ES2299172T3 - Promotores especificos de estambres de maiz. - Google Patents
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Abstract
PROMOTORES ESPECIFICOS DE LA ANTERA DE CEREALES, QUE SON PARTICULARMENTE UTILES PARA LA PRODUCCION DE MONOCOTILEDONES ESTERILES MASCULINOS TRANSGENICOS Y PLANTAS PARA QUE RECUPEREN SU FERTILIDAD.
Description
Promotores específicos de estambres de maíz.
Esta invención se refiere a promotores aislados
de maíz que pueden proporcionar expresión génica predominante o
específicamente en las células estaminales de una planta,
particularmente una planta monocotiledónea, y proporcionar por ello
poca o ninguna expresión génica en otras partes de la planta que no
están involucradas en la producción de polen fértil. Los promotores
son útiles en la producción de plantas transformadas, en las cuales
un gen debe expresarse al menos predominantemente, y de modo
preferible específicamente, en las células estaminales,
preferiblemente en las células de las anteras. Los promotores son
especialmente útiles en la producción de plantas con esterilidad
masculina y plantas restablecedoras de la fertilidad masculina como
se describe en las solicitudes de Patente Europea ("EPA")
89401194.9 y 90402281.1, respectivamente, de modo particular en la
producción de híbridos de plantas monocotiledóneas, tales como maíz,
arroz o trigo.
De acuerdo con esta invención, se proporcionan:
promotores específicos de los estambres, preferiblemente
específicos de las anteras, un promotor que controla la expresión de
la secuencia codificante genómica correspondiente al cDNA de SEQ ID
NO. 2 y que está contenido en la secuencia de los nucleótidos 1 a
1179 de SEQ ID NO. 3 (el "promotor CA55" o "PCA55"). Cada
uno de tales promotores puede utilizarse en una secuencia de DNA
extraña, preferiblemente una secuencia de DNA extraña quimérica, que
contiene un gen estructural, preferiblemente un DNA de esterilidad
masculina o un DNA restablecedor de la fertilidad masculina, bajo el
control transcripcional del promotor y que puede utilizarse para
transformar el genoma nuclear de una célula de una planta,
particularmente una planta monocotiledónea. Adicionalmente, se
proporcionan de acuerdo con esta invención: la planta estéril
masculina o la planta restablecedora de la fertilidad masculina que
pueden regenerarse a partir de una célula de este tipo transformada
con la secuencia de DNA extraña de esta invención; la célula
transformada propiamente dicha; un cultivo de una célula
transformada de este tipo; semillas de una planta regenerada de
este tipo y su progenie; y una planta de fertilidad restablecida y
sus semillas resultantes del cruzamiento de dichas plantas con
esterilidad masculina y restablecedoras de la fertilidad
masculina.
De acuerdo con esta invención, una planta con
esterilidad masculina o una planta restablecedora de la fertilidad
masculina puede producirse a partir de una sola célula de una planta
por transformación de la célula de la planta de una manera conocida
para insertar de manera estable, en su genoma nuclear, la secuencia
de DNA extraña de esta invención. La secuencia de DNA extraña
comprende al menos un DNA con esterilidad masculina o un DNA
restablecedor de la fertilidad masculina que está: bajo el control
de, y fusionado en marco en su extremo de aguas arriba (es decir,
5') a, uno de promotores de esta invención específicos de los
estambres, preferiblemente específicos de las anteras, y
particularmente específicos del tapete, tales como el promotor y
opcionalmente la secuencia conductora de SEQ ID NO. 3; y fusionado
en su extremo de aguas abajo (es decir 3') a señales adecuadas de
terminación (o regulación) de la transcripción, que incluyen una
señal de poliadenilación. De este modo, el RNA y/o la proteína o
polipéptido, codificados por el DNA de esterilidad masculina o
restablecedor de la fertilidad masculina, se produce o se
superproduce al menos predominantemente, con preferencia
exclusivamente, en las células estaminales de la planta. La
secuencia de DNA extraña puede comprender también al menos un DNA
marcador que: codifica un RNA y/o proteína o polipéptido que, cuando
está presente al menos en un tejido específico o células
específicas de la planta, hace que la planta pueda separarse o
distinguirse fácilmente de otras plantas que no contienen dicho RNA
y/o proteína o polipéptido al menos en el tejido específico o las
células específicas; se encuentra bajo el control de, y está
fusionado en su extremo 5' a, un segundo promotor que es capaz de
dirigir la expresión del DNA marcador al menos en el tejido
específico o las células específicas; y está fusionado en su
extremo 3' a señales de terminación de la transcripción adecuadas,
que incluyen una señal de poliadenilación. El DNA marcador se
encuentra preferiblemente en el mismo locus genético que el DNA de
esterilidad masculina o restablecedor de la fertilidad masculina.
Esta unión entre el DNA de esterilidad masculina o restablecedor de
la fertilidad masculina y el DNA marcador garantiza, con un grado
de certidumbre elevado, la segregación conjunta de, a la vez, el DNA
de esterilidad masculina o restablecedor de la fertilidad masculina
y el DNA marcador en la descendencia de la planta regenerada a
partir de la célula de la planta transformada. Sin embargo, en
algunos casos, dicha segregación conjunta no es deseable y, en tales
casos, el DNA marcador debería encontrarse en un locus genético
diferente del DNA de esterilidad masculina o restablecedor de la
fertilidad masculina.
El DNA de esterilidad masculina de esta
invención puede ser cualquier gen o fragmento de gen, cuyo producto
de expresión (RNA y/o proteína o polipéptido) altera
significativamente el metabolismo, el funcionamiento y/o el
desarrollo de las células estaminales, preferiblemente las células
de las anteras, e impide por tanto la producción de polen fértil.
DNAs de esterilidad masculina preferidos se describen en el
documento EPA 89401194.9, por ejemplo aquéllos DNAs que codifican:
RNasas tales como RNasa Ti o barnasa; DNasas tales como
endonucleasas (v.g. EcoRI); proteasas tales como papaína; enzimas
que catalizan la síntesis de fitohormonas (v.g.,
isopentenil-transferasa o los productos génicos del
gen 1 y el gen 2 del T-DNA de Agrobacterium;
glucanasas; lipasas; peroxidasas lipídicas; inhibidores de la pared
celular de las plantas, o toxinas (v.g. el fragmento A de la toxina
de la difteria o la botulina). Otros ejemplos preferidos de DNAs de
esterilidad masculina son DNAs antisentido que codifican RNAs
complementarios a genes, cuyos productos son esenciales para el
desarrollo normal de polen fértil. Ejemplos adicionales preferidos
de DNAs de esterilidad masculina codifican ribozimas capaces de
escindir específicamente secuencias diana dadas de genes que
codifican productos que son esenciales para la producción de polen
fértil. Otros ejemplos adicionales de DNAs de esterilidad masculina
codifican productos que pueden hacer que las células estaminales,
particularmente las células de las anteras - y no otras partes de la
planta - sean propensos a enfermedades específicas (v.g. infección
por hongos o virus) o condiciones de estrés (herbicidas).
La construcción de un vector que comprende un
DNA de esterilidad masculina, tal como un DNA codificante de
barnasa, bajo el control de un promotor específico de anteras del
maíz de esta invención, se efectúa del modo más conveniente en un
organismo hospedador bacteriano tal como E. coli. Sin
embargo, dependiendo de la naturaleza del DNA de esterilidad
masculina y la configuración específica del vector, pueden
encontrarse problemas debido a la expresión del DNA de esterilidad
masculina en, y la disminución concurrente de la viabilidad del
organismo hospedador. Tales problemas pueden resolverse de varias
maneras. Por ejemplo, el organismo hospedador puede proveerse, en
el mismo plásmido o un plásmido diferente del que contiene el DNA de
esterilidad masculina o incluso en su DNA cromosómico, de otra
secuencia de DNA que evita o inhibe significativamente el efecto de
la expresión del DNA de esterilidad masculina en el organismo
hospedador. Dicha otra secuencia de DNA puede codificar, por
ejemplo: un RNA antisentido a fin de evitar la acumulación y
traducción del RNA de esterilidad masculina; o una proteína (v.g.,
barstar) que inhibe específicamente el producto génico del RNA de
esterilidad masculina (v.g., barnasa; Hartley (1988) J. Mol. Biol.
