ES2924552T3 - Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

La presente divulgación se relaciona con el campo de la biología molecular de plantas, más particularmente con la regulación de la expresión génica en plantas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos
Campo
La presente divulgación se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más particularmente a la regulación de la expresión génica en plantas.
Antecedentes
La expresión de secuencias de ADN heterólogas en un hospedador de planta depende de la presencia de elementos reguladores unidos operativamente que son funcionales dentro del hospedador de la planta. La elección de la secuencia promotora puede determinar cuándo y dónde se expresa dentro del organismo una secuencia de ADN heteróloga. Donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se pueden usar promotores preferidos de tejido. Donde se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. A diferencia, donde se desea la expresión continua a través de las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Secuencias reguladoras adicionales en la dirección 5’ y/o en la dirección 3’ desde la secuencia promotora central se pueden incluir en las construcciones de expresión de vectores de transformación para proporcionar niveles variables de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.
Frecuentemente es conveniente expresar una secuencia de ADN en tejidos u órganos particulares de una planta. Por ejemplo, la elevada resistencia de una planta a la infección por patógenos transmitidos por la tierra y el aire se podría llevar a cabo por la manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un promotor preferido de tejido unido operativamente a un gen de resistencia a patógenos heterólogos de forma que se produzcan proteínas de resistencia a patógenos en el tejido de planta deseado. Alternativamente, se puede inhibir convenientemente la expresión de una secuencia de ADN nativa dentro de los tejidos de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, dicha inhibición se podría llevar a cabo con la transformación de la planta para que comprenda un promotor preferido de tejido unido operativamente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de forma que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcrito de ARN que interfiera con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa.
La alteración genética de plantas mediante el uso de técnicas de ingeniería genética y, por lo tanto, la producción de una planta con rasgos útiles, puede requerir la disponibilidad de una variedad de elementos reguladores. Una acumulación de promotores y otros elementos reguladores permitiría al investigador expresar moléculas de ADN recombinante a niveles deseados y en ubicaciones celulares. Por lo tanto, un conjunto de promotores permitiría expresar un nuevo rasgo al nivel deseado en el tejido deseado. Por lo tanto, el aislamiento, la caracterización y la creación de elementos reguladores híbridos que pueden producir un patrón de expresión que es único y sirve de regiones reguladoras para la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas de interés son útiles para la manipulación genética de plantas.
Breve sumario
La invención proporciona un elemento regulador híbrido que comprende el polinucleótido de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 39 y 40.
La invención proporciona además una construcción de ADN que comprende el elemento regulador híbrido como se ha descrito anteriormente.
Aun se proporciona además un casete de expresión que comprende la construcción de ADN como se ha descrito anteriormente.
La invención proporciona además una célula hospedadora que comprende el casete de expresión como se ha descrito anteriormente.
Aún más se proporciona por la invención una planta transgénica que comprende el casete de expresión como se ha descrito anteriormente.
La invención proporciona además un método de expresión dirigida de una secuencia de polinucleótidos en una planta o célula de la planta, comprendiendo dicho método introducir por transformación en la planta o la célula de la planta un casete de expresión que comprende el elemento regulador híbrido como se ha descrito anteriormente, unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés.
Aspectos adicionales y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no se encuentre bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona simplemente para fines ilustrativos.
Sumario de enseñanzas técnicas
Se proporcionan composiciones y métodos de regulación de la expresión de una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés en una planta o célula de la planta. Se proporcionan moléculas de ADN sintéticas que comprenden novedosas secuencias de polinucleótidos para elementos reguladores que tienen actividad reguladora génica. En algunos aspectos de la divulgación, el elemento regulador tiene actividad de promotor que inicia la transcripción en la célula de la planta. Ciertos aspectos de la divulgación comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1-74. También se incluyen fragmentos funcionales, segmentos o variantes de las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1-74, en donde dichas secuencias inician la transcripción en una célula de la planta, o una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia con las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1-74, en donde dichas secuencias inician la transcripción en la célula de la planta. Los aspectos de la divulgación también incluyen construcciones de ADN que comprenden un elemento regulador unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde dicho elemento regulador es capaz de impulsar la expresión de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga en una célula de la planta y dicho elemento regulador comprende una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento. Los aspectos de la divulgación proporcionan además vectores de expresión, y plantas o células de la planta que tienen incorporadas establemente en sus genomas una construcción de ADN como se describe anteriormente. Además, las composiciones incluyen semilla transgénica de dichas plantas.
En un aspecto de la divulgación, se proporcionan elementos reguladores híbridos que producen un patrón de expresión en plantas que es único para cada uno de los elementos reguladores híbridos con respecto a cualquier material regulador fuente o parental a partir del cual se produce el elemento regulador híbrido, en donde el elemento regulador híbrido contiene un segmento de cada elemento regulador parental. En un aspecto de la divulgación, el elemento regulador híbrido produce un patrón de expresión específico de tejido que es diferente con respecto a los elementos reguladores parentales. En otro aspecto de la divulgación, los elementos reguladores híbridos proporcionan un patrón de expresión ampliado en tejidos de planta con respecto a patrones de expresión más estrechos expresados a partir de un conjunto dado de elementos reguladores parentales. En otro aspecto de la divulgación, los elementos reguladores híbridos pueden producir un patrón de expresión constitutiva que se diferencia de un patrón de expresión no constitutiva de los elementos reguladores parentales.
Se proporcionan métodos y composiciones que se refieren a la construcción de elementos reguladores híbridos. En un aspecto de la divulgación, se puede crear un elemento regulador híbrido usando uno o más elementos reguladores previamente caracterizados y segmentos de ensamblaje de los uno o más elementos reguladores previamente caracterizados. En un aspecto adicional de la divulgación, los elementos reguladores caracterizados se pueden evaluar para posibles motivos para ayudar en la definición de segmentos que puedan ser útiles en un elemento regulador híbrido. En un aspecto de la divulgación, el extremo 3’ del promotor híbrido contiene una caja TATA de un elemento regulador parental. En otro aspecto de la divulgación, un método proporcionado se refiere a expresar una secuencia de nucleótidos en una planta o célula de la planta que comprende introducir en la planta o la célula de la planta un casete de expresión que comprende un elemento regulador híbrido unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, en donde dicho elemento regulador híbrido produce un patrón de expresión en tejido de la secuencia de nucleótidos de interés que es único con respecto a cada uno de los patrones de expresión en tejido parentales de elementos reguladores individuales.
En un aspecto de la divulgación, elementos reguladores parentales que se pueden usar para preparar un elemento regulador híbrido comprenden SEQ ID NO: 1-10, 31-34 y 61-74, o variantes de las mismas. También se incluyen fragmentos funcionales, segmentos o variantes de las secuencias de polinucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1 -10, 31 -34 y 61-74, en donde dichas secuencias de polinucleótidos inician la transcripción en una célula de la planta, o una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con las secuencias de polinucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1-10, 31-34 y 61-74, y en donde dichas secuencias de polinucleótidos inician la transcripción en una célula de la planta. En otro aspecto de la divulgación, elementos reguladores parentales que se pueden usar para preparar un elemento regulador híbrido comprenden uno o más de SEQ ID NO: 1­ 74, o variantes de las mismas.
Los aspectos de la divulgación también incluyen construcciones de ADN que comprenden un elemento regulador híbrido unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde dicho elemento regulador híbrido es capaz de impulsar la expresión de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga en una célula de la planta y dicho promotor comprende una de SEQ ID NO: 1-74, o un fragmento funcional de la misma, como se desvela en el presente documento. Los aspectos de la divulgación proporcionan además vectores de expresión, y plantas o células de la planta que tienen incorporadas establemente en sus genomas una construcción de ADN como se describe anteriormente. Además, las composiciones incluyen semilla transgénica de dichas plantas.
En la dirección 3’ desde la región de iniciación de la transcripción del elemento regulador habrá una secuencia de interés que proporcionará la modificación del fenotipo de la planta. Dicha modificación incluye la modulación de la producción de un producto endógeno en cuanto a la cantidad, o distribución relativa, o producción de un producto de expresión exógeno, para proporcionar una función novedosa o modulada o producto en la planta. Por ejemplo, se engloba una secuencia de polinucleótidos heteróloga que codifica un producto génico que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, a las sales, al frío, a la sequía, a patógenos, a nematodos o a insectos.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un método de modulación de la expresión de un gen en una planta establemente transformada, que comprende las etapas de (a) transformar una célula de la planta con una construcción de ADN que comprende un elemento regulador desvelado en el presente documento, o un fragmento funcional de la misma, unido operativamente a al menos una secuencia de polinucleótidos heteróloga; (b) cultivar la célula de la planta en condiciones de cultivo de plantas y (c) regenerar una planta establemente transformada de la célula de la planta, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos unida altera el fenotipo de la planta. En otro aspecto de la divulgación, la construcción de ADN comprende además un elemento potenciador heterólogo.
Se proporcionan casetes de expresión que comprenden las secuencias del elemento regulador de SEQ ID NO: 1 -74 unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Además, se proporcionan células vegetales, tejidos de planta, semillas y plantas transformados.
Descripcion de los dibujos
FIG. 1 Muestra una distribución de motivos usados para ayudar en la definición de la región del segmento del elemento regulador que se incorporaría en un elemento regulador híbrido. Las líneas verticales indican las posiciones del motivo, la flecha blanca indica el segmento usado en un elemento regulador híbrido y la flecha negra indica el elemento regulador parental de longitud completa. A. Una representación del elemento regulador SI-TIP2-3B (MOD 1) (SEQ ID NO: 10) y la región 5' en la dirección 5' de la caja TATAA seleccionada para su uso como un segmento en un elemento regulador híbrido basado en la agrupación de motivos, y B. Una representación del elemento regulador BD-GRP3 PRO (MOD 1) (SEQ ID NO: 2) y la región 3' en la dirección 3' que incluye la caja TATAA seleccionada para su uso como un segmento en un elemento regulador híbrido basado en la agrupación de motivos.
FIG. 2 Muestra los segmentos usados para preparar varios elementos reguladores híbridos de raíz.
FIG. 3 Muestra los segmentos usados para preparar cada elemento regulador híbrido aéreo.
Descripcion detallada
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no se encuentre bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona simplemente para fines ilustrativos.
El artículo "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos.
La divulgación se refiere a composiciones y métodos referidos a elementos reguladores de plantas y métodos de su uso. Las composiciones y los métodos adicionales se refieren a elementos reguladores híbridos y a métodos de preparación y uso de los elementos reguladores híbridos.
Los tejidos de planta son órganos complejos que se pueden dividir en diferentes regiones; por ejemplo, en el tejido de raíz, las regiones de tejido incluyen la cofia, el meristemo, la región de elongación y la región de maduración. Estas regiones reflejan diferentes estadios de la identidad y madurez de la célula. Los genes en estas células se activan e inactivan, por consiguiente, durante desarrollo y, por lo tanto, pueden no expresarse simultáneamente en todas las regiones de la raíz u otro tejido. Sin embargo, combinando trozos de elementos reguladores de estos genes como se enseña en el presente documento, se puede crear un elemento regulador sintético que impulsa la expresión en las diferentes regiones de un tejido particular. Los elementos reguladores proporcionados pueden retener la especificidad de tejido, aunque se pueden crear patrones de expresión únicos.
La divulgación se refiere a composiciones y métodos referidos a elementos reguladores híbridos de la planta y a métodos de su uso. Las composiciones comprenden secuencias de polinucleótidos para los elementos reguladores expuestos en SEQ ID NO: 1-74, y fragmentos, variantes y complementos de las mismas. En un aspecto de la divulgación, las composiciones comprenden secuencias de polinucleótidos para elementos reguladores híbridos expuestas en SEQ ID NO: 11 -30, 35-47 y 50-59, y fragmentos, variantes y complementos de las mismas.
Las composiciones pueden incluir las secuencias de nucleótidos para los elementos reguladores, fragmentos y variantes de las mismas. En aspectos específicos de la divulgación, las secuencias del elemento regulador híbrido desveladas en el presente documento son útiles para cambiar el patrón de expresión con respecto a un elemento regulador nativo. Las secuencias de nucleótidos también encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la posterior expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta de interés o como sondas para el aislamiento de otros elementos reguladores. Un aspecto de la divulgación proporciona construcciones de ADN que comprenden una secuencia de polinucleótidos del elemento regulador expuesta en SEQ ID NO: 1-10, 31-34 y 61-74, o elementos reguladores híbridos expuestos en SEQ ID NO: 11-30 y 35-60, o un fragmento funcional o variantes de las mismas, unidos operativamente a una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés, y cualquier combinaciones de los mismos.
El término "elemento regulador" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene actividad reguladora génica, es decir, una que tiene la capacidad de afectar el patrón de expresión transcripcional y/o traduccional de un polinucleótido transcribible unido operativamente. Por lo tanto, el término "actividad reguladora génica" se refiere a la capacidad de afectar la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente afectando la transcripción y/o la traducción de esa molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente. La actividad reguladora génica puede ser positiva y/o negativa y el efecto se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, tisulares, medioambientales, fisiológicas, patológicas, del ciclo celular y/o químicamente sensibles, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
Los elementos reguladores, tales como promotores, potenciadores, conductores y regiones de intrón, son moléculas de ácido nucleico que tienen actividad reguladora génica y desempeñan una parte integral en la expresión global de los genes en las células vivas. Por lo tanto, los elementos reguladores aislados, tales como los promotores y los conductores que funcionan en plantas, son útiles para modificar fenotipos de plantas mediante los métodos de ingeniería genética. Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente.
Como se usa en el presente documento, un "patrón de expresión génica" es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente en una molécula de ARN transcrita. La expresión se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, tisulares, medioambientales, fisiológicas, patológicas, del ciclo celular y/o químicamente sensibles, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. La molécula de ARN transcrita puede ser traducida para producir una molécula de proteína o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra reguladora, tal como un ARNbc, un ARNt, un ARNr y un miARN. Como se usa en el presente documento, un "patrón de expresión génica único" es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente en una molécula de ARN transcrita que se diferencia de otro elemento regulador por su patrón de expresión regional transcripcional de tejido o subtejido específico, o tipo de célula o patrón de expresión del estado celular y no simplemente una diferencia en la cantidad de transcripción cuantitativa. Un "patrón de expresión génica único", como se usa en el presente documento, no incluye un patrón de expresión constitutiva. En un aspecto de la divulgación, un patrón de expresión génica único incluye una reducción o eliminación de la transcripción de un ácido nucleico heterólogo en un tejido particular. En otro aspecto de la divulgación, un patrón de expresión génica único incluye un aumento o producción de transcripción de un ácido nucleico heterólogo en un tejido particular. Como se usa en el presente documento, un "patrón de expresión transcripcional regional" o "patrón de expresión transcripcional subregional" pretende significar cualquier patrón de expresión que no es ubicuo, solo tiene cierta expresión detectable en ciertas regiones de un cierto (ciertos) tejidos, y cualquier otra expresión fuera de la región o regiones debe estar en niveles basales nominales ("expresión ectópica"). El término "expresión aérea" se refiere a un patrón de expresión génica de un polinucleótido en uno o más tejidos de una planta por encima del suelo. En un aspecto de la divulgación, la secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés se expresa en un patrón de expresión en raíz ubicuo o un patrón de expresión aéreo ubicuo. En un aspecto de la divulgación, la expresión aérea no incluye la expresión en el polen de una planta.
Las secuencias del elemento regulador o variantes o fragmentos de las mismos, cuando se unen operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, pueden impulsar la expresión constitutiva de la secuencia de polinucleótidos heteróloga en el tejido de la planta que expresa esta construcción. El término "expresión constitutiva" significa que la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga se encuentra en toda la planta o en la mayoría de los tejidos de la planta.
Como se usa en el presente documento, el término "expresión de proteínas" es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita en una molécula de proteína. La expresión de proteínas se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere, en general, a una molécula de ácido nucleico que participa en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor puede ser inicialmente aislado de la región flanqueante 5' de una copia genómica de un gen. Alternativamente, los promotores pueden ser moléculas de ADN sintéticamente producidas o manipuladas. Los elementos reguladores pueden comprender promotores y actividad de promotor.
En un aspecto de la divulgación, se proporcionan fragmentos de un elemento regulador desvelado en el presente documento. Los fragmentos del elemento regulador puede presentar actividad de promotor, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros elementos reguladores y fragmentos de elementos reguladores, tales como en la construcción de elementos reguladores híbridos. En aspectos específicos de la divulgación, se proporcionan fragmentos de un elemento regulador que comprenden, o alternativamente que consisten en o que consisten esencialmente en, al menos aproximadamente 50, 95, 150, 250, 500 o aproximadamente 750 o más nucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótido que tiene actividad de promotor desvelada en el presente documento. Dichos fragmentos pueden presentar al menos aproximadamente el 85 por ciento, aproximadamente el 90 por ciento, aproximadamente el 95 por ciento, aproximadamente el 98 por ciento, o aproximadamente el 99 por ciento, o más, de identidad con una secuencia de referencia cuando se alinea óptimamente con la secuencia de referencia. Como se usa en el presente documento, el término "segmento de elemento regulador" es un fragmento de un elemento regulador caracterizado por una abundancia de motivos reconocibles del elemento regulador usando al menos los descritos por Higo, K et al. (1998) Nucleic Acids Research, en donde el segmento de elemento regulador produce un patrón de expresión deseado o único cuando se combina con al menos otro segmento del elemento regulador. Como se usa en el presente documento, un "segmento de elemento regulador" se usa indistintamente con un "segmento", un "segmento definido" y "segmento parental". En un aspecto de la divulgación, una abundancia de motivos reconocibles de elemento regulador incluye al menos 25 motivos, al menos 30 motivos, al menos 40 motivos, o al menos 50 motivos. En aspectos específicos de la divulgación, se proporcionan segmentos de un elemento regulador que comprenden al menos aproximadamente 50, 95, 150, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, o aproximadamente 1750 nucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótido desvelada en el presente documento. En otro aspecto de la divulgación, un segmento comprende al menos aproximadamente 50, 95, 150, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, o aproximadamente 1750 nucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótido, pero menos de la longitud completa de la molécula de polinucleótido parental. En un aspecto de la divulgación, un segmento de elemento regulador comprende un fragmento de un elemento regulador parental, en donde el fragmento comprende no más de aproximadamente 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000 o 500 nucleótidos contiguos de un elemento regulador parental. En un aspecto adicional de la divulgación, un elemento regulador híbrido comprende segmentos de polinucleótidos contiguos, en donde los segmentos de polinucleótidos contiguos inician la transcripción en una célula de la planta y producen un único patrón de expresión en tejido. Como se usa en el presente documento, un "ensamblaje" significa dos o más segmentos de elementos reguladores unidos operativamente. En un aspecto de la divulgación, un ensamblaje de segmentos incluye segmentos que son contiguos. En otro aspecto de la divulgación, un ensamblaje de segmentos incluye uno o más de los segmentos que no son contiguos, pero que todavía producen un patrón de expresión.
