JP7219972B2

JP7219972B2 - Ｄｎａ二本鎖切断に非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途

Info

Publication number: JP7219972B2
Application number: JP2019536931A
Authority: JP
Inventors: ジン，シェンカン; コランテス，ジュアン－カルロス
Original assignee: ラトガース，ザステートユニバーシティオブニュージャージー
Priority date: 2017-01-05
Filing date: 2018-01-04
Publication date: 2023-02-09
Anticipated expiration: 2038-01-04
Also published as: EP3565608A1; WO2018129129A1; US20190330658A1; JP2020503055A; EP3565608A4; CN110520163A

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年１月５日に出願された米国仮出願第６２／４４２，７０４号の優先権を主張するものである。当該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。

政府の利益
本明細書に開示された発明の少なくとも一部は、国務省フルブライト留学生プログラムからの政府支援（グラントＮｏ．１５１３０８１６）を受けてなされたものである。したがって、米国政府は本発明についてある種の権利を有する。

発明の分野
本発明は、標的化された遺伝子編集のためのシステムおよびその関連した用途に関する。

標的化された遺伝子の編集は、真核細胞、胚および動物を遺伝的に操作する強力なツールである。これによれば、標的化されたゲノムの位置および／または特定の染色体の配列を削除し、不活性化し、または修飾することができる。現状のいくつかの方法は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような人工的なヌクレアーゼ酵素の使用に依拠している。これらのキメラヌクレアーゼは、プログラム可能な、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結した配列特異的ＤＮＡ結合モジュールを有している。それぞれの新たなゲノム標的が生じると、新規な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールを有する新たなＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを設計する必要があることから、カスタム設計によるこれらのヌクレアーゼの調製は高価かつ時間のかかるものとなりがちである。また、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性はオフターゲットの切断を媒介しうるものである。近年開発されたゲノム修飾技術は、細菌の、ＲＮＡガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼである、規則間隔短鎖反復回文配列クラスター（ＣＲＩＳＰＲ；ｃｌｕｓｔｅｒｓｏｆｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を利用してＤＮＡ標的部位における特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導している。このＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体はその同族ＤＮＡを認識し、これと塩基対合することでＤＳＢを形成して標的を切断する。

しかしながら、未解決の主要な問題の１つは、体細胞における遺伝子変異をいかにして収集するかということである。今のところ、現状の技術における共通のエフェクターはヌクレアーゼであり、これはＤＮＡのＤＳＢをもたらし、これがさらに相同組み換えや非相同末端結合といった細胞の経路の不活性化を引き起こす。このプロセスは多くの主要な欠点を抱えている。第１に、末端結合による末端生成物の予期せぬ性質により、ＤＳＢが確率論的で予期できないようなインフレーム変異およびフレームシフト変異の双方を引き起こし、このことが直接的な臨床適用の用途を制限している。第２に、ＤＳＢは染色体転座のような非局所的な変異原性イベント（これはこの手法の望ましくない結果である）を生じる可能性を秘めている。インビボではこれらの変化は潜在的に有害なものでありうる。第３に、修復または修正には通常、ＤＳＢ媒介性の相同組み換えが必要とされるが、ほとんどの体組織／体細胞（そこでの治療が最も問題となる）においてその活性は低いか、または存在しない。

このように、ＤＳＢヌクレアーゼに基づく現状の技術は遺伝子編集への適用の可能性が限られており、二本鎖切断を引き起こすヌクレアーゼ活性に依拠しない標的化遺伝子修飾技術が求められている。

本発明は、標的化された遺伝子編集システムおよびその関連した用途を提供することにより、上記の要求に対処するものである。

一態様では、本発明は、標的核酸またはポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡの部位特異的な修飾の方法を提供する。当該方法は、標的核酸に対して遺伝子編集機構を指揮することを含む。遺伝子編集機構は、標的核酸またはポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの２つの異なる特異的核酸配列を認識する第１のシステム、および第２のシステムを含む（例えば、図１Ａ中の実例を参照）。

第１のシステムは、（ｉ）第１の配列標的化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ニッキングタンパク質（ＳＴＰ）、（ｉｉ）（ａ）標的ＤＮＡ中の第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ配列を含む第１の核酸標的化モチーフ、（ｂ）第１の配列標的化タンパク質に結合可能な第１のＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）第１のリクルーティングＲＮＡモチーフを含む第１のＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）（ａ）第１のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第１のＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）第１のリンカー、および（ｃ）第１のエフェクタードメインを含む、第１の非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質、を含む。第１の非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質は、酵素活性を有する。

第２のシステムは、標的ＤＮＡ中の第２の特異的核酸配列を認識する。第１の標的核酸配列および第２の標的核酸配列は、標的ＤＮＡの同じ鎖上にある。第１および第２のシステムが、シスで、すなわち同じＤＮＡ鎖上で、互いに近い２つのニックを導入する標的ヌクレオチド周辺の（例えば、標的部位の上流の１つのｇＲＮＡ、標的部位の下流の１つのｇＲＮＡ）２つの特定の配列（例えば、ｇＲＮＡによってガイドされる）を認識するように、２つの標的核酸配列のいずれか一方が、他方の上流または下流にあってもよい。このように、一続きのｓｓＤＮＡを一時的に曝露して、エフェクターモジュール（例えば、以下に記載されるＣＲＣエフェクターモジュール）がヌクレオチド変換を触媒し、続いて鎖修復の際に導入された修飾の固定が行われることを可能とする（例えば、図８Ｂおよび図１０Ａ～図１０Ｄを参照）。

第２のシステムは、様々な構成要素のセットを有してもよいが、一般に、（ｉ）標的ＤＮＡ中の第２の標的核酸配列を標的化する第２の配列標的化ｓｓＤＮＡニッキングタンパク質を有する。この配列標的化ｓｓＤＮＡニッキングタンパク質は、第１のシステムのものと同じであってもよい。

一実施形態では、第２のシステムは、（ｉｉ）（ａ）標的ＤＮＡ中の第２の標的核酸配列に相補的な第２のガイドＲＮＡ配列を含む第２の核酸標的化モチーフ、（ｂ）第２の配列標的化タンパク質に結合可能な第２のＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフを含む、第２のＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）（ａ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第２のＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）第２のリンカー、および（ｃ）第２のエフェクタードメインを含む第２の非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質をさらに含む。（ｉｉ）の第２のリクルーティングＲＮＡモチーフおよび（ｉｉｉ）のすべての構成要素は、第１のシステムの構成要素と同じであってもよく、またはそれらと異なってもよい。第２のエフェクター融合タンパク質は、酵素活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。

別の実施形態では、第２のシステムは、（ｉｉ）（ａ）標的ＤＮＡ中の第２の標的核酸配列に相補的な第２のガイドＲＮＡ配列を含む第２の核酸標的化モチーフ、および（ｂ）第２の配列標的化タンパク質に結合可能な第２のＣＲＩＳＰＲモチーフを含む第２のＲＮＡスキャホールドをさらに含んでもよい。エフェクタータンパク質が第２の標的核酸配列に動員されないように、第２のＲＮＡスキャホールドにはリクルーティングＲＮＡモチーフがないことが好ましい。

さらに別の実施形態では、第２のシステムは、（ｉｉ）（ａ）標的ＤＮＡ中の第２の標的核酸配列に相補的な第２のガイドＲＮＡ配列を含む第２の核酸標的化モチーフ、（ｂ）第２の配列標的化タンパク質に結合可能な第２のＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフを含む第２のＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）（ａ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第２のＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）第２のリンカー、および（ｃ）局所ＤＮＡ修復阻害剤ドメインを含む、局所ＤＮＡ修復阻害剤融合タンパク質をさらに含んでもよい。

上に記載される方法では、第１または第２の配列標的化タンパク質はＣＲＩＳＰＲタンパク質であってもよい。好ましくは、第１または第２の配列標的化タンパク質は、二本鎖切断を作るヌクレアーゼ活性を有さない。第１または第２の配列標的化タンパク質の例としては、化膿連鎖球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デンティコラからなる群から選択される種のｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９（ニッカーゼＣａｓ９）の配列が挙げられる。ある実施形態では、第１の配列標的化タンパク質および第２の配列標的化タンパク質は、オルソログであってもよく、異なるＰＡＭと関連してもよい。

上に記載される方法では、（ｉ）第１のリクルーティングＲＮＡモチーフおよび第１のＲＮＡ結合ドメイン、または（ｉｉ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフおよび第２のＲＮＡ結合ドメインは、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位、ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位、ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、並びに非天然のＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合部位からなる群から選択される対であってもよい。

上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質において、上記リンカーの配列の長さは０～１００（例えば、１～１００、５～８０、１０～５０および２０～３０）のアミノ酸長でありうる。上記酵素活性は、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性でありうる。ある実施形態では、酵素活性は、脱アミノ化活性（例えばシチジン脱アミノ化活性またはアデノシン脱アミノ化活性）、メチルトランスフェラーゼ活性またはデメチラーゼ活性である。第１または第２のＲＮＡ結合ドメインはＣａｓ９ではなく、その機能的な等価物でもなく、そのＲＮＡ結合ドメインでもない。第２のエフェクター融合タンパク質は、任意の酵素活性を有していてもよいし、有していなくてもよく、第１のエフェクター融合タンパク質によって媒介される所望の編集特性を改善することができる。
上記標的核酸は、細胞中に存在するものでありうる。当該標的核酸は、ＲＮＡであってもよいし、染色体外のＤＮＡであってもよいし、染色体上のゲノムＤＮＡであってもよい。当該細胞は、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウシの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択されうる。

上記細胞は、ヒトもしくは非ヒトの被験体中のものであるか、これ由来のものでありうる。当該ヒトまたは非ヒトの被験体は、遺伝子の遺伝子変異または遺伝子多型を有している。ある実施形態では、上記被験体は当該遺伝子変異に起因する障害または当該障害を有するリスクを抱えているものである。この場合、上記部位特異的な修飾は、上記遺伝子変異を修正するか、または上記遺伝子の発現を不活性化する。他の実施形態では、上記被験体は病原体を有しているか、または当該病原体に曝露されるリスクを抱えているものであり、上記部位特異的な修飾は、上記病原体の遺伝子を不活性化する。

また、上に記載される第１または第２のシステムの構成要素（ｉ）～（ｉｉｉ）の１つ以上をコードする単離された核酸、上記核酸を含む発現ベクター、または上記核酸を含む宿主細胞が提供される。

本発明の別の態様は、上に記載される第１のシステム、上に記載される第２のシステム、上に記載される単離された核酸、上に記載される発現ベクター、および上に記載される宿主細胞からなる群から選択される１つ以上を含む組成物を提供する。また、上に記載される第１のシステム、上に記載される第２のシステム、上に記載される単離された核酸、上に記載される発現ベクター、および上に記載される宿主細胞からなる群から選択される１つ以上を含むキットが提供される。当該キットは、再構成および／または希釈のための試薬、並びに核酸またはポリペプチドを宿主細胞中に導入するための試薬からなる群から選択される１つ以上の構成要素をさらに含んでもよい。

以下、本発明の１つ以上の実施形態の詳細について記載する。当該記載および特許請求の範囲の記載から、本発明の他の特徴、目的および利点については明らかとなるものと思われる。