202, 913). Alternativamente, el DNA de esterilidad masculina puede
contener elementos, tales como un Intrón vegetal, que dará
únicamente como resultado un producto génico activo en un ambiente
de células vegetales. Ejemplos de Intrones que pueden utilizarse
para este propósito son Intrones de las unidades de transcripción
de: el gen adh-1 del maíz (Luehrsen y Walbot
(1991) Mol. Gen. Genet. 225, 81; Mascarenhas et al., (1990)
Plant Mol. Biol. 15, 213), el gen contraído-1
del maíz (Vasil et al. (1989), Plant. Physiol. 91, 1575), el
gen cat-1 del haba del ricino (Tanaka et
al. (1990) Nucleic Acids Research ("NAR") 18, 6767), el
gen act-1 del arroz (McElroy et al.
(1990) The Plant Cell 2, 163; publicación PCT WO 91/09948)) y el
gen TA36 (Intrón representado en SEQ ID NO. 4).
El DNA restablecedor de la fertilidad masculina
de esta invención puede ser cualquier gen o fragmento de gen, cuyo
producto de expresión (RNA y/o proteína o polipéptido) desactiva,
neutraliza, inhibe, bloquea, contrarresta, vence o impide de otro
modo la actividad específica del producto de un DNA de esterilidad
masculina en las células estaminales, particularmente en las
células de las anteras. DNAs restablecedores de la fertilidad
masculina preferidos se describen en el documento EPA 90402281.1,
por ejemplo aquellos DNAs que codifican: barstar, que es el
inhibidor de la barnasa; EcoRI metilasa, que previene la actividad
de EcoRI; o inhibidores de proteasas (v.g. los inhibidores de
papaína). Otros ejemplos de DNAs restablecedores de la fertilidad
masculina son DNAs antisentido que codifican RNAs complementarios a
los DNAs de esterilidad masculina. Ejemplos adicionales de DNAs
restablecedores de la fertilidad masculina codifican ribozimas
capaces de escindir específicamente secuencias diana dadas de DNAs
de esterilidad masculina.
El DNA marcador de esta invención puede ser
cualquier gen o fragmento de gen que codifique un RNA y/o proteína
o polipéptido que permite que plantas que expresan el DNA marcador
se fácilmente y se separen distingan de las plantas que no expresan
el DNA marcador. Ejemplos del DNA marcador se describen en EPA
89401194.9, tales como los DNAs marcadores que codifican proteínas
o polipéptidos que: proporcionan un color distinguible a las
células vegetales, tales como el gen A1 que codifica
dihidroquercetina-4-reductasa (Meyer
et al. (1987) Nature 330, 667-678) y el gen
de glucuronidasa (Jefferson et al. (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ("PNAS") 83, 8447); proporcionan una característica
morfológica específica a una planta tal como crecimiento enano o
una forma diferente de las hojas; confieren a una planta tolerancia
al estrés, tal como la proporcionada por el gen que codifica la
superóxido-dismutasa como se describe en EPA
88402222.9; confieren resistencia a enfermedades o plagas a una
planta, tal como la proporcionada por un gen codificante de una
endotoxina de Bacillus thuringensis que confiere resistencia
a los insectos a una planta, como se describe en EPA 86300291.1; o
confieren a una planta una resistencia bacteriana, tal como la
proporcionada por el péptido bacteriano descrito en EPA 88401673.4.
DNAs marcadores preferidos codifican proteínas o polipéptidos que
inhiben o neutralizan la actividad de herbicidas tales como: el gen
sfr y el gen sfrv que codifican enzimas que confieren
resistencia a los inhibidores de la
glutamina-sintetasa tales como Bialaphos y
fosfinotricina como se describe en EPA 87400544.0.
Con objeto de que la proteína o el polipéptido
codificado por el DNA marcador funcione como se pretende, a menudo
se prefiere que los mismos se produzcan en la célula vegetal como un
precursor, en el cual la proteína madura está enlazada en su
extremo N-terminal a otro polipéptido (un "péptido
de direccionamiento") que translocará la proteína madura a un
compartimiento específico tal como los cloroplastos, la mitocondria,
o el retículo endoplasmático. Tales péptidos de direccionamiento y
las secuencias de DNA que codifican los mismos (las "secuencias
de direccionamiento") son bien conocidos. Por ejemplo, si un DNA
marcador codifica una proteína que confiere tolerancia o
resistencia a un herbicida u otro agente selectivo que actúa sobre
el metabolismo de los cloroplastos, tal como el gen sfr (o
bar) o el gen sfrv (publicación de patente europea
("EP") 0.242.236), puede ser preferible que dicho gen
comprenda también una secuencia de direccionamiento de cloroplastos
tal como la que codifica el péptido de tránsito de la subunidad
pequeña de la enzima
1,5-ribulosa-bisfosfato-carboxilasa
(Krebbers et al. (1988) Plant. Mol. Biol. 11, 745; EPA
85402596.2), aunque pueden utilizarse otras secuencias de
direccionamiento que codifican otros péptidos de tránsito, tales
como las listadas por Von Heijne et al. (1991) Plant Mol.
Biol. Reporter 9, 104.
Cada uno de los promotores de esta invención
específicos de los estambres, preferiblemente específicos de las
anteras, tales como el promotor CA55 aguas arriba del nucleótido
1180 en SEQ ID NO. 3, que pueden utilizarse para controlar el DNA
de esterilidad masculina o el DNA restablecedor de la fertilidad
masculina, pueden identificarse y aislarse de manera bien conocida
como se describe en EPA 89401194.9. A este respecto, los cDNAs de
SEQ ID NO. 2 de esta invención pueden utilizarse como sonda para
identificar (es decir, para hibridarse a) la región correspondiente
del genoma del maíz (es decir, la región que contiene DNA
codificante del mRNA específico de estambres, a partir del cual se
produjo el cDNA). A continuación, puede identificarse la porción
del genoma de la planta que está situada aguas arriba (es decir, 5')
del DNA que codifica dicho mRNA específico de estambres y que
contiene el promotor de este DNA. Por ejemplo, puede utilizarse el
cDNA de SEQ ID NO. 2 como sonda para identificar y aislar un clon
genómico a partir de una genoteca genómica de Zea mays, tal
como una genoteca genómica de Zea mays lambda EMBL3 o EMBL4.
De este modo, puede aislarse y secuenciarse un clon de DNA
genómico, tal como el clon de SEQ ID NO. 3. SEQ ID NO. 3 contiene
una región codificante que es homóloga al cDNA de SEQ ID NO. 2, y
aguas arriba de esta región codificante se encuentra una secuencia
promotora, con una secuencia TATA, que dirige la transcripción
específica de las anteras de la región codificante.
El segundo promotor, que controla el DNA
marcador, puede seleccionarse y aislarse también de manera bien
conocida, por ejemplo como se describe en EPA 89401194.9, de tal
modo que el DNA marcador se expresa selectivamente en uno o más
tejidos o células específicos o constitutivamente en la planta
entera, según se desee, dependiendo de la naturaleza del RNA y/o la
proteína o polipéptido codificado por el DNA marcador.
