ES2913457T3

ES2913457T3 - Métodos, módulos, instrumentos y sistemas de procesamiento celular automatizados

Info

Publication number: ES2913457T3
Application number: ES18825038T
Authority: ES
Inventors: Don Masquelier; Phillip Belgrader; Jorge Bernate; Ryan Gill; Kevin Ness
Original assignee: Inscripta Inc
Current assignee: Inscripta Inc
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-30
Publication date: 2022-06-02
Anticipated expiration: 2038-06-30
Also published as: US20190002874A1; US20200157532A1; US20190185846A1; JP2020530979A; RS63202B1; US20200063123A1; PL3645719T3; PT3645719T; CA3066253C; US10253316B2; US10954512B1; US20210222159A1; US11034953B1; US20190270987A1; US10519437B1; US20210002634A1; HRP20220615T1; RU2755308C2; KR20200024247A; US20200270601A1

Abstract

Un instrumento de corrección celular multimodular automatizado, que comprende: un alojamiento (100) configurado para contener todos o algunos de los módulos; un receptáculo (626a) configurado para recibir células; uno o más receptáculos (626b) configurados para recibir ácidos nucleicos; un módulo de transformación (110c) configurado para introducir los ácidos nucleicos en las células; un módulo de recuperación (110a, 110b) configurado para recibir células del módulo de transformación y para permitir que las células se recuperen después de la transformación celular en el módulo de transformación; un módulo de corrección nucleásica (922) configurado para permitir que los ácidos nucleicos introducidos corrijan ácidos nucleicos en las células; y un procesador (126) configurado para hacer funcionar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado en función de la entrada del usuario y/o la selección de una secuencia de órdenes preprogramada; un sistema robótico de manipulación (108) para mover materiales a o entre módulos; y que comprende un sistema automatizado de manipulación de líquidos (120) para mover líquidos directamente desde uno del módulo de recuperación, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica a otro del módulo de recuperación, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica sin la intervención del usuario.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, módulos, instrumentos y sistemas de procesamiento celular automatizados

Antecedentes

En el siguiente análisis, se describirán determinados artículos y métodos con fines introductorios y de exposición de antecedentes. Nada de lo contenido en el presente documento debe interpretarse como un "reconocimiento" de la técnica anterior. El solicitante se reserva expresamente el derecho de demostrar, en los casos en los que sea apropiado, que los artículos y métodos a los que se hace referencia en el presente documento no constituyen técnica anterior según las disposiciones legales aplicables.

La corrección nucleásica del genoma es un método en el que se realizan cambios en los ácidos nucleicos del genoma de un organismo vivo. Determinadas nucleasas crean roturas bicatenarias específicas del sitio en regiones diana del genoma que se pueden reparar mediante unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga, produciendo correcciones dirigidas. Estos métodos, sin embargo, no han sido compatibles con la automatización debido a las bajas eficiencias y problemas con la transformación celular, la medición del crecimiento y la selección de células. Asimismo, los dispositivos de sobremesa tradicionales no necesariamente aumentan a escala ni se integran bien en un sistema modular automatizado. Por lo tanto, los métodos y sistemas para crear poblaciones celulares corregidas siguen siendo laboriosos, y los desafíos de introducir múltiples series de correcciones utilizando técnicas recursivas han limitado la naturaleza y la complejidad de las poblaciones celulares que se pueden crear.

El documento US 2013/0005025 describe métodos para introducir varios ácidos nucleicos en una célula utilizando un sistema automatizado que incluye un receptáculo, tal como un tubo de microcentrífuga, un tubo de ensayo, una cubeta, un portaobjetos de microscopio, etc., que contiene una célula.

Por lo tanto, existe la necesidad de instrumentos, sistemas y métodos automatizados para introducir ácidos nucleicos ensamblados y otras moléculas biológicas en células vivas de manera automatizada donde las células corregidas puedan usarse para experimentación adicional fuera del instrumento automatizado.

Sumario de realizaciones ilustrativas

En determinadas realizaciones, se utilizan métodos automatizados para la corrección nucleásica del genoma de una o más regiones genómicas diana en múltiples células, realizándose los métodos en instrumentos automatizados de corrección celular multimodulares. Estos métodos se pueden utilizar para generar colecciones de células vivas de interés con los cambios genómicos deseados. Los métodos automatizados llevados a cabo utilizando los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados descritos en el presente documento se pueden utilizar con varias técnicas de corrección nucleásica del genoma, y se pueden utilizar con o sin el uso de uno o más marcadores seleccionables.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona, en realizaciones seleccionadas, módulos, instrumentos y sistemas para la corrección celular multimodular automatizada, incluida la corrección nucleásica del genoma. Otras realizaciones específicas de los instrumentos automatizados de corrección celular multimodulares de la divulgación están diseñadas para la corrección recursiva del genoma, p. ej., la introducción secuencial de múltiples correcciones en genomas dentro de una o más células de una población celular a través de dos o más operaciones de corrección dentro de los instrumentos.

Por tanto, en el presente documento, se proporcionan realizaciones de un instrumento de corrección celular multimodular automatizado que comprende: un alojamiento configurado para contener todos o algunos de los módulos; un receptáculo configurado para recibir células; uno o más receptáculos configurados para recibir ácidos nucleicos; un módulo de transformación configurado para introducir los ácidos nucleicos en las células; un módulo de recuperación configurado para recibir células del módulo de transformación y permitir que las células se recuperen después de la transformación celular en el módulo de transformación; un módulo de corrección nucleásica configurado para permitir que los ácidos nucleicos introducidos corrijan ácidos nucleicos en las células; y un procesador configurado para hacer funcionar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado en función de la entrada del usuario y/o la selección de una secuencia de órdenes preprogramada; un sistema robótico de manipulación para mover materiales hacia o entre los módulos; y que comprende un sistema automatizado de manipulación de líquidos para mover líquidos directamente desde uno del módulo de recuperación, módulo de transformación o módulo de corrección nucleásica a otro del módulo de recuperación, módulo de transformación o módulo de corrección nucleásica sin la intervención del usuario.

En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de uno o más receptáculos comprenden una cadena principal y un casete de corrección, y el instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprende además un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos comprende un imán y, en algunos aspectos, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos está configurado para realizar el ensamblaje utilizando una sola reacción isotérmica. En otros aspectos, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos está configurado para realizar un método de amplificación y/o ligadura.

En algunos aspectos del instrumento de corrección celular multimodular automatizado, el módulo de corrección y el módulo de recuperación están combinados.

En algunos aspectos, el instrumento de corrección celular multimodular automatizado puede también comprender un módulo de crecimiento configurado para cultivar las células y, en algunas implementaciones, el módulo de crecimiento mide la densidad óptica de las células en crecimiento, ya sea de forma continua o a intervalos. En algunas implementaciones, el procesador está configurado para ajustar las condiciones de crecimiento en el módulo de crecimiento de modo que las células alcancen una densidad óptica diana en el momento solicitado por un usuario. Además, en algunas realizaciones, el usuario se puede actualizar con respecto al proceso de crecimiento.

En algunos aspectos, el instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprende un cartucho de reactivos en el que el receptáculo configurado para recibir células y uno o más receptáculos configurados para recibir ácidos nucleicos están contenidos dentro de un cartucho de reactivos. Además, el cartucho de reactivos también puede contener algunos o todos los reactivos necesarios para la corrección celular. En algunas implementaciones, los reactivos contenidos en el cartucho de reactivos son ubicables por una secuencia de órdenes leída por el procesador y, en algunas implementaciones, el cartucho de reactivos incluye reactivos y se proporciona en un kit.

En algunos aspectos, el módulo de transformación del instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprende un dispositivo de electroporación; y, en algunas implementaciones, el dispositivo de electroporación es un dispositivo de electroporación de flujo continuo.

Algunos aspectos del instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprenden además un módulo de filtración configurado para intercambiar líquidos y/o concentrar las células. En aspectos específicos, el sistema de filtración también se puede utilizar para hacer que las células sean electrocompetentes.

En otros casos, se proporciona un instrumento de corrección celular multimodular automatizado en el que el instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprende un alojamiento configurado para alojar algunos o todos los módulos; un receptáculo configurado para recibir células; al menos un receptáculo configurado para recibir una cadena principal de ácido nucleico y un casete de corrección; un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos configurado para a) ensamblar la estructura principal y el casete de corrección; y b) desalinizar los ácidos nucleicos ensamblados después del ensamblaje; un módulo de crecimiento configurado para cultivar las células y medir la densidad óptica (DO) de las células; un módulo de filtración configurado para concentrar las células y volverlas electrocompetentes; un módulo de transformación que comprende un electroporador de flujo continuo para introducir los ácidos nucleicos ensamblados en las células; un módulo combinado de recuperación y corrección configurado para permitir que las células se recuperen después de la electroporación en el módulo de transformación y para permitir que los ácidos nucleicos ensamblados corrijan ácidos nucleicos en las células; y un procesador configurado para hacer funcionar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado en función de la entrada del usuario y/o la selección de una secuencia de órdenes de controlador apropiada.

En algunas implementaciones, el instrumento de corrección celular multimodular automatizado proporciona un cartucho de reactivo que comprende una pluralidad de depósitos de reactivo, un dispositivo de electroporación de flujo continuo y una secuencia de órdenes legible por un procesador para dispensar reactivos ubicados en la pluralidad de depósitos de reactivos y controlar el dispositivo de electroporación de flujo continuo.

En algunos aspectos, el módulo de crecimiento incluye un vial rotatorio de crecimiento con control de temperatura, un ensamblaje del motor para hacer girar el vial, un espectrofotómetro para medir, p. ej., la DO del vial y un procesador para aceptar la entrada de un usuario y controlar la velocidad de crecimiento de las células. El módulo de crecimiento puede medir automáticamente la DO de las células en crecimiento en el vial rotatorio de crecimiento de forma continua o a intervalos establecidos, y controlar el crecimiento de las células hasta una DO diana y un tiempo diana especificado por el usuario. Es decir, los métodos y dispositivos descritos en el presente documento proporcionan un bucle de realimentación que controla el crecimiento celular en tiempo real y ajusta la temperatura del vial rotatorio de crecimiento en tiempo real hasta alcanzar la DO diana en el tiempo diana especificado por el usuario.

En algunos aspectos del instrumento de corrección celular multimodular automatizado, el módulo de transformación comprende un dispositivo de electroporación de flujo continuo, donde el dispositivo de electroporación de flujo continuo comprende una entrada y un canal de entrada para la introducción de la muestra celular y los ácidos nucleicos ensamblados en el dispositivo de electroporación de flujo continuo; una salida y un canal de salida para la salida de la muestra celular electroporada del dispositivo de electroporación de flujo continuo; un canal de flujo que intersecciona con y está situado entre el canal de entrada y el canal de salida; y dos o más electrodos, donde los dos o más electrodos están colocados en el canal de flujo entre la intersección del canal de flujo con el primer canal de entrada y la intersección del canal de flujo con el canal de salida, en comunicación fluida con la muestra celular en el canal de flujo, y configurados para aplicar un impulso eléctrico o impulsos eléctricos a la muestra celular. En aspectos específicos, el dispositivo de electroporación de flujo continuo puede comprender dos o más canales de flujo en paralelo.

También se describen sistemas para utilizar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado para implementar operaciones de corrección genómica dentro de las células. Estos sistemas pueden incluir opcionalmente una o más interfaces entre el instrumento y otros dispositivos o receptáculos para la preparación de células, la preparación de ácidos nucleicos, la selección de poblaciones celulares corregidas, el análisis funcional de poblaciones celulares corregidas, el almacenamiento de poblaciones celulares corregidas, y similares.

Adicionalmente, se describen métodos para utilizar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado. En algunos métodos, las células electrocompetentes se describen directamente en el instrumento, preferentemente a una densidad óptica deseada, y se transfieren a un módulo de transformación. En algunos métodos, las células se transfieren a un módulo de crecimiento, donde se cultivan hasta una densidad óptica deseada. A continuación, las células se transfieren del vial de crecimiento a un módulo de filtración donde se concentran y, opcionalmente, se vuelven electrocompetentes. A continuación, las células se transfieren a un módulo de transformación.

En algunos aspectos, los casetes de ácidos nucleicos ensamblados se proporcionan directamente al instrumento y se transfieren a un módulo de transformación. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos, tales como una cadena principal de vector y uno o más casetes de corrección de oligonucleótidos se transfieren a un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos de forma simultánea o secuencial con la introducción o preparación de las células. En este aspecto, los ácidos nucleicos se ensamblan, se desalinizan (p. ej., a través de un intercambio de líquidos u ósmosis) y se transfieren al módulo de transformación para electroporarse en las células electrocompetentes. La electroporación o transfección tiene lugar en el módulo de transformación, a continuación, las células se transfieren a un módulo de recuperación/corrección que, opcionalmente, incluye la selección de las células que contienen una o más correcciones genómicas. Tras la recuperación/corrección/selección, las células se pueden extraer y utilizar directamente para la investigación o se pueden almacenar para futuras investigaciones, o se puede realizar otra serie (o varias series) de corrección genómica repitiendo las etapas de corrección dentro del instrumento.

También se describen colecciones de células creadas utilizando un instrumento de corrección celular multimodular automatizado para la corrección nucleásica del genoma, donde el instrumento comprende: un alojamiento; un receptáculo configurado para recibir células y uno o más ácidos nucleicos diseñados racionalmente que comprenden secuencias para facilitar las actividades de corrección nucleásica del genoma en las células; un módulo de transformación para la introducción del (de los) ácido(s) nucleico(s) en las células; un módulo de corrección para permitir que se produzcan las actividades de corrección nucleásica del genoma en las células, y un procesador configurado para hacer funcionar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado en función de la entrada del usuario, en donde las actividades de corrección nucleásica del genoma creadas por el instrumento automatizado producen una colección de células que comprende células individuales con correcciones diseñadas racionalmente.

En algunos casos, la colección de células comprende una colección de células de mutagénesis por saturación. En algunos casos, la colección de células comprende una colección de células de intercambio de promotores. En otros casos, la colección de células comprende una colección de células de intercambio de finalizadores. En otros casos más, la colección de células comprende una colección de células de intercambio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, Single Nucleotide Polymorphism). En otros casos más, la colección de células comprende una colección de células de intercambio de promotores.

En algunas implementaciones, la colección comprende al menos 100.000 células corregidas y, en otras implementaciones, la colección comprende al menos 1.000.000 de células corregidas.

En algunas implementaciones, la corrección nucleásica del genoma es una corrección del genoma RGN (RNA-Guided Nuclease, nucleásica guida por ARN). En un caso preferido, el instrumento está configurado para el uso de una nucleasa inducible. La nucleasa puede ser, p. ej., inducida químicamente, inducida por virus, fotoinducida, inducida por la temperatura o inducida por calor.

En algunas implementaciones, el instrumento proporciona una corrección multiplexada del genoma de múltiples células en un solo ciclo. En algunos casos, el instrumento tiene la capacidad de corregir el genoma de al menos 5 células en un solo ciclo. En otros casos, el instrumento tiene la capacidad de corregir el genoma de al menos 100 células en un solo ciclo. En otros casos más, el instrumento tiene la capacidad de corregir el genoma de al menos 1000 células en un solo ciclo. Incluso en otros casos, el instrumento tiene la capacidad de corregir el genoma de al menos 10.000 células en un solo ciclo. En casos específicos, los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados tienen la capacidad de corregir el genoma de al menos 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 o más células en un solo ciclo.

El número de sitios genómicos de una población de células que se pueden seleccionar para corregir en un solo ciclo puede estar entre 2 y 10.000.000.

En algunos casos que implican la corrección recursiva, el instrumento de corrección celular multimodular automatizado proporciona la introducción de dos o más correcciones del genoma en las células, con una sola corrección del genoma añadida a los genomas de la población celular para cada ciclo. Por consiguiente, en algunos casos, los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la presente divulgación son útiles para proporcionar secuencialmente dos o más correcciones por célula de una población de células por ciclo, tres o más correcciones por célula de una población de células, cinco o más correcciones por célula de una población, o 10 o más correcciones por célula en un solo ciclo para una población de células.

En casos específicos, el instrumento de corrección celular multimodular automatizado puede proporcionar una eficiencia de corrección de al menos el 10% de las células introducidas en el módulo de corrección por ciclo, preferentemente una eficiencia de corrección de al menos el 20 % de las células introducidas en el módulo de corrección por ciclo, más preferentemente una eficiencia de corrección de al menos el 25 % de las células introducidas en el módulo de corrección por ciclo, aún más preferentemente una eficiencia de corrección de al menos el 30 % de las células introducidas en el módulo de corrección del instrumento de corrección celular multimodular automatizado por ciclo, aún más preferentemente una eficiencia de corrección de al menos el 40 % de las células introducidas en el módulo de corrección por ciclo y, aún más preferentemente, el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de las células introducidas en el módulo de corrección por ciclo.

Otras características, ventajas y aspectos se describirán más adelante con más detalle.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen parte de la memoria descriptiva, ilustran una o más realizaciones y, junto con la descripción, explican estas realizaciones. Los dibujos adjuntos no han sido necesariamente realizados a escala. Las dimensiones de cualquier valor que se ilustra en los gráficos y en las figuras adjuntos son solo para fines ilustrativos, y pueden o no representar valores o dimensiones reales o preferidos. Cuando sea aplicable, puede que no se ilustre alguna o que no se ilustren todas las características para ayudar en la descripción de las características subyacentes. En los dibujos:

Las FIG. 1A y 1B representan vistas en planta y en perspectiva de una realización ilustrativa de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado para la corrección multiplexada del genoma de múltiples células utilizando uno o más cartuchos reemplazables como parte del instrumento.

Las FIG. 2A y 2B representan vistas laterales y frontales del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado de las FIG. 1A y 1B.

Las FIG. 2C y 2D representan un segundo bastidor ilustrativo de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 3A-3C representan vistas laterales, en corte y en perspectiva de un módulo de lavado y/o concentración de células ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 4 representa un módulo combinado ilustrativo de ensamblaje de ácidos nucleicos y purificación para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 5A representa un módulo de electroporación en línea ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 5B y 5C representan un módulo de electroporación de flujo continuo desechable ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 6A-6B representan un cartucho de lavado ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 6C-6E representan un cartucho de reactivo ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 7A-7C proporcionan un diagrama de bloques funcional y dos vistas en perspectiva de un módulo de filtración ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 7D es una vista en perspectiva de un cartucho de filtros ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Las FIG. 8A-8F representan módulos de crecimiento celular ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 9 es un diagrama de flujo de un método ilustrativo para el procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 10A es un diagrama de flujo de un primer flujo de trabajo ilustrativo para el procesamiento automatizado de células bacterianas mediante un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 10B es un diagrama de flujo de un segundo flujo de trabajo ilustrativo para el procesamiento automatizado de células bacterianas mediante un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 10C es un diagrama de flujo de un flujo de trabajo ilustrativo para el procesamiento celular automatizado de células de levadura mediante un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 11 ilustra una interfaz gráfica de usuario ilustrativo para proporcionar instrucciones y recibir información de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

La FIG. 12A es un diagrama de sistema de bloques funcionales de otra realización ilustrativa de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado para la corrección multiplexada del genoma de múltiples células. La FIG. 12B es un diagrama de sistema de bloques funcionales de otra realización ilustrativa más de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado para la corrección multiplexada, recursiva, del genoma de múltiples células.

La f Ig .13 es un sistema de control ilustrativo para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodal automatizado.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

La descripción que se establece a continuación en relación con los dibujos adjuntos pretende ser una descripción de diferentes realizaciones ilustrativas de la materia objeto desvelada. Las características y funcionalidades específicas se describen en relación con cada realización ilustrativa; sin embargo, será evidente para los expertos en la materia que las realizaciones desveladas pueden ponerse en práctica sin cada una de esas características y funcionalidades específicas.

La práctica de las técnicas descritas en el presente documento puede emplear las técnicas establecidas en Green, et al., Eds. (1999), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series" (Vol. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), "Genetic Variation: A Laboratory Manual"; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), "PCR Primer: A Laboratory Manual"; Bowtell y Sambrook (2003), "Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis"; Sambrook y Russell (2006), "Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; y Green y Sambrook, ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 4.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4.a ed.) W. H. Freeman, Nueva York, NY.; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, Londres; Nelson y Cox (2000), Lehninger, "Principles of Biochemistry" 3.a Ed., W. H. Freeman Pub., Nueva York, N.Y.; y Berg et al. (2002) "Biochemistry", 5.a Ed., W. H. Pub Freeman, Nueva York, N.Y.

Cabe destacar que, como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un oligonucleótido" se refiere a uno o más oligonucleótidos que cumplen la misma función, a "los métodos" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la materia, etc. Es decir, a menos que se especifique lo contrario, como se utilizan en el presente documento, los términos "un", "una", "el/la" tienen el significado de "uno/a o más". Adicionalmente, se ha de entender que los términos tales como "izquierdo/a", "derecho/a", "encima", "debajo", "delantero/a", "posterior", "lateral", "altura", "longitud", "ancho", "superior", "inferior", "interior", "exterior", "interno/a", "externo/a" que se pueden utilizar en el presente documento simplemente describen puntos de referencia y no limitan necesariamente las realizaciones de la presente divulgahción a una orientación o configuración en particular. Por otra parte, los términos tales como "primero/a", "segundo/a", "tercero/a", etc., simplemente identifican una de una serie de partes, componentes, etapas, operaciones, funciones y/o puntos de referencia desvelados en el presente documento, y tampoco limitan necesariamente las realizaciones de la presente divulgación a una configuración u orientación en particular.

Por otra parte, los términos "aproximadamente", "próximo", "menor", y términos similares

generalmente se refieren a intervalos que incluyen el valor identificado dentro de un margen del 20 %, 10 % o preferentemente 5 % en determinadas realizaciones, y cualquier valor intermedio.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor afirmado o intermedio en este intervalo se incluye dentro de la divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están englobados dentro de la divulgación, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la divulgación los intervalos que excluyen cualquiera de ambos de esos límites incluidos.

La referencia a lo largo de la memoria descriptiva a "una realización" o "en cualquier realización"

significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con una

realización está incluida en al menos una realización de la materia objeto desvelada. Por tanto, la aparición de las expresiones "en una realización" o "en cualquier realización" en diferentes lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren todas necesariamente a la misma realización.

Además, los rasgos distintivos, las estructuras o las características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. Además, se pretende que las realizaciones de la materia objeto desvelada cubran modificaciones y variaciones de la misma.

Introducción y visión general

En realizaciones seleccionadas, los instrumentos, sistemas y métodos de corrección celular multimodulares automatizados descritos en el presente documento se pueden utilizar en la corrección multiplexada del genoma en células vivas, así como en métodos para construir colecciones de poblaciones celulares corregidas. Los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados desvelados en el presente documento se pueden utilizar con varias técnicas de corrección del genoma y, en particular, con la corrección nucleásica del genoma. Los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación proporcionan métodos novedosos para introducir secuencias de ácido nucleico dirigidas a sitios genómicos para corregir el genoma de células vivas, incluyendo métodos para construir colecciones que comprenden diferentes clases de correcciones genómicas en regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados son especialmente adecuados para la introducción de correcciones en el genoma en diferentes células en un solo ciclo, generando así colecciones de células que tienen una o más correcciones del genoma de una manera multiplexada automatizada. Los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados también son adecuados para introducir dos o más correcciones, p. ej., correcciones en diferentes sitios genómicos diana en células individuales de una población celular. Ya sea una o muchas, estas correcciones del genoma son preferentemente correcciones diseñadas racionalmente; es decir, ácidos nucleicos que están diseñados y creados para introducir correcciones específicas en regiones diana dentro del genoma de una célula. Las secuencias utilizadas para facilitar las actividades de corrección del genoma incluyen secuencias que ayudan a guiar la escisión de la nucleasa, la introducción de una corrección del genoma en una región de interés y/o ambas. Estas secuencias también pueden incluir una corrección de una región del genoma de la célula para permitir el seguimiento de la corrección específica diseñada racionalmente en el genoma de la célula. Dichos métodos de introducción de correcciones en las células se enseñan, p. ej., en la patente de EE.UU. n.° 9.982.278, titulada "CRISPR enabled multiplexed genome engineering", por Gill et al., y la patente de EE. UU. n.° 10.017.760, número de serie de la solicitud 15/632.222, titulada "Methods for generating barcoded combinatorial libraries", concedida a Gill et al.

Dichos ácidos nucleicos y oligonucleótidos (u "oligos") pretenden incluir, pero sin limitación, una forma polimérica de nucleótidos que puede tener diferentes longitudes, incluyendo bien desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ácidos nucleicos y los oligonucleótidos para usar en las realizaciones ilustrativas se pueden modificar en una o más posiciones para potenciar la estabilidad introducida durante la síntesis química o la modificación enzimática posterior o la copia de la polimerasa. Estas modificaciones incluyen, pero sin limitación, la inclusión de uno o más ácidos nucleicos alquilados, ácidos nucleicos bloqueados (ACB), ácidos peptidonucleicos (APN), fosfonatos, fosfotioatos en el oligómero. Los ejemplos de nucleótidos modificados incluyen, pero sin limitación, 5-mercaptoetanol, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, p-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, p-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-D46-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Las moléculas de ácido nucleico también pueden modificarse en el resto de base, el resto de azúcar o la estructura principal de fosfato.

Corrección nucleásica del genoma

En realizaciones seleccionadas, los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados descritos en el presente documento utilizan un sistema de corrección nucleásica del genoma. Existen múltiples sistemas diferentes a base de nucleasas para proporcionar correcciones en el genoma de un organismo, y cada uno puede utilizarse en sistemas de corrección individuales, sistemas de corrección secuenciales (p. ej., el uso de diferentes sistemas nucleásicos de forma secuencial para proporcionar dos o más correcciones del genoma en una célula) y/o sistemas de corrección recursivos, (p. ej., utilizando un solo sistema nucleásico para introducir dos o más correcciones del genoma en una célula). En el presente documento, se describen ejemplos de sistemas de corrección nucleásica del genoma, aunque un experto en la materia reconocería al leer la presente divulgación que también son útiles otros sistemas de corrección dirigidos por enzimas en los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas.

Cabe señalar que los sistemas automatizados que se exponen en el presente documento pueden utilizar las nucleasas para la escisión del genoma y la introducción de una corrección en una región genómica diana utilizando un instrumento de la divulgación.

En aspectos particulares de las realizaciones ilustrativas, el sistema de corrección nucleásica es un sistema inducible que permite el control de la sincronización de la corrección. El sistema inducible puede incluir expresión inducible de la nucleasa, expresión inducible de los ácidos nucleicos de la corrección o ambas. La capacidad de modular la actividad de la nucleasa puede reducir la escisión fuera de la diana y facilitar la genomodificación exacta del genoma. Se pueden utilizar numerosos sistemas inducibles diferentes con los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación, como será evidente para un experto en la materia a la vista de la presente divulgación.

En determinados aspectos, la escisión por una nucleasa también se puede utilizar con los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas para seleccionar células con una corrección genómica en una región diana. Por ejemplo, se pueden seleccionar células que se hayan sometido a una corrección genómica que elimine un sitio de reconocimiento de nucleasa en particular (p. ej., a través de la recombinación homóloga) utilizando los instrumentos y sistemas de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas exponiendo las células a la nucleasa tras dicha corrección. El ADN de las células sin la corrección del genoma se escindirá y, posteriormente, tendrá un crecimiento limitado y/o perecerá, mientras que las células que recibieron la corrección del genoma eliminando el sitio de reconocimiento de nucleasa no se verán afectadas por la exposición posterior a la nucleasa.

Si la célula o población de células incluye una nucleasa guiada por ácido nucleico que codifica ADN que es inducida por una molécula inductora, la nucleasa se expresará únicamente en presencia de la molécula inductora. Como alternativa, si la célula o población de células incluye una nucleasa guiada por ácido nucleico que codifica ADN que es reprimida por una molécula represora, la nucleasa se expresará únicamente en ausencia de la molécula represora.

Por ejemplo, se han descrito sistemas inducibles para la corrección utilizando nucleasas guiadas por ARN, que utilizan la inducción química para limitar la exposición temporal de las células a la nucleasa guiada por ARN. (Publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2015/0291966 A1 de Zhang et al., titulada "Inducible DNA Binding Proteins and Genome Perturbation Tools and Applications Thereof', presentada el 23 de enero de 2015; véanse tambiénlos vectores de expresión lentivíricos inducibles disponibles en Horizon/Dharmaeon. Lafayette, CO. Para técnicas adicionales, véase, p. ej., Campbe l. L., "Targeting protein function: the expanding toolkit for conditional disruption" Biochem J., 473(17): 2573-2589 (2016).

En otros ejemplos, se puede usar una nucleasa inducible por virus para inducir la corrección de genes en las células. Véase, p. ej., Dong, "Establishment of a highly efficient virus-inducible CRISPR/Cas9 system in insect cells", Antiviral Res., 130:50-7 (2016). En otro ejemplo, para la expresión inducible de nucleasas dirigidas por ácidos nucleicos, las variantes se pueden activar y desactivar en células de mamíferos con 4-hidroxitamoxifeno (4-HT) al fusionar la nucleasa con el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógeno (ERT2, Estrogen Receptor). (Liu, et al., Nature Chemical Biology, 12:980-987 (2016) y véase la publicación de solicitud de patente internacional WO 2017/078631 A1 de Tan, titulada "Chemical-Inducible Genome Engineering Technology", presentada el 7 de noviembre de 2016.

Adicionalmente, se han desarrollado varios sistemas de control de la regulación génica para la expresión controlada de genes en las células, tanto procariotas como eucariotas. Estos sistemas incluyen el sistema de activación de la transcripción controlado por tetraciclina (Tet-On/Tet-Off, Clontech, Inc. (Palo Alto, CA), el sistema Lac Switch Inducible (Patente de EE. UU. n.° 4.833.080 de Brent et al., titulada "Regulation of eucaryotic gene expression"), el sistema de expresión génica inducible por ecdisona (No et al., "Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice", PNAS, 93(8):3346-3351 (1996)), y el sistema de cambio de genes cumate (Mullick, et al., "The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells", BMC Biotechnology, 6:43 (2006)).

