタイプIシステム、タ
イプIIシステムまたはタイプIIIシステムの、またはこれ由来のタンパク質を意味す
る。適切なCRISPR/Casタンパク質の非制限的な例としては、Cas3、Cas
4、Cas5、Cas5e(またはCasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、C
as7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10
、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cs
e1(またはCasA)、Cse2(またはCasB)、Cse3(またはCasE)、
Cse4(またはCasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、C
sm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、C
mr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx
16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、C
sf4およびCu1966が挙げられる。例えば、WO2014/144761、WO2
014/144592、WO2013/176772、US2014/0273226お
よびUS2014/0273233が参照され、これらの内容はその全体が参照により本
明細書に組み込まれる。
来のものである。例示的な実施形態において、Casタンパク質はCas9タンパク質で
あるか、またはこれ由来のものである。当該Cas9タンパク質は、化膿連鎖球菌、サー
モフィルス菌、ストレプトコッカス・エスピー、ノカルジオプシス・ダソンヴィレイ、ス
トレプトマイセス・プリスチネスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランジウム・ロセウム、スト
レプトスポランジウム・ロセウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス
・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム ・
シビリクム、ラクトバチルス・デルブリッキィ、ラクトバチルス・サリバリウス、ミクロ
シラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、
ポラロモナス・エスピー、クロコスファエラ・ワトソニー、シアノセイス・エスピー、ミ
クロシスティス アエルギノーサ、シネチョコッカス・エスピー、アセトハロビウム・ア
ラビティカム、アモニフェクス・デジェンシー、カルディセルロシルプター・ベスシー、
カンジダトゥス・デスルホルディス、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、
フィネゴルディア・マグナ、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマキュラム
・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フ
ェロオキシダンス、アロクロマティウム・ビノサム、マリノバクター・エスピー、ニトロ
ソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニー、シュードアルテロモナス・
ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガ
ータム、アナベナ・バリアビリス、ノデュラリア・スピミゲナ、ノストック・エスピー、
アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・エスピー
、リングビア・エスピー、ミクロコレウス・クソノプラステス、オスキアトリア・エスピ
ー、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌスまたはアカリオクロリス・マリ
ナ由来のものでありうる。一般に、Casタンパク質は少なくとも1つのRNA結合ドメ
インを含む。当該RNA結合ドメインはガイドRNAと相互作用する。Casタンパク質
は野生型のCasタンパク質であってもよいし、ヌクレアーゼ活性を有しない修飾型であ
ってもよい。Casタンパク質は、核酸に対する結合親和性および/もしくは特異性を増
大させ、酵素活性を変化させ、並びに/または当該タンパク質の他の特性を変化させるこ
とを目的として修飾されうる。例えば、当該タンパク質のヌクレアーゼ(すなわち、DN
アーゼ、RNアーゼ)ドメインは、修飾され、除去され、または不活性化されうる。ある
いは、当該タンパク質は、その機能に必須ではないドメインを除去する目的で短鎖化され
うる。当該タンパク質はまた、エフェクタードメインの活性を最適化する目的で、単鎖化
または修飾されうる。
の変異体またはその断片でありうる。他の実施形態において、Casタンパク質は変異型
Casタンパク質に由来するものであってもよい。例えば、Cas9タンパク質のアミノ
酸配列は、当該タンパク質の1つ以上の特性(例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定
性など)を変化させる目的で改変されうる。あるいは、Cas9タンパク質のRNA標的
化に関与しないドメインが当該タンパク質から除去されてもよく、これによって修飾型C
as9タンパク質は野生型Cas9タンパク質よりも短くなる。ある実施形態において、
本発明のシステムは、細菌中でコードされる、または哺乳動物の細胞での発現のためにコ
ドンが最適化された、化膿連鎖球菌由来のCas9タンパク質を利用する。
以上の点変異、挿入、欠失、切断を含むタンパク質、融合タンパク質またはこれらの組み
合わせ)を意味する。この変異体は、RNAガイド化DNA結合活性もしくはRNAガイ
ド化ヌクレアーゼ活性の少なくとも一方、またはこれらの双方を有している。一般に、修
飾型は、後述する配列番号:1のような野生型タンパク質に対して、少なくとも50%(
例えば、50%~100%(両端含む)の間の任意の数(例えば、50%、60%、70
%、75%、80%、85%、90%、95%および99%))の同一性を有する。
換えポリペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドを調製するには、これをコー
ドする核酸が、融合相手をコードする他の核酸(例えば、グルタチオン-S-トランスフ
ェラーゼ(GST)、6×-HisエピトープタグまたはM13遺伝子3タンパク質)と
連結されうる。得られた融合核酸は、適当な宿主細胞中で融合タンパク質を発現し、これ
は本技術分野において公知の手法により単離されうる。上記融合相手を除去して本発明の
組み換えタンパク質を得る目的で、単離された融合タンパク質は、例えば酵素消化によっ
てさらに処理されうる。あるいは、上記タンパク質は化学的に合成されてもよいし(例え
ば、Creighton, ”Proteins: Structures and M
olecular Principles,” W.H. Freeman & Co.
, NY, 1983を参照)、本明細書に記載の組み換えDNA技術によって製造され
てもよい。さらなる指針として、当業者はFrederick M. Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular B
iology, John Wiley & Sons, 2003;およびSambr
ook et al., Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual,” Cold Spring Harbor Press, C
old Spring Harbor, NY, 2001を参照しうる。
てもよいし、組成物の一部であってもよい。好ましくは、組成物中の場合、当該タンパク
質はまずある程度(より好ましくは高い純度レベル(例えば、約80%、90%、95%
もしくは99%またはそれ以上)へと)精製される。本発明に係る組成物は、所望の任意
のタイプの組成物でありうるが、典型的にはRNAによりガイドされる標的化のための組
成物としての使用に(またはこれに含まれるのに)適した水性組成物である。本技術分野
の当業者は、このようなヌクレアーゼ反応のための組成物に含まれうる種々の成分を熟知
している。
球菌由来のdCas9、D10A・H840A変異体タンパク質、図1A)、またはヌク
レアーゼ活性のないニッカーゼCas9(例えば化膿連鎖球菌由来のnCas9、D10
A変異体タンパク質、図1Aおよび図2F)が用いられうる。dCas9またはnCas
9は、種々の他の細菌種由来のものであってもよい。dCas9の非制限的な例とそれに
対応するPAM要求性の一覧を表1に示す。
本明細書に記載のプラットフォームの第2の構成要素はRNAスキャホールドであり、
これは3つのサブ構成要素:プログラム可能なガイドRNAモチーフ、CRISPR R
NAモチーフ、およびリクルーティングRNAモチーフ、を備えている。このスキャホー
ルドは、単一のRNA分子であってもよいし、複数のRNA分子の複合体であってもよい
。本明細書に開示されているように、プログラム可能なガイドRNA、CRISPR R
NAおよびCasタンパク質は、一緒になって配列の標的化および認識のためのCRIS
PR/Casベースのモジュールを形成する。一方、RNA-タンパク質結合対を介した
リクルーティングRNAモチーフはタンパク質エフェクターを動員し、このタンパク質エ
フェクターが遺伝子の修正を行う。このように、当該第2の構成要素は、修正モジュール
と配列認識モジュールとを連結するものである。
重要なサブ構成要素の1つは、プログラム可能なガイドRNAである。その単純さと効
率性から、CRISPR-Casシステムは種々の有機体の細胞において遺伝子編集を行
うのに用いられてきた。このシステムの特異性は標的DNAとカスタム設計されたガイド
RNAとの間での塩基対形成によって決定される。ガイドRNAの塩基対形成の特性を設
計・調整することにより、標的配列中にPAM配列が存在する限り、所望の任意の配列を
標的化することが可能である。
特異性を担っている。このガイド配列は、予め選択された所望の標的部位に対して相補的
でこれに対してハイブリダイゼーション可能な領域を含んでいる。種々の実施形態におい
て、このガイド配列は約10から約25超のヌクレオチドを含みうる。例えば、ガイド配
列とこれに対応する標的部位の配列との間の塩基対形成の領域のヌクレオチド長は、約1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23
、24、25、または25超でありうる。例示的な実施形態において、ガイド配列は約1
7~20ヌクレオチド長(例えば、20ヌクレオチド長)である。
とである。各標的配列およびこれに対応するPAM部位/配列は、本明細書ではCas標
的化部位と称される。最もよく特徴付けられているシステムの1つであるタイプII C
RISPRシステムは、標的を切断するのにCas9タンパク質および標的配列に相補的
なガイドRNAのみを必要とする。化膿連鎖球菌のタイプII CRISPRシステムは
N12-20NGGを有する標的部位を利用しているが、NGGとは化膿連鎖球菌由来の
PAM部位を意味し、N12-20とはPAM部位の5’側に位置する12~20ヌクレ
オチドを意味する。他の細菌種に由来する他のPAM部位の配列としては、NGGNG、
NNNNGATT、NNAGAA、NNAGAAWおよびNAAAACが挙げられる。例
えば、US20140273233、WO2013176772、Cong et al
.,(2012),Science 339(6121):819-823、Jinek
et al.,(2012),Science 337(6096):816-821
、Mali et al,(2013),Science 339(6121):823
-826、Gasiunas et al.,(2012),Proc Natl Ac
ad Sci USA.109(39):E2579-E2586、Cho et al
.,(2013)Nature Biotechnology 31,230-232、
Hou et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2013 S
ep 24;110(39):15644-9、Mojica et al.,Micr
obiology.2009 Mar;155(Pt3):733-40およびwww.