En la secuencia de DNA extraña de esta
invención, señales de terminación de la transcripción 3' o el
"extremo 3'" pueden seleccionarse de entre aquéllas que son
capaces de proporcionar terminación correcta de la transcripción
y/o poliadenilación de mRNA en células vegetales. Las señales de
terminación de la transcripción pueden ser las naturales del DNA de
esterilidad masculina o del DNA restablecedor de la fertilidad
masculina a transcribir, o pueden ser extrañas o heterólogas.
Ejemplos de señales de terminación de la transcripción 3'
heterólogas son las del gen de la octopina-sintasa
(Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835-845) y
del gen 7 de D-DNA (Velten y Schell (1985) NAR 13,
6981-6998). Cuando la secuencia de DNA extraña de
esta invención comprende más de un gen estructural (v.g. un DNA de
esterilidad masculina o un DNA restablecedor de la fertilidad y un
DNA marcador), se prefiere que los extremos 3' de los genes
estructurales sean diferentes.
En las plantas, especialmente en las plantas
monocotiledóneas, particularmente cereales tales como arroz, maíz y
trigo, la expresión de acuerdo con esta invención de un DNA
marcador, así como un DNA de esterilidad masculina o un DNA
restablecedor de la fertilidad, puede intensificarse por la
presencia en una o más, preferiblemente una, posición o posiciones
apropiada(s) en la unidad de transcripción de cada secuencia
de DNA extraña de esta invención, de un Intrón vegetal adecuado
(Luerhsen y Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 81; Mascarenhas
et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 913; Vasil et al.
(1989) Plant Physiol. 91, 1575; Tanaka et al. (1990) NAR 18,
6767; McElroy et al. (1990) The Plant Cell 2, 163;
publicación PCT WO 91/09948). Preferiblement e, cada Intrón tiene
una secuencia de nucleótidos que: puede ser reconocida por las
células de la especie vegetal que se transforma (para
requerimientos de reconocimiento de Intrones por plantas, véase
Goodall y Filipowicz (1989) Cell 58, 473; Hanley y Schuler (1988)
NAR 16, 7159), tiene una longitud mayor que aproximadamente
70-73 pb (Goodall y Filipowicz (1990) Plant Mol.
Biol. 14, 727), y está posicionada próxima al extremo 5' del mRNA
codificado, particularmente en cualquier secuencia conductora no
traducida.
Las células de una planta pueden transformarse
con la secuencia de DNA extraña de esta invención de manera
convencional. En el caso en que la planta a transformar es propensa
a infección por Agrobacterium, se prefiere utilizar un
vector, que contiene la secuencia de DNA extraña, que es un plásmido
Ti desactivado. La transformación puede realizarse utilizando
procedimientos descritos, por ejemplo, en EP 0.116.718 y EP
0.270.822. Vectores preferidos de plásmidos Ti contienen la
secuencia de DNA extraña entre las secuencias límite o al menos
localizadas aguas arriba de la secuencia límite derecha. Por
supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para
transformar la célula vegetal, utilizando procedimientos tales como
transferencia directa de genes (como se describe por ejemplo en EP
0.223.247), transformación mediada por polen (como se describe por
ejemplo en EP 0.270.356, publicación PCT WO/85/01856 y EP 0275069),
transformación de protoplastos in vitro (como se describe
por ejemplo en la Patente US 4.684.611), transformación mediada por
virus de plantas (como se describe por ejemplo en EP 0.067.553 y
Patente US 4.407.956) y transformación mediada por liposomas (como
se describe por ejemplo en la Patente US 4.536.475).
En el caso en que la planta a transformar es el
maíz, pueden utilizarse métodos de transformación desarrollados
recientemente tales como los métodos descritos para ciertas líneas
de maíz por Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8, 833 y
Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2,
603.
En el caso en que la planta a transformar es el
arroz, pueden utilizarse métodos de transformación desarrollados
recientemente tales como los métodos descritos para ciertas líneas
de arroz por Shimamoto et al. (1990) Nature 338, 274, Datta
et al. (1990) Bio/Technology 8, 736, Christou et al.
(1991) Bio/Technology 9, 957 y Lee et al. (1991) PNAS 88,
6389.
En el caso en que la planta a transformar es el
trigo, puede utilizarse un método análogo a los arriba descritos
para maíz o arroz. Preferiblemente, para la transformación de una
planta monocotiledónea, particularmente un cereal tal como arroz,
maíz o trigo, se utiliza un método de transferencia directa de DNA,
tal como un método de transformación biolística o electroporación.
Cuando se utiliza un método de transferencia directa de este tipo,
se prefiere minimizar el DNA que se transfiere de tal modo que se
integre esencialmente sólo en el genoma de la planta la secuencia
de DNA extraña de esta invención, con su DNA de esterilidad
masculina, DNA restablecedor de la fertilidad y/o DNA marcador. A
este respecto, cuando se construye una secuencia de DNA extraña de
esta invención y se multiplica sobre un plásmido en un organismo
hospedador bacteriano, se prefiere que, antes de la transformación
de una planta con la secuencia de DNA extraña, se separen las
secuencias plasmídicas que se requieren para propagación en el
organismo hospedador bacteriano, tales como un origen de
replicación, un gen de resistencia a antibióticos para selección
del organismo hospedador, etc., de las partes del plásmido que
contienen la secuencia de DNA extraña.
Los ejemplos que siguen describen: el
aislamiento y la caracterización de las dos secuencias de cDNA de
maíz SEQ ID NO. 1 y NO. 2; el uso del cDNA de SEQ ID NO. 2
de esta invención para aislamiento de promotores específicos de los
estambres de esta invención a partir del genoma del maíz, tales como
el promotor CA55 aguas arriba del nucleótido 1180 en SEQ ID NO. 3;
la construcción de casetes promotoras para la fusión de los
promotores con los DNAs de fertilidad masculina [sic] y
restablecedor de la fertilidad masculina; la construcción de
vectores de transformación de plantas a partir de las casetes
promotoras; así como la transformación de maíz, arroz y tabaco con
los vectores de transformación de plantas resultantes.
A no ser que se indique otra cosa en los
ejemplos, todos los procedimientos para fabricación y manipulación
de DNA recombinante se llevaron a cabo por los procedimientos
estándar descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1982) y
Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual,
Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989).
Cuando se fabricaron construcciones de plásmidos, se comprobaron la
orientación y la integridad de los fragmentos clonados por medio de
mapeado de restricción y/o secuenciación.
Los números de identificación de secuencias a
que se hace referencia anteriormente y en los ejemplos se listan a
continuación.
- \quad
- SEQ ID NO.: 1; secuencia de cDNA del gen CA444.
- \quad
- SEQ ID NO.: 2: secuencia de cDNA del gen CA455.
- \quad
- SEQ ID NO.: 3: clon de DNA genómico obtenido de una genoteca genómica de Zea mays utilizando el cDNA de SEQ ID NO. 2 como sonda.
- \quad
- SEQ ID NO. 4: Intrón del gen TA36 de Nicotiana tabacum unido a enlazadores KpnI.
- \quad
- SEQ ID NO. 5: secuencia del plásmido pVE149.
Para la clonación de cDNAs correspondientes a
genes que se expresan exclusivamente, o al menos predominantemente,
en las anteras del maíz, se preparó una genoteca de cDNA a partir de
mRNA poliA^{+} aislado de las espiguillas de la borla de la línea
de maíz disponible públicamente B73 portadora de anteras en
la etapa de tétrada. Por medio del kit del Sistema de Síntesis de
cDNA Amersham Plus RPN 1956 Y/Z (Amersham International PLC,
Buckinghamshire, Inglaterra), se sintetizó cDNA utilizando
transcriptasa inversa y un iniciador oligo dT de acuerdo con las
instrucciones expuestas en el kit para su utilización.
