CN102388143A

CN102388143A - AXMI-150 δ-内毒素基因及其使用方法

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Publication number: CN102388143A
Application number: CN2009801510795A
Authority: CN
Inventors: K·S·桑普森; D·J·汤姆索; V·海因里希斯
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: Athenix Corp
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-03-21
Also published as: WO2010075498A2; EA019574B1; US20120073016A1; EP2379724A2; AR075114A1; US8791326B2; WO2010075498A3; US20100160231A1; BRPI0923159A2; EA201170717A1; CO6400155A2; CA2747826A1; ZA201104532B; EP2379724B1; UY38535A; UY32361A; ES2534581T3; MX2011006694A; US8084416B2

Abstract

提供了用于向细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀虫活性的组合物和方法。提供了包括一个针对杀虫多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在DNA构建体或表达盒中用于在植物和细菌中进行转化和表达。组合物还包括经转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地，提供了分离的杀虫的核酸分子。此外，包括了与这些多核苷酸相对应的氨基酸序列。具体地，本发明提供了分离的核酸分子，这些核酸分子具有对SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，在SEQID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中列出的核苷酸序列，连同它们的变体以及片段。

Description

AXMI-150 δ-内毒素基因及其使用方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新颖的基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列在制备杀虫的配制品中并且在生产转基因的抗害虫植物中是有用的。

发明背景

苏芸金芽胞杆菌是一种形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，其特征在于它具有产生结晶内含物的能力，这些结晶的内含物对某些目和种的昆虫是具有特异毒性的，但是对植物以及其他非靶向的生物是无害的。由于这种原因，包括苏芸金芽胞杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物能够用作环境可接受的杀虫剂来控制农业的虫害或对于多种的人或动物疾病的媒虫。

来自苏芸金芽胞杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要对抗鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白还已经显示对抗膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及螨害虫目、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门(Sarcomastigorphora))的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白主要基于它们的杀昆虫活性最初被分类为CryI至CryV。这些主要的类别是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)与(VI)。这些蛋白被进一步区分成几个亚家族；在每个家族之内更为高度相关的蛋白被分配了区分的字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C、等等。在每个区分之内甚至更为接近地相关的蛋白被命名为，如Cry1C1、Cry1C2、等等。

最近说明了一种新式命名法，这种命名法是针对这些基于氨基酸序列同源性的Cry基因的，而不是靶向昆虫的特异性(Crickmore et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在这种新式分类中，每种毒素被分配了一个独特的名称，该名称结合了一个第一列(一个***数字)，一个第二列(一个大写体字母)、一个第三列(一个小写字母)、以及一个第四列(另一个***数字)。在这种新式分类中，在该第一列中罗马数字已经换成了***数字。带有小于45％的序列一致性的蛋白具有不同的第一列，并且对于第二和第三列的指标对应地是78％和95％。

该晶体蛋白直到它已经被昆虫摄取并且在昆虫中肠中溶解时才显示出杀昆虫活性。这种摄取的原毒素在该昆虫的消化道中被蛋白酶水解为一个活性的毒性分子(

and Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。这种毒素在该目标幼虫的中肠中与顶端的刷状缘受体相结合，并且插到该顶膜中产生了离子通道或孔，导致幼虫的死亡。

δ-内毒素大体上具有5个保守的序列结构域、以及3个保守的结构域(见，例如，de Maagd et al.(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一保守结构域由7个α螺旋组成，并且参与了膜***和孔形成。结构域II由排列成Greek key构型的三个β片层组成，而结构域III由处于“果冻卷饼”样式的两个反向平行β片层组成(de Maagd等人，2001，同上)。结构域II和III参与了受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

由于昆虫可以带来的灾害，以及通过控制虫害在产量方面的改进，存在着一种发现新形式的杀虫毒素的不断需求。

发明概述

提供了用于向细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀虫活性的组合物和方法。组合物包括针对杀虫的和杀昆虫(insectidal)多肽的核酸分子编码序列、包括那些核酸分子的载体、以及包括这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀虫多肽序列以及针对那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用在DNA构建体或表达盒中用于在生物(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计为用于在一种生物中表达，该生物体包括但不局限于：一种微生物或一种植物。组合物还包括经转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。

具体地，提供了分离的核酸分子，这些核酸分子编码了一种杀虫蛋白。此外，涵盖了与这些杀虫蛋白相对应的氨基酸序列。具体地，本发明提供了一种分离的核酸分子，该核酸分子包括对SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，或在SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中列出的核苷酸序列，连同它们的变体以及片段。还涵盖了与本发明的一个核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本发明的一个序列进行杂交的核苷酸序列。

提供了用于产生本发明的多肽的方法，以及用于使用这些多肽来控制或杀死一种鳞翅目的、鞘翅目的、线虫目的、或双翅目的害虫的方法。还包括了用于在一个样品中检测本发明的这些核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的这些组合物和方法对于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物是有用的。这些生物体以及包括这些生物体的组合物对于农业目的是所希望的。本发明的这些组合物有用于产生改变的或增强的具有杀虫活性的蛋白、或有用于在产物或生物中检测杀虫蛋白或核酸的存在。

详细说明

本发明描绘了用于调节生物(特别是植物或植物细胞)中的害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”一词是指该害虫(例如，昆虫)一旦摄取或以其他方式接触本发明的多肽类时就被杀死。“耐受性”一词是指该害虫的运动、摄食、繁殖、或其他功能的损害或降低。这些方法涉及用编码了本发明的一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列来转化生物。具体地，本发明的核苷酸序列有用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是芽胞杆菌属或其他物种的杀虫的核酸以及蛋白。发现这些序列在用于随后转化入感兴趣的生物体中的表达载体的构建方面用作探针用于其他同源(或部分同源的)基因的分离，以及用于通过本领域中已知的方法(如，结构域交换或DNA改组)来产生改变的杀虫蛋白。发现这些蛋白用于控制或杀死鳞翅目的、鞘翅目的、双翅目的、以及线虫目的害虫种群，以及用于生产具有杀虫活性的组合物。

“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”是指一种毒素，该毒素具有对抗一种或多种害虫的毒性，包括但不局限于：鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的、或线虫门的成员、或具有与这种蛋白的同源性的一种蛋白。已经从生物中分离出杀虫蛋白，这些生物包括例如，芽孢杆菌、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、以及日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括从在本文中所披露的全长核苷酸序列中推导出的氨基酸序列，以及比这些全长序列更短的氨基酸序列(或者由于使用了一个可替代的下游起始位点，或者由于产生一个较短的具有杀虫活性的蛋白的加工过程)。加工可以在表达该蛋白的生物内发生，或在该害虫摄取该蛋白之后发生。

杀虫蛋白类涵盖了δ-内毒素。δ-内毒素包括被鉴定为cry1至cry43、cyt1和cyt2、以及Cyt-样毒素的蛋白。目前存在着超过250种已知的δ-内毒素物种，它们具有宽范围的特异性和毒性。对于庞大的列表，见Crickmore et al.(1998)，Microbiol.MoI. Biol.Rev.62：807-813，而对于定期的更新，见位于 www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index处的Crickmore et al.(2003)″Bacillus thuringiensis toxin nomenclature″。

因此，在本文中提供了新颖的分离的核苷酸序列，这些序列赋予了杀虫活性。这些分离的核苷酸序列编码了具有与已知的δ-内毒素或二元的毒素同源性的多肽。还提供了这些杀虫蛋白的氨基酸序列。由这种基因的翻译而产生的蛋白允许细胞控制或杀死摄取了该蛋白的害虫。

分离的核酸分子、以及它们的变体和片段

本发明的一个方面涉及了分离的或重组的核酸分子，这些核酸分子包含编码了杀虫蛋白和多肽或它们的生物学活性部分的核苷酸序列；连同足以用作杂交探针的核酸分子用于鉴定编码了具有序列同源性的区域的蛋白的核酸分子。如本文所使用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。这种核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

“分离的”核酸序列(或DNA)被用在此处是指一种核酸序列(或DNA)，该核酸序列(或DNA)不再存在于它的自然环境中(例如，在体外或在重组体细菌或植物宿主细胞中)。在一些实施方案中，一种“分离的”核酸是不含有在衍生出该核酸的生物的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′和3′末端的序列)(优选编码蛋白的序列)。出于本发明的目的，“分离的”当用于指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在不同的实施方案中，编码了δ-内毒素的分离的核酸分子可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列天然地位于衍生出该核酸的细胞的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。在不同的实施方案中，基本上不含有细胞物质的δ-内毒素蛋白包括具有少于约30％、20％、10％、或5％(以干重计)的非δ-内毒素蛋白(在此也称为“污染蛋白”)的蛋白制品。

编码了本发明的这些蛋白的核苷酸序列包括在SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12中列出的序列，和它们的变体、片段、以及补体。“补体”一词是指一个核苷酸序列，该核苷酸序列与一种给定的核苷酸序列足够地互补，这样使得它可以与该给定的核苷酸序列杂交以便由此形成一个稳定的双链体。由这种核苷酸序列编码的杀虫蛋白相应的氨基酸序列在SEQ ID NO：2、或AXMI-004氨基酸序列中被列出，该AXMI-004氨基酸序列被描述于美国专利号7,355,089以及于2008年9月12日提交的名称为“Synthetic AXMI-004 Delta-endotoxin Genes and Methods for Their Use.”的美国专利申请号12/209,354中，这两个文件通过引用以其全部内容结合在此。