Las células que se pueden corregir utilizando los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas incluyen cualquier célula procariota, arqueal o eucariota. Por ejemplo, las células procarióticas para usar con las presentes realizaciones ilustrativas pueden ser células bacterianas gram positivas, p. ej., Bacillus subtilis, o células bacterianas gram negativas, p. ej., células de E. coli. Las células eucariotas para usar con los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas incluyen cualquier célula vegetal y cualquier célula animal, p. ej. células fúngicas, células de insecto, células de anfibios, células de nematodos o células de mamíferos.

Corrección del genoma de nucleasa con dedos de cinc

En realizaciones seleccionadas, los instrumentos de corrección celular multimodular automatizados descritos en el presente documento realizan la corrección del genoma de nucleasa con dedos de cinc. Las nucleasas con dedos de cinc (ZFN, Zinc-Finger Nucleases) son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión a ADN con dedos de cinc con un dominio de escisión de ADN. Los dominios con dedos de cinc se pueden genomodificar para regiones específicas de la diana en el genoma de un organismo. (Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 11:636-646 (2010); publicación de solicitud de patente internacional WO 2003/087341 A2 de Carroll et al., titulada "Targeted Chromosomal Mutagenesis Using Zinc Finger Nucleases", presentada el 22 de enero de 2003). Usando la maquinaria de reparación de ADN endógeno de un organismo, se pueden utilizar ZFN para alterar con precisión una región diana del genoma. Las ZFN se pueden utilizar para desactivar mutaciones dominantes en individuos heterocigotos al producir roturas bicatenarias ("DSB", Double-Strand Breaks) en el ADN del alelo mutante, que, en ausencia de un molde homólogo, serán reparadas mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ, Non-Homologous End-Joining). La NHEJ repara los DSB uniendo los dos extremos y, por lo general, no produce mutaciones, siempre que el corte sea limpio y sin complicaciones. (Durai et al., "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells", Nucleic Acids Res., 33(18):5978-90 (2005)). Este mecanismo de reparación se puede utilizar para inducir errores en el genoma a través de indels o reordenamiento cromosómico, volviendo no funcionales, a menudo, los productos genéticos codificados en esa ubicación.

Como alternativa, se puede introducir ADN en un genoma en presencia de fragmentos de ADN bicatenario exógenos mediante la reparación dependiente de la homología (HDR, Homology Dependent Repair). Se puede aprovechar la dependencia de la HDR en una secuencia homóloga para reparar las DSB mediante la inserción de una secuencia deseada dentro de una secuencia que sea homóloga a las secuencias flanqueantes de una DSB que, cuando se utiliza ^{como molde por el sistema de}hDr, ^{conduce a la creación del cambio deseado dentro de la región genómica de}interés.

También se pueden utilizar varios pares de ZFN para eliminar por completo grandes segmentos enteros de secuencia genómica (Lee et al., Genome Res., 20 (1): 81-9 (2009); y publicación de solicitud de patente de EE. UU.2011/0082093 A1 de Gregory et al. titulada "Methods and Compositions for Treating Trinucleotide Repeat Disorders", presentada el 28 de julio de 2010). Los tramos de repetición CAG/CTG expandidos son la base genética de más de una docena de trastornos neurológicos hereditarios, incluida la enfermedad de Huntington, distrofia miotónica y varias ataxias espinocerebelosas. Se ha demostrado en células humanas que las ZFN pueden dirigir las DSB a repeticiones CAG y reducir la repetición de longitudes patológicas largas a longitudes cortas menos tóxicas (Mittelman, et al., Las roturas bicatenarias dirigidas por dedos de cinc dentro de los tramos repetidos CAG potencian la inestabilidad repetida en las células humanas, PNAS, EE.UU., 106 (24): 9607-12 (2009); y publicación de solicitud de patente de EE. UU.

2013/0253040 A1 de Miller et al. titulada "Methods and Compositions for Treating Huntington's Disease", presentada el 28 de febrero de 2013).

Corrección meganucleásica del genoma

En realizaciones seleccionadas, los módulos, instrumentos y sistemas de corrección celular multimodulares automatizados descritos en el presente documento realizan la corrección meganucleásica del genoma. Las meganucleasas se identificaron en la década de los 90 del siglo pasado, y el trabajo posterior ha demostrado que son herramientas particularmente prometedoras para la corrección del genoma, ya que son capaces de inducir eficientemente la recombinación homóloga, generar mutaciones en regiones codificantes o no codificantes del genoma, y alterar los marcos de lectura de las regiones codificantes de los genomas. (Véase, p. ej., Epinat, et al., "A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in eukaryotic cells, p. ej., yeast and mammalian cells", Nucleic Acids Research, 31(11): 2952-2962; y la patente de EE. UU. n.° 8.921.332 de Choulika et al. titulada "Chromosomal Modification Involving the Induction of Double-stranded DNA Cleavage and Homologous Recombination at the Cleavage Site", presentada el 30 de diciembre de 2014). La alta especificidad de las meganucleasas les da un alto grado de precisión y una toxicidad celular mucho menor que otras enzimas de restricción naturales.

Corrección de nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción

En realizaciones seleccionadas, los módulos, instrumentos y sistemas de corrección celular multimodulares automatizados descritos en el presente documento realizan la corrección con nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción. Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nucleases) son enzimas de restricción que se pueden genomodificar para cortar secuencias específicas de ADN. Se fabrican fusionando un dominio de unión al ADN efector de tipo activador de la transcripción con un dominio de escisión del ADN (una nucleasa que corta las cadenas de ADN). Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) se pueden genomodificar para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada, así que, cuando se combina con una nucleasa, el ADN se puede cortar en lugares específicos. (Véase, p. ej., Miller, et al., " TALE nuclease architecture for efficient genome editing" Nature Biotechnology, 29 (2): 143-8 (2011); Boch, Nature Biotech., "TALEs of genome targeting", 29(2): 135-6 (2011); publicación de solicitud de patente internacional WO 2010/079430 A1 de Bonas et al. titulada "Modular DNA-binding Domains and Methods of Use", presentada el 12 de enero de 2010; publicación de solicitud de patente internacional WO 2011/072246 A2 de Voytas et al. titulada "TAL ^{Effector-Mediated}DnA ^{Modification", presentada el 10 de diciembre de 2010).}

Como las ZFN, las TALEN pueden corregir genomas induciendo DSB. Las DSB específicas del sitio creadas por las TALEN en las regiones diana se reparan a través de NHEJ o HDR, produciendo correcciones del genoma específicas. Las TALEN se pueden utilizar para introducir indels, reordenamientos, o para introducir ADN en un genoma a través de NHEJ en presencia de fragmentos de ADN bicatenario exógenos.

Corrección nucleásica guiada por ARN (RGN)

En determinados aspectos, la corrección del genoma de los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas utilizan técnicas de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), en las que se utilizan nucleasas guiadas por ARN (RGN) para corregir regiones diana específicas del genoma de un organismo. Al suministrarse la RGN en forma de complejo con un ARN guía sintético (ARNg) en una célula, el genoma de la célula se puede cortar en la ubicación deseada, permitiendo correcciones en la región diana del genoma. El ARN guía ayuda a las proteínas RGN a reconocer y cortar el ADN de la región del genoma diana. Mediante la manipulación de la secuencia de nucleótidos del ARN guía, se podría programar el sistema RGN para dirigirse a cualquier secuencia de ADN para la escisión.

El sistema RGN utilizado con los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas puede realizar la corrección del genoma utilizando cualquier sistema de nucleasa guiada por ARN con la capacidad tanto de cortar como de pegar en una región genómica diana deseada. En determinados aspectos, el sistema de nucleasa guiada por ARN puede utilizar dos moléculas de ARN separadas como ARNg, p. ej., un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARN de CRISPR transactivador (ARNtracr). En otros aspectos, el ARNg puede ser un solo ARNg que incluye las secuencias ARNcr y ARNtracr.

En determinados aspectos, la corrección del genoma introduce un cambio de ADN deseado en una región diana y elimina la región del motivo proto-espaciador (PAM, Proto-spAcer Motif) de la región diana, impidiendo así cualquier corrección adicional del genoma en esa región diana, p. ej., tras la exposición a una nucleasa guiada por ARN que forma un complejo con un ARNg sintético complementario a la región diana. En este aspecto, una primera actividad de corrección puede ser, p. ej., una actividad de corrección dirigida por RGN o una actividad de recombinación homóloga, y las células que tienen la corrección deseada pueden seleccionarse utilizando una RGN que forme un complejo con un ARNg sintético complementario a la región diana. Las células que no se sometieron a la primera actividad de corrección se eliminarán y, por lo tanto, no seguirán siendo viables según los criterios de selección apropiados. Las células que contienen la mutación deseada no se cortarán, ya que ya no contendrán el sitio PAM necesario, y seguirán creciendo y propagándose en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado.

Cuando se utiliza el sistema de proteínas RGN para la selección, es principalmente la actividad de corte lo que se necesita; por lo tanto, el sistema de proteínas nucleasas guiadas por ARN puede ser el mismo que se use para corregir, o puede ser un sistema de proteínas RGN que sea eficiente en el corte utilizando un sitio PAM particular, pero no necesariamente eficiente en la corrección en el sitio. Un aspecto importante de la nucleasa utilizada para la selección es el reconocimiento del sitio PAM que se reemplaza utilizando el enfoque de corrección de la operación de corrección genómica anterior.

Corrección del genoma mediante recombinación homologa

En otros aspectos, la corrección del genoma de los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de las realizaciones ilustrativas puede utilizar métodos de recombinación homóloga que incluyen la técnica cre-lox y la técnica FRET. La recombinación homóloga específica del sitio difiere de la recombinación homóloga general en que las secuencias de ADN específicas cortas, que son necesarias para el reconocimiento de la recombinasa, son los únicos sitios en los que se produce la recombinación. La recombinación específica del sitio requiere recombinasas especializadas para reconocer los sitios y catalizar la recombinación en estos sitios. Se ha demostrado el funcionamiento de varios sistemas de recombinación específicos del sitio derivados de bacteriófagos y levaduras, comprendiendo cada uno una recombinasa y sitios afines específicos, en células eucariotas con el fin de la integración del ADN y, por lo tanto, son aplicables para usar en la presente invención, y estos incluyen el bacteriófago PI Cre/lox, el sistema FLP-FRT de levadura y el sistema Dre de la familia de tirosinas de recombinasas específicas del sitio. Dichos sistemas y métodos de uso se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 7.422.889; 7.112.715; 6.956.146; 6.774.279; 5.677.177; 5.885.836; 5.654.182; y 4.959.317, que enseñan métodos de uso de dichas recombinasas. Otros sistemas de la familia de las tirosinas tales como el bacteriófago A Int integrasa, integrasa HK2022 y, además, sistemas que pertenecen a la familia separada de serinas de recombinasas tales como el bacteriófago phiC31, integrasas R4Tp901 son conocidos por funcionar en células de mamífero utilizando sus respectivos sitios de recombinación, y también son aplicables para usar en la presente invención. Algunos ejemplos de metodologías para la recombinación homóloga se describen en las patentes de EE.UU. n.°. 6.689.610; 6.204.061; 5.631.153; 5.627.059; 5.487.992; y 5.464.764.

Arquitectura del instrumento

Las FIG. 1A y 1B representan un ejemplo de un instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado que utiliza materiales de origen a base de cartuchos (p. ej., reactivos, enzimas, ácidos nucleicos, soluciones de lavado, etc.). El instrumento 100, por ejemplo, puede diseñarse como un instrumento de sobremesa para usar en un entorno de laboratorio. El instrumento 100 puede tener incorporada una mezcla de elementos reutilizables y desechables para realizar diferentes operaciones por fases en la realización de la escisión y/o corrección automatizadas del genoma en las células. Los materiales de origen a base de cartuchos, por ejemplo, puede colocarse en zonas designadas de una plataforma 102 del instrumento 100 para el acceso por parte de un instrumento robótico de manipulación 108. Como se ilustra en la FIG. 1B, la plataforma 102 puede incluir un sumidero de protección de manera que los contaminantes que se derramen, goteen o se desborden de cualquiera de los módulos del instrumento 100 estén contenidos por dentro de un borde del sumidero de protección.

Volviendo a la FIG. 1A, el instrumento 100, en algunas implementaciones, incluye un cartucho de reactivos 104 para introducir muestras de ADN y otros materiales de origen en el instrumento 100, un cartucho de lavado 106 para introducir eluyente y otros materiales de origen en el instrumento 100, y un sistema robótico de manipulación 108 para mover materiales entre receptáculos de cartuchos (por ejemplo, receptáculos de cartuchos 104 y 106) de los módulos (por ejemplo, módulos 110a, 110b y 110c) y unidades de almacenamiento (p. ej., unidades 112, 114, 116 y 118) del instrumento 100 para realizar la escisión y/o corrección automatizadas del genoma. Una vez finalizado el procesamiento del suministro celular 106, en algunas realizaciones, las células resultantes pueden ser transferidas por el instrumento robótico de manipulación 108 a una unidad de almacenamiento o receptáculo colocada en, p. ej., cartucho de reactivos 104 o cartucho de lavado 106 para su almacenamiento temporal y su recuperación posterior.

El sistema robótico de manipulación 108, por ejemplo, puede incluir una bomba 120 de desplazamiento de aire para transferir líquidos desde las diferentes fuentes de material de los cartuchos 104, 106 a los diferentes módulos 110 y a la unidad de almacenamiento, que puede ser un receptáculo del cartucho de reactivos 104 o del cartucho de lavado 106. En otras realizaciones, el sistema robótico de manipulación 108 puede incluir un cabezal de recogida y colocación (no ilustrado) para transferir recipientes de materiales de origen (p. ej., tubos o viales) desde el cartucho de reactivos 104 y/o el cartucho de lavado 106 a los diferentes módulos 110. En algunas realizaciones, una o más cámaras u otros sensores ópticos (no mostrados) confirman el movimiento y la posición adecuados del aparato de manipulación robótico a lo largo de un pórtico 122.

En algunas realizaciones, el sistema robótico de manipulación 108 utiliza puntas de transferencia desechables proporcionadas en un suministro de puntas de transferencia 116 (p. ej., soporte de puntas de pipeta) para transferir materiales de origen, reactivos (p. ej., ensamblaje de ácidos nucleicos) y células dentro del instrumento 100. Las puntas de transferencia 116 usadas, por ejemplo, puede desecharse en una unidad 112 de residuos sólidos. En algunas implementaciones, la unidad 112 de residuos sólidos contiene un nivelador para quitar los tubos, las puntas, los viales y/o los filtros del cabezal de recogida y colocación del sistema robótico de manipulación 108. Por ejemplo, como se ilustra, el sistema robótico de manipulación 108 incluye un cabezal 124 de recogida de filtros.

En algunas realizaciones, el instrumento 100 incluye cubetas electroporadoras con succionadores que se conectan a la bomba 120 de desplazamiento de aire. En algunas implementaciones, las células y el reactivo se aspiran en la cubeta de electroporación a través de un succionador, y la cubeta se mueve a uno o más módulos 110 del instrumento 100.

En algunas implementaciones, el instrumento 100 está controlado por un sistema de procesamiento 126 tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. El sistema de procesamiento 126 puede configurarse para hacer funcionar el instrumento 100 en función de la entrada del usuario. Por ejemplo, la entrada del usuario puede ser recibida por el instrumento 100 a través de un sistema de representación 128 en pantalla táctil. El sistema de procesamiento 126 puede controlar la cronología, duración, temperatura y otras operaciones de los diferentes módulos 110 del instrumento 100. Volviendo a la FIG. 1B, el sistema de procesamiento 126 puede estar conectado a una fuente de alimentación 150 para el funcionamiento del instrumento 100.

Volviendo a la FIG. 1A, el cartucho de reactivos 104, como se ilustra, incluye dieciséis depósitos (una matriz de 5 x 3 depósitos, más un depósito adicional) y un módulo de transformación 110c de flujo continuo (dispositivo de electroporación). El cartucho de lavado 106 puede configurarse para alojar tubos grandes o depósitos para almacenar, por ejemplo, soluciones de lavado, o soluciones que se utilizan con frecuencia a lo largo de un proceso iterativo. Además, en algunas realizaciones, el cartucho de lavado 106 puede incluir varios tubos, viales o depósitos más pequeños para retener volúmenes más pequeños de, p. ej., medios de origen, así como un receptáculo o repositorio para células corregidas. Por ejemplo, el cartucho de lavado 106 puede configurarse para permanecer en su sitio cuando se usen y reemplacen secuencialmente dos o más cartuchos de reactivos 104. Aunque el cartucho de reactivos 104 y el cartucho de lavado 106 se muestran en la FIG. 1A como cartuchos separados, en otras realizaciones, el contenido del cartucho de lavado 106 puede incorporarse al cartucho de reactivos 104. En realizaciones adicionales, se pueden cargar tres o más cartuchos en el instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado. En determinadas realizaciones, el cartucho de reactivos 104, el cartucho de lavado 106 y otros componentes de los módulos 110 del instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado se envasan conjuntamente en un kit.

Los cartuchos 104, 106 de reactivos y de lavado, en algunas implementaciones, son kits desechables proporcionados para usar en el instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, el usuario puede abrir y colocar cada uno de los cartuchos de reactivos 104 y el cartucho de lavado 106 dentro de un bastidor del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado antes de activar el procesamiento celular. Los bastidores ilustrativos se analizan con mayor detalle a continuación en relación con las FIG. 2A a 2D.

Los componentes de los cartuchos 104, 106, en algunas implementaciones, están marcados con indicaciones legibles por máquina, tales como códigos de barras, para el reconocimiento por parte del sistema robótico de manipulación 108. Por ejemplo, el sistema robótico de manipulación 108 puede escanear recipientes dentro de cada uno de los cartuchos 104, 106 para confirmar el contenido. En otras implementaciones, se pueden marcar indicaciones legibles por máquina sobre cada cartucho 104, 106, y el sistema de procesamiento del instrumento 100 de procesamiento celular multimodular puede identificar un mapa de materiales almacenados en función de las indicaciones legibles por máquina.

Volviendo a las FIG. 6A-6B, en algunas realizaciones, el cartucho de lavado 106 es un cartucho de lavado 600 que incluye un par de botes grandes 602, un conjunto de cuatro tubos pequeños 604 y un tubo grande 606 sostenido en un cuerpo 608 de cartucho. Cada uno de las botes 602 y tubos 604, 606, en algunas realizaciones, está sellado con una lámina de aluminio perforable para el acceso por parte de un sistema automatizado de manipulación de líquidos, tal como un succionador o una pipeta. En otras realizaciones, cada uno de los botes 602 y los tubos 604, 606 incluye una junta de acceso sellable. La parte superior de cada uno de los botes 602 y los tubos 604, 606, en algunas realizaciones, está marcada con indicaciones legibles por máquina (no ilustradas) para la identificación automática de los contenidos.

En algunas realizaciones, cada uno de los botes grandes 602 contiene solución de lavado. La solución de lavado puede ser la misma solución de lavado o diferente. En algunos ejemplos, las soluciones de lavado pueden contener, p. ej., tampón, tampón y glicerol al 10 %, etanol al 80 %.

En algunas implementaciones, una cubierta 610 fija los botes 602 y los tubos 604, 606 dentro del cuerpo 608 del cartucho. Volviendo a la FIG. 6B, la cubierta 610 puede incluir aberturas para acceder a cada uno de las botes 602 y tubos 604, 606. Además, la cubierta 610 puede incluir marcas 612 legibles por máquina para identificar el tipo de cartucho (p. ej., acceder a un mapa de contenidos de los cartuchos). Como alternativa, cada abertura puede marcarse por separado con cada uno de los contenidos.

Volviendo a las FIG. 6C-E, en algunas implementaciones, el cartucho de reactivos 104 es un cartucho 620 de reactivos que incluye un conjunto de dieciséis tubos pequeños o viales 626 (ap) y un módulo de electroporación 624 de flujo continuo, sostenido en un cuerpo 622 de cartucho. Cada uno de los tubos o viales 626 pequeños, en algunas realizaciones, está sellado con una lámina de aluminio perforable para el acceso de un sistema automatizado de manipulación de líquidos, tal como un succionador o una pipeta. En otras realizaciones, cada uno de los tubos o viales 626 pequeños incluye una junta de acceso sellable. La parte superior de cada uno de los tubos o viales 626 pequeños, en algunas realizaciones, está marcada con indicaciones legibles por máquina (no ilustradas) para la identificación automática de los contenidos. Las marcas legibles por máquina pueden incluir un código de barras, Código QR u otra codificación legible por máquina. Otros medios automatizados para identificar un recipiente en particular pueden incluir códigos de colores, reconocimiento de símbolos (p. ej., texto, imagen, icono, etc.) y/o reconocimiento de formas (p. ej., una forma relativa del recipiente). En lugar de estar marcadas sobre el propio recipiente, en algunas realizaciones, una superficie superior del cuerpo del cartucho y/o la cubierta del cartucho pueden contener indicaciones legibles por máquina para identificar los contenidos. Cada uno de los tubos o viales pequeños puede ser del mismo tamaño. Como alternativa, se pueden proporcionar múltiples volúmenes de tubos o viales en el cartucho 620 de reactivos. En un ejemplo ilustrativo, cada tubo o vial puede estar diseñado para contener entre 2 y 20 ml, entre 4 y 10 ml, o aproximadamente 5 ml.

En un ejemplo ilustrativo, cada uno de los tubos o viales 626 pequeños puede contener uno de los siguientes materiales: una cadena principal de vector, oligonucleótidos, reactivos para el ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, una muestra de células proporcionada por el usuario, un agente inductor, esferas magnéticas en tampón, etanol, un antibiótico para la selección de células, reactivos para eluir células y ácidos nucleicos, una capa de aceite, otros reactivos y medios de recuperación y/o crecimiento celular.

En algunas implementaciones, una cubierta 628 fija los tubos o viales 626 pequeños dentro del cuerpo 622 del cartucho. Volviendo a la FIG. 6D, la cubierta 628 puede incluir aberturas para acceder a cada uno de los tubos o viales 626 pequeños. Tres aberturas 632 grandes están delineadas en una banda en negrita (p. ej., azul) para indicar posiciones de adición de materiales suministrados por el usuario. Los materiales proporcionados por el usuario, por ejemplo, pueden incluir una cadena principal de vector, oligonucleótidos y una muestra de células. Además, la cubierta 610 puede incluir marcas 630 legibles por máquina para identificar el tipo de cartucho (p. ej., acceder a un mapa de contenidos de los cartuchos). Como alternativa, cada abertura puede marcarse por separado con cada uno de los contenidos. En algunas implementaciones, para garantizar el posicionamiento de los materiales suministrados por el usuario, los viales o tubos proporcionados para el llenado en el entorno del laboratorio pueden tener formas o tamaños únicos, de modo que el vial o tubo de la muestra de células solo quepa en la abertura de la muestra de células, que el vial o tubo de oligonucleótidos solo quepa en la abertura de los oligonucleótidos, y así sucesivamente.

Volviendo a la FIG. 1A, también se ilustra el sistema robótico de manipulación 108 que incluye el pórtico 122. En algunos ejemplos, el sistema robótico de manipulación 108 puede incluir un sistema automatizado de manipulación de líquidos como los fabricados por Tecan Group Ltd. de Mannedorf, Suiza, Hamilton Company of Reno, NV (véase, p. ej., documento WO2018015544A1 de Ott, titulado "Pipetting device, fluid processing system and method for operating a fluid processing system") o Beckman Coulter, Inc. de Fort Collins, CO. (véase, p. ej., el documento US20160018427A1 de Striebl et al., titulado "Methods and systems for tube inspection and liquid level detection"). El sistema robótico de manipulación 108 puede incluir una pipeta 120 de desplazamiento de aire. Los cartuchos 104, 106 de reactivos permiten una integración particularmente fácil con la instrumentación de manipulación de líquidos del sistema robótico de manipulación 108, tal como la pipeta 120 de desplazamiento de aire. En algunas realizaciones, solo la pipeta 120 de desplazamiento de aire es movida por el pórtico 122, y los diferentes módulos 110 y cartuchos 104, 106 permanecen estacionarios. Se pueden proporcionar puntas de pipeta 116 para usar con la pipeta 120 de desplazamiento de aire.

En algunas realizaciones, un sistema de movimiento mecánico automatizado (accionador) (no mostrado) suministra adicionalmente el control del movimiento del eje XY o el control del movimiento del eje XYZ a uno o más módulos 110 y/o cartuchos 104, 106 del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado 100. Las puntas 116 de pipeta, por ejemplo, pueden ser colocadas por el sistema robótico de manipulación en un repositorio 112 de residuos.

Por ejemplo, un módulo activo puede elevarse para entrar en un posicionamiento accesible por contacto con el sistema robótico de manipulación o, por el contrario, descender después de su uso para evitar el impacto con el sistema robótico de manipulación mientras el sistema robótico de manipulación está moviendo materiales a otros módulos 110 dentro del instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado.

El instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado, en algunas implementaciones, incluye el módulo de electroporación 110c de flujo continuo incluido en el cartucho de reactivos 104. Un puente 132 de conexión de electroporación de flujo continuo, por ejemplo, se conecta con el dispositivo de electroporación de flujo continuo una vez que las células y los ácidos nucleicos han sido transferidos al dispositivo a través de un canal de entrada. El puente 132 proporciona un sello hermético a los líquidos y una conexión eléctrica a los electrodos, así como control para realizar la electroporación dentro del módulo de electroporación 110c. Por ejemplo, el puente 132 de conexión de electroporación se puede conectar a los controles de electroporación 134 de flujo continuo dentro de un soporte electrónico 136 del instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado.

En algunas implementaciones, el instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado incluye módulos 110a, 110b de crecimiento celular dobles. Los módulos de crecimiento celular 110a, 110b, como se ilustra, incluyen cada uno un vial rotatorio 130a,130b de crecimiento celular. Al menos uno de los módulos de crecimiento celular 110a, 110b puede incluir adicionalmente un módulo de filtración integrado (no ilustrado). En realizaciones alternativas, en cambio, un módulo de filtración o un módulo de lavado y de concentración de células puede estar separado de los módulos de crecimiento celular 110a, 110b (p. ej., como se describe en relación con el módulo de crecimiento celular 1210a y el módulo de filtración 1210b de las FIG. 12A y 12B). Cada uno de los módulos de crecimiento celular 110a, 110b, por ejemplo, puede incluir las características y funcionalidades analizadas en relación con el módulo de crecimiento celular 800 de las FIG. 8A-F.

Una parte de filtración de uno o ambos módulos de crecimiento celular 110a, 110b, en algunas realizaciones, usa filtros reemplazables almacenados en un casete 118 de filtros. Por ejemplo, el sistema robótico de manipulación puede incluir el cabezal 124 de recogida de filtros para recoger y conectar los filtros para usar con uno o ambos módulos de crecimiento celular 110a, 110b. El cabezal de recogida de filtros transfiere un filtro al módulo de crecimiento, pipetea las células del módulo de crecimiento, y, a continuación, lava y vuelve a las células electrocompetentes. Los medios de las células y los líquidos de lavado se desechan en el módulo 114 de residuos.

En algunas implementaciones, el instrumento 100 de procesamiento celular multimodular automatizado incluye una función de ensamblaje y purificación de ácidos nucleicos (p. ej., un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos) para combinar los materiales proporcionados en el cartucho de reactivos 104 en un ácido nucleico ensamblado para la corrección celular. Además, una operación de desalinización o purificación purifica los ácidos nucleicos ensamblados y desaliniza el tampón de manera que los ácidos nucleicos se electroporan más eficazmente en las células. El elemento de ensamblaje y purificación de ácidos nucleicos puede incluir una cámara de reacción o receptáculo de tubos (no mostrados) y un imán (no mostrado).

Aunque el ejemplo de instrumento 100 ilustrado incluye una disposición particular de módulos 110, esta implementación es solo para fines ilustrativos. Por ejemplo, en otras realizaciones, se pueden incluir más o menos módulos 110 dentro del instrumento 100, y se pueden incluir diferentes módulos tales como, p. ej., un módulo de fusión celular para producir hibridomas y/o un módulo de producción de proteínas. Además, se pueden replicar determinados módulos dentro de determinadas realizaciones, tales como los módulos de crecimiento celular 110a, 110b duplicados de la FIG. 1A.

En algunas realizaciones, las células se modifican antes de la introducción en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado. Por ejemplo, las células pueden modificarse mediante el uso de un sistema rojo A para reemplazar un gen diana por un gen de resistencia a antibióticos, generalmente para la kanamicina o el cloranfenicol. (Véase Datsenko y Wanner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", PNAS, EE.UU., 97(12):6640-5 (2000); patente de EE. UU. n.° 6.509.156 B1 de Stewart et al. titulada "DNA Cloning Method Relying on the E. coli recE/recT Recombination System", concedida el 21 de enero de 2003). En algunas realizaciones, las células pueden haber sido ya transformadas o transfectadas con un vector que comprenda un casete de expresión para una nucleasa. En otro ejemplo, se puede introducir una corrección de genes deseada en la población celular antes de introducirse en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado (p. ej., usando reparación dirigida por homología), y utilizarse el sistema para seleccionar estas correcciones usando una nucleasa y/o añadir correcciones adicionales a la población celular.

Las FIG. 2A a 2D ilustran los bastidores ilustrativos 200 y 230 para usar en versiones de sobremesa de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, los bastidores 200 y 230 pueden tener un ancho de aproximadamente 60,9-121,9 cm (24-48 pulgadas), una altura de aproximadamente 60,9-121,9 cm (24 48 pulgadas) y una profundidad de aproximadamente 60,9-121,9 cm (24-48 pulgadas). Cada uno de los bastidores 200 y 230 puede estar diseñado para alojar múltiples módulos y suministros desechables utilizados en el procesamiento celular automatizado. Además, cada bastidor 200 y 250 puede montar un sistema robótico de manipulación para mover materiales entre módulos.

Las FIG. 2A y 2B representan un primer ejemplo de bastidor 200 de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Como se ilustra, el bastidor 200 incluye una cubierta 202 que tiene un mango 204 y bisagras 206 para levantar la cubierta 202 y acceder al interior del bastidor 200. Una rejilla de refrigeración 214 puede permitir el flujo de aire a través de un ventilador interno (no mostrado). Además, el bastidor 200 es levantado por pies ajustables 220. Los pies 220, por ejemplo, pueden proporcionar un flujo de aire adicional debajo del bastidor 200. Un botón de control 216, en algunas realizaciones, permite el inicio y la detención automatizados con un solo botón del procesamiento celular dentro del bastidor 200.