Un elemento regulador o un segmento de elemento regulador también se puede analizar para la presencia de motivos promotores activos, es decir, secuencias de ADN características, tales como una caja TATAA y otros motivos de sitios de unión a factores de transcripción conocidos. La identificación de dichos motivos conocidos se puede usar por un experto en la técnica para diseñar elementos reguladores híbridos que tienen un patrón de expresión deseado o único cuando se compara con el elemento regulador fuente o parental. Los motivos de secuencias de nucleótidos encontrados en los elementos reguladores se han caracterizado previamente y están disponibles en el base de datos PLACE (Higo, K et al. (1998) Nucleic Acids Research; dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/, a la que se puede acceder en la malla mundial usando el prefijo "www"; véase, por tanto, el número de solicitud de patente PCT WO 2014/164399). En un aspecto de la divulgación, un motivo comprende una secuencia de al menos seis nucleótidos. En algunos aspectos de la divulgación, un segmento de elemento regulador comprende aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125 o 150 motivos por cada 1000 nucleótidos. En algunos aspectos de la divulgación, un elemento regulador comprende al menos un motivo por aproximadamente cada 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, el término "potenciador" o "elemento potenciador" se refiere a un elemento regulador de la transcripción que actúa en cis, también conocido elemento en cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión global, pero que normalmente es insuficiente solo para impulsar la transcripción, de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no incluyen normalmente un sitio de iniciación de la transcripción (TSS) o caja TATA. Un elemento regulador puede comprender naturalmente uno o más elementos potenciadores que afectan la transcripción de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente. Un elemento potenciador aislado también se puede fusionar con un promotor heterólogo para producir un elemento en cis de promotor heterólogo, que confiere un aspecto de la modulación de expresión génica global. Un elemento regulador o fragmento de elemento regulador desvelado en el presente documento puede comprender uno o más elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos operativamente. Se cree que muchos elementos potenciadores se unen a proteínas de unión a ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN o que facilitan la abertura selectiva de la doble hélice en el sitio de iniciación de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar uniéndose a factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio de potenciador. Los elementos potenciadores se pueden identificar por varias técnicas, que incluyen el análisis de deleciones, es decir, la deleción de uno o más nucleótidos desde el extremo 5’ o internos a un promotor; el análisis de proteínas de unión a ADN usando huella de DNAsa I, interferencia por metilación, ensayos de cambio de movilidad por electroforesis, huella genómica in vivo por PCR mediada por ligación y otros ensayos convencionales; o por análisis de similitud de secuencias de ADN usando motivos de elementos en cis conocidos o elementos potenciadores como secuencia diana o motivo diana con métodos de comparación de secuencias de ADN convencionales, tales como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador se puede estudiar además por mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o por otros métodos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener por síntesis química o por aislamiento de elementos reguladores, que incluyen dichos elementos, y se pueden sintetizar con nucleótidos de flanqueo adicionales que contienen sitios útiles de enzimas de restricción para facilitar la manipulación de subsecuencias. Por lo tanto, están englobados el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores según los métodos desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos transcribibles unidas operativamente.
Como se usa en el presente documento, el término "región flanqueante de 5'" se refiere a una molécula de ADN aislada de una copia genómica de un gen y se define, en general, como un segmento de polinucleótido que empieza en el sitio de iniciación de la secuencia codificante de proteínas y se extiende 5' a través de la región no traducida 5' y en la región promotora. Estas secuencias, o conductores, pueden ser elementos de ADN sintéticamente producidos o manipulados.
Se puede usar un conductor como elemento regulador de 5' para modular la expresión de una molécula de polinucleótido transcribióle unida operativamente. Se pueden usar moléculas conductoras con elementos heterólogos o con sus elementos nativos.
Como se usa en el presente documento, el término "híbrido" se refiere a una única molécula de ADN sintética producida fusionando una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración, es decir, fusionada con la otra. La molécula de ADN híbrida es así una nueva molécula de ADN que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, el término "elemento regulador híbrido" se refiere a un elemento regulador producida a través de dicha manipulación de moléculas de ADN. Un elemento regulador híbrido puede combinar dos o más segmentos de ADN. Por lo tanto, están englobados el diseño, la construcción y el uso de elementos reguladores híbridos según los métodos desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos transcribibles unidas operativamente. En un aspecto de la divulgación, un elemento regulador híbrido comprende dos o más segmentos de ADN. En otro aspecto de la divulgación, un elemento regulador híbrido comprende tres o más segmentos de ADN. En otro aspecto de la divulgación, un elemento regulador híbrido comprende cuatro o más segmentos de ADN. En un aspecto de la divulgación, un fragmento de segmento de ADN puede ser un segmento parental. Como se usa en el presente documento, un "segmento" y "segmento parental" son intercambiables y pretenden referirse a fragmentos de "elementos reguladores parentales" nativos que se han analizado por motivos que se predice que producen un patrón de expresión regional en el tejido. Una combinación de segmentos parentales o variantes de los mismos puede producir un elemento regulador híbrido que expresa un gen de interés en un patrón de expresión ubicuo en tejido que es único de cada patrón de expresión individual de los elementos reguladores parentales. En un aspecto de la divulgación, un segmento parental puede ser una variante de un elemento regulador parental. En un aspecto de la divulgación, los elementos reguladores parentales expuestos en SEQ ID NO: 1-10, 31-34 y 61-74 se pueden usar como elementos reguladores parentales para generar segmentos parentales y variantes de los mismos. Por tanto, como elementos reguladores parentales se incluyen fragmentos funcionales, segmentos o variantes de las secuencias de polinucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1 -10, 31 -34 y 61-74, en donde dichas secuencias de polinucleótidos inician la transcripción en una célula de la planta, y una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia con las secuencias de polinucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1-10, 31-34 y 61-74, en donde dichas secuencias de polinucleótidos inician la transcripción en una célula de la planta. En ciertos aspectos de la divulgación, un elemento regulador parental puede incluir un elemento regulador parental que se origina de una planta. En otro aspecto de la divulgación, un elemento regulador parental puede incluir un elemento regulador parental que se origina de una bacteria o un virus.
Se proporcionan elementos reguladores híbridos que producen un patrón de expresión en plantas que es único con respecto a los elementos reguladores parentales, en donde el elemento regulador híbrido contiene segmentos o fragmentos de más de un elemento regulador parental. En un aspecto de la divulgación, el elemento regulador híbrido produce un patrón de expresión específico de tejido que es diferente con respecto a los elementos reguladores parentales. En otro aspecto de la divulgación, los elementos reguladores híbridos ensanchan el patrón de expresión hasta un patrón de expresión ubicuo en un tejido de planta con respecto a patrones de expresión en tejido regionales expresados de un conjunto dado de elementos reguladores parentales. En otro aspecto de la divulgación, los elementos reguladores híbridos expresan un intervalo de expresión más estrecho con respecto a un intervalo de patrones de expresión más ancho expresado de un conjunto dado de elementos reguladores parentales. En otro aspecto de la divulgación, los elementos reguladores en raíz híbridos pueden producir un patrón de expresión constitutiva que se diferencia de un patrón de expresión no constitutiva de elementos reguladores parentales.
En un aspecto de la divulgación, las secuencias de polinucleótidos desveladas en el presente documento, localizadas dentro de intrones, o 3' de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de intrones adecuados incluyen, pero no se limitan a, intrón IVS6 del maíz, o el intrón de actina del maíz. Un elemento regulador también puede incluir los elementos localizados aguas abajo (3') con respecto al sitio de iniciación de la transcripción, o dentro de regiones transcritas, o ambos. Un elemento regulador postranscripcional puede incluir elementos que son activos tras la iniciación de la transcripción, por ejemplo potenciadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, y determinantes de estabilidad de ARNm.
Los elementos reguladores, o variantes o fragmentos de los mismos, pueden estar asociados operativamente con uno o más elementos reguladores heterólogos para modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Dicha modulación incluye potenciar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo, modular los eventos postranscripcionales, o potenciar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo y modular los eventos postranscripcionales. Por ejemplo, uno o más elementos reguladores, o fragmentos de los mismos, pueden estar asociados operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejido, o fragmento de los mismos, para modular la actividad de dichos promotores dentro de tejidos deseados en células vegetales.
Las composiciones pueden englobar ácido nucleico aislado o recombinante. Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "recombinante" se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de ácido nucleico que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula hospedadora bacteriana o de planta recombinante in vitro o heteróloga. Una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante, o porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (óptimamente secuencias codificantes de proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversos aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Las secuencias del elemento regulador híbrido desveladas en el presente documento se pueden aislar de la región no traducida 5' que flanquea sus sitios de iniciación de la transcripción respectivos. Como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido" y "nucleótido" están ambos previstos para significar uno o más nucleótidos y se pueden usar indistintamente en singular o plural.
Los fragmentos y variantes de las secuencias de polinucleótidos del elemento regulador desveladas también están englobadas por la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos de secuencias reguladoras pueden retener la actividad biológica de iniciar la transcripción, más particularmente impulsar la transcripción en un modo específico de tejido o específico de subtejido. Alternativamente, fragmentos de una secuencia de polinucleótidos que son útiles como sondas de hibridación pueden no retener necesariamente la actividad biológica. Los fragmentos de una secuencia de polinucleótidos para la región reguladora pueden variar de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta un nucleótido menos de la longitud completa de una cualquiera de SEQ ID NO: 1-74.
Se puede preparar una porción biológicamente activa de un elemento regulador aislando una porción de la secuencia reguladora, y evaluando el actividad de promotor de la porción. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de polinucleótidos reguladora comprenden al menos aproximadamente 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 u 800 nucleótidos o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia reguladora de longitud completa desvelada en el presente documento.
Para secuencias de polinucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos a uno o más sitios internos dentro de la secuencia de polinucleótidos nativa y/o una sustitución de uno o más nucleótidos a uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Para secuencias de polinucleótidos, se pueden identificar variantes con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas como, por ejemplo, con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se expone brevemente más adelante. Las secuencias de polinucleótidos de variante pueden incluir secuencias de polinucleótidos sintéticamente derivadas, tales como las generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio. En general, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular, que incluyen SEQ ID NO: 1-74, de la divulgación tendrán al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular como se ha determinado por los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en cualquier parte en el presente documento. Una variante biológicamente activa de una secuencia de polinucleótidos de la divulgación se puede diferenciar de esa secuencia en tan solo 1-15 restos de ácido nucleico, tan solo 1 -10, tan solo 6-10, tan solo 5, tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 resto de ácido nucleico.
Las secuencias de polinucleótidos de variante también engloban secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como barajado de ADN. Con dicho procedimiento, las secuencias de polinucleótidos del elemento regulador se pueden manipular para crear nuevos elementos reguladores. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar de forma homóloga in vitro o in vivo. Se conocen en la técnica las estrategias para dicho barajado de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech.
15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de EE. UU. N.25.605.793 y 5.837.458.
Las secuencias de polinucleótidos de la divulgación se pueden usar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De este modo, se pueden usar métodos tales como PCR e hibridación para identificar dichas secuencias basándose en su homología de secuencias con las secuencias expuestas en el presente documento. Las secuencias aisladas basándose en su identidad de secuencia con las secuencias enteras expuestas en el presente documento o con fragmentos de los mismos están englobadas por la presente divulgación.
En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos de diseño de cebadores de PCR y clonación por PCR se conocen, en general, en la técnica y se desvelan en Sambrook, arriba. Véanse, por lo tanto, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no se limitan a, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector y cebadores parcialmente desapareados.
En las técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de polinucleótidos conocida se usa como una sonda que se híbrida selectivamente con otras secuencias de polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN o fragmentos de ADNc genómicos clonados (es decir, bibliotecas genómicas o de ADNc) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden preparar sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias del elemento regulador de la divulgación. Los métodos de preparación de las sondas para la hibridación y para la construcción de bibliotecas genómicas se conocen, en general, en la técnica y se desvelan en Sambrook, arriba.
Por ejemplo, se puede usar una secuencia de elemento regulador completa desvelada en el presente documento, o una o más porciones de las mismas, como sonda capaz de hibridarse específicamente con las secuencias del elemento regulador correspondientes y ARN mensajeros. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre secuencias del elemento regulador y, en general, tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Dichas sondas se pueden usar para amplificar secuencias del elemento regulador correspondientes de una planta elegida por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el cribado por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (o placas o colonias, véase, por ejemplo, Sambrook, arriba).
En general, las secuencias que tienen actividad de promotor y se hibridan con las secuencias de polinucleótidos, y fragmentos de las mismas, desveladas en el presente documento serán al menos 40 % al 50 % homólogas, aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % al 98 % homólogas o más con las secuencias desveladas. Es decir, la similitud de secuencias de las secuencias puede variar, compartiendo al menos aproximadamente del 40 % al 50 %, aproximadamente del 60 % al 70 %, y aproximadamente el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de referencia (objeto) se determina como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata (consulta) que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos respectivos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar sustituciones conservativas de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencia se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible, tal como BLAST, BLAST-2. Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento con respecto a la longitud completa de las secuencias que se comparan. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (por ejemplo, el porcentaje de identidad de la secuencia problema = número de posiciones idénticas entre las secuencias de consulta y las secuencias objetivo/número total de posiciones de secuencia problema x 100).
Las modificaciones de las secuencias del elemento regulador aisladas de la presente divulgación pueden proporcionar un intervalo de expresión de la secuencia de polinucleótidos heteróloga. Por lo tanto, se pueden modificar para ser promotores débiles o promotores fuertes. En general, un "promotor débil" significa un promotor que impulsa la expresión de una secuencia codificante a un bajo nivel. Un "bajo nivel" de expresión pretende significar la expresión a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. En cambio, un promotor fuerte impulsa la expresión de una secuencia codificante a un alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos.
Los elementos reguladores desvelados en el presente documento se pueden usar para aumentar o disminuir la expresión, dando así como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Las secuencias de polinucleótidos desveladas en el presente documento, así como las variantes y los fragmentos de las mismas, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta. Las secuencias del elemento regulador son útiles en este aspecto cuando se unen operativamente con una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión se va a controlar para lograr una respuesta fenotípica deseada. El término "unido operativamente" significa que la transcripción o traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia del elemento regulador. De este modo, las secuencias del elemento regulador desveladas en el presente documento se pueden proporcionar en casetes de expresión junto con secuencias de polinucleótidos heterólogas de interés para la expresión en la planta de interés, más particularmente para la expresión del tejido reproductor de la planta transformada.
Los elementos reguladores de las realizaciones se pueden proporcionar en construcciones de ADN para la expresión en el organismo de interés. Un "casete de expresión", como se usa en el presente documento, significa una construcción de ADN que comprende un elemento regulador de las realizaciones operativamente unido a un polinucleótido heterólogo que expresa un transcrito o gen de interés. Dichos casetes de expresión comprenderán una región de iniciación de la transcripción que comprende una de las secuencias del elemento regulador de polinucleótidos de la presente divulgación, o variantes o fragmentos de las mismas, unida operativamente a la secuencia de nucleótidos heteróloga. Dicho casete de expresión se puede proporcionar con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de polinucleótidos esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener además genes marcadores de selección, así como regiones de terminación en 3'.
El casete de expresión puede incluir, en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de iniciación de la transcripción (es decir, un promotor híbrido, o variante o fragmento del mismo, de la divulgación), una región de iniciación de la traducción, una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo hospedador. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, potenciadores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción ) y/o el polinucleótido de los aspectos de la divulgación pueden ser nativas/análogas a la célula hospedadora o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de los aspectos de la divulgación pueden ser heterólogos a la célula hospedadora o entre sí.
Como se usa en el presente documento, "heterólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana intencionada. Por ejemplo, un elemento regulador operativamente unido a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que derivó el polinucleótido o, si es de la misma especie/análoga, uno o ambos se modifican sustancialmente de su forma original y/o locus genómico o el elemento regulador no es el elemento regulador nativo para el polinucleótido operativamente unido.
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente unida de interés, puede ser nativa con el hospedador de la planta, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al elemento regulador, siendo expresada la secuencia de ADN, el hospedador de la planta, o cualquier combinación de los mismos).
Los elementos reguladores desvelados en el presente documento, así como las variantes y los fragmentos de los mismos, son útiles para la ingeniería genética de plantas, por ejemplo, para la producción de una planta transformada o transgénica, para expresar un fenotipo de interés. Como se usa en el presente documento, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. En general, el polinucleótido heterólogo está establemente integrado dentro del genoma de una planta transgénica o transformada de forma que el polinucleótido pase a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN recombinante. Se debe entender que, como se usa en el presente documento, el término "transgénico" incluye cualquier célula, estirpe celular, callo, tejido, parte de planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo, que incluye los transgénicos inicialmente así alterados, así como los creados por cruces sexuales o propagación asexual del transgénico inicial.
Un "evento" transgénico se produce por la transformación de células vegetales con una construcción de ADN heteróloga, que incluye un casete de expresión de ácido nucleico que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas resultantes de la inserción del transgén en el genoma de la planta y la selección de una planta particular caracterizada por la inserción en una localización de genoma particular. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgén. Al nivel genético, un evento es parte de la constitución genética de una planta. El término "evento" también se refiere a la descendencia producida por un cruce sexual entre el transformante y otra planta en donde la descendencia incluyen el ADN heterólogo.