本发明还涵盖了以下核酸分子，这些核酸分子是这些编码了杀虫蛋白的核苷酸序列的片段。“片段”一词是指编码了一种杀虫蛋白的核苷酸序列的一个部分。一个核苷酸序列的一个片段可以编码一种杀虫蛋白的一个生物学活性部分，或它可以是使用以下披露的方法而可以用作一种杂交探针或PCR引物的一个片段。作为编码了一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个相邻的核苷酸，或达到一种全长的编码本文中所披露的杀虫蛋白的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目，这取决于所预期的用途。“相邻”核苷酸一词旨在指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留该杀虫蛋白的生物学活性、并且因此保留杀虫活性的蛋白片段。“保留活性“一词旨在指该片段将具有至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀虫蛋白的杀虫活性。在一个实施方案中，该杀虫活性是杀鞘翅目的活性。在另一个实施方案中，该杀虫活性是杀鳞翅目的活性。在另一个实施方案中，该杀虫活性是杀线虫的活性。在另一个实施方案中，该杀虫活性是杀双翅目的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews et al.(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用将其全文结合在此。

编码一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列的一个片段(即编码本发明的一种蛋白的一个生物学活性部分)将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个相邻的氨基酸，或达到在本发明的全长杀虫蛋白中存在的氨基酸的总数目。

优选的本发明的杀虫蛋白是由一个核苷酸序列编码的，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12的核苷酸序列足够地一致的。“足够地一致”一词是指一种氨基酸或核苷酸序列，使用标准参数使用在此所描述的比对程序之一与参照序列相比较该序列具有至少约60％或65％序列一致性、约70％或75％序列一致性、约80％或85％序列一致性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。本领域的普通技术人员将会认识到，可以对这些数值进行适当地调整以便通过考虑密码子简并、氨基酸相似性、阅读框定位、等等来确定由两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应一致性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的一致性百分比，针对最佳比较目的而比对了这些序列。这两个序列之间的一致性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，一致性百分比＝相同位置的数目/位置(例如，重叠位置)的总数目x 100)。在一个实施方案中，这两个序列是相同长度的。在另一个实施方案中，该一致性百分比是贯穿该参比序列的整体来计算的(即，在本文中所披露的如SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12中任一项的序列)。在两个序列之间的一致性百分比可以使用与以下说明的那些相类似的技术来进行确定，其中允许或不允许缺口。在计算一致性百分比中，对典型地准确的匹配进行计数。

在两个序列之间的一致性百分比的确定可以使用一种数学算法来完成。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：2264的算法，它在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：5873-5877中进行了修改。这样一种算法合并到Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分＝100、字长＝12)来进行，以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用BLASTX程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的杀虫样蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所说明的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。可替代地，PSI-Blast可以用于进行一种迭代搜索，该搜索检测了分子间的远离关系。见Altschul等人(1997)(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用对应的程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可通过目测检查而手工地进行比对。

用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins et al.(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较了序列并且比对了该氨基酸或DNA序列的整体，并且因此可以提供有关该整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于几个可商购的DNA/氨基酸分析软件包，如Vector NTI Program Suite的ALIGNX模块(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。在用ClustalW对多个氨基酸序列进行比对之后，可以评估氨基酸一致性百分比。有用于ClustalW比对分析的软件程序的另一个非限制性实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许在多个蛋白之间评估氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers and Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法。将这种算法结合到ALIGN程序(版本2.0)中，ALIGN程序是GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10(可以从Accelrys，Inc.，9685 Scranton Rd.，San Diego，CA，USA获得)的一部分。当利用ALIGN程序来比较多个氨基酸序列时，可以使用一个PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、以及缺口罚分4。

除非另有说明，GAP版本10(它采用了Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453的算法)将使用以下参数用于测定序列一致性或相似性：对于一个核苷酸序列的一致性百分比以及相似性百分比，使用GAP权重50和长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于一个氨基酸序列的一致性百分比或相似性百分比，使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分程序。还可以使用等效的程序。“等效的程序”一词是指以下任何序列比较程序，该程序针对所研究的任何两个序列，当与由GAP版本10所产生的相应的比对相比时产生了一个比对，该比对具有相同的核苷酸残基匹配以及一个相同的序列一致性百分比。本发明还涵盖了变体核酸分子。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码了在本文中所披露的杀虫蛋白、但由于遗传密码的简并而保守性地不同的那些序列，连同如以上所讨论的足够一致的那些序列。自然发生的等位基因变体可以使用所熟知的分子生物学技术来鉴定，例如像以下所概括的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，这些核苷酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生但它们仍编码了在本发明中所披露的杀虫蛋白，如以下所讨论。本发明所涵盖的变体蛋白是有生物学活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白的生物学活性，即杀虫活性。“保留活性”一词旨在指该变体将具有至少约30％、至少约50％、至少约70％、或至少约80％的天然蛋白的杀虫活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews et al.(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用将其全文结合在此。

有经验的行家将会进一步意识到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入变化，由此导致在这些经编码的杀虫蛋白的氨基酸序列中的变化，而不改变这些蛋白的生物活性。因此，分离的核酸分子变体可以通过以下方式来创造：将一个或多个核苷酸置换、添加、或缺失引入到在本文中所披露的相应的核苷酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸置换、添加、或缺失引入到所编码的蛋白中。可以通过标准的技术(如定点诱变和PCR-介导的诱变)来引入突变。此类变体核苷酸序列也由本发明所涵盖。

例如，保守的氨基酸置换可以在一个或多个、预测的、非必需氨基酸残基上进行。一个“非必需”氨基酸残基是以下残基，该残基可以从一种杀虫蛋白的野生型序列中进行改变而不改变生物活性，而一个“必需”氨基酸残基是生物活性所要求的。一个“保守的氨基酸置换”是其中该氨基酸残基被一个具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域内已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

δ-内毒素大体上具有5个保守的序列结构域、以及3个保守的结构域(见，例如，de Maagd et al.(2001) Trends Genetics 17：193-199)。第一保守结构域由7个α螺旋组成，并且参与了膜***和孔形成。结构域I I由排列成Greek key构型的三个β片层组成，而结构域III由处于“果冻卷饼”样式的两个反向平行β片层组成(de Maagd等人，2001，同上)。结构域II和III参与了受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

氨基酸置换可以在保留功能的非保守性区域中进行。总体上，此类置换并非针对保守的氨基酸残基、或针对在一个保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白活性所必要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如以下残基，这些残基在一个与本发明的序列相类似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白之间是相同(例如，在同源蛋白的比对中相同的残基)。保守的但可能允许保守的氨基酸置换、并且仍保留活性的残基的实例包括例如以下残基，这些残基在一个与本发明的序列相类似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白之间仅具有保守性置换(例如，在比对同源蛋白中所包含的全部蛋白之间仅具有保守性置换的残基)。然而，本领域的普通技术人员应当理解，功能性变体在保守残基中可以具有少量的保守性或非保守性改变。

可替代地，可以通过沿着该编码序列的全部或部分随机地引入突变(如通过饱和诱变)来制备变体核苷酸序列，并且可以针对赋予杀虫活性的能力来筛选得到的突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，这种经编码的蛋白可以进行重组地表达，并且这种蛋白的活性可以使用标准的测定技术来测定。

使用诸如PCR、杂交、以及类似的方法可以鉴定出相应的杀虫序列，此类序列具有与本发明的序列实质的一致性。见，例如，Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)以及Innis，et al.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。

在一种杂交方法中，该杀虫核苷酸序列的全部或部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法在本领域内是总体上已知的，并且披露于Sambrook和Russell，2001，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如³²P、或任何其他可检测的标记物，如其他放射性同位素、一种荧光化合物、一种酶、或一种酶辅因子)进行标记。可以基于在本文中所披露的已知的编码杀虫蛋白的核苷酸序列、通过对合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。可以额外地使用简并引物，这些引物是基于在该核苷酸序列或经编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。这种探针典型地包括以下核苷酸序列的一个区域，这些核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的编码一种杀虫蛋白的核苷酸序列或它的一个片段或变体的至少约12个，至少约25个，至少约50、75、100、125、150、175、或200个连续核苷酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域大体上已知的，并且披露于Sambrook和Russell，2001(同上)中，该文献通过引用结合在此。

例如，在本文中所披露的一个完整的杀虫蛋白序列、或它的一个或多个部分可以用作一种探针，该探针能够与相对应的杀虫蛋白样序列以及信使RNA特异性地杂交。为了达到在不同的条件下的特异性杂交，此类探针包括以下序列，这些序列是独特的并且长度优选为至少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于由PCR从一种选择的生物中扩增出相对于应的杀虫序列。这种技术可以用于从一种所希望的生物中分离额外的编码序列，或用作一种诊断性测定来以便在一种生物中确定编码序列的存在。杂交技术包括铺板的(plated)DNA文库的杂交筛选(两种基板或克隆之一；见，例如，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是指以下条件，在这些条件下与其他序列相比一种探针将与它的目标序列杂交达到一个可检测地更大的程度(例如，超过背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与该探针100％互补的目标序列(同源探测)。可替代地，可以调整严格条件以便允许序列中的一些错误匹配，这样使得检测出较低程度的相似性(异源探测)。总体上，一个探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是以下条件，在这些条件下该盐浓度在pH 7.0-8.3下是小于约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可以用加入去稳定剂(如甲酰胺)来达到。示例性的低严格条件包括在37℃下用30％-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸纳)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在55℃至60℃下在0.5X至1X SSC中进行洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在60℃至65℃下在0.1X SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包括大约0.1％至大约1％的SDS。杂交的持续时间大体上是小于约24小时，通常为大约4至大约12小时。