Dentro del bastidor 200, en algunas implementaciones, un sistema robótico de manipulación 208 está dispuesto a lo largo de un pórtico 210 por encima de los cartuchos 212a, 212b de materiales y de los módulos. Los circuitos de control, tubos de manipulación de líquidos, controles de la bomba de aire, válvulas, unidades térmicas (p. ej., unidades de calefacción y refrigeración) y otros mecanismos de control, en algunas realizaciones, están dispuestos debajo de una cubierta del bastidor 200, en una región 218 de caja de control.

Aunque no se ilustra, en algunas realizaciones, se puede colocar un monitor sobre una cara frontal del bastidor 200, por ejemplo, cubriendo una parte de la cubierta 202. El monitor puede proporcionar información al usuario con respecto a un estado de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. En otro ejemplo, el monitor puede aceptar entradas del usuario para realizar el procesamiento de las células.

Las FIG. 2C y 2D representan un segundo ejemplo de bastidor 230 de un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El bastidor 230, como se ilustra, incluye una puerta transparente 232 con una bisagra 234. Por ejemplo, la puerta puede girar hacia la izquierda de la página para brindar acceso a una zona de trabajo del bastidor. El usuario, por ejemplo, puede abrir la puerta transparente 232 para cargar suministros, tales como cartuchos de reactivos y cartuchos de lavado, en el bastidor 230.

En algunas realizaciones, una cara frontal del bastidor 230 incluye además un sistema de representación (p. ej., un de representación en pantalla táctil) 236 ilustrado a la derecha de la puerta 232. El sistema de representación 236 puede proporcionar información al usuario con respecto a un estado de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. En otro ejemplo, el sistema de representación 236 puede aceptar entradas del usuario para realizar el procesamiento de las células.

Una rejilla 238 de aire en una cara derecha del bastidor 230 puede permitir el flujo de aire dentro de una zona de trabajo (p. ej., por encima de la plataforma) del bastidor 230 (p. ej., por encima de una plataforma). Una segunda rejilla 240 de aire a la izquierda del bastidor 230 puede proporcionar flujo de aire dentro de una región 242 de caja de control (p. ej., debajo de la plataforma) del bastidor 230. Aunque no se ilustra, en algunas realizaciones, pies tales como los pies 220 del bastidor 200 pueden elevar el bastidor 230 por encima de una superficie de trabajo, proporcionando un mayor flujo de aire.

Dentro del bastidor 230, en algunas implementaciones, un sistema robótico de manipulación 248 está dispuesto a lo largo de un pórtico 250 por encima de los cartuchos 252a, 252b, suministros materiales 254a, 254b (p. ej., puntas de pipeta y filtros) y módulos 256 (p. ej., viales de crecimiento dobles). Los circuitos de control, tubos de manipulación de líquidos, controles de la bomba de aire, válvulas y otros mecanismos de control, en algunas realizaciones, están dispuestos debajo de una cubierta del bastidor 230, en la región 242 de la caja de control.

En algunas realizaciones, una unidad 246 de residuos líquidos está montada en la pared exterior izquierda del bastidor 230. La unidad 246 de residuos líquidos, por ejemplo, puede montarse externamente al bastidor 230 para evitar la posible contaminación y para garantizar el vaciado rápido y el reemplazo de la unidad 246 de residuos líquidos.

Módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos

Determinadas realizaciones de los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la presente divulgación incluyen un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos dentro del instrumento. El módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos está configurado para aceptar los ácidos nucleicos necesarios para facilitar las actividades de corrección del genoma deseadas. El módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos también puede configurarse para aceptar la cadena principal del vector apropiada para el ensamblaje del vector y la posterior transformación en las células de interés.

En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Los vectores incluyen, pero sin limitación, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que incluyen uno o más extremos libres, sin extremos libres (p. ej., circulares); moléculas de ácido nucleico que incluyen ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidas en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como mediante técnicas convencionales de clonación molecular. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para empaquetar en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus, adenovirus defectuosos para la replicación y dependoparvovirus). Los vectores víricos también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para la transfección en una célula hospedadora. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador. Asimismo, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En el presente documento, se proporciona una explicación adicional de los vectores.

Los vectores de expresión recombinantes pueden incluir un ácido nucleico en una forma adecuada para la transformación, y para algunas secuencias de ácidos nucleicos, la traducción y expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse basándose en las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que se unen operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "conectado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a los elementos reguladores de una manera que permite la transcripción, y para algunas secuencias de ácidos nucleicos, la traducción y expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). Los métodos de recombinación y clonación apropiados se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n° 10/815.730, titulada "Recombinational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites", publicada el 2 de septiembre de 2004 como el documento US 2004-0171156 A1.

En algunos casos, un elemento regulador está unido operativamente a uno o más elementos de un sistema de nucleasa diana para impulsar la transcripción, y para algunas secuencias de ácido nucleico, la traducción y expresión de uno o más componentes del sistema de nucleasa diana.

En algunos casos, un vector puede incluir un elemento regulador unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica una nucleasa guiada por ácido nucleico. La secuencia de polinucleótidos que codifica la nucleasa guiada por ácido nucleico puede optimizarse por codones para la expresión en células particulares, tales como células procariotas o eucariotas. Las células eucariotas pueden ser células de levaduras, hongos, algas, plantas, animales o seres humanos. Las células eucariotas pueden ser de o derivar de un organismo particular, tal como un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, conejo, perro o mamífero no humano, incluidos los primates no humanos. Adicionalmente, o como alternativa, un vector puede incluir un elemento regulador unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos, que, cuando se transcribe, forma un ARN guía.

El módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos se puede configurar para realizar una amplia variedad de diferentes técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos de forma automatizada. Las técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos que se pueden realizar en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos de los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados desvelados incluyen, pero sin limitación, aquellos métodos de ensamblaje que utilizan endonucleasas de restricción, entre los que se incluyen la PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa), el ensamblaje de BioBrick (patente de EE. UU. n.° 9.361.427 de Hillson titulada "Scar-less Multipart DNA Assembly Design", concedida el 7 de junio de 2016), clonación de tipo IIS (p. ej., "GoldenGate assembly"; publicación de solicitud de patente europea EP 2395087 A1 de Weber et al. titulada "System and Method of Modular Cloning", presentada el 6 de julio de 2010) y la reacción de ciclado de la ligasa (de Kok S., "Rapid and Reliable DNA Assembly via Ligase Cycling Reaction", ACS Synth Biol., 3(2):97-106 (2014); Engler, et al., PLoS One, "A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability", 3(11):e3647 (2008); patente de EE. UU. n.° 6.143.527 de Pachuk et al. titulada "Chain Reaction Cloning Using a Bridging Oligonucleotide and DNA Ligase", concedida el 7 de noviembre de 2000). En otros casos, las técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos realizadas por los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados desvelados se basan en superposiciones entre partes adyacentes de los ácidos nucleicos, tales como Gibson Assembly®, CPEC, SLIC, ciclado de ligasa, etc. Los métodos de ensamblaje adicionales incluyen reparación de huecos en levadura (Bessa, "Improved gap repair cloning in yeast: treatment of the gapped vector with Taq DNA polymerase avoids vector self-ligation", Yeast, 29(10):419-23 (2012)), clonación Gateway (Ohtsuka, "Lantibiotics: mode of action, biosynthesis and bioengineering", Curr Pharm Biotechnol, 10(2):244-51 (2009); patente de EE.UU. n.° 5.888.732 de Hartley et al., titulada "Recombinational Cloning Using Engineered Recombination Sites", publicada el 30 de marzo de 1999; patente de EE.UU. n.° 6.277.608 de Hartley et al. titulada "Recominational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites", concedida el 21 de agosto de 2001), y clonación mediada por topoisomerasa (Udo, "An Alternative Method to Facilitate cDNA Cloning for Expression Studies in Mammalian Cells by Introducing Positive Blue White Selection in Vaccinia Topoisomerase I-Mediated Recombination", PLoS One, 10(9):e0139349 (2015); patente de EE.UU. n.° 6.916.632 B2 de Chestnut et al. titulada "Methods and Reagents for Molecular Cloning", concedida el 12 de julio de 2005). Estas y otras técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos se describen, p. ej., en Sands y Brent, "Overview of Post Cohen-Boyer Methods for Single Segment Cloning and for Multisegment DNA Assembly", CurrProtoc Mol Biol., 113:3.26.1-3.26.20 (2016); Casini et al., "Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly", Nat Rev Mol Cell Biol., (9):568-76 (2015); "Patron, DNA assembly for plant biology: techniques and tools", Curr Opinion Plant Biol., 19:14-9 (2014)).

El ensamblaje de ácidos nucleicos tiene una temperatura controlada dependiendo del tipo de ensamblaje de ácidos nucleicos utilizado en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado. Por ejemplo, cuando se utiliza PCR en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo tendrá una capacidad de termociclado que permitirá que las temperaturas cambien entre la desnaturalización, la hibridación y la extensión. Cuando se utilizan métodos de ensamblaje de temperatura única en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo tendrá la capacidad de alcanzar y mantener la temperatura que optimice el proceso de ensamblaje específico que se esté realizando. Estas temperaturas y la duración para mantener estas temperaturas pueden determinarse mediante un conjunto preprogramado de parámetros ejecutados por una secuencia de órdenes, o controlados manualmente por el usuario utilizando el sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

En una realización, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos es un módulo para realizar el ensamblaje utilizando una sola reacción isotérmica, tal como la representada en la FIG. 4. El módulo de ensamblaje isotérmico está configurado para realizar el método de clonación molecular utilizando la única reacción isotérmica. Determinados métodos de ensamblaje isotérmico pueden combinar simultáneamente hasta 15 fragmentos de ácido nucleico en función de la identidad de la secuencia. El método de ensamblaje proporciona, en algunos casos, ácidos nucleicos que se van a ensamblar que incluyen un solapamiento de aproximadamente 20-40 bases con fragmentos de ácido nucleico adyacentes. Los fragmentos se mezclan con un cóctel de tres enzimas: una exonucleasa, una polimerasa y una ligasa, junto con los componentes del tampón. Debido a que el proceso es isotérmico y se puede realizar en un método de 1 o 2 etapas utilizando un solo recipiente de reacción, las reacciones de ensamblaje isotérmicas son ideales para usar en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El método de 1 etapa permite ensamblar hasta cinco fragmentos diferentes utilizando un proceso isotérmico de una sola etapa. Los fragmentos y la mezcla maestra de enzimas se combinan y se incuban a 50 °C durante un máximo de una hora. Para la creación de construcciones más complejas con hasta quince fragmentos o para incorporar fragmentos de 100 pb a 10 kb, normalmente se utiliza el de 2 etapas, donde la reacción de 2 etapas requiere dos adiciones separadas de mezcla maestra; una para la etapa de exonucleasa e hibridación, y una segunda para las etapas de polimerasa y ligadura.

La FIG. 4 ilustra un ejemplo de módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos 400 con purificación integrada. El módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos 400 incluye una cámara 402 que tiene una junta de acceso 404 para transferir líquidos hacia y desde el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos 400 (p. ej., a través de una pipeta o un succionador). En algunas realizaciones, la junta de acceso 404 está conectada a un vial reemplazable que está colocado dentro de la cámara 402. Por ejemplo, un usuario o un sistema robótico de manipulación puede colocar el vial dentro del módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos 400 para su procesamiento.

La cámara 402 comparte un alojamiento 406 con un calentador resistivo 408. Una vez que se ha introducido una muestra en la cámara 402 del módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos 400, se puede utilizar el calentador resistivo 408 para calentar el contenido de la cámara 402 hasta una temperatura deseada. La rampa térmica se puede establecer en función del contenido de la cámara 402 (p. ej., los materiales suministrados a través de la junta de acceso 404 por la pipeta o la unidad succionadora del sistema robótico de manipulación). El sistema de procesamiento del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado puede determinar la temperatura diana y el plan de rampa térmica. La rampa térmica y la temperatura diana se pueden controlar mediante el control de un sensor térmico tal como un termistor 410 incluido dentro del alojamiento 406. En una realización particular, el calentador resistivo 408 está diseñado para mantener una temperatura dentro del alojamiento 406 de entre 20 °C y 80 °C, entre 25 °C y 75 °C, entre 37 °C y 65 °C, entre 40 °C y 60 °C, entre 45 °C y 55 °C o preferentemente de aproximadamente 50 °C.

Módulo de purificación

En algunas realizaciones, cuando se incluye un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado, el instrumento también puede incluir un módulo de purificación para eliminar los componentes no deseados de la mezcla de ensamblaje de ácidos nucleicos (p. ej., sales, minerales) y, en determinadas realizaciones, concentrar los ácidos nucleicos ensamblados. Los ejemplos de métodos para intercambiar el líquido después del ensamblaje de los ácidos nucleicos incluyen esferas magnéticas (p. ej., SPRI [Solid Phase Reversible Immobilization, de inmovilización reversible en fase sólida] o Dynal (Dynabeads) de Invitrogen Corp. de Carlsbad, CA), esferas de sílice, columnas de centrifugación de sílice, esferas de vidrio, precipitación (p. ej., utilizando etanol o isopropanol), lisis alcalina, purificación osmótica, extracción con butanol, técnicas de separación basadas en membranas, filtración, etc.

En un aspecto, el módulo de purificación proporciona filtración, p. ej., ultrafiltración. Por ejemplo, se dispone de una selección de microconcentradores dotados de membranas de celulosa generadas hidrófilas, anisotrópicas, de diferentes porosidades. (Véase, p. ej., los microconcentradores Millipore SCX utilizados en Juan, Li-Jung, et al. "Histone deacetylases specifically down-regulate p53-dependent gene activation". Journal of Biological Chemistry 275.27 (2000): 20436-20443.). En otro ejemplo, la purificación y concentración implica poner en contacto una muestra líquida que incluye los ácidos nucleicos ensamblados y una sal iónica con un intercambiador de iones que incluye una sal de fosfato insoluble, retirar el líquido y eluir el ácido nucleico del intercambiador de iones.

En un aspecto específico del módulo de purificación, se pueden utilizar esferas SPRI cuando se pueden añadir volúmenes x0,6~2,0 de esferas SPRI al ensamblaje de ácidos nucleicos. El producto de ensamblaje de ácidos nucleicos se une a las esferas SPRI, y las esferas SPRI se sedimentan colocando automáticamente un imán cerca del tubo, recipiente o cámara que aloja el sedimento. Por ejemplo, se pueden añadir volúmenes x0,6-2,0 de esferas SPRI al ensamblaje de ácidos nucleicos. Las esferas SPRI, por ejemplo, pueden lavarse con etanol, y se eluye el producto de ensamblaje de ácidos nucleicos unido, p. ej., en agua, tampón Tris o glicerol al 10 %.

En un aspecto específico, se acopla un imán a un accionador lineal que posiciona el imán. En algunas implementaciones, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos es un módulo combinado de ensamblaje y purificación diseñado para integrar el ensamblaje y la purificación. Por ejemplo, como se ha explicado anteriormente en relación con un módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, una vez transcurrido el tiempo suficiente para que tenga lugar la reacción isotérmica de ensamblaje de ácidos nucleicos, el contenido de la cámara 402 (p. ej., los reactivos y los ácidos nucleicos de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos), en algunas realizaciones, se combinan con esferas magnéticas (no mostradas) para activar el proceso de purificación. Las esferas SPRI en tampón se suministran en el contenido del módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante un sistema robótico de manipulación. Tras ello, en algunas realizaciones, un solenoide 412 es accionado por un imán para excitar las esferas magnéticas contenidas dentro de la cámara 402. El solenoide, en un ejemplo particular, puede conferir entre una fuerza de tracción magnética de 8,89 Newton (2 libras) y una fuerza de tracción de 22,24 Newton (5 libras), o aproximadamente una fuerza de tracción magnética de 17,79 Newton (4 libras) a las esferas magnéticas dentro de la cámara 402. El contenido de la cámara 402 se puede incubar durante el tiempo suficiente para que el vector y los oligonucleótidos ensamblados se unan a las esferas magnéticas.

Tras la unión, en algunas implementaciones, la mezcla de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos unidos (p. ej., reactivos de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos vector y oligonucleótidos ensamblados) se retira del módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, y los ácidos nucleicos unidos a las esferas se lavan una o varias veces con etanol al 80 %. Una vez lavados, los ácidos nucleicos unidos a las esferas se eluyen en un tampón y se transfieren al módulo de transformación.

En algunas implementaciones, se bloquea la posición de un vial en la cámara 402 para su procesamiento. Por ejemplo, un usuario puede presionar el vial más allá de un retén en la cámara 402 diseñada para retener el vial al conectarse con una pipeta o un succionador. En otro ejemplo, el usuario puede girar el vial de posición, conectando así una protuberancia a un canal correspondiente e impidiendo el movimiento ascendente. Un sensor de posición (no ilustrado) puede garantizar la retracción del vial. El sensor de posición, en una realización particular, es un sensor magnético que detecta la conexión entre una parte de la cámara 402 y el vial. En otras realizaciones, el sensor de posición es un sensor óptico que detecta la presencia del vial en una posición retraída. En realizaciones que usan un canal y una protuberancia, un interruptor mecánico presionado hacia abajo por la protuberancia puede detectar la conexión del vial.

Módulo de crecimiento

A medida que se ensamblan los ácidos nucleicos, las células se pueden cultivar en la preparación para la corrección. El crecimiento celular se puede controlar mediante la densidad óptica (p. ej., a una DO de 600 nm) que se mide en un módulo de crecimiento, y se utiliza un bucle de retroalimentación para ajustar el crecimiento celular a fin de alcanzar una DO diana en un momento determinado. Otras medidas de la densidad celular y del estado fisiológico que se pueden medir incluyen, pero sin limitación, pH, oxígeno disuelto, enzimas liberadas, propiedades acústicas y propiedades eléctricas.

En algunos aspectos, el módulo de crecimiento incluye un tubo de cultivo en un agitador o agitador vorticial que es interrogado por un espectrofotómetro o fluorímetro. El agitador o agitador vorticial puede calentar o enfriar las células, y el crecimiento celular se controla mediante mediciones de absorbancia o fluorescencia en tiempo real. En un aspecto, las células se cultivan a 25 °C-40 °C hasta una absorbancia de DO600 de 1-10 DO. Las células también se pueden cultivar en intervalos de temperatura de 25 °C-35 °C, 25 °C-30 °C, 30 °C-40 °C, 30 °C-35 °C, 35 °C-40 °C, 40 °C-50 °C, 40 °C-45 °C o 44 °C-50 °C. En otro aspecto, las células se inducen calentándolas a 42 °C-50 °C o añadiendo un agente inductor. Las células también pueden ser inducidas por calentamiento a intervalos de 42 °C-46 °C, 42 °C-44 °c , 44 °C-46 °C, 44 °C-48 °C, 46 °C-48 °C, 46 °C-50 °C o 48 °C-50 °C. En algunos aspectos, las células se enfrían hasta 0 °C-10 °C después de la inducción. Las células también se pueden enfriar hasta intervalos de temperatura de 0 °C-5 °C, 0 °C-2 °C, 2 °C-4 °C, 4 °C-6 °C, 6 °C-8 °C, 8 °C-10 °C o 5 °C-10 °C después de la inducción.

La FIG. 8A muestra una realización de un vial rotatorio 800 de crecimiento para usar con un dispositivo de crecimiento celular, tal como el dispositivo 850 de crecimiento celular ilustrado en las FIG. 8B-C. El vial rotatorio 800 de crecimiento, en algunas implementaciones, es un recipiente transparente que tiene un extremo abierto 804 para recibir medios líquidos y células, una región central 806 de vial, que define el recipiente principal para las células en crecimiento, una región de ahusada a estrechada 818 que define al menos una vía de luz 808, 810, un extremo cerrado 816 y un mecanismo 812 de conexión de transmisión. El vial rotatorio 800 de crecimiento puede tener un eje longitudinal central 820 alrededor del cual gira el vial 800, y las vías de luz 808, 810 pueden ser generalmente perpendiculares al eje longitudinal del vial. En algunos ejemplos, la primera vía de luz 810 puede colocarse en la parte inferior estrechada de la región ahusada a estrechada 818. El mecanismo 812 de conexión de transmisión, en algunas implementaciones, se conecta con un mecanismo de transmisión (p. ej., accionador, (no se muestra)) para girar el vial 800. El accionador puede incluir un eje impulsor 874 para un motor impulsor 864 (FIG. 8D).

En algunas realizaciones, el vial rotatorio 800 de crecimiento incluye una segunda vía de luz 808, por ejemplo, en la región ahusada superior de la región ahusada a estrechada 818. En algunos ejemplos, las paredes que definen la región ahusada superior de la región ahusada a estrechada 818 para la segunda vía de luz 808 pueden estar dispuestas en un ángulo más amplio con respecto al eje longitudinal 820 que las paredes que definen la parte estrechada inferior de la región ahusada a estrechada 810 para la primera vía de luz 810. Ambas vías de luz 808, 810, por ejemplo, pueden colocarse en una región del vial rotatorio 800 de crecimiento que se llena constantemente con el cultivo celular (células medios de crecimiento), y no se ve afectada por la velocidad de rotación del vial 800 de crecimiento. Como se ilustra, la segunda vía de luz 808 es más corta que la primera vía de luz 810, lo que permite una medición sensible de los valores de densidad óptica (DO) cuando los valores de DO del cultivo celular en el vial están en un nivel alto (p. ej., más adelante en el proceso de crecimiento celular), mientras que la primera vía de luz 810 permite una medición sensible de los valores de DO cuando los valores de DO del cultivo celular en el vial están en un nivel más bajo (p. ej., antes en el proceso de crecimiento celular).

El vial rotatorio 800 de crecimiento puede ser reutilizable o, preferentemente, el vial rotatorio de crecimiento es consumible. En algunas realizaciones, el vial rotatorio 800 de crecimiento es consumible y se puede presentar al usuario precargado con medio de crecimiento, donde el vial 800 está sellado en el extremo abierto 804 con una lámina de aluminio. Un vial rotatorio de crecimiento lleno de medio empaquetado de esta manera puede ser parte de un kit para usar con un dispositivo de crecimiento celular independiente o con un módulo de crecimiento celular que es parte de un sistema de procesamiento celular multimodular automatizado. Para introducir las células en el vial, un usuario solo necesita pipetear un volumen deseado de células y usar la punta de la pipeta para perforar el sello de lámina de aluminio del vial 800. Como alternativa, como es evidente, un instrumento automatizado puede transferir células desde, p. ej., un cartucho de reactivo, al vial de crecimiento. El medio de crecimiento se puede proporcionar en el vial de crecimiento o también se puede transferir desde un cartucho de reactivos al vial de crecimiento antes de añadir las células. El extremo abierto 804 puede incluir un labio alargado 802 para superponerse sobre y conectarse con el dispositivo 850 de crecimiento celular (FIG. 8B-C). En instrumentos automatizados, el vial rotatorio 800 de crecimiento puede etiquetarse con un código de barras u otro medio de identificación que pueda ser leído por un escáner o una cámara que forme parte del sistema de procesamiento 1310 como se ilustra en la FIG. 13.

En algunas implementaciones, el volumen del vial rotatorio 800 de crecimiento y el volumen del cultivo celular (incluido el medio de crecimiento) pueden variar mucho, pero el volumen del vial rotatorio 800 de crecimiento debe ser lo suficientemente grande para que el cultivo celular del vial de crecimiento 800 obtenga la aireación adecuada mientras el vial 800 está rotando. En la práctica, el volumen del vial rotatorio 800 de crecimiento puede variar de 1-250 ml, 2 100 ml, de 5-80 ml, 10-50 ml o de 12-35 ml. De igual modo, el volumen del cultivo celular (células medios de crecimiento) debe ser adecuado para permitir una aireación adecuada en el vial rotatorio 800 de crecimiento. Por tanto, el volumen del cultivo celular debe ser aproximadamente el 10-85 % del volumen del vial de crecimiento 800, o el 15 80 % del volumen del vial de crecimiento, o 20-70 %, 30-60 % o 40-50 % del volumen del vial de crecimiento. En un ejemplo, para un vial 800 de crecimiento de 35 ml, el volumen del cultivo celular sería de aproximadamente 4 ml a aproximadamente 27 ml.

El vial rotatorio 800 de crecimiento, en algunas realizaciones, está fabricado con un material transparente biocompatible, o al menos la parte del vial 800 que incluye la(s) vía(s) de la luz es transparente. Adicionalmente, el material a partir del cual se fabrica el vial rotatorio 800 de crecimiento debe poder enfriarse hasta aproximadamente 0°C o menos y calentarse hasta aproximadamente 75 °C o más, tal como de aproximadamente 2°C a aproximadamente 70 °C, aproximadamente 4 °C o hasta aproximadamente 60 °C, o aproximadamente 4 °C o hasta aproximadamente 55 °C para alojar tanto los ensayos de células en función de la temperatura como el almacenamiento a largo plazo a bajas temperaturas. Además, el material que se utiliza para fabricar el vial preferentemente es capaz de soportar temperaturas de hasta 55 °C sin deformarse mientras se está centrifugando. Los materiales adecuados incluyen vidrio, cloruro de polivinilo, polietileno, poliamida, polietileno, polipropileno, policarbonato, poli(metil metacrilato) (PMMA), polisulfona, poliuretano, y copolímeros de estos y otros polímeros. Los materiales preferidos incluyen polipropileno, policarbonato o poliestireno. En algunas realizaciones, el vial rotatorio 800 de crecimiento se fabrica de forma económica mediante, p. ej., moldeo por inyección o extrusión.

La FIG. 8B ilustra una vista superior de un vial rotatorio 800b de crecimiento, que es una implementación alternativa del vial rotatorio 800 de crecimiento. En algunos ejemplos, el vial 800b puede incluir una o más paletas 822 fijadas a una superficie interior que sobresale hacia el centro del vial 800b. El vial 800b mostrado en la FIG. 8B incluye tres paletas 822 que están espaciadas esencialmente la misma distancia alrededor de la periferia del vial 800b, pero, en otros ejemplos, el vial 800b puede incluir dos, cuatro o más paletas 822. Las paletas, en algunas implementaciones, proporcionan una alta mezcla y aireación dentro del vial 800b que rota dentro de un dispositivo de crecimiento celular, que facilita el crecimiento microbiano.

Las FIG. 8C-D ilustran vistas de un ejemplo de dispositivo 850 de crecimiento celular que recibe el vial rotatorio 800 de crecimiento. En algunas realizaciones, el dispositivo 850 de crecimiento celular rota para calentar o enfriar las células o el crecimiento celular dentro del vial 800 hasta un intervalo de temperaturas predeterminado. En algunas implementaciones, el vial rotatorio 800 de crecimiento se puede colocar dentro de un alojamiento principal 852 con el labio alargado 802 del vial 800 extendiéndose más allá de una superficie superior del alojamiento principal 852. En algunos aspectos, el labio alargado 802 proporciona una superficie de agarre para que un usuario introduzca o extraiga el vial 800 del alojamiento principal 852 del dispositivo 850. Adicionalmente, cuando está completamente introducido en el alojamiento principal 852, una superficie inferior del labio alargado 802 se apoya en una superficie superior del alojamiento principal 852. En algunos ejemplos, el alojamiento principal 852 del dispositivo 850 de crecimiento celular tiene un tamaño tal que las superficies exteriores del vial rotatorio 800 de crecimiento hacen tope con las superficies interiores del alojamiento principal 852, fijando así el vial 800 dentro del alojamiento principal 852. En algunas implementaciones, el dispositivo 850 de crecimiento celular puede incluir alojamientos terminales 854 dispuestos a cada lado del alojamiento principal 854 y un alojamiento inferior 856 dispuesto en un extremo inferior del alojamiento principal 852. En algunos ejemplos, el alojamiento inferior 856 puede incluir pestañas 858 que se pueden utilizar para conectar el dispositivo 850 de crecimiento celular a un mecanismo de control de la temperatura (p. ej., calefacción/refrigeración) u otra estructura, tal como un bastidor de un sistema de procesamiento celular automatizado.

Como se muestra en la FIG. 8D, el dispositivo 850 de crecimiento celular, en algunas implementaciones, puede incluir un rodamiento superior 860 y un rodamiento inferior 862 colocados en el alojamiento principal 852 que soportan la carga vertical de un vial rotatorio 800 de crecimiento que se ha introducido en el alojamiento principal 852. En algunos ejemplos, el dispositivo 850 de crecimiento celular también puede incluir un acceso óptico principal 866 y un acceso óptico secundario 868 que están alineados con la primera vía de luz 810 y la segunda vía de luz 808 del vial 800 cuando se introduce en el alojamiento principal 852. En algunos ejemplos, los accesos ópticos primario y secundario 866, 868 son huecos, aberturas o partes del alojamiento principal construido con materiales transparentes que permiten que la luz pase a través del vial 800 para realizar mediciones de DO del crecimiento celular. Además de los accesos ópticos 866, 868, el dispositivo 850 de crecimiento celular puede incluir una placa de emisión 870 que proporciona una o más fuentes de iluminación para la(s) vía(s) de luz, y una placa detectora 872 para detectar la luz tras el desplazamiento de la luz a través del líquido de cultivo celular en el vial rotatorio 800 de crecimiento. En un ejemplo, las fuentes de iluminación dispuestas en la placa de emisión 870 pueden incluir diodos de emisión de luz (LED, Light Emission Diodes) o fotodiodos que proporcionan iluminación en una o más longitudes de onda diana en línea con los medios de crecimiento que se normalmente se utilizan en el cultivo celular (ya sea, p. ej., células de mamífero, células bacterianas, células animales, células de levadura).

En algunas implementaciones, la placa de emisión 870 y/o la placa detectora 872 están comunicadas a través de una conexión por cable o inalámbrica a un sistema de procesamiento (p. ej., sistema de procesamiento 126, 1220, 1310) que controla la longitud de onda de la salida de luz por la placa de emisión 870, y recibe y procesa la iluminación detectada en la placa detectora 872. La placa de emisión 870 y la placa detectora 872 de control remoto, en algunos aspectos, proporciona la realización de mediciones de la DO automatizadas en el curso del crecimiento celular. Por ejemplo, el sistema de procesamiento 126, 1220 puede controlar la periodicidad con la que se realizan las mediciones de DO, que puede ser a intervalos predeterminados o en respuesta a una solicitud del usuario. Además, el sistema de procesamiento 126, 1220 puede utilizar los datos del sensor recibidos de la placa detectora 872 para realizar mediciones de DO en tiempo real y ajustar las condiciones de crecimiento celular (p. ej., temperatura, velocidad/sentido de la rotación).