Los cDNAs se clonaron en el vector lambda gt10,
utilizando el kit del Sistema de Clonación de cDNA
Amersham-lambda gt10-RPN1257, de
acuerdo con las instrucciones expuestas en el kit para su
utilización. A partir de la genoteca de cDNA así obtenida (30.000
calvas), se realizó un cribado diferencial con una sonda de cDNA
marcada de plantas de semillero B73 de maíz y con una sonda
de cDNA marcada de las espiguillas enteras de maíz B73. Se
seleccionaron 93 clones posibles de cDNA específicos de las anteras
y se cribaron de nuevo con sondas de cDNA marcadas de anteras,
plantas de semillero y mazorcas de maíz B73. Con los 66
clones restantes de estas selecciones adicionales, se realizó un
análisis Southern con sondas diferenciales de cDNA de las anteras en
la etapa de tétrada y de borlas, estigmas y mazorcas de la línea de
maíz B73. Esto condujo a la selección de 27 clones
específicos de las anteras que se subclonaron en pGEM1 (Promega,
Madison, Wisconsin, EE.UU.). La hibridación cruzada entre estos
subclones reveló la presencia de al menos dos clases. Se prepararon
sondas de algunos de estos subclones y se comprobaron de nuevo en
relación con su especificidad en transferencias Northern con 5 a 10
\mug de mRNA poliA^{+} aislado de diferentes tejidos de maíz
B73 (a saber, anteras, mazorcas, estigmas, hojas, y
espiguillas en diversas etapas). A partir de esta selección, se
identificaron dos clones específicos de las anteras, denominados
"pCA444" y "pCA455". Se secuenciaron estos clones, y sus
secuencias se presentan en el listado de secuencias como SEQ ID NO.
1 y SEQ ID NO. 2, respectivamente. Se encontró que pCA455 se
hibrida exclusivamente con mRNA de las anteras en diferentes etapas
de desarrollo. Se encontró que pCA444 se hibrida con mRNA de las
anteras y se hibrida muy débilmente con un mRNA de tamaño similar
procedente de embriones.
La secuencia de cDNA de pCA444 revela la
presencia de dos marcos de lectura abierta ("ORF") de un total
de 323 y 376 nucleótidos. La secuencia de cDNA de pCA455 revela la
presencia de dos ORFs de un total de 387 y 300 nucleótidos.
Para aislar los clones de DNA genómico que
llevan las secuencias reguladoras del gen, CA444, correspondiente a
pCA444, se utilizan dos enfoques.
El primer enfoque utiliza reacciones en cadena
de polimerasa ("PCR") inversa (Ochman et al. (1989) en
"PCR: Application & Protocols", Innis, M., Gelfand, D.,
Sninsky, J. y White, T., compiladores, Academic Press, Nueva York)
para la amplificación geométrica de las secuencias de DNA que
flanquean, aguas arriba y aguas abajo, una región de núcleo
seleccionada de la secuencia del gen CA444 correspondiente a la
secuencia de pCA444. Se realizan digestiones de DNA utilizando
tampones convencionales y condiciones bien conocidas. Fragmentos de
un tamaño adecuado (menores que 3 a 4 kb) para amplificación y
circularización correctas se producen utilizando enzimas de
restricción que no escinden la región de núcleo seleccionada de la
secuencia del gen CA444 y que se identifican preliminarmente por
hibridación Southern. La circularización se realiza con DNA ligasa
T4 en una concentración diluida de DNA que favorece círculos
monómeros (Collins y Weissman (1984) PNAS 81,
6812-6815). Se realizan tres reacciones en cadena
de polimerasa en paralelo con tres pares de oligonucleótidos
diferentes en condiciones convencionales (Saiki et al. (1985)
Science 230, 1250-1354) utilizando la
DNA-polimerasa Vent ^{TM} (número de catálogo
254L - Biolabs New England, Beverly, MA 01915, EE.UU.) aislada de
Thermococcus litoralis (Neuner et al. (1990) Arch.
Microbiol. 153, 205-207).
\vskip1.000000\baselineskip
En una reacción, las regiones flanqueantes de la
región de núcleo de CA444, desde el nucleótido 85 al nucleótido 358
de la secuencia de cDNA correspondiente (SEQ ID NO. 1), se
amplifican utilizando el par siguiente de 22 y 20 oligonucleótidos
que tienen las secuencias respectivas siguientes:
- 1)
- 5' CCG AGG ACC AGC AGG ACG AGG C 3' (nucleótido 64 a nucleótido 85 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)) y
- 2)
- 5' GGA TGG CAG GAG GGG AGA GG 3' (nucleótido 358 a nucleótido 377 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)).
\vskip1.000000\baselineskip
En la segunda reacción, las regiones
flanqueantes de la región de núcleo de CA444, desde el nucleótido
288 al nucleótido 392 de la secuencia de cDNA correspondiente (SEQ
ID NO. 1), se amplifican utilizando el par siguiente de 20 y 23
oligonucleótidos que tienen las secuencias respectivas
siguientes:
- 1)
- 5' GCA GGC TGT TGA TGA TGC CC 3' (nucleótido 269 a nucleótido 288 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)) y
- 2)
- 5' CCA TTT CAC AGT GAG AGC AGT CG 3' (nucleótido 392 a nucleótido 414 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)).
\vskip1.000000\baselineskip
En la tercera reacción, las regiones
flanqueantes de la región de núcleo de CA444, desde el nucleótido 43
al nucleótido 74 de la secuencia de cDNA correspondiente (SEQ ID
NO.: 1), se amplifican utilizando el par siguiente de 22 y 20
oligonucleótidos que tienen las secuencias respectivas
siguientes:
- 1)
- 5' GGG GCG GTG GCT GCT TCT AGC G 3' (nucleótido 22 a nucleótido 43 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)) y
- 2)
- 5' GCT GGT CCT CGG CGG CGG CA 3' (nucleótido 74 a nucleótido 93 de pCA444 (SEQ ID NO. 1)).
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo enfoque utiliza una genoteca genómica
de Zea mays lambda EMBL3 o EMBL4 que se criba con la
secuencia entera de cDNA de pCA444 como sonda. Se secuencian clones
genómicos correspondientes que se hibridan a pCA444 (Maxam y
Gilbert (1977) PNAS 74, 560) y su orientación se comprueba
por análisis mediante transferencia Northern con ribosondas de
ambos sentidos. La comparación de las secuencias de pCA444 con las
secuencias de clones genómicos conduce a la identificación de las
regiones homólogas. En el extremo 5' de la región de cada uno de
estos clones genómicos homólogos, se determinan el codón ATG y la
secuencia de consenso TATA. El hecho de que la secuencia
"TATA" forma parte del promotor se confirma por extensión con
iniciadores.
Para aislar los clones genómicos de DNA que
llevan las secuencias reguladoras del gen, CA455, correspondiente a
pCA455, se utilizan los dos enfoques del Ejemplo 2.
En el primer enfoque, se utiliza PCR inversa
(Ochman et al., 1989) para la amplificación geométrica de las
secuencias de DNA que flanquean una región de núcleo seleccionada
de la secuencia del gen CA455 correspondiente a la secuencia de
pCA455. La digestión y circularización del DNA se llevan a cabo como
en el Ejemplo 2. Se realizan dos reacciones en cadena de la
polimerasa en paralelo con dos pares de oligonucleótidos diferentes
en condiciones convencionales (Saiki et al., 1985) utilizando
la DNA-polimerasa Vent ^{TM} aislada de T.
litoralis (Neuner et al., 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
En una reacción, las regiones flanqueantes de la
región de núcleo de CA455, desde el nucleótido 54 al nucleótido 87
de la secuencia de cDNA correspondiente (SEQ ID NO. 2), se
amplifican utilizando el par siguiente de 21 y 23 oligonucleótidos
que tienen las secuencias respectivas siguientes:
- 1)
- 5' GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3' (nucleótido 34 a nucleótido 54 de pCA455 (SEQ ID NO. 2)) y
- 2)
- 5' CGT CGC CGT GTC GGT GCT TCT CG 3' (nucleótido 87 a nucleótido 109 de pCA455 (SEQ ID NO. 2)).