図１Ａは、標的ＤＮＡ中の２つの特異的核酸配列とそれぞれ相互作用する２つのシステムを含む、遺伝子編集機構の概略図である。第１のシステムは、（ｉ）配列標的化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ニッキングタンパク質（ＳＴＰ）、（ｉｉ）（ａ）標的ＤＮＡ中の標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的化モチーフ、（ｂ）配列標的化タンパク質に結合可能なＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）リクルーティングＲＮＡモチーフを含むＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）（ａ）リクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能なＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）リンカーおよび（ｃ）エフェクタードメインを含む非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質、を含む。Ｃ－Ｇ対を単に解説のために示すが、Ａ－Ｔ対も好適となりうる。第２のシステムは、任意に、構成要素（ｉｉ）（ｃ）すなわち、リクルーティングＲＮＡモチーフ、および構成要素（ｉｉｉ）、すなわち非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質と共に、第２の特異的核酸配列を認識する、第１のシステムと同様の構成要素のセットを含んでもよい。図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、インビボでの標的化された遺伝子編集のための例示的なヌクレアーゼ非依存的なＣａｓＲｃｕｒｅまたはＣＲＣプラットフォームの一連の概略図である。図１Ｂ：当該プラットフォームの構成要素を示し、左から右へ、（１）配列標的化成分であるｄＣａｓ９、（２）（配列標的化のための）ガイドＲＮＡモチーフを含むＲＮＡスキャホールド、（ｄＣａｓ９への結合のための）ＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（エフェクター－ＲＮＡ結合タンパク質融合物をリクルートするための）リクルーティングＲＮＡモチーフ、並びに、（３）エフェクター－ＲＮＡ結合ドメイン融合タンパク質である。このシステムは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（右）の特定のヌクレオチドを標的化するようにプログラムされうる。図１Ｃ：上記エフェクタータンパク質がモノマーとして機能する場合、当該システムは、標的部位の上流（左）または下流（右）のいずれかにおける単一の部位を標的とすることができる。図１Ｄ：エフェクタータンパク質が適切な触媒作用のために二量化を必要とする場合には、標的部位の上流および下流の配列を同時に標的とするように当該システムを多重化させることができ、これによってエフェクタータンパク質の二量化を可能とする（右）。あるいは、単一部位へとエフェクタータンパク質を動員するだけで、隣接するエフェクタータンパク質に対するその親和性を上昇させて二量化を促進させるには十分かもしれない（右）。図１Ｅ：標的部位に動員され配置された四量体エフェクター酵素の例であり、これは二重の標的化（左）または単一の標的化（右）により達成されうる。図１Ｆ：ＲＮＡである標的を編集するのに（例えば、レトロウイルスの不活性化に）用いられうるシステムである。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＡＩＤの標的化された動員によってヌクレオチド変換の部位特異的な変換が可能であることを示す。図２Ａ：大腸菌ｒｐｏＢ遺伝子のＲＲＤＲクラスターＩ（配列番号：２３および配列番号：２４）に沿った標的領域の概要である。図２Ａには、（上段）ＤＮＡ配列（配列番号：２３）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（中段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（すべてのｇＲＮＡはテンプレート鎖（ＴＳ、－）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（下段）タンパク質配列（配列番号：２５）にリファンピシン耐性に関与する決定的なアミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。図２Ｂ：大腸菌ＭＧ１６５５細胞を^ＡＩＤＣＲＣおよび所定のｇＲＮＡで処理し、１２０μＭのリファンピシンを含有するプレート上で選択した。図２Ｃ：図２Ｂの上段パネルから算出された変異頻度である。図２Ｄ：ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ｇＲＮＡを用いた^ＡＩＤＣＲＣ処理（上段、配列番号：２６）および未処理の細胞（中段、配列番号：２７）からの代表的な配列決定の結果である。Ｃ１５９２＞Ｔ変異により、タンパク質配列におけるＳ５３１Ｆの変化が生じており（下段、配列番号：２８および配列番号：２９）、この変異はＲｉｆを誘導することが知られている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ－Ｍａｈｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１８，９９－１０４（２００２），Ｘｕ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８７，２７８３－２７９２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．１８７．８．２７８３－２７９２．２００５（２００５），ａｎｄＺｅｎｋｉｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ４９，１５８７－１５９０，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．４９．４．１５８７－１５９０．２００５（２００５））。ここで、修飾されたヌクレオチドおよびアミノ酸残基を、ＣおよびＳ（野生型）並びにＴおよびＦ（変異体）と示す。図２Ｅ：ｒｐｏＢ＿ＴＳ－３、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４およびスクランブルのそれぞれのｇＲＮＡ（配列番号：３０～配列番号：４１）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ処理による変異の分布である。図２Ｆ：これらのデータから、ＣＲＣは、選択的に５’末端により近い側で、対を形成していない鎖（プロトスペーサー）上に位置する標的シチジン残基を能動的に脱アミノ化することが示唆される。図３Ａおよび図３Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：標的化モジュールのエンジニアリングにより変異の頻度が増加する。図３Ａ：標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａ（配列番号：５２）に改変することで、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ｇＲＮＡを用いて標的化したときのリファンピシンプレート上での生存画分の観点でのシステムの効率は、対コントロール比で１８倍（^ＡＩＤＣＲＣ）から４３倍（^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）に増加した。図３Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布である。Ｃ１５９２は１００％のクローンで改変され、そのうち７５％がＣからＴへ変異し、２５％がＣからＡへ変異した。図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：エフェクターモジュールのエンジニアリングにより変異の頻度が増加する。図４Ａ：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）およびＡＰＯＢＥＣ１（^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）について、プロトタイプシステムである^ＡＩＤＣＲＣと共存させてエフェクターとして試験した。ＡＰＯＢＥＣ１を用いて処理すると、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ｇＲＮＡを用いて標的化したときの変異の頻度は^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａに対して増加した。^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａの活性は^ＡＩＤＣＲＣよりも低かった。図４Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^ＡＰＯ１ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布（％）である。Ｃ１５９２＞Ｔの変換は１００％のクローンで観察された。また、分析したクローンのうち２５％は二重変異を有しており、Ｃ１５９０＞Ｔに変異していた（アミノ酸の変化はなし）。図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：ＲＮＡ動員スキャホールドの数を増やすと変異の頻度が増加する。図５Ａ：同じ位置を標的化したまま動員スキャホールドの数を増やすと、変異の効率は対応するスクランブルｇＲＮＡコントロールに対して５０倍（ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４１×ＭＳ２、配列番号：２）から１４０倍（ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４２×ＭＳ２、配列番号：５４）に増加した。図５Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４＿２×ＭＳ２（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布（％）である。Ｃ１５９２は１００％のクローンで改変され、そのうち６２．５％がＣからＴへ変異し、３７．５％がＣからＡへ変異した。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄは、ＣＲＣシステムにより哺乳動物の細胞の染色体外ＤＮＡにおける標的ヌクレオチドを修飾してタンパク質の機能を回復させることができることを示す。図６Ａ：これらの実験で用いられるコンストラクトの概要図である。（上段）システムの２つのタンパク質構成要素の化学量論的な濃度を保証するため、タンパク質をコードする遺伝子を、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）の制御下、多シストロン性コンストラクトとしてクローニングした。（下段）５’－Ｇまたは５’－Ａを有する標的を発現させるため、それぞれＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターの制御下でキメラｇＲＮＡ＿ＭＳ２コンストラクトをクローニングした。図６Ｂ：_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ欠損フルオロフォアの周辺の標的領域の概要図である。図６Ｂには、（上段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（すべてのｇＲＮＡは非テンプレート鎖（ＮＴ、＋）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（中段）ＤＮＡ配列（配列番号：４２および配列番号：４３）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（下段）タンパク質配列（配列番号：４４）にＥＧＦＰフルオロフォアを無効化する変異アミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。図６Ｃ：２９３Ｔ細胞における_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃの標的化である。_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－１および_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－２（より低い効率であった）を用いた処理ではＥＧＦＰシグナルが誘導されたが、スクランブルｇＲＮＡを用いた場合にはシグナルは検出されなかった。また、ＣＲＣプラットフォームを、動員のためにはシチジンデアミナーゼタンパク質のＣａｓ９タンパク質への直接的な融合を必要とし、効率の改善のためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の共発現を必要とする別の遺伝子編集システム（ＢＥ３）と比較した。ＢＦ、明野。図６Ｄ：標的化ｇＲＮＡとして_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－１を用いた^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡシステムおよびＢＥ３システムからのＧＦＰ陽性細胞の定量（％）である。図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＲＣシステムによる処理によって哺乳動物の細胞における内在性の遺伝子での部位特異的なヌクレオチド変換が引き起こされうることを示す。図７Ａ：チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３上の標的領域の概要図である。図７Ａには、（上段）ＤＮＡ配列（配列番号：４５および配列番号：４６）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（中段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（当該ｇＲＮＡはテンプレート鎖（ＴＳ、－）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（下段）タンパク質配列（配列番号：４７）にＨＰＲＴタンパク質の不安定化に関与する決定的なアミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。図７Ｂ：^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡまたはＢＥ３を用いたＨＰＲＴの標的化後の、あるいは処理していない６－ＴＧ耐性Ｖ７９－４細胞の定量である。未処理の細胞と比較すると、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理における生存画分は未処理の細胞よりも１４０倍増加したが、ＢＥ３処理では４０倍しか増加しなかった。図８Ａおよび図８Ｂは、ｃｉｓダブルニッキングアプローチの概要である。図８Ａ：この実施例では、標的シチジン（赤色）は、プロトスペーサーの５’末端から２位にあり、これはＣＲＣエフェクターモジュールにアクセス不可能とする。図８Ｂ：上段パネル。よりエフェクターモジュールにアクセス可能とするように標的シチジンを曝露するため、標的ヌクレオチドの上流および下流の近傍配列をｃｉｓで標的とするように当該システムを多重化させる。単に動員モジュール（ＲＮＡスキャホールド）のないｇＲＮＡを使用することにより、第２の部位からエフェクターモジュールを排除することが可能である。中段パネル。同時のｃｉｓダブルニッキングの後、一続きのｓｓＤＮＡが一時的に生成される。このように、エフェクターモジュールは、脱アミノ化反応を触媒し、Ｔ（黒色）へと標的ヌクレオチドを変異させて、標的シチジンへのアクセスを得ることができる。ｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａニッキング部位は、黒い矢印で示される。下段パネル。切れ目の入った鎖が修復された後、変換されたヌクレオチドが固定される。図９Ａおよび図９Ｂは、細菌のゲノム中のｃｉｓダブルニッキングを示す図である。図９Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉのｒｐｏＢ遺伝子のＲＲＤＲクラスターＩに沿った標的部位の概要（配列番号：２３、２４）。（上段）緑色のＰＡＭ（四角囲み）および赤色の変異可能な位置（矢印）を有するＤＮＡ配列（配列番号：２３）；（中段）これらの実験で使用されるｇＲＮＡの結合部位を示す。すべてのｇＲＮＡは、鋳型鎖（ＴＳ、－）を標的化するようにプログラムされていた；（下段）赤色のリファンピシン耐性に関与する決定的なアミノ酸（矢印）を有する青色のタンパク質配列（配列番号：２５）。この実験では、ｇＲＮＡＴＳ２およびＴＳ３を使用した。図９Ｂ：単一のニッキングと比較した、ｃｉｓダブルニッキングの変異頻度。ダブルニッキング実験のため、エフェクターモジュール（ＡＩＤ＿ＭＣＰ）を動員するかまたは除外すべく、リクルーティングＲＮＡモチーフ（２ｘＭＳ２）を有するか、またはこれを有しないｇＲＮＡＴＳ２およびＴＳ３の２つの変種をそれぞれ作製した。ｃｉｓダブルニッキングに加えてＴＳ３位にエフェクターモジュールを動員することで（ＴＳ２／ＴＳ３＿２ｘＭＳ２の処理）、ＴＳ３＿２ｘＭＳ２ｇＲＮＡによる単一のターゲッティングと比較して、変異頻度がわずかに増加した。重要なことには、ｃｉｓダブルニッキングに加えてＴＳ２位にエフェクターモジュールを動員することで（ＴＳ２＿２ｘＭＳ２／ＴＳ３の処理）、ＴＳ２＿２ｘＭＳ２処理による単一の標的化と比較して、変異頻度が１３０倍高くなった。図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ｃｉｓダブルニッキングアプローチを使用するＣＲＣシステムの様々な適用を示す図である。図１０Ａ：ＣＲＣエフェクターは両方のニッキング部位に動員される。図１０Ｂ：ＣＲＣエフェクターは、リクルーティングＲＮＡモチーフを有するか、またはこれを有しないｇＲＮＡを利用することにより、ニッキング部位に動員されるか、またはそこから除外されうる。上部パネルは、もっぱら下流ニッキング部位に動員されているＣＲＣエフェクターを示すのに対し、下部パネルでは、ＣＲＣエフェクターが上流ニッキング部位にのみ動員される。図１０Ｃ：さらにヌクレオチド変換効率を増強するため、上記システムは、ＣＲＣエフェクター（下流）および局所ＤＮＡ修復阻害剤（例えばＵＧＩ）を動員するようにプログラムされうる。２つのニッキング部位間のクロストークを回避するため、ＣＲＣエフェクターおよび阻害剤を独立して動員するためのオルソロガスなＲＮＡリクルーティングモチーフを使用することができる（例えば、ＭＳ２－ＭＣＰは、ＭＣＰに融合されたＣＲＣエフェクターを動員し、ＰＰ７－ＰＣＰはＰＣＰに融合されたＵＧＩを動員する）。図１０Ｄ：ダブルニッキングが必要とされるが、近辺に他の化膿連鎖球菌ＰＡＭ配列がない場合、どのＰＡＭ配列が入手可能であるかに依存してＣａｓ９オルソログが使用されうる。この実施例では、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９_Ｄ１０Ａ）が上流ニッキング部位を標的とするようにプログラムされるのに対し、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９_Ｄ１０Ａ）は下流ニッキング部位を標的とする。図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＡＩＤ＿Ｓ３８Ａバリアント（リン酸化可能ではないバリアント）を使用する概略図、およびこのアプローチによって変換効率の変化を示さない（しかしＳ３８Ａ変異によるオフターゲット効果を減少する可能性がある）結果である。

現状の遺伝子特異的な編集技術は、そのほとんどがヌクレアーゼ誘導性のＤＮＡのＤＳＢと、これによるＤＳＢ誘導性の相同組み換えに基づくものである。ほとんどの体細胞において相同組み換えの活性は低いかまたは存在しないことから、ほとんどの疾患において、体組織での病理学的な遺伝子変異の治療的な修正のためのこれらの技術の用途は制限されている。

本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも一部は、ＤＮＡ配列に標的化された遺伝子またはＲＮＡ転写物の編集を可能とするプラットフォームまたはシステムに基づくものである。このシステムはヌクレアーゼ活性に基づくものではなく、ＤＳＢを生成するものでもなく、ＤＳＢ媒介性の相同組み換えに依拠するものでもない。さらに、当該プラットフォームのＲＮＡスキャホールドの設計はモジュラー式であり、これによって任意の所望のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を極めてフレキシブルで簡便な方式により標的化することが可能となる。本質的に、このアプローチによれば、幹細胞などの体細胞における実質的にいかなるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に対しても、ＤＮＡまたはＲＮＡの編集酵素を導くことが可能である。標的のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を正確に編集することを通じて、当該酵素は、遺伝子疾患においては変異した遺伝子を修正し、ウイルス感染細胞においてはウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因タンパク質の発現を防止し、がんにおいてはがん原性タンパク質をサイレンシングすることができる。また、このアプローチは生体外で幹細胞または前駆細胞のゲノムを編集することによる細胞ベースの治療にも用いられうる。治療用途のほかにも、上記システムは、強力な研究ツールとして任意の有機体のゲノムの標的化された修飾に広く適用可能である。また、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２４１３を参照されたい。

遺伝子編集プラットフォーム
本発明の一形態によれば、遺伝子編集プラットフォームが提供され、これによって現状のヌクレアーゼおよびＤＳＢ依存的なゲノム工学技術および遺伝子編集技術における上述したような制限が克服される。当該プラットフォームはＣａｓＲｃｕｒｅシステムまたはＣＲＣシステムと称されるが、３つの機能的な構成要素を備えている：（１）配列の標的化のために設計された、ヌクレアーゼを含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのモジュール；（２）当該プラットフォームを標的配列へと導くとともに修正モジュールを動員するためのＲＮＡスキャホールドベースのモジュール；および（３）シチジンデアミナーゼ類（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）等）などの、エフェクター修正モジュールとしての非ヌクレアーゼＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素、である。ＣａｓＲｃｕｒｅシステムによれば、これらが一体となって、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列へのアンカリング、フレキシブルかつモジュラー式のエフェクターＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素の特定配列への動員、および遺伝子情報（特に、点変異）を修正するための体細胞において活性な細胞経路の誘導、が可能となる。

図１Ｂ～図１Ｆに、例示的なＣａｓＲｃｕｒｅシステムの概要図を示す。より具体的に、当該システムは、図１Ｂに示される３つの構造的および機能的な構成要素を備えている：（１）配列標的化モジュール（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）；（２）配列の認識およびエフェクターの動員のためのＲＮＡスキャホールド（ガイドＲＮＡモチーフ、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡモチーフおよびリクルーティングＲＮＡモチーフを含むＲＮＡ分子）；並びに（３）エフェクター（リクルーティングＲＮＡモチーフに結合する小タンパク質に融合した、ＡＩＤなどの非ヌクレアーゼＤＮＡ修飾酵素）、である。これらの３つの構成要素は、単一の発現ベクター中に、または２つもしくは３つの異なる発現ベクター中に構築されうる。これらの３つの特定の構成要素の全体性および組み合わせにより、技術的なプラットフォームが構成される。

本明細書に開示されているように、動員メカニズムには多くの明確な違いが存在する：ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員システム（ＣＲＣ）に対し、Ｃａｓ９のエフェクタータンパク質への直接的な融合（ＢＥ３）。後述する実施例に示されている結果から、ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員は、直接的な融合と比較して、染色体外の標的（図６Ｃおよび図６Ｄ）並びに内在性の遺伝子（図７Ｂ）の双方においてより効率的であることがわかる。また、上記ＣＲＣシステムはＤＮＡ修復酵素であるＵＮＧの阻害に依拠していないのに対し、ＢＥ３は強力なＵＮＧ阻害剤ペプチド（ＵＧＩ）を用いるものである。広範囲のまたは局所的なＤＮＡ修復の阻害は、望ましくない、制御不能な、潜在的に有害な結果をもたらす可能性がある。そして、ＣＲＣシステムのモジュラー式の設計によれば、フレキシブルなシステムの構築が可能となる。モジュールは互換性を有しており、異なるモジュールの多数の組み合わせも容易に達成可能である。これに対して、直接的な融合の場合、新たなモジュールを構築するには常に新たな融合プロセスを必要とする。さらに、ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員によれば、エフェクタータンパク質のオリゴマー化を促進しやすいのに対し、直接的な融合では立体障害のためにオリゴマーの形成は不可能である。

ａ．配列標的化モジュール
上記システムの配列標的化のための構成要素は、細菌の種に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくものである。本来の機能的な細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは３つの構成要素を必要とする：ヌクレアーゼ活性を提供するＣａｓタンパク質と、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される２つの短い非コードＲＮＡ種であり、この２つのＲＮＡ種はいわゆるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成する。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲは最もよく特徴付けられているシステムの１つであり、４つの連続したステップにより標的化されたＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす。第１に、２つの非コードＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ分子の繰り返し領域にハイブリダイズし、独自のスペーサー配列を有する成熟ｃｒＲＮＡ分子へのｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ分子の成熟を媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｎｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、いわゆるｇＲＮＡ）がＣａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）に対し、ｃｒＲＮＡ上の上記スペーサー配列と標的ＤＮＡ（これは３ヌクレオチド（ｎｔ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する）上のプロトスペーサー配列の相補鎖との間のワトソン－クリック塩基対を介したＤＮＡの標的化を指示する。ＰＡＭ配列はＣａｓ９の標的化に必須である。最後に、Ｃａｓのヌクレアーゼが標的ＤＮＡの切断を媒介することにより、標的部位内において二本鎖切断を引き起こす。その本来の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、度重なるウイルス感染から細菌を保護する適応免疫機構として機能し、ＰＡＭ配列は自己／非自己の認識シグナルとして作用し、Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性を有している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、インビトロおよびインビボの双方において、遺伝子編集のための非常に大きな可能性を有することが判明している。

本明細書に開示された発明においても、配列の認識機構は同様にして達成可能である。すなわち、変異体Ｃａｓタンパク質（例えば、そのヌクレアーゼ触媒ドメインに変異を有することでヌクレアーゼ活性を持たないｄＣａｓ９タンパク質、または触媒ドメインの１つに部分的に変異を有することでＤＳＢを生成するためのヌクレアーゼ活性を持たないｎＣａｓ９など）は、短い（典型的には２０ヌクレオチド長の）スペーサー配列を含みＣａｓタンパク質をその標的であるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列へと導く非コードＲＮＡスキャホールド分子を特異的に認識する。後者は３’ＰＡＭの横に位置している。

種々のＣａｓタンパク質が本発明において用いられうる。Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質との語は互換的に使用可能であり、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ結合を伴うＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓのタイプＩシステム、タイプＩＩシステムまたはタイプＩＩＩシステムの、またはこれ由来のタンパク質を意味する。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非制限的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、ＷＯ２０１４／１４４７６１、ＷＯ２０１４／１４４５９２、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＵＳ２０１４／０２７３２２６およびＵＳ２０１４／０２７３２３３が参照され、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、Ｃａｓタンパク質はタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来のものである。例示的な実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であるか、またはこれ由来のものである。当該Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌、サーモフィルス菌、ストレプトコッカス・エスピー、ノカルジオプシス・ダソンヴィレイ、ストレプトマイセス・プリスチネスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランジウム・ロセウム、ストレプトスポランジウム・ロセウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム・シビリクム、ラクトバチルス・デルブリッキィ、ラクトバチルス・サリバリウス、ミクロシラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス・エスピー、クロコスファエラ・ワトソニー、シアノセイス・エスピー、ミクロシスティスアエルギノーサ、シネチョコッカス・エスピー、アセトハロビウム・アラビティカム、アモニフェクス・デジェンシー、カルディセルロシルプター・ベスシー、カンジダトゥス・デスルホルディス、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマティウム・ビノサム、マリノバクター・エスピー、ニトロソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニー、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガータム、アナベナ・バリアビリス、ノデュラリア・スピミゲナ、ノストック・エスピー、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・エスピー、リングビア・エスピー、ミクロコレウス・クソノプラステス、オスキアトリア・エスピー、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌスまたはアカリオクロリス・マリナ由来のものでありうる。一般に、Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメインを含む。当該ＲＮＡ結合ドメインはガイドＲＮＡと相互作用する。Ｃａｓタンパク質は野生型のＣａｓタンパク質であってもよいし、ヌクレアーゼ活性を有しない修飾型であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、核酸に対する結合親和性および／もしくは特異性を増大させ、酵素活性を変化させ、並びに／または当該タンパク質の他の特性を変化させることを目的として修飾されうる。例えば、当該タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾され、除去され、または不活性化されうる。あるいは、当該タンパク質は、その機能に必須ではないドメインを除去する目的で短鎖化されうる。当該タンパク質はまた、エフェクタードメインの活性を最適化する目的で、単鎖化または修飾されうる。

ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質は野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）の変異体またはその断片でありうる。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は変異型Ｃａｓタンパク質に由来するものであってもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、当該タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変化させる目的で改変されうる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡ標的化に関与しないドメインが当該タンパク質から除去されてもよく、これによって修飾型Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも短くなる。ある実施形態において、本発明のシステムは、細菌中でコードされる、または哺乳動物の細胞での発現のためにコドンが最適化された、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。

変異型Ｃａｓタンパク質とは、野生型タンパク質のポリペプチド誘導体（例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断を含むタンパク質、融合タンパク質またはこれらの組み合わせ）を意味する。この変異体は、ＲＮＡガイド化ＤＮＡ結合活性もしくはＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ活性の少なくとも一方、またはこれらの双方を有している。一般に、修飾型は、後述する配列番号：１のような野生型タンパク質に対して、少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％（両端含む）の間の任意の数（例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および９９％））の同一性を有する。

Ｃａｓタンパク質（本発明において記載されている他のタンパク質構成成分）は、組み換えポリペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドを調製するには、これをコードする核酸が、融合相手をコードする他の核酸（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×－ＨｉｓエピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質）と連結されうる。得られた融合核酸は、適当な宿主細胞中で融合タンパク質を発現し、これは本技術分野において公知の手法により単離されうる。上記融合相手を除去して本発明の組み換えタンパク質を得る目的で、単離された融合タンパク質は、例えば酵素消化によってさらに処理されうる。あるいは、上記タンパク質は化学的に合成されてもよいし（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，” Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３を参照）、本明細書に記載の組み換えＤＮＡ技術によって製造されてもよい。さらなる指針として、当業者はＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，” ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照しうる。

本明細書に記載されているＣａｓタンパク質は、精製または単離された形態で提供されてもよいし、組成物の一部であってもよい。好ましくは、組成物中の場合、当該タンパク質はまずある程度（より好ましくは高い純度レベル（例えば、約８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれ以上）へと）精製される。本発明に係る組成物は、所望の任意のタイプの組成物でありうるが、典型的にはＲＮＡによりガイドされる標的化のための組成物としての使用に（またはこれに含まれるのに）適した水性組成物である。本技術分野の当業者は、このようなヌクレアーゼ反応のための組成物に含まれうる種々の成分を熟知している。

本明細書に開示されているように、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（例えば化膿連鎖球菌由来のｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ・Ｈ８４０Ａ変異体タンパク質、図１Ｂ、配列番号：１）、またはヌクレアーゼ活性のないニッカーゼＣａｓ９（例えば化膿連鎖球菌由来のｎＣａｓ９、Ｄ１０Ａ変異体タンパク質、配列番号：５２、図１Ｂおよび図２Ｆ）が用いられうる。ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９は、種々の他の細菌種由来のものであってもよい。ｄＣａｓ９の非制限的な例とそれに対応するＰＡＭ要求性の一覧を表１に示す。

ｂ．配列認識のためのＲＮＡスキャホールドおよびエフェクターの動員
本明細書に記載のプラットフォームの第２の構成要素はＲＮＡスキャホールドであり、これは３つのサブ構成要素：プログラム可能なガイドＲＮＡモチーフ、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡモチーフ、およびリクルーティングＲＮＡモチーフ、を備えている。このスキャホールドは、単一のＲＮＡ分子であってもよいし、複数のＲＮＡ分子の複合体であってもよい。本明細書に開示されているように、プログラム可能なガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、一緒になって配列の標的化および認識のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのモジュールを形成する。一方、ＲＮＡ－タンパク質結合対を介したリクルーティングＲＮＡモチーフはタンパク質エフェクターを動員し、このタンパク質エフェクターが遺伝子の修正を行う。このように、当該第２の構成要素は、修正モジュールと配列認識モジュールとを連結するものである。

プログラム可能なガイドＲＮＡ
重要なサブ構成要素の１つは、プログラム可能なガイドＲＮＡである。その単純さと効率性から、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは種々の有機体の細胞において遺伝子編集を行うのに用いられてきた。このシステムの特異性は標的ＤＮＡとカスタム設計されたガイドＲＮＡとの間での塩基対形成によって決定される。ガイドＲＮＡの塩基対形成の特性を設計・調整することにより、標的配列中にＰＡＭ配列が存在する限り、所望の任意の配列を標的化することが可能である。

本明細書に記載のＲＮＡスキャホールドのサブ構成要素のうち、ガイド配列が標的化の特異性を担っている。このガイド配列は、予め選択された所望の標的部位に対して相補的でこれに対してハイブリダイゼーション可能な領域を含んでいる。種々の実施形態において、このガイド配列は約１０から約２５超のヌクレオチドを含みうる。例えば、ガイド配列とこれに対応する標的部位の配列との間の塩基対形成の領域のヌクレオチド長は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、または２５超でありうる。例示的な実施形態において、ガイド配列は約１７～２０ヌクレオチド長（例えば、２０ヌクレオチド長）である。

適切な標的核酸を選択する１つの要件は、当該核酸が３’ＰＡＭ部位／配列を有することである。各標的配列およびこれに対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書ではＣａｓ標的化部位と称される。最もよく特徴付けられているシステムの１つであるタイプＩＩＣＲＩＳＰＲシステムは、標的を切断するのにＣａｓ９タンパク質および標的配列に相補的なガイドＲＮＡのみを必要とする。化膿連鎖球菌のタイプＩＩＣＲＩＳＰＲシステムはＮ１２－２０ＮＧＧを有する標的部位を利用しているが、ＮＧＧとは化膿連鎖球菌由来のＰＡＭ部位を意味し、Ｎ１２－２０とはＰＡＭ部位の５’側に位置する１２～２０ヌクレオチドを意味する。他の細菌種に由来する他のＰＡＭ部位の配列としては、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＡＡＣが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１４０２７３２３３、ＷＯ２０１３１７６７７２、Ｃｏｎｇｅｔａｌ．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８１９－８２３、Ｊｉｎｅｋ
ｅｔａｌ．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｍａｌｉｅｔａｌ，（２０１３），Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｇａｓｉｕｎａｓｅｔａｌ．，（２０１２），ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０９（３９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６、Ｃｈｏｅｔａｌ．，（２０１３）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１，２３０－２３２、Ｈｏｕｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１３Ｓｅｐ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｍｏｊｉｃａｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９Ｍａｒ；１５５（Ｐｔ３）：７３３－４０およびｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ＣＲＩＳＰＲ／を参照のこと。これらの文献の内容はその全体が参照により本明細書に引用されている。

標的核酸の鎖は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ上の二本鎖のいずれかでありうる。このようなゲノムｄｓＤＮＡの例としては、必ずしもこれらに限定されないが、宿主細胞の染色体、ミトコンドリアＤＮＡおよび安定的に保持されたプラスミドが挙げられる。しかしながら、本発明に係る方法は、宿主細胞のｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的化部位が存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ）に対しても実施可能であることに留意すべきである。本発明に係る方法は、ＲＮＡに対しても実施可能である。

ＣＲＩＳＰＲモチーフ
上述したガイド配列に加えて、本発明のＲＮＡスキャホールドはさらに他の活性または不活性なサブ構成要素を含む。一例において、当該スキャホールドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するＣＲＩＳＰＲモチーフを備えている。例えば、当該スキャホールドは、天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模したものとして、上述したプログラム可能なガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡに融合されてなるハイブリッドＲＮＡ分子でありうる。例示的なハイブリッドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡであるｓｇＲＮＡ配列は以下のとおりである：５’－（２０ｎｔガイド）－ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ－３’（配列番号：４；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３Ｄｅｃ１９；１５５（７）：１４７９－９１）。種々のｔｒａｃｒＲＮＡ配列が本技術分野において公知であり、一例として、以下のｔｒａｃｒＲＮＡおよびその活性部分が挙げられる。本明細書で用いられる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性部分はＣａｓ９またはｄＣａｓ９などのＣａｓタンパク質と複合体を形成する能力を保持している。例えば、ＷＯ２０１４１４４５９２を参照のこと。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドＲＮＡを作製する方法は本技術分野において公知である。例えば、ＷＯ２０１４０９９７５０、ＵＳ２０１４０１７９００６およびＵＳ２０１４０２７３２２６を参照のこと。これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に引用されている。

ある実施形態においては、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性とガイド配列とは２つの異なるＲＮＡ分子であり、これらがともにガイドＲＮＡおよび関連するスキャホールドを形成する。この場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有する分子はガイド配列を有する分子と（通常は塩基対形成によって）相互作用することができなくてはならない。

リクルーティングＲＮＡモチーフ
ＲＮＡスキャホールドの第３のサブ構成要素は、リクルーティングＲＮＡモチーフであり、これは修正モジュールと配列認識モジュールとを連結する。この連結は本明細書に記載のプラットフォームにとって重要なものである。

エフェクター／ＤＮＡ編集酵素を標的配列に動員する１つの方法は、エフェクタータンパク質をｄＣａｓ９に直接融合することである。配列認識に必要なタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）へのエフェクター酵素（「修正モジュール」）の直接的な融合は、配列特異的な転写の活性化または抑制によって可能であるが、タンパク質－タンパク質の融合の設計によって空間的な障害が発生する可能性があり、活性を発揮するためには多量化複合体を形成する必要がある酵素にとってこのことは理想的であるとは言えない。実際に、ほとんどのヌクレオチド編集酵素（例えば、ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣ３Ｇなど）は、ＤＮＡ編集の触媒活性を発揮するのに二量体、三量体またはより高次のオリゴマーの形成を必要とする。所定のコンホメーションでＤＮＡに対してアンカリングするｄＣａｓ９への直接的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害となりうる。

これに対し、本明細書に記載のプラットフォームは、ＲＮＡスキャホールドが媒介するエフェクタータンパク質の動員に基づくものである。より具体的に、当該プラットフォームは、種々のＲＮＡモチーフ／ＲＮＡ結合タンパク質の結合対の利点を活用するものである。この目的に向けて、ＲＮＡスキャホールドはＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質、ＭＣＰ）に特異的に結合するＲＮＡモチーフ（例えば、ＭＳ２オペレーターモチーフ）がｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲスキャホールドに連結されるように設計される（図１Ｂ）。

その結果、本明細書に記載の当該プラットフォームのこのＲＮＡスキャホールド構成要素は、設計されたＲＮＡ分子であり、特異的なＤＮＡ／ＲＮＡの配列認識のためのｇＲＮＡモチーフ（すなわち、ｄＣａｓ９結合のためのＣＲＩＳＰＲＲＮＡモチーフ）のみならず、エフェクターの動員のためのリクルーティングＲＮＡモチーフをも備えている（図１Ｂ）。このようにして、動員されたエフェクタータンパク質融合物は、そのリクルーティングＲＮＡモチーフへの結合能を通じて標的部位へと動員されうる。ＲＮＡスキャホールドが媒介する動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、三量体またはオリゴマーが標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列の近傍で比較的容易に形成されやすい。立体配置の例を図１Ｂ～図１Ｅに示す。これらのＲＮＡリクルーティングモチーフ／結合タンパク質の対は、天然源（例えば、ＲＮＡファージまたは酵母テロメラーゼ）に由来するものであってもよいし、人工的に設計されたもの（例えば、ＲＮＡアプタマーおよびこれに対応する結合タンパク質リガンド）であってもよい。ＣａｓＲｃｕｒｅシステムにおいて用いられうるリクルーティングＲＮＡモチーフ／ＲＮＡ結合タンパク質の対の例の非制限的な一覧を表２に示す。

上述した結合対のための配列を以下に示す。

ＲＮＡスキャホールドは、単一のＲＮＡ分子であってもよいし、複数のＲＮＡ分子の複合体であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲモチーフおよびリクルーティングＲＮＡモチーフが、１つの長い単一のＲＮＡ分子の３つのセグメントであってもよい。あるいは、これらの１つ、２つまたは３つが別々の分子に存在していてもよい。後者の場合、当該３つの構成要素は、共有結合または、例えばワトソン－クリック塩基対結合などの非共有結合を介して互いに連結されてスキャホールドを形成しうる。

一例において、ＲＮＡスキャホールドは２つの異なるＲＮＡ分子を含みうる。第１のＲＮＡ分子は、プログラム可能なガイドＲＮＡと、自身と相補的な領域とともにステム二本鎖構造を形成しうる領域とを含みうる。そして第２のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲモチーフおよびリクルーティングＲＮＡモチーフに加えて、上述した相補的な領域を含みうる。このステム二本鎖構造を介することで、第１および第２のＲＮＡ分子は本発明のＲＮＡスキャホールドを形成する。一実施形態において、第１および第２のＲＮＡ分子はそれぞれ他の配列との間で塩基対を形成する（約６～約２０ヌクレオチドの）配列を含む。同様にして、ＣＲＩＳＰＲモチーフおよびリクルーティングＤＮＡモチーフもまた、異なるＲＮＡ分子に存在していてもよいし、他のステム二本鎖構造を用いて一体化されてもよい。

本発明のＲＮＡおよび関連するスキャホールドは、細胞ベースの発現、インビトロでの転写、および化学合成などの本技術分野において公知の種々の方法により作製されうる。ＴＣ－ＲＮＡ化学（例えば、米国特許８，２０２，９８３号を参照）を利用することで相対的に長い（２００マーまたはそれ以上の）ＲＮＡを化学的に合成することが可能であり、基本的な４つのリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）により作製されるＲＮＡよりも優れた特別な機能を備えたＲＮＡを作製することができる。

Ｃａｓタンパク質－ガイドＲＮＡスキャホールド複合体は、本技術分野において公知の宿主細胞系またはインビトロでの翻訳－転写系を利用した組み換え技術を用いて作製されうる。これらのシステムおよび技術の詳細については、例えば、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３が参照され、その内容は全体が参照により本明細書に引用されている。この複合体は、少なくともある程度、当該複合体が作製された細胞を構成する細胞物質またはインビトロでの翻訳－転写系から、単離または精製されてもよい。

ＲＮＡスキャホールドは、１つまたはそれ以上の修飾を含みうる。このような修飾としては、少なくとも１つの非天然のヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチド、またはそれらの類似体を含めることが挙げられる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分、リン酸部分および／または塩基部分において修飾されうる。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体または２’－フルオロ類似体を含みうる。核酸の骨格が修飾されてもよく、例えばホスホロチオエート骨格が用いられてもよい。ロックト核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）を使用することも可能である。修飾塩基のさらなる例としては、以下に制限されないが、２－アミノプリン、５－ブロモウリジン、シュードウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。これらの修飾は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素に適用されうる。好ましい実施形態において、これらの修飾はＲＮＡ構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ配列）に対してなされる。

ｃ．エフェクター：非ヌクレアーゼＤＮＡ修飾酵素
本発明に記載のプラットフォームの第３の構成要素は、非ヌクレアーゼエフェクターである。このエフェクターはヌクレアーゼではなく、いかなるヌクレアーゼ活性をも有していないが、ＤＮＡ修飾酵素の他の類型の活性を有していてもよい。酵素活性の例としては、以下に制限されないが、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性が挙げられる。ある実施形態では、エフェクターが、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、およびＤＮＡデメチラーゼの活性を有する。

好ましい実施形態において、この第３の構成要素はＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインを有する共役体または融合タンパク質である。これらの２つのドメインは、リンカーを介して結合されうる。

ＲＮＡ結合ドメイン
本発明では種々のＲＮＡ結合ドメインが用いられうるが、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）またはその変異体（ｄＣａｓ９など）のＲＮＡ結合ドメインを用いてはならない。上述したように、所定のコンホメーションでＤＮＡに対してアンカリングするｄＣａｓ９への直接的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害となりうる。その代わりに、本発明では種々の他のＲＮＡモチーフ－ＲＮＡ結合タンパク質の結合対を利用するのである。その例としては、表２に記載のものが挙げられる。