En algunas realizaciones, el alojamiento inferior 856 puede contener un motor impulsor 864 que genera un movimiento de rotación que hace que el vial rotatorio 800 de crecimiento gire dentro del dispositivo 850 de crecimiento celular. En algunas implementaciones, el motor 864 puede incluir un eje impulsor 874 que se conecta con un extremo inferior del vial rotatorio 800 de crecimiento. El motor 864 que genera movimiento de rotación para el vial rotatorio 800 de crecimiento, en algunas realizaciones, es un motor impulsor de tipo CC sin escobillas con controles de conducción integrados que se pueden configurar para mantener un valor de revoluciones por minuto (rpm) constante entre 0 y aproximadamente 3000 rpm. Como alternativa, se pueden utilizar otros tipos de motores tales como un motor paso a paso, servomotores o motores CC con escobillas. Opcionalmente, el motor 864 también puede tener control de conducción para permitir la inversión de la dirección rotacional, y un tacómetro para detectar e informar las rpm reales. En otros ejemplos, el motor 864 puede generar un movimiento oscilante invirtiendo la dirección de la rotación a una frecuencia predeterminada. En un ejemplo, el vial 800 es rotado en cada dirección durante un segundo a una velocidad de 350 rpm. El motor 864, en algunas implementaciones, se comunica a través de una red de comunicación alámbrica o inalámbrica con un sistema de procesamiento (p. ej., sistema de procesamiento 126, 1220) que está configurado para controlar el funcionamiento del motor 864, que puede incluir la ejecución de protocolos programados en el procesador y/o proporcionados por la entrada del usuario, por ejemplo, como se describe en relación con el controlador 1330 de módulos de la FIG. 13. Por ejemplo, el motor 864 puede configurarse para variar la velocidad y/o la dirección de la rotación del vial 800 para provocar la precesión axial del cultivo celular, mejorando así la mezcla para evitar la agregación celular y aumentar la aireación. En algunos ejemplos, la velocidad o dirección de rotación del motor 864 puede variar en función de los datos del sensor de densidad óptica recibidos desde la placa detectora 872.

En algunas realizaciones, el alojamiento principal 852, los alojamientos terminales 854 y el alojamiento inferior 856 del dispositivo 856 de crecimiento celular se pueden fabricar con un material resistente que incluye aluminio, acero inoxidable y otros materiales termoconductores, entre los que se incluyen plásticos. Estas estructuras o partes de las mismas se pueden crear a través de diferentes técnicas, p. ej., fabricación de metal, moldeo por inyección, creación de capas estructurales que se fusionan, etc. Mientras que, en algunos ejemplos, el vial rotatorio 800 de crecimiento es reutilizable, en otras realizaciones, el vial 800 es preferentemente consumible. Los otros componentes del dispositivo 850 de crecimiento celular, en algunos aspectos, son preferentemente reutilizables y pueden funcionar como un dispositivo de sobremesa independiente o como un módulo de un sistema de procesamiento celular multimodular automatizado.

En algunas implementaciones, el sistema de procesamiento que se comunica con el módulo de crecimiento celular puede programarse con información que se utilizará como "blanco" o control para el cultivo celular en crecimiento. Un "blanco" o control, en algunos ejemplos, es un recipiente que solo contiene medio de crecimiento celular, que produce el 100% de transmitancia y 0 DO, mientras que las muestras de células desvían los rayos de luz y tendrán un porcentaje de transmitancia inferior y una DO superior. A medida que las células crecen en el medio y se vuelven más densas, la transmitancia disminuye y la DO aumenta. El procesador del módulo de crecimiento celular, en algunas implementaciones, puede programarse para utilizar valores de longitud de onda para los blancos en línea con los medios de crecimiento que normalmente se utilizan en el cultivo celular (ya sea, p. ej., células de mamífero, células bacterianas, células animales, células de levadura). Como alternativa, en el módulo de crecimiento celular, se pueden incluir un segundo espectrofotómetro y un recipiente, donde el segundo espectrofotómetro se utiliza para leer un blanco a intervalos designados.

La FIG. 8E ilustra otro tipo de dispositivo 880 de crecimiento celular que utiliza agitación, en lugar de rotación, para controlar la temperatura y potenciar la mezcla y la aireación dentro de un vial 890 de crecimiento celular (FIG. 8F). El dispositivo 880 de crecimiento celular, en algunos ejemplos, es de menor tamaño que los agitadores de sobremesa convencionales, para su integración en sistemas de procesamiento celular multimodulares automatizados. En algunas implementaciones, el dispositivo 880 de crecimiento celular incluye un alojamiento 884 que recibe el vial 890 de crecimiento celular. El dispositivo 880 de crecimiento celular puede, en algunos ejemplos, incluir un ensamblaje del motor colocado debajo del vial 890 que genera un movimiento orbital del vial 890 en función de la velocidad del motor. En un ejemplo, el vial 890 se desplaza en una órbita de un plano horizontal a 600 a 900 rpm, tal como a 750 rpm, que es significativamente más rápido que los agitadores de banco más grandes que orbitan a aproximadamente 250 rpm. En algunos aspectos, el movimiento de sacudida se genera en al menos un plano horizontal. En algunos ejemplos, el vial de crecimiento celular 890 utilizado con el dispositivo 880 de crecimiento celular en agitación es un tubo de fondo cónico de forma sustancialmente similar a un matraz que se usa en un agitador de banco convencional. Similar al dispositivo rotatorio de crecimiento celular 850, el dispositivo 880 de crecimiento celular puede incluir una placa de iluminación 870 y una placa detectora 872 para tomar medidas automatizadas de la DO en el transcurso del crecimiento celular. En algunos ejemplos, se puede acoplar una fuente de luz 882 al dispositivo 880 de crecimiento celular, que genera la iluminación que es medida por una placa detectora, que, en algunos ejemplos, se ubica debajo del vial 890 o en un lado opuesto del vial 890 desde la fuente de luz 882.

Para reducir el fondo de las células que no han recibido una corrección del genoma, el módulo de crecimiento también puede permitir un proceso de selección para enriquecer las células corregidas. Por ejemplo, el ácido nucleico introducido puede incluir un gen, que confiera resistencia antibiótica u otro marcador seleccionable. El hecho de alternar la introducción de marcadores seleccionables para series secuenciales de corrección también puede eliminar el fondo de las células no corregidas y permitir múltiples ciclos del instrumento de corrección celular multimodular automatizado para seleccionar células que tengan correcciones secuenciales del genoma.

Los genes de resistencia a los antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, genes tales como el gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la tetraciclina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la canavanina, gen de resistencia a la blasticidina, gen de resistencia a la higromicina, gen de resistencia a la puromicina y gen de resistencia al cloranfenicol. En algunas realizaciones, la eliminación del fondo de células muertas se ayuda de potenciadores líticos tales como detergentes, estrés osmótico, temperatura, enzimas, proteasas, bacteriófago, agentes reductores o caotropos. En otras realizaciones, se utiliza la eliminación de células y/o el intercambio de medios para reducir el fondo de células muertas.

Módulo de lavado y/o concentración de células

El módulo de lavado y/o concentración de células puede utilizar cualquier método para intercambiar los líquidos en el entorno celular, y puede concentrar las células o permitir que permanezcan esencialmente en el mismo o mayor volumen de líquido que el utilizado en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos. Además, en algunos aspectos, los procesos realizados en el módulo de lavado de células también vuelven a las células electrocompetentes, mediante, p. ej., el uso de glicerol en el lavado.

Se pueden utilizar numerosos métodos diferentes para lavar las células, entre los que se incluyen la purificación de gradiente de densidad, diálisis, columnas de intercambio iónico, filtración, centrifugación, dilución y el uso de esferas para la purificación.

En algunos aspectos, el módulo de lavado y/o concentración de células utiliza un dispositivo de centrifugación. En otros aspectos, el módulo de lavado y/o concentración de células utiliza un módulo de filtración. En otros aspectos más, las esferas se acoplan a restos que se unen a la superficie celular. Estos restos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, lectinas, aglutinina de germen de trigo, lisozimas mutadas y ligandos.

En otros aspectos, las células se genomodifican para ser magnetizadas, permitiendo que los imanes sedimenten las células después de las etapas de lavado. El mecanismo de magnetización celular puede incluir, pero sin limitación, la expresión de la proteína ferritina.

El módulo de lavado y/o de concentración de células, en algunas implementaciones, es un módulo de ensamblaje de centrífuga. Volviendo a las FIG. 3A-C, en algunas implementaciones, un módulo 300 de ensamblaje de centrífuga incluye una puerta superior 302 diseñada para ser accionada por un sistema robótico de manipulación (no mostrado) para suministrar materiales de ensamblaje de ácidos nucleicos (p. ej., oligonucleótidos, cadena principal de vector, enzimas, etc.) a uno o más viales 304a, b situados en cubos 306a, b para viales conectados a un rotor 308. En algunas realizaciones, el sistema robótico de manipulación suministra los viales 304a, b al módulo 300 de ensamblaje de centrífuga. En otras realizaciones, un usuario desecha los viales 304a, b dentro de los cubos 306a, b para viales. Los cubos 306a, b para viales, en algunas realizaciones, están conectados al rotor 308 a través de una conexión articulada, de manera que los cubos 306a,b para viales pueden oscilar hacia afuera durante la rotación. En otras realizaciones, la posición de los cubos 306a,b es fija.

El módulo 300 de ensamblaje de centrífuga, en algunas realizaciones, está climatizado. Por ejemplo, la temperatura interna puede ser controlada por serpentines de refrigeración 310 y aislamiento 312. Las líneas 314 de suministro y retorno de refrigerante pueden bombear refrigerante a los serpentines de refrigeración 310, enfriando así una cámara 316 del módulo 300 de ensamblaje de centrífuga. En algunos ejemplos, el módulo 300 de ensamblaje de centrífuga puede diseñarse para enfriar la cámara 316 hasta entre 0 °C y 10 °C, entre 2 °C y 8 °C, y lo más preferentemente hasta aproximadamente 4 °C. Además, se puede proporcionar el control de la condensación para limitar la humedad dentro de la cámara 316. La climatización, en algunas realizaciones, se establece a través de un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, el sistema de procesamiento puede dirigir señales a las interfaces del circuito 320.

En algunas realizaciones, un motor 318 impulsa rotacionalmente el rotor 308. La aceleración y la desaceleración del motor 318 y, por lo tanto, del rotor 308 pueden controlarse mediante un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Como se ilustra, hay colocado un sensor de movimiento 322 (p. ej., acelerómetro o giroscopio) en una base del motor 318 para controlar los parámetros de rotación. Como alternativa, se puede colocar un sensor de movimiento (no ilustrado) tal como un acelerómetro o un giroscopio dentro de la cámara 316 para controlar los parámetros de rotación. El sistema de procesamiento, por ejemplo, puede controlar las señales del sensor de movimiento y analizar las condiciones para ejecutar un apagado de seguridad si la rotación está fuera de los parámetros. En una realización ilustrativa, el brazo del rotor puede estar diseñado para girar hasta 10000 revoluciones por minuto (rpm), hasta 8000 rpm o hasta aproximadamente 6500 rpm. El sistema de procesamiento puede modificar la velocidad de rotación en función de los materiales suministrados al módulo 300 de ensamblaje de centrífuga.

El módulo de lavado y/o de concentración de células, en algunas implementaciones, es un módulo de filtración. Volviendo a la FIG. 7A, un diagrama de bloques ilustra unidades funcionales ilustrativas de un módulo de filtración 700. En algunas implementaciones, un control principal 702 del módulo de filtración 700 incluye una primera bomba 704a de líquido para captar líquido de lavado 706, y una segunda bomba 704b de líquido para retirar los residuos líquidos a una unidad 708 de residuos líquidos (p. ej., tal como la unidad 114 de residuos líquidos de la FIG. 1A o la unidad 1228 de residuos líquidos de las FIG. 12A y 12B). Se puede disponer un sensor de flujo 712 en un conector 714 con la unidad 708 de residuos líquidos para controlar la liberación de residuos líquidos del módulo de filtración. Se puede disponer una válvula 716 (una válvula de tres vías como se ilustra) en un conector 718 con el líquido de lavado 716 para conectar selectivamente el líquido de lavado 716 y el módulo de filtración 700.

El módulo de filtración 700, en algunas implementaciones, incluye un colector de distribución 720 de filtros para filtrar y concentrar una muestra de células. El colector de distribución 720 de filtros puede incluir uno o más sensores de temperatura 722 y uno o más sensores de presión 724 para controlar el flujo y la temperatura del líquido de lavado y/o de los residuos líquidos. Los sensores 722, 724, en algunas realizaciones, son controlados y analizados por un sistema de procesamiento del sistema de procesamiento celular multimodal automatizado, tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. El colector de distribución 720 de filtros puede incluir una o más válvulas 726 para dirigir el flujo del líquido de lavado y/o de los residuos líquidos. El sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodal automatizado, por ejemplo, puede accionar las válvulas de acuerdo con un conjunto de instrucciones para dirigir la filtración realizada por el módulo de filtración 700.

El módulo de filtración 700 incluye al menos un filtro 730. Los ejemplos de filtros adecuados para usar en el módulo de filtración 700 incluyen filtros de membrana, filtros cerámicos y filtros metálicos. El filtro se puede utilizar en cualquier forma; el filtro puede ser, por ejemplo, cilíndrico o esencialmente plano. El filtro seleccionado para una operación dada o un flujo de trabajo dado, en algunas realizaciones, depende del tipo de flujo de trabajo (p. ej., bacteriano, de levadura, vírico, etc.) o los volúmenes de materiales que se estén procesando. Por ejemplo, mientras que los filtros planos son de coste relativamente bajo y de uso común, los filtros de mayor superficie, tales como filtros cilíndricos, puede aceptar mayores caudales. En otro ejemplo, los filtros huecos pueden mostrar tasas de recuperación inferiores cuando se procesan pequeños volúmenes de muestra (p. ej., de menos de aproximadamente 10 ml). Por ejemplo, para utilizar con bacterias, puede ser preferible que el filtro utilizado sea un filtro de membrana, particularmente un filtro de fibra hueca. Por la expresión "fibra hueca" se entiende una membrana tubular. El diámetro interno del tubo, en algunos ejemplos, es de al menos 0,1 mm, más preferentemente al menos 0,5 mm, lo más preferentemente al menos 0,75 mm y preferentemente el diámetro interno del tubo es, como máximo, de 10 mm, más preferentemente, como máximo, de 6 mm, lo más preferentemente, como máximo, de 1 mm. Hay módulos de filtro que tienen fibras huecas disponibles en el mercado de varias compañías, entre las que se incluyen G. E. Life Sciences (Marlborough, MA) e InnovaPrep (Drexel, MO) (véase, p. ej., documento US20110061474A1 concedido a Page et al., titulado "Liquid to Liquid Biological Particle Concentrator with Disposable Fluid Path").

En algunas implementaciones, el módulo de filtración 700 incluye un medio de expulsión 728 de filtros (p. ej., un accionador) para expulsar un filtro 730 después de su uso. Por ejemplo, un usuario o el sistema robótico de manipulación puede empujar el filtro 730 a su posición de uso, de manera que el filtro quede retenido por el colector de distribución 720 de filtros durante la filtración. Tras la filtración, para retirar el filtro 730 usado, el accionador de expulsión 728 de filtros puede expulsar el filtro 730, liberar el filtro 730 de manera que el usuario o el sistema robótico de manipulación puedan retirar el filtro 730 usado del módulo de filtración 700. El filtro 730 usado, en algunos ejemplos, puede disponerse dentro de la unidad 112 de residuos sólidos de las FIG. 1A-1B, la unidad 1218 de residuos sólidos de las FIG. 12A y 12B, o devolverse a un cartucho 740 de filtros, como se ilustra en las FIG. 7D.

Volviendo a la FIG. 7D, en algunas implementaciones, los filtros 730 proporcionados en el cartucho 740 de filtros dispuesto dentro del bastidor del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado son transportados al módulo de filtración 700 por un sistema robótico de manipulación (p. ej., el sistema robótico de manipulación 108 descrito en relación con las FIG. 1A y 1B o el sistema robótico de manipulación 1218 de las FIG. 12A y 12B) y colocados dentro del módulo de filtración 700 antes de su uso.

El módulo de filtración 700, en algunas implementaciones, requiere una limpieza periódica. Por ejemplo, el sistema de procesamiento puede alertar a un usuario cuando se requiera una limpieza a través de la interfaz de usuario del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado y/o a través de un medio de mensajería inalámbrica (p. ej., mensaje de texto, correo electrónico y/o aplicación de dispositivo informático personal). Se puede cargar un filtro de descontaminación, por ejemplo, en el módulo de filtración 700, y se puede limpiar el módulo de filtración 700 con una solución de lavado y/o una mezcla de alcohol.

En algunas implementaciones, el módulo de filtración 700 está en conexión fluida con un cartucho de lavado 710 (tal como el cartucho de lavado 600 de la FIG. 6A) que contiene el fluido de lavado 716 a través del conector 718. Por ejemplo, al colocar el usuario el cartucho de lavado 710 dentro del bastidor del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, el conector 718 puede coincidir con una entrada inferior del cartucho de lavado 710, creando un conducto de líquido entre el fluido de lavado 716 y el módulo de filtración 700.

Volviendo a las FIG. 7B y 7C, en algunas implementaciones, un módulo de filtración 750 de doble filtro incluye filtros dobles 752, 754 dispuestos sobre depósitos de lavado dobles 754. En un ejemplo, cada filtro puede ser un filtro de fibra de núcleo hueco con poros de 0,45 pm y más de 85 cm2 de área. Los depósitos de lavado 754, en algunos ejemplos, puede tener un volumen de 50 ml, 100 ml o más de 200 ml. En algunas realizaciones, los depósitos de lavado 754 están dispuestos en un cartucho de lavado 756, tal como el cartucho 600 de lavado o de reactivos de la FIG. 6A.

El sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, en algunas implementaciones, controla el accionamiento de los filtros dobles 752 en una dirección X (horizontal) y Z (vertical) para colocar los filtros 752a, 752b en los depósitos de lavado 754. En un ejemplo particular, los filtros dobles 752 pueden moverse conjuntamente a lo largo del eje X, pero tienen un intervalo de movimiento del eje Z independiente.

Como se ilustra, los filtros dobles 752 del módulo de filtración 750 están conectados a un cuerpo 758 de brazo delgado. En algunas realizaciones, se puede disponer cualquier bomba y válvula del módulo de filtración 750 a una distancia del cuerpo 758 (p. ej., dentro de un suelo del bastidor del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado). De esta manera, el módulo de filtración 750 puede reemplazar a los módulos de filtración comerciales convencionales mucho más voluminosos.

Además, en algunas realizaciones, el módulo de filtración 750 está en comunicación líquida con un sistema de purga de residuos diseñado para liberar residuos líquidos en una unidad de almacenamiento de residuos líquidos, tal como la unidad de almacenamiento 708 de la FIG. 7A o la unidad de almacenamiento 114 de residuos líquidos de la FIG.

1A o 1228 de las FIG. 12A y 12B.

Módulo de transformación

El módulo de transformación puede implementar cualquier técnica de transformación o de transfección celular utilizada habitualmente por los expertos en el campo de la transfección, transformación y microfluídica. La transformación puede tener lugar en tubos de microcentrífuga, tubos de ensayo, cubetas, placas de múltiples pocillos, microfibras e instrumentos de flujo. La temperatura y el control del módulo de transformación se pueden controlar utilizando un sistema de procesamiento tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13, con controles configurados por el usuario y/o mediante una secuencia de órdenes proporcionada al sistema de procesamiento.

Se pretende que la transformación incluya varias técnicas reconocidas en la técnica para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena (p. ej., ADN) en una célula diana, y el término "transformación", como se usa en el presente documento, incluye todas las técnicas de transformación y transfección. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, electroporación, lipofección, optoporación, inyección, microprecipitación, microinyección, liposomas, bombardeo de partículas, sonoporación, poración inducida por láser, transfección de esferas, coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, o transfección mediada por DEAE-dextrano. Las células también se pueden preparar para la captación de vectores utilizando, p. ej., lavado con sacarosa o glicerol. Adicionalmente, se pueden utilizar técnicas híbridas que aprovechen las capacidades de los métodos de transfección mecánicos y químicos, p. ej., magnetofección, una metodología de transfección que combina la transfección química con métodos mecánicos. En otro ejemplo, los lípidos catiónicos se pueden implementar en combinación con pistolas de genes o electroporadores. Se pueden encontrar materiales y métodos adecuados para transformar o transfectar células diana, p. ej., en Green y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014).

El medio o tampón utilizado para suspender las células y el material (reactivo) que se someterá a electroporación en las células para el proceso de electroporación puede ser un medio o tampón que incluya, pero sin limitación, MEM, DMEM, IMDM, RPMl, solución de Hanks, PBS o solución de Ringer, donde los medios pueden proporcionarse en el cartucho de reactivos como parte de un kit. Para la electroporación de la mayoría de las células eucariotas, el medio o tampón suele contener sales para mantener una presión osmótica adecuada. Las sales del medio o tampón también vuelven al medio conductor. Para la electroporación de células procariotas muy pequeñas tales como las bacterias, a veces se utiliza agua o glicerol al 10 % como medio de baja conductancia para permitir una fuerza de campo eléctrico muy alta. En ese caso, las moléculas cargadas que se van a suministrar vuelven todavía al medio a base de agua más conductor que las membranas celulares a base de lípidos, y el medio puede seguir considerándose prácticamente conductor, particularmente en comparación con las membranas celulares.

El compuesto que se va a electroporar en las células de elección puede ser cualquier compuesto conocido en la técnica que sea útil para la electroporación, tal como ácidos nucleicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN, péptidos, proteínas y moléculas pequeñas como hormonas, citocinas, quimiocinas, fármacos o precursores de fármacos.

Es importante usar suficiente tensión para lograr la electroporación del material en las células, pero no demasiado tensión, ya que demasiada potencia disminuirá la viabilidad de la célula. Por ejemplo, para electroporar una suspensión de una estirpe celular humana, se requieren 200 voltios para una muestra de 0,2 ml en una cubeta de 4 mm de separación con descarga exponencial de un condensador de aproximadamente 1000 pF. Sin embargo, si se coloca la misma suspensión celular de 0,2 ml en un recipiente más largo con una distancia entre electrodos de 2 cm (5 veces la distancia entre la cubeta), la tensión requerida sería de 1000 voltios, pero se necesita un capacitor de solo 40 pF (1/25 de 1000 pF), porque la energía eléctrica de un capacitor sigue la ecuación de:

E = 0,5 U2 C

donde E es la energía eléctrica, U es la tensión y C es la capacitancia. Por lo tanto, un generador de impulsos de alta tensión es realmente fácil de fabricar, porque necesita un capacitor mucho más pequeño para almacenar una cantidad similar de energía. De manera análoga, no sería difícil generar otras formas de onda de tensiones superiores.

Los dispositivos de electroporación de la divulgación pueden permitir una alta velocidad de transformación celular en un período de tiempo relativamente corto. La velocidad de transformación celular depende del tipo de célula y del número de células que se transforman. Por ejemplo, para E. coli, los dispositivos de electroporación pueden proporcionar una velocidad de transformación celular de 1 a 1010 células por segundo, de 104 a 107 por segundo, de 105 a 108 por segundo o de 106 a 109 por segundo. Los dispositivos de electroporación también permiten la transformación de lotes de células que varían de 1 célula a 1010 células en un solo procedimiento de transformación utilizando el dispositivo.

La eficiencia de la transformación utilizando los dispositivos de electroporación de la divulgación puede hacer que al menos el 10 % de las células se pore lo suficiente para permitir el suministro de la molécula biológica. Preferentemente, la eficiencia de la transformación utilizando los dispositivos de electroporación de la divulgación puede hacer que al menos el 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de las células se pore lo suficiente para permitir el suministro de la molécula biológica.

En algunas realizaciones, la electroporación se realiza en una cubeta, un pocillo, un tubo, una cámara, una celda de flujo, un canal o una punta de pipeta. En otras realizaciones, la cubeta, el pocillo, el tubo o la cámara se llena y se vacía desde el fondo. En algunas realizaciones, la cubeta contiene un succionador conectado al fondo.

La FIG. 5A representa un ejemplo de dispositivo de electroporación 500 de una sola unidad (módulo de electroporación) que incluye, de arriba a abajo, un alojamiento 502 que encierra un miembro de conexión 504 configurado para conectarse con una pipeta, tal como una pipeta de desplazamiento de aire automática (no mostrada), y un filtro 506. Además del alojamiento 502, hay una parte de la cubeta de electroporación 510 del dispositivo de electroporación 500 que incluye electrodos 512 y paredes 514 de la cámara de electroporación 516. La cámara, en algunos ejemplos, puede variar entre 0,01 y 100 mm de ancho, 1-5000 mm de altura y 1-20.000 pl de volumen; entre 0,03-50 mm de ancho, 50-2000 mm de altura y 500-10.000 pl de volumen; o entre 0,05-30 mm de ancho, 2-500 mm de altura y 25-4500 pl de volumen.

En algunas realizaciones, se puede colocar un primer depósito 508 entre el filtro 506 y la cámara de electroporación 516, estando el primer depósito en comunicación fluida con la cámara de electroporación 516 y proporcionando un repositorio vacío para cualquier muestra celular que pueda tomarse más allá de la cámara de electroporación 516. El primer depósito 508, en algunos ejemplos, puede variar entre 0,1 y 150 mm de ancho, 0,1-250 mm de altura y 0,5 10.000 pl de volumen; entre 0,3-100 mm de ancho, 30-150 mm de altura y 20-4.000 pl de volumen; o entre 0,5-100 mm de ancho, 0,5-100 mm de altura y 5-2000 pl de volumen.

En algunas implementaciones, el dispositivo de electroporación 500 puede incluir adicionalmente otro depósito 524 en comunicación fluida con el primer depósito 508 (a través del filtro 506). El segundo depósito 524 se puede colocar entre el filtro 506 y el miembro de conexión 504 para proteger la pipeta de la contaminación por cualquier líquido que pueda pasar el filtro 506. El segundo depósito 524, en algunos ejemplos, puede variar entre 0,1 y 250 mm de ancho, 0,2-1000 mm de altura y 0,1-2.500 pl de volumen; entre 0,1-150 mm de ancho, 50-400 mm de altura y 1-1.000 pl de volumen; o entre 0,2-100 mm de ancho, 0,5-200 mm de altura y 2-600 pl de volumen.

En algunas realizaciones, un succionador 518 está en comunicación fluida y acoplado a la cámara de electroporación 516, teniendo el succionador 518 un extremo proximal 520 a la cámara de electroporación 516 y un extremo distal 522 a la cámara de electroporación 516. El extremo distal 522 del succionador 518 puede permitir la captación y dispensación de la muestra de células del dispositivo de electroporación 500. El succionador 518, en algunas realizaciones, forma parte de un sistema robótico de manipulación. El succionador 518, en algunos ejemplos, puede estar hecho de plásticos tales como el cloruro de polivinilo, polietileno, poliamida, polietileno, polipropileno, acrilonitrilo butadieno, policarbonato, poliéteretecetona (PEEK), polisulfona y poliuretano, copolímeros de estos y otros polímeros, vidrio (tal como un capilar de vidrio) y tubos de metal tales como aluminio, acero inoxidable o cobre. Algunos ejemplos de materiales incluyen estireno cristalino y copolímeros de olefina cíclica. El PEEK es un plástico preferido debido a su bajo precio y fácil fabricación. El succionador 518, en algunos ejemplos, puede variar entre 0,02 y 2.000 mm de ancho, 0,25-2000 mm de altura y 1-2.000 pl de volumen; entre 0,02-1.250 mm de ancho, 250-1500 mm de altura y 1,5-1.500 pl de volumen; o entre 0,02-10 mm de ancho, 4,0-1.000 mm de altura y 2,5-1000 pl de volumen.

El alojamiento 502 y el elemento de conexión 504 del dispositivo de electroporación 500, en algunos ejemplos, puede ser de silicona, resina, cloruro de polivinilo, polietileno, poliamida, polietileno, polipropileno, acrilonitrilo butadieno, policarbonato, poliéteretecetona (PEEK), polisulfona y poliuretano, copolímeros de estos y otros polímeros. De manera análoga, las paredes 512 de la cámara de electroporación, en algunos ejemplos, puede ser de silicona, resina, vidrio, fibra de vidrio, cloruro de polivinilo, polietileno, poliamida, polietileno, polipropileno, acrilonitrilo butadieno, policarbonato, poliéteretecetona (PEEK), polisulfona y poliuretano, copolímeros de estos y otros polímeros. Algunos ejemplos de materiales incluyen estireno cristalino y copolímeros de olefina cíclica. Estas estructuras o partes de las mismas se pueden crear a través de diferentes técnicas, p. ej., moldeo por inyección, creación de capas estructurales que se fusionan, etc. Los materiales preferidos son policarbonato y polímeros de olefina cíclica.

La cámara de electroporación 516, en algunas realizaciones, es generalmente de forma cilíndrica. En otras realizaciones, la cámara de electroporación 516 puede ser rectangular, cónica o cuadrada.

El filtro 506 se puede conformar, en algunos ejemplos, a partir de plásticos porosos, polietileno hidrófobo, algodón o fibras de vidrio. Preferentemente, el filtro 506 comprende un material de bajo coste tal como plásticos porosos. El filtro puede variar entre 0,2 y 500 mm de ancho, 0,2-500 mm de altura y 1-3.000 pl de volumen; entre 0,3-250 mm de ancho, 20-200 mm de altura y 50-2.500 pl de volumen; o entre 0,5-150 mm de ancho, 0,2-80 mm de altura y 10-2000 pl de volumen.

El miembro de conexión 504 está configurado para tener una dimensión que sea compatible con el dispositivo de manipulación de líquidos utilizado en el instrumento de electroporación.

Los componentes de los dispositivos de electroporación pueden fabricarse por separado y luego ensamblarse, o determinados componentes de los dispositivos de electroporación pueden fabricarse o moldearse como una sola entidad, con otros componentes añadidos después del moldeo. Por ejemplo, el succionador, las paredes de electroporación y el alojamiento pueden fabricarse o moldearse como una sola entidad, siendo los electrodos, el filtro y el miembro de conexión añadidos posteriormente a la entidad única para formar el módulo de electroporación. De manera análoga, las paredes de electroporación y el alojamiento pueden fabricarse como una sola entidad, siendo el succionador, los electrodos, el filtro y el miembro de conexión añadidos al módulo de electroporación después del moldeo. Son posibles otras combinaciones de componentes integrados y no integrados.