\vskip1.000000\baselineskip
En la segunda reacción, se amplifican las
regiones flanqueantes de la región de núcleo de CA455, desde el
nucleótido 54 al nucleótido 557 de la secuencia de cDNA
correspondiente (SEQ ID NO. 2), utilizando el par siguiente de 21 y
24 oligonucleótidos que tienen las secuencias respectivas
siguientes:
- 1)
- 5' GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3' (nucleótido 34 a nucleótido 54 de pCA455 (SEQ ID NO. 2)) y
- 2)
- 5' CCG TTG CGT TGC GTT GCG TAG ACG 3' (nucleótido 557 a nucleótido 580 de pCA455 (SEQ ID NO. 2)).
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo enfoque utiliza una genoteca genómica
de Zea mays lambda EMBL3 o EMBL4 que se escruta con la
secuencia de cDNA entera de pCA455 como sonda. Clones genómicos
correspondientes que se hibridan a pCA455 se secuencian (Maxam y
Gilbert, 1977), y su orientación se comprueba por análisis mediante
transferencia Northern con ribosondas de ambos sentidos. La
comparación de pCA455 con las secuencias de clon genómico conduce a
la identificación de las regiones homólogas. En el extremo 5' de la
región de cada uno de estos clones genómicos homólogos, se
determinan el codón ATG y la secuencia de consenso TATA. Que la
secuencia "TATA" forma parte del promotor se confirma por
extensión con iniciadores.
Utilizando este segundo enfoque, se escrutó una
genoteca genómica de Zea mays lambda EMBL4 existente con la
secuencia de cDNA entera de pCA455, como sonda. La genoteca se
obtuvo del Dr. H. Saedler del Instituto Max Planck en Colonia,
Alemania, con la designación "GH#1417". La genoteca comprendía
DNA genómico de Zea mays que estaba parcialmente digerido con
MboI y cuyos fragmentos de restricción resultantes se
clonaron entre los sitios BamHI de los vectores de
reemplazamiento EMBL4 del bacteriófago lambda (Frischauff et
al. (1983) J. Mol. Biol. 170, 827; Pouwels et al. (1988)
Cloning Vectors - A Laboratory Manual (actualización
suplementaria), Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Los
fragmentos de restricción de la genoteca pudieron escindirse de los
vectores como fragmentos EcoRI.
Se encontró que un fragmento EcoRI de
aproximadamente 6 kb de longitud de la genoteca se hibridaba con
pCA455 y se designó "VG55". Se encontró que VG55 contiene un
sitio BamHI exclusivo, y uno de los fragmentos
EcoRI-BamHI de VG55 se hibridaba todavía con pCA455,
mientras que el otro no lo hacía. El fragmento
EcoRI-BamHI que se hibridaba de modo cruzado con
pCA455 se clonó entre los sitios EcoRI y BamHI del
vector pGEM1 (Promega), produciendo un plásmido que se designó
"pVG55.3". Se secuenció pVG55.3 (Maxam y Gilbert, 1977), y se
comprobó su orientación por análisis mediante transferencia
Northern con ribosondas de ambos sentidos. La secuencia de pVG55.3,
aparte de algunos nucleótidos en su extremo 5' (que incluye su sitio
EcoRI), se muestra en SEQ ID NO. 3, apreciándose que tiene
un alto grado de homología con pCA455. El codón ATG de la secuencia
codificante supuesta de pVG55.3 está localizado en la posición 1180,
la secuencia codificante supuesta termina en la posición 1596, y la
secuencia "TATA" está localizada en la posición 1072. El hecho
de que la secuencia "TATA" forma parte del promotor se
confirma por extensión con iniciadores. El sitio singular
BamHI, arriba mencionado, está localizado en la posición
2770 en SEQ ID NO. 3.
La secuencia situada aguas arriba de la posición
1180 en SEQ ID NO. 3 puede utilizarse como región promotora para la
expresión específica de las anteras de una secuencia codificante de
interés. Esta secuencia es el promotor CA55 o PCA55.
Preferiblemente, se utiliza la secuencia completa desde la posición
1 a la posición 1179, pero parece ser que la región mínima que
puede servir como un promotor específico de anteras se extiende
aproximadamente 300 a 500 pb aguas arriba de la posición 1180 en SEQ
ID NO. 3. El uso de la secuencia conductora no traducida en la
región promotora PCA55, entre el sitio de iniciación de la
transcripción (que puede determinarse por medio de extensión con
iniciadores) y el comienzo de la traducción ATG, parece ser
preferido, pero no esencial para expresión específica de las
anteras de un gen estructural heterólogo bajo el control del
promotor PCA55, y la secuencia conductora puede reemplazarse
aparentemente por la secuencia conductora no traducida de otros
genes, tales como genes de plantas.
Las secuencias reguladoras 5', con inclusión del
promotor, de cada uno de los genes específicos de anteras de los
Ejemplos 2 y 3 se subclonan en el polienlazador de
pMa5-8 y pMc5-8 (documento EPA
87402348.4). Esto produce vectores que pueden utilizarse para
aislar DNA monocatenario para uso en mutagénesis orientada.
Utilizando mutagénesis orientada (EPA 87402348.4), se modifican
secuencias circundantes del codón de iniciación de la traducción
ATG de las secuencias reguladoras 5' de cada uno de los genes
específicos de las anteras para crear un sitio de reconocimiento
singular para una enzima de restricción para la cual existe un sitio
de reconocimiento correspondiente en el extremo 5' de cada uno de
los DNAs de esterilidad masculina y restablecedores de la
fertilidad masculina (que deben fusionarse a las secuencias
reguladoras 5' en el Ejemplo 5, más adelante). Los plásmidos
resultantes contienen cada uno el sitio de restricción de nueva
creación. La secuencia de nucleótidos precisa que abarca cada sitio
de restricción de nueva creación se determina a fin de confirmar
que la misma difiere únicamente de las secuencias reguladoras 5' del
gen correspondiente específico de anteras del maíz por la
sustitución, creando el nuevo sitio de restricción.
En la utilización de este procedimiento para
construcción de casetes promotoras, se introduce un sitio
NcoI en el codón de iniciación de la traducción ATG de
pVG55.3 del Ejemplo 3 como sigue. Un fragmento de 1800 pb
EcoRI-AvaI de pVG55.3 (el sitio AvaI está
localizado en la posición 1276 de SEQ ID NO. 3; el sitio
EcoRI se deriva de pGEM1 (Promega) y está localizado en el
extremo 5' de SEQ ID NO. 3 [no representado]) se clona entre los
sitios EcoRI y AvaI de los vectores
pMa5-8 y pMc5-8 (Stanssens et
al. (1989) MAR 17, 4441; EPA 87402348.4), produciendo
plásmidos designados "pHa5-VG55.3" y
"pMc5-VG55.3", respectivamente. Estos plásmidos
se utilizan para mutagénesis orientada por un método de DNA dúplex
con lagunas utilizando marcadores seleccionables alternativos como
ha sido descrito por Stanssens et al. (1989), supra.