特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键性因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth and Wahl(1984) Anal.Biochem.138：267-284的等式中进行估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是在DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是在杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对计的杂交物的长度。T_m是以下温度，在该温度下一个互补的目标序列的50％与一个完全匹配的探针进行杂交(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m减少大约1℃；因此，可以调整T_m、杂交、和/或洗涤条件，以便与具有所希望的一致性的序列进行杂交。例如，如果找到具有＞90％一致性的序列，T_m可以被降低10℃。总体上，严格条件被选择为在一种限定的离子强度和pH下比针对该特定序列及其补体的热解链点(T_m)低大约5℃。然而，极端严格条件可以利用在低于该热解链点(T_m)1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在低于该热解链点(T_m)6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在低于该热解链点(T_m)11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组合物、以及所希望的T_m，普通技术人员应当理解，内在地说明了在杂交和/或洗涤溶液的严格性方面的改变。如果所希望的错误匹配程度导致小于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选增加SSC浓度，这样使得可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；以及Ausubel et al，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

分离的蛋白及其变体和片段

杀虫蛋白也涵盖于本发明之内。“杀虫蛋白”一词是指一种蛋白，该蛋白具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。还提供了它们的片段、生物学活性部分、以及变体，并且它们可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白”被用来指一种蛋白，该蛋白不再存在于它的自然环境中(例如，在体外或在重组体细菌或植物宿主细胞中)。

“片段”或“生物学活性部分”包括以下多肽片段，这些多肽片段包括与在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列足够地一致的氨基酸序列，并且它们展示出杀虫活性。一种杀虫蛋白的一个生物学活性部分可以是例如长度为10、25、50、100、150、200、250个或更多氨基酸的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术进行制备，并且对杀虫活性进行评估。用于测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews et al.(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用将其全文结合在此。如本文中使用的，一个片段包括至少8个相邻的SEQ ID NO：2的氨基酸。然而，本发明涵盖了其他片段，如该蛋白中大于约10、20、30、50、100、150、200、250、或300个氨基酸的任何片段。

“变体”一词是指具有一种氨基酸序列的蛋白或多肽，该序列与SEQ IDNO：2的氨基酸序列是至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的。变体还包括由一个核酸分子所编码的多肽，该核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12的核酸分子、或它的一个补体进行杂交。变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。参见，例如，在本文中实验性实例部分所披露的变体。由本发明所涵盖的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白的生物学活性，即保留了杀虫活性。在一些实施方案中，这些变体具有相对于天然蛋白提高的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews et al.(1988) Biochem.J.252：199-206；Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用将其全文结合在此。

细菌基因(如本发明的axmi基因)在开放阅读框的起始附近相当经常地具有多个甲硫氨酸起始密码子。经常，在这些起始密码子中的一个或多个上的翻译起始将导致一种功能蛋白的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌)还将该密码子GTG识别为一个起始密码子，并且在GTG密码子上引起翻译的蛋白在第一个氨基酸上包含一个甲硫氨酸。在少数情况下，细菌***中的翻译可能在TTG密码子处启动，尽管在这种情况下TTG编码一个甲硫氨酸。此外，常常不首先确定这些密码子中的哪一些在细菌中自然地使用。因此，应当理解，使用这些可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀虫蛋白的产生。这些杀虫蛋白涵盖于在本发明之中，并且可以在本发明的这些方法中使用。应当理解的是当在植物中表达时将有必要将替代起始密码子改变为ATG以用于正确的翻译。

还涵盖了针对本发明的多肽、或它们的变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域所熟知的(见，例如Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；美国专利号4,196,265)。

改变或改进的变体

应当认识到，可以通过不同的方法来改变一种杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可以导致编码以下蛋白的DNA序列，这些蛋白具有不同于由本发明的一种杀虫蛋白所编码的氨基酸序列的那些。这种蛋白可以按照不同的方式进行改变，包括SEQ ID NO：2的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短、以及***，包括达到大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约15、大约20、大约25、大约30、大约35、大约40、大约45、大约50、大约55、大约60、大约65、大约70、大约75、大约80、大约85、大约90、大约100、大约105、大约110、大约115、大约120、大约125、大约130、大约135、大约140、大约145、大约150、大约155个、或更多氨基酸置换、缺失或***。用于此类操作的方法在本领域内是总体上已知的。例如，可以通过在DNA中的突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。在某些方面，在该氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响该蛋白的功能。此类变体将具有所希望的杀虫活性。然而，应当理解，一种杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力可以通过对本发明的这些组合物使用此类技术来进行改进。例如，可以在以下宿主细胞中表达一种杀虫蛋白，这些宿主细胞在DNA复制过程中显示出高比率的碱基错误结合，如XL-1 Red(Stratagene，La Jolla，CA)。在此类菌株中繁殖之后，可以分离出该DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过由PCR进行扩增并且将得到的PCR片段克隆到一个载体中)，在一种非诱变菌株中培养这些杀虫蛋白突变体，并且鉴定具有杀虫活性的经突变的基因，例如通过进行一项对杀虫活性进行测试的测定。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白。参见，例如Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology78：290-293。此类测定可包括将植物与一种或多种害虫相接触，并且确定该植物的存活和/或引起害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例可在Schnepf et al.(1998)Microbiol.Mol. Biol.Rev.62：775-806中找到。

可替代地，可以在氨基或羧基的末端上对多种蛋白的蛋白序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的***、缺失、或改变，这些方法如PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增借助于将编码氨基酸的序列包含到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长了该编码蛋白的序列。可替代地，所加入的蛋白序列可以包括完整的编码蛋白的序列，如在本领域内通常用于产生蛋白融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加一种感兴趣的蛋白的表达；(2)引入一个结合结构域、酶活性、或表位以促进蛋白纯化、蛋白检测、或本领域已知的其他实验用途；或(3)将一种蛋白的分泌或翻译靶向一个亚细胞器，如革兰氏阴性菌的壁膜间隙，或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了由诱变和重组操作(如DNA改组)所衍生的序列。使用此类操作，可以将一个或多个不同的杀虫蛋白编码区用来创造出一种具有所希望的性质的新的杀虫蛋白。按照这种方式，从包含以下序列区域的相关序列多核苷酸的种群中产生重组多核苷酸的文库，这些序列区域具有充分的序列一致性并且可以在体外或体内进行同源重组。例如，使用这种方法，可以将编码一个感兴趣的结构域的序列基序在本发明的一个杀虫基因与其他已知的杀虫基因之间进行改组，以获得编码一种蛋白的新基因，该蛋白具有一种改进的感兴趣的性质，例如一种增加的杀昆虫活性。用于此类DNA改组的策咯是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是针对产生了经改变的杀虫蛋白的另一种机制。可在杀虫蛋白之间交换结构域，从而导致具有改进的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并且针对杀虫活性来对它们进行测试的方法是本领域所熟知的(见，例如，Naimov et al.(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd et al.(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge et al.(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf et al.(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang et al.91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

载体

本发明的一个杀虫序列可以在用于在一种感兴趣的植物中表达的表达盒中得到提供。“植物表达盒”一词是指一个DNA构建体，该构建体能够导致一种蛋白在一种植物细胞中从一个开放阅读框中的表达。典型地，这些构建体包含一个启动子以及一种编码序列。经常，此类构建体还将包含 3′非翻译区。此类构建体可以包含一个“信号序列”或“前导序列”，以促进该肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网、或高尔基体。

“信号序列”一词是指一个序列，该序列是已知或怀疑导致跨过该细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些产生的糖基化。细菌的杀昆虫毒素经常被合成为毒素原的，它们是在该目标害虫的肠中开始被强烈激活(Chang(1987)Methods Enzymol.153：507-516)。在本发明的一些实施方案中，该信号序列位于该天然的序列中，或可以衍生自本发明的一个序列。“前导序列”一词是指当被翻译时导致足以触发该肽链的共翻译运输至一个亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内，进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。

“植物转化载体”一词是指一种DNA分子，该分子对于有效转化一个植物细胞而言是所必需的。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，或可以被组织进入超过一个的“载体”DNA分子中。例如，二元载体是植物转化载体，它们利用两个非邻近的DNA载体来编码用于植物细胞转化的所有需求的顺式和反式作用功能(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”是指用于在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指一种载体，该载体具有将异源的DNA序列或片段结合、整合到一种外源细胞中并且在其中表达该异源DNA序列或片段的能力。该盒将包括与本发明的一个序列可操作地连接的5′和3′的调节序列。“可操作地连接”一词是指在一个启动子与一个第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发并介导了对应于该第二序列的DNA序列的转录。总体上，可操作地连接意味着被连接的核酸序列是相邻的并且(在有必要时连结两个蛋白编码区)是在相同的阅读框中相邻的。该盒可以额外地包含至少一种有待共转化到生物体中的额外的基因。可替代地，可以在多个表达盒上提供这种或这些额外的基因。

“启动子”是指一个核酸序列，该核酸序列发挥作用以指导一种下游编码序列的转录。该启动子连同其他转录和翻译的调节性核酸序列(也被称为“控制序列”)是一个感兴趣的DNA序列的表达所必需的。