Los electrodos 512 se pueden formar a partir de un metal, tal como cobre, titanio, aluminio, latón, plata, rodio, oro o platino, o grafito, capaz de soportar la aplicación de un campo eléctrico. Por ejemplo, un campo eléctrico aplicado puede destruir los electrodos hechos de metales como el aluminio. Si se desea un dispositivo de electroporación de varios usos, las placas de electrodos se pueden recubrir con metales resistentes a la corrosión electroquímica. Se pueden utilizar recubrimientos conductores como metales nobles, p. ej., oro, para proteger las placas de electrodos. En un ejemplo particular, la cubeta de electroporación puede incluir un primer electrodo metálico y un segundo electrodo metálico de titanio recubierto con una capa de oro. Por el contrario, si el dispositivo de electroporación 500 está diseñado para un solo uso (p. ej., desechable), se pueden utilizar metales menos costosos tales como el aluminio.

En una realización, la distancia entre los electrodos puede ser de entre 0,3 mm y 10 mm. En otra realización, la distancia entre los electrodos puede ser de entre 1 mm y 20 mm, o de entre 1 mm y 10 mm, o de entre 2 mm y 5 mm. El diámetro interno de la cámara de electroporación puede ser de entre 0,1 mm y 10 mm. Para evitar diferentes intensidades de campo entre los electrodos, los electrodos deben disponerse en paralelo con una distancia constante entre sí en toda la superficie de los electrodos. Preferentemente, el primer electrodo metálico y el segundo electrodo metálico están separados por una distancia de 2-4 mm en una disposición paralela con variaciones en la distancia inferiores a /-20 pm. Por otra parte, la superficie de los electrodos debe ser lo más lisa posible sin orificios ni picos. Se prefieren los electrodos que tienen una rugosidad Rz de 1 a 10 pm. En otras realizaciones, el dispositivo de electroporación incluye al menos un electrodo adicional que aplica un potencial de tierra a, p. ej., la parte del succionador del dispositivo de electroporación.

Aunque se ilustra como un dispositivo 500 de una sola unidad, en otras realizaciones, el módulo de electroporación incluye múltiples unidades de electroporación. Cada unidad de electroporación se puede configurar para electroporar volúmenes de muestra de células de entre 1 pl y 20 ml. Por ejemplo, puede haber diferentes capacidades de volumen de unidades de electroporación en un dispositivo de electroporación de múltiples unidades.

En un módulo de electroporación de múltiples unidades, en algunas realizaciones, los electrodos son elementos individuales independientes. En otras realizaciones, un dispositivo de electroporación de múltiples unidades puede incluir electrodos dispuestos de manera que las cubetas de electroporación de unidades de electroporación adyacentes compartan electrodos. Dichos dispositivos de electroporación de múltiples unidades pueden incluir, p. ej., 2 o más unidades de electroporación, 4 o más unidades de electroporación, 8 o más unidades de electroporación, 16 o más unidades de electroporación, 32 o más unidades de electroporación, 48 o más unidades de electroporación, 64 o más unidades de electroporación, o incluso 96 o más unidades de electroporación preferentemente en un dispositivo automatizado. Cuando se emplean múltiples dispositivos paralelos, normalmente se utilizan volúmenes similares en cada unidad.

Aunque se proporcionan dimensiones ilustrativas, las dimensiones, como es evidente, variarán según el volumen de la muestra de células y el (los) recipiente(s) que se utilicen para contener las células y/o el material que se vaya a electroporar.

En realizaciones preferidas, el módulo de transformación incluye al menos un dispositivo de electroporación de flujo continuo que tiene un alojamiento con una cámara de electroporación, un primer electrodo y un segundo electrodo configurados para conectarse con un generador de impulsos eléctricos. En algunas implementaciones, los dispositivos de electroporación de flujo continuo están configurados para coincidir con un cartucho reemplazable tal como los cartuchos 104, 106 de la FIG. 1A (p. ej., el módulo de transformación 110c), mediante el cual los contactos eléctricos se conectan con los electrodos del dispositivo de electroporación. En determinadas realizaciones, los dispositivos de electroporación son esterilizables en autoclave y/o desechables, se envasan con los reactivos en el cartucho de reactivos y/o se pueden retirar del cartucho de reactivos. El dispositivo de electroporación se puede configurar para electroporar volúmenes de muestra de células de entre 1 pl y 2 ml, 10 pl y 1 ml, 25 pl y 750 pl o 50 pl y 500 pl. Las células que pueden someterse a electroporación con los dispositivos de electroporación desvelados incluyen células de mamíferos (incluidas células humanas), células vegetales, levaduras, otras células eucariotas, bacterias, arqueas y otros tipos de células.

Los cartuchos de reactivos para usar en los sistemas automatizados de procesamiento celular multimodular (p. ej., el cartucho 104 de la FIG. 1A), en algunas realizaciones, incluyen uno o más dispositivos de electroporación (p. ej., el módulo de electroporación 110c de la FIG. 1A), preferentemente dispositivos de electroporación de flujo continuo. La FIG. 5B es una vista en perspectiva inferior de un conjunto 530 de seis dispositivos (p. ej., unidades o módulos) de electroporación de flujo continuo 532a-f unidos entre sí que pueden formar parte de un cartucho de reactivos, y la FIG.

5C es una vista en perspectiva superior del mismo. El cartucho puede incluir de una a seis o más unidades de electroporación de flujo continuo 532a-f dispuestas en un solo sustrato 534. Cada una de las seis unidades de electroporación de flujo continuo 532a-f tiene pocillos correspondientes 536a-f, que definen entradas de muestra de células, y pocillos 538a-f (véase la FIG. 5C), que definen salidas de muestra de células. Adicionalmente, como se observa en la FIG. 5B, cada unidad de electroporación 532a-f incluye una entrada 540a-f respectiva, una salida 542af respectiva, un canal de flujo 544a-f respectivo, y dos electrodos 546a-f a cada lado de un estrechamiento en el canal de flujo 544a-f respectivo de cada unidad de electroporación de flujo continuo 532a-f.

Una vez que se fabrican las seis unidades de electroporación de flujo continuo 532a-f, en algunas realizaciones, pueden separarse entre sí a lo largo de las líneas marcadas que separan cada unidad de la unidad adyacente (es decir, "distanciarse") y usarse de una en una, o, como alternativa, en otras realizaciones, se pueden utilizar dos o más unidades de electroporación de flujo continuo 532a-f en paralelo, en cuyo caso esas dos o más unidades preferentemente permanecen conectadas a lo largo de las líneas marcadas.

En términos generales, la electroporación microfluídica, que utiliza volúmenes de suspensión celular inferiores a aproximadamente 10 ml y tan bajos como de 1 pl, permite un control más preciso sobre un proceso de transfección o transformación, y permite una integración flexible con otras herramientas de procesamiento celular en comparación con los dispositivos de electroporación a escala de laboratorio. La electroporación microfluídica proporciona ventajas únicas para, p. ej., la transformación, el procesamiento y análisis de una sola célula; configuraciones de dispositivos de electroporación de múltiples unidades; y procesamiento y análisis de células multimodular, automático, integrado.

Los dispositivos de electroporación de flujo continuo incluidos en los cartuchos de reactivos pueden lograr una electroporación celular de alta eficiencia con baja toxicidad. En realizaciones específicas de los dispositivos de electroporación de flujo continuo de la divulgación, el nivel de toxicidad de la transformación produce más del 10 % de células viables después de la electroporación, preferentemente más del 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso 95 % de células viables después de la transformación, dependiendo del tipo de célula y ácidos nucleicos que se introducen en las células.

Tras la transformación, se permite que las células se recuperen en condiciones que potencien el proceso de corrección del genoma que tiene lugar como resultado de la transformación y expresión de los ácidos nucleicos introducidos en las células.

Método de procesamiento celular multimodular automatizado

La FIG. 9 es un diagrama de flujo de un método ilustrativo 900 para usar un sistema de procesamiento celular multimodular automatizado tal como los sistemas ilustrados en las FlG. 1A-1B y 12A-12B. El sistema de procesamiento de la FIG. 13, por ejemplo, puede dirigir la fase de procesamiento del método 900. Por ejemplo, una secuencia de órdenes informáticas puede identificar configuraciones para cada fase de procesamiento e instrucciones para el movimiento de un sistema robótico de manipulación para realizar las acciones del método 900. En algunos casos, una secuencia de órdenes informáticas puede ser identificada por un cartucho suministrado al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, el cartucho puede incluir indicaciones legibles por máquina, tales como un código de barras o un código QR, incluyendo la identificación de una secuencia de órdenes almacenada en una memoria del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado (p. ej., tal como la memoria 1302 de la FIG. 13). En otro ejemplo, el cartucho puede contener una secuencia de órdenes descargable incluida en indicaciones legibles por máquina, tal como una etiqueta de radiofrecuencia (RF). En otros casos, el usuario puede identificar una secuencia de órdenes, por ejemplo, mediante la descarga de la secuencia de órdenes a través de una conexión por cable o inalámbrica al sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado o mediante la selección de una secuencia de órdenes almacenada a través de una interfaz de usuario del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. En un ejemplo particular, el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede incluir una interfaz de pantalla táctil para enviar configuraciones de usuario y activar el procesamiento celular.

En algunas implementaciones, el método 900 comienza con la transferencia de células a un módulo de crecimiento (902). El módulo de crecimiento, por ejemplo, puede ser el módulo de crecimiento 800 descrito en relación con las FIG. 8A a 8F. En un ejemplo particular, el sistema de procesamiento 120 puede dirigir el sistema robótico de manipulación 108 para transferir células 106 al módulo de crecimiento 110a, como se describe en relación con las FIG. 12A y 12B. En otro ejemplo, como se describe en relación con la FIG. 1A, las células pueden ser transferidas desde uno de los cartuchos 104, 106 a los módulos de crecimiento 110a, 110b por el sistema robótico de manipulación 108. En algunas realizaciones, el vial de crecimiento puede contener medios de crecimiento y suministrarse, p. ej., como parte de un kit. En otras realizaciones, el vial de crecimiento puede llenarse con medio transferido, p. ej., a través del dispositivo de manipulación de líquidos, de un recipiente de reactivos.

En algunos casos, antes de transferir las células (p. ej., desde el cartucho de reactivos 104 o desde un vial añadido al instrumento), se pueden escanear indicaciones legibles por máquina sobre el vial u otro recipiente situado en una posición designada para células a fin de confirmar que el vial o recipiente se marca con la indicación de que contiene células. Además, las indicaciones legibles por máquina pueden indicar un tipo de células proporcionadas al instrumento. El tipo de células, en algunas realizaciones, puede hacer que el instrumento seleccione una secuencia de órdenes de procesamiento en particular (p. ej., una serie de instrucciones para el sistema robótico de manipulación, y la configuración y activación de los diferentes módulos).

En algunas implementaciones, las células crecen en el módulo de crecimiento hasta una densidad óptica deseada (904). Por ejemplo, el sistema de procesamiento 126 de las FIG. 1A-1B o el sistema de procesamiento 1220 de las FIG. 12A-B puede controlar un ajuste de temperatura del módulo de crecimiento 110a para incubar las células durante el ciclo de crecimiento. El sistema de procesamiento 126, 1220 puede recibir además señales del sensor del módulo de crecimiento 110a, 110b indicativas de la densidad óptica y analizar las señales del sensor para controlar el crecimiento de las células. En algunos casos, un usuario puede establecer parámetros de crecimiento para controlar el crecimiento de las células. Por ejemplo, la temperatura y el grado de agitación de las células. Además, en algunos casos, el usuario se puede actualizar con respecto al proceso de crecimiento. Las actualizaciones, en algunos ejemplos, pueden incluir un mensaje presentado en una interfaz de usuario del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado, un mensaje de texto al número de teléfono móvil de un usuario, un mensaje de correo electrónico a una cuenta de correo electrónico o un mensaje transmitido a una aplicación que se ejecuta en un dispositivo electrónico portátil (p. ej., teléfono móvil, tableta electrónica, etc.). En respuesta a los mensajes, en algunos casos, el usuario puede modificar parámetros, tales como la temperatura, para ajustar el crecimiento celular. Por ejemplo, el usuario puede enviar parámetros actualizados a través de una interfaz de usuario del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado o a través de una aplicación de un dispositivo informático portátil en comunicación con el sistema de procesamiento celular multimodular automatizado, tal como una interfaz de usuario 1100 de la FIG. 11.

Aunque se describe en relación con la densidad óptica, en otras implementaciones, el crecimiento celular de dentro del módulo de crecimiento puede controlarse utilizando una medida diferente de la densidad celular y del estado fisiológico tal como, en algunos ejemplos, pH, oxígeno disuelto, enzimas liberadas, propiedades acústicas y propiedades eléctricas.

En algunas implementaciones, al alcanzarse la densidad óptica deseada (904), las células se transfieren desde el módulo de crecimiento a un módulo de filtración o módulo de lavado y concentración celulares (906). El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 1208 de las FIG. 12A-12B, por ejemplo, puede transferir las células desde el módulo de crecimiento 1210a al módulo de filtración 1210b. El módulo de filtración, por ejemplo, se puede diseñar para volver a las células electrocompetentes. Además, el módulo de filtración se puede configurar para reducir el volumen de la muestra celular a un volumen apropiado para la electroporación. En otro ejemplo, el módulo de filtración puede configurarse para eliminar componentes no deseados, tales como sales, de la muestra de células. En algunos casos, el sistema robótico de manipulación 108 transfiere una solución de lavado al módulo de filtración 1210b para lavar las células.

En algunas implementaciones, las células se vuelven electrocompetentes y se eluyen en el módulo de filtración o en el módulo de lavado y concentración celulares (908). Las células se pueden eluir utilizando una solución de lavado. Por ejemplo, las células se pueden eluir utilizando reactivos de un suministro de reactivos. El módulo de filtración o módulo de lavado y concentración celulares, por ejemplo, puede ser similar al módulo de filtración 700 ilustrado en las FIG. 7A y 7B. Como se ha explicado anteriormente, se pueden utilizar numerosos métodos diferentes para lavar las células, entre los que se incluyen la purificación de gradiente de densidad, diálisis, columnas de intercambio iónico, filtración, centrifugación, dilución y el uso de esferas para la purificación. En algunos aspectos, el módulo de lavado y concentración celulares utiliza un dispositivo de centrifugación. En otros aspectos, el módulo de filtración utiliza un instrumento de filtración. En otros aspectos más, las esferas se acoplan a restos que se unen a la superficie celular. Estos restos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, lectinas, aglutinina de germen de trigo, lisozimas mutadas y ligandos. En otros aspectos, las células se genomodifican para ser magnetizadas, permitiendo que los imanes sedimenten las células después de las etapas de lavado. El mecanismo de magnetización celular puede incluir, pero sin limitación, la expresión de la proteína ferritina.

En algunos casos, la solución de lavado se transfiere al módulo de filtración antes de la elución. El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 12A-12B, por ejemplo, puede transferir la solución de lavado desde un vial o recipiente situado en una posición designada para la solución de lavado. Antes de la transferencia de la solución de lavado, se pueden escanear indicaciones legibles por máquina en el vial u otro recipiente o depósito situado en la posición designada para la solución de lavado para confirmar el contenido del vial, recipiente o depósito. Además, las indicaciones legibles por máquina pueden indicar un tipo de solución de lavado suministrada al instrumento. El tipo de solución de lavado, en algunos casos, puede hacer que el sistema seleccione una secuencia de órdenes de procesamiento en particular (p. ej., ajustes y activación del módulo de filtración apropiado para la solución de lavado en particular).

En otros casos, las células se eluyen en un módulo de lavado de células de un cartucho de lavado. Por ejemplo, las células eluidas pueden recogerse en un recipiente vacío del cartucho de lavado 106 ilustrado en la FIG. 1A, y el sistema robótico de manipulación 108 puede transferir medios desde el cartucho de reactivos 104 (o un pocillo de reactivos del cartucho de lavado 10b) a las células eluidas.

Una vez que las células se han vuelto electrocompetentes y se han suspendido en un volumen apropiado, al como de 50 pl a 10 ml, o de 100 pl a 80 ml, o de 150 pl a 8 ml, o de 250 pl a 7 ml, o de 500 pl a 6 ml, o de 750 pl a 5 ml para la transformación por el módulo de filtración (906), en algunas implementaciones, las células se transfieren a un módulo de transformación (918). El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B, por ejemplo, puede transferir las células del módulo de filtración al módulo de transformación 110c. El módulo de filtración se puede acoplar físicamente al módulo de transformación, o estos módulos pueden estar separados. En una realización tal como el instrumento 100 de la FIG. 1A con suministros a base de cartuchos, las células se pueden eluir a un depósito dentro de un cartucho, tal como el cartucho de reactivos 104, antes de su transferencia al módulo de transformación.

En algunas implementaciones, los ácidos nucleicos se preparan fuera del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, un usuario puede incluir un vector ensamblado u otro ensamblaje de ácidos nucleicos como reactivo antes de ejecutar el proceso de transformación y otros procesos en el método 900.

Sin embargo, en otras implementaciones, los ácidos nucleicos se preparan mediante el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Una parte de las siguientes etapas 910 a 916, en algunas realizaciones, se realiza en paralelo con una parte de las etapas 902 a 908. Al menos una parte de las siguientes etapas, en algunas realizaciones, se realiza antes y/o después de las etapas 902 a 908.

En algunas implementaciones, los ácidos nucleicos, tales como un oligonucleótido de la corrección y una cadena principal de vector, así como, en algunos ejemplos, las enzimas y otros componentes de la reacción se transfieren a un módulo de ensamblaje (910) de ácidos nucleicos. El módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos puede configurarse para realizar una o más de una amplia variedad de diferentes técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos de manera automatizada. Las técnicas de ensamblaje de ácidos nucleicos que se pueden realizar en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos pueden incluir, pero sin limitación, aquellos métodos de ensamblaje que utilizan endonucleasas de restricción, entre los que se incluyen la PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa), ensamblaje de bioladrillos, clonación de tipo IIS (p. ej., ensamblaje GoldenGate) y reacción de ciclado de la ligasa. En otros ejemplos, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos puede realizar una técnica de ensamblaje basada en superposiciones entre partes adyacentes de los ácidos nucleicos, tales como Gibson Assembly®, CPEC, SLIC, ciclado de ligasa, etc. Los métodos de ensamblaje ilustrativos adicionales que se pueden realizar mediante el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos incluyen reparación de huecos en levadura, clonación Gateway y clonación mediada por la topoisomerasa. El módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, por ejemplo, puede ser el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos 400 descrito en relación con la FIG. 4. En un ejemplo particular, el sistema de procesamiento 120 puede dirigir el sistema robótico de manipulación 1208 para transferir ácidos nucleicos 1206 al módulo de ensamblaje 1210e de ácidos nucleicos, como se describe en relación con la FIG. 12B. En otro ejemplo, como se describe en relación con la FIG. 1A, los ácidos nucleicos pueden transferirse desde uno de los cartuchos 104, 106 a un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos mediante el sistema robótico de manipulación 108.

En algunos casos, antes de la transferencia de cada una de las muestras de ácido nucleico, las enzimas y otros componentes de la reacción, las indicaciones legibles por máquina pueden escanearse en los viales u otros recipientes situados en posiciones designadas para estos materiales para confirmar que los viales o recipientes están marcados con indicaciones de que contienen el material anticipado. Además, los indicaciones legibles por máquina pueden indicar un tipo de una o más de las muestras de ácido nucleico, las enzimas y otros componentes de reacción proporcionados al instrumento. El(los) tipo(s) de materiales, en algunos casos, pueden hacer que el instrumento seleccione una secuencia de órdenes de procesamiento particular (p. ej., una serie de instrucciones para que el sistema robótico de manipulación identifique más materiales y/o configuraciones y la activación del módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos).

En algunos casos, la temperatura del módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos se controla en función del tipo de ensamblaje de ácidos nucleicos utilizado. Por ejemplo, cuando se utiliza PCR en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo puede tener una capacidad de termociclado que permita que las temperaturas cambien entre la desnaturalización, la hibridación y la extensión. Cuando se utilizan métodos de ensamblaje de temperatura única en el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo puede tener la capacidad de alcanzar y mantener la temperatura que optimice el proceso de ensamblaje específico que se esté realizando.

El control de la temperatura, en algunos casos, se realiza mediante un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. Estas temperaturas y la duración del mantenimiento de las temperaturas pueden determinarse mediante un conjunto de parámetros preprogramados (p. ej., identificados dentro de la secuencia de órdenes de procesamiento o en otro espacio de memoria accesible por el sistema de procesamiento) o ser controladas manualmente por el usuario a través de la interfaz con el sistema de procesamiento.

Una vez transcurrido el tiempo suficiente para que tenga lugar la reacción de ensamblaje, en algunas implementaciones, el ensamblaje de ácidos nucleicos se transfiere a un módulo de purificación (914). El sistema de procesamiento, por ejemplo, puede controlar la cronología de la reacción de ensamblaje en función de uno o más del tipo de reacción, tipo de materiales y configuración del usuario proporcionados al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B, por ejemplo, puede transferir el ensamblaje de ácidos nucleicos al módulo de purificación a través de una interfaz de succionador o pipeta. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B puede transferir un vial que contiene el ensamblaje de ácidos nucleicos desde una cámara del módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos a una cámara del módulo de desalinización/purificación.

En algunas implementaciones, el ensamblaje de ácidos nucleicos se desaliniza y se eluye en el módulo de purificación (916). El módulo de purificación, por ejemplo, puede eliminar los componentes no deseados de la mezcla de ensamblaje de ácidos nucleicos (p. ej., sales, minerales, etc.). En algunos casos, el módulo de purificación concentra los ácidos nucleicos ensamblados en un volumen inferior al volumen de ensamblaje de ácidos nucleicos. Los ejemplos de métodos para intercambiar líquidos después del ensamblaje de ácidos nucleicos incluyen esferas magnéticas (p. ej., SPRI o Dynal (Dynabeads) de Invitrogen Corp. de Carlsbad, CA), esferas de sílice, columnas de centrifugación de sílice, esferas de vidrio, precipitación (p. ej., utilizando etanol o isopropanol), lisis alcalina, purificación osmótica, extracción con butanol, técnicas de separación basadas en membranas, filtración, etc. Por ejemplo, se pueden utilizar uno o más microconcentradores dotados de membranas de celulosa generadas hidrófilas, anisotrópicas, de porosidad variable. En otro ejemplo, el módulo de desalinización/purificación puede procesar una muestra líquida que incluya un ácido nucleico y una sal iónica poniendo en contacto la mezcla con un intercambiador de iones que incluya una sal de fosfato insoluble, retirar el líquido y eluir ácido nucleico del intercambiador de iones.

En un caso ilustrativo, el ensamblaje de ácidos nucleicos puede combinarse con esferas magnéticas, tales como esferas SPRI, en una cámara de un módulo de purificación. El ensamblaje de ácidos nucleicos se puede incubar a una temperatura establecida durante el tiempo suficiente para que el ensamblaje de ácidos nucleicos se una a las esferas magnéticas. Después de la incubación, se puede conectar un imán cerca de la cámara para que el ensamblaje de ácidos nucleicos se pueda lavar y eluir. Se analiza un ejemplo ilustrativo de este proceso en relación con el módulo combinado de purificación y ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos de la FIG. 4.

Una vez que se ha eluido el ensamblaje de ácidos nucleicos, el ensamblaje de ácidos nucleicos, en algunas implementaciones, se transfiere al módulo de transformación (918). El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B, por ejemplo, puede transferir el ensamblaje de ácidos nucleicos al módulo de transformación a través de una interfaz de succionador o pipeta a, p. ej., un módulo de electroporación a base de cubetas o un módulo de electroporación de flujo continuo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, los ácidos nucleicos ensamblados desalinizados, durante la transferencia, pueden combinarse con las células electrocompetentes de la etapa 908. En otras realizaciones, el módulo de transformación puede aceptar cada una de las células electrocompetentes y el ensamblaje de ácidos nucleicos por separado y permitir la mezcla (p. ej., abrir uno o más canales para combinar los materiales en una cámara compartida).

Las células pueden transformarse en el módulo de transformación (920). La transformación puede implicar cualquier técnica reconocida en la técnica para introducir una secuencia de ácido nucleico exógeno (p. ej., ADN) en una célula diana (ya sea transformación o transfección), incluyendo, en algunos ejemplos, electroporación, lipofección, optoporación, inyección, microprecipitación, microinyección, liposomas, bombardeo de partículas, sonoporación, poración inducida por láser, transfección de esferas, coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, o transfección mediada por DEAE-dextrano. En algunas realizaciones, se pueden utilizar técnicas híbridas que aprovechen las capacidades de los métodos de transfección mecánicos y químicos, tal como la magnetofección, una metodología de transfección que combina la transfección química con métodos mecánicos. En otro ejemplo, los lípidos catiónicos se pueden implementar en combinación con pistolas de genes o electroporadores.

En algunas implementaciones, el módulo de transformación utiliza la electroporación para generar la captación del material de ADN. Puede transferirse un tampón o medio al módulo de transformación y añadirse a las células para que las células puedan suspenderse en un tampón o medio que sea favorable para la supervivencia celular durante la electroporación. Antes de la transferencia del tampón o medio, se pueden escanear indicaciones legibles por máquina en el vial u otro recipiente o depósito situado en la posición designada para el tampón o medio para confirmar el contenido del vial, recipiente o depósito. Además, las indicaciones legibles por máquina pueden indicar un tipo de tampón o medio proporcionado al instrumento. El tipo de tampón o medio, en algunas realizaciones, puede hacer que el instrumento seleccione una secuencia de órdenes de procesamiento en particular (p. ej., configuración y activación del módulo de transformación apropiado para el tampón o medio en particular). Para la electroporación de células bacterianas, se pueden utilizar medios de baja conductancia, tales como agua o soluciones de glicerol, para reducir la producción de calor por una corriente transitoria alta. Para las células de levadura, se puede utilizar una solución de sorbitol. Para la electroporación de células de mamíferos, las células pueden suspenderse en un medio o tampón ^{altamente conductor, tal como MEM, DMEM, IMDM, RPMI, solución de Hanks,}PbS, ^{HBSS, HeBS y solución de}Ringer. En un ejemplo particular, el sistema robótico de manipulación 108 puede transferir una solución tampón al módulo de transformación 110c desde uno de los cartuchos 104, 106. El módulo de transformación, por ejemplo, puede ser un módulo de electroporación de flujo continuo tal como los módulos de electroporación descritos en relación con las FIG. 5A y 5B. Como se describe en relación con la FIG. 1A y la FIG. 5B, el módulo de transformación puede ser un módulo de electroporación 110c de flujo continuo desechable dotado del cartucho 104 de la FIG. 1A.

En algunas implementaciones, el módulo de transformación prepara además las células para la captación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las células bacterianas pueden tratarse con un lavado de sacarosa o glicerol antes de añadir los ácidos nucleicos, y las células de levadura pueden tratarse con una solución de acetato de litio, ditioteitol (DTT) y tampón TE. En otras implementaciones que implican la preparación de células para la captación de ácido nucleico, el módulo de filtración u otro módulo separado (p. ej., un módulo de lavado de células) puede preparar las células para la actualización de ácido nucleico.

Una vez transformadas, las células se transfieren a un segundo módulo de crecimiento/recuperación/corrección (922). El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B, por ejemplo, puede transferir las células transformadas al segundo módulo de crecimiento a través de una interfaz de succionador o pipeta. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación 108 de 1A-1B o 12A-12B puede transferir un vial que contenga las células transformadas desde una cámara del módulo de transformación a una cámara del segundo módulo de crecimiento.

El segundo módulo de crecimiento, en algunas realizaciones, actúa como un módulo de recuperación, permitiendo que las células se recuperen del proceso de transformación. En otras realizaciones, las células pueden proporcionarse a un módulo de recuperación separado antes de ser transportadas al segundo módulo de crecimiento. Durante la recuperación, el segundo módulo de crecimiento permite que las células transformadas capten y, en determinados aspectos, integren los ácidos nucleicos introducidos en el genoma de la célula. El segundo módulo de crecimiento puede configurarse para incubar las células a cualquier temperatura óptima definida por el usuario para el crecimiento celular, preferentemente a 25 °C, 30 °C o 37 °C.

En algunas realizaciones, el segundo módulo de crecimiento se comporta como un módulo de selección, seleccionando las células transformadas basándose en un antibiótico u otro reactivo. En un ejemplo, se utiliza el sistema de proteína nucleasa guiada por ARN (RGN) para la selección a fin de escindir los genomas de las células que no han recibido la corrección deseada. El sistema de proteínas RGN utilizado para la selección puede ser igual o diferente al RGN utilizado para la corrección. En el ejemplo de un agente de selección de antibióticos, el antibiótico se puede añadir al segundo módulo de crecimiento para activar la selección. Los genes de resistencia a los antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, genes tales como el gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la tetraciclina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la canavanina, gen de resistencia a la blasticidina, gen de resistencia a la higromicina, gen de resistencia a la puromicina o gen de resistencia al cloranfenicol. El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B, por ejemplo, puede transferir el antibiótico al segundo módulo de crecimiento a través de una interfaz de succionador o pipeta. En algunas realizaciones, la eliminación del fondo de células muertas se ayuda de potenciadores líticos tales como detergentes, estrés osmótico por lavado hipnótico, temperatura, enzimas, proteasas, bacteriófago, agentes reductores o caotropos. El sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13, por ejemplo, puede alterar variables ambientales, tales como la temperatura, para inducir la selección, mientras que el sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B puede suministrar materiales adicionales (p. ej., detergentes, enzimas, agentes reductores, etc.) para ayudar en la selección. En otras realizaciones, se utiliza la eliminación de células y/o el intercambio de medios por filtración para reducir el fondo de células muertas.