このように、ＲＮＡ結合ドメインがリクルーティングＲＮＡモチーフに結合する能力を介してエフェクタータンパク質が標的部位へと動員されうる。ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、四量体またはオリゴマーが標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列の近傍で比較的容易に形成されうる。

エフェクタードメイン
エフェクター構成要素は、活性を有する部分（すなわち、エフェクタードメイン）を含むものである。ある実施形態では、エフェクタードメインは非ヌクレアーゼタンパク質（例えば、デアミナーゼ）の天然の活性部分を含む。また別の実施形態では、エフェクタードメインは非ヌクレアーゼタンパク質の天然の活性部分の修飾アミノ酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。エフェクタードメインは酵素活性を有する。この活性の例としては、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化活性またはヒストンメチル化活性が挙げられる。非ヌクレアーゼタンパク質（例えばデアミナーゼ）におけるいくつかの修飾は、オフターゲット効果を減少させることを支援しうる。例えば、以下に述べられるように、ＡＩＤ中のＳｅｒ３８をＡｌａへと変異させることにより（配列番号：５１）、オフターゲット部位へのＡＩＤの動員を減少させることができる。

リンカー
上述した２つのドメイン並びに本明細書に記載の他のドメインは、これらに限定されないが、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、またはタンパク質融合、あるいは当業者に公知の任意の手段などのリンカーによって連結されうる。この連結は非可逆的でも可逆的であってもよい。例えば、米国特許第４６２５０１４号、第５０５７３０１号および第５５１４３６３号、米国特許出願公開第２０１５０１８２５９６号および第２０１０００６３２５８号、並びにＷＯ２０１２１４２５１５を参照のこと（これらの内容はその全体が参照により本明細書に引用される）。ある実施形態では、共役体中の各リンカーおよび各タンパク質ドメインの所望の特性を利用するため、いくつかのリンカーが含まれうる。例えば、柔軟なリンカーと共役体の溶解性を高めるリンカーが単独でまたは他のリンカーとともに用いられる。ペプチドリンカーは、当該リンカーをコードするＤＮＡを発現させることにより、共役体中の１つ以上のタンパク質ドメインに連結されうる。リンカーは、酸により開裂するものであってもよいし、光により開裂するものであってもよいし、熱に対して感受性のものであってもよい。共役の方法は当業者によく知られており、本発明での使用に包含される。

ある実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインは、ペプチドリンカーによって連結されうる。ペプチドリンカーは、これら２つのドメインとリンカーとをインフレームでコードする核酸を発現させることによって連結されうる。場合により、リンカーペプチドはこれらのドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または双方で連結されうる。いくつかの例では、リンカーは免疫グロブリンのヒンジ領域のリンカーであり、この技術は米国特許第６，１６５，４７６号、第５，８５６，４５６号、米国特許出願公開第２０１５０１８２５９６号および第２０１０／００６３２５８号、並びに国際出願ＷＯ２０１２／１４２５１５号に開示されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に引用される。

他のドメイン
エフェクター融合タンパク質は他のドメインを含みうる。ある実施形態において、エフェクター融合タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含みうる。一般に、ＮＬＳは一続きの塩基性アミノ酸を含む。各局在化シグナルは本技術分野において公知である（例えば、Ｌａｎｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５を参照）。ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置してもよいし、内部の領域に位置していてもよい。

ある実施形態において、融合タンパク質は、当該タンパク質の標的細胞中への送達を促進するために少なくとも１つの細胞透過ドメインを含みうる。一実施形態において、細胞透過ドメインは細胞透過ペプチド配列でありうる。種々の細胞透過ペプチド配列が本技術分野において公知であり、その例としては、ＨＩＶ－１ＴＡＴタンパク質、ヒトＨＢＶのＴＬＭ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２のものや、ポリアルギニンペプチド配列が挙げられる。

さらに他の実施形態において、融合タンパク質は少なくとも１つのマーカードメインを含みうる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグおよびエピトープタグが挙げられる。ある実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質でありうる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグおよび／またはエピトープタグでありうる（例えば、米国特許出願第２０１４０２７３２３３号を参照）。

一実施形態では、当該システムがどのように作動するかを説明するための例としてＡＩＤを用いた。ＡＩＤは、ＤＮＡまたはＲＮＡとの関連でシチジンの脱アミノ化反応を触媒するシチジンデアミナーゼである。標的部位まで運ばれると、ＡＩＤはＣ塩基をＵ塩基に変換する。***細胞において、これはＣからＴへの点変異を引き起こしうる。あるいは、ＣからＵへの変換は細胞のＤＮＡ修復経路（主に切除による修復経路）を誘導し、これによってＵ－Ｇ塩基対のミスマッチを除去し、Ｔ－Ａ、Ａ－Ｔ、Ｃ－ＧまたはＧ－Ｃ対で置換しうる。その結果、標的であるＣ－Ｇ部位において点変異が生じうる。切除による修復経路はすべてではないもののほとんどの体細胞に存在することから、標的部位へのＡＩＤの動員によりＣ－Ｇ塩基対が他の対へと修正されうる。この場合、Ｃ－Ｇ塩基対が体細胞において潜在的に疾患の原因となっている遺伝子変異である場合には、上述のアプローチは変異を修正することによって疾患を治療するために用いられうる。

同様にして、潜在的に疾患の原因となっている遺伝子変異が特定部位のＡ－Ｔ塩基対である場合には、同様のアプローチを採用して当該特定部位にアデノシンデアミナーゼを動員し、これによってＡ－Ｔ塩基対を他の対へと修正することができる。他のエフェクター酵素は、塩基対形成における他のタイプの変換を生じることが予想される。ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素の非制限的な例の一覧を表３に示す。

上述した特定の３つの構成要素は技術的なプラットフォームを構成する。各構成要素については、表１～３に記載の一覧からそれぞれ選択することができ、これによって特定の治療／有用性の目標が達成される。

一例として、（ｉ）配列標的化タンパク質としての化膿連鎖球菌由来のｄＣａｓ９、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡモチーフおよびＭＳ２オペレーターモチーフを含むＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）ＭＳ２オペレーター結合タンパク質ＭＣＰに融合したヒトＡＩＤを含むエフェクター融合物を用いて、ＣａｓＲｃｕｒｅシステムを構築した。各構成要素の配列を以下に示す。

（Ｎ_２０：プログラム可能な配列；下線：ＣＲＩＳＰＲＲＮＡモチーフ；太字：ＭＳ２モチーフ；イタリック：終止）
１つのＭＳ２ループ（１ｘＭＳ２）を含む上記ＲＮＡスキャホールド。２つのＭＳ２ループ（２ｘＭＳ２）を含み、ＭＳ２スキャホールドに下線が引かれたＲＮＡスキャホールドを以下に示す：

上述したＣａｓタンパク質と同様、非ヌクレアーゼエフェクターもまた、組み換えポリペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドの作製技術は本技術分野において公知である。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照のこと。

本明細書に記載されるように、ＡＩＤにおいてＳｅｒ３８をＡｌａへと変異させることにより、ＡＩＤのオフターゲット部位への動員を減少させることができる。ＡＩＤ＿Ｓ３８Ａ（リン酸化ヌル、ｐｎＡＩＤ）および野生型ＡＩＤの両方のＤＮＡおよびタンパク質の配列を以下に示す：

本明細書に記載のプラットフォーム／システムの上述した３つの構成要素は、１～３個の発現ベクターを用いて発現させることができる。当該システムは、実質的にいかなるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をも標的化するようにプログラムされうる。

発現系
上述したプラットフォームを用いるには、タンパク質およびＲＮＡの１つ以上の構成要素を、これらをコードする核酸から発現させることが好ましい。これは種々の方法で実施されうる。例えば、ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸を１つ以上の中間体ベクターにクローニングし、これを原核細胞または真核細胞に導入して複製および／または転写させることが可能である。ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質を製造するための、ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸の貯蔵または操作の点で、中間体ベクターは、典型的には原核生物のベクター（例えば、プラスミド、シャトルベクター、昆虫ベクター）である。当該核酸はまた、植物細胞、動物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞またはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために１つ以上の発現ベクターにクローニングされてもよい。よって、本発明は、上述したＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質の任意のものをコードする核酸を提供する。好ましくは、当該核酸は単離および／または精製されている。

本発明はまた、上述したＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質の１つ以上をコードする配列を有する組み換え構築物またはベクターをも提供する。当該構築物の例としては、ベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）に本発明の核酸配列がフォワード方向またはリバース方向で挿入されたものが挙げられる。好ましい実施形態において、当該構築物は、当該配列に作動的に連結されたプロモーターなどの制御配列を含む。適切なベクターおよびプロモーターは当業者にとって数多く知られており、市販もされている。原核宿主および真核宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）にも記載されている。

ベクターとは、自身が連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターは、自己を複製し、または宿主ＤＮＡへ取り込まれる能力を有している。ベクターの例としては、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。本発明のベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で当該核酸を含む。好ましくは、ベクターは発現されるべき核酸配列に作動的に連結された１つ以上の制御配列を含む。「制御配列」としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列としては、ヌクレオチド配列の構成的な発現を指示するものだけでなく、誘導性の制御配列であってもよい。発現ベクターの設計は、形質転換され、形質導入され、または感染させられる宿主細胞、所望のＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルなどの選択といった因子に依存しうる。

発現ベクターの例としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、宿主中で複製可能であって生存可能である限り、他の任意のベクターが用いられてもよい。適当な核酸配列は、種々の方法によってベクター中に挿入されうる。一般に、上述したＲＮＡまたはタンパク質の１つをコードする核酸配列が、本技術分野において公知の手法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されうる。かような手法および関連するサブクローニングの手法は当業者の知見の範囲内のものである。

ベクターは、発現を増幅するための適当な配列を含みうる。また、発現ベクターは、好ましくは１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有することで、真核細胞の培養でのジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌でのアンピシリン耐性といった、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供することができる。

ＲＮＡを発現するベクターは、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、ＨＩプロモーター、Ｕ６プロモーターまたは７ＳＫプロモーター）を含むことでＲＮＡの発現を促進することができる。これらのヒトプロモーターによれば、哺乳動物細胞におけるＲＮＡの発現およびその後のプラスミドのトランスフェクションが可能となる。あるいは、インビトロでの転写のためにＴ７プロモーターが用いられてもよく、ＲＮＡはインビトロで転写されて精製されてもよい。

上述した適当な核酸配列を含有するベクターおよび適当なプロモーター配列または制御配列は、適当な宿主を形質転換し、これにトランスフェクションされ、または感染して、当該宿主に上述したＲＮＡまたはタンパク質を発現させることができる。適当な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌、放線菌、ネズミチフス菌）、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ、ヨトウガ（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３）、アデノウイルス、および植物細胞が挙げられる。適当な宿主の選択は、当業者の知見の範囲内のものである。ある実施形態において、本発明は、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、これにトランスフェクションし、これに感染させることによる上述したＲＮＡまたはタンパク質の製造方法を提供する。宿主細胞は次いで、適当な条件下で培養され、これによってＲＮＡまたはタンパク質の発現が可能となる。

外来のヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための本技術分野において公知の任意の手法が用いられうる。例としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーマルおよび組み込み型の双方）、並びに、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の任意の周知の方法が挙げられる。

方法
本発明の他の形態は、細胞、胚、ヒトまたは非ヒト動物における標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体の配列）または標的ＲＮＡ配列の修飾方法に関するものである。当該方法は、上述した（ｉ）配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドを細胞または胚に導入することを含む。ＲＮＡスキャホールドは、配列標的化タンパク質および融合タンパク質を標的部位における標的ポリヌクレオチドへとガイドし、融合タンパク質のエフェクタードメインがその配列を修飾する。本明細書に記載のように、ｃａｓ９タンパク質などの配列標的化タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を失うように修飾されている。

ある実施形態において、エフェクタータンパク質は単量体として機能する。この場合、本発明のシステムは、図１Ｃに示すように、標的部位の上流（左）または下流（右）のいずれかの単一の部位に標的化される。他の実施形態では、適切な触媒作用のためにエフェクタータンパク質は二量化を必要とする。この目的に向けて、当該システムは多量化されて標的部位の上流および下流の標的配列を同時に標的化され、これによってエフェクタータンパク質の二量化を可能とすることができる（図１Ｄ、左）。あるいは、単一部位へエフェクタータンパク質が動員されるだけでも、隣接するエフェクタータンパク質に対するその親和性を増大させて二量化を促進するのに十分であることもある（図１Ｄ、右）。さらに他のある実施形態では、図１Ｅに示すように、三量体のエフェクター酵素が標的部位に動員されて配置されうる。これは、二重の標的化（図１Ｅ、左）または単一の標的化（図１Ｅ、右）によって達成されうる。本発明に開示されているシステムは、ＲＮＡの標的を編集するのに用いられてもよい（例えば、レトロウイルスの不活性化）。図１Ｆを参照のこと。この場合、エフェクタータンパク質が機能性オリゴマーの集合体を必要とするのであれば、図１Ｄおよび図１Ｅの右パネルのように、ＲＮＡ分子への単一の標的化によってオリゴマー化が促進されうる。

標的ポリヌクレオチドについて、ＰＡＭ配列がその直後（下流または３’）に存在すること以外は配列の制限はない。ＰＡＭ配列の例としては、これらに限定されないが、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドと定義され、ＷはＡまたはＴと定義される）が挙げられる。ＰＡＭ配列の他の例は上述したとおりであり、当業者であれば所定のＣＲＩＳＰＲタンパク質とともに用いるための他のＰＡＭ配列を同定することができるであろう。標的部位は、遺伝子のコード領域中、遺伝子のイントロン中、遺伝子間の制御領域中などに存在しうる。当該遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってもよいし、ＲＮＡをコードする遺伝子であってもよい。

標的ポリヌクレオチドは、細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドでありうる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドでありうる。また、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列であってもよいし、非コード配列（例えば、制御ポリヌクレオチド）であってもよい。

本発明に係るシステムのタンパク質構成要素は、単離されたタンパク質として細胞または胚の内部へ導入されうる。一実施形態において、各タンパク質は少なくとも１つの細胞透過ドメインを含むことができ、これによってタンパク質の細胞への取り込みが促進される。他の実施形態において、タンパク質またはタンパク質類をコードするｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が細胞または胚の内部へ導入されてもよい。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は一般に、所望の細胞または胚の内部で機能するプロモーター配列に作動的に連結されている。ＤＮＡ配列は線状であってもよいし、ＤＮＡ配列はベクターの一部であってもよい。さらに他の実施形態において、タンパク質は、当該タンパク質および上述したＲＮＡスキャホールドを含むＲＮＡ－タンパク質複合体として細胞または胚の内部へ導入されてもよい。

別の実施形態において、当該タンパク質をコードするＤＮＡは、ＲＮＡスキャホールドの構成要素をコードする配列または配列群を含みうる。タンパク質およびＲＮＡスキャホールドをコードするＤＮＡ配列は一般に、細胞または胚の内部において、当該タンパク質およびＲＮＡスキャホールドのそれぞれの発現を可能とする適当なプロモーター制御配列に作動的に連結されている。当該タンパク質およびＲＮＡスキャホールドをコードするＤＮＡ配列は、追加の発現をコントロールする配列、制御配列、および／またはプロセシング配列をさらに含みうる。当該タンパク質およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、線状であってもよいし、ベクターの一部であってもよい。

ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を介して当該ＲＮＡを細胞中へ導入する実施形態では、ＲＮＡをコードする配列は真核細胞におけるガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動的に連結されていてもよい。例えば、ＲＮＡをコードする配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動的に連結されていてもよい。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、哺乳動物のＵ６またはＨ１プロモーターが挙げられる。例示的な実施形態において、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに連結される。他の例示的な実施形態において、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターに連結される。

タンパク質および／またはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、線状または環状でありうる。ある実施形態では、ＤＮＡ配列はベクターの一部であってもよい。適切なベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターが挙げられる。例示的な実施形態において、タンパク質および／またはＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター中に存在する。適切なプラスミドベクターの非制限テイナ例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびこれらの変異体が挙げられる。ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製の起点などを含みうる。

本発明に係る本システムのタンパク質構成要素（またはこれをコードする核酸）およびＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ）は、種々の手段によって細胞または胚中に導入されうる。典型的に、胚は所望の種の単細胞段階の受精胚である。ある実施形態において、細胞または胚はトランスフェクションされている。トランスフェクションの適切な方法としては、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション、ヌクレオフェクション（またはエレクトロポレーション）、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルストランスダクション、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソーム性脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃による送達、インパレフェクション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、および専売薬剤で促進される核酸の取り込みが挙げられる。トランスフェクションの方法は、本技術分野において周知である（例えば、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００３または“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照）。他の実施形態において、分子はマイクロインジェクションによって細胞または胚中に導入される。例えば、分子は単細胞の胚の前核中にインジェクションされうる。