这种表达盒配备有多个限制位点，这些限制位点用于***该杀虫序列以便处于这些调节区的转录调节之下。

该表达盒将以5′至3′的转录方向包括一个转录和翻译的起始区(即，一个启动子)、本发明的一种DNA序列、以及在植物中发挥作用的一个翻译和转录的终止区(即，终止区)。该启动子对于该植物宿主和/或本发明的DNA序列而言可以是天然的或类似的、或外源的或异源的。额外地，该启动子可以是天然序列或可替代地是一个合成序列。在该启动子对于该植物宿主而言是“天然的”或“同源的”时，它是指该启动子是在该启动子所引入的天然植物中被发现的。在启动子对于本发明的DNA序列而言是“外源的”或“异源的”时，它是指该启动子对于可操作地连接的本发明的DNA序列而言不是天然的或自然发生的启动子。

该终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于可操作地连接的感兴趣的DNA序列而言可以是天然的，对于该植物宿主而言可以是天然的，或可以衍生自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该植物宿主、或它们的任何组合而言是外源的或异源的)。方便的终止区可以获自根瘤土壤杆菌的Ti质粒，如章鱼碱合酶以及胭脂碱合酶的终止区。还可见Guerineau et al.(1991)Mol Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

在适当时，可以针对在经转化的宿主细胞中的表达增加来优化这种或这些基因。即，可以使用宿主细胞偏爱的密码子来合成这些基因用于改进的表达，或可以通过以一个宿主偏爱的密码子使用频率来使用密码子来合成这些基因。总体上，该基因的GC含量会增加。对于宿主偏爱的密码子的使用的讨论，见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。用于合成植物偏爱的基因的方法在本领域内是可供使用的。见，例如，美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，通过引用结合在此。

在一个实施方案中，将该杀虫蛋白靶向叶绿体而用于表达。按照这种方式，当该杀虫蛋白不直接***到该叶绿体中时，该表达盒将额外地包含一个编码转运肽的核酸以便将该杀虫蛋白指向该叶绿体。此类转运肽是本领域所已知的。参见，例如Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；以及Shah et al.(1986)Science 233：478-481。

可以针对在叶绿体中的表达来优化被靶向该叶绿体的杀虫蛋白基因，以便说明在该植物细胞核与这种细胞器之间在密码子使用方面的差异。按照这种方式，可以使用叶绿体偏爱的密码子来合成感兴趣的核酸。见，例如，美国专利号5,380,831，通过引用结合在此。

植物转化

本发明的方法涉及将一个核苷酸构建体引入植物中。“引入”一词是指按照以下方式将该核苷酸构建体给予该植物，使得该构建体获得了接近该植物的一个细胞的内部的途径。本发明的方法不要求用于将一个核苷酸构建体引入植物中的一种具体方法，只要求该核苷酸构建体获得了接近该植物的至少一个细胞的内部的途径。用于将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于：稳定转化法、瞬时转化法、以及病毒介导法。

“植物”一词是指整个植物、植物器官(例如，叶子、茎、根、等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚芽以及以上的子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“经转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源的核酸序列或DNA片段结合或整合到该植物细胞中的植物。这些核酸序列包括外源的、或不存在于该未经转化的植物细胞中的那些序列，连同可以是内源的、或存在于该未经转化的植物细胞中的那些序列。“异源的”大体上是指以下核酸序列，这些核酸序列对于它们所在的细胞或天然基因组的一部分而言不是内源的，并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击、或类似方法加到该细胞中。

可通过在本领域内已知的几种技术之一来实现植物细胞的转化。可以对本发明的杀虫基因进行修饰以便在植物细胞中获得或增强表达。典型地，表达这种蛋白的一个构建体将包含一个驱动该基因的转录的启动子，连同一个允许转录终止和多腺苷酸化的3′非翻译区。此类构建体的组织在本领域内是熟知的。在一些情况下，它可有用于对该基因进行工程化处理，这样使得得到的肽被分泌、或者以其他方式靶向到在植物细胞中。例如，该基因可以经工程化处理以包含一个信号肽来促进该肽到内质网的转移。还可以优选工程化处理该植物表达盒以包含一个内含子，这样使得该内含子的mRNA加工是表达所要求的。

典型地，这种“植物表达盒”将被***一种“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以包括对于实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体。例如，利用包括超过一种相邻的DNA区段的植物转化载体在本领域内是一种常见的实践。在本领域内，这些载体经常被称为“二元载体”。二元载体连同具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌-介导的转化，其中对于实现有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂性是相当大的，并且将功能分散到分开的DNA分子上是有利的。二元载体典型地包含一种质粒载体，该质粒载体包含对于T-DNA转移所要求的顺式作用序列(如左边界和右边界)、经工程化处理以便能够在一个植物细胞中表达的一个选择标记物、以及一个“感兴趣的基因”(一个经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的基因，对于它而言转基因植物的产生是所希望的)。在这种质粒载体上还存在着细菌复制所要求的序列。这些顺式作用序列以一种方式进行排列使得允许有效转移到植物细胞中并在其中进行表达。例如，该选择标记物基因以及该杀虫蛋白基因位于该左边界与右边界之间。经常，一个第二质粒载体包含了介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。这种质粒经常包含这些毒性功能(Vir基因)，这些毒性功能允许由土壤杆菌感染植物细胞，并且通过在边界序列上的切割以及vir-介导的DNA转移来转移DNA，如在本领域中所理解(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。几种类型的土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105、等)可以用于植物转化。该第二质粒载体是通过其他方法(如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇、等)转化这些植物所不需要的。

总体上，植物转化法类涉及将异源DNA转移到目标植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体、等)中，之后跟随应用了一个最大阈值水平的合适选择(取决于这种选择标记物基因)，以便从一群未经转化的细胞团中回收这些经转化的植物细胞。典型地将外植体转移到一种新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在被置于补充有一种最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后，这种经转化的细胞被分化成芽。然后，将这些芽转移到一种选择性生根培养基中用于回收已生根的芽或小植株。然后，该转基因小植株长成一棵成熟植物并且产生能育的种子(例如，Hiei et al.(1994)The Plant Journal6：271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。典型地将外植体转移到一种新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的总体说明可见于Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239以及Bommineni and Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。因为这种经转化的材料包含多个细胞；经转化的和未转化的细胞存在于受试的目标愈伤组织或组织或细胞组群的任何部分中。杀死未经转化的细胞并允许经转化的细胞进行增殖的能力导致了经转化的植物培养物。经常，去除未经转化的细胞的能力是快速回收经转化的植物细胞以及成功产生转基因植物的一个限制。

转化方案连同用于将核苷酸序列引入植物的方案可依据靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶或双子叶)而变化。转基因植物的产生可以通过几种方法之一来进行，包括但不限于：显微注射、电穿孔、直接的基因转移、由土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞中(土壤杆菌-介导的转化)、用粘附于粒子上的异源外源DNA来轰击植物细胞、射弹粒子加速(ballistic particle acceleration)、气溶胶束转化(aerosol beam transformation)(美国公开申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO 91/00915；美国公开申请号2002015066)、Lec1转化、以及用于转移DNA的不同的其他非粒子直接介导法。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab and Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于DNA的粒子枪递送，该DNA包含一个选择标记并且通过同源重组将该DNA靶向该质体基因组。额外地，质体转化可以通过一个核编码的以及质体指导的RNA聚合酶的组织偏爱的表达、通过一个沉默的携带质体的转基因的反式激活来完成。这种***已经报道于McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305。

在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在该培养基中应用了一种最大阈值水平的合适选择以杀死这些未经转化的细胞，并且通过定期转移到一种新鲜培养基中来分离和增殖这些从这种选择处理中存活的假定经转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，鉴定并增殖了这些用该质粒载体转化的细胞。然后，分子和生物化学的方法可以用于证实整合到该转基因植物的基因组中的感兴趣的异源基因的存在。

已经转化的细胞可以根据常规方法长成植物。参见，例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后，可以让这些植物进行生长，并且用相同的经转化的品系或不同的品系进行授粉，并且鉴定出这种得到的具有所希望的表型特征的组成型表达的杂种。可以生长两代或更多代以确保所希望的表型特征的表达被稳定地维持并遗传，并接着收获种子以确保已经获得了所希望的表型特征的表达。按照这种方式，本发明提供了经转化的种子(也被称为“转基因种子”)，该种子具有本发明的一个核苷酸构建体，例如被稳定地结合到它们的基因组中的本发明的表达盒。

植物转化的评估

在将异源外源DNA引入植物细胞中之后，通过不同的方法来证实异源基因在植物类基因组中的转化或整合，这些方法例如对与该整合的基因相关联的核酸、蛋白以及代谢产物的分析。

PCR分析是在移植到土壤中之前的较早阶段时针对经结合的基因的存在来筛选经转化的细胞、组织或芽的一种快速方法(Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。PCR是使用对感兴趣的基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物类来进行。

可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实植物类转化(Sambrook和Russell，2001，同上)。总体上，从该转化体中提取了总DNA，用合适的限制酶进行消化，在琼脂糖凝胶中进行分级，并且转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。然后，根据标准的技术，用例如放射性标记³²P的目标DNA片段来探测该膜或“印迹”以证实引入的基因整合到该植物基因组中(Sambrook和Russell，2001，同上)。

在RNA印迹分析中，从该转化体的特定组织中分离了RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并且根据在本领域内是常规的标准操作来印迹到尼龙滤膜上(Sambrook和Russell，2001，同上)。然后，通过在本领域内已知的方法、通过将该滤膜与衍生自一种杀虫基因的放射性探针进行杂交来测试由该杀虫基因所编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，2001，同上)。