Como se usa en el presente documento, el término planta incluye plantas enteras, órganos de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), células vegetales, protoplastos de la planta, cultivos de tejido de células de planta de los que se pueden regenerar las plantas, callos de planta, grupos de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutas, frutos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíz y anteras. Grano pretende significar la semilla madura producida por productores comerciales para fines distintos de cultivar o reproducir las especies. La descendencia, las variantes y los mutantes de las plantas generadas también están incluidos dentro del alcance de la divulgación, a condición de que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. Como se usa en el presente documento, el término incluye
Las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento se pueden usar para la transformación de cualquier especie de planta, que incluye, pero no se limita a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies de plantas incluyen maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo de cola de zorro (Setaria italica), mijo de dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), alazor (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgarís), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coníferas.
Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías de Lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis, tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizcleño (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo.
Las coníferas que se pueden emplear incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino elliotii (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorto (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesií); cicuta occidental (Tsuga canadensis);pícea de Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); píceas verdaderas, tales como abeto blanco (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea) y cedros, tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas pueden ser plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras realizaciones, las plantas de maíz y soja son óptimas, y en aún otras realizaciones las plantas de maíz son óptimas.
Otras plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas de aceite incluyen algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarroba, fenogreco, soja, judías de huerto, caupí, frijol mungo, judía de Lima, haba, lentejas, garbanzos, etc.
Las secuencias codificantes heterólogas expresadas por una secuencia del elemento regulador desvelada en el presente documento se pueden usar para variar el fenotipo de una planta. Diversos cambios en el fenotipo son de interés, que incluyen modificar la expresión de un gen en una planta, alterar el mecanismo de defensa contra los patógenos o insectos de una plata, aumentar la tolerancia de una planta a herbicidas, alterar el desarrollo de la planta para responder al estrés medioambiental, modular la respuesta de la planta a las sales, la temperatura (calor y frío) y la sequía. Estos resultados se pueden lograr por la expresión de una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés que comprende un producto génico apropiado. En aspectos específicos de la divulgación, la secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés es una secuencia de planta endógena cuyo nivel de expresión es elevado en la planta o parte de la planta. Los resultados se pueden lograr proporcionando la expresión alterada de uno o más productos de genes endógenos, particularmente hormonas, receptores, moléculas de señalización, enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la captación en nutrientes de la planta. Estos cambios provocan un cambio en el fenotipo de la planta transformada. En ciertos aspectos de la divulgación, los patrones de expresión de los elementos reguladores desvelados en el presente documento son útiles para muchos tipos de cribado.
Las categorías generales de secuencias de polinucleótidos de interés que se pueden utilizar con las secuencias reguladoras desveladas en el presente documento incluyen, por ejemplo, los genes implicados en la información, tales como dedos de cinc, los implicados en la comunicación, tales como cinasas y los implicados en el mantenimiento, tales como las proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronómica, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, resistencia al estrés medioambiental (alteración de la tolerancia al frío, la sal, la sequía, etc.) y características del grano. Todavía otras categorías de transgenes incluyen genes para inducir la expresión de productos exógenos, tales como enzimas, cofactores y hormonas de plantas y otros eucariotas, así como organismos procariotas. Se reconoce que cualquier gen de interés se puede unir operativamente al elemento regulador de la divulgación y expresar en la planta.
A modo de ilustración, sin pretender ser limitante, lo siguiente es una lista de otros ejemplos de los tipos de genes que se pueden usar a propósito de los elementos reguladores desvelados en el presente documento.
1. Transgenes que confieren resistencia a insectos o enfermedad y que codifican:
1. (A) Genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Las defensas de las plantas son frecuentemente activadas por la interacción específica entre el producto de un gen de resistencia (R) a enfermedad en la planta y el producto de un gen de avirulencia (Avr) correspondiente en el patógeno. Se puede transformar una variedad de plantas con el gen de resistencia clonado para manipular plantas que son resistentes a cepas de patógenos específicas. Véanse, por ejemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonación del gen de tomate Cf-9 para la resistencia a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gen Pto de tomate para la resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato codifica una proteína cinasa); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae); McDowell y Woffenden, (2003) Trends Biotechnol.
21(4):178-83 y Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11 (6):567-82. Una planta resistente a una enfermedad es una que es más resistente a un patógeno en comparación con la planta natural.
. (B) Genes que codifican una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de los mismos o un polipéptido sintético modelado en ellos. Véanse, por ejemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que desvelan la clonación y la secuencia de nucleótidos de un gen de delta-endotoxina de Bt. Además, las moléculas de ADN que codifican genes de delta-endotoxina se pueden comprar de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md.), por ejemplo, con los números de acceso ATCC® 40098, 67136, 31995 y 31998. Otros ejemplos no limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis que están genéticamente manipulados se dan en las siguientes patentes y solicitudes de patente: patentes de EE. UU. N.25.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332; 7.179.965, 7.208.474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 y los documentos de patente WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 y WO 1997/40162.
También se pueden apilar genes que codifican proteínas pesticidas, que incluyen, pero no se limitan a: proteínas insecticidas de Pseudomonas sp. tales como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de la cepa CHAO y Pf-5 (previamente fluorescens) de Pseudomonas protegens (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: N.° de acceso de GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) y de Pseudomonas pseudoalcaligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 y Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas insecticidas de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 y Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069), número de patente de EE. u U. 6.048.838 y número de patente de EE. UU. 6.379.946; un polipéptido PIP-1 del número de serie de EE. UU. 13792861; un polipéptido AfIP-1A y/o AflP-1B del número de serie de EE. UU. 13/800233; un polipéptido PHI-4 del número de serie de EE. UU. 13/839702; un polipéptido PIP-47 del número de serie PCT PCT/US14/51063; un polipéptido PIP-72 del número de serie PCT PCT/US14/55128; un polipéptido PtIP-50 y un polipéptido PtIP-65 del número de publicación PCT WO2015/120270; un polipéptido PtIP-83 del número de publicación PCT WO2015/120276; un polipéptido PtIP-96 del número de serie PCT PCT/US 15/55502; y 5-endotoxinas que incluyen, pero no se limitan a, las clases Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51 y Cry55 de genes de 5-endotoxina y los genes Cyt1 y Cyt2 citolíticos de B. thuringiensis. Los miembros de estas clases de proteínas insecticidas de B. thuringiensis incluyen, pero no se limitan a, Cry1Aa1 (N.° de acceso AAA22353); Cry1Aa2 (N.° de acceso N.° de acceso AAA22552); Cry1Aa3 (n .° de acceso BAA00257); Cry1Aa4 (N.° de acceso CAA31886); Cry1Aa5 (N.° de acceso BAA04468); Cry1Aa6 (N.° de acceso AAA86265); Cry1Aa7 (N.° de acceso AAD46139); Cry1Aa8 (N.° de acceso 126149); Cry1Aa9 (N.° de acceso BAA77213); Cry1Aa10 (N.° de acceso AAD55382); Cry1Aa11 (N.2 de acceso CAA70856); Cry1Aa12 (N.2 de acceso AAP80146); Cry1Aa13 (N.2 de acceso AAM44305); Cry1Aa14 (N.° de acceso AAP40639); Cry1Aa15 (N.° de acceso AAY66993); Cry1Aa16 (N.2 de acceso HQ439776); Cry1Aa17 (N.2 de acceso HQ439788); Cry1Aa18 (N.2 de acceso HQ439790); Cry1Aa19 (N.2 de acceso HQ685121); Cry1Aa20 (N.2 de acceso JF340156); Cry1Aa21 (N.° de acceso JN651496); Cry1Aa22 (n .° de acceso KC158223); Cry1Ab1 (N.2 de acceso AAA22330); Cry1Ab2 (N.2 de acceso AAA22613); Cry1Ab3 (N.° de acceso AAA22561); Cry1Ab4 (N.° de acceso BAA00071 ); Cry1Ab5 (N.° de acceso CAA28405); Cry1Ab6 (N.° de acceso AAA22420); Cry1Ab7 (N.° de acceso CAA31620); Cry1Ab8 (N.° de acceso AAA22551); Cry1Ab9 (N.° de acceso CAA38701); Cry1Ab10 (N.° de acceso A29125); Cry1Ab11 (N.° de acceso 112419); Cry1Ab12 (N.° de acceso AAC64003); Cry1Ab13 (N.2 de acceso AAN76494); Cry1Ab14 (N.2 de acceso AAG16877); Cry1Ab15 (N.2 de acceso AAO13302); Cry1Ab16 (N.° de acceso AAK55546); Cry1Ab17 (N.° de acceso AAT46415); Cry1Ab18 (N.2 de acceso AAQ88259); Cry1Ab19 (N.2 de acceso AAW31761); Cry1Ab20 (N.2 de acceso ABB72460); Cry1Ab21 (N.2 de acceso ABS18384); Cry1Ab22 (N.2 de acceso ABW87320); Cry1Ab23 (N.° de acceso HQ439777); Cry1Ab24 (N.° de acceso HQ439778); Cry1Ab25 (N.2 de acceso HQ685122); Cry1Ab26 (N.2 de acceso HQ847729); Cry1Ab27 (N.° de acceso JN135249); Cry1Ab28 (N.° de acceso JN135250); Cry1Ab29 (N.° de acceso JN135251); Cry1Ab30 (N.2 de acceso JN135252); Cry1Ab31 (N.2 de acceso JN135253); Cry1Ab32 (N.° de acceso JN135254); Cry1Ab33 (N.° de acceso AAS93798); Cry1Ab34 (N.° de acceso KC156668); tipo Cry1Ab (N.° de acceso AAK14336); tipo Cry1Ab (N.° de acceso AAK14337); tipo Cry1Ab (N.° de acceso AAK14338); tipo Cry1Ab (N.° de acceso ABG88858); Cr1Ac1 (N.° de acceso AAA22331); Cry1Ac2 (N.° de acceso AAA22338); Cry1Ac3 (N.° de acceso CAA38098); Cry1Ac4 (N.° de acceso AAA73077); Cry1Ac5 (N.° de acceso AAA22339); Cry1Ac6 (N.° de acceso AAA86266); Cry1Ac7 (N.° de acceso AAB46989); Cry1Ac8 (N.° de acceso AAC44841); Cry1Ac9 (N.° de acceso AAB49768); Cry1Ac10 (N.° de acceso CAA05505 ); Cry1Ac11 (N.2 de acceso CAA10270); Cry1Ac12 (N.2 de acceso 112418); Cry1Ac13 (N.2 de acceso AAD38701); Cry1Ac14 (N.2 de acceso AAQ06607); Cry1Ac15 (N.2 de acceso AAN07788); Cry1Ac16 (N.° de acceso AAU87037); Cry1Ac17 (N.° de acceso AAX18704); Cry1Ac18 (N.2 de acceso AAY88347); Cry1Ac19 (N.2 de acceso ABD37053); Cry1Ac20 (N.° de acceso ABB89046 ); Cry1Ac21 (N.° de acceso AAY66992 ); Cry1Ac22 (N.° de acceso ABZ01836); Cry1Ac23 (N.° de acceso CAQ30431); Cry1Ac24 (n .° de acceso ABL01535); Cry1Ac25 (N.2 de acceso FJ513324); Cry1Ac26 (N.2 de acceso FJ617446); Cry1Ac27 (n .° de acceso FJ617447); Cry1Ac28 (N.° de acceso ACM90319); Cry1Ac29 (N.° de acceso DQ438941); Cry1Ac30 (N.° de acceso GQ227507); Cry1Ac31 (N.° de acceso GU446674); Cry1Ac32 (N.2 de acceso HM061081); Cry1Ac33 (N.2 de acceso GQ866913); Cry1Ac34 (N.° de acceso HQ230364); Cry1Ac35 (N.° de acceso JF340157); Cry1Ac36 (N.° de acceso JN387137); Cry1Ac37 (N.2 de acceso JQ317685); Cry1Ad1 (N.2 de acceso AAA22340); Cry1Ad2 (N.° de acceso CAA01880); Cry1Ae1 (N.° de acceso AAA22410); Cry1Af1 (N.° de acceso AAB82749); Cry1Ag1 (N.° de acceso AAD46137); Cry1Ah1 (N.° de acceso AAQ14326); Cry1Ah2 (N.° de acceso ABB76664); Cry1Ah3 (N.° de acceso HQ439779); Cry1Ai1 (N.° de acceso AAO39719); Cry1Ai2 (N.° de acceso HQ439780); tipo Cry1A (N.° de acceso AAK14339); Cry1Ba1 (N.2 de acceso CAA29898); Cry1Ba2 (N.2 de acceso CAA65003); Cry1Ba3 (N.° de acceso AAK63251); Cry1Ba4 (N.° de acceso AAK51084); Cry1Ba5 (N.° de acceso ABO20894); Cry1 Ba6 (N.° de acceso ABL60921); Cry1 Ba7 (N.° de acceso HQ439781); Cry1 Bb1 (N.2 de acceso AAA22344); Cry1Bb2 (N.2 de acceso HQ439782); Cry1Bc1 (N.2 de acceso c Aa 86568); Cry1 Bd1 (N.° de acceso AAD10292); Cry1 Bd2 (N.° de acceso AAM93496); Cry1Be1 (N.° de acceso AAC32850); Cry1Be2 (N.° de acceso AAQ52387); Cry1Be3 (N.° de acceso ACV96720); Cry1 Be4 (N.2 de acceso HM070026); Cry1 Bf1 (N.2 de acceso CAC50778); Cry1Bf2 (N.° de acceso AAQ52380); Cry1Bg1 (N.° de acceso AAO39720); Cry1Bh1 (N.° de acceso HQ589331); Cry1Bi1 (N.2 de acceso KC156700); Cry1Ca1 (N.2 de acceso CAA30396); Cry1Ca2 (N.° de acceso CAA31951); Cry1Ca3 (N.° de acceso AAA22343); Cry1Ca4 (N.° de acceso CAA01886); Cry1Ca5 (N.° de acceso CAA65457); Cry1Ca6 [1] (N.° de acceso AAF37224 ); Cry1Ca7 (N.2 de acceso AAG50438); Cry1Ca8 (N.2 de acceso AAM00264); Cry1Ca9 (N.° de acceso AAL79362); Cry1Ca10 (N.° de acceso AAN16462); Cry1Ca11 (N.° de acceso AAX53094); Cry1Ca12 (N.° de acceso HM070027); Cry1Ca13 (N.° de acceso HQ412621); Cry1 Ca14 (N.2 de acceso JN651493); Cry1 Cb1 (N.2 de acceso M97880); Cry1 Cb2 (N.° de acceso AAG35409); Cry1Cb3 (N.° de acceso ACD50894 ); tipo Cry1Cb (N.° de acceso AAX63901); Cry1 Da1 (N.2 de acceso CAA38099); Cry1 Da2 (N.2 de acceso 176415); Cry1 Da3 (N.° de acceso HQ439784); Cry1Db1 (N.° de acceso CAA80234 ); Cry1Db2 (N.° de acceso AAK48937 ); Cry1Dc1 (N.2 de acceso ABK35074); Cry1Ea1 (N.2 de acceso CAA37933); Cry1Ea2 (N.° de acceso CAA39609); Cry1Ea3 (N.° de acceso AAA22345); Cry1Ea4 (N.° de acceso a A d 04732); Cry1Ea5 (N.° de acceso A15535); Cry1Ea6 (N.° de acceso AAL50330); Cry1Ea7 (N.° de acceso AAW72936); Cry1Ea8 (N.° de acceso ABX11258); Cry1Ea9 (N.° de acceso HQ439785); Cry1Ea10 (N.° de acceso ADR00398); Cry1Ea11 (N.° de acceso JQ652456); Cry1Eb1 (N.2 de acceso AAA22346); Cry1Fa1 (N.2 de acceso AAA22348); Cry1Fa2 (N.