addgene.org/CRISPR/を参照のこと。これらの文献の内容はその全体
が参照により本明細書に引用されている。
なゲノムdsDNAの例としては、必ずしもこれらに限定されないが、宿主細胞の染色体
、ミトコンドリアDNAおよび安定的に保持されたプラスミドが挙げられる。しかしなが
ら、本発明に係る方法は、宿主細胞のdsDNAの性質にかかわらずCas標的化部位が
存在する限り、宿主細胞中に存在する他のdsDNA(例えば、不安定なプラスミドDN
A、ウイルスDNA、ファージミドDNA)に対しても実施可能であることに留意すべき
である。本発明に係る方法は、RNAに対しても実施可能である。
上述したガイド配列に加えて、本発明のRNAスキャホールドはさらに他の活性または
不活性なサブ構成要素を含む。一例において、当該スキャホールドは、tracrRNA
活性を有するCRISPRモチーフを備えている。例えば、当該スキャホールドは、天然
のcrRNA:tracrRNA二本鎖を模したものとして、上述したプログラム可能な
ガイドRNAがtracrRNAに融合されてなるハイブリッドRNA分子でありうる。
例示的なハイブリッドcrRNA:tracRNAであるsgRNA配列は以下のとおり
である:5’-(20ntガイド)-GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACA
GCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG
AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(配列番号:4
;Chen et al.Cell.2013 Dec 19;155(7):1479
-91)。種々のtracrRNA配列が本技術分野において公知であり、一例として、
以下のtracrRNAおよびその活性部分が挙げられる。本明細書で用いられる場合、
tracrRNAの活性部分はCas9またはdCas9などのCasタンパク質と複合
体を形成する能力を保持している。例えば、WO2014144592を参照のこと。c
rRNA-tracrRNAハイブリッドRNAを作製する方法は本技術分野において公
知である。例えば、WO2014099750、US20140179006およびUS
20140273226を参照のこと。これらの文献の内容は、その全体が参照により本
明細書に引用されている。
分子であり、これらがともにガイドRNAおよび関連するスキャホールドを形成する。こ
の場合、tracrRNA活性を有する分子はガイド配列を有する分子と(通常は塩基対
形成によって)相互作用することができなくてはならない。
RNAスキャホールドの第3のサブ構成要素は、リクルーティングRNAモチーフであ
り、これは修正モジュールと配列認識モジュールとを連結する。この連結は本明細書に記
載のプラットフォームにとって重要なものである。
パク質をdCas9に直接融合することである。配列認識に必要なタンパク質(例えば、
dCas9)へのエフェクター酵素(「修正モジュール」)の直接的な融合は、配列特異
的な転写の活性化または抑制によって可能であるが、タンパク質-タンパク質の融合の設
計によって空間的な障害が発生する可能性があり、活性を発揮するためには多量化複合体
を形成する必要がある酵素にとってこのことは理想的であるとは言えない。実際に、ほと
んどのヌクレオチド編集酵素(例えば、AIDまたはAPOBEC3Gなど)は、DNA
編集の触媒活性を発揮するのに二量体、三量体またはより高次のオリゴマーの形成を必要
とする。所定のコンホメーションでDNAに対してアンカリングするdCas9への直接
的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害となりうる
。
エフェクタータンパク質の動員に基づくものである。より具体的に、当該プラットフォー
ムは、種々のRNAモチーフ/RNA結合タンパク質の結合対の利点を活用するものであ
る。この目的に向けて、RNAスキャホールドはRNA結合タンパク質(例えば、MS2
コートタンパク質、MCP)に特異的に結合するRNAモチーフ(例えば、MS2オペレ
ーターモチーフ)がgRNA-CRISPRスキャホールドに連結されるように設計され
る(図1A)。
素は、設計されたRNA分子であり、特異的なDNA/RNAの配列認識のためのgRN
Aモチーフ(すなわち、dCas9結合のためのCRISPR RNAモチーフ)のみな
らず、エフェクターの動員のためのリクルーティングRNAモチーフをも備えている(図
1A)。このようにして、動員されたエフェクタータンパク質融合物は、そのリクルーテ
ィングRNAモチーフへの結合能を通じて標的部位へと動員されうる。RNAスキャホー
ルドが媒介する動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、三量体
またはオリゴマーが標的DNA配列または標的RNA配列の近傍で比較的容易に形成され
やすい。立体配置の例を図1B~図1Eに示す。これらのRNAリクルーティングモチー
フ/結合タンパク質の対は、天然源(例えば、RNAファージまたは酵母テロメラーゼ)
に由来するものであってもよいし、人工的に設計されたもの(例えば、RNAアプタマー
およびこれに対応する結合タンパク質リガンド)であってもよい。CasRcureシス
テムにおいて用いられうるリクルーティングRNAモチーフ/RNA結合タンパク質の対
の例の非制限的な一覧を表2に示す。
合体であってもよい。例えば、ガイドRNA、CRISPRモチーフおよびリクルーティ
ングRNAモチーフが、1つの長い単一のRNA分子の3つのセグメントであってもよい
。あるいは、これらの1つ、2つまたは3つが別々の分子に存在していてもよい。後者の
場合、当該3つの構成要素は、共有結合または、例えばワトソン-クリック塩基対結合な
どの非共有結合を介して互いに連結されてスキャホールドを形成しうる。
NA分子は、プログラム可能なガイドRNAと、自身と相補的な領域とともにステム二本
鎖構造を形成しうる領域とを含みうる。そして第2のRNA分子は、CRISPRモチー
フおよびリクルーティングRNAモチーフに加えて、上述した相補的な領域を含みうる。
このステム二本鎖構造を介することで、第1および第2のRNA分子は本発明のRNAス
キャホールドを形成する。一実施形態において、第1および第2のRNA分子はそれぞれ
他の配列との間で塩基対を形成する(約6~約20ヌクレオチドの)配列を含む。同様に
して、CRISPRモチーフおよびリクルーティングRNAモチーフもまた、異なるRN
A分子に存在していてもよいし、他のステム二本鎖構造を用いて一体化されてもよい。
転写、および化学合成などの本技術分野において公知の種々の方法により作製されうる。
TC-RNA化学を利用することで相対的に長い(200マーまたはそれ以上の)RNA
を化学的に合成することが可能であり、基本的な4つのリボヌクレオチド(A、C、Gお
よびU)により作製されるRNAよりも優れた特別な機能を備えたRNAを作製すること
ができる。
宿主細胞系またはインビトロでの翻訳-転写系を利用した組み換え技術を用いて作製され
うる。これらのシステムおよび技術の詳細については、例えば、WO201414476
1、WO2014144592、WO2013176772、US2014027322
6およびUS20140273233が参照され、その内容は全体が参照により本明細書
に引用されている。この複合体は、少なくともある程度、当該複合体が作製された細胞を
構成する細胞物質またはインビトロでの翻訳-転写系から、単離または精製されてもよい
。
ては、少なくとも1つの非天然のヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチド、またはそれら
の類似体を含めることが挙げられる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分、リン酸部分お
よび/または塩基部分において修飾されうる。修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル類
似体、2’-デオキシ類似体または2’-フルオロ類似体を含みうる。核酸の骨格が修飾
されてもよく、例えばホスホロチオエート骨格が用いられてもよい。ロックト核酸(LN
A)または架橋核酸(BNA)を使用することも可能である。修飾塩基のさらなる例とし
ては、以下に制限されないが、2-アミノプリン、5-ブロモウリジン、シュードウリジ
ン、イノシン、7-メチルグアノシンが挙げられる。これらの修飾は、CRISPRシス
テムの任意の構成要素に適用されうる。好ましい実施形態において、これらの修飾はRN
A構成要素(例えば、ガイドRNA配列)に対してなされる。
本発明に記載のプラットフォームの第3の構成要素は、非ヌクレアーゼエフェクターで
ある。このエフェクターはヌクレアーゼではなく、いかなるヌクレアーゼ活性をも有して
いないが、DNA修飾酵素の他の類型の活性を有していてもよい。酵素活性の例としては
、以下に制限されないが、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラー
ゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリ
ン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザ
ーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フ
ォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性が挙げられる。ある実施形態では、エフェク
ターが、シトシンデアミナーゼ(例えば、AID、APOBEC3G)、アデノシンデア
ミナーゼ(例えば、ADA)、DNAメチルトランスフェラーゼ、およびDNAデメチラ
ーゼの活性を有する。
タードメインを有する共役体または融合タンパク質である。これらの2つのドメインは、
リンカーを介して結合されうる。
本発明では種々のRNA結合ドメインが用いられうるが、Casタンパク質(Cas9
など)またはその変異体(dCas9など)のRNA結合ドメインを用いてはならない。
上述したように、所定のコンホメーションでDNAに対してアンカリングするdCas9
への直接的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害と
なりうる。その代わりに、本発明では種々の他のRNAモチーフ-RNA結合タンパク質
の結合対を利用するのである。その例としては、表2に記載のものが挙げられる。
介してエフェクタータンパク質が標的部位へと動員されうる。RNAスキャホールド媒介
性の動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、四量体またはオリ
ゴマーが標的DNA配列または標的RNA配列の近傍で比較的容易に形成されうる。
エフェクター構成要素は、活性を有する部分(すなわち、エフェクタードメイン)を含
むものである。ある実施形態では、エフェクタードメインは非ヌクレアーゼタンパク質(
例えば、デアミナーゼ)の天然の活性部分を含む。また別の実施形態では、エフェクター
ドメインは非ヌクレアーゼタンパク質の天然の活性部分の修飾アミノ酸配列(例えば、置
換、欠失、挿入)を含む。エフェクタードメインは酵素活性を有する。この活性の例とし
ては、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、DNA修復
活性、DNA損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性
、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビ
ナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、
グリコシラーゼ活性、DNAメチル化、ヒストンアセチル化活性またはヒストンメチル化
活性が挙げられる。
上述した2つのドメイン並びに本明細書に記載の他のドメインは、これらに限定されな
いが、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、また
はタンパク質融合、あるいは当業者に公知の任意の手段などのリンカーによって連結され
うる。この連結は非可逆的でも可逆的であってもよい。例えば、米国特許第462501
4号、第5057301号および第5514363号、米国特許出願公開第201501
82596号および第20100063258号、並びにWO2012142515を参
照のこと(これらの内容はその全体が参照により本明細書に引用される)。ある実施形態
では、共役体中の各リンカーおよび各タンパク質ドメインの所望の特性を利用するため、
いくつかのリンカーが含まれうる。例えば、柔軟なリンカーと共役体の溶解性を高めるリ
ンカーが単独でまたは他のリンカーとともに用いられる。ペプチドリンカーは、当該リン
カーをコードするDNAを発現させることにより、共役体中の1つ以上のタンパク質ドメ
インに連結されうる。リンカーは、酸により開裂するものであってもよいし、光により開
裂するものであってもよいし、熱に対して感受性のものであってもよい。共役の方法は当
業者によく知られており、本発明での使用に包含される。
リンカーによって連結されうる。ペプチドリンカーは、これら2つのドメインとリンカー
とをインフレームでコードする核酸を発現させることによって連結されうる。場合により
、リンカーペプチドはこれらのドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または