可以对转基因植物进行蛋白印迹、生物化学测定、以及类似测定，以便通过标准操作来证实由该杀虫基因所编码的蛋白的存在(Sambrook和Russell，2001，同上)，这是使用与在该杀虫蛋白上存在的一种或多种表位相结合的抗体而进行的。

植物中的杀虫活性

在本发明的另一个方面，可以产生表达了一种具有杀虫活性的杀虫蛋白的转基因植物。以上通过实例来说明的方法可用于产生转基因植物，但产生这些转基因植物细胞的方式对于本发明而言不是至关重要的。可以依据实验者的判断来使用在本领域内已知或说明的方法，如土壤杆菌介导的转化、生物射弹转化、以及非粒子介导法。可以通过在本领域内所说明的普通方法来分离表达一种杀虫蛋白的植物，这些方法例如通过愈伤组织的转化，经转化的愈伤组织的选择，以及从此类转基因愈伤组织中再生出能育的植物类。在此类方法中，可以使用任何基因作为一个选择标记物，只要它在植物细胞中的表达赋予了鉴定或选择经转化的细胞的能力。

已经开发了多种用植物细胞一起使用的标记物，如对于氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素、以及类似物的抗性。编码了参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可以用作选择标记物。例如，提供对于植物除草剂(如草甘磷、溴苯腈、或咪唑琳酮)的抗性的基因可以是特别有用的。已经报道了此类基因Stalker et al.(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴草腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan et al.(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。额外地，在本文中所披露的这些基因用作标记物来评估细菌的或植物的细胞的转化。用于检测在一种植物、植物器官(例如，叶子、茎、根、等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或以上的子代中转基因的存在的方法是本领域内所熟知的。在一个实施方案中，转基因的存在是通过测定杀虫活性来检测的。

可以针对杀虫活性来对表达一种杀虫蛋白的能育的植物进行测试，并且对显示出最佳活性的植物进行选择用于进一步的育种。在本领域内对害虫活性进行测定的方法是可供使用的。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白。见，例如，Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology78：290-293。

本发明可以用于转化任何植物类种类，包括但不限于：单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、以及油菜、芸苔属植物、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔属的树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏性植物、以及针叶树。

蔬菜包括但不限于：番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及甜瓜属(genus Curcumis)的成员，如黄瓜、网纹甜瓜、以及甜瓜。观赏性植物包括但不限于：杜鹃花属、绣球属、木槿属、蔷薇属、郁金香、水仙属、碧冬茄属、康乃馨、一品红、以及菊花。优选地，本发明的植物是农作物植物(例如，玉蜀黍、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜、等)。

在虫害控制方面的用途

在虫害控制或工程化处理其他生物中用于采用多种菌株作为杀虫剂的总体方法在本领域内是已知的，这些菌株包括了本发明的一个核苷酸序列或它的一种变体。见，例如，美国专利号5,039,523和EP 0480762A2。

包含本发明的一个核苷酸序列、或它的一个变体的芽孢杆菌菌株、或已经被遗传改变而包含一种杀虫基因和蛋白的微生物可用于保护农业作物以及产品免受害虫的侵害。在本发明的一个方面，用以下试剂来处理一种产生毒素(杀虫剂)的生物的完整的(即，未裂解的)细胞，当这些细胞被施用到一种或多种目标害虫的环境时这些试剂延长了在该细胞中产生的毒素的活性。

可替代地，通过将一种杀虫蛋白基引入到一个细胞宿主中来产生该杀虫剂。该杀虫基因的表达直接或间接地导致了该杀虫剂的细胞内产生和维持。在本发明的一个方面，然后在以下条件下对这些细胞进行处理，当该细胞被施用到一种或多种目标害虫的环境时这些条件延长了在该细胞中产生的毒素的活性。得到的产物保留该毒素的毒性。然后，可以按照常规技术来配制这些天然胶囊化的杀虫剂，用于施用到栖宿着一种目标害虫的环境(例如，土壤、水、以及植物的叶)。见，例如EPA 0192319，以及其中所引用的文献。可替代地，可配制表达本发明的一个基因的这些细胞，以便允许得到的材料作为一种杀虫剂的施用。

本发明的活性成分通常以组合物的形式进行施用，并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用到有待处理的作物区域或植物中。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂(cryoprotectants)、表面活性剂、洗涤剂、杀虫肥皂(pesticidal soaps)、休眠喷洒油(dormant oils)、聚合物、和/或定时释放或生物可降解的载体配制品，这些配制品允许在单次施用该配制品之后对一个目标面积进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀害虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些配制品中的几种的混合物，如果希望的话，与其他农业上可接受的载体、表面活性剂或在配制品领域内通常采用的促进施用的佐剂一起。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且相应于在配制技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，可将这些配制品制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”以允许由一种目标害虫来摄食或摄取该杀虫配制品。

施用本发明的一种活性成分或本发明的一种农业化学组合物(该组合物包含由本发明的细菌菌株所产生的这些杀虫蛋白中的至少一种)的方法包括叶施用、种子涂覆和土壤施用。施用次数以及施用率取决于由相对应的害虫所侵染的强度。

可以将该组合物配制成一种粉末、粉尘、小粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液、或类似剂型，并且可以通过以下常规方法来制备该组合物，这些方法例如包括该多肽的多个细菌细胞的一种培养物的干燥、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降、或浓缩。在包含至少一种这种杀虫多肽的所有此类组合物中，该多肽可以按照按重量计从大约1％至大约99％的浓度而存在。

可以在一个给定的区域内通过本发明的这些方法来杀死鳞翅目的、双翅目的、或鞘翅目的害虫或减少其数目，或可以将它们预防性地施用到一个环境区域内以防止由一种易受影响的害虫的侵染。优选地，这种害虫摄取、或接触了一个杀虫有效量的该多肽。“杀虫有效量”一词是指该杀虫剂的一个量值，该量值能够引起至少一种害虫的死亡、或明显减少害虫的生长、摄食、或正常的生理发育。这个量值将取决于以下因素而变化：例如，有待控制的特定的目标害虫，有待处理的特定的环境、地点、植物、作物、或农业场所，环境条件，以及施用在杀虫上有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性、以及数量。这些配制品还可以根据气候条件、环境考虑、和/或施用频率和/或害虫侵染的严重度而变化。

可通过将该细菌细胞、晶体、和/或孢子悬浮物、或分离的蛋白组分与所希望的农业上可接受的载体配制在一起来制备所说明的杀害虫剂组合物。在施用之前，可以用一种合适的手段(如冻干、冷冻干燥、干燥的，或在一种水性载体、介质或合适的稀释剂，如盐水或其他缓冲液中)配制这些组合物。这些经配制的组合物可以处于以下形式：一种粉尘或颗粒材料、或一种在油(植物性或矿物性)中的悬浮体、或水或油/水乳液、或作为一种可湿性粉末、或与适合于农业施用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且在本领域内是熟知的。术语“农业上可接受的载体”覆盖了所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂、等等，它们在杀虫剂配制技术中是常用的；这些对于杀虫剂配制领域的普通技术人员而言是熟知的。这些配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂相混合，并且通过不同的手段进行制备，例如通过使用常规的配制技术将这种杀虫组合物与合适的佐剂进行均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制品和施用方法说明于美国专利号6,468,523中，该文献通过引用结合在此。

“害虫”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱、以及类似物。虫害包括选自以下的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、等等，特别是鞘翅目、鳞翅目、以及双翅目。

鞘翅目包括肉食亚目(suborder Adephaga)和多食亚目(suborder Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(superfamily Caraboidea)和豉甲总科(superfamily Gyrinoidea)，而多食亚目包括牙甲总科(superfamily Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(superfamily Staphylinoidea)、花萤总科(superfamily Cantharoidea)、郭公虫总科(superfamily Cleroidea)、叩头虫总科(superfamily Elateroidea)、花甲总科(superfamily Dascilloidea)、泥甲总科(superfamily Dryopoidea)、九甲总科(superfamily Byrrhoidea)、扁甲总科(superfamily Cucujoidea)、芜菁总科(superfamily Meloidea)、花蚤总科(superfamily Mordelloidea)、拟步甲总科(superfamily Tenebrionoidea)、长蝽总科(superfamily Bostrichoidea)、金龟总科(superfamily Scarabaeoidea)、天牛总科(superfamily Cerambycoidea)、叶甲总科(superfamily Chrysomeloidea)以及象甲总科(superfamily Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)、以及龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(family Gyrinidae)。牙甲总科包括牙甲科(family Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(family Silphidae)和隐翅甲科(family Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(family Cantharidae)和萤科(family Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蝽科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芜菁科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜕科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蝽科(Scolytidae)。

双翅目包括长角亚目(Nema tocera)、短角亚目(Brachycera)、以及环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)、以及瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、以及长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Division Aschiza)和有缝组(Division Schizophora)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)、以及果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、以及麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺娥科(Ceometridae)、灯娥科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)以及谷蛾科(Tineidae)。