° de acceso AAA22347); Cry1Fa3 (N.° de acceso HM070028); Cry1Fa4 (N.° de acceso HM439638); Cry1 Fb1 (N.° de acceso CAA80235); Cry1 Fb2 (N.° de acceso BAA25298); Cry1Fb3 (N.° de acceso AAF21767); Cry1Fb4 (N.° de acceso AAC10641); Cry1Fb5 (N.° de acceso AAO13295); Cry1 Fb6 (N.° de acceso ACD50892); Cry1 Fb7 (N.° de acceso ACD50893); Cry1Ga1 (N.2 de acceso CAA80233); Cry1Ga2 (N.2 de acceso CAA70506); Cry1Gb1 (N.2 de acceso AAD10291); Cry1 Gb2 (N.2 de acceso AAO13756); Cry1 Gc1 (N.2 de acceso AAQ52381); Cry1Ha1 (N.° de acceso CAA80236); Cry1Hb1 (N.° de acceso AAA79694); Cry1Hb2 (N.° de acceso HQ439786); tipo Cry1 H (N.° de acceso AAF01213); Cry1 Ia1 (N.° de acceso CAA44633); CrylIa2 (N.° de acceso a Aa 22354); Cry1Ia3 (N.° de acceso AAC36999); Cry1Ia4 (N.° de acceso AAB00958); Cry1 Ia5 (N.° de acceso CAA70124); Cry1 Ia6 (N.° de acceso AAC26910); Cry1Ia7 (N.° de acceso AAM73516); Cry1Ia8 (N.° de acceso AAK66742); Cry1Ia9 (N.° de acceso AAQ08616); Cry1Ia10 (N.° de acceso AAP86782); Cry1Ia11 (N.° de acceso CAC85964 ); Cry1Ia12 (N.2 de acceso AAV53390); Cry1Ia13 (N.2 de acceso ABF83202); Cry1 Ia14 (N.2 de acceso ACG63871); Cry1Ia15 (N.2 de acceso FJ617445); Cry1Ia16 (N.2 de acceso FJ617448); Cry1 Ia17 (N.° de acceso GU989199); Cry1 Ia18 (N.° de acceso ADK23801); Cry1Ia19 (N.° de acceso HQ439787); Cry1Ia20 (N.° de acceso JQ228426); Cry1Ia21 (N.° de acceso JQ228424); Cry1 Ia22 (N.° de acceso JQ228427); Cry1 Ia23 (N.° de acceso JQ228428); Cry1Ia24 (N.° de acceso JQ228429); Cry1Ia25 (N.° de acceso JQ228430); Cry1Ia26 (N.° de acceso JQ228431); Cry1 Ia27 (N.° de acceso JQ228432); Cry1 Ia28 (N.° de acceso JQ228433); Cry1Ia29 (N.° de acceso JQ228434); Cry1Ia30 (N.° de acceso JQ317686); Cry1Ia31 (N.° de acceso JX944038); Cry1 Ia32 (N.° de acceso JX944039); Cry1 Ia33 (N.° de acceso JX944040); Cry1Ib1 (N.° de acceso AAA82114); Cry1Ib2 (N.° de acceso ABW88019); Cry1Ib3 (N.° de acceso ACD75515); Cry1 Ib4 (N.° de acceso HM051227); Cry1 Ib5 (N.° de acceso HM070028); Cry1Ib6 (N.° de acceso ADK38579); Cry1Ib7 (N.° de acceso JN571740); Cry1Ib8 (N.° de acceso JN675714); Cry1Ib9 (N.2 de acceso JN675715); Cry1Ib10 (N.2 de acceso JN675716); Cry1Ib11 (N.° de acceso JQ228423); Cry1Ic1 (N.° de acceso AAC62933); Cry1Ic2 (N.° de acceso AAE71691); Cry1Id1 (N.° de acceso AAD44366); Cry1Id2 (N.° de acceso JQ228422); C ry lIe l (N.2 de acceso AAG43526); Cry1Ie2 (N.s de acceso HM439636); Cry1Ie3 (N.s de acceso KC156647); Cry1Ie4 (N.2 de acceso KC156681); Cry1 lf1 (N.2 de acceso AAQ52382); Cry1 Ig 1 (N.° de acceso KC156701); tipo Cry11 (N.° de acceso AAC31094); tipo Cry11 (N.° de acceso ABG88859); Cry1Ja1 (N.° de acceso AAA22341); Cry1Ja2 (N.° de acceso HM070030); Cry1Ja3 (N.° de acceso JQ228425); Cry1Jb1 (N.° de acceso AAA98959); Cry1Jc1 (N.° de acceso AAC31092); Cry1Jc2 (N.2 de acceso AAQ52372); Cry1Jd1 (N.2 de acceso CAC50779); Cry1Ka1 (N.° de acceso AAB00376); Cry1Ka2 (N.° de acceso HQ439783); Cry1La1 (N.° de acceso AAS60191); Cry1 La2 (N.° de acceso HM070031); Cry1 Ma1 (N.° de acceso FJ884067); Cry1 Ma2 (N.2 de acceso KC156659); Cry1Na1 (N.2 de acceso KC156648); Cry1Nb1 (N.2 de acceso KC156678); tipo Cry1 (N.° de acceso AAC31091); Cry2Aa1 (N.° de acceso AAA22335); Cry2Aa2 (N.° de acceso Aa A83516); Cry2Aa3 (N.° de acceso D86064); Cry2Aa4 (N.° de acceso AAC04867); Cry2Aa5 (N.° de acceso CAA10671); Cry2Aa6 (N.° de acceso CAA10672); Cry2Aa7 (N.° de acceso CAA10670); Cry2Aa8 (N.° de acceso AAO13734); Cry2Aa9 (N.° de acceso AAO13750 ); Cry2Aa10 (N.° de acceso AAQ04263); Cry2Aa11 (N.° de acceso AAQ52384); Cry2Aa12 (N.2 de acceso ABI83671); Cry2Aa13 (N.2 de acceso ABL01536); Cry2Aa14 (N.° de acceso ACF04939); Cry2Aa15 (N.° de acceso JN426947); Cry2Ab1 (N.° de acceso AAA22342); Cry2Ab2 (N.° de acceso CAA39075); Cry2Ab3 (N.° de acceso AAG36762); Cry2Ab4 (N.° de acceso AAO13296 ); Cry2Ab5 (N.° de acceso AAQ04609); Cry2Ab6 (N.° de acceso AAP59457); Cry2Ab7 (N.° de acceso AAZ66347); Cry2Ab8 (N.° de acceso ABC95996); Cry2Ab9 (N.° de acceso ABC74968); Cry2Ab10 (N.° de acceso EF157306); Cry2Ab11 (N.° de acceso CAM84575); Cry2Ab12 (N.° de acceso ABM21764); Cry2Ab13 (N.° de acceso ACG76120); Cry2Ab14 (N.2 de acceso ACG76121); Cry2Ab15 (N.2 de acceso HM037126); Cry2Ab16 (N.2 de acceso GQ866914); Cry2Ab17 (N.2 de acceso HQ439789); Cry2Ab18 (N.2 de acceso JN135255); Cry2Ab19 (N.° de acceso JN135256); Cry2Ab20 (n .° de acceso JN135257); Cry2Ab21 (N.2 de acceso JN135258); Cry2Ab22 (N.2 de acceso JN135259); Cry2Ab23 (N.2 de acceso JN135260); Cry2Ab24 (N.2 de acceso JN135261); Cry2Ab25 (N.2 de acceso JN415485); Cry2Ab26 (N.° de acceso JN426946); Cry2Ab27 (N.° de acceso JN415764); Cry2Ab28 (N.° de acceso JN651494); Cry2Ac1 (N.° de acceso CAA40536); Cry2Ac2 (N.° de acceso AAG35410); Cry2Ac3 (N.° de acceso AAQ52385); Cry2Ac4 (N.° de acceso ABC95997); Cry2Ac5 (N.° de acceso ABC74969); Cry2Ac6 (N.° de acceso ABC74793); Cry2Ac7 (N.° de acceso CAL18690); Cry2Ac8 (N.° de acceso CAM09325); Cry2Ac9 (N.° de acceso CAM09326); Cry2Ac10 (N.° de acceso ABN15104); Cry2Ac11 (N.° de acceso CAM83895); Cry2Ac12 (N.° de acceso CAM83896); Cry2Ad1 (N.° de acceso AAF09583); Cry2Ad2 (N.° de acceso ABC86927); Cry2Ad3 (N.2 de acceso CAK29504); Cry2Ad4 (N.2 de acceso CAM32331); Cry2Ad5 (N.° de acceso CAO78739 ); Cry2Ae1 (N.° de acceso AAQ52362); Cry2Af1 (N.° de acceso ABO30519); Cry2Af2 (N.2 de acceso GQ866915); Cry2Ag1 (N.2 de acceso ACH91610); Cry2Ah1 (N.° de acceso EU939453); Cry2Ah2 (N.° de acceso ACL80665); Cry2Ah3 (N.° de acceso GU073380); Cry2Ah4 (N.2 de acceso KC156702); Cry2Ai1 (N.2 de acceso FJ788388); Cry2Aj (N.° de acceso ); Cry2Ak1 (N.° de acceso KC156660); Cry2Ba1 (N.° de acceso KC156658); Cry3Aa1 (N.2 de acceso AAA22336); Cry3Aa2 (N.2 de acceso AAA22541); Cry3Aa3 (N.° de acceso CAA68482); Cry3Aa4 (N.° de acceso AAA22542); Cry3Aa5 (N.° de acceso a Aa 50255); Cry3Aa6 (N.° de acceso AAC43266); Cry3Aa7 (N.° de acceso CAB41411); Cry3Aa8 (N.° de acceso AAS79487); Cry3Aa9 (N.° de acceso AAW05659); Cry3Aa10 (N.° de acceso AAU29411); Cry3Aa11 (N.° de acceso AAW82872); Cry3Aa12 (N.° de acceso ABY49136 ); Cry3Ba1 (N.2 de acceso CAA34983); Cry3Ba2 (N.2 de acceso CAA00645); Cry3Ba3 (N.2 de acceso JQ397327); Cry3Bb1 (N.2 de acceso AAA22334); Cry3Bb2 (N.2 de acceso a Aa 74198); Cry3Bb3 (N.° de acceso 115475); Cry3Ca1 (N.° de acceso CAA42469); Cry4Aa1 (N.° de acceso CAA68485); Cry4Aa2 (N.° de acceso BAA00179); Cry4Aa3 (N.° de acceso CAD30148); Cry4Aa4 (N.° de acceso AFB18317); tipo Cry4A (N.° de acceso AAY96321); Cry4Ba1 (N.2 de acceso CAA30312); Cry4Ba2 (N.2 de acceso CAA30114); Cry4Ba3 (N.° de acceso AAA22337); Cry4Ba4 (N.° de acceso BAA00178); Cry4Ba5 (N.° de acceso CAD30095); tipo Cry4Ba (N.° de acceso ABC47686); Cry4Ca1 (N.° de acceso EU646202); Cry4Cb1 (N.2 de acceso FJ403208); Cry4Cb2 (N.2 de acceso FJ597622); Cry4Cc1 (N.° de acceso FJ403207); Cry5Aa1 (N.° de acceso AAA67694); Cry5Ab1 (N.° de acceso AAA67693); Cry5Ac1 (N.2 de acceso 134543); Cry5Ad1 (N.2 de acceso ABQ82087); Cry5Ba1 (N.° de acceso AAA68598); Cry5Ba2 (N.° de acceso ABW88931); Cry5Ba3 (N.° de acceso AFJ04417); Cry5Ca1 (N.2 de acceso HM461869); Cry5Ca2 (N.2 de acceso ZP_04123426); Cry5Da1 (N.2 de acceso HM461870); Cry5Da2 (N.2 de acceso ZP_04123980); Cry5Ea1 (N.2 de acceso HM485580); Cry5Ea2 (N.° de acceso ZP_04124038); Cry6Aa1 (n .° de acceso AAA22357); Cry6Aa2 (N.2 de acceso AAM46849); Cry6Aa3 (N.2 de acceso ABH03377); Cry6Ba1 (N.° de acceso AAA22358); Cry7Aa1 (N.° de acceso AAA22351); Cry7Ab1 (N.° de acceso a Aa 21120); Cry7Ab2 (N.° de acceso AAA21121); Cry7Ab3 (N.° de acceso ABX24522); Cry7Ab4 (N.° de acceso EU380678); Cry7Ab5 (N.° de acceso ABX79555); Cry7Ab6 (N.° de acceso ACI44005); Cry7Ab7 (N.° de acceso ADB89216); Cry7Ab8 (N.° de acceso GU145299); Cry7Ab9 (N.° de acceso ADD92572); Cry7Ba1 (N.° de acceso ABB70817); Cry7Bb1 (N.° de acceso KC156653); Cry7Ca1 (N.2 de acceso ABR67863); Cry7Cb1 (N.2 de acceso KC156698); Cry7Da1 (N.2 de acceso ACQ99547); Cry7Da2 (N.2 de acceso HM572236); Cry7Da3 (N.2 de acceso KC156679); Cry7Ea1 (N.2 de acceso HM035086); Cry7Ea2 (N.2 de acceso HM132124); Cry7Ea3 (N.° de acceso EEM19403); Cry7Fa1 (N.° de acceso HM035088); Cry7Fa2 (N.° de acceso EEM19090); Cry7Fb1 (N.2 de acceso HM572235); Cry7Fb2 (N.2 de acceso KC156682); Cry7Ga1 (N.2 de acceso HM572237); Cry7Ga2 (N.2 de acceso KC156669); Cry7Gb1 (N.2 de acceso KC156650); Cry7Gc1 (N.2 de acceso KC156654); Cry7Gd1 (N.2 de acceso KC156697); Cry7Ha1 (N.2 de acceso KC156651); Cry7Ia1 (N.2 de acceso KC156665); Cry7Ja1 (N.2 de acceso KC156671); Cry7Ka1 (N.2 de acceso KC156680); Cry7Kb1 (N.2 de acceso BAM99306); Cry7La1 (N.° de acceso BAM99307); Cry8Aa1 (N.° de acceso AAA21117); Cry8Ab1 (N.° de acceso EU044830); Cry8Ac1 (N.2 de acceso KC156662); Cry8Ad1 (N.2 de acceso KC156684); Cry8Ba1 (N.° de acceso AAA21118); Cry8Bb1 (N.° de acceso CAD57542); Cry8Bc1 (N.° de acceso CAD57543); Cry8Ca1 (N.° de acceso AAA21119); Cry8Ca2 (N.° de acceso AAR98783); Cry8Ca3 (N.° de acceso EU625349); Cry8Ca4 (N.° de acceso ADB54826); Cry8Da1 (N.° de acceso BAC07226); Cry8Da2 (N.° de acceso BD133574); Cry8Da3 (N.° de acceso BD133575); Cry8Db1 (N.° de acceso BAF93483); Cry8Ea1 (N.° de acceso AAQ73470); Cry8Ea2 (N.° de acceso EU047597); Cry8Ea3 (N.° de acceso KC855216); Cry8Fa1 (N.° de acceso AAT48690); Cry8Fa2 (N.° de acceso HQ174208); Cry8Fa3 (N.° de acceso AFH78109); Cry8Ga1 (N.° de acceso AAT46073); Cry8Ga2 (N.° de acceso ABC42043); Cry8Ga3 (N.° de acceso FJ198072); Cry8Ha1 (N.° de acceso AAW81032); Cry8Ia1 (N.° de acceso EU381044); Cry8Ia2 (N.° de acceso GU073381); Cry8Ia3 (N.° de acceso HM044664); Cry8Ia4 (N.° de acceso KC156674); Cry8Ib1 (N.2 de acceso GU325772); Cry8Ib2 (N.2 de acceso KC156677); Cry8Ja1 (N.2 de acceso EU625348); Cry8Ka1 (N.° de acceso FJ422558); Cry8Ka2 (N.° de acceso ACN87262); Cry8Kb1 (N.2 de acceso HM123758); Cry8Kb2 (N.2 de acceso KC156675); Cry8La1 (N.2 de acceso GU325771); Cry8Ma1 (N.° de acceso HM044665); Cry8Ma2 (N.° de acceso EEM86551); Cry8Ma3 (N.2 de acceso HM210574); Cry8Na1 (N.2 de acceso HM640939); Cry8Pa1 (N.° de acceso HQ388415); Cry8Qa1 (N.° de acceso HQ441166); Cry8Qa2 (N.° de acceso KC152468); Cry8Ra1 (N.° de acceso AFp87548); Cry8Sa1 (N.° de acceso JQ740599); Cry8Ta1 (N.° de acceso KC156673); tipo Cry8 (N.° de acceso FJ770571); tipo Cry8 (N.° de acceso ABS53003); Cry9Aa1 (N.° de acceso CAA41122); Cry9Aa2 (N.° de acceso CAA41425); Cry9Aa3 (N.° de acceso GQ249293); Cry9Aa4 (N.° de acceso GQ249294); Cry9Aa5 (N.° de acceso JX174110); tipo Cry9Aa (N.° de acceso AAQ52376); Cry9Ba1 (N.° de acceso CAA52927); Cry9Ba2 (N.2 de acceso GU299522); Cry9Bb1 (N.2 de acceso AAV28716); Cry9Ca1 (N.° de acceso CAA85764); Cry9Ca2 (N.° de acceso AAQ52375); Cry9Da1 (N.° de acceso BAA19948); Cry9Da2 (N.° de acceso AAB97923); Cry9Da3 (N.° de acceso GQ249293); Cry9Da4 (N.° de acceso GQ249297); Cry9Db1 (N.° de acceso AAX78439); Cry9Dc1 (N.° de acceso KC156683); Cry9Ea1 (N.° de acceso BAA34908); Cry9Ea2 (N.° de acceso AAO12908); Cry9Ea3 (N.° de acceso ABM21765); Cry9Ea4 (N.° de acceso ACE88267); Cry9Ea5 (N.° de acceso ACF04743); Cry9Ea6 (N.° de acceso ACG63872 ); Cry9Ea7 (N.° de acceso FJ380927); Cry9Ea8 (N.° de acceso GQ249292); Cry9Ea9 (N.° de acceso JN651495); Cry9Eb1 (N.° de acceso CAC50780); Cry9Eb2 (N.2 de acceso GQ249298); Cry9Eb3 (N.2 de acceso KC156646); Cry9Ec1 (N.° de acceso AAC63366); Cry9Ed1 (N.° de acceso AAX78440); Cry9Ee1 (N.° de acceso GQ249296); Cry9Ee2 (N.2 de acceso KC156664); Cry9Fa1 (N.2 de acceso KC156692); Cry9Ga1 (N.° de acceso KC156699); tipo Cry9 (N.° de acceso AAC63366); Cry10Aa1 (N.° de acceso a Aa 22614); Cry10Aa2 (N.° de acceso E00614); Cry10Aa3 (N.° de acceso CAD30098); Cry10Aa4 (N.° de acceso AFBI8318); tipo Cry10A (N.° de acceso DQ167578); Cry11Aa1 (N.° de acceso AAA22352); Cry11Aa2 (N.° de acceso AAA22611); Cry11Aa3 (N.° de acceso CAD30081); Cry11Aa4 (N.2 de acceso AFB18319); tipo Cry11Aa (N.2 de acceso DQ166531); Cry11 Ba1 (N.2 de acceso CAA60504); Cry11 Bb1 (N.2 de acceso AAC97162); Cry11 Bb2 (N.2 de acceso HM068615); Cry12Aa1 (N.° de acceso AAA22355); Cry13Aa1 (N.° de acceso AAA22356); Cry14Aa1 (N.2 de acceso AAA21516); Cry14Ab1 (N.2 de acceso KC156652); Cry15Aa1 (N.2 de acceso AAA22333); Cry16Aa1 (N.2 de acceso CAA63860); Cry17Aa1 (N.2 de acceso CAA67841); Cry18Aa1 (N.° de acceso CAA67506); Cry18Ba1 (N.° de acceso AAF89667); Cry18Ca1 (N.2 de acceso AAF89668); Cry19Aa1 (N.2 de acceso CAA68875); Cry19Ba1 (N.2 de acceso BAA32397); Cry19Ca1 (N.2 de acceso AFM37572); Cry20Aa1 (N.2 de acceso AAB93476); Cry20Ba1 (N.° de acceso ACS93601); Cry20Ba2 (N.° de acceso KC156694); tipo Cry20 (N.2 de acceso GQ144333); Cry21Aa1 (N.2 de acceso 132932); Cry21Aa2 (N.° de acceso 166477); Cry21Ba1 (N.° de acceso BAC06484); Cry21Ca1 (N.° de acceso JF521577); Cry21Ca2 (N.° de acceso KC156687); Cry21Da1 (N.° de acceso JF521578); Cry22Aa1 # I34547); Cry22Aa2 (N.2 de acceso CAD43579); Cry22Aa3 (N.2 de acceso ACD93211); Cry22Ab1 (N.° de acceso AAK50456); Cry22Ab2 (N.° de acceso CAD43577); Cry22Ba1 (N.2 de acceso CAD43578); Cry22Bb1 (N.2 de acceso KC156672); Cry23Aa1 (N.2 de acceso AAF76375); Cry24Aa1 (N.2 de acceso AAC61891); Cry24Ba1 (N.2 de acceso BAD32657); Cry24Ca1 (N.° de acceso CAJ43600); Cry25Aa1 (N.° de acceso AAC61892); Cry26Aa1 (N.2 de acceso AAD25075); Cry27Aa1 (N.2 de acceso BAA82796); Cry28Aa1 (n .° de acceso AAD24189); Cry28Aa2 (N.° de acceso AAG00235); Cry29Aa1 (N.° de acceso CAC80985); Cry30Aa1 (N.° de acceso CAC80986); Cry30Ba1 (N.° de acceso BAD00052); Cry30Ca1 (N.2 de acceso BAD67157); Cry30Ca2 (N.2 de acceso ACU24781); Cry30Da1 (N.2 de acceso EF095955); Cry30Db1 (N.2 de acceso BAE80088); Cry30Ea1 (N.2 de acceso ACC95445); Cry30Ea2 (N.° de acceso FJ499389); Cry30Fa1 (N.° de acceso ACI22625 ); Cry30Ga1 (N.2 de acceso ACG60020); Cry30Ga2 (N.2 de acceso HQ638217); Cry31Aa1 (N.2 de acceso BAB 11757); Cry31Aa2 (N.2 de acceso AAL87458); Cry31Aa3 (N.2 de acceso BAE79808); Cry31Aa4 (N.° de acceso BAF32571); Cry31Aa5 (N.° de acceso BAF32572); Cry31Aa6 (N.2 de acceso BAI44026); Cry31Ab1 (N.2 de acceso BAE79809); Cry31Ab2 (n .° de acceso BAF32570); Cry31Ac1 (N.° de acceso BAF34368); Cry31 Ac2 (N.° de acceso AB731600); Cry31Ad1 (N.° de acceso BAI44022); Cry32Aa1 (N.° de acceso AAG36711); Cry32Aa2 (N.2 de acceso GU063849); Cry32Ab1 (N.2 de acceso GU063850); Cry32Ba1 (N.2 de acceso BAB78601); Cry32Ca1 (N.2 de acceso BAB78602); Cry32Cb1 (N.2 de acceso KC156708); Cry32Da1 (N.° de acceso BAB78603); Cry32Ea1 (N.° de acceso GU324274); Cry32Ea2 (N.2 de acceso KC156686); Cry32Eb1 (N.2 de acceso KC156663); Cry32Fa1 (N.2 de acceso KC156656); Cry32Ga1 (N.2 de acceso KC156657); Cry32Ha1 (N.2 de acceso KC156661); Cry32Hb1 (N.° de acceso KC156666); Cry32Ia1 (N.