En realizaciones adicionales, además de o como una alternativa a la aplicación de la selección, el segundo módulo de crecimiento sirve como módulo de corrección, permitiendo la corrección del genoma en las células transformadas. Como alternativa, en otras realizaciones, las células, tras la recuperación y la selección (si se realiza), se transfieren a un módulo de corrección separado. Como un módulo de corrección, el segundo módulo de crecimiento induce la corrección de los genomas de las células, p. ej., a través de la expresión de los ácidos nucleicos introducidos. La expresión de la nucleasa puede implicar uno o más de inducción química, fotoinducción, inducción vírica o de temperatura. El segundo módulo de crecimiento, por ejemplo, puede configurarse para calentar o enfriar las células durante un proceso de inducción de temperatura. En una ilustración particular, las células se pueden inducir calentando a 42 °C-50 °C. Además de la ilustración, a continuación, las células se pueden enfriar hasta 0-10 °C después de la inducción. En el ejemplo de la inducción química o vírica, se puede transferir un agente inductor al segundo módulo de crecimiento para inducir la corrección. Si se introduce una nucleasa inducible en las células, durante la corrección, la nucleasa inducible es inducida mediante la introducción de una molécula inductora, tal como la molécula inductora 1224 descrita en relación con la FIG. 12A. El agente inductor o la molécula inductora, en algunas implementaciones, es transferido al segundo módulo de crecimiento por el sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B (p. ej., a través de una interfaz de pipeta o succionador).

En algunas implementaciones, si no se desea corregir células adicionales (924), las células pueden transferirse desde el módulo de crecimiento celular a una unidad de almacenamiento para su posterior eliminación del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado (926). La unidad de almacenamiento, por ejemplo, puede incluir la unidad de almacenamiento 114 de las FIG. 12A-12B. El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B, por ejemplo, puede transferir las células a la unidad de almacenamiento 114 a través de una interfaz de succionador o pipeta. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-1B o 12A-12B pueden transferir un vial que contiene las células desde una cámara del segundo módulo de crecimiento a un vial o tubo de dentro de la unidad de almacenamiento.

En algunas implementaciones, si se desea corregir células adicionales (924), las células pueden transferirse al mismo módulo de filtración o a uno diferente y volverse electrocompetentes (908). Además, en algunos casos, el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos puede preparar una nueva muestra de ácido nucleico ensamblado en este momento. Antes de la corrección recursiva, en algunos casos, el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede requerir que el usuario suministre materiales adicionales (p. ej., cartuchos de repuesto).

Las etapas pueden ser iguales o diferentes durante la segunda serie de corrección. Por ejemplo, en algunos casos, tras una ejecución posterior de la etapa 904, se transfiere un medio de crecimiento selectivo al módulo de crecimiento para permitir la selección de células corregidas de la primera serie de corrección. El sistema robótico de manipulación 108 de las FIG. 1A-B o 12A-B, por ejemplo, puede transferir el medio de crecimiento selectivo desde un vial o recipiente de un cartucho de reactivo situado en una posición designada para el medio de crecimiento selectivo. Antes de transferir el medio de cultivo selectivo, se pueden escanear indicaciones legibles por máquina en el vial u otro recipiente o depósito situado en la posición designada para el medio de crecimiento selectivo para confirmar el contenido del vial, recipiente o depósito. Además, las indicaciones legibles por máquina pueden indicar un tipo de medio de cultivo selectivo proporcionado al instrumento. El tipo de medio de cultivo selectivo, en algunos casos, puede hacer que el instrumento seleccione una secuencia de órdenes de procesamiento particular (p. ej., configuraciones y activación del módulo de crecimiento apropiado para el medio de crecimiento selectivo en particular). Se describen ejemplos particulares de flujos de trabajo de corrección recursiva en relación con las FIG. 10A a 10C.

En algunas implementaciones, el método 900 puede programarse para solicitar materiales y/o completar el ciclo de corrección en coordinación con el programa de un usuario. Por ejemplo, el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede proporcionar al usuario la capacidad de programar la finalización de uno o más ciclos de procesamiento celular (p. ej., una o más correcciones recursivas) de modo que el método 900 se ejecute con el objetivo de completarse en el momento preferido del usuario. La programación en el tiempo, por ejemplo, se puede configurar a través de una interfaz de usuario, tal como la interfaz de usuario 1316 de la FIG. 13. En una ilustración particular, un usuario puede configurar la finalización de un primer ciclo a las 4:00 p. m. para que el usuario pueda suministrar cartuchos adicionales de materiales al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado para permitir el procesamiento nocturno de otra serie de corrección celular.

En algunas implementaciones, a lo largo del método 900, el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede alertar al usuario sobre su estado actual. Por ejemplo, la interfaz de usuario 1316 de la FIG. 13 puede presentar una indicación gráfica de la fase actual del procesamiento. En un ejemplo particular, se puede superponer una cara frontal del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado con una interfaz de usuario (p. ej., una pantalla táctil) que presente un gráfico animado que represente el estado actual del procesamiento celular. La interfaz de usuario puede presentar además cualquier usuario y/o configuración predeterminada asociada con la fase de procesamiento actual (p. ej., ajuste de la temperatura, configuración de la hora, etc.).

Aunque se ilustra como una serie particular de operaciones, en otros casos, se pueden incluir más o menos etapas en el método 900. Por ejemplo, en algunos casos, antes de realizarse cada serie de corrección, se puede examinar el contenido de los depósitos, los cartuchos y/o los viales para confirmar que los materiales apropiados están disponibles para continuar con el procesamiento. Por ejemplo, en algunos casos, uno o más sensores de imagen (p. ej., escáneres de código de barras, cámaras, etc.) pueden confirmar el contenido en diferentes lugares dentro del alojamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. En un ejemplo, se pueden disponer múltiples sensores de formación de imágenes dentro del alojamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, estando cada sensor de imágenes configurado para detectar uno o más materiales (p. ej., indicaciones legibles por máquina, tales como códigos de barras o códigos QR, formas/tamaños de materiales, etc.). En otro ejemplo, al menos un sensor de formación de imágenes puede ser movido por el sistema robótico de manipulación a múltiples ubicaciones para detectar uno o más materiales. En casos adicionales, uno o más sensores de peso pueden detectar la presencia o ausencia de materiales desechables o reemplazables. En un ejemplo ilustrativo, el soporte 116 de suministro de puntas de transferencia puede incluir un sensor de peso para detectar si se han cargado o no puntas en la región. En otro ejemplo ilustrativo, un sensor óptico puede detectar que un nivel de residuos líquidos ha alcanzado un nivel de umbral, que se ha de eliminar antes de continuar con el procesamiento celular. Las solicitudes de materiales adicionales, la eliminación de suministros de residuos u otras intervenciones del usuario (p. ej., limpieza manual de uno o más elementos, etc.), en algunas implementaciones, se presentan en una interfaz gráfica de usuario del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, en algunas implementaciones, entra en contacto con el usuario con solicitudes de nuevos materiales u otras intervenciones manuales, por ejemplo, a través de una aplicación de software, correo electrónico o mensaje de texto.

Flujos de trabajo para el procesamiento celular en un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado

El instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado está diseñado para realizar varios flujos de trabajo de procesamiento celular utilizando los mismos módulos. Por ejemplo, los materiales de origen, en envases individuales o en forma de cartucho, pueden diferir, y las instrucciones correspondientes (p. ej., secuencia de órdenes informáticas) pueden seleccionarse correspondientemente, utilizando la misma instrumentación básica y sistema robótico de manipulación; es decir, el sistema de procesamiento celular multimodular se puede configurar para realizar una serie de flujos de trabajo diferentes para procesar muestras de células y diferentes tipos de muestras de células. En algunos casos, se puede realizar un mismo flujo de trabajo de forma iterativa para corregir recursivamente una muestra de célula. En otros casos, se corrige una muestra de células recursivamente, pero el flujo de trabajo puede cambiar de una iteración a otra.

Las FIG. 10A a 10C ilustran ejemplos de flujos de trabajo que se pueden realizar utilizando un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado que incluye dos módulos de crecimiento celular 1002, 1008, dos módulos de filtración 1004 y 1010, y un módulo de electroporación 1006 de flujo continuo. Aunque se describen como módulos de crecimiento 1002, 1008 y módulos de filtración 1004, 1010 separados, en cambio, cada uno puede diseñarse como un módulo doble. Por ejemplo, un módulo de crecimiento doble, incluidos los módulos de crecimiento 1002 y 1008, puede incluir viales de crecimiento de rotación dobles que comparten algunos circuitos, controles, y una fuente de alimentación, y que están dispuestos en un mismo alojamiento. De manera análoga, un módulo de filtración doble puede incluir módulos de filtración 1004 y 1010, incluyendo dos filtros separados y tubos de suministro de líquido, pero compartiendo circuitos, controles, una fuente de alimentación y un alojamiento. Los módulos 1002, 1004, 1006, 1008 y 1010, por ejemplo, puede ser parte del instrumento 100 descrito en relación con las FIG. 1A y 1B.

Volviendo a la FIG. 10A, un diagrama de flujo ilustra un primer flujo de trabajo 1000 de corrección del genoma bacteriano que implica dos fases de procesamiento que tienen etapas de procesamiento idénticas, produciendo dos correcciones en un linaje de células 1012. Cada fase puede hacer funcionar en función de un cartucho diferente de materiales de origen. Por ejemplo, un primer cartucho puede incluir una primera colección de oligonucleótidos 1014a y una primera cadena principal de ARNgu 1016a. Un segundo cartucho, introducido en el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado entre las fases de procesamiento o antes del procesamiento, pero en una posición diferente a la del primer cartucho, puede incluir una segunda colección de oligonucleótidos 1014b y una segunda cadena principal de ARNgu 1016b. Cada cartucho se puede considerar como un "cartucho de una colección" para construir una colección de células corregidas. El linaje de células 1012, en algunos casos, se incluye en el cartucho de la primera colección. El linaje de células 1012 se puede suministrar dentro de un kit que incluye los dos cartuchos. Como alternativa, un usuario puede añadir un recipiente (p. ej., un vial o un tubo) del linaje de células 1012 a un cartucho adquirido.

El flujo de trabajo 1000, en algunos casos, se realiza basándose en una secuencia de órdenes ejecutada por un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. A la secuencia de órdenes, en un primer ejemplo, se puede acceder a través de un marcador legible por máquina o una etiqueta añadida al primer cartucho. En algunos casos, cada fase de procesamiento se realiza utilizando una secuencia de órdenes separada. Por ejemplo, cada cartucho puede incluir una indicación de una secuencia de órdenes o una secuencia de órdenes en sí misma para procesar el contenido del cartucho.

En algunas implementaciones, la primera fase comienza con la introducción del linaje de células 1012 en el primer módulo de crecimiento 1002 para la inoculación, crecimiento y control (1018a). En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación añade un vial del linaje de células 1012 al medio contenido en el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1012 del primer cartucho y añade el linaje de células 1012 al medio contenido en el vial rotatorio de crecimiento. Es posible que las células se hayan mantenido a una temperatura de 4 °C en este punto. En un ejemplo particular, se pueden cultivar 20 ml de linaje de células dentro de un vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 a una temperatura de 30 °C a una DO de 0,50. El linaje de células 1012 añadido al primer módulo de crecimiento 1002 puede controlarse a lo largo del tiempo hasta que se detecte una DO de 0,50 mediante el control automático del vial de crecimiento. El control puede ser periódico o continuo. Este puede durar, por ejemplo, aproximadamente 900 minutos (estimados), aunque el tiempo exacto depende de la detección de la DO deseada.

En algunas implementaciones, después de cultivar las células hasta la DO deseada, se añade un inductor al primer módulo de crecimiento 1002 para inducir las células. En un ejemplo particular, se pueden añadir 100 pl de inductor y el módulo de crecimiento 1002 puede llevar la temperatura de la mezcla hasta 42 °C y mantenerla durante 15 minutos.

El linaje de células 1012, después del crecimiento y de la inducción, se transfiere al primer módulo de filtración 1004, en algunas implementaciones, para convertir las células en electrocompetentes (1020a) y para reducir el volumen de las células para la transformación. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1012 desde el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 hasta un soporte de vial del primer módulo de filtración 1004. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1012 del vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. Por ejemplo, se puede utilizar la punta de pipeteo desechable utilizada para transferir el linaje de células 1012 al primer módulo de crecimiento 1002 para transferir el linaje de células 1012 desde el primer módulo de crecimiento 1002 hasta el primer módulo de filtración 1004. En algunos casos, antes de transferir el linaje de células 1012 desde el primer módulo de crecimiento 1002 hasta el primer módulo de filtración 1004, se enfría el primer módulo de crecimiento 1002 hasta 4 °C de manera que el linaje de células 1012 se reduce de manera similar a esta temperatura. En un ejemplo particular, la temperatura del primer módulo de crecimiento 1002 se puede reducir hasta aproximadamente 4 °C en un lapso de aproximadamente 8 minutos, y el módulo de crecimiento 1002 puede mantener la temperatura a 4 °C durante aproximadamente 15 minutos para garantizar la reducción de la temperatura del linaje de células 1012.

Antes de transferir el linaje de células, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del primer módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El primer módulo de filtración 1004, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

El primer módulo de filtración 1004, por ejemplo, puede formar parte de un módulo de filtración doble tal como el módulo de filtración 750 descrito en relación con las FIG. 7B y 7C. En un ejemplo particular, el primer módulo de filtración 1004 se puede mantener a 4 °C durante el proceso de lavado y elución mientras se transfieren materiales celulares entre un vial de elución y el primer módulo de filtración 1004.

En algunas implementaciones, al volver las células electrocompetentes en el módulo de filtración 1004, el linaje de células 1012 se transfiere a un módulo de transformación 1006 (p. ej., un módulo de electroporación de flujo continuo) para su transformación. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1012 desde el soporte del vial del primer módulo de filtración 1004 hasta un depósito del módulo de electroporación 1006 de flujo continuo. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1012 desde el primer módulo de filtración 1002 o un depósito temporal y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. En un ejemplo particular, se transfieren 400 pl del linaje de células 1012 concentrado del primer módulo de filtración 1004 a un depósito de mezcla antes de transferirlo al módulo de transformación 1006. Por ejemplo, el linaje de células 1012 puede transferirse a un depósito en un cartucho para mezclarlo con los ácidos nucleicos ensamblados, luego ser transferido por el sistema robótico de manipulación utilizando una punta de pipeta. En un ejemplo particular, el módulo de transformación se mantiene a 4 °C. El linaje de células 1012 puede transformarse, en un ejemplo ilustrativo, en aproximadamente cuatro minutos.

Mientras las células crecen y/o se vuelven electrocompetentes, en algunas implementaciones, una primera colección de oligonucleótidos 1014a y la cadena principal de ARNgu 1016a se ensamblan mediante un proceso de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos para crear ácidos nucleicos ensamblados en una mezcla maestra (1022a) de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos ensamblados pueden crearse en algún momento durante las primeras etapas 1018a, 1020a de procesamiento de la primera fase del flujo de trabajo 1000. Como alternativa, se pueden crear ácidos nucleicos ensamblados antes de comenzar la primera etapa 1018 del procesamiento.

En algunos casos, los ácidos nucleicos se ensamblan utilizando un módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, el sistema robótico de manipulación puede añadir la primera colección de oligonucleótidos 1014a y la cadena principal de ARNgu 1016a desde un recipiente de colecciones del cartucho de reactivos del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado hasta un módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos (no ilustrado), tal como el módulo de ensamblaje 1210g de ácidos nucleicos descrito en relación con la FIG. 12B. La mezcla de ensamblaje de ácidos nucleicos, por ejemplo, puede incluir, en un ejemplo particular, 50 pl de mezcla maestra Gibson Assembly®, 25 pl de cadena principal 1016a de vector y 25 pl de oligonucléotido 1014a. El módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos se puede mantener a temperatura ambiente. El proceso de ensamblaje puede tardar aproximadamente 30 minutos.

En otros casos, los ácidos nucleicos se ensamblan externamente al instrumento de procesamiento celular multimodular y se añaden como material de origen. Por ejemplo, se puede añadir un vial o tubo de ácidos nucleicos ensamblados a un cartucho de reactivos antes de activar la primera etapa 1018a del procesamiento celular. En un ejemplo particular, se proporcionan 100 pl de ácidos nucleicos ensamblados.

En algunas implementaciones, los ácidos nucleicos ensamblados se purifican (1024a). Los ácidos nucleicos ensamblados, por ejemplo, pueden ser transferidos por el sistema robótico de manipulación desde el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos hasta un módulo de purificación (no mostrado), tal como el módulo de purificación 1210h de la FIG. 12B. En otros casos, el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos puede incluir características de purificación (p. ej., un módulo combinado de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos y purificación). En casos adicionales, los ácidos nucleicos ensamblados se purifican externamente al instrumento de procesamiento celular multimodular y se añaden como material de origen. Por ejemplo, se puede añadir un vial o tubo de ácidos nucleicos ensamblados purificados a un cartucho de reactivos con el linaje de células 1012 antes de activar la primera etapa 1018a del procesamiento celular.

En un ejemplo particular, se purifican 100 pl de ácidos nucleicos ensamblados en una mezcla isotérmica de ensamblaje de ácidos nucleicos. En algunos casos, se añaden esferas magnéticas al módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, por ejemplo, el sistema robótico de manipulación puede añadir 180 pl de esferas magnéticas en una suspensión líquida al módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos. Se puede activar un imán acoplado funcionalmente al módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos y lavar la muestra en 200 pl de etanol (p. ej., el sistema robótico de manipulación puede transferir etanol al módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos). Los residuos líquidos de esta operación, en algunos casos, se transfieren a un receptáculo de residuos del cartucho (p. ej., mediante el sistema robótico de manipulación usando la misma punta de pipeta que se utiliza para transferir el etanol). En este momento, los ácidos nucleicos ensamblados desalinizados pueden transferirse a un recipiente de almacenamiento, tal como un depósito del cartucho. Los ácidos nucleicos ensamblados desalinizados pueden mantenerse, por ejemplo, a una temperatura de 4 °C hasta que las células estén listas para la transformación. En un ejemplo particular, se pueden añadir 100 pl de los ácidos nucleicos ensamblados a los 400 pl del linaje de células 1012 concentrado en el depósito de mezcla antes de la transferencia al módulo de transformación 1006. En algunos casos, el proceso de purificación puede durar aproximadamente 16 minutos.

En algunas implementaciones, los ácidos nucleicos ensamblados y el linaje de células 1012 se añaden al módulo de electroporación 1006 de flujo continuo, y el linaje de células 1012 se transforma (1026a). El sistema robótico de manipulación, por ejemplo, puede transferir la mezcla del linaje de células 1012 y los ácidos nucleicos ensamblados al módulo de electroporación 1006 de flujo continuo desde un depósito de mezcla, p. ej., utilizando una punta de pipeta o mediante la transferencia de un vial o tubo. En algunos casos, se utiliza un módulo de electroporación de flujo continuo incorporado tal como los módulos de electroporación 500 de flujo continuo de la FIG. 5A para transformar el linaje de células 1012. En otros casos, se utiliza un módulo de electroporación a base de cartuchos tal como el módulo de electroporación 530 de flujo continuo de la FIG. 5B para transformar el linaje de células 1012. El módulo de electroporación 1006, por ejemplo, puede mantenerse a una temperatura de 4 °C. El proceso de electroporación, en un ejemplo ilustrativo, puede durar aproximadamente cuatro minutos.

El linaje de células 1012 transformado, en algunas implementaciones, se transfiere al segundo módulo de crecimiento 1008 para su recuperación (1028a). En un ejemplo particular, las células transformadas se someten a un proceso de recuperación en el segundo módulo de crecimiento 1008 a una temperatura de 30 °C. Las células transformadas, por ejemplo, pueden mantenerse en el segundo módulo de crecimiento 1008 durante aproximadamente una hora para su recuperación.

En algunas implementaciones, se transfiere un medio selectivo al segundo vial de crecimiento (no ilustrado), y las células se dejan incubar durante un período de tiempo adicional en un proceso de selección. En un ejemplo ilustrativo, se puede transferir un antibiótico al segundo vial de crecimiento y las células se pueden incubar durante dos horas más a una temperatura de 30 °C.

Tras la recuperación, las células pueden estar listas para otra serie de corrección o para el almacenamiento en un recipiente, p. ej., para experimentos adicionales realizados fuera del entorno de procesamiento celular automatizado. Como alternativa, se puede transferir una parte de las células a una unidad de almacenamiento como colección de células resultante, mientras que otra parte de las células puede prepararse para una segunda serie de corrección.

En algunas implementaciones, en la preparación para una segunda serie de corrección, las células transformadas se transfieren al segundo módulo de filtración 1010 para el intercambio de medios y la filtración (1030a). Antes de transferir el linaje de células transformado, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del segundo módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede formar parte de un módulo de filtración doble tal como el módulo de filtración 750 descrito en relación con las FIG. 7B y 7C. En un ejemplo particular, el segundo módulo de filtración 1010 se puede mantener a 4 °C durante el proceso de lavado y elución mientras se transfieren materiales celulares entre un vial de elución y el segundo módulo de filtración 1010. El resultado de este proceso de filtración, en un ejemplo particular, se deposita en un vial o tubo a la espera de su posterior procesamiento, p. ej., la transferencia a un módulo de transformación. El vial o tubo puede mantenerse en una unidad de almacenamiento a una temperatura de 4 °C.

La primera fase del procesamiento puede tener lugar durante un solo día. En un caso ilustrativo, se estima que la primera fase del procesamiento tardará menos de 19 horas en completarse (p. ej., aproximadamente 18,7 horas). En este punto del flujo de trabajo 1000, en algunas implementaciones, los nuevos materiales se añaden manualmente al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, se puede añadir un nuevo cartucho de reactivos. Además, en este punto, se pueden añadir un nuevo cartucho de lavado, filtros de reemplazo y/o puntas de pipeta de reemplazo al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Además, en algunos casos, el módulo de filtros puede someterse a un proceso de limpieza y/o se pueden vaciar las unidades de residuos sólidos y líquidos en la preparación de la siguiente serie de procesamiento. En otros casos más, los cartuchos de reactivos pueden proporcionar reactivos para dos o más ciclos de corrección.

En algunas implementaciones, la segunda serie de corrección implica los mismos módulos 1002, 104, 1006, 1008 y 1010, las mismas etapas de procesamiento 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 y 1030, y los mismos intervalos de temperaturas y de tiempo que la primera fase de procesamiento descrita anteriormente. Por ejemplo, la segunda colección de oligonucleótidos 1014b y la segunda cadena principal 1016b de ARNgu se pueden utilizar para corregir las células transformadas de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Aunque se ilustra como un proceso de dos fases, en otras realizaciones, se pueden realizar hasta dos, cuatro, seis, ocho o más recursiones para continuar corrigiendo el mismo linaje de células 1012.

En otras implementaciones, volviendo a la FIG. 10B, un flujo de trabajo 1040 implica los mismos módulos 1002, 1004, 1006, 1008 y 1010, así como las mismas etapas 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 y 1030 de procesamiento para la primera fase del proceso. Sin embargo, a diferencia del flujo de trabajo 1000 de la FIG. 10A, una segunda fase del flujo de trabajo 1040 de la FIG. 10B implica etapas de curado. El "curado" es un proceso en el que un vector, por ejemplo, el vector de corrección utilizado en la serie anterior de corrección, el vector "motor" que comprende la secuencia de expresión de la nucleasa, o ambos, se eliminan de las células transformadas. El curado puede realizarse mediante, p. ej., la escisión del vector de corrección utilizando un plásmido de curado volviendo al vector de corrección y/o vector motor no funcionales (ilustrado en el flujo de trabajo de la FIG. 10b); la dilución del vector en la población de células a través del crecimiento celular (es decir, cuantos más ciclos de crecimiento atraviesan las células, menos células hijas retendrán los vectores de corrección o vectores motor) (no se muestra), o mediante, p. ej., la utilización de un origen de replicación sensible al calor en el vector de corrección o vector motor (no mostrado). En un ejemplo, un "plásmido de curado" puede estar contenido dentro del cartucho de reactivos del instrumento automatizado o puede añadirse manualmente al instrumento antes de la segunda fase de procesamiento. Al igual que con el flujo de trabajo 1000, en algunos casos, el flujo de trabajo 1040 se realiza basándose en una secuencia de órdenes ejecutada por un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. A la secuencia de órdenes, en un primer ejemplo, se puede acceder a través de un marcador legible por máquina o una etiqueta añadida al primer cartucho. En algunos casos, cada fase de procesamiento se realiza utilizando una secuencia de órdenes separada. Por ejemplo, cada cartucho puede incluir una indicación de una secuencia de órdenes o una secuencia de órdenes en sí misma para procesar el contenido del cartucho. De esta manera, por ejemplo, la segunda fase, que incluye el cartucho de curado, se puede realizar utilizando una secuencia de órdenes diseñada para la configuración (p. ej., temperaturas, tiempos, cantidades de materiales, etc.) apropiada para el curado. Las condiciones de curado dependerán del mecanismo utilizado para el curado; es decir, en este ejemplo, la forma en que el plásmido de curado escinda el plásmido de corrección y/o plásmido motor.

En algunas implementaciones, la segunda fase del flujo de trabajo 1040 comienza al recibir las primeras células corregidas de la primera fase del flujo de trabajo 1040 en el primer módulo de crecimiento 1002. Por ejemplo, las células corregidas en primer lugar se pueden haber corregido utilizando un linaje de células 1042, una colección de oligonucleótidos 1044 y una cadena principal 1046 de ARNgu mediante la aplicación de las etapas 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 y 1030 como se describe en relación con el flujo de trabajo 1000 de la FIG. 10a . El linaje de células 1042 corregido en primer lugar, por ejemplo, puede transferirse al primer módulo de crecimiento 1002 mediante un sistema robótico de manipulación. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación añade un vial del linaje de células 1042 corregido en primer lugar a un vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1042 corregido en primer lugar desde un receptáculo de una unidad de almacenamiento y añade el linaje de células 1042 al vial rotatorio de crecimiento. Es posible que las células se hayan mantenido a una temperatura de 4 °C en este punto.

En algunas implementaciones, las células corregidas en primer lugar se inoculan, se cultivan y se controlan en el primer módulo de crecimiento 1002 (1018d). En un ejemplo particular, se puede transferir una alícuota del linaje de células 1042 corregido en primer lugar a un vial rotatorio de crecimiento que contenga, p. ej., 20 ml de medio de cultivo a una temperatura de 30 °C a una DO de 0,50. El linaje de células 1042 añadido al primer módulo de crecimiento 1002 puede controlarse a lo largo del tiempo hasta que se detecte una DO de 0,50 a través del control automatizado. El control puede ser periódico o continuo. Este puede durar, por ejemplo, aproximadamente 900 minutos (estimados), aunque el tiempo exacto depende de la detección de la DO deseada.

En algunas implementaciones, después de crecer hasta la DO deseada, se añade un inductor al primer módulo de crecimiento 1002 para inducir las células. En un ejemplo particular, se pueden añadir 100 pl de inductor y el módulo de crecimiento 1002 puede llevar la temperatura de la mezcla hasta 42 °C y mantenerla durante 15 minutos.

El linaje de células 1042 corregido en primer lugar, después del crecimiento y de la inducción, se transfiere al primer módulo de filtración 1004, en algunas implementaciones, para convertir en electrocompetentes las células corregidas en primer lugar (1020d). En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1042 corregido en primer lugar desde el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 hasta un soporte de vial del primer módulo de filtración 1004. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1042 corregido en primer lugar desde el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. Por ejemplo, se puede utilizar la punta de pipeteo desechable utilizada para transferir el linaje de células 1042 corregido en primer lugar al primer módulo de crecimiento 1002 para transferir el linaje de células 1042 desde el primer módulo de crecimiento 1002 al primer módulo de filtración 1004. En algunos casos, antes de transferir el linaje de células 1042 desde el primer módulo de crecimiento 1002 hasta el primer módulo de filtración 1004, se enfría el primer módulo de crecimiento 1002 hasta 4 °C de manera que el linaje de células 1042 se reduce de manera similar a esta temperatura. En un ejemplo particular, la temperatura del primer módulo de crecimiento 1002 se puede reducir hasta aproximadamente 4 °C en un lapso de aproximadamente 8 minutos, y el módulo de crecimiento 1002 puede mantener la temperatura a 4 °C durante aproximadamente 15 minutos para garantizar la reducción de la temperatura del linaje de células 1012.

Antes de transferir el linaje de células 1042 corregido en primer lugar al módulo de filtración, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del primer módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El primer módulo de filtración 1004, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

En algunas implementaciones, al volver electrocompetentes las células corregidas en primer lugar en el módulo de filtración 1004 (1020d), el linaje de células corregido en primer lugar 1042 se transfiere a un módulo de transformación 1006 (p. ej., módulo de electroporación de flujo continuo) para su transformación. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1042 desde el soporte del vial del primer módulo de filtración 1004 hasta un depósito del módulo de electroporación 1006 de flujo continuo. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1042 desde el primer módulo de filtración 1002 o un depósito temporal y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. En un ejemplo particular, se transfieren 400 pl del linaje de células 1042 concentrado del primer módulo de filtración 1004 a un depósito de mezcla antes de transferirlo al módulo de transformación 1006. Por ejemplo, el linaje de células 1042 puede transferirse a un depósito en un cartucho para mezclarlo con un plásmido de curado 1050, a continuación, puede mezclarse y transferirse mediante el sistema robótico de manipulación utilizando una punta de pipeta. En un ejemplo particular, el módulo de transformación 1006 se mantiene a 4 °C. El linaje de células 1042 puede transformarse, en un ejemplo ilustrativo, en aproximadamente cuatro minutos.

El linaje de células 1042 transformado, en algunas implementaciones, se transfiere al segundo módulo de crecimiento 1008 para su recuperación/curado (1028d). En un ejemplo particular, se someten 20 ml de células transformadas a un proceso de recuperación en el segundo módulo de crecimiento 1008 a una temperatura de 30 °C. Las células transformadas, por ejemplo, pueden mantenerse en el segundo módulo de crecimiento 1008 durante aproximadamente una hora para su recuperación. Si se desea otra serie de corrección, se cura el primer plásmido o vector de corrección. Si no se desea otra serie de corrección, se pueden curar el primer plásmido de corrección y el plásmido motor.

Tras la recuperación y el curado, las células pueden estar listas para otra serie de corrección o para su almacenamiento para usar en investigaciones adicionales fuera del instrumento de procesamiento celular automatizado. Por ejemplo, se puede transferir una parte de las células a una unidad de almacenamiento como colección de células resultante, mientras que otra parte de las células puede prepararse para una segunda serie de corrección.