双方で連結されうる。いくつかの例では、リンカーは免疫グロブリンのヒンジ領域のリン
カーであり、この技術は米国特許第6,165,476号、第5,856,456号、米
国特許出願公開第20150182596号および第2010/0063258号、並び
に国際出願WO2012/142515号に開示されており、これらの内容はその全体が
参照により本明細書に引用される。
エフェクター融合タンパク質は他のドメインを含みうる。ある実施形態において、エフ
ェクター融合タンパク質は少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)を含みうる。一
般に、NLSは一続きの塩基性アミノ酸を含む。各局在化シグナルは本技術分野において
公知である(例えば、Lange et al.,J.Biol.Chem.,2007
,282:5101-5105を参照)。NLSは、融合タンパク質のN末端またはC末
端に位置してもよいし、内部の領域に位置していてもよい。
進するために少なくとも1つの細胞透過ドメインを含みうる。一実施形態において、細胞
透過ドメインは細胞透過ペプチド配列でありうる。種々の細胞透過ペプチド配列が本技術
分野において公知であり、その例としては、HIV-1 TATタンパク質、ヒトHBV
のTLM、Pep-1、VP22のものや、ポリアルギニンペプチド配列が挙げられる。
含みうる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグおよび
エピトープタグが挙げられる。ある実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質で
ありうる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグおよび/またはエピトープタ
グでありうる(例えば、米国特許出願第20140273233号を参照)。
Dを用いた。AIDは、DNAまたはRNAとの関連でシトシンの脱アミノ化反応を触媒
するシチジンデアミナーゼである。標的部位まで運ばれると、AIDはC塩基をU塩基に
変換する。***細胞において、これはCからTへの点変異を引き起こしうる。あるいは、
CからUへの変換は細胞のDNA修復経路(主に切除による修復経路)を誘導し、これに
よってU-G塩基対のミスマッチを除去し、T-A、A-T、C-GまたはG-C対で置
換しうる。その結果、標的であるC-G部位において点変異が生じうる。切除による修復
経路はすべてではないもののほとんどの体細胞に存在することから、標的部位へのAID
の動員によりC-G塩基対が他の対へと修正されうる。この場合、C-G塩基対が体細胞
において潜在的に疾患の原因となっている遺伝子変異である場合には、上述のアプローチ
は変異を修正することによって疾患を治療するために用いられうる。
ある場合には、同様のアプローチを採用して当該特定部位にアデノシンデアミナーゼを動
員し、これによってA-T塩基対を他の対へと修正することができる。他のエフェクター
酵素は、塩基対形成における他のタイプの変換を生じることが予想される。DNA/RN
A修飾酵素の非制限的な例の一覧を表3に示す。
ついては、表1~3に記載の一覧からそれぞれ選択することができ、これによって特定の
治療/有用性の目標が達成される。
ii)ガイドRNA配列、CRISPR RNAモチーフおよびMS2オペレーターモチ
ーフを含むRNAスキャホールド、並びに(iii)MS2オペレーター結合タンパク質
MCPに融合したヒトAIDを含むエフェクター融合物を用いて、CasRcureシス
テムを構築した。各構成要素の配列を以下に示す。
ペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドの作製技術は本技術分野において公知
である。例えば、Creighton,“Proteins:Structures a
nd Molecular Principles”,W.H. Freeman &
Co.,NY,1983;Ausubel et al.,Current Proto
cols in Molecular Biology,John Wiley & S
ons,2003;およびSambrook et al.,Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Press,Cold Spring Harbor,NY,2001を参照
のこと。
の発現ベクターを用いて発現させることができる。当該システムは、実質的にいかなるD
NA配列またはRNA配列をも標的化するようにプログラムされうる。
上述したプラットフォームを用いるには、タンパク質およびRNAの1つ以上の構成要
素を、これらをコードする核酸から発現させることが好ましい。これは種々の方法で実施
されうる。例えば、RNAスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸を1つ以上
の中間体ベクターにクローニングし、これを原核細胞または真核細胞に導入して複製およ
び/または転写させることが可能である。RNAスキャホールドまたはタンパク質を製造
するための、RNAスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸の貯蔵または操作
の点で、中間体ベクターは、典型的には原核生物のベクター(例えば、プラスミド、シャ
トルベクター、昆虫ベクター)である。当該核酸はまた、植物細胞、動物細胞(好ましく
は、哺乳動物細胞またはヒト細胞)、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与の
ために1つ以上の発現ベクターにクローニングされてもよい。よって、本発明は、上述し
たRNAスキャホールドまたはタンパク質の任意のものをコードする核酸を提供する。好
ましくは、当該核酸は単離および/または精製されている。
る配列を有する組み換え構築物またはベクターをも提供する。当該構築物の例としては、
ベクター(プラスミドまたはウイルスベクターなど)に本発明の核酸配列がフォワード方
向またはリバース方向で挿入されたものが挙げられる。好ましい実施形態において、当該
構築物は、当該配列に作動的に連結されたプロモーターなどの制御配列を含む。適切なベ
クターおよびプロモーターは当業者にとって数多く知られており、市販もされている。原
核宿主および真核宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、S
ambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pre
ss)にも記載されている。
。ベクターは、自己を複製し、または宿主DNAへ取り込まれる能力を有している。ベク
ターの例としては、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。本発明
のベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で当該核酸を含む。好ましくは、
ベクターは発現されるべき核酸配列に作動的に連結された1つ以上の制御配列を含む。「
制御配列」としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例え
ば、ポリアデニル化シグナル)が挙げられる。制御配列としては、ヌクレオチド配列の構
成的な発現を指示するものだけでなく、誘導性の制御配列であってもよい。発現ベクター
の設計は、形質転換され、形質導入され、または感染させられる宿主細胞、所望のRNA
またはタンパク質の発現レベルなどの選択といった因子に依存しうる。
、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドと
ファージDNAとの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ジフ
テリアウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス等のウイルスDNAが挙げられる。しかしなが
ら、宿主中で複製可能であって生存可能である限り、他の任意のベクターが用いられても
よい。適当な核酸配列は、種々の方法によってベクター中に挿入されうる。一般に、上述
したRNAまたはタンパク質の1つをコードする核酸配列が、本技術分野において公知の
手法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されうる。かような手法および関連
するサブクローニングの手法は当業者の知見の範囲内のものである。
ましくは1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有することで、真核細胞の培養でのジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌でのアンピシリン
耐性といった、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供することがで
きる。
ロモーター、U6プロモーターまたは7SKプロモーター)を含むことでRNAの発現を
促進することができる。これらのヒトプロモーターによれば、哺乳動物細胞におけるRN
Aの発現およびその後のプラスミドのトランスフェクションが可能となる。あるいは、イ
ンビトロでの転写のためにT7プロモーターが用いられてもよく、RNAはインビトロで
転写されて精製されてもよい。
配列は、適当な宿主を形質転換し、これにトランスフェクションされ、または感染して、
当該宿主に上述したRNAまたはタンパク質を発現させることができる。適当な発現宿主
の例としては、細菌細胞(例えば、大腸菌、放線菌、ネズミチフス菌)、真菌細胞(酵母
)、昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ、ヨトウガ(Sf9))、動物細胞(例えば、
CHO、COSおよびHEK293)、アデノウイルス、および植物細胞が挙げられる。
適当な宿主の選択は、当業者の知見の範囲内のものである。ある実施形態において、本発
明は、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質の1つをコードするヌクレオチド配列を含
む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、これにトランスフェクションし、これに
感染させることによる上述したRNAまたはタンパク質の製造方法を提供する。宿主細胞
は次いで、適当な条件下で培養され、これによってRNAまたはタンパク質の発現が可能
となる。
手法が用いられうる。例としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリ
ブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソ
ーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、ウイルスベ
クター(エピソーマルおよび組み込み型の双方)、並びに、クローニングされたゲノムD
NA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の
任意の周知の方法が挙げられる。
本発明の他の形態は、細胞、胚、ヒトまたは非ヒト動物における標的DNA配列(例え
ば、染色体の配列)または標的RNA配列の修飾方法に関するものである。当該方法は、
上述した(i)配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチド、(ii
)RNAスキャホールドまたはこれをコードするDNAポリヌクレオチド、および(ii
i)非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチ
ドを細胞または胚に導入することを含む。RNAスキャホールドは、配列標的化タンパク
質および融合タンパク質を標的部位における標的ポリヌクレオチドへとガイドし、融合タ
ンパク質のエフェクタードメインがその配列を修飾する。本明細書に記載のように、ca
s9タンパク質などの配列標的化タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を失うように修
飾されている。
本発明のシステムは、図1Bに示すように、標的部位の上流(左)または下流(右)のい
ずれかの単一の部位に標的化される。他の実施形態では、適切な触媒作用のためにエフェ
クタータンパク質は二量化を必要とする。この目的に向けて、当該システムは多量化され
て標的部位の上流および下流の標的配列を同時に標的化され、これによってエフェクター
タンパク質の二量化を可能とすることができる(図1C、左)。あるいは、単一部位へエ
フェクタータンパク質が動員されるだけでも、隣接するエフェクタータンパク質に対する
その親和性を増大させて二量化を促進するのに十分であることもある(図1C、右)。さ
らに他のある実施形態では、図1Dに示すように、三量体のエフェクター酵素が標的部位
に動員されて配置されうる。これは、二重の標的化(図1D、左)または単一の標的化(
図1D、右)によって達成されうる。本発明に開示されているシステムは、RNAの標的
を編集するのに用いられてもよい(例えば、レトロウイルスの不活性化)。図1Eを参照
のこと。この場合、エフェクタータンパク質が機能性オリゴマーの集合体を必要とするの
であれば、図1Cおよび図1Dの右パネルのように、RNA分子への単一の標的化によっ
てオリゴマー化が促進されうる。
こと以外は配列の制限はない。PAM配列の例としては、これらに限定されないが、NG
G、NGGNGおよびNNAGAAW(ここで、Nは任意のヌクレオチドと定義され、W