° de acceso KC156667); Cry32Ja1 (N.2 de acceso KC156685); Cry32Ka1 (N.2 de acceso KC156688); Cry32La1 (N.2 de acceso KC156689); Cry32Ma1 (N.2 de acceso KC156690); Cry32Mb1 (N.2 de acceso KC156704); Cry32Na1 (N.° de acceso KC156691); Cry320a1 (N.° de acceso KC156703); Cry32Pa1 (N.2 de acceso KC156705); Cry32Qa1 (N.2 de acceso KC156706); Cry32Ra1 (N.2 de acceso KC156707); Cry32Sa1 (N.2 de acceso KC156709); Cry32Ta1 (N.2 de acceso KC156710); Cry32Ua1 (N.° de acceso KC156655); Cry33Aa1 (N.° de acceso AAL26871); Cry34Aa1 (N.2 de acceso AAG50341); Cry34Aa2 (N.2 de acceso AAK64560); Cry34Aa3 (N.° de acceso AAT29032); Cry34Aa4 (N.° de acceso AAT29030); Cry34Ab1 (N.° de acceso AAG41671); Cry34Ac1 (N.° de acceso AAG50118); Cry34Ac2 (N.° de acceso AAK64562); Cry34Ac3 (N.2 de acceso AAT29029); Cry34Ba1 (N.2 de acceso AAK64565); Cry34Ba2 (N.° de acceso AAT29033); Cry34Ba3 (N.° de acceso AAT29031); Cry35Aa1 (N.° de acceso AAG50342); Cry35Aa2 (N.° de acceso AAK64561); Cry35Aa3 (N.° de acceso AAT29028); Cry35Aa4 (N.2 de acceso AAT29025); Cry35Ab1 (N.2 de acceso AAG41672); Cry35Ab2 (N.2 de acceso AAK64563); Cry35Ab3 (N.2 de acceso AY536891); Cry35Ac1 (N.2 de acceso AAG50117); Cry35Ba1 (N.° de acceso AAK64566); Cry35Ba2 (N.° de acceso AAT29027); Cry35Ba3 (N.2 de acceso AAT29026); Cry36Aa1 (N.2 de acceso AAK64558); Cry37Aa1 (N.2 de acceso AAF76376 ); Cry38Aa1 (N.2 de acceso AAK64559); Cry39Aa1 (N.2 de acceso BAB72016); Cry40Aa1 (N.° de acceso BAB72018); Cry40Ba1 (N.° de acceso BAC77648); Cry40Ca1 (N.2 de acceso EU381045); Cry40Da1 (N.2 de acceso ACF15199); Cry41Aa1 (n .° de acceso BAD35157); Cry41Ab1 (N.° de acceso BAD35163); Cry41Ba1 (N.° de acceso HM461871); Cry41Ba2 (N.° de acceso ZP_04099652); Cry42Aa1 (N.° de acceso BAD35166); Cry43Aa1 (N.2 de acceso BAD15301); Cry43Aa2 (N.2 de acceso BAD95474 ); Cry43Ba1 (N.2 de acceso BAD15303); Cry43Ca1 (N.2 de acceso KC156676); Cry43Cb1 (N.2 de acceso KC156695); Cry43Cc1 (N.° de acceso KC156696); tipo Cry43 (N.° de acceso BAD15305); Cry44Aa (N.2 de acceso BAD08532); Cry45Aa (N.2 de acceso BAD22577); Cry46Aa (N.° de acceso BAC79010); Cry46Aa2 (N.° de acceso BAG68906); Cry46Ab (N.° de acceso BAD35170); Cry47Aa (N.° de acceso AAY24695); Cry48Aa (N.° de acceso CAJ18351); Cry48Aa2 (N.° de acceso CAJ86545); Cry48Aa3 (N.° de acceso CAJ86546 ); Cry48Ab (N.° de acceso CAJ86548); Cry48Ab2 (N.° de acceso CAJ86549); Cry49Aa (N.° de acceso CAH56541); Cry49Aa2 (N.° de acceso CAJ86541); Cry49Aa3 (N.° de acceso CAJ86543); Cry49Aa4 (N.° de acceso CAJ86544); Cry49Ab1 (N.° de acceso CAJ86542); Cry50Aa1 (N.° de acceso BAE86999); Cry50Ba1 (N.2 de acceso GU446675); Cry50Ba2 (N.2 de acceso GU446676); Cry51Aa1 (n .° de acceso ABI14444); Cry51Aa2 (N.° de acceso GU570697); Cry52Aa1 (N.° de acceso EF613489); Cry52Ba1 (N.2 de acceso FJ361760); Cry53Aa1 (N.2 de acceso EF633476); Cry53Ab1 (N.° de acceso FJ361759); Cry54Aa1 (N.° de acceso ACA52194); Cry54Aa2 (N.° de acceso GQ140349); Cry54Ba1 (N.° de acceso GU446677); Cry55Aa1 (N.° de acceso ABW88932); Cry54Ab1 (N.2 de acceso JQ916908); Cry55Aa2 (N.2 de acceso AAE33526); Cry56Aa1 (N.2 de acceso ACU57499); Cry56Aa2 (N.2 de acceso GQ483512); Cry56Aa3 (N.2 de acceso JX025567); Cry57Aa1 (N.° de acceso ANC87261); Cry58Aa1 (N.° de acceso ANC87260); Cry59Ba1 (N.2 de acceso JN790647); Cry59Aa1 (N.2 de acceso ACR43758); Cry60Aa1 (N.2 de acceso ACU24782); Cry60Aa2 (N.2 de acceso EAO57254); Cry60Aa3 (N.2 de acceso EEM99278); Cry60Ba1 (N.° de acceso GU810818); Cry60Ba2 (N.° de acceso EAO57253); Cry60Ba3 (N.2 de acceso EEM99279); Cry61Aa1 (N.2 de acceso HM035087); Cry61Aa2 (N.2 de acceso HM132125); Cry61Aa3 (N.2 de acceso EEM19308); Cry62Aa1 (N.2 de acceso HM054509); Cry63Aa1 (N.° de acceso BAI44028); Cry64Aa1 (n .° de acceso BAJ05397); Cry65Aa1 (N.2 de acceso HM461868); Cry65Aa2 (N.2 de acceso ZP_04123838); Cry66Aa1 (N.2 de acceso HM485581); Cry66Aa2 (N.2 de acceso ZP_04099945); Cry67Aa1 (N.° de acceso HM485582); Cry67Aa2 (N.° de acceso ZP_04148882); Cry68Aa1 (N.° de acceso HQ113114); Cry69Aa1 (N.° de acceso HQ401006); Cry69Aa2 (N.° de acceso JQ821388); Cry69Ab1 (N.2 de acceso JN209957); Cry70Aa1 (N.2 de acceso JN646781); Cry70Ba1 (N.2 de acceso ADO51070); Cry70Bb1 (N.2 de acceso EEL67276); Cry71Aa1 (N.2 de acceso JX025568); Cry72Aa1 (N.° de acceso JX025569).
Ejemplos de 5-endotoxinas también incluyen, pero no se limitan a, las proteínas Cry1A de los números de patente de EE. UU. 5.880.275 y 7.858.849; una toxina DIG-3 o DIG-11 (deleción aminoterminal de variantes de la a-hélice 1 y/o la a-hélice 2 de proteínas Cry, tales como Cry1A) de los números de patente de EE. UU. 8.304.604 y 8.304.605, Cry1B del número de serie de la solicitud de patente de EE. UU. 10/525.318; Cry1C de la patente de EE. UU. número 6.033.874; Cry1F de los números de patente de EE. UU. 5.188.960, 6.218.188; quimeras Cry1A/F de los números de patente de EE. UU. 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063); una proteína Cry2, tal como la proteína Cry2Ab de la patente de EE. UU. número 7.064.249); una proteína Cry3A, que incluye, pero no se limita a, una proteína insecticida híbrida manipulada (eHIP) creada fusionando combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (número de publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2010/0017914); una proteína Cry4; una proteína Cry5; una proteína Cry6; proteínas Cry8 de los números de patente de EE. UU. 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 y 7.462.760; una proteína Cry9, tal como los miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; una proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7145-7151; una proteína Cry22, Cry34Ab1 de los números de patente de EE. UU. 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593; una proteína CryET33 y CryET34 de los números de patente de EE. UU. 6.248.535, 6.326.351,6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 y 7.504.229; homólogos de CryET33 y CryET34 del número de publicación de patente de EE. UU. 2006/0191034, 2012/0278954, y el número de publicación PCT WO 2012/139004; una proteína Cry35Ab1 de los números de patente de EE. UU. 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593; una proteína Cry46, una proteína Cry51, una toxina binaria Cry; una toxina TIC901 o relacionada; TIC807 del documento de patente US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; TIC3131, TIC 3400, y TIC3407 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2015/0047076; AXMI-027, AXMI-036 y AXMI-038 de la patente de EE. UU. número 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de US7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 y AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de WO 2005/021585; AXMI-008 de US 2004/0250311; AXMI-006 de US 2004/0216186; AXMI-007 de US 2004/0210965; AXMI-009 de US 2004/0210964; AXMI-014 de US 2004/0197917; AXMI-004 de US 2004/0197916; AXMI-028 y AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 y AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 de la patente de EE. UU. número 8,084,416; AXMI-205 de US20110023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 y AXMI-064 de US 2011/0263488; proteínas AXMI-R1 y relacionadas de US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z y AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 y AXMI231 de WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 y AXMI-184 de la patente de EE. UU. número 8,334,431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 y AXMI-045 de US 2010/0298211; AXMI-066 y AXMI-076 de US20090144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de la patente de EE. UU. número 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de US 2010/0005543; y proteínas Cry, tales como Cry1A y Cry3A que tienen sitios proteolíticos modificados de la patente de EE. UU. número 8.319.019; y una proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa y Cry1Ca de la cepa VBTS 2528 de Bacillus thuringiensis de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2011/0064710. Otras proteínas Cry son bien conocidas para un experto en la técnica (véase Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, a la que se puede acceder en la malla mundial usando el prefijo "www"). La actividad insecticida de las proteínas Cry es bien conocida por un experto en la técnica (para una revisión véase van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path.
101:1-16). El uso de proteínas Cry como rasgos de plantas transgénicas es bien conocido por un experto en la técnica y las plantas transgénicas en Cry que incluyen, pero no se limitan a, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c y CBI-Bt han recibido autorización reglamentaria (véase Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 y the CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. en ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database, a la que se puede acceder en la malla mundial usando el prefijo "www"). Más de una proteína pesticida bien conocida por un experto en la técnica también se puede expresar en plantas tales como Vip3Ab y Cry1 Fa (US2012/0317682), Cry1 BE y Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA y Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F y CryCa (US2012/0317681), Cry1 DA y Cry1 BE (US2012/0331590), Cry1 DA y Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1 AB y Cry1 BE (US2012/0324606) y Cry1 Fa y Cry2Aa, Cry11 o Cry1 E (US2012/0324605)); Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab y Cry3Aa (US20130167268); Cry3A y Cry1 Ab o Vip3Aa (US20130116170); y Cry1 F, Cry34Ab1, y Cry35Ab1 (PCT/US2010/060818). Las proteínas pesticidas también incluyen lipasas insecticidas, que incluyen acil hidrolasas de lípido de la patente de EE. UU. número 7.491.869, y oxidasas de colesterol, tales como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413).
Las proteínas pesticidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetativas) de las patentes de EE. UU. número 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 y 8.237.020. Otras proteínas VIP son bien conocidas por un experto en la técnica (véase, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, al que se puede acceder en la malla mundial usando el prefijo "www"). Las proteínas pesticidas también incluyen proteínas de complejo de toxina (TC), obtenibles de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse los números de patente de EE. UU. 7.491.698 y 8.084.418). Algunas proteínas TC tienen actividad insecticida "independiente" y otras proteínas TC potencian la actividad de las toxinas independientes producidas por el mismo organismo dado. La toxicidad de un proteína TC "independiente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus o Paenibacillus, por ejemplo) se puede potenciar por uno o más "potenciadores" de proteína TC derivados de un organismo fuente de un género diferente. Hay tres tipos principales de proteínas TC. Como se denomina en el presente documento, las proteínas de la clase A ("proteína A") son toxinas independientes. Las proteínas de la clase B ("proteína B") y las proteínas de la clase C ("proteína C") potencian la toxicidad de las proteínas de la clase A. Los ejemplos de proteínas de la clase A son TcbA, TcdA, XptA1 y XptA2. Los ejemplos de proteínas de la clase B son TcaC, TcdB, XptB1Xb y XptC1Wi. Los ejemplos de proteínas de la clase C son TccC, XptClXb y XptB1 Wi. Las proteínas pesticidas también incluyen proteínas de veneno de araña, serpiente y escorpión. Los ejemplos de péptidos de veneno de araña incluyen, pero no se limitan a, péptidos licotoxina-1 y mutantes de los mismos (patente de EE. UU. número 8.334.366).
. (C) Una hormona o feromona específica de insecto, tal como un ecdisteroide y hormona juvenil, una variante de los mismos, un mimético basado en ellos, o un antagonista o agonista de los mismos. Véase, por ejemplo, la divulgación por Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de la expresión en baculovirus de esterasa de hormona juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil.
. (D) Un péptido específico de insecto que, tras la expresión, altera la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las divulgaciones de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (la clonación de expresión da ADN que codifica el receptor de la hormona diurética de insectos); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (una alostatina identificada en Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini y Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847-853 y Vasconcelos y Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Véase por tanto, la patente de EE. UU. número 5.266.317 a Tomalski, et al., que desvela genes que codifican toxinas específicas de insecto.
. (E) Una enzima responsable de una hiperacumulación de un monterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no de proteína con actividad insecticida.
. (F) Una enzima implicada en la modificación, que incluye la modificación postraduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glicolítica, una enzima proteolítica, un enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una cinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, tanto natural como sintética. Véase el número de solicitud PCT WO 93/02197 a nombre de Scott, et al., que desvela la secuencia de nucleótidos de un gen callasa. Las moléculas de ADN que contienen secuencias codificantes de quitinasa se pueden obtener, por ejemplo, de la ATCC con los números de acceso 39637 y 67152. Véanse, por tanto, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que enseñan la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica la quitina del anquilostoma del tabaco, y Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que proporciona la secuencia de nucleótidos del gen ubi4-2 poliubiquitina de perejil, las solicitudes de patente de EE. UU. número de serie 10/389.432, 10/692.367 y la patente de EE. UU. número 6.563.020.
. (G) Una molécula que estimula la transducción de señales. Por ejemplo, véase la divulgación por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de secuencias de nucleótidos para clones de ADNc de calmodulina de judía mungo, y Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina de maíz.
. (H) Un péptido de momento hidrófobo. Véase la solicitud PCT número WO 95/16776 y la patente de EE. UU. número 5.580.852 (divulgación de derivados de péptido de taquiplesina que inhiben los patógenos fúngicos de las plantas) y la solicitud PCT número WO 95/18855 y la patente de EE. UU. número 5.607.914) (enseña péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedad).