本発明に係る本システムのタンパク質構成要素（またはこれをコードする核酸）およびＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ）は、細胞または胚中に同時または逐次的に導入されうる。ＲＮＡ（または当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ）に対するタンパク質（またはこれをコードする核酸）の比率は通常、これらがＲＮＡ－タンパク質複合体を形成できるようにほぼ化学量論的なものである。同様に、２つの異なるタンパク質（またはこれをコードする核酸）の比率もまた、ほぼ化学量論的なものである。一実施形態において、タンパク質構成要素およびＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ配列）は、同一の核酸またはベクター内で一緒に送達される。

この方法は、ガイドＲＮＡがエフェクタータンパク質を標的配列の標的部位へとガイドし、エフェクタードメインが標的配列を修飾することができるように、細胞または胚を適切な条件下で維持することをさらに含む。

一般に、細胞は細胞の増殖および／または維持のために適切な条件下で維持されうる。適切な細胞培養条件は本技術分野において周知であり、例えば、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ
ａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００３または“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｎｔｉａｇｏｅｔａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ１０５：５８０９－５８１４；Ｍｏｅｈｌｅｅｔａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ１０４：３０５５－３０６０；Ｕｒｎｏｖｅｔａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５：６４６－６５１；およびＬｏｍｂａｒｄｏｅｔａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５：１２９８－１３０６に記載されている。当業者であれば、細胞培養の方法が本技術分野において公知であって細胞のタイプによって変動しうるものであることを理解している。すべての場合において、特定の細胞のタイプに最適な技術を決定するのに通常の最適化がなされうる。

胚はインビトロで培養されうる（例えば、細胞培養）。典型的には、胚は適切な温度で、かつ適切な（必要に応じてタンパク質およびＲＮＡスキャホールドの発現を可能とするのに必要なＯ_２／ＣＯ_２比の）培地中で培養される。適切な培地の非制限的な例としては、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣおよびＨＴＦ培地が挙げられる。当業者であれば、培養条件が胚の種によって変動しうるものであることを理解している。すべての場合において、特定の胚の種に最適な技術を決定するのに通常の最適化がなされうる。場合によっては、インビトロで培養された胚から細胞株が得られてもよい（例えば、胚性幹細胞株）。

あるいは、胚は雌の宿主の子宮中に移されることにより、インビボで培養されてもよい。一般的に言えば、雌の宿主は上記胚と同一または類似の種から選ばれる。好ましくは、当該雌の宿主は偽妊娠のものである。偽妊娠の雌の宿主を作製する手法は本技術分野において公知である。さらに、胚を雌の宿主中に移す手法も公知である。胚をインビボで培養することで当該胚を発育させ、当該胚に由来する動物を出産させることが可能である。このような動物は、体のすべての細胞において修飾された染色体配列を含んでいる。

種々の真核細胞が、この方法において適切に用いられる。例えば、当該細胞はヒトの細胞、ヒトではない哺乳動物の細胞、哺乳動物ではない脊椎動物の細胞、無脊椎動物の細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞の真核有機体でありうる。種々の胚もまた、この方法において適切に用いられる。例えば、当該胚は、１細胞、２細胞または４細胞の、ヒトのまたは非ヒト哺乳動物の胚でありうる。単細胞の胚を含む例示的な哺乳動物の胚としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサギ、ネコ科動物、イヌ科動物、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよび霊長類の胚が挙げられる。さらに他の実施形態において、当該細胞は幹細胞である。適切な幹細胞としては、これらに限定されないが、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児の幹細胞、成人の幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡能性幹細胞、単分化能幹細胞などが挙げられる。例示的な実施形態においては、当該細胞が哺乳動物の細胞であるか、または当該胚が哺乳動物の胚である。

ＣＲＩＳＰＲに基づいて特定のヌクレオチドを標的とする場合の１つの制限は、最も近いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関する標的ヌクレオチドの位置である。理想的には、標的ヌクレオチドは、ＰＡＭから遠位にあるプロトスペーサーの５’末端から数えて４位～８位の間になくてはならない。しかしながら、実際には、これはすべての標的については達成できない可能性がある（図８Ａ）。この課題を解決するため、本発明は、標的ヌクレオチド（標的部位の上流の１つのｇＲＮＡ、標的部位の下流の１つのｇＲＮＡ）周辺の２つの配列（ｇＲＮＡによってガイドされる）を認識する標的化モジュールとして例えばＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を使用して、ｃｉｓで互いに近く、すなわち同じＤＮＡ鎖上に２つのニックを導入するシステムも提供する。このように、一続きのｓｓＤＮＡは、一時的に曝露されて、ＣＲＣエフェクターモジュールがヌクレオチド変換を触媒し、続いて鎖修復の際に導入された修飾の固定が行われることを可能とする（図８Ｂ）。

この戦略は、変換効率を大幅に高める。ＰＡＭの空間的／位置的な要求のために従来は標的化ができなかったか、または標的とすることが非常に困難であった配列を標的とすることが可能となる。さらに、この技術は、さらに以下の利点を有する：（１）ＣＲＣシステム中の特定のゲノム領域を標的とするように２つのｇＲＮＡをプログラムすることが、標的化の特異性を高め、オフターゲット効果を減少させる；（２）ＣＲＣシステムへの機能的なモジュール（複数の場合もある）の柔軟な付加が、相乗的に変換効率を増強し、特異性を高め、オフターゲット効果を減少させることを可能とする。

下記実施例４に示されるように、細菌遺伝子変換モデルにおいて変換効率を増強するためにこのＣｉｓダブルニッキング技術を適用する研究を行った（図９）。実験的には、ｎＣａｓ９（ｎＣａｓ９_Ｄ１０ＡまたはｎＣａｓ９_Ｈ８４０）は、同じＤＮＡ鎖上の２つの隣接する位置を標的とするようにプログラムされた。２つのｇＲＮＡを有する同じ鎖をダブルニッキングすることは、二本鎖ＤＮＡ切断またはＤＳＢ修復経路の活性化を誘導しないため、これは安全なアプローチである。手順の概要を図８に記載する。このアプローチを試験するため、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ｒｐｏＢ）をコードする細菌遺伝子を、ｇＲＮＡであるＴＳ－２およびＴＳ－３を使用して標的化した（図９Ａ）。これは、特定のｒｐｏＢ変異体が抗生物質リファンピシンに耐性（Ｒｉｆ^Ｒ）であることから、この薬物を使用して当該変異体を選択することができる陰性選択システムである。原核細胞における結果は、標的化効率が１００倍まで増強されうることを示唆する（図９Ｂ）。

ＣＲＣのモジュール設計の利用により、本発明は、２つのエフェクター（同一または異なる）を標的配列に動員して、相乗的に遺伝子変換を増強することができる方法も提供する。これらの設計を図１０に例示する。例えば、両方のｇＲＮＡを同じリクルーティングＲＮＡモチーフ（例えば、ＭＳ２スキャホールド）を有するように作製することができ、ＭＣＰタンパク質に融合されたＣＲＣエフェクターは両方のニッキング部位へと動員されうる（図１０Ａ）。これは、標的配列に２つの同一のエフェクターを動員して、エフェクターの局所濃度を高めるか、またはエフェクター機能に必要な二量体化もしくは多量体化を促進することを可能とする。

同様に、本発明は、それぞれ、リクルーティングＲＮＡモチーフ有するまたはそれを有しないｇＲＮＡを選択することによって、ＣＲＣエフェクターをニッキング部位のいずれかへと動員するか、またはそこから除外することができる方法も提供する（図９Ｂおよび図１０Ｂ）。これは、１つのエフェクターを動員することを可能とするが、一本鎖ＤＮＡを曝露し、エフェクター機能を促進する。

別の例では、本発明は、同じ標的配列に２つの異なる機能的エフェクターを動員する方法を提供する。２つのエフェクターは、遺伝子変換を促進するように互いに相乗的にはたらく。例えば、標的化効率をさらに高めるため、標的ヌクレオチドに近いニッキング部位にデアミナーゼ（例えばＡＩＤ）のＣＲＣ動員、および第２のニッキング部位に局所ＤＮＡ修復阻害剤（例えばＵＮＧ阻害剤、ＵＧＩ）の動員をプログラムすることができる。ＡＩＤが、例えば標的配列のＣのＴへの変換を促進しながら、ＵＧＩは内因性修復経路を局所的に阻害する。これら２つのエフェクターは、そのようにして標的部位で特異的に協働し、変換効率を増強する。ＣＲＣ動員部位と阻害剤動員部位の間のクロストークを回避するため、オルソロガスなリクルーティングＲＮＡモチーフをこれらのモジュール（例えば、ＭＳ２－ＭＣＰはＭＣＰに融合されたＣＲＣエフェクターＡＩＤを動員し、ＰＰ７－ＰＣＰはＰＣＰに融合されたＵＧＩを動員する）の各々に使用することができる（図１０Ｃ）。

また、ある実施形態では、ヘテロ二量体化が適切なエフェクター活性に必要な場合、ヘテロ動員の立体配置も適用されうる。また、効果的に機能するように少なくとも２つの構成要素を必要とする任意の遺伝子変換酵素系に対してもヘテロ動員の立体配置が適用されうる。リクルーティングＲＮＡスキャホールドおよびそれらのＲＮＡ結合タンパク質パートナーの非網羅的な一覧を表２に要約する。最後に、ｃｉｓダブルニッキングに対してＰＡＭ配列の制限がある場合、どのＰＡＭ配列が標的化部位の近くで利用可能であるかに応じて、化膿連鎖球菌以外の種に由来するＣａｓ９オルソログをプログラムすることもできる（図１０Ｄ）。異なる種に由来するＣａｓ９オルソログの非網羅的な一覧を表１に要約する。

有用性および用途
本明細書に開示のシステムおよび方法は、非常に多くのタイプの細胞における標的ポリヌクレオチドを修飾し、編集する（例えば、不活性化および活性化する）といった広範な有用性を有するものである。このように、本システムおよび方法は、例えば研究および治療において広範な用途のスペクトルを有している。

ヒトにおける重篤な疾患の多くは、１つの共通の原因、遺伝子の変化または変異、を有している。患者において疾患を引き起こす変異は、自身の親からの継承により獲得されるか、または環境要因によって引き起こされる。これらの疾患としては、これに限定されないが、以下のようなカテゴリーが挙げられる。第一に、いくつかの遺伝子障害は生殖系列細胞の変異によって引き起こされる。その一例は嚢胞性線維症であり、これは親から受け継がれるＣＦＴＲ遺伝子における変異によって引き起こされる。変異体ＣＦＴＲにおける第２のサプレッサー変異は、体細胞組織においてＣＦＴＲタンパク質の機能を部分的に回復することができる。本発明者らの技術によって修正することができる点遺伝子変異によって引き起こされる他の遺伝子疾患の例としていくつかを挙げると、ゴーシェ病、アルファトリプシン欠乏性疾患、鎌状赤血球貧血が挙げられる。第二に、慢性のウイルス感染性疾患などのいくつかの疾患は、外因性の環境要因によって引き起こされ、遺伝子の変化を生じる。その一例はＡＩＤＳであり、これはヒトＨＩＶウイルスのゲノムが感染したＴ細胞のゲノム中に挿入されることによって引き起こされる。第三に、いくつかの神経変性疾患が遺伝子の変化に関係している。その一例はハンチントン病であり、これは罹患した患者のハンチンチン遺伝子においてＣＡＧの３つのヌクレオチドが伸長することによって引き起こされる。最後に、がんはがん細胞中に蓄積した種々の体細胞の変異によって引き起こされる。したがって、疾患の原因となる遺伝子変異を修正するか、またはその配列を機能的に修正すれば、これらの疾患を治療するための魅力的な治療機会が提供される。

体細胞の遺伝子編集は、多くのヒト疾患に対する魅力的な治療戦略である。治療的な遺伝子編集を成功裡に達成するには、（ｉ）いかにして配列特異的な認識を達成するか（「配列認識モジュール」）；（ｉｉ）いかにして根本的な変異を修正するか（「修正モジュール」）；および（ｉｉｉ）いかにして「修正モジュール」を「配列認識モジュール」と一緒になるように連結して配列特異的な修正を達成するか、の３つの重要な因子を考慮する必要がある。これらの個々の課題を達成する方法は数多く存在する。しかしながら、現状のプラットフォームまたは技術はいずれも、最適かつ実用的な体細胞の遺伝子編集を達成することはできていない。より詳細に、現状の遺伝子特異的な編集技術は、そのほとんどがヌクレアーゼ誘導性のＤＮＡＤＳＢとそれによって生じるＤＳＢ誘導性の相同組み換えを利用したものであるが、ほとんどの体細胞においてその活性は低いかまたは存在しない。よって、ほとんどの疾患で、体細胞組織における病理学的な遺伝子変異の治療的な修正に対するこれらの技術の用途は限定されている。

これに対し、本発明により開示されているシステムおよび方法によれば、ヌクレアーゼ活性に依拠することなく、遺伝子またはＲＮＡ転写物をＤＮＡ配列特異的に編集することが可能である。当該システムおよび方法はＤＳＢを生成せず、またＤＳＢ媒介性の相同組み換えに依拠することもない。さらに、本システムのこのような設計はモジュラー式であることから、所望の任意のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を標的化するための極めてフレキシブルで簡便な方法が提供される。すなわち、このアプローチによればＤＮＡまたはＲＮＡを編集する酵素を、事実上、幹細胞などの体細胞中の任意のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列へとガイドすることができる。標的となるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の正確な編集により、当該酵素は遺伝子障害における変異した遺伝子を修正し、感染した細胞においてはウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因となるタンパク質の発現を抑制し、あるいはがんにおいてはがん原性のタンパク質をサイレンシングすることができる。したがって、本発明において開示される当該システムおよび方法は、上述した遺伝子障害、慢性の感染性疾患、神経変性疾患およびがんなどの疾患における根本的な遺伝子の変化を修正するのに用いられうる。

遺伝子疾患
６０００超の遺伝子疾患が既知の遺伝子変異によって引き起こされていると推定されている。病理学的な組織／器官における疾患の原因となる根本的な変異を修正すれば、当該疾患の緩和または治癒がもたらされうる。例えば、嚢胞性線維症は米国において３０００人に１人が罹患している。この疾患はＣＦＴＲ遺伝子の変異が遺伝することによって引き起こされており、７０％の患者が同一の変異（５０８位のフェニルアラニンの欠損をもたらす３ヌクレオチドの欠損（ΔＰｈｅ５０８と称される））を有している。ΔＰｈｅ５０８はＣＦＴＲの誤配置および分解をもたらす。本発明に開示された本システムおよび方法は、罹患した組織（肺）においてＶａｌ５０９残基（ＧＴＴ）をＰｈｅ５０９（ＴＴＴ）に変換するのに用いられ、これによってΔＰｈｅ５０８変異を機能的に修正することができる。さらに、変異体ΔＰｈｅ５０８ＣＦＴＲ中の第２のサプレッサー変異（Ｒ５５３ＱまたはＲ５５３ＭまたはＶ５１０Ｄなど）は、体細胞組織においてＣＦＴＲタンパク質の機能を部分的に回復することができる。

慢性の感染性疾患
本発明に開示された本システムおよび方法はまた、ヒトの細胞／組織中に導入されたウイルスゲノムにおける任意の遺伝子を特異的に不活性化するのに用いられうる。例えば、本発明に開示された本システムおよび方法によれば、ウイルスにとって必須の遺伝子の翻訳を早期に終止させるためのストップコドンを作製することができ、これによって慢性かつ消耗性の感染性疾患を改善または治癒することができる。例えば、ＡＩＤＳの現在の治療法はウイルス量を低減させることはできるものの、潜伏しているＨＩＶを陽性Ｔ細胞から完全に除去することはできない。本明細書に開示の本システムおよび方法は、１つ以上のストップコドンを導入することにより、ヒトＴ細胞において、統合されたＨＩＶゲノム中の１つ以上のＨＩＶの必須の遺伝子の発現を永久に不活性化するのに用いられうる。他の例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。本明細書に開示の本システムおよび方法は、ヒトゲノム中に導入された１つ以上のＨＢＶの必須の遺伝子を特異的に不活性化し、ＨＢＶのライフサイクルをサイレンシングするのに用いられうる。

神経変性疾患
神経変性疾患の中には、機能獲得型変異によって引き起こされるものがある。例えば、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進展をもたらす。本発明に開示された本システムおよび方法は、ストップコドンを導入するか、またはスプライシング部位を変化させることにより、変異を修正し、または変異型タンパク質の発現を抑制するのに用いられうる。