はAまたはTと定義される)が挙げられる。PAM配列の他の例は上述したとおりであり
、当業者であれば所定のCRISPRタンパク質とともに用いるための他のPAM配列を
同定することができるであろう。標的部位は、遺伝子のコード領域中、遺伝子のイントロ
ン中、遺伝子間の制御領域中などに存在しうる。当該遺伝子は、タンパク質をコードする
遺伝子であってもよいし、RNAをコードする遺伝子であってもよい。
でありうる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオ
チドでありうる。また、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物(例えば、タンパク質)を
コードする配列であってもよいし、非コード配列(例えば、制御ポリヌクレオチド)であ
ってもよい。
は胚の内部へ導入されうる。一実施形態において、各タンパク質は少なくとも1つの細胞
透過ドメインを含むことができ、これによってタンパク質の細胞への取り込みが促進され
る。他の実施形態において、タンパク質またはタンパク質類をコードするmRNA分子ま
たはDNA分子が細胞または胚の内部へ導入されてもよい。タンパク質をコードするDN
A配列は一般に、所望の細胞または胚の内部で機能するプロモーター配列に作動的に連結
されている。DNA配列は線状であってもよいし、DNA配列はベクターの一部であって
もよい。さらに他の実施形態において、タンパク質は、当該タンパク質および上述したR
NAスキャホールドを含むRNA-タンパク質複合体として細胞または胚の内部へ導入さ
れてもよい。
の構成要素をコードする配列または配列群を含みうる。タンパク質およびRNAスキャホ
ールドをコードするDNA配列は一般に、細胞または胚の内部において、当該タンパク質
およびRNAスキャホールドのそれぞれの発現を可能とする適当なプロモーター制御配列
に作動的に連結されている。当該タンパク質およびRNAスキャホールドをコードするD
NA配列は、追加の発現をコントロールする配列、制御配列、および/またはプロセシン
グ配列をさらに含みうる。当該タンパク質およびガイドRNAをコードするDNA配列は
、線状であってもよいし、ベクターの一部であってもよい。
RNAをコードする配列は真核細胞におけるガイドRNAの発現のためのプロモーター制
御配列に作動的に連結されていてもよい。例えば、RNAをコードする配列は、RNAポ
リメラーゼIII(Pol III)によって認識されるプロモーター配列に作動的に連
結されていてもよい。適切なPol IIIプロモーターの例としては、これらに限定さ
れないが、哺乳動物のU6またはH1プロモーターが挙げられる。例示的な実施形態にお
いて、RNAをコードする配列は、マウスまたはヒトのU6プロモーターに連結される。
他の例示的な実施形態において、RNAをコードする配列は、マウスまたはヒトのH1プ
ロモーターに連結される。
る。ある実施形態では、DNA配列はベクターの一部であってもよい。適切なベクターと
しては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工/ミニ染色体、トランスポ
ゾン、およびウイルスベクターが挙げられる。例示的な実施形態において、タンパク質お
よび/またはRNAをコードするDNAは、プラスミドベクター中に存在する。適切なプ
ラスミドベクターの非制限テイナ例としては、pUC、pBR322、pET、pBlu
escriptおよびこれらの変異体が挙げられる。ベクターは、追加の発現制御配列(
例えば、エンハンサー配列、Kozak配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など)
、選択可能なマーカー配列(例えば、抗生物質耐性遺伝子)、複製の起点などを含みうる
。
RNA構成要素(またはこれをコードするDNA)は、種々の手段によって細胞または胚
中に導入されうる。典型的に、胚は所望の種の単細胞段階の受精胚である。ある実施形態
において、細胞または胚はトランスフェクションされている。トランスフェクションの適
切な方法としては、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション、ヌクレオフェクシ
ョン(またはエレクトロポレーション)、カチオン性ポリマートランスフェクション(例
えば、DEAE-デキストランまたはポリエチレンイミン)、ウイルストランスダクショ
ン、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトラ
ンスフェクション、、カチオン性リポソームトランスフェクション、イムノリポソームト
ランスフェクション、非リポソーム性脂質トランスフェクション、デンドリマートランス
フェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクシ
ョン、遺伝子銃による送達、インパレフェクション、ソノポレーション、光学トランスフ
ェクション、および専売薬剤で促進される核酸の取り込みが挙げられる。トランスフェク
ションの方法は、本技術分野において周知である(例えば、“Current Prot
ocols in Molecular Biology” Ausubel et a
l.,John Wiley&Sons,New York,2003または“Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual” Samb
rook&Russell,Cold Spring Harbor Press,Co
ld Spring Harbor,N.Y.,3rd edition, 2001を
参照)。他の実施形態において、分子はマイクロインジェクションによって細胞または胚
中に導入される。例えば、分子は単細胞の胚の前核中にインジェクションされうる。
RNA構成要素(またはこれをコードするDNA)は、細胞または胚中に同時または逐次
的に導入されうる。RNA(または当該RNAをコードするDNA)に対するタンパク質
(またはこれをコードする核酸)の比率は通常、これらがRNA-タンパク質複合体を形
成できるようにほぼ化学量論的なものである。同様に、2つの異なるタンパク質(または
これをコードする核酸)の比率もまた、ほぼ化学量論的なものである。一実施形態におい
て、タンパク質構成要素およびRNA構成要素(またはこれをコードするDNA配列)は
、同一の核酸またはベクター内で一緒に送達される。
し、エフェクタードメインが標的配列を修飾することができるように、細胞または胚を適
切な条件下で維持することをさらに含む。
適切な細胞培養条件は本技術分野において周知であり、例えば、“Current Pr
otocols in Molecular Biology” Ausubel et
al., John Wiley&Sons,New York,2003または“M
olecular Cloning:A Laboratory Manual” Sa
mbrook&Russell,Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor,N.Y.,3rd edition,2001
)、Santiago et al.(2008) PNAS 105:5809-58
14;Moehle et al.(2007)PNAS 104:3055-3060
;Urnov et al.(2005) Nature 435:646-651;お
よびLombardo et al.(2007) Nat. Biotechnolo
gy 25:1298-1306に記載されている。当業者であれば、細胞培養の方法が
本技術分野において公知であって細胞のタイプによって変動しうるものであることを理解
している。すべての場合において、特定の細胞のタイプに最適な技術を決定するのに通常
の最適化がなされうる。
、かつ適切な(必要に応じてタンパク質およびRNAスキャホールドの発現を可能とする
のに必要なO2/CO2比の)培地中で培養される。適切な培地の非制限的な例としては
、M2、M16、KSOM、BMOCおよびHTF培地が挙げられる。当業者であれば、
培養条件が胚の種によって変動しうるものであることを理解している。すべての場合にお
いて、特定の胚の種に最適な技術を決定するのに通常の最適化がなされうる。場合によっ
ては、インビトロで培養された胚から細胞株が得られてもよい(例えば、胚性幹細胞株)
。
。一般的に言えば、雌の宿主は上記胚と同一または類似の種から選ばれる。好ましくは、
当該雌の宿主は偽妊娠のものである。偽妊娠の雌の宿主を作製する手法は本技術分野にお
いて公知である。さらに、胚を雌の宿主中に移す手法も公知である。胚をインビボで培養
することで当該胚を発育させ、当該胚に由来する動物を出産させることが可能である。こ
のような動物は、体のすべての細胞において修飾された染色体配列を含んでいる。
胞、ヒトではない哺乳動物の細胞、哺乳動物ではない脊椎動物の細胞、無脊椎動物の細胞
、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞の真核有機体でありうる。種々の胚もま
た、この方法において適切に用いられる。例えば、当該胚は、1細胞、2細胞または4細
胞の、ヒトのまたは非ヒト哺乳動物の胚でありうる。単細胞の胚を含む例示的な哺乳動物
の胚としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサ
ギ、ネコ科動物、イヌ科動物、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよび霊長類の胚が挙げられる
。さらに他の実施形態において、当該細胞は幹細胞である。適切な幹細胞としては、これ
らに限定されないが、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児の幹細胞、成人の幹細胞、多能性
幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡能性幹細胞、単分化能幹細胞などが挙げ
られる。例示的な実施形態においては、当該細胞が哺乳動物の細胞であるか、または当該
胚が哺乳動物の胚である。
本明細書に開示のシステムおよび方法は、非常に多くのタイプの細胞における標的ポリ
ヌクレオチドを修飾し、編集する(例えば、不活性化および活性化する)といった広範な
有用性を有するものである。このように、本システムおよび方法は、例えば研究および治
療において広範な用途のスペクトルを有している。
している。患者において疾患を引き起こす変異は、自身の親からの継承により獲得される
か、または環境要因によって引き起こされる。これらの疾患としては、これに限定されな
いが、以下のようなカテゴリーが挙げられる。第一に、いくつかの遺伝子障害は生殖系列
細胞の変異によって引き起こされる。その一例は嚢胞性線維症であり、これは親から受け
継がれるCFTR遺伝子における変異によって引き起こされる。第二に、慢性のウイルス
感染性疾患などのいくつかの疾患は、外因性の環境要因によって引き起こされ、遺伝子の
変化を生じる。その一例はAIDSであり、これはヒトHIVウイルスのゲノムが感染し
たT細胞のゲノム中に挿入されることによって引き起こされる。第三に、いくつかの神経
変性疾患が遺伝子の変化に関係している。その一例はハンチントン病であり、これは罹患
した患者のハンチンチン遺伝子においてCAGの3つのヌクレオチドが伸長することによ
って引き起こされる。最後に、がんはがん細胞中に蓄積した種々の体細胞の変異によって
引き起こされる。したがって、疾患の原因となる遺伝子変異を修正するか、またはその配
列を機能的に修正すれば、これらの疾患を治療するための魅力的な治療機会が提供される
。
伝子編集を成功裡に達成するには、(i)いかにして配列特異的な認識を達成するか(「
配列認識モジュール」);(ii)いかにして根本的な変異を修正するか(「修正モジュ
ール」);および(iii)いかにして「修正モジュール」を「配列認識モジュール」と
一緒になるように連結して配列特異的な修正を達成するか、の3つの重要な因子を考慮す
る必要がある。これらの個々の課題を達成する方法は数多く存在する。しかしながら、現
状のプラットフォームまたは技術はいずれも、最適かつ実用的な体細胞の遺伝子編集を達
成することはできていない。より詳細に、現状の遺伝子特異的な編集技術は、そのほとん
どがヌクレアーゼ誘導性のDNA DSBとそれによって誘導される相同組み換えを利用
したものであるが、ほとんどの体細胞においてその活性は低いかまたは存在しない。よっ
て、ほとんどの疾患で、体細胞組織における病理学的な遺伝子変異の治療的な修正に対す
るこれらの技術の用途は限定されている。
活性に依拠することなく、遺伝子またはRNA転写物をDNA配列特異的に編集すること
が可能である。当該システムおよび方法はDSBを生成せず、またDSB媒介性の相同組
み換えに依拠することもない。さらに、本システムのこのような設計はモジュラー式であ
ることから、所望の任意のDNA配列またはRNA配列を標的化するための極めてフレキ
シブルで簡便な方法が提供される。すなわち、このアプローチによればDNAまたはRN
Aを編集する酵素を、事実上、幹細胞などの体細胞中の任意のDNA配列またはRNA配
列へとガイドすることができる。標的となるDNA配列またはRNA配列の正確な編集に
より、当該酵素は遺伝子障害における変異した遺伝子を修正し、感染した細胞においては
ウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因となるタンパク質の発
現を抑制し、あるいはがんにおいてはがん原性のタンパク質をサイレンシングすることが
できる。したがって、本発明において開示される当該システムおよび方法は、上述した遺
伝子障害、慢性の感染性疾患、神経変性疾患およびがんなどの疾患における根本的な遺伝