. (I) Una permeasa de membrana, un formador de canales o un bloqueante de canales. Por ejemplo, véase la divulgación por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expresión heteróloga de un análogo de péptido lítico de cecropina-beta para convertir las plantas transgénicas de tabaco resistentes a Pseudomonas solanacearum.
0. (J) Una proteína invasiva viral o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de la cubierta viral en células vegetales transformadas confiere resistencia a infección vírica y/o desarrollo de enfermedad efectuada por el virus del que deriva el gen de la proteína de la cubierta, así como por virus relacionados. Véase Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. La resistencia mediada por las proteínas de la cubierta se ha conferido en placas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del pepino, virus de la mancha del tabaco, virus X de la patata, virus Y de la patata, virus del grabado del tabaco, virus del cascabeleo del tabaco y virus del mosaico del tabaco. Id.
1. (K) Un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada de los mismos. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido hacia una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, matando el insecto. Véase Taylor, et al., Resumen N.° 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escocia, 1994) (inactivación enzimática en el tabaco transgénico por producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios).
2. (L) Un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que muestra que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpo recombinante se protegen del ataque por virus.
3. (M) Una proteína que detiene el desarrollo producido en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por lo tanto, las endo alfa-1,4-D-poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes de la planta solubilizando la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared de las células de la planta. Véase, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. La clonación y la caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de la endopoligalacturonas de judía se describe por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.
4. (N) Una proteína que detiene el desarrollo producido en la naturaleza por una planta. Por ejemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, han mostrado que plantas transgénicas que expresan el gen inactivante del ribosoma de cebada tienen un aumento de resistencia a la enfermedad fúngica.
5. (O) Genes implicados en la respuesta a resistencia adquirida sistémica (SAR) y/o los genes relacionados con la patogénesis. Briggs, (1995) Current Biology 5(2): 128-131, Pieterse y Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 y Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.
6. (P) Genes antifúngicos (Cornelissen y Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 y Parijs, et al., (1991) Plant 183:258-264 y Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Véase también la solicitud de patente de EE. UU. número 09/950.933.
7. (Q) Genes de desintoxicación, tales como para fumonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados estructuralmente relacionados. Por ejemplo, véase, la patente de EE. UU. número 5.792,931.
8. (R) Inhibidores de la cistatina y cisteína proteinasa. Véase la solicitud de EE. UU. número de serie 10/947.979.
9. (S) Genes defensina. Véanse el documento de patente WO03/000863 y la solicitud de EE. UU. de número de serie 10/178.213.
0. (T) Genes que confieren resistencia a nematodos. Véanse el documento de patente WO 03/033651 y Urwin, et. al., (1998) Plant 204:472-479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327-31.
21. (U) Genes tales como rcgl que confieren resistencia a la pudrición del tallo por antracnosis, que se provoca por el hongo Colletotrichum graminiola. Véanse Jung, et al., Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413-418, así como la solicitud de patente provisional de EE. UU. número 60/675.664.
22. (V) Ácidos nucleicos que se relacionan con la regulación por disminución de la expresión de genes diana en especies de plagas de insecto que interfieren con las moléculas de ácido ribonucleico (ARN), que controlan las especies de plagas de insectos. La publicación PCT WO 2011/025860 y WO 2014/153254 describen métodos de inhibición de la expresión de genes diana en plagas de plantas por invertebrados que incluyen plagas de plantas de Diabrotica. Además, la publicación PCT WO 2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insecto que incluyen plagas del género Lygus.
. Transgenes que confieren resistencia a un herbicida, por ejemplo:
1. (A) Un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como una imidazolinona o una sulfonilurea. Los genes a modo de ejemplo en esta categoría codifican la enzima ALS y AHAS mutante como se describe, por ejemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 y Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Véanse, por tanto, los números de patentes de EE. UU. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 y 5.378.824 y la publicación internacional WO 96/33270.
2. (B) Glifosato (resistencia conferida por los genes 5-enolpiruvil-3-fosfikimato sintasa (EPSP) mutante y aroA, respectivamente) y otros compuestos de fosfono, tales como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferasa (PAT) y fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus (bar)) y ácidos piridinoxi o fenoxi propriónicos y ciclohexonas (genes que codifican un inhibidor de ACCasa). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. número 4.940.835 a Shah, et al., que desvela la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. La patente de EE. UU. número 5.627.061 de Barry et al. también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse, por tanto, los números de patente de EE. UU. 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E y 5.491.288 y las publicaciones internacionales EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 y EP1173582. La resistencia al glifosato también es conferida a plantas que expresan un gen que codifica una enzima oxido-reductasa de glifosato, como se describe más completamente en los números de patente de EE. UU. 5.776.760 y 5.463.175. Además, la resistencia al glifosato se puede conferir a las plantas por la expresión en exceso de genes que codifican la N-acetiltransferasa de glifosato. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente EE. UU. de número de serie 11/405.845 y 10/427.692 y la solicitud PCT número US01/46227. Una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante se pueden obtener con el número de acceso ATCC 39256 y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se desvela en la patente de EE. UU. número 4.769.061 de Comai. La solicitud de patente EP número 0333033 a Kumada, et al., y la patente de EE. UU. número 4.975.374 de Goodman et al. desvela secuencias de nucleótidos de genes glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas, tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen fosfinotricin-acetil-transferasa se proporciona en las patentes EP número 0242 246 y 0 242 236 de Leemans et al., De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61 que describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad de fosfinotricina acetil transferasa. Véanse, por tanto, las patentes de EE. UU. número 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 y 5.879.903. Los genes a modo de ejemplo que confieren resistencia a ácidos fenoxipropriónicos y cicloshexonas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1-S1, Acc1-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
3. (C) Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen nitrilasa). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican los genes mutantes psbA. Las secuencias de nucleótidos para genes nitrilasa se desvelan en la patente de EE. UU. número 4.810.648 de Stalker, y las moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles con los números de acceso ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y la expresión de ADN que codifica una glutatión S-transferasa se describen por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.
4. (D) Acetohidroxiácido sintasa, que se ha encontrado que hace que las plantas que expresan esta enzima sean resistentes a múltiples tipos de herbicidas, se ha introducido en una variedad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet 246:419). Otros genes que confieren resistencia a herbicidas incluyen: un gen que codifica una proteína quimérica de citocromo de rata P4507A1 y NADPH de levadura-citocromo P450 oxidorreductasa (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol.
106(1 ):17-23), genes para glutatión reductasa y superóxido dismutasa (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687 y genes para diversas fosfotransferasas (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).
5. (E) La protoporfirinógeno oxidasa (protox) es necesaria para la producción de clorofila, que es necesaria para la supervivencia de toda la planta. La enzima protox sirve de diana para una variedad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las especies diferentes de plantas presentes, causando su destrucción total. El desarrollo de plantas que contienen actividad de protox alterada que son resistentes a estos herbicidas se describe en las patentes de EE. UU. número 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 y 5.767.373; y la publicación internacional número WO 01/12825.
. Transgenes que confieren o contribuyen a una característica de grano alterada, tales como:
1. (A) Ácidos grasos alterados, por ejemplo, por
(1) Regulación por disminución de la estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véanse Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 y el documento de patente WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn),
(2) Elevación del ácido oleico por la modificación del gen FAD-2 y/o disminución del ácido linolénico por la modificación del gen FAD-3 (véanse las patentes de EE. UU. número 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y el documento de patente WO 93/11245),
(3) Alteración del contenido de ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento de patente WO 01/12800,
(4) Alteración de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, diversos genes lpa, tales como lpa1, lpa3, hpt o hggt. Por ejemplo, véase los documentos de patente WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, la patente de EE. UU. número 6.423.886, la patente de EE. UU. número 6.197.561, la patente de EE. UU. número 6.825.397, las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 y Rivera-Madrid, et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624.
2. (B) Contenido de fósforo alterado, por ejemplo, por la
(1) Introducción de un gen que codifica fitasa se potenciaría la degradación de fitato, que añade más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para una divulgación de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger.
(2) Regulación por incremento de un gen que reduce el contenido de fitato. En maíz, esto se podría llevar a cabo, por ejemplo, clonando y luego reintroduciendo el ADN asociado a uno o más de los alelos, tales como los alelos LPA, identificados en mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico, tales como en Raboy, et al., (1990) Maydica 35:383 y/o alterando la actividad de inositol cinasa como en el documento de patente WO 02/059324, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0009011, el documento de patente WO 03/027243, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0079247, el documento de patente WO 99/05298, la patente de EE. UU. número 6.197.561, la patente de EE. UU. número 6.291.224, la patente de EE. UU. número 6.391.348, el documento de patente WO2002/059324, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0079247, los documentos de patente WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147.
3. (C) La alteración de hidratos de carbono se efectuó, por ejemplo, alterando un gen para una enzima que afecta el patrón de ramificación del almidón o un gen que altera la tiorredoxina, tal como NTR y/o TRX (véase la patente de EE. UU. número 6.531.648) y/o una inactivación de gamma zaína o mutante tal como cs27 o TUSC27 o en27 (véase la patente de EE. UU. número 6.858.778 y las publicaciones de solicitud de patente de EE. u U. número 2005/0160488 y 2005/0204418). Véanse Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (secuencia de nucleótidos del gen de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans), Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (secuencia de nucleótidos del gen levansucrasa de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (producción de plantas transgénicas que expresan alfa-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol.
21:515 (secuencias de nucleótidos de genes de invertasa de tomate), Segaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagénesis dirigida al sitio del gen alfa-amilasa de cebada) y Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II de ramificación de almidón de endosperma de maíz), documento de patente WO 99/10498 (digestibilidad mejorada y/o extracción de almidón mediante la modificación de UDP-D-xilosa 4-epimerasa, frágil 1 y 2, Ref1, HCHL, C4H), la patente de EE. UU. número 6.232.529 (método de producción de semilla de alto aceite por modificación de niveles de almidón (AGP)). Los genes de modificación de ácido graso mencionados anteriormente también se pueden usar para afectar el contenido de almidón y/o la composición mediante la interrelación de las vías de almidón y de aceite.
4. (D) Alteración del contenido o la composición de antioxidantes, tal como la alteración de tocoferol o tocotrienoles. Por ejemplo, véase la patente de EE. UU. número 6.787.683, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0034886 y el documento de patente WO 00/68393 que implican la manipulación de niveles de antioxidante mediante la alteración de una fitil prenil transferasa (ppt), el documento de patente WO 03/082899 mediante la alteración de una homogentisato geranil transferasa (hggt).
5. (E) Alteración de aminoácidos esenciales en semillas. Por ejemplo, véanse la patente de EE. UU.
número 6.127.600 (método de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), patente de EE. UU. número 6.080.913 (métodos binarios de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), patente de EE. UU. número 5.990.389 (alta lisina), WO99/40209 (alteración de las composiciones de aminoácido en semillas), WO99/29882 (métodos de alteración del contenido en aminoácidos de las proteínas), patente de EE. UU. número 5.850.016 (alteración de las composiciones de aminoácidos en semillas), WO98/20133 (proteínas con potenciados niveles de aminoácidos esenciales), patente de EE. UU. número 5.885.802 (alta metionina), patente de EE. UU. número 5.885.801 (alta treonina), patente de EE. UU. número 6.664.445 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), patente de EE. UU. número 6.459.019 (elevada lisina y treonina), patente de EE. UU. número 6.441.274 (subunidad beta de la triptófano sintasa de planta), patente de EE. UU. número 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), patente de EE. UU. número 5.939.599 (alto azufre), patente de EE. UU. número 5.912,414 (elevada metionina), WO98/56935 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), WO98/45458 (proteína de semilla manipulada que tiene mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), WO98/42831 (elevada lisina), patente de EE. UU. número 5.633.436 (aumento del contenido de aminoácidos de azufre), patente de EE. UU. número 5.559.223 (proteínas de almacenamiento sintético con estructura definida que contienen niveles programables de aminoácidos esenciales para mejorar el valor nutritivo de las plantas), documentos de patente WO96/01905 (elevada treonina), WO95/15392 (elevada lisina), publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0163838, publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0150014, publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0068767, patente de EE. UU. número 6.803.498, documentos de patente WO01/79516 y WO00/09706 (Ces A: celulosa sintasa), patente de EE. UU. número 6.194.638 (hemicelulosa), patente de EE. UU. número 6.399.859 y publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0025203 (UDPGdH), patente de EE. UU. número 6.194.638 (RGP).
4. Genes que controlan la esterilidad masculina
Hay varios métodos para conferir la esterilidad masculina genética disponible, tales como múltiples genes mutantes en localizaciones separadas dentro del genoma que confieren esterilidad masculina, como se desvela en las patentes de EE. UU. número 4.654.465 y 4.727.219 de Brar, et al., y translocaciones cromosómicas como se describe por Patterson en las patentes de EE. UU. número 3.861.709 y 3.710.511. Además de estos métodos, Albertsen, et al., patente de EE. UU. número 5.432.068, describe un sistema de esterilidad masculina nuclear que incluye: identificar un gen que es crítico para la fertilidad masculina; silenciar este gen nativo que es crítico para la fertilidad masculina; retirar el promotor nativo del gen de fertilidad masculina esencial y sustituirlo con un promotor inducible; insertar este gen genéticamente manipulado de nuevo en la planta y así crear una planta que es masculina estéril debido a que el promotor inducible no está "activado”, dando como resultado que no se transcribe el gen de fertilidad masculina. La fertilidad se restaura induciendo, o "encendiendo", el promotor, que a su vez permite al gen conferir fertilidad masculina a transcribir.
1. (A) Introducción de un gen de desacetilasa bajo el control de un promotor específico del tapete y con la aplicación de la sustancia química N-Ac-PPT (documento de patente WO 01/29237).
2. (B) Introducción de diversos promotores específicos del estambre (documentos de patente WO 92/13956, WO 92/13957).
3. (C) Introducción del gen barnasa y barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611 -622).
Para ejemplos adicionales de sistemas y genes de esterilidad masculina y femenina nuclear, véanse, por tanto, las patentes de EE. UU. número 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 y 6.265.640.
5. Genes que crean un sitio para la integración de ADN específico de sitio
Esto incluye la introducción de sitios de FRT que se pueden usar en el sistema FLP/FRT y/o sitios Lox que se pueden usar en el sistema Cre/Loxp. Por ejemplo, véase Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 y el documento de patente WO 99/25821. Otros sistemas que se pueden usar incluyen la recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag 1994), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983) y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki, et al., 1992).
6. Los genes que afectan la resistencia al estrés abiótico (que incluyen, pero no se limitan a, florecimiento, desarrollo de espigas y semillas, potenciamiento de la eficiencia de utilización de nitrógeno, alteración de la sensibilidad al nitrógeno, resistencia o tolerancia a la sequía, resistencia o tolerancia al frío y resistencia o tolerancia a la sal) y elevado rendimiento bajo estrés. Por ejemplo, véanse el documento de patente WO 00/73475 donde la eficiencia de uso del agua se altera mediante la alteración de malato; la patente de EE. UU. número 5.892.009, la patente de EE. UU. número 5.965.705, la patente de EE. UU. número 5.929.305, la patente de EE. UU. número 5.891.859, la patente de EE. UU. número 6.417.428, la patente de EE. UU. número 6.664.446, la patente de EE. UU. número 6.706.866, la patente de EE. UU. número 6.717.034, los documentos de patente WO2000060089, WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521 y WO9938977 que describen genes, que incluye genes CBF y factores de transcripción eficaces en mitigar los efectos negativos de la congelación, la alta salinidad y la sequía en plantas, así como que confieren otros efectos positivos sobre el fenotipo de las plantas; la publicación de solicitud de patente de e E. UU. número 2004/0148654 y el documento de patente WO01/36596 donde se altera el ácido abscísico en las plantas, dando como resultado una mejora en el fenotipo de la planta, tal como un elevado rendimiento y/o elevada tolerancia al estrés abiótico; documentos de patente WO2000/006341, WO04/090143, la solicitud de patente de EE. UU. de número de serie 10/817483 y la patente de EE. UU. número 6.992.237, donde la expresión de citoquinina se modifica dando como resultado plantas con elevada tolerancia al estrés, tal como tolerancia a la sequía y/o elevado rendimiento. Véanse también los documentos de patente WO0202776, WO2003052063, JP2002281975, la patente de EE. UU. número 6.084.153, documento de patente WO0164898, la patente de EE. UU. número 6.177.275 y la patente de EE. UU. número 6.107.547 (potenciamiento de la utilización de nitrógeno y alteración de la sensibilidad al nitrógeno). Para la alteración de etileno, véase la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0128719, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2003/0166197 y el documento de patente WO200032761. Para factores de transcripción o reguladores de la transcripción de plantas de estrés abiótico, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0098764 o la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0078852.
Otros genes y factores de transcripción que afectan el crecimiento de las plantas y los rasgos agronómicos, tales como el rendimiento, la floración, el crecimiento de la planta y/o la estructura de la planta, se pueden introducir o introgresar en las plantas, véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO97/49811 (LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 y la patente de EE. UU. número 6.573.430 (TFL), la patente de EE. UU. número 6.713.663 (FT), los documentos de patente WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, la patente de EE. UU. número 6.794.560, la patente de EE. UU. número 6.307.126 (g A i), WO99/09174 (D8 y Rht) y los documentos de patente WO2004076638 y WO2004031349 (factores de transcripción).
"iARN" se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. número 6.506.559). Estas incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana y la "cosupresión" o "supresión sentido", que se refieren a la producción de transcritos sentido de ARN capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente de EE. UU. número 5.231.020). Dichas técnicas se basan en el uso de construcciones que producen la acumulación de ARN bicatenario con una cadena complementaria al gen diana a silenciar. Las secuencias reguladoras desveladas en el presente documento se pueden usar para impulsar la expresión de construcciones que darán como resultado la interferencia por ARN que incluye microARN y ARNip.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a la regulación por disminución de la expresión de genes diana en especies de plagas de insecto por interferencia con moléculas de ácido ribonucleico (ARN). La publicación PCT WO 2007/074405 describe métodos de inhibición de la expresión de genes diana en plagas de invertebrados que incluyen el escarabajo de la patata del Colorado. La publicación PCT WO 2005/110068 describe métodos de inhibición de la expresión de genes diana en plagas de invertebrados que incluyen en particular el gusano de la raíz del maíz occidental como un medio de control de la infestación por insectos. Además, la publicación PCT WO 2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insecto que incluyen plagas del género Lygus.