がん
がんの進展には多くの遺伝子（がん抑制遺伝子、がん遺伝子、およびＤＮＡ修復遺伝子など）が関与している。これらの遺伝子が変異すると種々のがんを引き起こすことがよくある。本発明に開示された本システムおよび方法を用いることで、これらの変異を特異的に標的化し、修正することが可能である。その結果、触媒部位またはスプライシング部位に点変異が導入されることで、がんの原因となるタンパク質が機能的に無害化され、あるいはその発現が抑制されうる。

幹細胞の遺伝的修飾
ある実施形態においては、本発明に開示される本システムおよび方法を用いて、幹細胞または前駆細胞が遺伝的に修飾されうる。適切な細胞としては、例えば、幹細胞（成人の幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞など）および前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）が挙げられる。適切な細胞としては、例えば、齧歯動物の幹細胞、齧歯動物の前駆細胞、ヒトの幹細胞、ヒトの前駆細胞などの哺乳動物の幹細胞および前駆細胞が挙げられる。適切な宿主細胞としては、単離された宿主細胞などのインビトロの宿主細胞が挙げられる。

ある実施形態において、本発明は、エクスビボで組織を標的として正確に遺伝的に修飾するのに用いられ、根本的な遺伝的欠陥を修正することができる。エクスビボでの修正の後、組織は患者に戻されてもよい。また、本技術は遺伝子疾患を修正するための細胞ベースの治療法に広範に用いられうる。

動物および植物における遺伝子編集
上述した本システムおよび方法は、１つ以上の所望の遺伝子修飾を有する非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を作製するのに用いられうる。ある実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてホモ接合性である。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてヘテロ接合性である。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は脊椎動物（例えば、魚類（ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚など）、両生類（カエル、サンショウウオなど）、鳥類（ニワトリ、七面鳥など）、爬虫類（ヘビ、トカゲなど）、哺乳類（有蹄動物（ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）；ウサギ目の動物（ウサギなど）；齧歯動物（ラット、マウスなど）；非ヒト霊長類など））である。

本発明は、上述したようなヒトにおける疾患を治療する方法と同様の方法で動物における疾患を治療するのにも用いられうる。あるいは、本発明は、研究、薬剤の開発および標的の評価のための特定の遺伝子変異を有するノックイン動物疾患モデルを作製するのに用いられうる。上述のシステムおよび方法はまた、家畜および穀物の品質を改良および改善する目的で、種々の有機体のＥＳ細胞または胚に点変異を導入するのにも用いられうる。

外因性の核酸を植物細胞中に導入する方法は本技術分野において周知である。適切な方法としては、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバクテリウム媒介性の形質転換などが挙げられる。これらの方法の選択は通常、形質転換される細胞のタイプや形質転換を行う状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。

キット
本発明はさらに、ＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓによりガイドされる標的への結合または修正の反応を含む上述した方法を実施するための試薬を含有するキットをも提供する。この目的に向けて、本明細書に記載の方法のための１つ以上の反応成分（例えば、ＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、融合エフェクタータンパク質および関連する核酸）が使用のためのキットの形態で供給されうる。一実施形態において、当該キットはＣＲＩＳＰＲタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、エフェクタータンパク質、上述したＲＮＡスキャホールドの１つ以上、上述したＲＮＡ分子のセットを含む。他の実施形態において、当該キットは１つ以上の他の反応成分を含んでもよい。このようなキットにおいては、１つ以上の反応成分の適量が、１つ以上の容器中で提供され、または基板上に保持される。

当該キットの追加の成分の例としては、以下に限定されないが、１つ以上の宿主細胞、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための１つ以上の試薬、ＲＮＡもしくはタンパク質の発現を検出し、または標的核酸の状態を確認するための１つ以上の試薬（例えば、プローブまたはＰＣＲプライマー）、および反応のための（１Ｘまたは濃縮形態の）緩衝液または培地が挙げられる。当該キットはまた、以下の成分の１つ以上をも含みうる：支持体、終止試薬、修飾試薬または消化試薬、浸透圧調節物質および検出用装置。

用いられる反応成分は、種々の形態で提供されうる。例えば、当該成分（例えば、酵素、ＲＮＡ、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されるか、またはフリーズドライまたは凍結乾燥された粉末、ペレットまたはビーズでありうる。後者の場合、これらの成分は再構成されると、アッセイに用いるための成分の完全な混合物を生じる。本発明のキットは任意の適切な温度で提供されうる。例えば、液体中のタンパク質成分またはその複合体を含有するキットの貯蔵のため、キットを０℃未満（好ましくは－２０℃以下）で、あるいは凍結状態で提供して維持することが好ましい。

キットまたはシステムは、本明細書に記載の成分の任意の組み合わせを、少なくとも１回のアッセイに十分な量で含有することができる。ある用途においては、１つ以上の反応成分を予め測定された単回使用量で個々のチューブまたは同様の容器中で、典型的には使い捨てのものとして提供してもよい。このように準備しておくと、標的核酸または当該標的核酸を含有するサンプルもしくは細胞を直接個々のチューブに添加することで、ＲＮＡによりガイドされる反応が実施されうる。キット中に供給される成分の量は、任意の適切な量であればよく、当該製品が向けられる対象となる市場に依存しうる。これらの成分が供給される容器は、供給された形態を保持できる従来の任意の容器であればよく、例えば、遠心チューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、瓶または内蔵された検査デバイス（流体デバイス、カートリッジ、ラテラルフローもしくは他の類似のデバイス）でありうる。

当該キットはまた、容器または容器の組み合わせを保持する包装材料をも含みうる。このようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料としては、反応成分または検出プローブを種々の任意の配置で（例えば、バイアル中で、マイクロタイタープレートのウェル中で、マイクロアレイ中で）保持する固体のマトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、マイクロパーティクルなど）が挙げられる。当該キットは、上記の成分の使用のために有形の形式で記録された指示書をさらに含んでもよい。

定義
核酸またはポリヌクレオチドとは、ＤＮＡ分子（例えば、以下に限定されないが、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ分子（例えば、以下に限定されないが、ｍＲＮＡ）を意味し、ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体を含む。ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成されうる。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、修飾された塩基、修飾された主鎖、ＲＮＡ中のデオキシリボヌクレオチドなどの天然には存在しない部分を含んでもよい。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうる。

核酸分子またはポリペプチドについて言及する際の「単離された」との語は、当該核酸分子またはポリペプチドが、自然界においては自身が会合しているかまたは一緒になっていることが観察される少なくとも１つの他の成分を実質的に含有していないことを意味する。

本明細書で用いられる場合、「ガイドＲＮＡ」との語は一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に結合して当該ＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化することができるＲＮＡ分子（またはＲＮＡ分子の包括的な群）を意味する。ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化ガイドセグメントおよびタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含みうる。ＤＮＡ標的化セグメントは、標的配列に対して相補的な（または少なくともストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる）ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチドなどのＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する。これらの２つのセグメントは同一のＲＮＡ分子中に位置していてもよいし、２つ以上の異なるＲＮＡ分子中に存在していてもよい。これらの２つのセグメントが別のＲＮＡ分子中に存在する場合、ＤＮＡ標的化ガイドセグメントを含む分子はＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と称され、タンパク質結合セグメントを含む分子はトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称されることがある。

本明細書で用いられる場合、「標的核酸」または「標的」との語は、標的となる核酸配列を含有する核酸を意味する。標的核酸配列は一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよく、二本鎖ＤＮＡであることがよくある。「標的核酸配列」、「標的配列」または「標的領域」は、本明細書で用いられる場合、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて結合させ、またはこれを用いて修飾しようとする特定の配列またはその相補体を意味する。標的配列は、細胞のゲノム内で、インビトロまたはインビボの核酸内に存在するものであってよく、一本鎖核酸または二本鎖核酸のいかなる形態であってもよい。

「標的核酸の鎖」とは、本明細書に記載のガイドＲＮＡを用いた塩基対形成に供される標的核酸の鎖を意味する。すなわち、ｃｒＲＮＡおよびガイド配列とハイブリダイズする標的核酸の鎖が「標的核酸の鎖」と称される。標的核酸の他方の鎖はガイド配列に対して相補的ではないが、これは「非相補的な鎖」と称される。二本鎖の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の場合、それぞれの鎖はｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡを設計するための「標的核酸の鎖」となることができ、適当なＰＡＭ部位が存在する限り本発明の方法を実施するのに用いられうる。

本明細書で用いられる場合、「由来する」との語は、第１の成分（例えば、第１の分子）または当該第１の成分からの情報が、別の第２の成分（例えば、当該第１の分子とは異なる第２の分子）を単離し、抽出し、または作製するのに用いられるプロセスを意味する。例えば、哺乳動物のコドンに最適化されたＣａｓ９ポリヌクレオチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列に由来する。また、Ｃａｓ９の単一変異ニッカーゼ（ｎＣａｓ９Ｄ１０ＡなどのｎＣａｓ９）およびＣａｓ９の二重変異のヌル－ニッカーゼ（ｄＣａｓ９Ｄ１０ＡＨ８４０ＡなどのｄＣａｓ９）などの哺乳動物のコドンに最適化されたＣａｓ９変異ポリヌクレオチドは、哺乳動物のコドンに最適化された野生型のＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドに由来する。

本明細書において用いられる場合、「野生型」との語は、当業者によって理解される本技術分野の用語であり、変異体またはバリアントの形態から区別されて天然に存在している有機体、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。

本明細書において用いられる場合、「バリアント」とは、第２の成分（例えば、第２の分子であり、これは「親の」分子と称される）と関連した第１の成分（例えば、第１の分子）を意味する。バリアント分子は、親の分子に由来するもの、これから単離されるもの、これに基づくもの、またはこれに相同のものでありうる。例えば、Ｃａｓ９の単一変異ニッカーゼおよびＣａｓ９の二重変異のヌル－ニッカーゼなどの哺乳動物のコドンに最適化されたＣａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）の変異体の形態は、哺乳動物のコドンに最適化された野生型のＣａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）のバリアントである。バリアントとの語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれを説明するのにも用いられうる。

ポリヌクレオチドに適用される場合、バリアント分子はもとの親の分子との間で完全なヌクレオチド配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親の分子との間で１００％未満のヌクレオチド配列の同一性を有していてもよい。例えば、遺伝子のヌクレオチド配列のバリアントは、もとのヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有する第２のヌクレオチド配列でありうる。

ポリヌクレオチドのバリアントはまた、完全な親のポリヌクレオチドを含み、追加の融合ヌクレオチド配列をさらに含むポリヌクレオチドをも包含する。ポリヌクレオチドのバリアントはまた、親のポリヌクレオチドの部分またはサブ配列であるポリヌクレオチドをも包含する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドの独特なサブ配列（例えば、標準的な配列の比較・アラインメント技術により決定されるもの）もまた、本発明に包含される。

他の形態において、ポリヌクレオチドのバリアントは、親のヌクレオチド配列に対してマイナーな、取るに足らない、または重要でない改変を含むヌクレオチド配列を包含する。例えば、マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、（ｉ）対応するポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない、（ｉｉ）ポリヌクレオチドのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの外側で生じる、（ｉｉｉ）対応するアミノ酸配列に影響しうる欠失または挿入を生じるがポリペプチドの生物学的活性にはほとんどまたはまったく影響しない、（ｉｖ）ヌクレオチドの変化が、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換を生じる、ヌクレオチド配列に対する改変が挙げられる。ポリヌクレオチドがタンパク質をコードしない場合（例えば、ｔＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）、当該ポリヌクレオチドのバリアントは当該ポリヌクレオチドの機能の喪失を生じないヌクレオチドの変化を含みうる。他の形態において、機能的に同一なヌクレオチド配列を生じる本明細書に開示のヌクレオチド配列の保存的なバリアントは本発明に包含される。当業者であれば、本明細書に開示のヌクレオチド配列の多くのバリアントが本発明に包含されることを理解している。

ポリペプチドに適用される場合、バリアントペプチドはもとの親のポリペプチドとの間で完全なアミノ酸配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親のタンパク質との間で１００％未満のアミノ酸の同一性を有していてもよい。例えば、アミノ酸配列のバリアントは、もとのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有する第２のヌクレオチド配列でありうる。

ポリペプチドのバリアントはまた、完全な親のポリペプチドを含み、追加の融合アミノ酸配列をさらに含むポリペプチドをも包含する。ポリペプチドのバリアントはまた、親のポリペプチドの部分またはサブ配列であるポリペプチドをも包含する。例えば、本明細書に記載のポリペプチドの独特なサブ配列（例えば、標準的な配列の比較・アラインメント技術により決定されるもの）もまた、本発明に包含される。

他の形態において、ポリペプチドのバリアントは、親のアミノ酸配列に対してマイナーな、取るに足らない、または重要でない改変を含むポリペプチドを包含する。例えば、マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、非機能性ペプチド配列の付加のような、ポリペプチドの生物学的活性に影響をほとんどまたはまったく与えず機能的に同等のポリペプチドをもたらすアミノ酸の改変（置換、欠失および挿入など）が挙げられる。他の形態において、本発明に係るバリアントのポリペプチドは、親の分子（例えば、ヌクレアーゼ活性が修飾され、または失われたＣａｓ９ポリペプチドの変異体）の生物学的活性を変化させる。当業者であれば、本明細書に開示のポリペプチドの多くのバリアントが本発明に包含されることを理解している。

ある形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、わずかな百分率（例えば、典型的には約１０％未満、約５％未満、４％未満、２％未満または１％未満）のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を変化させ、これを付加し、または欠失させるバリアント分子を含みうる。

本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における「保存的置換」との語は、（ｉ）三量体コドンの暗号の縮重によりアミノ酸配列に対応する変化を生じないか、または（ｉｉ）もとの親のアミノ酸が化学的に類似の構造を有するアミノ酸で置換される、ヌクレオチド配列の変化を意味する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧表は本技術分野において周知であり、そこでは１つのアミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、芳香族の側鎖または正に荷電した側鎖）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、よって得られるポリペプチド分子の機能的な特性には実質的な変化は生じない。

以下に、類似の化学的特性を有する天然アミノ酸のグルーピングを示すが、ここではある群の内部での置換は「保存的な」アミノ酸置換である。異なる機能的特性を考慮する場合、これらの天然アミノ酸は異なるグルーピングで配置されうるため、以下に示すグルーピングは厳密なものではない。非極性および／または脂肪族の側鎖を有するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンが挙げられる。極性の荷電していない側鎖を有するアミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。芳香族の側鎖を有するアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。正に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

「Ｃａｓ９の変異体」または「Ｃａｓ９のバリアント」とは、化膿連鎖球菌のＣａｓ９タンパク質（すなわち、配列番号：１）のような野生型のＣａｓ９タンパク質のタンパク質またはポリペプチド誘導体を意味し、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質またはこれらの組み合わせが挙げられる。これはＣａｓ９タンパク質のＲＮＡ標的化活性を実質的に保持している。当該タンパク質またはポリペプチドは、配列番号：１の断片を含んでもよいし、これからなっていてもよいし、実質的にこれからなっていてもよい。一般に、この変異体／バリアントは、配列番号：１に対して少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％の任意の値）の同一性を有する。この変異体／バリアントは、ＲＮＡ分子に結合し、当該ＲＮＡ分子を介して特定のＤＮＡ配列に標的化されることができ、ヌクレアーゼ活性をさらに有していてもよい。これらのドメインの例としては、ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号：１の第７～２２アミノ酸、第７５９～７６６アミノ酸および第９８２～９８９アミノ酸）およびＨＮＨモチーフ（第８３７～８６３アミノ酸）が挙げられる。Ｇａｓｉｕｎａｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ．２０１２Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２５；１０９（３９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６およびＷＯ２０１３１７６７７２を参照のこと。

「相補性」とは、伝統的なワトソン－クリック塩基対形成または他の非伝統的な形式で、核酸が他の核酸配列と水素結合を形成する能力を意味する。相補性の百分率は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成しうる残基の百分率を示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、および１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続したすべての残基が第２の核酸配列における同数の連続した残基と水素結合するであろうことを意味する。本明細書において用いられる場合、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％である相補性の程度を意味するか、または２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。

本明細書において用いられる場合、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、その条件下で標的配列に対して相補性を有する核酸が当該標的配列と優先的にハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は通常、配列依存的であり、種々の要因によって変動する。一般に、配列が長くなるほど、当該配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ－ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓＰａｒｔＩ，ＳｅｃｏｎｄＣｈａｐｔｅｒ
“Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅ
ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。

「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、特定のハイブリダイゼーション条件下において、完全にまたは部分的に相補的な核酸の鎖が一体化して、これを構成する二本の鎖が水素結合により合わさった二本鎖の構造または領域を形成するプロセスを意味する。水素結合は通常、アデニンとチミンもしくはウラシルとの間（ＡとＴまたはＵ）、またはシチジンとグアニンとの間（ＣとＧ）で形成されるが、他の塩基対が形成されてもよい（例えば、ｅ．ｇ．，Ａｄａｍｓｅｔａｌ．，ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，１１ｔｈｅｄ．，１９９２）。