子の変化を修正するのに用いられうる。
6000超の遺伝子疾患が既知の遺伝子変異によって引き起こされていると推定されて
いる。病理学的な組織/器官における疾患の原因となる根本的な変異を修正すれば、当該
疾患の緩和または治癒がもたらされうる。例えば、嚢胞性線維症は米国において3000
人に1人が罹患している。この疾患はCFTR遺伝子の変異が遺伝することによって引き
起こされており、70%の患者が同一の変異(508位のフェニルアラニンの欠損をもた
らす3ヌクレオチドの欠損(ΔPhe508と称される))を有している。ΔPhe50
8はCFTRの誤配置および分解をもたらす。本発明に開示された本システムおよび方法
は、罹患した組織(肺)においてVal509残基(GTT)をPhe509(TTT)
に変換するのに用いられ、これによってΔPhe508変異を機能的に修正することがで
きる。
本発明に開示された本システムおよび方法はまた、ヒトの細胞/組織中に導入されたウ
イルスゲノムにおける任意の遺伝子を特異的に不活性化するのに用いられうる。例えば、
本発明に開示された本システムおよび方法によれば、ウイルスにとって必須の遺伝子の翻
訳を早期に終止させるためのストップコドンを作製することができ、これによって慢性か
つ消耗性の感染性疾患を改善または治癒することができる。例えば、AIDSの現在の治
療法はウイルス量を低減させることはできるものの、潜伏しているHIVを陽性T細胞か
ら完全に除去することはできない。本明細書に開示の本システムおよび方法は、1つ以上
のストップコドンを導入することにより、ヒトT細胞において、統合されたHIVゲノム
中の1つ以上のHIVの必須の遺伝子の発現を永久に不活性化するのに用いられうる。他
の例は、B型肝炎ウイルスである。本明細書に開示の本システムおよび方法は、ヒトゲノ
ム中に導入された1つ以上のHBVの必須の遺伝子を特異的に不活性化し、HBVのライ
フサイクルをサイレンシングするのに用いられうる。
神経変性疾患の中には、機能獲得型変異によって引き起こされるものがある。例えば、
SOD1G93Aは筋萎縮性側索硬化症(ALS)の進展をもたらす。本発明に開示され
た本システムおよび方法は、ストップコドンを導入するか、またはスプライシング部位を
変化させることにより、変異を修正し、または変異型タンパク質の発現を抑制するのに用
いられうる。
がんの進展には多くの遺伝子(がん抑制遺伝子、がん遺伝子、およびDNA修復遺伝子
など)が関与している。これらの遺伝子が変異すると種々のがんを引き起こすことがよく
ある。本発明に開示された本システムおよび方法を用いることで、これらの変異を特異的
に標的化し、修正することが可能である。その結果、触媒部位またはスプライシング部位
に点変異が導入されることで、がんの原因となるタンパク質が機能的に無害化され、ある
いはその発現が抑制されうる。
ある実施形態においては、本発明に開示される本システムおよび方法を用いて、幹細胞
または前駆細胞が遺伝的に修飾されうる。適切な細胞としては、例えば、幹細胞(成人の
幹細胞、胚性幹細胞、iPS細胞など)および前駆細胞(例えば、心臓前駆細胞、神経前
駆細胞など)が挙げられる。適切な細胞としては、例えば、齧歯動物の幹細胞、齧歯動物
の前駆細胞、ヒトの幹細胞、ヒトの前駆細胞などの哺乳動物の幹細胞および前駆細胞が挙
げられる。適切な宿主細胞としては、単離された宿主細胞などのインビトロの宿主細胞が
挙げられる。
するのに用いられ、根本的な遺伝的欠陥を修正することができる。エクスビボでの修正の
後、組織は患者に戻されてもよい。また、本技術は遺伝子疾患を修正するための細胞ベー
スの治療法に広範に用いられうる。
上述した本システムおよび方法は、1つ以上の所望の遺伝子修飾を有する非ヒトトラン
スジェニック動物またはトランスジェニック植物を作製するのに用いられうる。ある実施
形態において、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてホモ接合性であ
る。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてヘテロ
接合性である。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は脊椎動物(例えば、
魚類(ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚など)、両生類(カエル、サンショウウオ
など)、鳥類(ニワトリ、七面鳥など)、爬虫類(ヘビ、トカゲなど)、哺乳類(有蹄動
物(ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど);ウサギ目の動物(ウサギなど);齧歯動物(ラッ
ト、マウスなど);非ヒト霊長類など))である。
る疾患を治療するのにも用いられうる。あるいは、本発明は、研究、薬剤の開発および標
的の評価のための特定の遺伝子変異を有するノックイン動物疾患モデルを作製するのに用
いられうる。上述のシステムおよび方法はまた、家畜および穀物の品質を改良および改善
する目的で、種々の有機体のES細胞または胚に点変異を導入するのにも用いられうる。
法としては、ウイルス感染(二本鎖DNAウイルスなど)、トランスフェクション、接合
、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシ
ウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバク
テリウム媒介性の形質転換などが挙げられる。これらの方法の選択は通常、形質転換され
る細胞のタイプや形質転換を行う状況(すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはイン
ビボ)に依存する。
本発明はさらに、CRISPR:Casによりガイドされる標的への結合または修正の
反応を含む上述した方法を実施するための試薬を含有するキットをも提供する。この目的
に向けて、本明細書に記載の方法のための1つ以上の反応成分(例えば、RNA、Cas
タンパク質、融合エフェクタータンパク質および関連する核酸)が使用のためのキットの
形態で供給されうる。一実施形態において、当該キットはCRISPRタンパク質または
Casタンパク質をコードする核酸、エフェクタータンパク質、上述したRNAスキャホ
ールドの1つ以上、上述したRNA分子のセットを含む。他の実施形態において、当該キ
ットは1つ以上の他の反応成分を含んでもよい。このようなキットにおいては、1つ以上
の反応成分の適量が、1つ以上の容器中で提供され、または基板上に保持される。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための1つ以上の試薬、RNAもしくはタン
パク質の発現を検出し、または標的核酸の状態を確認するための1つ以上の試薬(例えば
、プローブまたはPCRプライマー)、および反応のための(1Xまたは濃縮形態の)緩
衝液または培地が挙げられる。当該キットはまた、以下の成分の1つ以上をも含みうる:
支持体、終止試薬、修飾試薬または消化試薬、浸透圧調節物質および検出用装置。
、RNA、プローブおよび/またはプライマー)は、水溶液中に懸濁されるか、またはフ
リーズドライまたは凍結乾燥された粉末、ペレットまたはビーズでありうる。後者の場合
、これらの成分は再構成されると、アッセイに用いるための成分の完全な混合物を生じる
。本発明のキットは任意の適切な温度で提供されうる。例えば、液体中のタンパク質成分
またはその複合体を含有するキットの貯蔵のため、キットを0℃未満(好ましくは-20
℃以下)で、あるいは凍結状態で提供して維持することが好ましい。
回のアッセイに十分な量で含有することができる。ある用途においては、1つ以上の反応
成分を予め測定された単回使用量で個々のチューブまたは同様の容器中で、典型的には使
い捨てのものとして提供してもよい。このように準備しておくと、標的核酸または当該標
的核酸を含有するサンプルもしくは細胞を直接個々のチューブに添加することで、RNA
によりガイドされる反応が実施されうる。キット中に供給される成分の量は、任意の適切
な量であればよく、当該製品が向けられる対象となる市場に依存しうる。これらの成分が
供給される容器は、供給された形態を保持できる従来の任意の容器であればよく、例えば
、遠心チューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、瓶または内蔵された検査デバイ
ス(流体デバイス、カートリッジ、ラテラルフローもしくは他の類似のデバイス)であり
うる。
のようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料としては、反応成分または検出
プローブを種々の任意の配置で(例えば、バイアル中で、マイクロタイタープレートのウ
ェル中で、マイクロアレイ中で)保持する固体のマトリックス(例えば、ガラス、プラス
チック、紙、箔、マイクロパーティクルなど)が挙げられる。当該キットは、上記の成分
の使用のために有形の形式で記録された指示書をさらに含んでもよい。
核酸またはポリヌクレオチドとは、DNA分子(例えば、以下に限定されないが、cD
NAもしくはゲノムDNA)またはRNA分子(例えば、以下に限定されないが、mRN
A)を意味し、DNA類似体またはRNA類似体を含む。DNA類似体またはRNA類似
体は、ヌクレオチド類似体から合成されうる。DNA分子またはRNA分子は、修飾され
た塩基、修飾された主鎖、RNA中のデオキシリボヌクレオチドなどの天然には存在しな
い部分を含んでもよい。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうる。
分子またはポリペプチドが、自然界においては自身が会合しているかまたは一緒になって
いることが観察される少なくとも1つの他の成分を実質的に含有していないことを意味す
る。
質に結合して当該CRISPRタンパク質を標的DNA内の特定の位置に標的化すること
ができるRNA分子(またはRNA分子の包括的な群)を意味する。ガイドRNAは、D
NA標的化ガイドセグメントおよびタンパク質結合セグメントの2つのセグメントを含み
うる。DNA標的化セグメントは、標的配列に対して相補的な(または少なくともストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズしうる)ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合
セグメントは、Cas9またはCas9関連ポリペプチドなどのCRISPRタンパク質
と相互作用する。これらの2つのセグメントは同一のRNA分子中に位置していてもよい
し、2つ以上の異なるRNA分子中に存在していてもよい。これらの2つのセグメントが
別のRNA分子中に存在する場合、DNA標的化ガイドセグメントを含む分子はCRIS
PR RNA(crRNA)と称され、タンパク質結合セグメントを含む分子はトランス
活性化RNA(tracrRNA)と称されることがある。
列を含有する核酸を意味する。標的核酸配列は一本鎖であってもよいし二本鎖であっても
よく、二本鎖DNAであることがよくある。「標的核酸配列」、「標的配列」または「標
的領域」は、本明細書で用いられる場合、CRISPRシステムを用いて結合させ、また
はこれを用いて修飾しようとする特定の配列またはその相補体を意味する。標的配列は、
細胞のゲノム内で、インビトロまたはインビボの核酸内に存在するものであってよく、一
本鎖核酸または二本鎖核酸のいかなる形態であってもよい。
標的核酸の鎖を意味する。すなわち、crRNAおよびガイドRNAとハイブリダイズす
る標的核酸の鎖が「標的核酸の鎖」と称される。標的核酸の他方の鎖はガイド配列に対し
て相補的ではないが、これは「非相補的な鎖」と称される。二本鎖の標的核酸(例えば、
DNA)の場合、それぞれの鎖はcrRNAおよびガイドRNAを設計するための「標的
核酸の鎖」となることができ、適当なPAM部位が存在する限り本発明の方法を実施する
のに用いられうる。
)または当該第1の成分からの情報が、別の第2の成分(例えば、当該第1の分子とは異
なる第2の分子)を単離し、抽出し、または作製するのに用いられるプロセスを意味する
。例えば、哺乳動物のコドンに最適化されたCas9ポリヌクレオチドは、野生型Cas
9タンパク質のアミノ酸配列に由来する。また、Cas9の単一変異ニッカーゼ(nCa
s9D10AなどのnCas9)およびCas9の二重変異のヌル-ニッカーゼ(dCa
s9 D10A H840AなどのnCas9)などの哺乳動物のコドンに最適化された
Cas9変異ポリヌクレオチドは、哺乳動物のコドンに最適化された野生型のCas9タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドに由来する。
技術分野の用語であり、変異体またはバリアントの形態から区別されて天然に存在してい
る有機体、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。
分子であり、これは「親の」分子と称される)と関連した第1の成分(例えば、第1の分
子)を意味する。バリアント分子は、親の分子に由来するもの、これから単離されるもの
、これに基づくもの、またはこれに相同のものでありうる。例えば、Cas9の単一変異
ニッカーゼおよびCas9の二重変異のヌル-ニッカーゼなどの哺乳動物のコドンに最適
化されたCas9(hspCas9)の変異体の形態は、哺乳動物のコドンに最適化され
た野生型のCas9(hspCas9)のバリアントである。バリアントとの語は、ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれを説明するのにも用いられうる。