El DNA dúplex con lagunas se construye a partir del
pMc5-VG55.3 monocatenario y el fragmento grande
EcoRI-AvaI de pMa5-VG55.3. Para la
mutagénesis, se hace uso del oligonucleótido que tiene la secuencia
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- CAG GAG CGA GCC ATG GCT GCA G.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta mutagénesis introduce en el sitio
NcoI en el codón ATG de la secuencia codificante de SEQ ID
NO. 3. La casete resultante comprende el promotor y la secuencia
conductora de SEQ ID NO. 3 en un fragmento EcoRI-NcoI
que debe fusionarse a las secuencias codificantes de los DNAs de
esterilidad masculina y restaurador de la fertilidad masculina como
se describe en el Ejemplo 5, más adelante. Alternativamente, se
introduce el sitio NcoI en el codón de iniciación de la
traducción ATG de pVG55.3 durante la amplificación por PCR de un
fragmento de DNA, que contiene la región promotora CA55, utilizando
los dos oligonucleótidos siguientes como iniciadores:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-GAT TCG AAT TCT GGT ATG CAT CAA TAG AGC CG-3'
- \quad
- 5'-CAG GAG CGA GCC ATG GCT GCA G-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de DNA amplificado se utiliza
directamente como casete promotora para la construcción de vectores
de transformación de plantas como se describe en el Ejemplo 5.
Utilizando los procedimientos descritos en EPA
89401194.9 y 90402281.1, se utilizan las casetes promotoras del
Ejemplo 4 para construir vectores de transformación de plantas que
comprenden secuencias de DNA extrañas quiméricas de esta invención,
cada una de las cuales contiene las secuencias reguladoras 5', con
inclusión del promotor específico de anteras, de uno de los genes
específicos de las anteras aislados en el Ejemplo 2 ó 3. Cada una
de estas secuencias reguladoras 5' se encuentra aguas arriba de,
está en la misma unidad de transcripción que, y controla o bien un
DNA de esterilidad masculina (de EPA 89401194.9) que codifica
barnasa de Bacillus amyloliquefaciens (Hartley y Rogerson
(1972) Preparative Biochemistry 2 (3), 243-250) o
un DNA restablecedor de la fertilidad masculina (de EPA 90402281.1)
que codifica barstar (Hartley y Rogerson (1972) supra;
Hartley y Sweaton (1973) J. Biol. Chem. 248 (16),
5624-5626). Aguas abajo de cada DNA de esterilidad
masculina o cada DNA restablecedor de la fertilidad masculina se
encuentra el extremo 3' del gen de la
nopalina-sintasa (An et al. (1985) EMBO J. 4
(2), 277). Cada secuencia de DNA quimérica comprende también el
promotor 35 S'3 (Hull y Howell (1987) Virology 86,
482-493) cohesionado en marco con el gen neo
que codifica resistencia a la kanamicina (EPA 84900782.8) y el
extremo 3' del gen de la octopina-sintasa (Dhaese
et al. (1983) EMBO J. 2, 419).
Alternativamente, se construyen los vectores de
transformación de plantas pVE149, pVE139 y pVE136, como sigue.
En un primer paso, el fragmento de DNA
EcoRI-HindIII de 1083 pb de pMT416, que contiene las
secuencias codificantes de barnasa y barstar (Hartley (1988) J. Mol.
Biol. 202, 913) se liga al fragmento grande
EcoRI-HindIII del plásmido pMa5-8,
produciendo el plásmido pMa5tpbs1. Por medio de mutagénesis
orientada (publicación PCT WO 89/03887), se introduce luego un
sitio NcoI en el codón de iniciación de la traducción ATG de la
secuencia codificante de barnasa. Para este propósito, se construye
un DNA dúplex con lagunas a partir del pMa5tpbs1 monocatenario, el
fragmento grande EcoRI-HindIII de
pMc5-8, y el oligonucleótido siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-GAT AAC CGG TAC CAT GGT TGT CAC AGG GG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante se designa como
"pVE145A".
En una tanda de mutagénesis subsiguiente, se
introduce un sitio MsiI 14 pb aguas abajo del codón de iniciación
de la traducción ATG de la secuencia codificante de barnasa
utilizando un DNA dúplex con lagunas constituido por DNA
monocatenario de pVE145A, el fragmento grande
EcoRI-HindIII de pMa5-8, y el
oligonucleótido siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-CCC CGT CAA ATG CAT TGA TAA CCG G-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante se designa como
"pVE145".
Los plásmidos pMa5-8 y
pMc5-8 han sido depositados en fecha 3 de mayo de
1988 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSM), Mascherodberweg 1B, D-330 Braunschweig,
Alemania bajo los números de acceso DSM 4567 y DSM 4566,
respectivamente.
Se corta pVE145 con NsiI, se rellena con Klenow,
y se liga al fragmento de DNA de 111 pb representado en SEQ ID NO.
4 que contiene el Intrón TA36 y que ha sido escindido con KpnI y se
ha hecho romo en los extremos con Klenow, obteniéndose el plásmido
pVE146. El fragmento de SEQ ID NO. 4 se obtiene por amplificación, a
partir de DNA genómico de Nicotiana tabacum cv. Samsun, por
medio de PCR utilizando como iniciadores los dos oligonucleótidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-CGA CGG TAC CAC GTA ATT AG-3'
- \quad
- 5'-CAT AGG GTA CCT GTA TGT AAT AAA AAC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pVE147 se construye por ligación del
fragmento EcoRI-HindIII de 2820 pb de pGEM1
(Promega), el fragmento HindIII-NcoI de 979 pb de
pVE146 (que lleva el gen barnasa con Intrón), y el fragmento PCR de
1184 pb del Ejemplo 4 que lleva el promotor específico de anteras
CA55 del maíz.
Finalmente, se obtiene pVE149 por ligación de
los cuatro fragmentos de DNA siguientes:
- -
- el fragmento de 1715 pb EcoRI (rellenado con Klenow)-XbaI de pVE147, que lleva el gen de barnasa bajo control del promotor CA55,
- -
- un fragmento de 296 pb EcoRI-XbaI de pTTM6 (depositado en fecha 7 de marzo de 1988 en la DSM bajo el número de acceso DSM 4468), que lleva el extremo 3' no traducido del gen de la nopalina-sintasa de T-DNA de Agrobacterium,
- -
- un fragmento de 1728 pb BglII (rellenado con Klenow)-HindIII, que lleva el gen bar (EP 0.242.236) bajo el control del promotor 35S3 (EP 0.359.617) y con un extremo 3' no traducido del gen de la nopalina-sintasa de T-DNA de Agrobacterium (este fragmento corresponde a la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5 entre las posiciones 2409 y 4137), y
- -
- el fragmento grande EcoRI-HindIII de pUC19 (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, EE.UU.).
La secuencia completa de pVE149 se muestra en
SEQ ID NO. 5.
El plásmido pVE136 es idéntico a pVE149 excepto
que carece del Intrón TA36 en el gen de barnasa. pVE136 se
construye reemplazando, en pVE149, el fragmento de 534 pb
NcoI-BamHI, que lleva el gen de barnasa, con el
fragmento de 449 pb NcoI-BamHI de pVE145A.
Se construye pVE136 y se mantiene en E.
coli WK6 que contiene el plásmido pMc5-BS.
pMc5-BS contiene el gen barstar bajo el control del
promotor tak (De Boer et al. (1983) PNAS 80, 21) y se
construye por clonación del fragmento EcoRI-HindIII
de pMT416 (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202, 913) en
pMc5-8. A continuación, la secuencia, que comienza
con la secuencia señal PhoA y que termina con el último nucleótido
antes del codón de iniciación de la traducción de la región
codificante de barstar, se deleciona por mutagénesis de salto
("looping-out") de acuerdo con los
procedimientos generales descritos por Sollazi et al. (1985)
Gene 37, 199. La disponibilidad de un gen de resistencia a la
ampicilina en los plásmidos derivados de pUC18 que llevan el gen
quimérico barnasa y el gen de resistencia a cloranfenicol en
pMc5-BS hace posible que la cepa se mantenga estable
en placas provistas de dos antibióticos o con objeto de seleccionar
un plásmido cualquiera. Si bien está reprimida normalmente, la
expresión de genes por este promotor puede inducirse por adición de
un inductor del operón lac utilizado comúnmente, IPTG
(isopropil-\beta-d-tiogalactopiranosido).