对于主要农作物的本发明的虫害包括：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilaiis)、欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)、黑地老虎(black cutworm)；谷实夜娥(Helicoverpa zea)、棉铃虫(corn earworm)；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)、西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟(lesser cornstalk borer)；小蔗秆草螟 (Diatraea saccharalis)，小蔗秆草螟(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、西方玉米根螟(western corn rootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)、北方玉米根螟(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpuncta ta howardi)，南方玉米根螟(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属(Melanotus spp.)、金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)、北方圆头犀金龟(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方圆头犀金龟(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米跳甲；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis)，玉米谷象；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米叶蚜虫；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜虫；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis)，玉米斑潜蝇；玉米黄蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马；窃蚁(Solenopsis milesta)，窃蚁；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；粒肽脏切夜娥(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita)、蛴螬；伪金针虫属(Eleodes spp.)、叩头虫属(Conoderus spp.)、以及Aeolus属，蛴螬；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲；玉米铜色跳甲，玉米跳甲；玉米隐啄象，玉米谷象；玉米缢管蚜，玉米叶蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜；美洲谷长蝽，高粱长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，粱痪蚊(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；二斑叶蹒(Tetranychus urticae)，二斑叶蹒；小麦：一点黏虫(Pseudaletia unipunctata)，黏虫；草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；黑角负泥虫，谷类叶甲；三叶草叶象(Hypera punctata)，三叶草叶象；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根螟；俄罗斯小麦蚜虫；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，异黑蝗；血黑蝗，迁徙蝗虫；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦蛆(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyza americana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheat stem maggot)；麦疫种蝇(Hylemya coarctata)，麦种蝇(wheat bulb fly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus ductus)，麦茎蜂；曲叶螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶娥(Suleima helianthana)，向日葵芽娥；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵娥；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽蠓；棉花：烟芽夜娥(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥，棉铃虫；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；红铃麦娥(Pectinophora gossypiella)，粉色棉铃虫；棉铃象(Anhonomus grandis)，棉子象鼻虫；棉蚜(Aphis gossypii)，棉花蚜虫；棉序盲蝽(Pseuda tomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽；温室粉虱(Trialeurodes abutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，牧草盲蝽；赤胫黑蝗，红胫蝗虫；异黑蝗，异黑蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马，烟蓟马；朱砂叶螨，朱砂叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；稻：小蔗杆草螟，甘蔗螟；草地夜娥，秋夜娥；谷实夜娥，棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄鞘叶甲；稻水象(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，米叶蝉；美洲谷长蝽，高粱长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜娥(soybean looper)；梨豆夜蛾，夜蛾科；苜蓿绿夜娥(Plathypena scabra)，苜蓿绿夜娥；玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；甜菜夜娥，甜菜夜娥；烟芽夜娥，棉花蚜虫；谷实夜娥，棉铃虫；墨西哥大豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥大豆瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)，桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟缘蝽，绿蝽；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；异黑蝗，异黑蝗；玉米种蝇，玉米种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马，洋葱蓟马；草莓叶螨(Tetranychus turkestani)，草莓叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；麦二叉蚜，麦二叉蚜(greenbug)；美洲谷长蝽，高粱长蝽；拟缘蝽，绿蝽；烟草蝽(Euschistus servus)，茶色蝽；灰地种蝇(Delia platura)，种蝇；小麦瘿蚊，小麦瘿蚊；潜岩螨(Petrobia latens)，麦长腿蜘蛛；油料种子油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲；蓓带夜娥(Mamestra configurata)，贝莎夜蛾(Bertha armyworm)；菜蛾(Plutella xylostella)，小菜蛾；地种蝇属(Delia ssp.)，根蛆。

线虫包括寄生性线虫，例如根结线虫、胞囊线虫、以及根腐线虫，包括异皮线虫属、根结线虫属、以及球异皮线虫属；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(燕麦胞囊线虫)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)以及马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属。

用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。这些方法包括将一种多核苷酸引入到一种植物或植物细胞中，该多核苷酸包含在本文中所披露的一个杀虫序列。如本文所定义的，该植物的“产量”指由该植物所产生的生物质的品质和/或数量。“生物质”一词是指任何经测量的植物产物。生物质产生方面的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改进。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。额外地，增加叶生物质可以用于增加植物衍生的药学或工业产物的生产。产量的增加可以包括与一种不表达该杀虫序列的植物相比任何统计学上显著的增加，包括但不限于：产量的至少1％的增加，至少3％的增加，至少5％的增加，至少10％的增加，至少20％的增加，至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

还可以用一种或多种化学成分来处理植物，这些化学成分包括一种或多种除草剂、杀虫剂、或杀真菌剂。示例性的化学成分包括：果实/蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草丁膦、氯吡嘧磺隆(Gowan)、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、Indaziflam；果实/蔬菜杀虫剂：涕灭威、转苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、Cyazypyr、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、Fozthiazate、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果/蔬菜杀真菌剂类：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、三乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸恶咪唑、赛座灭、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂类：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、氟虫腈、精恶唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻磺隆、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、Pyrasulfotole、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、Pyroxasulfon；谷物杀真菌剂类：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷类杀昆虫剂类：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉米除草剂类：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)甲酚噻草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、Topramezone、Tembotrione、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、Pyroxasulfon；玉蜀黍杀昆虫剂类：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-三氟氯氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、Cyazypyr、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉米杀真菌剂类：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；稻除草剂类：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、稻思达、乙氧嘧磺隆、丙草胺、硝草酮、Tefuryltrione、恶草酮、精恶唑禾草灵、Pyrimisulfan；稻杀昆虫剂类：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、***磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基) 氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；稻杀真菌剂类：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯奎酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂类：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、哒草伏、二甲戊乐灵、嘧硫苯甲酸钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂类：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-三氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、γ-三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、***磷、硫丹；棉花杀真菌剂类：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂类：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂类：λ-三氟氯氰菊酯、灭多威、对硫磷、甲硫威、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、Cyazypyr、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂类：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂类：杀草敏、甜安宁、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、丁基吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、三氟啶磺隆、得杀草、精喹禾灵；甜菜杀昆虫剂类：吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威；低芥酸菜籽除草剂类：二氯吡啶酸、禾草灵、丁基吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、得杀草；低芥酸菜籽杀真菌剂类：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；低芥酸菜籽杀昆虫剂类：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ三氟氯氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、Cyazypyr、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

通过展示并且并非通过限制来提供了以下这些实例。

实验性实例

实例1.质粒DNA的提取

通过如下的MiDAS基因组学方法从选定的菌株中鉴定全基因序列：

从该菌株中制备染色体外的DNA。染色体外的DNA包含以下各项的一些或全部的混合物：不同尺寸的质粒、噬菌体染色体、通过纯化方案未分离的基因组DNA片段、其他未表征的染色体外的分子。

对染色体外的DNA进行机械的或酶的剪切以产生大小分布的片段。

通过高通量焦磷酸(pyrosequencing)测序方法对这些片段的DNA进行测序。

通过同源性和/或其他计算分析来鉴定推定的毒素基因。

当要求时，通过几种PCR或克隆策略中的一种(例如TAIL-PCR)来对感兴趣的基因进行序列最终处理。

实例2.AXMI-150的异源表达

将axmi-150(约2kb，它编码约77.5kD的蛋白)的全部ORF克隆到基于pRSF1b的大肠杆菌表达载体中(从而给出pAX5482)。以内部甲硫氨酸(距离pAX5482中初始甲硫氨酸的下游19个氨基酸)开始的axmi-150的基因序列也被克隆到该基于pRSF1b的载体中从而给出pAX5484。

还将对axmi-150进行编码的序列克隆到基于pAX916的芽胞杆菌表达载体中(从而给出pAX5483)。通过限制性分析并且最后通过该克隆的基因的完全测序来证实这些得到的克隆的全体。

为了在大肠杆菌中进行表达，用pAX5482或pAX5484来转化BL21*DE3。将单一的菌落接种在添加有卡那霉素的LB中并且在37℃下生长过夜。第二天，用1％的过夜培养物一式两份地接种新鲜培养基并且在37℃下生长至对数期。随后，在37℃下用1mM IPTG诱导培养物3小时或者在20℃下过夜。将每个细胞球粒悬浮在50mM碳酸钠缓冲液(pH 10.5，添加有1mM DTT)中并且进行超声处理。通过SDS-PAGE的分析检测到相应于AXMI-150的一个约78kD蛋白的表达。

为了在芽胞杆菌中表达，用pAX5483来转化Bt51并且在CYS-glu培养基中将一个单菌落生长3天至芽孢形成。然后用50mM Tris Cl缓冲液(pH8.0)或50mM碳酸钠缓冲液(pH 10.5)(各自都添加有1mM DTT)来提取细胞球粒。可溶的部分显示存在一个78kD Axmi150蛋白。胰酶消化AXMI-150给出约55kD的一个模糊蛋白带。

axmi-150开放阅读框的序列被提供在此(为SEQ ID NO：i)并且编码了AXMI-150蛋白(SEQ ID NO：2)。

相对于公共序列数据库对AXMI-150氨基酸序列进行的搜索表明AXMI-150是与AXMI-004蛋白同源的(美国专利7,355,099)。AXMI-150还展示与cry1Ca4，以及与国际申请公开号WO2005/107383中所描述的AXMI-004-样蛋白的一个组的氨基酸同源性。

已知的同系物以及大致的百分比同一性为：

AXMI-004-85.5％

Cry1Ca4(毒素结构域)-51.8％

实例3.AXMI-150的杀虫活性

使用适当的对照物在昆虫测定中检验包含AXMI-150的可溶性提取物。这些板的5日读数显示AXMI-150对于欧洲玉米螟(ECB)、黎豆夜蛾(VBC)具有杀虫活性，并且对于小菜蛾(DBM)以及西南玉米螟(SWCB)具有高死亡率(＞50％)。表1显示了在此所使用的得分分配的说明。