本明細書において用いられる場合、「発現」とは、それによってポリヌクレオチドがＤＮＡの鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳されるプロセスを意味する。転写物およびコードされたポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と称されうる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来のものである場合、発現には真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングも含まれうる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」との語は、本明細書においては区別せずに用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体を意味する。この重合体は線状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、間に非アミノ酸を含んでいてもよい。これらの語はまた、修飾されたアミノ酸の重合体、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、ＰＥＧ化、または、ラベル化成分との共役などの他の任意の改変を施されたものをも包含する。本明細書において用いられる場合、「アミノ酸」との語は、グリシンおよびＤ体またはＬ体の光学異性体、並びにアミノ酸類似体およびペプチド類似体などの、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸を含む。

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」との語は、２つ以上のポリペプチド配列を一緒に合わせることによって作製されたタンパク質を意味する。本発明に包含される融合ポリペプチドとしては、第１のポリペプチド（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）をコードする核酸配列を、第２のポリペプチド（例えば、エフェクタードメイン）をコードする核酸配列と合わせて単一のオープンリーディングフレームを形成したキメラ状の遺伝子構築物の翻訳産物が挙げられる。言い換えれば、「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して合わさった２つ以上のタンパク質の組み換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、２つのドメインの間にペプチドリンカーを含んでもよい。

「リンカー」との語は、２つ以上のものを合わせるのに用いられる任意の手段、もの、または部分を意味する。リンカーは共有結合性のリンカーであってもよいし、非共有結合性のリンカーであってもよい。共有結合性のリンカーの例としては、共有結合または連結すべきタンパク質もしくはドメインの１つ以上に共有結合で連結されたリンカー部分が挙げられる。このリンカーはまた、非共有結合（例えば、白金原子などの金属中心を介した有機金属結合）であってもよい。共有結合で連結するには、炭酸誘導体などのアミド基、エーテル、有機エステルまたは無機エステルなどのエステル、アミノ、ウレタン、ウレアなどの種々の官能性が用いられうる。連結を提供すべく、各ドメインは、酸化、ヒドロキシ化、置換、削減などによって修飾されてカップリングのための部位を提供することができる。共役の方法は当業者に周知であり、本発明での使用に包含される。リンカー部位としては、以下に限定されないが、化学的なリンカー部位または例えばペプチドリンカー部位（リンカー配列）が挙げられる。ＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインの機能を有意に低下させない修飾が好ましいことは理解されるであろう。

本明細書において用いられる場合、「共役体」または「共役」または「連結された」との語は、２つ以上のものがあわさって１つのものを形成していることを意味する。共役体には、ペプチド－小分子共役体と、ペプチド－タンパク質／ペプチド共役体の双方が包含される。

「被験者」および「患者」の語は、本明細書では区別せずに用いられ、脊椎動物を意味し、好ましくは哺乳動物を意味し、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物としては、以下に限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、運動競技用動物およびペットが挙げられる。インビボで得られた、またはインビトロで培養された、生命体の組織、細胞およびこれらの子孫もまた包含されうる。ある実施形態において、被験者は無脊椎動物（例えば、昆虫または線形動物）であってもよいが、他の実施形態では、被験者は植物または真菌であってもよい。

本明細書で用いられる場合、「治療」または「治療する」または「緩和する」または「軽減する」は区別せずに用いられる。これらの語は、以下に限定されないが、治療上の便益および／または予防的な便益などの有利な、または所望の結果を得るためのアプローチを意味する。治療上の便益とは、治療に供された１つ以上の疾患、症状または兆候における、治療に関連した改善またはこれに対する効果を意味する。予防的な便益のためには、特定の疾患、症状または兆候が進展するリスクのある被験者に対して、または疾患の病理学的な兆候の１つ以上を申告している被験者に対して、組成物が投与されうるが、これらの疾患、症状または兆候は依然として顕在化していなくてもよい。

本明細書において、「接触させる」との語が成分の任意のセットに関連して用いられる場合には、接触させられる成分が同一の混合物中に混合される（例えば、同一の容器または溶液中に添加される）任意のプロセスを含むが、必ずしも当該成分が実際に物理的に接触していなくてもよい。これらの成分は、任意の順序で、任意の組み合わせ（またはサブコンビネーション）で接触してよく、得られた混合物から当該成分の１つ以上が、続いて（場合によっては他の成分の添加の前に）除去される場合も含みうる。例えば、「ＡをＢおよびＣと接触させる」とは、以下の場合のいずれかまたはすべてが含まれる：（ｉ）ＡをＣと混合し、次いでこの混合物にＢを添加する；（ｉｉ）ＡおよびＢを混合して混合物とし、この混合物からＢを除去し、次いでこの混合物にＣを添加する；（ｉｉｉ）ＢとＣとの混合物にＡを添加する。標的の核酸または細胞を１つ以上の反応成分（Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡなど）と接触させることとしては、以下の場合のいずれかまたはすべてが含まれる：（ｉ）標的または細胞を反応混合物の第１の成分と接触させて混合物とし、次いで当該反応混合物の他の成分を、任意の順序または組み合わせでこの混合物に添加する；（ｉｉ）標的または細胞との混合の前に、上記反応混合物を完全に形成する。

本明細書において用いられる場合、「混合物」との語は、分散していて特定の秩序をもたない、要素の組み合わせを意味する。混合物は異種のものであり、別々の構成要素へと空間的に分離することはできない。要素の混合物の例としては、同一の水溶液中に溶解している多数の異なる要素や、別々の成分が空間的に区別されないようにして、固体状の支持体にランダムにまたは特定の秩序をもたずに付着している多数の異なる要素が挙げられる。言い換えれば、混合物はアドレス可能ではない。

本明細書に開示されている、値の範囲について多くのものが記載される。文脈から明らかにそうでないと言えない限り、ある範囲の上限値および下限値の中間のそれぞれの値もまた、下限値の単位の１０分の１の値として具体的に開示されているものとする。明記された任意の値または明記された範囲の中間の値と当該明記された範囲内に位置する他の任意の明記された値または中間の値との間のより小さいそれぞれの範囲もまた、本発明の範囲に包含される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、それぞれ独立して、当該範囲に含まれても含まれなくてもよく、境界値のいずれかまたは双方がより小さい範囲に含まれるか、あるいはいずれもより小さい範囲に含まれないそれぞれの範囲もまた、明記された範囲において具体的に除外された任意の境界値に依存する形で、本発明に包含される。明記された範囲が境界値の１つまたは双方を含む場合、これらの含まれた境界値の一方または双方を除外した範囲もまた、本発明に包含される。「約」との語は一般的に、示された数のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」とは、９％～１１％の範囲を示し、「約２０」とは１８～２２を意味しうる「約」の別の意味は、四捨五入などの文脈から明らかであり、よって例えば、「約１」は０．５～１．４をも意味する。

実施例１細菌ゲノムの標的シチジンヌクレオチドにおいて部位特異的変異をもたらすＣＲＣシステム
本実施例では、大腸菌ＭＧ１６５５株をモデルとして用いた。細菌のＲＮＡポリメラーゼのサブユニットβ遺伝子（ｒｐｏＢ）における変異は、細胞を抗生物質であるリファンピシンに対して耐性にする（Ｊｉｎ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２０２，４５－５８，（１９８８）およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．，ＪＡｎｔｉｂｉｏｔ６７，６２５－６３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊａ．２０１４．１０７（２０１４））。変異については単離して個別に解析することが可能であり、変異の頻度も算出されうる。ＡＩＤは、シチジンデアミナーゼのＡＰＯＢＥＣファミリーに属するＢ細胞特異的なタンパク質であり、抗体の多様化および親和性成熟の際の体細胞超変異およびクラススイッチ組み換えに関与している（Ｏｄｅｇａｒｄ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ６，５７３－５８３（２００６），およびＮｏｉａ，ｅｔａｌ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６，１－２２，ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７６．０６１７０５．０９０７４０（２００７））。よって、これらの実験のセットについては、非ヌクレアーゼエフェクタータンパク質としてＡＩＤを用いて大腸菌ＭＧ１６５５株が標的化される。

コンストラクトおよびシステムの構成
誘導性プロモーター
タンパク質をコードするすべてのコンストラクトは、Ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下で設計した。誘導剤としては、３０ｎＭの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ；シグマ）を用いた。

Ｃａｓ９コンストラクト
本システムの主要な特徴は、ＤＳＢの生成を伴わずにヌクレオチドの修飾を正確に導入することにある。この目的に向けて、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ欠損体（すなわち、触媒活性を失ったＣａｓ９（Ｃａｓ９_{Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ}、ｄＣａｓ９）およびＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９_Ｄ１０ＡまたはｎＣａｓ９_{Ｈ８４０Ａ}）（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７，８１６－８２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９（２０１２）））をＤＮＡ標的化モジュールとして用いた。Ｃａｓ９ニッカーゼは、オフセットダブルＤＮＡニッキングによりオフターゲットのＤＳＢを低減する目的で用いられてきた（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５４，１３８０－１３８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０８．０２１（２０１３）およびＳｈｅｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈ１１，３９９－４０２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８５７（２０１４））。また、ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性から独立した種々の活性をもたらすことを目的として作製されてきた。Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ４３９，１３２－１３６，（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔａｌ．ＮａｔＭｅｔｈ１０，９７３－９７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６００（２０１３）、Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，８３３－８３８，ｄｏｉ：１０．１０３８ｅｔａｌ．／ｎｂｔ．２６７５（２０１３）、Ｚａｌａｔａｎ，Ｊ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６０，３３９－３５０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．１１．０５２（２０１５）、Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５２，１１７３－１１８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０２．０２２（２０１３）、Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ８，２１８０－２１９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１３．１３２（２０１３）、Ｈｉｌｔｏｎ，Ｉ．Ｂ．ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ３３，５１０－５１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１９９（２０１５）、Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．ｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈ１２，１１４３－１１４９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３６３（２０１５）、Ｃｈｅｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５５，１４７９－１４９１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１（２０１３）およびＦｕ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１７０７（２０１６）を参照。したがって、これらのバリアントはほとんど安全であると考えられ、本研究により提供されるシステムを開発するのにふさわしい候補である。

標的化された動員システム
本システムは、ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員プラットフォームとして作製された。本研究において用いられたコンストラクトの概要などの概略図を図１Ｂに示す。Ｃａｓ９のバリアントについては独立したコンストラクトとして設計したが、ｇＲＮＡについてはＣＲＩＳＰＲＲＮＡスキャホールドの３’末端にファージＲＮＡスキャホールドを合成的に融合したキメラＲＮＡ種として作製した。ファージＲＮＡスキャホールドは、非ヌクレアーゼエフェクタータンパク質に連結された特定のＲＮＡ結合タンパク質を動員する（図１Ｃ）。このＲＮＡスキャホールド動員システムは、ファージＭＳ２およびそれが相互作用する相手方であるＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に由来するものである。

標的化ｇＲＮＡ
標的は、細菌のｒｐｏＢ遺伝子である。３つのクラスター（合わせてリファンピシン耐性決定領域（ＲＲＤＲ）と称される）における変異により、細胞は抗生物質であるリファンピシンに対する耐性を獲得する（Ｒｉｆ^Ｒ）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ
Ａｎｔｉｂｉｏｔ６７，６２５－６３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊａ．２０１４．１０７（２０１４））。ＲＲＤＲクラスターＩ配列における重要なアミノ酸を標的化することを目的として、４つのｇＲＮＡのセットを設計した（すなわち、Ｓ５１２、Ｄ５１６、Ｈ５２６およびＳ５３１；図２Ａ）。Ｊｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ２０２，４５－５８，（１９８８）およびＪｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ．Ｖｏｌｕｍｅ２７３３００－３１９（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９６）。

実験的アプローチ
化学的にコンピテントとした大腸菌ＭＧ１６５５細胞を、セクション１に記載のコンストラクトをコードするプラスミドの組み合わせからなる全ＤＮＡ１０～２０ｎｇで形質転換した。形質転換の後、細胞を選別し、適切な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で誘導した。選別／誘導の後、ＯＤを測定し、細胞を順次希釈し、リファンピシン（１２０μＭ）を含有するＬＢ寒天プレート上に１０^８～１０^４個の細胞を播種した。平板効率のためにリファンピシンを含まない選択寒天プレート上に２００個の細胞を播種した。一晩インキュベーションした後、コロニーを計数し、変異の頻度を記録した。また、コロニーから単離されたｒｐｏＢ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、配列を決定して変異をマッピングした。

結果
ＡＩＤの標的化された動員はＣからＴへの部位特異的な変換をもたらす
ｒｐｏＢのＲＲＤＲ（クラスターＩ）領域を標的化する４つのｇＲＮＡのセットを用いて、標的部位へとＡＩＤを動員した（図２Ａ）。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を用いたＣＲＣ標的化および、程度は低いがｒｐｏＢ＿ＴＳ－３を用いたＣＲＣ標的化により、リファンピシン培地中でのＭＧ１６５５細胞の生存画分は増加した（図２Ｂ、図２Ｃ）。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４による処理から得られたクローンの配列解析から、Ｃ１５９２のＴへの変異と、これに付随する、Ｒｉｆ^Ｒ細胞をもたらす変異であることが知られているセリン５３１からフェニルアラニンへのアミノ酸の変換についての高い特異性が確認された（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ－Ｍａｈｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１８，９９－１０４（２００２），Ｘｕ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８７，２７８３－２７９２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．１８７．８．２７８３－２７９２．２００５（２００５）およびＺｅｎｋｉｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ４９，１５８７－１５９０，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．４９．４．１５８７－１５９０．２００５（２００５））（図２Ｄ）。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－３、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４およびスクランブルの変異の分布を図２Ｅにまとめた。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４処理において観察された変異頻度のかなりの増加と修飾ヌクレオチドの配置、並びにｒｐｏＢ＿ＴＳ－３処理における効率の低下から、標的であるシチジンは、プロトスペーサーの５’末端により近い、ＣＲＩＳＰＲＲ－ループにより残された対を形成していない鎖上に位置する必要があることが示唆される（すなわち、変異頻度はＴＳ４＞ＴＳ３であり、これらはいずれも同一のヌクレオチドを標的化し、修飾する；図２Ａ、図２Ｃおよび図２Ｅ）。このことは、ＡＩＤが一本鎖ＤＮＡ上のシチジン残基を積極的に脱アミノ化するという見解と整合している（Ｏｄｅｇａｒｄ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ６，５７３－５８３（２００６），Ｎｏｉａ，ｅｔａｌ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６，１－２２，ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７６．０６１７０５．０９０７４０（２００７），Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ２３，２５８－２６８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１１．１０．００４（２０１２）およびＲａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５５１６（２０１４））。標的化モデルの概略図を図２Ｆに示す。

ＣＲＣのモジュラリティ
標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａへ変更するとＣからＴ／Ａへの変換の効率が上昇する
標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａへ変更すると、リファンピシンプレート上の生存画分の観点でのシステムの効率がコントロールに対して１８倍から４３倍へと上昇した（図３Ａ）。変異の解析により、標的ヌクレオチドに対して^ＡＩＤＣＲＣ処理と同様の特異性が確認された。この場合、Ｃ１５９２は１００％のクローンで修飾され、７５％がＣからＴへと変異し、２５％がＣからＡへと変異していた（図３Ｂ）。

他の非ヌクレアーゼエフェクター（ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＡＰＯＢＥＣ１）の標的化された動員により、部位特異的なＣからＴ／Ａへの変換を導入することができる
エフェクタータンパク質としてのＡＩＤに加えて、ＡＰＯＢＥＣファミリーに由来する他のシチジンデアミナーゼ（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＡＰＯＢＥＣ１）についても試験を行った（図４Ａ）。ＡＰＯＢＥＣ１は、プロトタイプシステム（^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）と比較して、標的化された変異の頻度を増加させた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性は、プロトタイプシステムよりも低かった。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を標的化コンストラクトとして用い、^Ａｐｏ１ＣＲＣ_Ｄ１０Ａで処理された細胞の変異の解析では、１００％がＣ１５９２→Ｔの変換を示した。また、カ移籍したクローンの２５％は二重変異体であり、アミノ酸の変化を生じないＣ１５９０→Ｔの変換をも示した（図４Ｂ）。