El fragmento de 5843 pb
NcoI-BamHI de pVE149 parcialmente digerido, que
lleva la totalidad del plásmido excepto la secuencia codificante de
barnasa, se rellena con Klenow y se liga a un fragmento
DraI-HindIII (rellenado con Klenow) de pVE151, que
lleva la secuencia codificante de barstar. El plásmido resultante
se designa como "pVE139". pVE151 se obtiene por medio de
mutagénesis orientada de pMc5-BS, de tal manera que
se introduce un sitio DraI en el codón de iniciación de la
traducción ATG de la secuencia codificante de barstar. Para este
propósito, se construye un DNA dúplex con lagunas a partir del
PMc5-BS monocatenario, el fragmento grande
EcoRI-HindIII de pMa5-8, y el
oligonucleótido siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 5'-GCT TTT TTA AAT TTA TTT TCT CC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Vectores de T-DNA para
transformaciones de plantas mediadas por Agrobacterium se
preparan por clonación de los fragmentos EcoRI (rellenado con
Klenow)-HindIII apropiados de pVE149 o PVE136 (que
contienen el gen 35S3-bar y el gen del promotor barstar del
promotor específico de anteras) o PVE139 (que contiene los genes
quiméricos 35S3-bar y el promotor barstar específico de
anteras) entre los sitios HindIII y XbaI (rellenado con Klenow) de
los vectores T-DNA conocidos pGSC1700 o pGSC1701A.
pGSC1700 ha sido depositado en fecha 21 de marzo de 1988 en el DSM
bajo el número de acceso DSM 4469, y pGSC1701A ha sido depositado en
fecha 22 de octubre de 1987 en el DSM bajo el número de acceso DSM
4286. Los vectores T-DNA que contienen pVE149,
pVE139 y pVE136 se utilizan para transformación de tabaco como se
describe en el Ejemplo 7.
Utilizando los procedimientos descritos por
Fromm et al. (1990), supra, se transforman cultivos de
suspensión embriogénicos de una línea de maíz B73 X
A188 con los vectores de transformación de plantas descritos
en el Ejemplo 5, que incluyen pVE149, pVE136 y pVE139 - sea
directamente o después de linealización adecuada (v.g., después de
digestión con EcoRI y/o HindIII). Las plantas transformadas
regeneradas a partir de los cultivos de suspensión embriogénicos,
cada una de las cuales contiene un promotor específico de anteras
del Ejemplo 2 ó 3 que controla un DNA de esterilidad masculina o un
DNA restablecedor de la fertilidad masculina, son normales excepto
por lo que respecta a sus flores. A este respecto, cada planta que
contiene un DNA de esterilidad masculina bajo el control de uno de
los promotores específicos de las anteras expresa dicho DNA al
menos predominantemente en sus anteras y no produce polen normal
alguno, cada planta que contiene un DNA restablecedor de la
fertilidad masculina bajo el control de uno de los promotores
específicos de las anteras, expresa dicho DNA al menos
predominantemente en sus anteras, pero produce polen normal.
Utilizando los procedimientos descritos en EPA
89401194.9 y 90402281.1, se transforman plantas de tabaco por
transferencia mediada por Agrobacterium con los vectores de
transformación de plantas que contienen las secuencias de DNA
quiméricas extrañas del Ejemplo 5. Las plantas de tabaco
transformadas, cada una de las cuales contiene un promotor
específico de anteras del Ejemplo 2 ó 3 que controla o bien un DNA
de esterilidad masculina o un DNA restablecedor de la fertilidad
masculina, son normales excepto en lo que respecta a sus flores. A
este respecto, cada planta que contiene un DNA de esterilidad
masculina bajo el control de uno de los promotores específicos de
las anteras expresa dicho DNA al menos predominantemente en sus
anteras y no produce polen normal alguno, y cada planta que
contiene un DNA restablecedor de la fertilidad masculina bajo el
control de uno de los promotores específicos de las anteras expresa
dicho DNA al menos predominantemente en sus anteras, pero produce
polen normal.
Utilizando los procedimientos descritos por
Datta et al. (1990) supra, se transforman protoplastos
de la línea de arroz Oryza sativa, variedad Chinsurah Boro
II, con los vectores de transformación de plantas descritos en el
Ejemplo 5, incluyendo pVE149, pVE136 y pVE139 - sea directamente o
después de linealización adecuada (v.g. después de digestión con
EcoRI y/o HindIII). Las plantas transformadas regeneradas a partir
de los protoplastos, cada una de las cuales contiene un promotor
específico de anteras del Ejemplo 2 ó 3 que controla o bien un DNA
de esterilidad masculina o un DNA restablecedor de la fertilidad
masculina, son normales excepto en lo que respecta a sus flores. A
este respecto, cada planta que contiene un DNA de esterilidad
masculina bajo el control de los promotores específicos de las
anteras expresa dicho DNA al menos predominantemente en sus anteras
y no produce polen normal alguno, y cada planta que contiene un DNA
restablecedor de la fertilidad masculina bajo el control del
promotor específico de anteras expresa dicho DNA al menos
predominantemente en sus anteras pero produce polen normal.
Alternativamente, embriones inmaduros de variedades de arroz
Gulfmont, Lemont, IR26, IR36, IR54 o IR72 se bombardean con
partículas de oro, que llevan DNA de plásmido apropiado del Ejemplo
5, y se regeneran plantas de acuerdo con los procedimientos
descritos por Christou et al. (1991) Bio/Technology
9, 957.
Es innecesario decir que el uso de los
promotores de maíz específicos de las anteras de esta invención no
está limitado a la transformación de cualquier planta específica.
Dichos promotores de maíz pueden ser útiles en cualquier cosecha en
la que los mismos sean capaces de controlar la expresión génica, y
preferiblemente donde dicha expresión ocurre al menos
predominantemente, de manera preferible específicamente, en las
células estaminales de la cosecha. Asimismo, el uso de tales
promotores no se limita al control de los DNAs de esterilidad
masculina o DNAs restablecedores de la fertilidad masculina, sino
que puede utilizarse para controlar la expresión de cualquier gen
selectivamente en las células estaminales.
Adicionalmente, esta invención no está limitada
a los promotores específicos de los estambres, preferiblemente
específicos de las anteras, y en particular específicos del tapete,
descritos en los ejemplos anteriores. De hecho, se cree que las
secuencias de DNA de los promotores de los Ejemplos 2 y 3 pueden
modificarse por reemplazamiento de algunos de sus nucleótidos con
otros nucleótidos, con tal que dichas modificaciones no alteren
sustancialmente la aptitud de los complejos de polimerasa, con
inclusión de activadores de la transcripción, de las células
estaminales, particularmente células de las anteras, para reconocer
los promotores, tal como están modificados.
1. Información General
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- SOLICITANTE: PLANT GENETIC SYSTEMS N.V.