Las moléculas de ácido nucleico incluyen elementos silenciadores para el direccionamiento de la subunidad H de ATPasa vacuolar, útiles para controlar una población de plagas de coleópteros e infestación como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2012/0198586. La publicación PCT WO 2012/055982 describe ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) que inhibe o regula por disminución la expresión de un gen diana que codifica: una proteína ribosómica de insecto, tal como la proteína ribosómica L19, la proteína ribosómica L40 o la proteína ribosómica S27A; una subunidad de proteasoma de insecto, tal como la proteína Rpn6, la proteína Pros 25, Rpn2, la proteína de la subunidad beta 1 del proteasoma o la proteína beta 2 Pros; un p-coatómero de insecto de la vesícula COPI, el Y-coatómero de la vesícula COPI, la proteína p'-coatómero o el Z-coatómero de la vesícula COPI; una proteína de tetraspanina 2 A de insecto que es una proteína de dominio transmembranario putativa; una proteína de insecto que pertenece a la familia de actina, tal como actina 5C; una proteína ubiquitina-5E de insecto; una proteína Sec23 de insecto que es un activador de la GTPasa implicado en el transporte de proteína intracelular; una proteína arrugada de insecto que es una miosina poco convencional que participa en la actividad motora; una proteína de cuello torcido de insecto que participa en la regulación del corte y empalme de ARNm alternativo nuclear; una proteína de subunidad G de H+-ATPasa vacuolar de insecto y una Tbp-1 de insecto, tal como la proteína de unión a Tat. La publicación PCT WO 2007/035650 describe ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) que inhibe o regula por disminución la expresión de un gen diana que codifica Snf7. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2011/0054007 describe elementos de silenciamiento de polinucleótidos que se dirigen a RPS10. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2014/0275208 y US2015/0257389 describe elementos de silenciamiento de polinucleótidos que se dirigen a RyanR, HP2 y PAT3. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2011/0054007 describe elementos de silenciamiento de polinucleótidos que se dirigen a RPS10. La publicación PCT WO 2016/205445 describe elementos de silenciamiento de polinucleótidos que reducen la fecundidad, que incluyen NCLB, MAEL, BOULE y VgR. Las publicaciones PCT WO/2016/138106, WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913 y WO 2016/060914 describen elementos de silenciamiento de polinucleótidos que se dirigen a las moléculas de ácidos nucleicos de subunidad de coatómeros de COPI que confieren resistencia a plagas de coleópteros y hemípteros. Las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. 2012/029750, US 20120297501 y 2012/0322660 describen ácidos ribonucleicos interferentes (ARN o ARN bicatenario) que funcionan tras la captación por una especie de plaga de insecto para regular por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en donde el ARN comprende al menos un elemento de silenciamiento, en donde el elemento de silenciamiento es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, comprendiendo o consistiendo una hebra en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2012/0164205 describe posibles dianas para interferir con ácidos ribonucleicos bicatenarios para inhibir plagas de invertebrados que incluyen: una secuencia homóloga a Chd3, una secuencia homóloga a beta-tubulina, una secuencia homóloga a V-ATPasa de 40 kDa, una secuencia homóloga a EF1a, una secuencia homóloga a la subunidad p28 del proteasoma 26S, una secuencia homóloga a epóxido hidrolasa de la hormona juvenil, una secuencia homóloga a la proteína de los canales de cloruro dependiente del hinchamiento, una secuencia homóloga a la proteína glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, una secuencia homóloga a la proteína Act42A, una secuencia homóloga al factor 1 de ribosilación de ADP, una secuencia homóloga a la proteína del factor de transcripción IIB, una secuencia homóloga a quitinasa, una secuencia homóloga a enzima de conjugación con ubiquitina, una secuencia homóloga a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una secuencia homóloga a ubiquitina B, un homólogo a esterasa de la hormona juvenil y una secuencia homóloga a alfa-tubulina.
Las secuencias del elemento regulador aisladas desveladas en el presente documento se pueden modificar para proporcionar un intervalo de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por lo tanto, se puede utilizar menos de toda la región del elemento regulador y la capacidad para impulsar la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés retenida. Se reconoce que los niveles de expresión del ARNm se pueden alterar de diferentes formas con deleciones de porciones de las secuencias promotoras. Los niveles de expresión de ARNm se pueden disminuir, o alternativamente, la expresión se puede aumentar como resultado de deleciones del elemento regulador si existe, por ejemplo, un elemento regulador negativo (para un represor) que se retira durante el proceso de truncación. En general, se usarán al menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia del elemento regulador aislada para impulsar la expresión de una secuencia de polinucleótidos.
Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase, por tanto, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 -158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Los casetes de expresión que comprenden las secuencias desveladas en el presente documento también pueden contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen que se va a cotransformar en el organismo. Alternativamente, se pueden proporcionar secuencia(s) adicional(es) en otro casete de expresión.
Cuando corresponda, las secuencias de polinucleótidos cuya expresión va a estar bajo el control de una secuencia del elemento regulador híbrido de la presente divulgación, y cualquier secuencia de nucleótidos adicional, se pueden optimizar para la elevada expresión en la planta transformada. Es decir, estas secuencias de nucleótidos se pueden sintetizar usando codones preferidos por las plantas para expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11, para una discusión del uso de codones preferido de hospedador. Están disponibles en la técnica métodos de síntesis de genes preferidos de planta. Véase, por ejemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
Se conocen modificaciones de secuencia adicionales para potenciar la expresión génica en un hospedador celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitios de corte y empalme de exones-intrones, repeticiones de tipo transposón y otras de dichas secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia de polinucleótidos heteróloga se puede ajustar a niveles promedio para un hospedador celular dado, como se calcula como referencia con genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm de horquilla secundaria predichas.
Los casetes de expresión pueden contener además secuencias conductoras en 5'. Dichas secuencias conductoras pueden actuar potenciando la traducción. Se conocen en la técnica conductores de la traducción e incluyen, sin limitación: conductores de picornavirus, por ejemplo, conductor del EMCV (región no codificante en 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); conductores de potyvirus, por ejemplo, conductor de TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison, et al., (1986) Virology 154:9-20); conductor de MDMV (virus del mosaico enano del maíz); proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); conductor sin traducir de ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de AMV) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); conductor del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256) y conductor del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Véanse, por tanto, Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiology 84:965-968. Los métodos conocidos para potenciar la estabilidad del ARNm también pueden utilizar, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la ubiquitina del maíz (Christensen y Quail, (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen, et al., (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) o el intrón AdhI de maíz (Kyozuka, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka, et al., (1990) Maydica 35:353-357).
En la preparación del casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN se pueden manipular de manera que se proporcionen las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según convenga, en el marco de lectura apropiado. Para este fin, se pueden emplear adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, u otras manipulaciones pueden estar implicadas para proporcionar sitios de restricción convenientes, retirada de ADN superfluo o retirada de sitios de restricción. Para este fin, se puede implicar a mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, hibridación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.
También se pueden incluir genes indicadores o genes marcadores de selección en casetes de expresión. Los ejemplos de genes indicadores adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar en, por ejemplo, Jefferson, et al., (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin, et al., (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet, et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff, et al., (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain, et al., (1995) Bio Techniques 19:650-655 y Chiu, et al., (1996) Current Biology 6:325-330.
Los genes marcadores de selección para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de selección adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J.
2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213; Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron, et al., (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108 y Zhijian, et al., (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-36); bromoxinilo (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478-481 y las solicitudes de patente de Ee . UU. número de serie 10/004.357 y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513-2518).
Otros genes que podrían servir de utilidad en la recuperación de eventos transgénicos incluirían, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (beta-glucuronidasa; Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescencia verde; Chalfie, et al., (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs, et al., (1987) Nucleic Acids Res.
15(19):8115 y Luehrsen, et al., (1992) Methods Enzymol. 216:397-414) y los genes de maíz que codifican la producción de antocianinas (Ludwig, et al., (1990) Science 247:449).
Se puede usar el casete de expresión que comprende un elemento regulador híbrido unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos de interés para transformar cualquier planta. En otro aspecto de la divulgación, un casete de expresión que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 1-74 unidas operativamente a una secuencia de polinucleótidos de interés se puede usar para transformar cualquier planta. De este modo, se pueden obtener plantas genéticamente modificadas, células vegetales, tejido de planta, semilla y raíz.
Ciertos métodos desvelados implican introducir un polinucleótido en una planta. Como se usa en el presente documento, "introducir" pretende significar presentar a la planta el polinucleótido de tal manera que la secuencia acceda al interior de una célula de la planta. Los métodos de la divulgación no dependen de un método de introducción particular de una secuencia en una planta, solo que el polinucleótido accede al interior de al menos una célula de la planta. Se conocen en la técnica métodos de introducción de polinucleótidos en las plantas que incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.
Una "transformación estable" es una transformación en la que la construcción de polinucleótido introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la descendencia de la misma. "Transformación transitoria" significa que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta.
Los protocolos de transformación, así como los protocolos de introducción de secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o la célula de la planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegida para la transformación. Métodos adecuados de introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y posterior inserción en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Townsend, et al., patente de EE. UU. número 5.563.055 y Zhao, et al., patente de EE. UU. número 5.981.840), transferencia génica directa (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración de partículas balísticas (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. número 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes, et al., (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) y transformación de Lecl (documento de patente WO 00/28058). Véase también Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de EE. Uu . número 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; patente de EE. UU. número 5.736,369 (cereales); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 84:5345-5349 (liliáceas); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por bigotes); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., y (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por Agrobacterium tumefaciens).
En un aspecto de la divulgación, las construcciones de ADN que comprenden un elemento regulador híbrido se pueden proporcionar a una planta usando una variedad de métodos de transformación transitorios. En otro aspecto de la divulgación, las construcciones de ADN que comprenden las secuencias desveladas SEQ ID NO: 1-74 se pueden proporcionar a una planta usando una variedad de métodos de transformación transitoria. Dichos métodos de transformación transitoria incluyen, pero no se limitan a, sistemas de vector vírico y la precipitación del polinucleótido de un modo que se descarte la posterior liberación del ADN. Por lo tanto, puede ocurrir la transcripción del ADN unido a partículas, pero la frecuencia con la que se libera para llegar a integrarse en el genoma se reduce enormemente. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
En otros aspectos de la divulgación, un polinucleótido se puede introducir en plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos víricos. En general, dichos métodos implican incorporar una construcción de polinucleótido de la divulgación dentro de un ADN vírico o molécula de ARN. Los métodos de introducción de polinucleótidos en plantas y que expresan una proteína codificada en ellas, que implican ADN vírico o moléculas de ARN, se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. número 5.889.191,5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 y Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221.
Se conocen en la técnica métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una localización específica en el genoma de la planta. En un aspecto de la divulgación, la inserción del polinucleótido en una localización genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico de sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 y WO99/25853. Brevemente, el polinucleótido de la divulgación puede estar contenido en un casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El casete de transferencia se introduce en una planta que ha incorporado establemente en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés se integra así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.
Las células que se han transformado pueden hacerse crecer en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Entonces se pueden cultivar estas plantas, y o polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la descendencia resultante que tiene expresión de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda y después pueden recogerse las semillas para garantizar que se ha conseguido la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, la presente divulgación proporciona semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción de polinucleótido, por ejemplo, un casete de expresión que comprende una de SEQ ID NO: 1 -74, establemente incorporada en su genoma.
Hay una variedad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejido de planta. El método de regeneración particular dependerá del tejido de planta de partida y de la especie de planta particular a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas o a partir de diversos explantes transformados se conoce bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, (1988) en: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye normalmente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario a través del estadio de plántula enraizada. Los embriones transgénicos y las semillas se regeneran similarmente. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan a partir de aquí en un medio de crecimiento de plantas apropiado, tal como tierra. Preferentemente, las plantas regeneradas se autopolinizan proporcionando plantas transgénicas homocigóticas. De otro modo, el polen obtenido de la planta regenerada se cruza con plantas crecidas a partir de líneas agronómicamente importantes. En cambio, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de los aspectos de la divulgación que contiene un polinucleótido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.
Los aspectos de la divulgación proporcionan composiciones para cribar compuestos que modulan la expresión dentro de las plantas. Los vectores, las células y las plantas se pueden usar para cribar moléculas candidatas a agonistas y antagonistas de secuencias del elemento regulador de SEQ ID NO: 1-74. Por ejemplo, un gen indicador puede estar unido operativamente a una secuencia de elemento regulador y expresarse como un transgén en una planta. Se añaden los compuestos a probar y se mide la expresión génica del indicador para determinar el efecto sobre la actividad de promotor.
En un aspecto de la divulgación, un elemento regulador, por ejemplo las secuencias SEQ ID NO: 1 -74, puede ser editado o insertado en una planta por edición del genoma usando un sistema CRISPR/Cas9.
En un aspecto, los elementos reguladores desvelados se pueden introducir en el genoma de una planta usando tecnologías de edición del genoma, o elementos reguladores previamente introducidos en el genoma de una planta pueden ser editados usando tecnologías de edición del genoma. Por ejemplo, los elementos reguladores desvelados se pueden introducir en una localización deseada en el genoma de una planta mediante el uso de tecnologías de rotura bicatenaria, tales como TALEN, meganucleasas, nucleasas de dedos de cinc y CRISPR-Cas. Por ejemplo, los elementos reguladores desvelados se pueden introducir en una localización deseada en un genoma usando un sistema de CRISPR-Cas, con el fin de inserción específica de sitio. La localización deseada en un genoma de planta puede ser cualquier sitio diana deseado para la inserción, tal como una región genómica susceptible de cultivo, o puede ser un sitio diana localizado en una ventana genómica con un rasgo existente de interés. Los elementos reguladores de interés existentes podrían ser o elementos reguladores endógenos o elementos reguladores previamente introducidos.
En otro aspecto, donde el elemento regulador desvelado se haya introducido previamente en un genoma, se pueden usar tecnologías de edición del genoma para alterar o modificar la secuencia del elemento regulador introducida. Las modificaciones específicas de sitio que se pueden introducir en las composiciones de elementos reguladores desveladas incluyen las producidas usando cualquier método de introducción de modificación específica de sitio, que incluye, pero no se limita a, mediante el uso de oligonucleótidos de reparación de genes (por ejemplo, publicación de EE. UU.
2013/0019349), o mediante el uso de tecnologías de rotura bicatenaria, tales como TALEN, meganucleasas, nucleasas de dedos de cinc y CRISPR-Cas. Dichas tecnologías se pueden usar para modificar el polinucleótido previamente introducido mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos dentro del polinucleótido introducido. Alternativamente, se pueden usar tecnologías de rotura bicatenaria para añadir secuencias de nucleótidos adicionales al polinucleótido introducido.
Un "sitio diana alterado", "secuencia diana alterada", "sitio diana modificado" y "secuencia diana modificada" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia diana como se desvela en el presente documento, que comprende al menos una alteración cuando se compara con la secuencia diana no alterada. Dichas "alteraciones" incluyen, por ejemplo: (i) sustitución de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido o (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica al que se refiere la presente divulgación.
Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero se deben permitir algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, partes son partes en peso; peso molecular es peso molecular medio; temperatura es en grados centígrados; y presión es a atmosférica o próxima a ella.
Parte experimental
Ejemplo 1: Elementos reguladores híbridos de raíz
Las raíces son órganos complejos que se pueden dividir en diferentes regiones; por ejemplo, la cofia, el meristemo, la región de elongación y la región de maduración. Estas regiones reflejan diferentes estadios de identidad y madurez de las células de la raíz. Los genes en estas células se activan e inactivan y, por lo tanto, no se pueden expresar simultáneamente en todas las regiones de la raíz. Los elementos reguladores controlan la expresión de estos genes. La identificación de elementos reguladores naturales con características de expresión necesarias presenta retos en muchos niveles diferentes y puede producir niveles de expresión no anticipados y patrones en plantas transgénicas. Una alternativa a los elementos reguladores naturales es un elemento regulador híbrido que se crea combinando segmentos de diferentes elementos reguladores. Los segmentos de elementos reguladores que funcionan en diferentes regiones de la raíz del maíz se pueden combinar de forma que se cree un elemento regulador híbrido que funciona en todas o la mayoría de las regiones de la raíz. Preferentemente, se mantiene la especificidad por raíz, aunque podría ocurrir expresión ectópica.
Ejemplo 2: Construcción de secuencias del elemento regulador híbrido de raíz
Se construyeron cada una de las secuencias reguladoras híbridas (SEQ ID NO: 11-30 y 35-60) usando segmentos de elementos reguladores que se habían caracterizado previamente para la expresión (etapa 1; Tabla 1). Los elementos reguladores nativos se clasificaron ampliamente en dos grupos por patrón de expresión, punta de raíz y región de maduración. La punta de raíz incluyó la cofia, el meristemo y el área de la región de elongación adyacente al meristemo. La región de maduración incluyó la región de maduración de la raíz y la porción de la región de elongación adyacente a la región de maduración. Se evaluaron los elementos reguladores, que pertenecen a cualquier clase, para los posibles motivos usando bases de datos públicas y patentadas para ayudar en la definición de segmentos que se pueden usar en el elemento regulador híbrido (etapa 2). Se conocen en la técnica algoritmos de motivos útiles para el cribado en el proceso, tales como Higo, K et al. (1998) Nucleic Acids Research. El proceso se inició evaluando la posición de motivos, el tamaño y el tipo de motivos, así como la agrupación de motivos. La agrupación de motivos entre la caja TATA y aproximadamente 1 kb en la dirección 5’ de la caja TATA se favoreció como un segmento para usar en un promotor híbrido con respecto a los segmentos que estuvieron más distales. La tercera etapa (etapa 3) comprendió el ensamblaje de segmentos elegidos que contribuyeron al extremo 3’ del elemento regulador híbrido, que incluye la caja TATA, y entonces los segmentos que comprenden el extremo 5’ del elemento regulador híbrido (Tabla 2). El proceso de ensamblaje puso, en general, los segmentos de la punta de la raíz en el extremo 3’ del elemento regulador. Se clonaron cada una de SEQ ID NO: 11-18 en un vector de expresión respectivo para la introducción en plantas de maíz. Se usó el gen de p-glucuronidasa (GUS) como un gen indicador para caracterizar la expresión dirigida por cada uno de los elementos reguladores híbridos. Se regeneraron aproximadamente 10 eventos transgénicos de maíz para cada vector.