表1.得分***的说明

分数	说明
		0	未观察到影响
1	轻微的不均匀的矮化
		2	中等程度的不均匀的矮化
3	中等程度至严重均匀的矮化
		4	死亡率(＜100％)具有均匀矮化特征
5	全部死亡

表2.AXMI-150的杀虫活性

害虫	AXMI-150的活性
		欧洲玉米螟	+++
黎豆夜蛾	+
		小菜蛾	+++++
西南玉米螟	++++

实例4.杀虫活性的其他测定

本发明的核苷酸序列可以针对它们产生杀虫蛋白的能力来进行测试。经常通过多种方式来评定一种杀虫蛋白充当针对一种害虫的杀虫剂的能力。在本领域内熟知的一种方法是进行一项摄食测定。在这项摄食测定中，将这种害虫暴露于一种包含有待测试的化合物的样品或对照样品。经常，这是通过将有待测试的材料、或此类材料的一种合适的稀释物置于该害虫将摄取的材料(如，人工饵料)上来进行。这种有待测试的材料可以由一种液体、固体、或浆料组成。可将有待测试的材料置于表面上，并接着允许其干燥。可替代地，可将有待测试的材料与一种溶化的人工饵料进行混合，然后分配到该测定小室中。该测定小室可以是例如一个杯子、一个皿、或一个微量滴定板的一个孔。

用于吸吮性害虫(sucking pest)(例如，蚜虫)的测定可以涉及通过一个分隔物将这种测试材料与这种昆虫分开，这种分隔物理想地是可以被这种吸吮性昆虫的吸吮式口器刺穿、以便允许摄取这种测试材料的部分。经常将这种测试材料与一种摄食刺激物(如蔗糖)相混合，以便促进该测试化合物的摄取。

其他类型的测定可以包括将这种测试材料显微注射到这种害虫的口或肠内，连同形成转基因的植物类，之后随后这种害虫摄食该转基因植物的能力的测试。植物测试可涉及分离被正常地消耗的植物部分，例如放在叶上的小笼，或分离在包含昆虫的笼中的整个植物。

用于测定害虫的其他方法和途径在本领域内是已知的，并且可见于例如Robertson and Preisler，eds.(1992) Pesticide bioassays with arthropods，CRC，Boca Raton，FL。可替代地，在期刊“Arthropod Management Tests”以及“Journal of Economic Entomology”中、或通过与美国昆虫学学会(Entomological Society of America，ESA)的会员的讨论而经常地说明了这些测定。

实例5.AXMI-004的定向释放

在AXMI-004(SEQ ID NO：14)上执行定向释放。针对受体结合区域中的三个环进行诱变。作为一个第一步骤，环1(相应于SEQ ID NO：14的残基311-316)、环2(相应于SEQ ID NO：14的残基368-378)以及环3(相应于SEQ ID NO：14的残基434-438)的缺失被产生出来、被表达于Bt51中并且被测试生物活性。环2和3的缺失严重地降低了蛋白的溶解度，而环1的缺失没有影响蛋白的溶解度。环1缺失变体显示抗欧洲玉米螟(ECB)的降低的毒性，但是保持它的抗小菜蛾(DBM)的活性。

接下来，在这3个环内，总计23个位置被诱变处理。产生了一组点突变体。

质粒pAX5485(pRSF1b中的His6-axmi004-m2)被用来表达wt axmi-004并且还是用于诱变以及变体表达的基础。使用

闪电定点诱变试剂盒(Stratagene)来进行诱变，对突变体进行测序，并且对独特的变体进行鉴定。产生以下的点突变体多样性：

表3：环1：

位置

311

312

313

314

315

316

Wt

Y

S

V

G

R

N

多样性

G

R

G

P

G

C

G

R

A

R

P

T

C

A

S

C

A

S

T

A

I

A

T

P

A

E

H

T

W

T

P

Q

D

W

P

W

V

H

Q

H

N

K

E

V

L

E

I

L

N

E

V

L

E

K

L

M

D

V

F

Q

D

M

K

V

D

K

E

Y

Q

I

K

D

Q

[0140]

					I
							总计	14	13	11	14	16	13

表4：环2：

表5：环3：

位置	434	435	436	437	438
						wt	K	S	G	T	P
突变体	T	R	P	A	G
							G	T	R	G	R
	A	G	T	P	T
							R	A	A	T	S
	S	P	S	S	W
							W	W	V	R	A
	P	L	K	I	F
							E	E	E	M	L
	Q	V	L	E	V
							V	M	D	H	Q
	L	D	H	Y	K
							N	H	Q	V	F
	F		N	K	I
							M			D	P
	I			F	N
							K			L
	H			N


						总计	17	12	13	17	15

环1、环2以及环3的变体被分别地合并。

文库的表达和筛选：

初级筛选：

将合并的文库变体以及pAX5485转化到BL21*DE3细胞中并且铺于LB+卡那霉素(100μg/ml)上。将新鲜的克隆挑入16ml LB+卡那霉素(100μg/ml)液体培养基中并且在37℃以及300rpm下在24深孔块中生长直至达到OD600nm为0.3至0.4。将IPTG加至终浓度为0.5mM并且在20℃下将这些培养物孵育另外18小时。对OD600nm进行测定并且通过离心来收集细胞(在4℃下，在4500rpm下，10分钟)。在密度为10OD600/ml下将细胞球粒再悬浮于50mM碳酸钠(pH 10.5，1mM DTT)中。通过珠粒拍打将这些细胞破裂并且在4℃下在4000rpm下离心15分钟之后获得可溶的提取物。

在每个变体4次重复下针对抗ECB、西南玉米螟(SWCB)、烟芽夜蛾(Hz)、黎豆夜蛾(VBC)以及DBM的活性来测定这些提取物。5天之后，通过平均来自4次重复的得分来确定毒性得分。在这个初级筛选中对应地测定了环1集合体的122个变体、环2集合体的240个变体、以及环3集合体的121个变体，这提供了该文库的1.5x覆盖。

重复测定以及按比例放大：

显示在ECB或SWCB上提高分数的变体被测序并且在每个变体4次重复下进行重复测定。选择再次显示抗ECB或SWCB增强活性的变体用来按比例放大。

对于按比例放大，将3个新鲜转化的克隆挑入70ml LB+卡那霉素(100μg/ml)中并且在37℃以及150rpm下在0.5升摇床烧瓶中进行生长直至达到OD600nm为0.3至0.4。将IPTG加至终浓度为0.5mM并且在20℃下将这些培养物孵育另外18小时。对OD600nm进行测定并且通过离心来收集细胞(在4℃下，在5000rpm下，10分钟)。在密度为10OD600/ml下将细胞球粒再悬浮于50mM碳酸钠(pH 10.5，1mM DTT)中。通过珠粒拍打将这些细胞破裂并且在4℃下在4000rpm下离心15分钟之后获得可溶的提取物。通过将连续稀释的提取物与已知浓度的BSA标准品相比较，在用考马斯染色的SDS-PAGE上对这些提取物中的Axmi-004变体进行定量。所有变体蛋白以非常类似的水平测试表达。

在每个变体和害虫16次重复下针对ECB、SWCB、VBC、Hz以及DBM来测定按比例放大的制备物。将得分进行平均。

在初级筛选、重复测定以及按比例放大中下面的环2变体显示了提高的毒性：

表6

在位置370、373、376、以及377处序列多样性被示于表7中：

表7

370

371

372

373

374

375

376

377

378

AXMI004

Q

P

A

P

A

P

F

L21A5

Q

P

A

P

A

P

Q

F

L21F2

R

Q

P

A

P

A

P

F

L21B11

Q

P

A

P

A

T

P

F

[0161]

L22F7

Q

P

A

P

A

G

P

F

L23G5

Q

P

M

P

A

P

F

在初级筛选以及重复测定中来自环1文库的三个变体显示提高的毒性(表8)。

表8

	Hz	ECB	VBC	DBM	SWCB
						axmi004	-	+	++	+++++	+
1H11	-	++	+	+++++	+
						1E8	-	++	++	+++++	无数据
1F9	+	++	+	+++++	无数据

所有这三个改进的变体都是在SEQ ID NO：14的位置316处突变的，在该位置天冬酰胺残基在突变体L11E8、L11F9、以及L11H11中被对应地突变为缬氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸，这表明已经鉴定出与提高活性相关联的一个重要的位置。

在ECB活性的初级筛选、重复测定中以及按比例放大中下面的环3变体显示了提高的毒性：

表9：

	矮化得分	死亡率(％)
			AXMI004	++	28％
L31B10	++	无数据
			L31A11	++	20％
L31H11	++	33％

改进的变异体是从AXMI004的位置434处的赖氨酸被对应地突变成为突变体L31B10和L31A11中苏氨酸以及缬氨酸的，并且从AXMI004的位置438处的脯氨酸突变为突变体L31H11中的丝氨酸。在这些AXMI004的模拟的晶体结构中，环1、2、和3中突变位置的侧链都朝向同一总体方向。这些发现表明几个环中的氨基酸可以促成共同的结合界面。因此在几个环中结合功能上提高多样性的另外的排列可以在活性方面提供甚至进一步的提高。