ヌクレオチド配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親の分子との間で100
%未満のヌクレオチド配列の同一性を有していてもよい。例えば、遺伝子のヌクレオチド
配列のバリアントは、もとのヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列において少
なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%またはそれ
より高い同一性を有する第2のヌクレオチド配列でありうる。
合ヌクレオチド配列をさらに含むポリヌクレオチドをも包含する。ポリヌクレオチドのバ
リアントはまた、親のポリヌクレオチドの部分またはサブ配列であるポリヌクレオチドを
も包含する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドの独特なサブ配列(例えば、標
準的な配列の比較・アラインメント技術により決定されるもの)もまた、本発明に包含さ
れる。
マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変を含むヌクレオチド配列を包含する
。例えば、マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、(i)対応す
るポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない、(ii)ポリヌクレオチドのタンパク質
をコードするオープンリーディングフレームの外側で生じる、(iii)対応するアミノ
酸配列に影響しうる欠失または挿入を生じるがポリペプチドの生物学的活性にはほとんど
またはまったく影響しない、(iv)ヌクレオチドの変化が、アミノ酸の化学的に類似の
アミノ酸による置換を生じる、ヌクレオチド配列に対する改変が挙げられる。ポリヌクレ
オチドがタンパク質をコードしない場合(例えば、tRNAまたはcrRNAまたはtr
acrRNA)、当該ポリヌクレオチドのバリアントは当該ポリヌクレオチドの機能の喪
失を生じないヌクレオチドの変化を含みうる。他の形態において、機能的に同一なヌクレ
オチド配列を生じる本明細書に開示のヌクレオチド配列の保存的なバリアントは本発明に
包含される。当業者であれば、本明細書に開示のヌクレオチド配列の多くのバリアントが
本発明に包含されることを理解している。
で完全なアミノ酸配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親のタンパク質との
間で100%未満のアミノ酸の同一性を有していてもよい。例えば、アミノ酸配列のバリ
アントは、もとのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において少なくとも50%、6
0%、70%、80%、90%、95%、98%、99%またはそれより高い同一性を有
する第2のヌクレオチド配列でありうる。
酸配列をさらに含むポリペプチドをも包含する。ポリペプチドのバリアントはまた、親の
ポリペプチドの部分またはサブ配列であるポリペプチドをも包含する。例えば、本明細書
に記載のポリペプチドの独特なサブ配列(例えば、標準的な配列の比較・アラインメント
技術により決定されるもの)もまた、本発明に包含される。
な、取るに足らない、または重要でない改変を含むポリペプチドを包含する。例えば、マ
イナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、非機能性ペプチド配列の付
加のような、ポリペプチドの生物学的活性に影響をほとんどまたはまったく与えず機能的
に同等のポリペプチドをもたらすアミノ酸の改変(置換、欠失および挿入など)が挙げら
れる。他の形態において、本発明に係るバリアントのポリペプチドは、親の分子(例えば
、ヌクレアーゼ活性が修飾され、または失われたCas9ポリペプチドの変異体)の生物
学的活性を変化させる。当業者であれば、本明細書に開示のポリペプチドの多くのバリア
ントが本発明に包含されることを理解している。
ずかな百分率(例えば、典型的には約10%未満、約5%未満、4%未満、2%未満また
は1%未満)のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を変化させ、これを付加し、または欠
失させるバリアント分子を含みうる。
存的置換」との語は、(i)三量体コドンの暗号の縮重によりアミノ酸配列に対応する変
化を生じないか、または(ii)もとの親のアミノ酸が化学的に類似の構造を有するアミ
ノ酸で置換される、ヌクレオチド配列の変化を意味する。機能的に類似のアミノ酸を提供
する保存的置換の一覧表は本技術分野において周知であり、そこでは1つのアミノ酸残基
が類似の化学的特性(例えば、芳香族の側鎖または正に荷電した側鎖)を有する他のアミ
ノ酸残基で置換されており、よって得られるポリペプチド分子の機能的な特性には実質的
な変化は生じない。
る群の内部での置換は「保存的な」アミノ酸置換である。異なる機能的特性を考慮する場
合、これらの天然アミノ酸は異なるグルーピングで配置されうるため、以下に示すグルー
ピングは厳密なものではない。非極性および/または脂肪族の側鎖を有するアミノ酸とし
ては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンが挙げられ
る。極性の荷電していない側鎖を有するアミノ酸としては、セリン、スレオニン、システ
イン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。芳香族の側鎖を有する
アミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。正
に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げ
られる。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン
酸が挙げられる。
タンパク質(すなわち、配列番号:1)のような野生型のCas9タンパク質のタンパク
質またはポリペプチド誘導体を意味し、例えば、1つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、
融合タンパク質またはこれらの組み合わせが挙げられる。これはCas9タンパク質のR
NA標的化活性を実質的に保持している。当該タンパク質またはポリペプチドは、配列番
号:1の断片を含んでもよいし、これからなっていてもよいし、実質的にこれからなって
いてもよい。一般に、この変異体/バリアントは、配列番号:1に対して少なくとも50
%(例えば、50%~100%の任意の値)の同一性を有する。この変異体/バリアント
は、RNA分子に結合し、当該RNA分子を介して特定のDNA配列に標的化されること
ができ、ヌクレアーゼ活性をさらに有していてもよい。これらのドメインの例としては、
RuvC様モチーフ(配列番号:1の第7~22アミノ酸、第759~766アミノ酸お
よび第982~989アミノ酸)およびHNHモチーフ(第837~863アミノ酸)が
挙げられる。Gasiunas et al.,Proc Natl Acad Sci
USA.2012 September 25;109(39):E2579-E25
86およびWO2013176772を参照のこと。
、核酸が他の核酸配列と水素結合を形成する能力を意味する。相補性の百分率は、核酸分
子中で第2の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン-クリック塩基対形成)を形成しう
る残基の百分率を示す(例えば、10個のうち5、6、7、8、9、および10個は、5
0%、60%、70%、80%、90%、および100%の相補性である)。「完全に相
補的」とは、核酸配列の連続したすべての残基が第2の核酸配列における同数の連続した
残基と水素結合するであろうことを意味する。本明細書において用いられる場合、「実質
的に相補的」とは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50またはそれ
よりも多いヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも60%、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%である相補
性の程度を意味するか、または2つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
することを意味する。
トな条件」とは、その条件下で標的配列に対して相補性を有する核酸が当該標的配列と優
先的にハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を意味する
。ストリンジェントな条件は通常、配列依存的であり、種々の要因によって変動する。一
般に、配列が長くなるほど、当該配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度
は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen(1993),
Laboratory Techniques In Biochemistry An
d Molecular Biology-Hybridization With N
ucleic Acid Probes Part I,Second Chapter
“Overview of principles of hybridizatio
n and the strategy of nucleic acid probe
assay”,Elsevier,N.Y.に詳細に記載されている。
ゼーション条件下において、完全にまたは部分的に相補的な核酸の鎖が一体化して、これ
を構成する二本の鎖が水素結合により合わさった二本鎖の構造または領域を形成するプロ
セスを意味する。水素結合は通常、アデニンとチミンもしくはウラシルとの間(AとTま
たはU)、またはシトシンとグアニンとの間(CとG)で形成されるが、他の塩基対がけ
いせいされてもよい(例えば、e.g.,Adams et al.,The Bioc
hemistry of the Nucleic Acids, 11th ed.,
1992)。
NAの鋳型から(mRNAまたは他のRNA転写物へと)転写されるプロセス、および/
または、転写されたmRNAが引き続きペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻
訳されるプロセスを意味する。転写物およびコードされたポリペプチドは、総称して「遺
伝子産物」と称されうる。ポリヌクレオチドがゲノムDNA由来のものである場合、発現
には真核細胞中でのmRNAのスプライシングも含まれうる。
区別せずに用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体を意味する。この重合体は線状であ
っても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、間に非アミノ酸を含んでい
てもよい。これらの語はまた、修飾されたアミノ酸の重合体、例えば、ジスルフィド結合
の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、PEG化、または、ラベル
化成分との共役などの他の任意の改変を施されたものをも包含する。本明細書において用
いられる場合、「アミノ酸」との語は、グリシンおよびD体またはL体の光学異性体、並
びにアミノ酸類似体およびペプチド類似体などの、天然および/または非天然もしくは合
成のアミノ酸を含む。
列を一緒に合わせることによって作製されたタンパク質を意味する。本発明に包含される
融合ポリペプチドとしては、第1のポリペプチド(例えば、RNA結合ドメイン)をコー
ドする核酸配列を、第2のポリペプチド(例えば、エフェクタードメイン)をコードする
核酸配列と合わせて単一のオープンリーディングフレームを形成したキメラ状の遺伝子構
築物の翻訳産物が挙げられる。言い換えれば、「融合ポリペプチド」または「融合タンパ
ク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して合わさった2つ以
上のタンパク質の組み換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、2つのドメインの
間にペプチドリンカーを含んでもよい。
または部分を意味する。リンカーは共有結合性のリンカーであってもよいし、非共有結合
性のリンカーであってもよい。共有結合性のリンカーの例としては、共有結合または連結
すべきタンパク質もしくはドメインの1つ以上に共有結合で連結されたリンカー部分が挙
げられる。このリンカーはまた、非共有結合(例えば、白金原子などの金属中心を介した
有機金属結合)であってもよい。共有結合で連結するには、炭酸誘導体などのアミド基、
エーテル、有機エステルまたは無機エステルなどのエステル、アミノ、ウレタン、ウレア
などの種々の官能性が用いられうる。連結を提供すべく、各ドメインは、酸化、ヒドロキ
シ化、置換、削減などによって修飾されてカップリングのための部位を提供することがで
きる。共役の方法は当業者に周知であり、本発明での使用に包含される。リンカー部位と
しては、以下に限定されないが、化学的なリンカー部位または例えばペプチドリンカー部
位(リンカー配列)が挙げられる。RNA結合ドメインおよびエフェクタードメインの機
能を有意に低下させない修飾が好ましいことは理解されるであろう。
の語は、2つ以上のものがあわさって1つのものを形成していることを意味する。共役体