En algunas implementaciones, en la preparación para una segunda serie de corrección, las células transformadas se transfieren al segundo módulo de filtración 1010 para el intercambio de medios y la filtración (1030d) que contiene glicerol para volver electrocompetentes las células. Antes de transferir el linaje de células transformado, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del segundo módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede formar parte de un módulo de filtración doble tal como el módulo de filtración 750 descrito en relación con las FIG. 7B y 7C. En un ejemplo particular, el segundo módulo de filtración 1010 se puede mantener a 4 °C durante el proceso de lavado y elución mientras se transfieren materiales celulares entre un vial de elución y el segundo módulo de filtración 1010. El resultado de este proceso de filtración, en un ejemplo particular, son células electrocompetentes depositadas en un vial o tubo a la espera de su posterior procesamiento. El vial o tubo puede mantenerse en una unidad de almacenamiento a una temperatura de 4 °C.

Volviendo a la FIG. 10C, un diagrama de flujo ilustra un flujo de trabajo 1060 de levadura que implica dos fases de procesamiento que tienen etapas de procesamiento idénticas, produciendo dos correcciones en un linaje de células 1062. Cada fase puede hacer funcionar en función de un cartucho diferente de materiales de origen. Por ejemplo, un primer cartucho puede incluir una primera colección de oligonucleótidos 1070a y una primera cadena principal 1072a de ARNgu. Un segundo cartucho, introducido en el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado entre las fases de procesamiento o antes del procesamiento, pero en una posición diferente a la del primer cartucho, puede incluir una segunda colección de oligonucleótidos 1070b y una segunda cadena principal 1072b de ARNgu. Cada cartucho se puede considerar como un "cartucho de una colección" para construir una colección de células corregidas. Como alternativa, un usuario puede añadir un recipiente (p. ej., un vial o un tubo de linaje de células 1062a a cada uno de los cartuchos adquiridos incluidos en un kit de células de levadura.

El flujo de trabajo 1060, en algunos casos, se realiza basándose en una secuencia de órdenes ejecutada por un sistema de procesamiento del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado, tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. A la secuencia de órdenes, en un primer ejemplo, se puede acceder a través de un marcador legible por máquina o una etiqueta añadida al primer cartucho. En algunas realizaciones, cada fase de procesamiento se realiza utilizando una secuencia de órdenes separada. Por ejemplo, cada cartucho puede incluir una indicación de una secuencia de órdenes o una secuencia de órdenes en sí misma para procesar el contenido del cartucho.

En algunas implementaciones, la primera fase comienza con la introducción del linaje de células 1062 en el primer módulo de crecimiento 1002 para la inoculación, el crecimiento y el control (1018e). En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación añade un vial de linaje de células 1062 a un vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1062 del primer cartucho y añade el linaje de células 1062 al vial rotatorio de crecimiento. Es posible que las células se hayan mantenido a una temperatura de 4 °C en este punto. En un ejemplo particular, se pueden cultivar 20 ml de linaje de células dentro de un vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 a una temperatura de 30 °C a una DO de 0,75. El linaje de células 1012 añadido al primer módulo de crecimiento 1002 puede controlarse automáticamente a lo largo del tiempo dentro del módulo de crecimiento 1002 hasta que se detecte una DO de 0.75 a través del control automatizado. El control puede ser periódico o continuo.

En algunas implementaciones, se puede utilizar un sistema de expresión inducible. Por tanto, después de crecer hasta la DO deseada, se añade un inductor al primer módulo de crecimiento 1002 para inducir las células. El inductor podría ser una molécula pequeña o un intercambio de medios a un medio con un azúcar diferente como la galactosa.

El linaje de células 1062, después del crecimiento y de la inducción, se transfiere al primer módulo de filtración 1004, en algunas implementaciones, para intercambiar medios (1064a). En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1062 desde el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 hasta un soporte de vial del primer módulo de filtración 1004. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1062 del vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. Por ejemplo, se puede utilizar la punta de pipeteo desechable utilizada para transferir el linaje de células 1062a al primer módulo de crecimiento 1002 para transferir el linaje de células 1062 desde el primer módulo de crecimiento 1002 al primer módulo de filtración 1004. En algunos casos, antes de transferir el linaje de células 1062 desde el primer módulo de crecimiento 1002 hasta el primer módulo de filtración 1004, se enfría el primer módulo de crecimiento 1002 hasta 4 °C de manera que el linaje de células 1062 se reduce de manera similar a esta temperatura. En un ejemplo particular, la temperatura del primer módulo de crecimiento 1002 se puede reducir hasta aproximadamente 4 °C en un lapso de aproximadamente 8 minutos, y el módulo de crecimiento 1002 puede mantener la temperatura a 4 °C durante aproximadamente 15 minutos para garantizar la reducción de la temperatura del linaje de células 1062. Durante el intercambio de medios, en un ejemplo ilustrativo, se pueden añadir 0,4 ml de sorbitol 1 M al linaje de células 1062.

Antes de transferir el linaje de células 1062, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del primer módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El primer módulo de filtración 1004, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

Después de la operación de intercambio de medios, en algunas implementaciones, se transfiere el linaje de células 1062 de nuevo al primer módulo de crecimiento 1002 para el acondicionamiento (1066a). En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1062 desde el primer módulo de filtración 1004 hasta el primer módulo de crecimiento 1002. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1062 del primer módulo de filtración 1004 y lo suministra al vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002. Durante el acondicionamiento, por ejemplo, se pueden añadir 5 ml de DTT/LIAc y Sorbitol 80 mM al linaje de células 1062. Por ejemplo, el sistema robótico de manipulación puede transferir el TDT/LIAc y Sorbitol, individual o simultáneamente, al primer módulo de crecimiento 1002. El linaje de células 1062 se puede mezclar con DTT/LIAc y Sorbitol, por ejemplo, a través de la rotación del vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002. Durante el acondicionamiento, el linaje de células 1062 se puede mantener a una temperatura de 4 °C.

En algunas implementaciones, tras el acondicionamiento, el linaje de células 1062 se transfiere al primer módulo de filtración 1004 para lavar y preparar las células (1068). Por ejemplo, las células pueden volverse electrocompetentes en esta etapa. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1062 desde el vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 hasta un soporte de vial del primer módulo de filtración 1004. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1062 del vial rotatorio de crecimiento del primer módulo de crecimiento 1002 y lo suministra al primer módulo de filtración 1004.

Antes de transferir el linaje de células, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del primer módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1A. El primer módulo de filtración 1004, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A. En otros casos, se usa el mismo filtro para volver electrocompetente que el filtro utilizado para el intercambio de medios en la etapa 1064a. En algunas realizaciones, se usa sorbitol 1 M para volver electrocompetentes las células de levadura.

En algunas implementaciones, al volverse electrocompetente en el módulo de filtración 1004, el linaje de células 1062 se transfiere a un módulo de transformación 1006 (p. ej., un módulo de electroporación de flujo continuo) para su transformación. En un ejemplo, un sistema robótico de manipulación mueve el vial del linaje de células 1062 desde el soporte del vial del primer módulo de filtración 1004 hasta un depósito del módulo de electroporación 1006 de flujo continuo. En otro ejemplo, el sistema robótico de manipulación pipetea el linaje de células 1062 desde el módulo de filtración 1004 o un depósito temporal y lo suministra al primer módulo de filtración 1004. En un ejemplo particular, se transfieren 400 pl del linaje de células 1062 concentrado del primer módulo de filtración 1004 a un depósito de mezcla antes de transferirlo al módulo de transformación 1006. Por ejemplo, el linaje de células 1062 puede transferirse a un depósito de un cartucho para mezclarlo con los componentes del ácido nucleico (cadena principal y oligonucleótido de corrección), luego se mezcla y se transfiere mediante el sistema robótico de manipulación utilizando una punta de pipeta. Dado que la cadena principal (vector) y el oligonucleótido de corrección se ensamblan en las células (in vivo), un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos no es un componente necesario para la corrección de levadura. En un ejemplo particular, el módulo de transformación se mantiene a 4 °C.

En algunas implementaciones, los ácidos nucleicos que se van a ensamblar y el linaje de células 1062 se añaden al módulo de electroporación 1006 de flujo continuo, y se transforma el linaje de células 1062 (1026e). El sistema robótico de manipulación, por ejemplo, puede transferir la mezcla del linaje de células 1062e y el ensamblaje de ácidos nucleicos al módulo de electroporación 1006 de flujo continuo desde un depósito de mezcla, p. ej., utilizando una punta de pipeta o mediante la transferencia de un vial o tubo. En algunas realizaciones, se utiliza un módulo de electroporación de flujo continuo incorporado tal como los módulos de electroporación 500 de flujo continuo de la FIG.

5A para transformar el linaje de células 1062e. En otras realizaciones, se utiliza un módulo de electroporación a base de cartuchos tal como el módulo de electroporación 530 de flujo continuo de la FIG. 5B para transformar el linaje de células 1062e. El módulo de electroporación 1006, por ejemplo, puede mantenerse a una temperatura de 4 °C.

El linaje de células 1062e transformado, en algunas implementaciones, se transfiere al segundo módulo de crecimiento 1008 para su recuperación (1028a). En un ejemplo particular, se someten 20 ml de células transformadas a un proceso de recuperación en el segundo módulo de crecimiento 1008.

En algunas implementaciones, un medio selectivo, p.ej., un medio de crecimiento auxotrófico o un medio que contiene un fármaco, se transfiere al segundo vial de crecimiento (no ilustrado), y las células se dejan incubar durante un período de tiempo adicional en un proceso de selección. En un ejemplo ilustrativo, se puede transferir un antibiótico al segundo vial de crecimiento y las células se pueden incubar durante dos horas más a una temperatura de 30 °C.

Tras la recuperación, las células pueden estar listas para otra serie de corrección o para el almacenamiento en una colección de células. Por ejemplo, una parte de las células puede transferirse a una unidad de almacenamiento como colección de células resultante (1076a), mientras que otra parte de las células puede prepararse para una segunda serie de corrección (1078a). Las células pueden almacenarse, por ejemplo, a una temperatura de 4 °C.

En algunas implementaciones, en la preparación para una segunda serie de corrección, las células transformadas se transfieren al segundo módulo de filtración 1010 para el intercambio de medios (1078a). Antes de transferir el linaje de células 1062a transformado, en algunas implementaciones, se lava previamente un filtro del segundo módulo de filtración 1004 utilizando una solución de lavado. La solución de lavado, por ejemplo, puede suministrarse en un cartucho de lavado, tal como el cartucho 1006 descrito en relación con la FIG. 1a . El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede estar conectado de forma fluida a la solución de lavado del cartucho de lavado, como se describe en relación con la FIG. 7A.

El segundo módulo de filtración 1010, por ejemplo, puede formar parte de un módulo de filtración doble tal como el módulo de filtración 750 descrito en relación con las FIG. 7B y 7C. En un ejemplo particular, el segundo módulo de filtración 1010 se puede mantener a 4 °C durante el proceso de lavado y elución mientras se transfieren materiales celulares entre un vial de elución y el segundo módulo de filtración 1010.

En algunas implementaciones durante el proceso de filtración, se añade una preparación enzimática para lisar las paredes celulares del linaje de células 1062a. Por ejemplo, se puede añadir una enzima lítica de levadura tal como Zylomase® para lisar las paredes celulares. La enzima lítica de levadura, en un ejemplo particular, puede incubarse en el linaje de células 1026a durante entre 5-60 minutos a una temperatura de 30 °C. El resultado de este proceso de filtración, en un ejemplo particular, se deposita en un vial o tubo a la espera de su posterior procesamiento. El vial o tubo puede mantenerse en una unidad de almacenamiento a una temperatura de 4 °C.

La primera fase del procesamiento puede tener lugar durante un solo día. En este punto del flujo de trabajo 1060, en algunas implementaciones, los nuevos materiales se añaden manualmente al instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Por ejemplo, se puede añadir un nuevo linaje de células 1062b y un nuevo cartucho de reactivos. Además, en este punto, se pueden añadir un nuevo cartucho de lavado, filtros de reemplazo y/o puntas de pipeta de reemplazo al sistema de procesamiento celular multimodular automatizado. Además, en algunos casos, el módulo de filtros puede someterse a un proceso de limpieza y/o se pueden vaciar las unidades de residuos sólidos y líquidos en la preparación de la siguiente serie de procesamiento.

En algunas implementaciones, la segunda serie de corrección implica los mismos módulos 1002, 104, 1006, 1008 y 1010, las mismas etapas 1018, 1064, 1066, 1026, 1028 y 1076 y/o 1078 de procesamiento, y las mismas condiciones (p. ej., temperaturas, intervalos de tiempo, etc.) que la primera fase de procesamiento descrita anteriormente. Por ejemplo, la segunda colección de oligonucleótidos 1070b y la segunda cadena principal 1072b de ARNgu se pueden utilizar para corregir una combinación de las células transformadas de forma muy similar a la descrita anteriormente. Aunque se ilustra como un proceso de dos fases, en otras realizaciones, se pueden realizar hasta dos, tres, cuatro, seis, ocho o más recursiones para continuar corrigiendo el linaje de células 1062.

Los siguientes ejemplos ilustran el uso del instrumento de la divulgación.

Ejemplo I: ejecución de la corrección dirigida por RGN Singleplex completamente automatizada

La corrección genómica automatizada Singleplex utilizando la nucleasa MAD7 se realizó con éxito con un instrumento multimodular automatizado de la divulgación. Véase la patente de EE.UU. n.° 9.982.279.

Se ensamblaron una cadena principal de plásmido ampR y un casete de corrección lacZ_F172* a través de Gibson Assembly® en un "vector de corrección" en un módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos incluido en el instrumento automatizado. lacZ_F172 desactiva funcionalmente el gen lacZ. "lacZ_F172*" indica que la corrección se produce en el resto 172 de la secuencia de aminoácidos de lacZ. Después del ensamblaje, se desalinizó el producto en el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos utilizando esferas AMPure, se lavó con etanol al 80 % y se eluyó en tampón. Se transfirieron el vector de corrección ensamblado y las células de E. coli electrocompetentes, listas para la recombinación, a un módulo de transformación para la electroporación. El módulo de transformación comprendía una cubeta de ADP-EPC. Véase, p. ej., patente de EE.UU. n.° 62/551069. Se combinaron las células y los ácidos nucleicos, y se permitió la mezcla durante 1 minuto y se realizó la electroporación durante 30 segundos. Los parámetros para el impulso de poración fueron: tensión, 2400 V; longitud, 5 ms; intervalo, 50 ms; número de impulsos, 1; polaridad, . Los parámetros para los impulsos de transferencia fueron: tensión, 150 V; longitud, 50 ms; intervalo, 50 ms; número de impulsos, 20; polaridad, /-. Después de la electroporación, se transfirieron las células a un módulo de recuperación (otro módulo de crecimiento) y se permitió su recuperación en medio SOC que contenía cloranfenicol. Se añadió carbenicilina al medio después de 1 hora y se permitió la recuperación de las células durante otras 2 horas. Tras la recuperación, se mantuvieron las células a 4 °C hasta que el usuario las recuperó.

Después del proceso automatizado y la recuperación, se sembró una alícuota de células en una base de agar MacConkey suplementada con lactosa (como sustrato de azúcar), cloranfenicol y carbenicilina, y se cultivó hasta que aparecieron colonias. Las colonias blancas representaban células corregidas funcionalmente, las colonias moradas representaban células sin corregir. Todas las transferencias de líquidos se realizaron mediante el dispositivo de manipulación de líquidos automatizado del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

El resultado del tratamiento automatizado fue que se transformaron aproximadamente 1,0E-03 células totales (comparable a los resultados de laboratorio convencionales) y que la eficiencia de corrección fue del 83,5 %. La corrección de lacZ_172 en las colonias blancas se confirmó mediante la secuenciación de la región corregida del genoma de las células. Además, las etapas del procesamiento celular automatizado se observaron de forma remota por cámara web y se enviaron mensajes de texto para actualizar el estado del procedimiento de procesamiento automatizado.

Ejemplo II: ejecución de la corrección recursiva totalmente automatizada

La corrección recursiva se realizó con éxito utilizando el sistema automatizado de procesamiento celular multimodular. Se ensamblaron una cadena principal de plásmido ampR y un casete de corrección lacZ-V10* a través de Gibson Assembly® en un "vector de corrección" en un módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos incluido en el sistema automatizado. Similar a la corrección de lacZ_F172, la corrección de lacZ_V10 desactiva funcionalmente el gen lacZ. "lacZ_V10" indica que la corrección se produce en la posición de aminoácido 10 de la secuencia de aminoácidos de lacZ. Después del ensamblaje, se desalinizó el producto en el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos utilizando esferas AMPure, se lavó con etanol al 80 % y se eluyó en tampón. Se transfirieron el primer vector de corrección ensamblado y las células de E. coli electrocompetentes, listas para la recombinación, a un módulo de transformación para la electroporación. El módulo de transformación comprendía una cubeta de ADP-EPC. Se combinaron las células y los ácidos nucleicos, y se permitió la mezcla durante 1 minuto y se realizó la electroporación durante 30 segundos. Los parámetros para el impulso de poración fueron: tensión, 2400 V; longitud, 5 ms; intervalo, 50 ms; número de impulsos, 1; polaridad, . Los parámetros para los impulsos de transferencia fueron: tensión, 150 V; longitud, 50 ms; intervalo, 50 ms; número de impulsos, 20; polaridad, /-. Después de la electroporación, se transfirieron las células a un módulo de recuperación (otro módulo de crecimiento), permitiendo su recuperación en medio SOC que contenía cloranfenicol. Se añadió carbenicilina al medio después de 1 hora y las células se cultivaron durante otras 2 horas. A continuación, se transfirieron las células a un módulo de centrífuga y luego se realizó un intercambio de medios. Se volvieron a suspender las células en TB que contenía cloranfenicol y carbenicilina, donde las células se cultivaron hasta una DO600 de 2,7, y a continuación, se concentraron y se volvieron electrocompetentes.

Durante el crecimiento celular, se preparó un segundo vector de corrección en el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos. El segundo vector de corrección comprendía un gen de resistencia a la kanamicina, y el casete de corrección comprendía una corrección galK Y145*. Si tiene éxito, la corrección galK Y145* confiere a las células la capacidad de captar y metabolizar la galactosa. La corrección generada por el casete galK Y154* introduce un codón finalizador en el aminoácido 154, cambiando el aminoácido tirosina a un codón finalizador. Esta corrección vuelve al producto del gen galK no funcional y evita que las células puedan metabolizar la galactosa. Después del ensamblaje, se desalinizó el segundo producto del vector de corrección en el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos utilizando esferas AMPure, se lavó con etanol al 80 % y se eluyó en tampón. Se transfirieron el segundo vector de corrección ensamblado y las células de E. coli electrocompetentes (que se transformaron y seleccionaron para el primer vector de corrección) a un módulo de transformación para la electroporación, utilizando los mismos parámetros que se han detallado anteriormente. Después de la electroporación, se transfirieron las células a un módulo de recuperación (otro módulo de crecimiento), y se permitió su recuperación en medio SOC que contenía carbenicilina. Tras la recuperación, las células se mantuvieron a 4 °C hasta que se recuperaron, tras lo que se sembró una alícuota de células en agar LB suplementado con cloranfenicol y kanamicina. Para cuantificar las correcciones tanto de lacZ como de galK, se generaron placas de parche de réplica en dos tipos de medios: 1) base de agar MacConkey suplementada con lactosa (como sustrato de azúcar), cloranfenicol y kanamicina, y 2) base de agar MacConkey suplementada con galactosa (como sustrato de azúcar), cloranfenicol y kanamicina. Todas las transferencias de líquidos se realizaron mediante el dispositivo de manipulación de líquidos automatizado del sistema de procesamiento celular multimodular automatizado.

En este experimento de corrección recursiva, el 41 % de las colonias analizadas tenían correcciones de lacZ y galK, cuyos resultados fueron comparables a las eficiencias de la corrección doble obtenidas utilizando un enfoque manual o de "sobremesa".

Realizaciones alternativas de la arquitectura de los instrumentos

Las FIG. 12A y 12B ilustran ejemplos de realizaciones alternativas de instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados para realizar el procesamiento celular automatizado, p. ej., la corrección en múltiples células en un solo ciclo. Los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados, por ejemplo, pueden ser instrumentos de sobremesa diseñados para usar en un entorno de laboratorio. Los instrumentos de corrección celular multimodular automatizados pueden tener incorporada una mezcla de elementos reutilizables y desechables para realizar diferentes operaciones por fases en la realización de la escisión y/o corrección automatizadas del genoma en las células.

La FIG. 12A es un diagrama de bloques de un primer ejemplo de instrumento 1200 para realizar el procesamiento celular automatizado, p. ej., la corrección en múltiples células en un solo ciclo de acuerdo con la divulgación. En algunas implementaciones, el instrumento 1200 incluye una plataforma 1202, un receptáculo 1204 de suministro de reactivos para introducir componentes de muestra de ADN en el instrumento 1200, un receptáculo 1206 de suministro de células para introducir células en el instrumento 1200, y un sistema robótico de manipulación 1208 para mover materiales entre los receptáculos (por ejemplo, receptáculos 1204, 1206, 1212, 1222, 1224 y 1226) de los módulos (por ejemplo, módulos 1210a, 1210b, 1210c, 1210d) y unidades de almacenamiento (p. ej., unidades 1216, 1218, 1228 y 1214) del instrumento 1200 para realizar el procesamiento celular automatizado. Una vez finalizado el procesamiento del suministro celular 1206, en algunas realizaciones, las células resultantes 1212 se pueden transferir mediante el sistema robótico de manipulación 1208 a una unidad de almacenamiento 1214 para su almacenamiento temporal y posterior recuperación.

El sistema robótico de manipulación 1208, por ejemplo, puede incluir una bomba de desplazamiento de aire para transferir líquidos desde las diferentes fuentes de materiales a los diferentes módulos 1210 y la unidad de almacenamiento 1214. En otras realizaciones, el sistema robótico de manipulación 1208 puede incluir un cabezal de recogida y colocación para transferir recipientes de materiales de origen (p. ej., tubos) desde un cartucho de suministro (no ilustrado, explicado en relación con la FIG. 1A) a los diferentes módulos 1210. En algunas realizaciones, una o más cámaras u otros sensores ópticos (no mostrados), confirman el movimiento y la posición correctos del pórtico.

En algunas realizaciones, el sistema robótico de manipulación 1208 utiliza puntas de transferencia desechables proporcionadas en un suministro 1216 de puntas de transferencia para transferir materiales de origen, reactivo 1204 (p. ej., ensamblaje de ácidos nucleicos) y células 1206 dentro del instrumento 1200. Las puntas de transferencia 1216 usadas, por ejemplo, puede desecharse en una unidad 1218 de residuos sólidos. En algunas implementaciones, la unidad 1218 de residuos sólidos contiene un nivelador para retirar los tubos del cabezal de recogida y colocación del sistema robótico de manipulación 1208.

En algunas realizaciones, el instrumento 1200 incluye cubetas electroporadoras con succionadores que se conectan a una bomba de desplazamiento de aire. En algunas implementaciones, las células 1206 y el reactivo 1204 se aspiran en la cubeta de electroporación a través de un succionador, y la cubeta se mueve a uno o más módulos 1210 del instrumento 1200.

En algunas implementaciones, el instrumento 1200 está controlado por un sistema de procesamiento 1220 tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13. El sistema de procesamiento 1220 puede configurarse para hacer funcionar el instrumento 100 en función de la entrada del usuario. El sistema de procesamiento 1220 puede controlar la cronología, duración, temperatura y otras operaciones de los diferentes módulos 1210 del instrumento 1200. El sistema de procesamiento 1220 puede estar conectado a una fuente de alimentación (no mostrada) para el funcionamiento del instrumento 1200.

En algunas realizaciones, el instrumento 1200 incluye un módulo de transformación 1210c para la introducción de, p. ej., en el contexto de la corrección, ácido(s) nucleico(s) en las células 1206. Por ejemplo, el sistema robótico de manipulación 1208 puede transferir el reactivo 1204 y las células 1206 al módulo de transformación 1210c. El módulo de transformación 1210 puede realizar cualquier transformación celular o técnicas de transfección utilizadas habitualmente por los expertos en el campo de la transfección, transformación y microfluídica. La transformación pretende incluir varias técnicas reconocidas en este campo para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena (p. ej., ADN) en una célula diana, incluyendo aquellas técnicas de transformación y transfección. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, electroporación, lipofección, optoporación, inyección, microprecipitación, microinyección, liposomas, bombardeo de partículas, sonoporación, poración inducida por láser, transfección de esferas, coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, o transfección mediada por DEAE-dextrano. La transformación puede tener lugar en tubos de microcentrífuga, tubos de ensayo, cubetas, placas de múltiples pocillos, microfibras o instrumentos de flujo. El sistema de procesamiento 1220 puede controlar la temperatura y el funcionamiento del módulo de transformación 1210c. En algunas implementaciones, el sistema de procesamiento 1270 efectúa el funcionamiento del módulo de transformación 1210c según uno o más controles variables establecidos por un usuario.

En algunas implementaciones, el módulo de transformación 1210c está configurado para preparar células para la captación de vectores aumentando la competencia celular con una solución de pretratamiento, 1222, p. ej., lavado con sacarosa o glicerol. Adicionalmente, se pueden utilizar técnicas híbridas que aprovechen las capacidades de los métodos de transfección mecánicos y químicos, p. ej., magnetofección, una metodología de transfección que combina la transfección química con métodos mecánicos. En otro ejemplo, los lípidos catiónicos se pueden implementar en combinación con pistolas de genes o electroporadores. Se pueden encontrar materiales y métodos adecuados para transformar o transfectar células diana, p. ej., en Green y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014), y otros manuales de laboratorio.

Después de la transformación, en algunas implementaciones, las células pueden transferirse a un módulo de recuperación 1210d. En algunas realizaciones, el módulo de recuperación 1210d es un módulo combinado de recuperación e inducción de la corrección. En el módulo de recuperación 1210d, se puede permitir la recuperación de las células, expresen los ácidos nucleicos y, en un sistema de nucleasa inducible, se introduce una nucleasa en las células, p. ej., por medio de inducción controlada temporalmente, tal como, en algunos ejemplos, inducción química, luminosa, vírica o de temperatura, o la introducción de una molécula inductora 1224 para la expresión de la nucleasa.

Después de la corrección, en algunas implementaciones, las células se transfieren a la unidad de almacenamiento 1214, donde las células se pueden almacenar células resultantes 1212 hasta que las células se retiran para su posterior estudio o recuperación de una población de células corregida, p. ej., una colección de células corregida.

En algunas implementaciones, el instrumento 1200 está diseñado para la corrección recursiva del genoma, donde se introducen múltiples correcciones secuencialmente en genomas dentro de las células de una población de células. En algunas implementaciones, el suministro de reactivo 1204 se repone antes de acceder a las células resultantes 1212 de la unidad de almacenamiento para el procesamiento recursivo. En otras implementaciones, se pueden introducir múltiples suministros de reactivos 1204 y/o grandes volúmenes de los mismos en el instrumento 1200 de modo que no se requiera necesariamente la interacción del usuario antes de un ciclo de procesamiento posterior.

Una parte de una células resultantes 1212a, en algunas realizaciones, se transfiere a un módulo de crecimiento celular automatizado 1210a. Por ejemplo, se pueden transferir todas las células resultantes 1212a, o se puede transferir solo una alícuota, de modo que el instrumento retenga muestras modificadas por incrementos. El módulo de crecimiento celular 1210a, en algunas implementaciones, mide la DO de las células durante el crecimiento para garantizar que estén a la concentración deseada antes de la inducción de la corrección. Otras medidas de la densidad celular y del estado fisiológico que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, pH, oxígeno disuelto, enzimas liberadas, propiedades acústicas y propiedades eléctricas.

Para reducir el fondo de las células que no han recibido una corrección del genoma, en algunas realizaciones, el módulo de crecimiento 1210a realiza un proceso de selección para enriquecer las células corregidas utilizando un medio de crecimiento selectivo 1226. Por ejemplo, el ácido nucleico introducido puede incluir un gen que confiera resistencia a antibióticos u otro marcador seleccionable. En algunas implementaciones, pueden introducirse múltiples genes o marcadores selectivos 1226 en las células durante la corrección recursiva. Por ejemplo, el hecho de alternar la introducción de marcadores seleccionables para series secuenciales de corrección puede eliminar el fondo de células no corregidas y permitir múltiples ciclos del instrumento 1200 para seleccionar células que tengan correcciones secuenciales del genoma. Los genes de resistencia a los antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, genes tales como el gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la tetraciclina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la canavanina, gen de resistencia a la blasticidina, gen de resistencia a la higromicina, gen de resistencia a la puromicina, y gen de resistencia al cloranfenicol.

Desde el módulo de crecimiento 1210a, las células pueden transferirse a un módulo de filtración 110b. El módulo de filtración 1210b o, como alternativa, un módulo de lavado y concentración de células, puede permitir el intercambio de medios. En algunas realizaciones, la eliminación del fondo de células muertas se ayuda de potenciadores líticos tales como detergentes, estrés osmótico, temperatura, enzimas, proteasas, bacteriófago, agentes reductores o caotropos. En otras realizaciones, se utiliza la eliminación de células y/o el intercambio de medios para reducir el fondo de células muertas. El producto de desecho del módulo de filtración 1210b, en algunas realizaciones, se recoge en una unidad 1228 de residuos líquidos.

Tras la filtración, las células pueden presentarse al módulo de transformación 1210c, y luego al módulo de recuperación 1210d y, finalmente, a la unidad de almacenamiento 1214 como se ha detallado anteriormente.

Volviendo a la FIG. 12B, similar a la FIG. 12A, un segundo instrumento ilustrativo 1240 para realizar la escisión y/o corrección automatizadas del genoma en múltiples células en un solo ciclo incluye la plataforma 1202, el receptáculo 1204 de suministro de reactivo para introducir uno o más componentes de ácidos nucleicos en el instrumento 1240, el receptáculo 1206 de suministro de células para introducir células en el instrumento 1240, y el sistema robótico de manipulación 1208 para mover materiales entre módulos (p. ej., módulos 1210a, 1210b, 1210c, 1210f 1210g, 1210m y 1210h), receptáculos (p. ej., receptáculos 1204, 1206, 1212, 1214, 1224, 1242, 1244 y 1246) y unidades de almacenamiento (p. ej., unidades 1214, 1216, 1218 y 1228) del instrumento 1240 para realizar el procesamiento celular automatizado. Una vez finalizado el procesamiento del suministro celular 1206, en algunas realizaciones, las células resultantes 1212 se pueden transferir mediante el sistema robótico de manipulación 1208 a la unidad de almacenamiento 1214 para su almacenamiento temporal y posterior recuperación.