Tabla 1: Patrón de expresión de promotores de raíz en plantas de maíz transgénico
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Tabla 2: Elementos reguladores parentales que contribuyen segmentos a los promotores híbridos de raíz
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Ejemplo 3: Análisis de la expresión de elementos reguladores en maíz transgénico
La Tabla 3 muestra el resultado de la expresión para cada elemento regulador híbrido en raíces. En general, cada elemento regulador híbrido impulsó la expresión y proporcionó un patrón de expresión que fue, en general, ubicuo en la raíz. La expresión fue casi coherente en el meristemo, la región de elongación y la región de maduración entre eventos. La expresión en la cofia fue más variable, ya que solo un promotor natural (SEQ ID NO: 1; Tabla 1) impulsó explícitamente la expresión en la cofia. Por lo tanto, la expresión en la cofia fue ectópica en ausencia de SEQ ID NO: 1 en estos experimentos. Los niveles de expresión de los elementos reguladores híbridos fueron, en general, superiores a los de los progenitores individuales en 2 veces o más; sin embargo, no todos se expresaron a niveles más altos y fueron o equivalentes al progenitor que se expresa más alto o ligeramente inferiores.
Se construyó SEQ ID NO: 11 usando segmentos de progenitores con características de expresión espacial que se solaparon mínimamente (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 4). Se fusionaron tres copias de un segmento de SEQ ID NO: 8 con una copia de un segmento de SEQ ID NO: 4. Los resultados de raíces de maíz transgénico histoquímicamente teñidas mostraron que la expresión era principalmente en el meristemo y la región de maduración de raíces transgénicas, que refleja ambos segmentos reguladores parentales. En mayores eventos de expresión, el patrón de expresión se mezcló para expresión más uniforme a través del meristemo, las regiones de elongación y de maduración. Ningún segmento parental de SEQ ID NO: 11 impulsó la expresión en la cofia; sin embargo, algunos eventos mostraron la expresión ectópica en la cofia. Una observación adicional fue la expresión en el tallo, que se presentó por el elemento regulador parental expuesto en SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 12 demuestra que los segmentos de diferentes especies pueden actuar juntos en un formato híbrido. SEQ ID NO: 6 se obtiene de sorgo e impulsa la expresión a mayores niveles en la región de elongación que SEQ ID NO: 8. Se colocaron tres copias de un segmento de elemento regulador parental de SEQ ID NO: 6 en la dirección 5’ de un segmento de elemento regulador parental de SEQ ID NO: 4 en una configuración similar a SEQ ID NO: 11. El resultado de la construcción fue un patrón de expresión más uniforme con respecto a SEQ ID NO: 11 en raíces transgénicas histoquímicamente teñidas. Los datos cuantitativos mostraron que el nivel de expresión dirigida por SEQ ID NO: 12 superó el nivel de los elementos reguladores parentales individuales de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. El aumento fue de aproximadamente 3 veces. Se observó expresión ectópica en la raíz y también se observó expresión en el tallo.
SEQ ID NO: 13 eliminó segmentos repetidos combinando una copia de cada segmento de SEQ ID NO: 8, 6 y 4, respectivamente. Los resultados de la tinción histoquímica mostraron una expresión uniforme en la cofia, el meristemo, la región de elongación y la región de maduración. La tinción histoquímica es el resultado de sumergir tejido muestreado en una disolución que contiene un sustrato, X-Gluc (sal de sodio), que produce la aparición de un precipitado azul en el sitio en el tejido donde se está expresando la enzima B-glucuronidasa.
SEQ ID NO: 14 y 15 fueron elementos reguladores híbridos construidos con segmentos distintos de los de SEQ ID NO: 8, 6 y 4. En SEQ iD NO: 14, un segmento de SEQ ID NO: 4 se sustituyó con un segmento de SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 tiene un patrón de expresión similar a SEQ ID NO: 4, pero es de Brachypodium distachyon mientras que SEQ ID NO: 4 es de maíz. Se añadió un segmento de SEQ ID NO: 5 entre los segmentos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 15 consistió en segmentos de tres especies. SEQ ID NO: 9 se originó de maíz, SEQ ID NO: 5 era de sorgo y SEQ ID NO: 2 se obtuvo de Brachypodium (Tabla 2). SEQ ID NO: 15 es muy similar a SEQ ID NO: 14, con una diferencia de un segmento de SEQ ID NO: 6 sustituido por un segmento de SEQ ID NO: 9. Tanto SEQ ID NO: 14 como SEQ ID NO: 15 impulsaron la expresión en raíces de maíz (Tabla 3). Se observó expresión ectópica en la cofia. Otros sitios de expresión incluyeron algunos eventos de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 con bajos niveles de expresión en tallo y cascarilla que se diferenciaron de SEQ ID NO: 13 que tenía tallo y bajos niveles de expresión en hojas.
SEQ ID NO: 16 demuestra flexibilidad adicional reemplazando segmentos con patrones de expresión similares, tales como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, que se usaron para la expresión principalmente en el meristemo, con un segmento de un elemento regulador parental que impulsó la expresión en una parte diferente de la punta de la raíz. Se seleccionó SEQ ID NO: 1 por su preferencia por la cofia de la raíz en plantas de maíz transgénico y se usó en lugar de SEQ ID NO: 2 en una configuración de SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 16 impulsó la expresión en la cofia y las otras regiones de la raíz (Tabla 3). No se detectó expresión fuera de las raíces.
Se exploró SEQ ID NO: 17 usando otro segmento de elemento regulador de Brachypodium, SEQ ID NO: 3, en lugar de SEQ ID NO: 2 y un segmento de Setaria italica, SEQ ID NO: 10, para sustituir el segmento de maíz, SEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO: 18 fue similar a SEQ ID NO: 17, con la excepción de que SEQ ID NO: 5 de sorgo se sustituyó con otro segmento de sorgo, SEQ ID NO: 7 (Tabla 2). Tanto SEQ ID NO: 17 como SEQ ID NO: 18 funcionaron en raíces de maíz transgénico, produciendo SEQ ID NO: 17 más expresión ectópica en la cofia que SEQ ID NO: 18 (Tabla 3). Algunos eventos para SEQ ID NO: 17 y 18 tuvieron cierta expresión del tallo.
Los resultados combinados de SEQ ID NO: 11 - 18 demuestran que se pueden ensamblar los segmentos de maíz, sorgo, Brachypodium y Setaria italica que funcionan en diferentes regiones de la raíz del maíz para producir un elemento regulador híbrido que funciona en todas las regiones de una raíz de maíz (Tabla 3).
Tabla 3: Resultados de la expresión para cada elemento regulador híbrido en raíces de maíz transgénico
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Se probaron combinaciones de segmentos adicionales que comprendían los componentes de segmento de promotores híbridos, SEQ ID NO: 13 y 17, en plantas de maíz. A los tres segmentos para cada elemento regulador parental se les asignó una posición "A" que indica el segmento 5', "B" el segmento central y "C" el segmento 3' (véase la FIG. 2). Los segmentos se pusieron entonces en combinaciones reordenadas como se indica en la FIG. 2 y las Tablas 4 y 5 para probar la localización relativa de segmentos en un promotor híbrido. La alteración del orden de los tres segmentos para SEQ ID NO: 13 produjo la expresión de tipo parental para dos de las tres combinaciones (Tabla 4). La combinación que no muestra expresión de tipo parental tuvo expresión reducida en la cofia de la raíz. Estos resultados indican flexibilidad en la posición de los segmentos dentro del elemento regulador, pero que no todas las combinaciones producirán el mismo desenlace. Estos resultados están soportados por la reordenación de SEQ ID NO: 17 que comprende segmentos diferentes de SEQ ID NO: 13. Dos de las tres combinaciones produjeron expresión de tipo parental y similar a SEQ ID NO: 13, una no (Tabla 5). La combinación que no muestra el fenotipo parental también tuvo una disposición de segmentos diferente en comparación con SEQ ID NO: 13 (CBA frente a CAB).
Tabla 4: Expresión de la orientación relativa de segmentos de un elemento regulador híbrido en raíces de maíz transgénico
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Tabla 5: Expresión de la orientación relativa de segmentos de un elemento regulador híbrido en raíces de maíz transgénico
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Para probar el uso de solo dos segmentos de elementos reguladores parentales para producir un único patrón de expresión en un promotor híbrido, se hicieron combinaciones por parejas usando dos segmentos de SEQ ID NO: 13 y se compararon con la expresión de SEQ ID NO: 13 (Tabla 6). Los resultados mostraron que se podrían hacer combinaciones que reflejaran la expresión de SEQ ID NO: 13, pero otras no. De las que no, una combinación (CA) no reflejó por completo la contribución de cada segmento. Los resultados indican que dos segmentos son suficientes para producir un promotor que funcione a través de diferentes regiones de la raíz, pero los segmentos puestos juntos y cómo se ponen juntos puede afectar el resultado de la expresión.
Tabla 6: Expresión de la orientación relativa de segmentos de un elemento regulador híbrido en raíces de maíz transgénico
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Ejemplo 4: Elementos reguladores aéreos híbridos
Los métodos usados para crear los elementos reguladores de raíz híbridos también se pueden aplicar a otros tipos de elementos reguladores híbridos, que incluyen tejido por encima del suelo que expresa elementos reguladores híbridos ("elementos reguladores aéreos"). Se combinan segmentos de un elemento regulador parental de pelos del maíz (SEQ ID NO: 48) y un elemento regulador parental de tejido verde de Brachypodium (SEQ ID NO: 49), como se describe en el Ejemplo 3, para SEQ ID NO: 11, donde segmentos repetidos de un elemento regulador preferido de pelos se ponen en la dirección 5’ de un segmento de tejido verde que suministra una caja TATA para SEQ ID NO: 48. La inversa también se realizó, donde un segmento expresado en pelos del elemento regulador parental preferido de pelos del maíz (SEQ ID NO: 48) proporciona la caja TATA y múltiples segmentos del elemento regulador de tejido parental verde de Brachypodium (SEQ ID NO: 49) están en la dirección 5’ para un elemento regulador híbrido aéreo. El resultado de combinar estos elementos, mostrado en la Tabla 7 y FIG. 3, fue que el elemento regulador híbrido resultante impulsó la expresión transgénica en tanto las hojas como los pelos de las plantas de maíz. La expresión en otros tejidos, tales como raíz y tallo, no fueron significativamente diferentes en comparación con los progenitores. Tomados conjuntamente, segmentos de promotores de tejido verde vegetativos se pueden combinar con segmentos de tejido no verde reproductor para producir un patrón de expresión deseado en maíz. Los segmentos de elementos reguladores parentales se pueden originar de diferentes especies.
No se esperó precisamente que la combinación de los segmentos aumentara la expresión en los tejidos de interés mucho más allá del nivel proporcionado por los progenitores. Por lo tanto, para ayudar a modular la expresión en la dirección de niveles elevados, se usaron las regiones -20 de tres promotores víricos de planta diferentes en sustitución de la región -20 del segmento que proporciona la caja TATA para elementos reguladores híbridos aéreos. Los promotores víricos, en general, son fuertes promotores en plantas, por lo que las regiones -20 de estos promotores, que consisten en la región de caja TATA y otras secuencias que interactúan con la maquinaria de transcripción basal, se pueden visualizar como "optimizados" para la expresión. Por lo tanto, el conectar en la dirección 5’ segmentos reguladores con estos elementos de secuencia "optimizados" puede producir elevados niveles de expresión del elemento regulador híbrido. Los tres promotores víricos seleccionados para proporcionar las regiones -20 fueron BYDV (virus del enanismo amarillo de la judía, SEQ ID NO: 67, HLCV (virus del arrugamiento de las hojas de la malvarrosa, SEQ ID NO: 66 y virus del rayado del plátano (AY), SEQ ID NO: 65. Estos representan las familias de virus Geminiviridae y Caulimoviridae, aunque se pueden usar otros promotores de virus y promotores de otras familias distintas de las familias Geminiviridae y Caulimoviridae. La Tabla 7 muestra que cada una de las regiones -20 afectó positivamente la expresión en hojas y pelos. La expresión en raíces y tallo no estuvo afectada de la misma forma. La región -20 de BSV(AY) proporcionó el aumento más significativo en la expresión, que incluyó un aumento en la expresión en cascarilla.
Tabla 7: Las regiones -20 de la familia Geminiviridae y Caulimoviridae afectaron positivamente la expresión en hojas y pelos
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Se preparó un conjunto de elementos reguladores híbridos que consistía en segmentos parentales no redundantes. El segmento que proporcionó la caja TATA (SEQ ID NO: 48) genera la expresión en tejidos de hoja y pelos, pero donde la expresión en pelos es inferior a la de hoja (Tabla 8). En un esfuerzo por aumentar la expresión en pelos, se probaron los segmentos de dos promotores preferidos de pelos diferentes (SEQ ID NO: 61 y 62) en combinación con SEQ ID NO: 48. En el primer elemento regulador híbrido, se añadió un segmento de SEQ ID NO: 61 (SEQ ID NO: 47). Se observó un aumento en la expresión en pelos. La expresión en hoja y raíz siguió siendo aproximadamente la misma, y la expresión en tallo aumentó ligeramente. La adición de SEQ ID NO: 62 (SEQ ID NO: 56) produjo un aumento más significativo en la expresión en pelos. La expresión en hoja y tallo disminuyó ligeramente, y la expresión en raíz no tuvo cambio. En un tercer elemento regulador híbrido, el segmento de pelos más hacia 5' desde el elemento regulador híbrido de SEQ ID NO: 56 se sustituyó con un segmento de tejido verde (SEQ ID NO: 64) para producir el elemento regulador híbrido aéreo de SEQ ID NO: 57. El resultado fue un aumento en la expresión en hoja y un regreso de la expresión en pelos a los niveles previos. La expresión en tallo aumentó ligeramente y la expresión en raíz siguió sin cambiar. Estos resultados demuestran la capacidad de uso de segmentos del elemento regulador parental no redundantes, donde los segmentos no redundantes puede ser de una especie diferente (en este caso Brachypodium distachyon), para producir un elemento regulador híbrido que funciona en tejidos de maíz dirigidos.
Tabla 8: Resultados de la expresión para cada elemento regulador híbrido en maíz transgénico
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Similar a los elementos reguladores híbridos de raíz, la orientación relativa de segmentos entre sí puede afectar el resultado de la expresión en elementos reguladores híbridos designados para la expresión en otros tejidos (véase la FIG.
2 para la orientación de segmentos). La Tabla 9 muestra los resultados de expresión de un segmento de tejido verde colocado en el extremo 5’ de un elemento regulador híbrido (SEQ ID NO: 54) frente a una posición 3' donde se proporciona la caja TATA (SEQ ID NO: 55). Cuando el segmento de tejido verde se coloca en la posición 5', no existe aumento en la expresión de las hojas (SEQ ID NO: 54; Tabla 9). Sin embargo, cuando el elemento de tejido verde se pone en la posición 3', aumenta la expresión en la hoja. La posición también afectó la expresión en cascarilla con algo de efecto inverso.
Tabla 9: Expresión de la orientación relativa de segmentos de un elemento regulador híbrido en maíz transgénico
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En otro ejemplo, se colocaron dos copias del segmento de pelos usado en la Tabla 7 (desde el elemento regulador parental de SEQ ID NO: 60) en la dirección 5’ de dos copias del segmento de tejido verde también en la Tabla 7 (desde el elemento regulador parental de SEQ ID NO: 49). La expresión en hoja y pelos aumentó aproximadamente dos veces con respecto a los progenitores en esta configuración (SEQ ID NO: 53; Tabla 10). Sin embargo, la inversión de la disposición de manera que dos copias del segmento de tejido verde estuvieran en la dirección 5’ de las dos copias del segmento de pelos no produjo la expresión en la hoja (SEQ ID NO: 59; Tabla 10). Los resultados combinados sugieren que el segmento que proporciona la caja TATA o los segmentos de 3' pueden afectar o influir en la expresión proporcionada por el elemento regulador híbrido.
Tabla 10: Expresión de la orientación relativa de segmentos de un elemento regulador híbrido en maíz transgénico
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Ejemplo 10: Transformación mediada por A grobacterium de maíz y regeneración de plantas transgénicas
Para la transformación mediada por Agrobacterium de polinucleótidos de maíz de la divulgación, se empleó el método de Zhao (patente de EE. UU. N.° 5.981.840 y publicación de patente PCT WO98/32326). Brevemente, se aislaron embriones maduros de la maíz y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium en condiciones por las cuales las bacterias fueron capaces de transferir la secuencia del elemento regulador de la divulgación a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de inoculación. Los embriones se cocultivaron durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido tras la etapa de infección. T ras el periodo de cocultivo se realizó una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en presencia de al menos un antibiótico que se sabía que inhibía el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de planta (etapa 3: etapa de reposo). A continuación, los embriones inoculados se cultivaron en medio que contenía un agente selectivo y se recuperaron los callos transformados en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Se generaron plántulas a partir de los callos (etapa 5: la etapa de regeneración) antes de la transferencia al invernadero.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un elemento regulador híbrido que comprende el polinucleótido de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 39 y 40.
2. Una construcción de ADN que comprende el elemento regulador híbrido de la reivindicación 1.
3. La construcción de ADN de la reivindicación 2, en donde el elemento regulador híbrido está unido operativamente unido a un polinucleótido de interés.
4. Un casete de expresión que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 2 o 3.
5. Una célula hospedadora que comprende el casete de expresión de la reivindicación 4.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en donde la célula hospedadora comprende una célula de la planta, una célula bacteriana o una célula de animal.
7. Una planta transgénica que comprende el casete de expresión de la reivindicación 4.
8. Un método para la expresión dirigida de una secuencia de polinucleótidos en una planta o célula de la planta, comprendiendo dicho método introducir por transformación en la planta o la célula de la planta un casete de expresión que comprende el elemento regulador híbrido de la reivindicación 1, unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos heteróloga de interés.
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