ＲＮＡ動員スキャホールドの数を増加させるとＣからＴ／Ａへの変換の特異性を変えずに変異の頻度が増加する
タンデムの多量体リクルーティングスキャホールドを付加することで、標的領域上に存在するエフェクターを潜在的に増加させることができ、これによってシステムの効率を向上させることができた。この目的に向けて、２つのＭＳ２ループ（２×ＭＳ２、配列番号：５４）を含むようにｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を改良した。１つのＭＳ２ループ（１×ＭＳ２、配列番号：２）を有するｒｐｏＢ＿ＴＳ－４とｒｐｏＢ＿ＴＳ－４２×ＭＳ２との間で、標的化の効率を比較した（図５Ａ）。その結果から、リクルーティングループの数を増加させると、Ｒｉｆ^Ｒの観点での変異の効率は実際に向上することが示され、これによって存在するエフェクタータンパク質が増加していることが示唆される。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４２×ＭＳ２を標的化コンストラクトとして用い、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａで処理された細胞の変異の解析では、Ｃ１５９２ヌクレオチドが１００％のクローンにおいて修飾され、そのうち６２．５％がＣからＴへ変異し、３７．５％がＣからＡへ変異していたことが示された（図５Ｂ）。これらの結果から、リクルーティングモジュールの改良はシステムの標的化の特異性に影響しないことが示唆される。

まとめると、以上の結果から、ＣＲＣシステムのモジュラー設計により作製プロセスが簡便になり、システムのさらなる改善の可能性が高まることがわかる。

実施例２ＣＲＣシステムは哺乳動物のシステムにおいて部位特異的なヌクレオチドの変換をもたらした
実験のデザイン：哺乳動物での発現のためのシステムの改良
次いで、哺乳動物での発言のためにシステムの改良を試みた。この目的に向けて、自己切断可能なＰ２Ａペプチドで隔てられたＡＩＤ＿ＭＣＰ融合物がその後に連結された、哺乳動物のコドンに最適化されたｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａを用いて、原核細胞のＡＩＤＣＲＣＤ１０Ａシステムを多シストロン性のコンストラクトとして反復した。このコンストラクトをユビキチンＣプロモーターの制御下でクローニングした。それぞれ５’－Ｇまたは５’－Ａを有する標的について、Ｕ６またはＨ１プロモーターの制御下で、ｇＲＮＡ＿２×ＭＳ２カセットをクローニングした（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５５１６（２０１４））。これらの一連の実験で用いられたコンストラクトの概略図を図６Ａに示す。

染色体外ＤＮＡの標的化：ＥＧＦＰ逆変異アッセイ
ＥＧＦＰを改良して、そのフルオロフォアを破壊する機能喪失型点変異（１９７Ａ→Ｇ、Ｙ６６Ｃ）を有するようにし、これによってタンパク質を非蛍光性とした（_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ）。次いで、この変異体ＧＦＰの発現ベクターを哺乳動物の細胞にトランスフェクションし、システムの基材とする。本実験の目的は、上述した機能喪失型点変異を「修正」することであった。「修正された」遺伝子が転写されて翻訳されると、この修正によってタンパク質の機能は回復し、蛍光顕微鏡下で蛍光性の細胞として可視化することが可能となる。

実験的アプローチ
_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡおよびｇＲＮＡコンストラクトをコードする標的プラスミドを含むＤＮＡの組み合わせ１０μｇを用いて、約７×１０^５個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。比較のために、これら一連の実験では第３世代の塩基エディターシステム（ＢＥ３、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
ａｄｖａｎｃｅｏｎｌｉｎｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４６）を用いた。ＢＥ３は異なる動員メカニズム（Ｃａｓ９とＡＰＯＢＥＣ１との直接的な融合）を用いた少し似たシステムであり、ＤＮＡ修復に関与する酵素であるウラシルＤＮＡグリコシラーゼを阻害するペプチドを含む。一晩のインキュベーションの後、蛍光顕微鏡下で細胞を解析して、ＧＦＰシグナルを観察した。

結果
上述したＣＲＣシステムは、タンパク質の機能を保ったまま、染色体外ＤＮＡにおける標的ヌクレオチドを修飾することができることがわかった。標的のシチジンは鋳型鎖（ＴＳ、－）に位置することから、２つのｇＲＮＡについては、標的ヌクレオチド周辺の非鋳型鎖（ＮＴ、＋）に結合するように設計した（図６Ｂ）。標的のシチジンは、それぞれ_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１プロトスペーサーおよび_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２プロトスペーサー内の５位および１２位に位置する。ｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａ、ＡＩＤ＿ＭＣＰ、ｇＲＮＡ（_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１または_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２）、および標的コンストラクト（_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ）をコードするＤＮＡを用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１および_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２で処理したがスクランブルでは処理していない細胞について、ＥＧＦＰシグナルを検出した（図６Ｃ）。標的のシチジンの位置により、_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２の場合と比較して、_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１で処理された細胞ではＥＧＦＰシグナルがより強かった。_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１は、標的のＣをＡＩＤへよりアクセス可能にしているようである（図６Ｃ、中央および右のパネル）。また、ＣＲＣプラットフォームを、動員のためのシチジンデアミナーゼタンパク質のＣａｓ９タンパク質への直接融合を利用し、効率の改善のためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）の阻害剤の共発現を必要とする別の遺伝子編集システム（ＢＥ３）と比較した。そうしたところ、予期せぬことに、エフェクターと配列標的化モジュールとがＲＮＡスキャホールドを介して連結しているＣＲＣシステムの方が、局所的なＵＮＧの阻害を必要としなくとも（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤ＵＧＩの発現を必要としなくとも）、ＢＥ３システムよりもずっと効率的であることが判明した（図６Ｃ、図６Ｄおよび図７Ｂ）。

これらの結果により、細菌の系からの知見が裏付けられ、本システムは、プログラム可能な方法で、ヒトの細胞の染色体外ＤＮＡにおける特定のシチジン残基を効率的に脱アミノ化することが示される。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａによる処理および標的化ｇＲＮＡとして_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１を用いたＢＥ３による処理からのＧＦＰ陽性細胞の計量により、ＣＲＣシステムがＢＥ３よりも優れた変換効率を示すことが示唆される（図６Ｄ）。

実施例３ＣＲＣシステムは哺乳動物の細胞において内因性の遺伝子の部位特異的なヌクレオチド変換をもたらす
内因性の遺伝子座の標的化：チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子
細菌の陰性選択システムから観察された良好な結果に後押しされて、哺乳動物の細胞においても類似のアプローチを採用することとした。ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）は、プリン代謝に関与する酵素であり、そのコーディング配列における変異は代謝拮抗物質である６－チオグアニン（６－ＴＧ^Ｒ）に対する耐性を生じることが知られている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２６９，８１５－８１６（１９７７））。これらの実験は、ＣＲＣシステムを用いてＨＰＲＴ遺伝子を変異させてその機能を阻害し、さらなる解析のために、６－ＴＧを用いて変異細胞を選択することを目的として行った。

実験的アプローチ
^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡコンストラクトおよびｇＲＮＡであるＨＰＲＴ＿ＴＳ－１発現ベクターを含むＤＮＡの組み合わせ１０μｇを用いて、約７×１０^５個のチャイニーズハムスターＶ７９－４細胞をトランスフェクションした。比較のために、細胞をＢＥ３およびｇＲＮＡであるＨＰＲＴ＿ＴＳ－１で処理した。既報に記載の哺乳動物における突然変異誘発性のプロトコールに従って、処理した細胞および未処理の細胞を増殖させた（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００１））。簡単に言えば、トランスフェクションの後、細胞を７日間維持し、次いで変異の固定および既に存在していたＨＰＲＴｍＲＮＡおよびタンパク質のターンオーバーのための６－ＴＧによる選択を行った。６０μＭの６－ＴＧを用いて１４日間細胞を選択し、６－ＴＧ^Ｒのコロニーを形成させた。コロニーを計数して変異の頻度を見積もり、個々のコロニーを単離して配列決定の解析のために別々に増殖させた。

結果
チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子に由来するエクソン３を標的化するように、１つのｇＲＮＡを設計した（図７Ａ）。このｇＲＮＡは、フェニルアラニンをコードするコドン７４を標的化し、この残基における変異はＨＰＲＴタンパク質の安定性を低下させることが既に知られていた（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６３，３３１－３３６，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８－１１１９（８８）９０５３６－７（１９８８））。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡまたはＢＥ３コンストラクトをコードするＤＮＡを、標的化ｇＲＮＡ発現ベクターと一緒に用いてＶ７９－４細胞をトランスフェクションした。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａシステムは、ＢＥ３システムよりも高い効率で、細胞を６－ＴＧ処理に対して耐性にする変異をもたらした（すなわち、それぞれ未処理の細胞と比較して１４０倍ｖｓ．４０倍であった；図７Ｂ）。この結果から、ＣＲＣシステムは哺乳動物の内因性の遺伝子座における特定のＤＮＡ配列を標的化し、修飾することができることが示される。

実施例４Ｃｉｓダブルニッキングは困難な標的化配列に対する変換効率の増加をもたらした
この実施例では、上に記載されるｃｉｓダブルニッキングを使用して、細菌遺伝子変換モデルにおける変換効率を増強させた（図９）。

簡潔には、ｎＣａｓ９（ｎＣａｓ９_Ｄ１０ＡまたはｎＣａｓ９_Ｈ８４０）は、同じＤＮＡ鎖上の２つの隣接する位置を標的とするようにプログラムされた。２つのｇＲＮＡを有する同じ鎖をダブルニッキングすることは、二本鎖ＤＮＡ切断またはＤＳＢ修復経路の活性化を誘導しないことから、これは安全なアプローチである。上記手順の概要を図８に記載する。このアプローチを試験するため、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ｒｐｏＢ）をコードする細菌遺伝子を、ｇＲＮＡであるＴＳ－２およびＴＳ－３を使用して標的化した（図９Ａ）。これは、特定のｒｐｏＢ変異体が抗生物質リファンピシンに耐性（Ｒｉｆ^Ｒ）であることから、この薬物を使用して当該変異体を選択することができる陰性選択システムである。結果を図９Ｂに示す。原核細胞では、標的化効率が約１３０倍まで増強されたことがわかった。

実施例５ＣＲＣシステムは標的シチジンヌクレオチドにおいて部位特異的変異をもたらした
この実施例では、ＡＩＤバリアントを、ＡＩＤ誘導性オフターゲット効果がある場合にはそれを減少させるために使用した。本来、ＡＩＤは、ユビキタスなキナーゼであるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）により、Ｓｅｒ３８に対するリン酸化によって活性化される。このリン酸化は、複製プロテインＡ（ＲＰＡ）と呼ばれる別のユビキタスなタンパク質との相互作用をもたらす。ＡＩＤ中のＳｅｒ３８をＡｌａに変異させることにより（配列番号：５１）、ＡＩＤのオフターゲット部位への動員を減少させることができる。

ＡＩＤ中の変異がＣＲＣの触媒活性に影響を及ぼさないことを確認するため、先の実験と同じ方法（ＧＦＰ逆変異アッセイ）で、安定的にゲノムに統合された非蛍光ＥＧＦＰ遺伝子を持つＨＥＫ２９３細胞を処理した。リン酸化ヌルＣＲＣ（ＡＩＤ＿Ｓ３８Ａバリアントを含む、ｐｎＣＲＣと称される）の成績を、通常のＣＲＣ（ｗｔＡＩＤを含む）と並べて比較した。ＧＦＰ変換効率をフローサイトメトリーによって測定した。図１１Ｂに示されるように、結果は、変異がＣＲＣの変換効率に効果を有しないことを示す。

上述した実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲によって確定される本発明を限定するものとしてというよりも、例示的なものと捉えられるべきである。容易に理解可能であろうが、上述した特徴についての多くの改変および組み合わせが、特許請求の範囲に記載の本発明を逸脱することなく採用可能である。このような改変は本発明の範囲からの逸脱とみなされてはならず、このような改変はすべて、後述する特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書において引用されたすべての文献は、その全体が参照により引用されている。

Claims

遺伝子編集機構による標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの部位特異的な修飾システムであって、それぞれ前記標的ＤＮＡまたはＲＮＡにおける第１の標的核酸配列および第２の標的核酸配列との相互作用のための第１のシステムおよび第２のシステムを含み；
（１）前記第１のシステムが、
（ｉ）第１のＣＲＩＳＰＲタンパク質、
（ｉｉ）（ａ）前記標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の前記第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ配列を含む第１の核酸標的化モチーフ、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲタンパク質に結合可能な第１のＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）第１のリクルーティングＲＮＡモチーフを含む、第１のＲＮＡスキャホールド、並びに
（ｉｉｉ）（ａ）前記第１のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第１のＲＮＡ結合ドメインおよび（ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の酵素活性を有する第１のエフェクタードメインを含み、（ｂ）第１のリンカーを含んでもよい第１の非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質、を含み、
（２）前記第２のシステムが、
（ｉ）第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質、並びに
（ｉｉ）（ａ）前記標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の前記第２の標的核酸配列に相補的な第２のガイドＲＮＡ配列を含む第２の核酸標的化モチーフ、および（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質に結合可能な第２のＣＲＩＳＰＲモチーフを含む、第２のＲＮＡスキャホールド、を含み、
前記第１のＣＲＩＳＰＲタンパク質および前記第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質が二本鎖切断を引き起こさないものである、
遺伝子編集機構による標的ＤＮＡまたはＲＮＡの部位特異的な修飾システム。
前記第２のＲＮＡスキャホールドが、（ｃ）第２のリクルーティングＲＮＡモチーフをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記第２のシステムが、
（ｉｉｉ）（ａ）前記第２のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第２のＲＮＡ結合ドメインおよび（ｃ）第２のエフェクタードメインを含み、（ｂ）第２のリンカーを含んでもよい第２の非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質をさらに含む、請求項２に記載のシステム。
前記第２のシステムが、（ｉｉｉ）（ａ）前記第２のリクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能な第２のＲＮＡ結合ドメインおよび（ｃ）局所ＤＮＡ修復阻害剤ドメインを含み、（ｂ）第２のリンカーを含んでもよい局所ＤＮＡ修復阻害剤融合タンパク質を含む、請求項２に記載のシステム。
前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こさないＣＲＩＳＰＲタンパク質バリアントである、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすヌクレアーゼ活性を有しない、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、化膿連鎖球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デンティコラからなる群から選択される種のｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９の配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１のＣＲＩＳＰＲタンパク質および前記第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ９のオルソログおよびバリアントであり、異なるＰＡＭと関連する、請求項７に記載のシステム。
前記第１または第２のリクルーティングＲＮＡモチーフ、および前記第１または第２のＲＮＡ結合ドメインが、
テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、
テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、
ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位、
ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位、
ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位、並びに
非天然のＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合部位からなる群から選択される対である、請求項３～８のいずれか１項に記載のシステム。
前記第１または第２のリンカーの長さが０～１００アミノ酸残基である、請求項３～９のいずれか１項に記載のシステム。
前記酵素活性が、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
前記酵素活性が、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性またはデメチラーゼ活性である、請求項１１に記載のシステム。
前記酵素活性が、シチジン脱アミノ化活性またはアデノシン脱アミノ化活性である、請求項１１に記載のシステム。
前記第１または第２のＲＮＡ結合ドメインがＣａｓ９、その機能的等価物およびそのＲＮＡ結合ドメインのいずれでもない、請求項３～１３のいずれか１項に記載のシステム。
前記標的ＤＮＡまたは前記標的ＲＮＡが細胞内にある、請求項１～１４のいずれか１項に記載のシステム。
前記標的ＤＮＡが、染色体外ＤＮＡまたは染色体上のゲノムＤＮＡである、請求項１５に記載のシステム。
前記細胞が、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウシの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載のシステム。
前記細胞が、ヒトまたは非ヒトの被験体由来のものである、請求項１５または１６に記載のシステム。
前記ヒトまたは非ヒトの被験体が遺伝子の遺伝子変異を有している、請求項１８に記載のシステム。
前記被験体が、前記遺伝子変異に起因する障害または前記障害を有するリスクを抱えている、請求項１９に記載のシステム。
前記部位特異的な修飾が、前記遺伝子変異を修正するか、または前記遺伝子の発現を不活性化する、請求項１９に記載のシステム。
前記被験体が、病原体を有しているか、または前記病原体に曝露されるリスクを抱えている、請求項１８に記載のシステム。
前記部位特異的な修飾が、前記病原体の遺伝子を不活性化する、請求項２２に記載のシステム。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の前記第１のシステム、および前記第２のシステムをコードする、単離された核酸または単離された核酸のセット。
請求項２４に記載の単離された核酸または単離された核酸のセットを含む、発現ベクターまたは宿主細胞。
（ｉ）請求項１～２３のいずれか１項に記載の第１のシステムおよび第２のシステム、
（ｉｉ）請求項２４に記載の単離された核酸または単離された核酸のセット、並びに
（ｉｉｉ）請求項２５に記載の前記発現ベクターまたは前記宿主細胞からなる群から選択される１つ以上を含む、キット。
再構成および／または希釈のための試薬、並びに核酸またはポリペプチドを宿主細胞中に導入するための試薬からなる群から選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の第１のシステムおよび第２のシステム、
請求項２４に記載の単離された核酸または単離された核酸のセット、並びに
請求項２５に記載の前記発現ベクターまたは前記宿主細胞からなる群から選択される１つ以上を含む、組成物。