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Promotores específicos de los estambres del maíz
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- SEQ. ID. NO: 1: cDNA CA444
\vskip0.800000\baselineskip
- SEQ. ID. NO: 2: cDNA CA455
\vskip0.800000\baselineskip
- SEQ. ID. NO: 3: secuencia genómica de maíz que comprende el promotor CA55
\vskip0.800000\baselineskip
- SEQ. ID. NO: 4: Intrón TA36
\vskip0.800000\baselineskip
- SEQ. ID. NO: 5: plásmido pVE149
\vskip0.800000\baselineskip
- iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- DESTINATARIO: Plant Genetic Systems N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CALLE: Plateaustraat 22,
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CÓDIGO POSTAL Y CIUDAD: 9000 Gante,
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.800000\baselineskip
- v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- TIPO DE MEDIO: disquete flexible 5,25 pulg., de 2 caras y alta densidad, 1,2 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- ORDENADOR: IBM PC/AT
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- SISTEMA OPERATIVO: DOS versión 3.3
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- SOPORTE LÓGICO: WordPerfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: No disponibles
\vskip0.800000\baselineskip
- vii)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.800000\baselineskip
- EPA 91400300.9, presentada el 7 de febrero de 1991
\vskip0.800000\baselineskip
- EPA 91401787.6, presentada el 28 de junio de 1991
\vskip1.000000\baselineskip
2. Descripción de la Secuencia: SEQ. ID. NO:
1
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE SECUENCIA: nucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD DE LA SECUENCIA: 533
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASE DE CADENA: bicatenario
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- ORGANISMO: maíz
\vskip0.500000\baselineskip
- ÓRGANO: antera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS: desde el nucleótido 2 al nucleótido 376: Marco de Lectura Abierto 1
\hskip4,85cm desde el nucleótido 3 al
nucleótido 326: Marco de Lectura Abierto 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- PROPIEDADES: cDNA específico de anteras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- DIVERSOS: cDNA designado como CA444
\vskip1.000000\baselineskip
3. Descripción de la Secuencia: SEQ. ID. NO:
2
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE SECUENCIA: nucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD DE LA SECUENCIA: 796
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASE DE CADENA: bicatenario
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: maíz
\vskip0.800000\baselineskip
- ÓRGANO: antera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS: desde el nucleótido 2 al nucleótido 388: Marco de Lectura Abierto 1
\hskip4,85cm desde el nucleótido 70 al
nucleótido 369: Marco de Lectura Abierto 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- PROPIEDADES: cDNA específico de anteras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- DIVERSOS: cDNA designado como CA455
\vskip1.000000\baselineskip
4. Descripción de la Secuencia: SEQ. ID. NO:
3
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2784 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASE DE CADENA: bicatenario
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE ORIGINAL: maíz
\vskip0.800000\baselineskip
- ÓRGANO: antera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- - nucleótido 1 a nucleótido 1179: región que comprende el promotor y la secuencia conductora
\vskip0.800000\baselineskip
- - nucleótido 1072: secuencia TATA
\vskip0.800000\baselineskip
- - nucleótido 1180 a nucleótido 1596: secuencia codificante supuesta
\vskip0.800000\baselineskip
- - nucleótido 1120 a nucleótido 1839: región correspondiente a cDNA de SEQ. ID. NO. 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- PROPIEDADES: DNA genómico obtenido por sonda de una genoteca genómica de Zea mays utilizando el{}\hskip2,45cm cDNA se SEQ. ID. NO. 2 como sonda. El DNA genómico se designa como pVG 55.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
5. Descripción de la Secuencia: SEQ. ID. NO:
4
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE SECUENCIA: nucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD DE LA SECUENCIA: 111 pb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASE DE CADENA: bicatenario
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico amplificado por medio de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Nicotiana tabacum cv. Samsun
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS: desde nt 1 a nt 7: secuencia espaciadora
\hskip4,85cm desde nt 8 a nt 13: sitio
KpnI
\hskip4,85cm desde nt 16 a nt 100: secuencia
de Intrón
\hskip4,85cm desde nt 101 a nt 106: sitio
KpnI
\hskip4,85cm desde nt 107 a nt 111: secuencia
espaciadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- PROPIEDADES: Intrón del gen TA36 con enlazadores KpnI en los extremos 5' y 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6. Descripción de la Secuencia: SEQ. ID. NO:
5
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE SECUENCIA: nucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD DE LA SECUENCIA: 6376 pb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASE DE CADENA: bicatenario
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA plasmídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 1 a nt 396: DNA derivado de pUC18
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 397 a nt 802: extremo 3' no traducido derivado del gen de nopalina-sintasa de T-DNA de Agrobacte-{}\hskip0,3cmrium
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 803 a nt 1223: secuencia codificante de barnasa con el Intrón TA36
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 119 a nt 1203: Intrón TA36
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 1224 a nt 2408: región promotora CA55 de maíz
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 2409 a nt 3272: promotor 35S3
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 3273 a nt 3824: secuencia codificante del gen bar
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 3825 a nt 4137: extremo 3' no traducido derivado del gen de nopalina-sintasa de T-DNA de Agrobac-{}\hskip0,3cmterium
\vskip0.800000\baselineskip
- - nt 4138 a nt 6376: DNA derivado de pUC18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- PROPIEDADES: DNA plasmídico replicable en E. coli designado como pVE14
Claims (20)
1. Un promotor específico de anteras que
comprende una secuencia correspondiente a 300 pb aguas arriba de la
posición 1180 en SEQ ID NO. 3.
2. Un promotor específico de anteras que se
caracteriza porque su secuencia de nucleótidos está contenida
en la secuencia de nucleótidos 1 a 1179 de SEQ No. 3.
3. Una región promotora que se
caracteriza por tener la secuencia que comienza entre
aproximadamente los nucleótidos 680 y 880 y termina en el
nucleótido 1179 de SEQ ID NO. 3.
4. La región promotora de la reivindicación 3,
que se caracteriza por tener la secuencia de nucleótidos
entre el nucleótido 1224 y el nucleótido 2408 de SEQ ID NO. 5.
5. La región promotora de la reivindicación 3 ó
4 en la cual la secuencia conductora no traducida está reemplazada
por la secuencia conductora no traducida de otro gen,
preferiblemente un gen vegetal.
6. Un DNA adecuado para transformación de una
planta en donde dicho DNA comprende un gen estructural heterólogo,
bajo el control del promotor de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, o la región promotora de la reivindicación
3 a 5.
7. El DNA de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual dicho gen estructural es un DNA de esterilidad masculina,
que codifica preferiblemente una ribonucleasa.
8. El DNA de acuerdo con la reivindicación 7, en
el cual dicho gen estructural codifica barnasa.
9. El DNA de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual dicho gen estructural es un DNA restablecedor de la
fertilidad masculina.
10. El DNA de acuerdo con la reivindicación 9,
en el cual dicho gen estructural codifica barstar.
11. El DNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, que es un plásmido.
12. El DNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, que es DNA nuclear de una célula
vegetal.
13. Una célula vegetal que comprende el DNA de
una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
14. Un cultivo de células vegetales que está
constituido esencialmente por las células vegetales de la
reivindicación 13.
15. Una planta o una semilla de una planta
constituida esencialmente por las células vegetales de la
reivindicación 13.
16. Una planta, o la semilla o progenie de la
misma, regenerada a partir de la célula vegetal de la reivindicación
13, que comprende en el DNA nuclear de sus células, el DNA de una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
17. La planta de acuerdo con la reivindicación
15 ó 16, caracterizada porque es una monocotiledónea,
preferiblemente un cereal.
18. La planta de acuerdo con la reivindicación
17, que es una planta de maíz.
19. Un método para aislar un promotor específico
de estambres del maíz que comprende realizar una PCR inversa sobre
DNA genómico de maíz utilizando un par de oligonucleótidos
constituidos por un primer oligonucleótido complementario a una
secuencia de 21 a 24 nucleótidos del DNA de SEQ ID NO. 2 o el DNA de
SEQ ID NO. 3 entre las posiciones de los nucleótidos 1120 y 1839, y
un segundo oligonucleótido correspondiente a una secuencia de 21 a
24 nucleótidos del DNA de SEQ ID NO. 2 o el DNA de SEQ ID NO. 3
entre las posiciones de los nucleótidos 1120 y 1839.
20. El método de la reivindicación 19, en el
cual dicho primer oligonucleótido tiene la secuencia siguiente:
- \quad
- 5'GCT CGA TGT ATG CAG TGC AGC 3'
y en donde dicho segundo oligonucleótido tiene
una secuencia seleccionada del grupo constituido por:
- \quad
- 5'CGT CGC CGT GTC GGT GCT TCT CG 3', y
- \quad
- 5'CCG TTG CGT TGC GTT GCG TAG ACG 3'.
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