には、ペプチド-小分子共役体と、ペプチド-タンパク質/ペプチド共役体の双方が包含
される。
し、好ましくは哺乳動物を意味し、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物としては、
以下に限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、運動競技用動物およびペットが挙げ
られる。インビボで得られた、またはインビトロで培養された、生命体の組織、細胞およ
びこれらの子孫もまた包含されうる。ある実施形態において、被験者は無脊椎動物(例え
ば、昆虫または線形動物)であってもよいが、他の実施形態では、被験者は植物または真
菌であってもよい。
軽減する」は区別せずに用いられる。これらの語は、以下に限定されないが、治療上の便
益および/または予防的な便益などの有利な、または所望の結果を得るためのアプローチ
を意味する。治療上の便益とは、治療に供された1つ以上の疾患、症状または兆候におけ
る、治療に関連した改善またはこれに対する効果を意味する。予防的な便益のためには、
特定の疾患、症状または兆候が進展するリスクのある被験者に対して、または疾患の病理
学的な兆候の1つ以上を申告している被験者に対して、組成物が投与されうるが、これら
の疾患、症状または兆候は依然として顕在化していなくてもよい。
場合には、接触させられる成分が同一の混合物中に混合される(例えば、同一の容器また
は溶液中に添加される)任意のプロセスを含むが、必ずしも当該成分が実際に物理的に接
触していなくてもよい。これらの成分は、任意の順序で、任意の組み合わせ(またはサブ
コンビネーション)で接触してよく、得られた混合物から当該成分の1つ以上が、続いて
(場合によっては他の成分の添加の前に)除去される場合も含みうる。例えば、「AをB
およびCと接触させる」とは、以下の場合のいずれかまたはすべてが含まれる:(i)A
をCと混合し、次いでこの混合物にBを添加する;(ii)AおよびBを混合して混合物
とし、この混合物からBを除去し、次いでこの混合物にCを添加する;(iii)BとC
との混合物にAを添加する。標的の核酸または細胞を1つ以上の反応成分(Casタンパ
ク質またはガイドRNAなど)と接触させることとしては、以下の場合のいずれかまたは
すべてが含まれる:(i)標的または細胞を反応混合物の第1の成分と接触させて混合物
とし、次いで当該反応混合物の他の成分を、任意の順序または組み合わせでこの混合物に
添加する;(ii)標的または細胞との混合の前に、上記反応混合物を完全に形成する。
たない、要素の組み合わせを意味する。混合物は異種のものであり、別々の構成要素へと
空間的に分離することはできない。要素の混合物の例としては、同一の水溶液中に溶解し
ている多数の異なる要素や、別々の成分が空間的に区別されないようにして、固体状の支
持体にランダムにまたは特定の秩序をもたずに付着している多数の異なる要素が挙げられ
る。言い換えれば、混合物はアドレス可能ではない。
かにそうでないと言えない限り、ある範囲の上限値および下限値の中間のそれぞれの値も
また、下限値の単位の10分の1の値として具体的に開示されているものとする。明記さ
れた任意の値または明記された範囲の中間の値と当該明記された範囲内に位置する他の任
意の明記された値または中間の値との間のより小さいそれぞれの範囲もまた、本発明の範
囲に包含される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、それぞれ独立して、
当該範囲に含まれても含まれなくてもよく、境界値のいずれかまたは双方がより小さい範
囲に含まれるか、あるいはいずれもより小さい範囲に含まれないそれぞれの範囲もまた、
明記された範囲において具体的に除外された任意の境界値に依存する形で、本発明に包含
される。明記された範囲が境界値の1つまたは双方を含む場合、これらの含まれた境界値
の一方または双方を除外した範囲もまた、本発明に包含される。「約」との語は一般的に
、示された数のプラスまたはマイナス10%を意味する。例えば、「約10%」とは、9
%~11%の範囲を示し、「約20」とは18~22を意味しうる「約」の別の意味は、
四捨五入などの文脈から明らかであり、よって例えば、「約1」は0.5~1.4をも意
味する。
CRCシステム
本実施例では、大腸菌MG1655株をモデルとして用いた。細菌のRNAポリメラー
ゼのサブユニットβ遺伝子(rpoB)における変異は、細胞を抗生物質であるリファン
ピシンに対して耐性にする(Jin,et al.,Journal of Molec
ular Biology 202,45-58,(1988)およびGoldstei
n,et al.,J Antibiot 67,625-630,doi:10.10
38/ja.2014.107(2014))。変異については単離して個別に解析する
ことが可能であり、変異の頻度も算出されうる。AIDは、シチジンデアミナーゼのAP
OBECファミリーに属するB細胞特異的なタンパク質であり、抗体の多様化および親和
性成熟の際の体細胞超変異およびクラススイッチ組み換えに関与している(Odegar
d,et al.,Nat Rev Immunol 6,573-583(2006)
,およびNoia,et al.Annual Review of Biochemi
stry 76,1-22,doi:doi:10.1146/annurev.bio
chem.76.061705.090740(2007))。よって、これらの実験の
セットについては、非ヌクレアーゼエフェクタータンパク質としてAIDを用いて大腸菌
MG1655株が標的化される。
誘導性プロモーター
タンパク質をコードするすべてのコンストラクトは、Tet誘導性プロモーターの制御
下で設計した。誘導剤としては、30nMの濃度のアンヒドロテトラサイクリン(ATc
;シグマ)を用いた。
本システムの主要な特徴は、DSBの生成を伴わずにヌクレオチドの修飾を正確に導入
することにある。この目的に向けて、Cas9のヌクレアーゼ欠損体(すなわち、触媒活
性を失ったCas9(Cas9D10A/H840A、dCas9)およびCas9ニッ
カーゼ(nCas9D10AまたはnCas9H840A)(Jinek,M.et a
l.,Science 337,816-821,doi:10.1126/scien
ce.1225829(2012)))をDNA標的化モジュールとして用いた。Cas
9ニッカーゼは、オフセットダブルDNAニッキングによりオフターゲットのDSBを低
減する目的で用いられてきた(Ran,F.A. et al.,Cell 154,1
380-1389,doi:10.1016/j.cell.2013.08.021(
2013)およびShen,B.et al.,Nat Meth 11,399-40
2,doi:10.1038/nmeth.2857(2014))。また、dCas9
は、ヌクレアーゼ活性から独立した種々の活性をもたらすことを目的として作製されてき
た。Fujita,T.et al.,Biochemical and biophy
sical research communications 439,132-13
6,(2013)、Perez-Pinera,P.et al.Nat Meth 1
0,973-976,doi:10.1038/nmeth.2600(2013)、M
ali,P.et al.Nat Biotechnol 31,833-838,do
i:10.1038 et al./nbt.2675(2013)、Zalatan,
J.G.et al.,Cell 160,339-350,doi:10.1016/
j.cell.2014.11.052(2015)、Qi,L.S. et al.,
Cell 152,1173-1183,doi:10.1016/j.cell.20
13.02.022(2013)、Larson,M. H.et al.,Natur
e protocols 8,2180-2196,doi:10.1038/npro
t.2013.132(2013)、Hilton,I.B. et al.,Nat
Biotech 33,510-517,doi:10.1038/nbt.3199(
2015)、Thakore,P.I.et al.,Nat Meth 12,114
3-1149,doi:10.1038/nmeth.363(2015)、Chen,
B.et al.,Cell 155,1479-1491,doi:10.1016/
j.cell.2013.12.001(2013)およびFu,Y.et al.,N
ature communications 7,doi:10.1038/ncomm
s11707(2016)を参照。したがって、これらのバリアントはほとんど安全であ
ると考えられ、本研究により提供されるシステムを開発するのにふさわしい候補である。
本システムは、RNAスキャホールド媒介性の動員プラットフォームとして作製された
。本研究において用いられたコンストラクトの概要などの概略図を図1Aに示す。Cas
9のバリアントについては独立したコンストラクトとして設計したが、gRNAについて
はCRISPR RNAスキャホールドの3’末端にファージRNAスキャホールドを合
成的に融合したキメラRNA種として作製した。ファージRNAスキャホールドは、非ヌ
クレアーゼエフェクタータンパク質に連結された特定のRNA結合タンパク質を動員する
(図1B)。このRNAスキャホールド動員システムは、ファージMS2およびそれが相
互作用する相手方であるMS2コートタンパク質(MCP)に由来するものである。
標的は、細菌のrpoB遺伝子である。3つのクラスター(合わせてリファンピシン耐
性決定領域(RRDR)と称される)における変異により、細胞は抗生物質であるリファ
ンピシンに対する耐性を獲得する(RifR)(Goldstein,et al.,J
Antibiot 67,625-630,doi:10.1038/ja.2014
.107(2014))。RRDRクラスターI配列における重要なアミノ酸を標的化す
ることを目的として、4つのgRNAのセットを設計した(すなわち、S512、D51
6、H526およびS531;図2A)。Jin,et al.,Journal of
molecular biology 202,45-58,(1988)およびJi
n,D.J.et al.,Methods in Enzymology Vol.V
olume 273 300-319(Academic Press,1996)。
化学的にコンピテントとした大腸菌MG1655細胞を、セクション1に記載のコンス
トラクトをコードするプラスミドの組み合わせからなる全DNA 10~20ngで形質
転換した。形質転換の後、細胞を選別し、適切な抗生物質を含有するLuria-Ber
tani培地中で誘導した。選別/誘導の後、ODを測定し、細胞を順次希釈し、リファ
ンピシン(120μM)を含有するLB寒天プレート上に108~104個の細胞を播種
した。平板効率のためにリファンピシンを含まない選択寒天プレート上に200個の細胞
を播種した。一晩インキュベーションした後、コロニーを計数し、変異の頻度を記録した
。また、コロニーから単離されたrpoB遺伝子をPCRにより増幅し、配列を決定して
変異をマッピングした。
AIDの標的化された動員はCからTへの部位特異的な変換をもたらす
rpoBのRRDR(クラスターI)領域を標的化する4つのgRNAのセットを用い
て、標的部位へとAIDを動員した(図2A)。rpoB_TS-4を用いたCRC標的
化および、程度は低いがrpoB_TS-3を用いたCRC標的化により、リファンピシ
ン培地中でのMG1655細胞の生存画分は増加した(図2B、図2C)。rpoB_T
S-4による処理から得られたクローンの配列解析から、C1592のTへの変異と、こ
れに付随する、RifR細胞をもたらす変異であることが知られているセリン531から
フェニルアラニンへのアミノ酸の変換についての高い特異性が確認された(Peters
en-Mahrt,et al.,Nature 418,99-104(2002),
Xu,M.,et al.,Journal of Bacteriology 187
,2783-2792,doi:10.1128/JB.187.8.2783-279
2.2005(2005)およびZenkin,N.,et al.,Antimicr
obial Agents and Chemotherapy 49,1587-15
90,doi:10.1128/AAC.49.4.1587-1590.2005(2
005))(図2D)。rpoB_TS-3、rpoB_TS-4およびスクランブルの
変異の分布を図2Eにまとめた。rpoB_TS-4処理において観察された変異頻度の
かなりの増加と修飾ヌクレオチドの配置、並びにrpoB_TS-3処理における効率の
低下から、標的であるシトシンは、プロトスペーサーの5’末端により近い、CRISP
R R-ループにより残された対を形成していない鎖上に位置する必要があることが示唆
される(すなわち、変異頻度はTS4>TS3であり、これらはいずれも同一のヌクレオ
チドを標的化し、修飾する;図2A、図2Cおよび図2E)。このことは、AIDが一本
鎖DNA上のシトシン残基を積極的に脱アミノ化するという見解と整合している(Ode
gard,et al.,Nat Rev Immunol 6,573-583(20
06),Noia,et al.,Annual Review of Biochem
istry 76,1-22,doi:doi:10.1146/annurev.bi
ochem.76.061705.090740(2007),Smith,H.C.,
et al.,Seminars in Cell & Developmental
Biology 23,258-268,doi:10.1016/j.semcdb.