实例6.AXMI-150的定向释放

这个实例描绘了AXMI-150(SEQ ID NO：2)的定向释放。已经针对推定的处理区域中的环进行突变。

质粒pAX5482(pRSF1b中的His6-axmi150)被用来表达wt axmi-150并且还是用于诱变以及变体表达的基础。使用

闪电试剂盒(Stratagene)来进行诱变，对突变体进行测序，并且对独特的变体进行鉴定。产生以下的点突变体多样性：

表10

116

117

118

119

120

121

122

AXMI150

N

T

G

S

K

P

T

S

A

P

A

G

R

G

P

S

T

G

C

T

S

A

E

R

T

P

G

C

R

M

C

P

S

Y

A

G

V

A

R

T

Q

P

N

L

G

Q

R

K

R

D

Q

L

E

H

A

K

M

D

E

L

I

W

E

L

H

Q

H

E

S

M

V

K

H

D

N

F

H

V

D

E

F

L

Y

K

M

Q

总计

10

11

14

10

11

12

15

[0175] 文库的表达和筛选：

初级筛选：

将合并的文库变体以及pAX5482转化到BL21*DE3细胞中并且铺于LB+卡那霉素(100μg/ml)上。将新鲜的克隆挑入16ml LB+卡那霉素(100μg/ml)液体培养基中并且在37℃以及300rpm下在24深孔块中生长直至达到OD600nm为0.3至0.4。将IPTG加至终浓度为0.5mM并且在20℃下将这些培养物孵育另外18小时。对OD600nm进行测定并且通过离心来收集细胞(在4℃下，在4500rpm下，10分钟)。在密度为10OD600/ml下将细胞球粒再悬浮于50mM碳酸钠(pH 10.5，1mM DTT)中。通过珠粒拍打将这些细胞破裂并且在4℃下在4000rpm下离心15分钟之后获得可溶的提取物。

在每种变体4个重复下针对抗ECB、SWCB、Hz、VBC以及DBM的活性来测定提取物。5天之后，通过平均来自4次重复的得分来确定毒性得分。对119个变异体进行筛选，给出该文库1.5x覆盖。

重复测定以及按比例放大：

显示在ECB或SWCB上提高分数的变体被测序并且在每个变体4次重复下进行反复测定。选择再次显示抗ECB或SWCB增强活性的变体用来按比例放大。

对于按比例放大，将3个新鲜转化的克隆挑入70ml LB+卡那霉素(100μg/ml)中并且在37℃以及150rpm下在0.5升摇床烧瓶中进行生长直至达到OD600nm为0.3至0.4。将IPTG加至终浓度为0.5mM并且在20℃下将这些培养物孵育另外18小时。对OD600nm进行测定并且通过离心来收集细胞(在4℃下，在5000rpm下，10分钟)。在密度为10OD600/ml下将细胞球粒再悬浮于50mM碳酸钠(pH 10.5，1mM DTT)中。通过珠粒拍打将这些细胞破裂并且在4℃下在4000rpm下离心15分钟之后获得可溶的提取物。通过将连续稀释的提取物与已知浓度的BSA标准物进行比较在用考马斯染色的SDS-PAGE上对这些提取物中的Axmi-150变体进行定量。所有变体蛋白以非常类似的水平测试表达。

在每个变体和害虫16次重复下针对ECB、SWCB、VBC、Hz以及DBM来测定按比例放大的制备物。将得分进行平均并且对标准差进行确定。

如下面表11-13中所示，在按比例放大时变异体的活性显示出提高。

表11：

表12

表13

这些改进的变异体中序列多样性被描述如下：

表14

116

117

118

119

120

121

122

AXMI150

N

T

G

S

K

L11A6

N

S

G

S

K

L11B5

N

G

S

A

K

L11B6

N

T

G

S

K

L11C10

K

N

T

G

S

K

L11D1

N

T

G

S

K

L11D10

N

T

G

Q

S

K

L11D3

N

T

K

S

K

L11F10

N

T

G

S

P

K

实例7.用于植物表达的基因的运载

本发明的编码区是与用于在植物中表达的适当的启动子和终止子序列相连的。此类序列在本领域内是所熟知的，并且可以包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子，用于在双子叶植物中表达的拟南芥属UBQ3启动子或CaMV 35S启动子、以及nos或PinII终止子。用于生产并证实启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域内也是熟知的。

在本发明的一个方面中，设计并产生了合成的DNA序列。这些合成的序列具有相对该亲本序列的经改变的核苷酸序列，但是这些合成的序列编码了与该亲本AXMI-150蛋白(例如SEQ ID NO：3、4、5、6、或7)基本一致的蛋白。

在本发明的另一个方面，包括编码蛋白的合成DNA序列，这些序列是与AXMI-004蛋白(例如SEQ ID NO：8-12)基本上一致的。AXMI-004蛋白被描述于美国专利号7,355,089以及于2008年9月12日提交的名称为“Synthetic AXMI-004 Delta-endotoxin Genes and Methods for Their Use”的美国专利申请号12/209,354中。

在本发明的另一个方面，这些合成基因的改进变体被设计为使得将得到的肽靶向一种植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致将融合蛋白靶向植物细胞器的肽序列在本领域内是已知的。例如，来自白羽扇豆(Lupinus albus)的酸性磷酸酶基因的N-末端区域(

ID GI：14276838，Miller et al.(2001)Plant Physiology 127：594-606)在本领域内是已知导致异源蛋白的内质网靶向作用。如果得到的融合蛋白在C-末端还包含一个内质网保留序列，该序列包括肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即，“KDEL”基序，SEQ ID NO：13)，则该融合蛋白将被靶向内质网。如果这种融合蛋白在C-末端缺少一个靶向内质网的序列，则该蛋白将被靶向内质网，但最终将被隔离在质外体中。

因此，这个基因编码了一种融合蛋白，该融合蛋白包含了来自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸( ID GI：14276838，Miller et al，2001，同上文)，它们融合到本发明的氨基酸序列的N-末端上，以及C-末端上的KDEL序列上。因此，预测得到的蛋白一旦表达于一种植物细胞时就被靶向该植物的内质网。

将以上说明的植物表达盒与一种合适的、辅助经转化的细胞和组织的选择的、植物选择标记物相组合，并且将其连接到植物转化载体中。这些可以包括来自土壤杆菌介导的转化的二元载体、或用于气溶胶或生物射弹转化的简单的质粒载体。

实例8.用于植物表达的运载基因

将本发明的基因的编码区DNA可操作地与用于在植物中表达的合适启动子和终止子序列相连接。此类序列在本领域内是所熟知的，并且可以包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子，用于在双子叶植物中表达的拟南芥属UBQ3启动子或CaMV 35S启动子、以及nos或PinII终止子。用于生产并证实启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域内也是熟知的。

将以上说明的植物表达盒与一种合适的、辅助经转化的细胞和组织的选择的、植物选择标记物相组合，并将其连接到植物转化载体中。这些可以包括来自土壤杆菌介导的转化的二元载体、或用于气溶胶或生物射弹转化的简单的质粒载体。

实例9.使用在本文中说明的杀虫蛋白基因的玉蜀黍细胞的转化

最好在授粉后8至12天收集玉米穗。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将这些胚以盾片侧向上的方式放置在一种合适的孵育培养基上，如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL母液)2，4-D)。然而，培养基和盐类(而不是DN62A5S)是适当的并且在本领域内是已知的。将这些胚在黑暗中在25℃下孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。

将所得到的外植体转移至网眼方阵(30-40个/平板)，转移至渗透培养基上并保持大约30-45分钟，随后转移至一个聚束平板(beaming plate)上(见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

在植物细胞中将被设计为本发明基因的DNA构建体加速进入植物组织中，这是使用一种气溶胶束加速器、使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所说明的条件进行的。在聚束之后，将胚在渗透培养基上孵育大约30分钟，并且将其置于孵育培养基上在25℃下在黑暗中过夜。为了避免不适当地破坏经聚束的外植体，它们在转移至恢复培养基之前被孵育至少24小时。然后，将胚在25℃下在黑暗中扩散到恢复培养基上，持续大约5天，随后转移至一种选择培养基中。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域已知的方法引发该再生过程。允许这些得到的芽在生根培养基上生根，并且将得到的植物转移至育苗盆(nursery pot)中并繁殖成转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl将该溶液的pH调整至pH 5.8，加入高达3g/L的浓度的Gelrite(Sigma)，并将该培养基高压灭菌。在冷却至50℃之后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(Phytotechnology Labs)。

实验10.本发明的基因在由土壤杆菌-介导的转化的植物细胞中的转化

穗最好在授粉之后8至12天进行收集。将胚与穗进行分离，并且那些大小为0.8-1.5mm的胚是优选用于转化的。将胚以盾片侧向上的方式置于在一种适当的孵育介质中，并且在25℃下在黑暗中孵育过夜。然而，本质上不需要将这些胚孵育过夜。将这些胚与一种土壤杆菌属菌株进行接触，该菌株包含了这些适当的载体用于Ti质粒介导的转化，持续大约5-10分钟，并接着将其置于共培养基上持续大约3天(25℃下、在黑暗中)。在共培养之后，将外植体转移到恢复期培养基中，持续大约5天(25℃下、在黑暗中)。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且如本领域内所已知来引发再生过程。

在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有公开文件和专利申请是通过引用结合在此的，其程度就像每个单独公开文件或专利申请被专门地和单独地表明通过引用结合在此一样。

尽管本发明在上文中出于理解清楚的目的、通过展示和实例已经相当详细地进行了说明，应当明显的是可以在所附的权利要求书的范围内实行某些改变和改进。