2011.10.004(2012)およびRanganathan,V.,et al
.,Nature communications 5,doi:10.1038/nc
omms5516(2014))。標的化モデルの概略図を図2Fに示す。
標的化モジュールをdCas9からnCas9D10Aへ変更するとCからT/Aへの
変換の効率が上昇する
標的化モジュールをdCas9からnCas9D10Aへ変更すると、リファンピシン
プレート上の生存画分の観点でのシステムの効率がコントロールに対して18倍から43
倍へと上昇した。変異の解析により、標的ヌクレオチドに対してAIDCRC処理と同様
の特異性が確認された。この場合、C1592は100%のクローンで修飾され、75%
がCからTへと変異し、25%がCからAへと変異していた(図3B)。
された動員により、部位特異的なCからT/Aへの変換を導入することができる
エフェクタータンパク質としてのAIDに加えて、APOBECファミリーに由来する
他のシチジンデアミナーゼ(すなわち、APOBEC3GおよびAPOBEC1)につい
ても試験を行った(図4A)。APOBEC1は、プロトタイプシステム(AIDCRC
D10A)と比較して、標的化された変異の頻度を増加させた。APOBEC3Gの活性
は、プロトタイプシステムよりも低かった。rpoB_TS-4を標的化コンストラクト
として用い、Apo1CRCD10Aで処理された細胞の変異の解析では、100%がC
1592→Tの変換を示した。また、カ移籍したクローンの25%は二重変異体であり、
アミノ酸の変化を生じないC1590→Tの変換をも示した(図4B)。
に変異の頻度が増加する
タンデムの多量体リクルーティングスキャホールドを付加することで、標的領域上に存
在するエフェクターを潜在的に増加させることができ、これによってシステムの効率を向
上させることができた。この目的に向けて、2つのMS2ループ(2×MS2)を含むよ
うにrpoB_TS-4を改良した。1つのMS2ループ(1×MS2)を有するrpo
B_TS-4とrpoB_TS-4 2×MS2との間で、標的化の効率を比較した(図
5A)。その結果から、リクルーティングループの数を増加させると、RifRの観点で
の変異の効率は実際に向上することが示され、これによって存在するエフェクタータンパ
ク質が増加していることが示唆される。rpoB_TS-4 2×MS2を標的化コンス
トラクトとして用い、AIDCRCD10Aで処理された細胞の変異の解析では、C15
92ヌクレオチドが100%のクローンにおいて修飾され、そのうち62.5%がCから
Tへ変異し、37.5%がCからAへ変異していたことが示された(図5B)。これらの
結果から、リクルーティングモジュールの改良はシステムの標的化の特異性に影響しない
ことが示唆される。
簡便になり、システムのさらなる改善の可能性が高まることがわかる。
変換をもたらした
実験のデザイン:哺乳動物での発現のためのシステムの改良
次いで、哺乳動物での発言のためにシステムの改良を試みた。この目的に向けて、自己
切断可能なP2Aペプチドで隔てられたAID_MCP融合物がその後に連結された、哺
乳動物のコドンに最適化されたnCas9D10Aを用いて、原核細胞のAIDCRCD
10Aシステムを多シストロン性のコンストラクトとして反復した。このコンストラクト
をユビキチンCプロモーターの制御下でクローニングした。それぞれ5’-Gまたは5’
-Aを有する標的について、U6またはH1プロモーターの制御下で、gRNA_2×M
S2カセットをクローニングした(Ranganathan,V.,et al.,Na
ture communications 5,doi:10.1038/ncomms
5516 (2014))。これらの一連の実験で用いられたコンストラクトの概略図を
図6Aに示す。
EGFPを改良して、そのフルオロフォアを破壊する機能喪失型点変異(197A→G
、Y66C)を有するようにし、これによってタンパク質を非蛍光性とした(nfEGF
PY66C)。次いで、この変異体GFPの発現ベクターを哺乳動物の細胞にトランスフ
ェクションし、システムの基材とする。本実験の目的は、上述した機能喪失型点変異を「
修正」することであった。「修正された」遺伝子が転写されて翻訳されると、この修正に
よってタンパク質の機能は回復し、蛍光顕微鏡下で蛍光性の細胞として可視化することが
可能となる。
nfEGFPY66C、AIDCRCD10AおよびgRNAコンストラクトをコード
する標的プラスミドを含むDNAの組み合わせ10μgを用いて、約7×105個の29
3T細胞をトランスフェクションした。比較のために、これら一連の実験では第3世代の
塩基エディターシステム(BE3、Komor,A.C. et al.,Nature
advance online publication,doi:10.1038/
nature17946)を用いた。BE3は異なる動員メカニズム(Cas9とAPO
BEC1との直接的な融合)を用いた少し似たシステムであり、DNA修復に関与する酵
素であるウラシルDNAグリコシラーゼを阻害するペプチドを含む。一晩のインキュベー
ションの後、蛍光顕微鏡下で細胞を解析して、GFPシグナルを観察した。
上述したCRCシステムは、タンパク質の機能を保ったまま、染色体外DNAにおける
標的ヌクレオチドを修飾することができることがわかった。標的のシトシンは鋳型鎖(T
S、-)に位置することから、2つのgRNAについては、標的ヌクレオチド周辺の非鋳
型鎖(NT、+)に結合するように設計した(図6B)。標的のシトシンは、それぞれn
fEGFPY66C_NT-1プロトスペーサーおよびnfEGFPY66C_NT-2
プロトスペーサー内の5位および12位に位置する。nCas9D10A、AID_MC
P、gRNA(nfEGFPY66C_NT-1またはnfEGFPY66C_NT-2
)、および標的コンストラクト(nfEGFPY66C)をコードするDNAを用いて、
293T細胞をトランスフェクションした。nfEGFPY66C_NT-1およびnf
EGFPY66C_NT-2で処理したがスクランブルでは処理していない細胞について
、EGFPシグナルを検出した(図6C)。標的のシトシンの位置により、nfEGFP
Y66C_NT-2の場合と比較して、nfEGFPY66C_NT-1で処理された細
胞ではEGFPシグナルがより強かった。nfEGFPY66C_NT-1は、標的のC
をAIDへよりアクセス可能にしているようである(図6C、中央および右のパネル)。
また、CRCプラットフォームを、動員のためのシチジンデアミナーゼタンパク質のCa
s9タンパク質への直接融合を利用し、効率の改善のためにウラシルDNAグリコシラー
ゼ(UGI)の阻害剤の共発現を必要とする別の遺伝子編集システム(BE3)と比較し
た。そうしたところ、予期せぬことに、エフェクターと配列標的化モジュールとがRNA
スキャホールドを介して連結しているCRCシステムの方が、局所的なUNGの阻害を必
要としなくとも、BE3システムよりもずっと効率的であることが判明した(図6C、図
6Dおよび図7B)。
能な方法で、ヒトの細胞の染色体外DNAにおける特定のシトシン残基を効率的に脱アミ
ノ化することが示される。AIDCRCD10Aによる処理および標的化gRNAとして
nfEGFPY66C_NT-1を用いたBE3による処理からのGFP陽性細胞の計量
により、CRCシステムがBE3よりも優れた変換効率を示すことが示唆される(図6D
)。
クレオチド変換をもたらす
内因性の遺伝子座の標的化:チャイニーズハムスターのHPRT遺伝子
細菌の陰性選択システムから観察された良好な結果に後押しされて、哺乳動物の細胞に
おいても類似のアプローチを採用することとした。ヒポキサンチン-グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ(HPRT)は、プリン代謝に関与する酵素であり、そのコーデ
ィング配列における変異は代謝拮抗物質である6-チオグアニン(6-TGR)に対する
耐性を生じることが知られている(O’Neill,J.P.et al.,Natur
e 269,815-816(1977))。これらの実験は、CRCシステムを用いて
HPRT遺伝子を変異させてその機能を阻害し、さらなる解析のために、6-TGを用い
て変異細胞を選択することを目的として行った。
AIDCRCD10AコンストラクトおよびgRNAであるHPRT_TS-1発現ベ
クターを含むDNAの組み合わせ10μgを用いて、約7×105個のチャイニーズハム
スターV79-4細胞をトランスフェクションした。比較のために、細胞をBE3および
gRNAであるHPRT_TS-1で処理した。既報に記載の哺乳動物における突然変異
誘発性のプロトコールに従って、処理した細胞および未処理の細胞を増殖させた(Kle
in,C.B.,et al.,in Current Protocols in T
oxicology(John Wiley&Sons,Inc.,2001))。簡単
に言えば、トランスフェクションの後、細胞を7日間維持し、次いで変異の固定および既
に存在していたHPRT mRNAおよびタンパク質のターンオーバーのための6-TG
による選択を行った。60μMの6-TGを用いて14日間細胞を選択し、6-TGRの
コロニーを形成させた。コロニーを計数して変異の頻度を見積もり、個々のコロニーを単
離して配列決定の解析のために別々に増殖させた。
チャイニーズハムスターのHPRT遺伝子に由来するエクソン3を標的化するように、
1つのgRNAを設計した(図7A)。このgRNAは、フェニルアラニンをコードする
コドン74を標的化し、この残基における変異はHPRTタンパク質の安定性を低下させ
ることが既に知られていた(Davidson,B.L.,et al.,Gene 6
3,331-336,doi:http://dx.doi.org/10.1016/
0378-1119(88)90536-7(1988))。AIDCRCD10Aまた
はBE3コンストラクトをコードするDNAを、標的化gRNA発現ベクターと一緒に用
いてV79-4細胞をトランスフェクションした。AIDCRCD10Aシステムは、B
E3システムよりも高い効率で、細胞を6-TG処理に対して耐性にする変異をもたらし
た(すなわち、それぞれ未処理の細胞と比較して140倍vs.40倍であった;図7B
)。この結果から、CRCシステムは哺乳動物の内因性の遺伝子座における特定のDNA
配列を標的化し、修飾することができることが示される。
本発明を限定するものとしてというよりも、例示的なものと捉えられるべきである。容易
に理解可能であろうが、上述した特徴についての多くの改変および組み合わせが、特許請
求の範囲に記載の本発明を逸脱することなく採用可能である。このような改変は本発明の
範囲からの逸脱とみなされてはならず、このような改変はすべて、後述する特許請求の範
囲に含まれるものとする。本明細書において引用されたすべての文献は、その全体が参照
により引用されている。
Claims (16)
- (i)配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(ii)(a)標的核酸の配列に相補的なガイドRNA配列を含む核酸標的化モチーフ、(b)前記配列標的化タンパク質に結合可能なCRISPRモチーフ、および(c)リクルーティングRNAモチーフを含むRNAスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(iii)(a)前記リクルーティングRNAモチーフに結合可能なRNA結合ドメイン、(b)リンカー、および(c)DNA/RNA修飾の酵素活性を有するエフェクタードメインを含む非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞であって、
ヒト細胞または非ヒト細胞であり、前記ヒト細胞は、体細胞、前駆細胞、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児の幹細胞、成人の幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡能性幹細胞または単分化能性幹細胞である、宿主細胞。 - 前記配列標的化タンパク質がCRISPRタンパク質である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記配列標的化タンパク質が、化膿連鎖球菌、B群溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デンティコラからなる群から選択される種のdCas9またはnCas9の配列を含む、請求項1または2に記載の宿主細胞。
- 前記リクルーティングRNAモチーフおよび前記RNA結合ドメインが、以下のものからなる群から選択される対である、請求項1~3のいずれか1項に記載の宿主細胞:
テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質またはそのRNA結合部位;
テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質またはそのRNA結合部位;
MS2ファージオペレーターステムループおよびMS2コートタンパク質(MCP)またはそのRNA結合部位;
PP7ファージオペレーターステムループおよびPP7コートタンパク質(PCP)またはそのRNA結合部位;
SfMuファージComステムループおよびComRNA結合タンパク質またはそのRNA結合部位;並びに、
非天然のRNAアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのRNA結合部位。 - 前記酵素活性が、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である、請求項1~4のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウシの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、非ヒトの被験体中のものであるか、ヒトまたは非ヒト由来のものである、請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記ヒトまたは非ヒトの被験体が遺伝子の遺伝子変異を有しているか、または、病原体を有しているかもしくは前記病原体に曝露されるリスクを抱えている、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記被験体が、前記遺伝子変異に起因する障害または前記障害を有するリスクを抱えている、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記配列標的化タンパク質がヌクレアーゼ活性を有していない、請求項1~9のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- (a)前記配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(b)前記RNAスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(c)前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
を宿主細胞に導入することを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の宿主細胞の製造方法(但し、ヒトに対する医療行為を除く)。 - 前記配列標的化タンパク質が、前記配列標的化タンパク質をコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項11に記載の製造方法。
- 前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質が、前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質をコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項11または12に記載の製造方法。
- 前記RNAスキャホールドが、前記RNAスキャホールドをコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項11~13のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記RNAスキャホールドまたは前記タンパク質の発現を可能とする適切な条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、請求項11~14のいずれか1項に記載の製造方法。
- (i)配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(ii)(a)標的核酸の配列に相補的なガイドRNA配列を含む核酸標的化モチーフ、(b)前記配列標的化タンパク質に結合可能なCRISPRモチーフ、および(c)リクルーティングRNAモチーフを含むRNAスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、
(iii)(a)前記リクルーティングRNAモチーフに結合可能なRNA結合ドメイン、(b)リンカー、および(c)DNA/RNA修飾の酵素活性を有するエフェクタードメインを含む非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
を含むシステムを用いて改変された真核細胞であって、
ヒト細胞または非ヒト細胞であり、前記ヒト細胞は、体細胞、前駆細胞、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児の幹細胞、成人の幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡能性幹細胞または単分化能性幹細胞である、真核細胞。
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