En algunas realizaciones, el sistema robótico de manipulación 1208 utiliza puntas de transferencia desechables proporcionadas en el suministro 1216 de puntas de transferencia para transferir materiales de origen, una cadena principal 1242 de vector, oligonucleótidos 1244 de corrección, reactivos 1204 (p. ej., para ensamblaje de ácidos nucleicos, purificación de ácidos nucleicos, volver a las células electrocompetentes, etc.), y las células 1206 dentro del instrumento 1240, como se describe en relación con la FIG. 12A.

En otras realizaciones, el instrumento 1240 incluye cubetas electroporadoras con succionadores que se conectan a una bomba de desplazamiento de aire. En algunas implementaciones, las células 1206 y el reactivo 1204 se aspiran en la cubeta de electroporación a través de un succionador, y la cubeta se mueve a uno o más módulos 1210 del instrumento 1240.

Como se describe en relación con la FIG. 12A, en algunas implementaciones, el instrumento 1240 está controlado por el sistema de procesamiento 1220 tal como el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13.

El instrumento 1240, en algunas realizaciones, incluye un módulo de ensamblaje 1210g de ácidos nucleicos y, en determinados ejemplos, instrumentos automatizados de procesamiento celular multimodular, el módulo de ensamblaje 1210g de ácidos nucleicos puede incluir, en algunas realizaciones, un ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos. Como se ha descrito anteriormente, el módulo de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos está configurado para realizar el método de clonación molecular Gibson Assembly®.

En algunas realizaciones, después del ensamblaje de los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos (p. ej., en el ejemplo de un ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos, la mezcla de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos (ácidos nucleicos reactivos de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos) se transfieren a un módulo de purificación 1210h. En este caso, se eliminan los componentes no deseados de la mezcla de ensamblaje de ácidos nucleicos (p. ej., sales, minerales) y, en determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos ensamblados se concentran. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, en el módulo de depuración 1210h, la mezcla de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos se puede combinar con un tampón sin sal y con esferas magnéticas, tales como esferas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) o esferas AMPure. La mezcla de ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos se puede incubar durante un tiempo suficiente (p. ej., de 30 segundos a 10 minutos) para que los ácidos nucleicos ensamblados se unan a las esferas magnéticas. En algunas realizaciones, el módulo de purificación incluye un imán configurado para conectar las esferas magnéticas. El imán puede conectarse para poderse eliminar el sobrenadante de los ácidos nucleicos ensamblados unidos y para que los ácidos nucleicos ensamblados unidos puedan lavarse con, p. ej., etanol al 80 %. De nuevo, se puede conectar el imán y eliminarse la solución de lavado con etanol al 80 %. Se puede dejar secar la esfera magnética/los ácidos nucleicos ensamblados, a continuación, los ácidos nucleicos ensamblados pueden eluirse y el imán puede conectarse nuevamente, esta vez para secuestrar las esferas y eliminar el sobrenadante que contenga los ácidos nucleicos ensamblados eluidos. Después, los ácidos nucleicos ensamblados pueden transferirse al módulo de transformación (p. ej., electroporador en una realización preferida). El módulo de transformación ya puede contener las células electrocompetentes en el momento de la transferencia.

En algunas realizaciones, el instrumento 1240 incluye el módulo de transformación 1210c para la introducción de los ácidos nucleicos en las células 1206, como se describe en relación con la FIG. 12A. Sin embargo, en esta circunstancia, los ácidos nucleicos ensamblados 1204, que salen del módulo de purificación 1210h, se transfieren al módulo de transformación 1210c para su combinación con las células 1206.

Después de la transformación en el módulo de transformación 1210c, en algunas implementaciones, las células pueden transferirse a un módulo de recuperación 1210m. En el módulo de recuperación 1210e, se puede permitir la recuperación de las células, la expresión de los ácidos nucleicos y, en un sistema nucleásico inducible, la inducción de la nucleasa, p. ej., por medio de inducción controlada temporalmente, tal como, en algunos ejemplos, inducción química, luminosa, vírica o de temperatura, o la introducción de la molécula inductora para la expresión de la nucleasa.

Después de la recuperación, en algunas implementaciones, las células se transfieren a un módulo de corrección 1210f. El módulo de corrección 1210f proporciona las condiciones adecuadas para inducir la corrección de los genomas de las células, p. ej., a través de la expresión de los ácidos nucleicos introducidos y la inducción de una nucleasa inducible. Las células pueden incluir una nucleasa inducible. La nucleasa puede ser, en algunos ejemplos, inducida químicamente, inducida biológicamente (p. ej., a través de un promotor inducible), inducida por virus, fotoinducida, inducida por la temperatura y/o inducida por calor dentro del módulo de corrección 1210f.

Después de la corrección, en algunas implementaciones, las células se transfieren a la unidad de almacenamiento 1214 como se describe en relación con la FIG. 12A.

En algunas implementaciones, el instrumento 1240 está diseñado para la corrección recursiva del genoma, donde se introducen múltiples correcciones secuencialmente en genomas dentro de las células de una población de células. En algunas implementaciones, el suministro de reactivo 1204 se repone antes de acceder a las células resultantes 1212 de la unidad de almacenamiento para el procesamiento recursivo. Por ejemplo, la cadena principal 1242 de vector adicional y/o los oligonucleótidos 1244 de corrección se pueden introducir en el instrumento 1240 para el ensamblaje y la preparación a través del módulo de ensamblaje 1210g de ácidos nucleicos y el módulo de purificación 1210h. En otras implementaciones, se pueden introducir en el instrumento 140 múltiples volúmenes 1242 de cadena principal de vector y/u oligonucleótidos 1244 de corrección, de modo que no se requiera necesariamente la interacción del usuario antes de un ciclo de procesamiento posterior. Para cada ciclo subsiguiente, la cadena principal 1242 de vector y/o los oligonucleótidos 1244 de corrección pueden cambiar. Tras la preparación del ensamblaje de ácidos nucleicos, se puede proporcionar el ensamblaje de ácidos nucleicos en el suministro 1204 de reactivos o en otra región de almacenamiento.

Una parte de una células resultantes 1212a, en algunas realizaciones, se transfiere al módulo de crecimiento celular automatizado 1210a, como se ha explicado en relación con la FIG. 12A.

Para reducir el fondo de las células que no han recibido una corrección del genoma, en algunas realizaciones, el módulo de crecimiento 1210a realiza un proceso de selección para enriquecer las células corregidas utilizando un medio de crecimiento selectivo 1226, como se ha explicado en relación con la FIG. 12A.

Desde el módulo de crecimiento 1210a, las células pueden transferirse al módulo de filtración 1210b, como se ha explicado en relación con la FIG. 12A. Como se ilustra, el eluyente de un suministro de elución 1246 (p. ej., tampón, glicerol) puede transferirse al módulo de filtración 1210b para el intercambio de medios.

Tras la filtración, las células pueden presentarse al módulo de transformación 1210c para su transformación, y luego al módulo de recuperación 110m y al módulo de corrección 1210f y, finalmente, a la unidad de almacenamiento 1214 como se ha detallado anteriormente.

En algunas realizaciones, los instrumentos de procesamiento celular multimodular automatizado de las FIG. 12A y/o 12B contienen uno o más cartuchos de suministro reemplazables y un sistema robótico de manipulación, como se ha explicado en relación con las FIG. 1A y 1B. Cada cartucho puede contener una o más de una mezcla de ensamblaje de ácidos nucleicos, oligonucleótidos, vector, medios de crecimiento, agente de selección (p. ej., antibióticos), agente inductor, reactivos de purificación de ácidos nucleicos tales como esferas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI), etanol y glicerol al 10 %.

Aunque los instrumentos 1200, 1240 ilustrativos se ilustran incluyendo una disposición particular de los módulos 1210, estas disposiciones son solo para fines ilustrativos. Por ejemplo, en otras realizaciones, se pueden incluir más o menos módulos 1210 dentro de cada uno de los instrumentos 1200, 1240. También, se pueden incluir diferentes módulos en el instrumento, tales como, p. ej., un módulo que facilite la fusión celular para proporcionar, p. ej., hibridomas, un módulo que amplifique los ácidos nucleicos antes del ensamblaje, y/o un módulo que facilite la expresión y/o secreción de proteínas. Además, se pueden replicar determinados módulos 1210 dentro de determinadas realizaciones, tales como los módulos de crecimiento celular 110a, 110b duplicados de la FIG. 1A. Cada uno de los instrumentos 1200 y 1240, en otro ejemplo, puede diseñarse para aceptar un cartucho de medios tal como los cartuchos 104 y 106 de la FIG. 1A. Son posibles otras modificaciones.

Sistema de control para un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado

Volviendo a la FIG. 11, una captura de pantalla ilustra un ejemplo de interfaz gráfica de usuario (GUI, Graphical User Interface) 1100 para interactuar con un instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. La interfaz, por ejemplo, puede presentarse en el sistema de representación 236 de las FIG. 1C y 2D. En un ejemplo, la GUI 1100 puede ser presentada por el sistema de procesamiento 1310 de la FIG. 13 en la pantalla táctil 1316.

En algunas implementaciones, la GUI 1100 se divide en una serie de paneles de información y entrada de datos, tal como un panel de protocolos 1102, un panel de temperatura 1106, un panel de electroporación 1108 y un panel de crecimiento celular 1110. Son posibles más paneles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la GUI 1100 incluye un panel para cada módulo, tales como, en algunos ejemplos, uno o más de cada uno de un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, un módulo de purificación, un módulo de crecimiento celular, un módulo de filtración, un módulo de transformación, un módulo de corrección y un módulo de recuperación. Los paneles inferiores de la GUI 1100, en algunas realizaciones, representan módulos aplicables al presente flujo de trabajo (p. ej., como se selecciona en el panel de protocolos 1102 o como se designa dentro de una secuencia de órdenes cargada a través de una interfaz de secuencia de órdenes (no ilustrada)). En algunas realizaciones, un elemento de desplazamiento o paginación puede permitir al usuario acceder a paneles adicionales no ilustrados en la captura de pantalla de la FIG. 11.

La GUI 1100, en algunas realizaciones, incluye una serie de controles 1120 para acceder a diferentes pantallas, tales como la captura de pantalla ilustrada (p. ej., mediante el uso de un control de inicio 1120a). Por ejemplo, mediante la selección de un control de corrección 1120b, el usuario puede tener la opción de proporcionar una, dos o una serie de etapas de procesamiento celular. A través de la selección de un control de secuencia de órdenes 1120c, el usuario puede tener la oportunidad de añadir una nueva secuencia de órdenes de procesamiento o corregir una secuencia de órdenes de procesamiento existente. El usuario, en algunas realizaciones, puede seleccionar un control de ayuda 1120d para obtener más información con respecto a los elementos de la GUI 1100 y el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. En algunas implementaciones, el usuario selecciona un control de configuración 1120e para acceder a las opciones de configuración para los procesos deseados y/o la GUI 1100 tal como, en algunos ejemplos, la zona horaria, el idioma, las unidades, las opciones de acceso a la red. Un control de potencia 1120f, cuando se selecciona, permite al usuario apagar el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

Volviendo al panel de protocolos 1102, en algunas implementaciones, un usuario selecciona un protocolo (p. ej., una secuencia de órdenes o un flujo de trabajo) para que lo ejecute el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado introduciendo el protocolo en un campo de entrada 1112 de protocolos (o, como alternativa, un menú desplegable). En otras realizaciones, el protocolo se puede seleccionar a través de una pantalla de interfaz de usuario separada, a la que se accede, por ejemplo, seleccionando el control de secuencia de órdenes 1120b. En otro ejemplo, el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede seleccionar el protocolo y presentarlo en el campo de entrada 1112 de protocolos. Por ejemplo, un sistema de procesamiento del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado puede escanear indicaciones legibles por máquina colocadas en uno o más cartuchos cargados en el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado para determinar el protocolo apropiado. Como se ilustra, se ha seleccionado el protocolo "Kit1_microbio (1.0.2)", que puede corresponder a un kit de cartuchos y otros suministros desechables adquiridos para usar con el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado.

En algunas implementaciones, el panel de protocolos 1102 incluye además un control de inicio 1114a y un control de parada 1114b para controlar la ejecución del protocolo presentado en el campo de entrada 1112 de protocolos. La GUI 1100 se puede proporcionar en una interfaz de pantalla táctil, por ejemplo, donde la selección táctil del control de inicio 1114a inicia el procesamiento celular, y la selección del control de parada 1114b detiene el procesamiento celular.

Volviendo al panel de estados de ejecución 1104, en algunas implementaciones, un gráfico 1116 ilustra fases del procesamiento del protocolo identificado en el panel de protocolos 1102. Por ejemplo, una parte de la finalización 1118a de la ejecución se ilustra en azul, mientras que una parte de la fase actual 1118b se ilustra en verde, y cualquier error 1118c se marca con marcadores que se extienden desde el punto de tiempo a lo largo del curso de la parte de la finalización 1118a de la ejecución donde se produjo el error. Una región de mensajes 1118d presenta un porcentaje de ejecución completada, un porcentaje de fase completada y un número total de errores. En algunas realizaciones, al seleccionar el gráfico 1116, al usuario se le pueden presentar más detalles sobre el estado de ejecución, tales como, en algunos ejemplos, la identificación del tipo de error, un nombre de la fase del procesamiento actual (p. ej., ensamblaje de ácidos nucleicos, purificación, crecimiento celular, filtración, transformación, recuperación, corrección, etc.) y una lista de las fases de procesamiento dentro de la ejecución. Además, en algunas realizaciones, un mensaje de tiempo de finalización de la ejecución indica una fecha y una hora en las que se estima que se completará la ejecución. La ejecución, en algunos ejemplos, puede ser indicativa de un proceso de corrección de una sola célula o de una serie de procesos de corrección celular recursivos programados para ejecutarse sin la intervención del usuario. En algunas realizaciones (no mostradas), el panel de estados de ejecución 1104 ilustra adicionalmente un tiempo estimado en el que se requerirá la intervención del usuario (p. ej., reemplazo de cartucho, eliminación de residuos sólidos, eliminación de residuos líquidos, etc.).

En algunas implementaciones, el panel de estados de ejecución 1104 incluye un control de pausa 1124 para pausar el procesamiento celular. El usuario puede seleccionar pausar la ejecución actual, por ejemplo, para corregir un error identificado o para realizar una intervención manual, tal como la eliminación de residuos.

El panel de temperatura 1106, en algunas realizaciones, ilustra una serie de iconos 1126 con los correspondientes mensajes 1128 que indican los ajustes de temperatura para diferentes aparatos del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. Los iconos, de izquierda a derecha, pueden representar un módulo de transformación 1126a (p. ej., un cartucho de electroporación de flujo continuo asociado con el cartucho 110c de reactivos de la FIG. 1A o los dispositivos de electroporación de flujo continuo 534 de la FIG. 5B), un módulo de purificación 1126b, un primer módulo de crecimiento 1126c, un segundo módulo de crecimiento 1126d y un módulo de filtración 1126e. Los mensajes correspondientes 1128a-e identifican una temperatura actual, temperatura baja y temperatura alta del módulo correspondiente (p. ej., para esta fase o esta ejecución). Al seleccionarse uno de los iconos 1126, en algunas realizaciones, se puede revisar una visualización gráfica de la temperatura en el tiempo.

Debajo del panel de temperatura, en algunas implementaciones, una serie de paneles identifican el estado actual de una serie de módulos. Por ejemplo, el panel de electroporación 1108 representa el estado de un módulo de transformación, mientras que el panel de crecimiento celular 1110 representa el estado de un módulo de crecimiento. En algunas realizaciones, los paneles presentados en el presente documento identifican el estado de un módulo actualmente operativo (p. ej., el módulo que participa en el procesamiento celular en la fase actual), así como el estado de cualquier módulo que ya se haya utilizado durante la ejecución actual (como se ilustra, por ejemplo, en el panel de estados de ejecución 1104). La información de un estado pasado, por ejemplo, puede presentar al usuario información sobre los parámetros utilizados en la(s) fase(s) previa(s) del procesamiento celular.

Volviendo al panel de electroporación 1108, en algunas implementaciones, se presentan parámetros operativos 1130a de voltios, miliamperios y julios. Adicionalmente, un mensaje de estado 1132a puede identificar información adicional sobre el funcionamiento del módulo de transformación tal como, en algunos ejemplos, un estado de error, un tiempo restante para el procesamiento o contenido del módulo (p. ej., materiales añadidos al módulo). En algunas implementaciones, se presentará un icono 1134a sobre el mensaje de estado 1132a en un modo activo (p. ej., en color, "encendido", en negrita, etc.) cuando el módulo correspondiente está procesando activamente. La selección del icono 1134a, en algunas realizaciones, provoca la presentación de una pantalla gráfica de información detallada con respecto a los parámetros operativos 1130a.

Volviendo al panel de crecimiento celular 1110, en algunas implementaciones, se presentan los parámetros operativos 1130b de DO y horas de crecimiento. Adicionalmente, un mensaje de estado 1132b puede identificar información adicional sobre el funcionamiento del módulo de crecimiento tal como, en algunos ejemplos, un estado de error, un tiempo restante para el procesamiento o contenido del módulo (p. ej., materiales añadidos al módulo). En algunas implementaciones, se presentará un icono 1134b sobre el mensaje de estado 1132b en un modo activo (p. ej., en color, "encendido", en negrita, etc.) cuando el módulo correspondiente está procesando activamente. La selección del icono 1134b, en algunas realizaciones, provoca la presentación de un sistema de representación gráfico de información detallada con respecto a los parámetros operativos 1130b.

A continuación, se describe una descripción de hardware de un sistema de procesamiento ilustrativo y un entorno de procesamiento de acuerdo con realizaciones ilustrativas con referencia a la FIG. 13. En la FIG. 13, el sistema de procesamiento 1310 incluye una CPU 1308 que realiza una parte de los procesos descritos anteriormente. Por ejemplo, la CPU 1308 puede gestionar las fases de procesamiento del método 900 de la FIG. 9 y/o los flujos de trabajo de las FIG. 10A-C. Los datos del proceso y, las secuencias de órdenes, las instrucciones y/o la configuración del usuario pueden almacenarse en la memoria 1302. Estos datos del proceso, y secuencias de órdenes, instrucciones y/o configuraciones del usuario también se pueden almacenar en un disco de medio de almacenamiento 1304, tal como un medio de almacenamiento portátil (p. ej., unidad USB, unidad de disco óptico, etc.) o se pueden almacenar de forma remota. Por ejemplo, los datos del proceso y, las secuencias de órdenes, las instrucciones y/o la configuración del usuario pueden almacenarse en una ubicación accesible para el sistema de procesamiento 1310 a través de una red 1328. Además, los avances reivindicados no están limitados por la forma de los medios legibles por ordenador en los que se almacenan las instrucciones del proceso inventivo. Por ejemplo, las instrucciones pueden almacenarse en una memoria FLASH, RAM, ROM, o cualquier otro dispositivo de procesamiento de información con el que se comunique el sistema de procesamiento 1310, tal como un servidor, ordenador, teléfono inteligente u otro dispositivo informático portátil.

Además, los componentes de los avances reivindicados pueden proporcionarse como una aplicación de utilidad, demonio de fondo o componente de un sistema operativo, o una combinación de los mismos, ejecutándose junto con la CPU 1308 y un sistema operativo como con otros sistemas informáticos conocidos por los expertos en la materia.

La CPU 1308 puede ser un procesador ARM, sistema en un chip (SOC, System-On-a-Chip), microprocesador, microcontrolador, procesador de señales digitales (DSP, Digital Signal Processor), o pueden ser otros tipos de procesadores que serían reconocidos por un experto en la materia. Además, la CPU 1308 puede implementarse como múltiples procesadores que trabajan cooperativamente en paralelo para realizar las instrucciones de los procesos inventivos descritos anteriormente.

El sistema de procesamiento 1310 forma parte de un entorno de procesamiento 1300. El sistema de procesamiento 1310 de la Figura 13 también incluye un controlador de red 1306 para interactuar con la red 1328 para acceder a elementos adicionales dentro del entorno de procesamiento 1300. Como puede apreciarse, la red 1328 puede ser una red pública, tal como Internet, o una red privada como una red LAN o w A n , o cualquier combinación de las mismas y también puede incluir subredes PSTN o ISDN. La red 1328 puede ser inalámbrica, tal como una red celular que incluye EDGE, sistemas celulares inalámbricos 3G y 4G. La red inalámbrica también puede ser Wi-Fi, Bluetooth o cualquier otra forma de comunicación inalámbrica conocida.

El sistema de procesamiento 1310 incluye además una interfaz de E/S de propósito general 1312 que interactúa con una interfaz de usuario (p. ej., pantalla táctil) 1316, uno o más sensores 1314 y uno o más dispositivos periféricos 1318. Los dispositivos periféricos de E/S 1318 pueden incluir, en algunos ejemplos, un sistema de grabación de video, un sistema de grabación de audio, micrófono, dispositivos de almacenamiento externo y/o sistemas de altavoces externos. El uno o más sensores 1314 pueden incluir uno o más de un giroscopio, un acelerómetro, un sensor de gravedad, un acelerómetro lineal, un sistema de posicionamiento global, un escáner de código de barras, un escáner de código QR, un escáner RFID, un monitor de temperatura y un sistema de iluminación o elemento de iluminación.

El controlador de almacenamiento de propósito general 1324 conecta el disco del medio de almacenamiento 1304 con el bus de comunicación 1340, tal como un bus paralelo o un bus serie como un bus en serie universal (USB, Universal Serial Bus) o similar, para interconectar todos los componentes del sistema de procesamiento. Una descripción de los elementos generales y la funcionalidad del controlador de almacenamiento 1324, el controlador de red 1306 y la interfaz de E/S de propósito general 1312 se omiten en el presente documento por brevedad, ya que se trata de elementos conocidos.

El sistema de procesamiento 1310, en algunas realizaciones, incluye uno o más sensores 1314 a bordo y/o periféricos. Los sensores 1314, por ejemplo, se pueden incorporar directamente a la electrónica interna y/o a un alojamiento del instrumento de procesamiento multimodular automatizado. Una parte de los sensores 1314 puede estar en contacto físico directo con la interfaz de E/S 1312, p. ej., a través de un cable; o en contacto inalámbrico, por ejemplo, a través de un Bluetooth, una conexión wifi o NFC. Por ejemplo, un controlador de comunicaciones inalámbricas 1326 puede habilitar las comunicaciones entre uno o más sensores inalámbricos 1314 y la interfaz de E/S 1312. Por otra parte, uno o más sensores 1314 pueden estar en contacto indirecto, por ejemplo, a través de servidores intermediarios o dispositivos de almacenamiento que se basan en la red 1328; o en contacto (alámbrico, inalámbrico o indirecto) con un acumulador de señal en algún lugar dentro del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado, que, a su vez, está en contacto (alámbrico, inalámbrico o indirecto) con la interfaz de E/S 1312.

Se puede utilizar un grupo de sensores 1314 que se comunican con la interfaz de E/S 1312 en combinación para recopilar un tipo de señal dado de múltiples lugares para generar un mapa de señales más completo. Se puede utilizar uno o más sensores 1314 que se comunican con la interfaz de E/S 1312 como elemento de comparación o verificación, por ejemplo para filtrar, cancelar o rechazar otras señales.

En algunas realizaciones, el entorno de procesamiento 1300 incluye un dispositivo informático 1338 que se comunica con el sistema de procesamiento 1310 a través del controlador de comunicaciones inalámbricas 1326. Por ejemplo, el controlador de comunicaciones inalámbricas 1326 puede permitir el intercambio de mensajes de correo electrónico, mensajes de texto y/o alertas de aplicaciones de software designadas para un teléfono inteligente u otro dispositivo informático personal de un usuario.

El entorno de procesamiento 1300, en algunas implementaciones, incluye un sistema robótico de manipulación 1322 de materiales. El sistema de procesamiento 1310 puede incluir un controlador robótico 1320 para emitir señales de control para accionar elementos del sistema robótico de manipulación de materiales, tal como la manipulación de la posición de un pórtico, bajar o subir un succionador o una pipeta, y/o accionar bombas y válvulas para provocar la transferencia de líquido entre un succionador/una pipeta y diferentes recipientes (p. ej., cámaras, viales, etc.) en el instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El controlador robótico 1320, en algunos ejemplos, puede incluir un controlador de hardware, elemento de firmware y/o uno o más algoritmos o paquetes de software para interconectar el sistema de procesamiento 1310 con el sistema robótico de manipulación de materiales 1322.

En algunas implementaciones, el entorno de procesamiento 1310 incluye una o más interfaces 1332 de módulo, tales como, en algunos ejemplos, una o más interfaces de sensor, interfaces de control de potencia, interfaces de válvula y bomba, y/o interfaces de accionador para activar y controlar el procesamiento de cada módulo del sistema de procesamiento multimodular automatizado. Por ejemplo, las interfaces de módulo 1332 pueden incluir una interfaz de accionador para el motor impulsor 864 del dispositivo de crecimiento celular rotatorio 850 (FIG. 8D) y una interfaz de sensor para la placa detectora 872 que detecta la densidad óptica del crecimiento celular dentro del vial rotatorio 800 de crecimiento. Un controlador 1330 de módulo, en algunas realizaciones, está configurado para interactuar con las interfaces 1332 de módulo. El controlador 1330 de módulo puede incluir uno o varios controladores (p. ej., posiblemente un controlador por módulo, aunque algunos módulos pueden compartir un solo controlador). El controlador 1330 de módulo, en algunos ejemplos, puede incluir un controlador de hardware, elemento de firmware y/o uno o más algoritmos o paquetes de software para interconectar el sistema de procesamiento 1310 con las interfaces 1332 de módulo.

El entorno de procesamiento 1310, en algunas implementaciones, incluye un sistema de climatización 1336 para controlar las condiciones climáticas dentro del alojamiento del sistema de procesamiento multimodular automatizado. El sistema de climatización 1336 puede controlar adicionalmente las condiciones climáticas dentro de uno o más módulos del instrumento de procesamiento celular multimodular automatizado. El sistema de procesamiento 1310, en algunas realizaciones, incluye un controlador de temperatura 1334 para interactuar con el sistema de climatización 1336. El controlador de temperatura 1334, en algunos ejemplos, puede incluir un controlador de hardware, elemento de firmware y/o uno o más algoritmos o paquetes de software para interconectar el sistema de procesamiento 1310 con el sistema de climatización 1336.

Producción de colecciones de células utilizando métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos módulos, e instrumentos de corrección automatizados e instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados para crear una colección de células que varían la expresión, los niveles y/o la actividad de los ARN y/o proteínas de interés en diferentes tipos de células utilizando diferentes estrategias de corrección, como se describe en el presente documento con mayor detalle. Por consiguiente, la divulgación pretende cubrir las colecciones de células corregidas creadas por los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación. Estas colecciones de células pueden tener diferentes correcciones dirigidas, incluyendo, pero sin limitación, desactivaciones de genes, inserción génica, inserciones, deleciones, correcciones de un solo nucleótido, correcciones cortas repetidas en tándem, cambios de marco, expansión de triplete de codones, y similares en células de diferentes organismos. Estas correcciones se pueden dirigir a regiones codificantes o no codificantes del genoma, y preferentemente se diseñan racionalmente.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados para crear una colección de células que varían los procesos vinculados al ADN. Por ejemplo, la colección de células puede incluir células individuales que tengan correcciones en los sitios de unión al ADN para interferir con la unión al ADN de elementos reguladores que modulen la expresión de genes seleccionados. Adicionalmente, las colecciones de células pueden incluir correcciones en el ADN genómico que tengan un impacto en procesos celulares tales como la formación de heterocromatina, la recombinación de clase de cambio y la recombinación VDJ.

En aspectos específicos, las colecciones de células se crean utilizando la corrección multiplexada de células individuales dentro de una población de células, editándose múltiples células dentro de una población de células en una sola serie de corrección, es decir, se producen múltiples cambios dentro de las células de la colección de células en una sola operación automatizada. Las colecciones que se pueden crear en una sola operación automatizada multiplexada pueden comprender hasta 500 células corregidas, 1000 células corregidas, 2000 células corregidas, 5000 células corregidas, 10.000 células corregidas, 50.000 células corregidas, 100.000 células corregidas, 200.000 células corregidas, 300.000 células corregidas, 400.000 células corregidas, 500.000 células corregidas, 600.000 células corregidas, 700.000 células corregidas, 800.000 células corregidas, 900.000 células corregidas, 1.000. 000 células corregidas, 2.000.000 células corregidas, 3.000.000 células corregidas, 4.000.000 células corregidas, 5.000.000 células corregidas, 6.000.000 células corregidas, 7.000.000 células corregidas, 8.000. 000 células corregidas, 9.000.000 células corregidas, 10.000.000 de células corregidas o más.

En otros aspectos específicos, las colecciones de células se crean mediante la corrección recursiva de células individuales dentro de una población de células, añadiéndose correcciones a las células individuales en dos o más series de corrección. El uso de la corrección recursiva produce la combinación de dos o más correcciones dirigidas a dos o más sitios del genoma en células individuales de la colección. Las colecciones que se pueden crear en una operación recursiva automatizada pueden comprender hasta 500 células corregidas, 1000 células corregidas, 2000 células corregidas, 5000 células corregidas, 10.000 células corregidas, 50.000 células corregidas, 100.000 células corregidas, 200.000 células corregidas, 300.000 células corregidas, 400.000 células corregidas, 500.000 células corregidas, 600.000 células corregidas, 700.000 células corregidas, 800.000 células corregidas, 900.000 células corregidas, 1.000.000 células corregidas, 2.000.000 células corregidas, 3.000.000 células corregidas, 4.000. 000 células corregidas, 5.000.000 células corregidas, 6.000.000 células corregidas, 7.000.000 células corregidas, 8.000.000 células corregidas, 9.000.000 células corregidas, 10.000.000 de células corregidas o más.

Se pueden encontrar ejemplos de estrategias de corrección no automatizadas que se pueden modificar en función de la presente memoria descriptiva para utilizar los sistemas automatizados, p. ej., en las patente de EE.UU. n.°8.110.360, 8.332.160, 9.988.624, 20170316353 y 20120277120.

En aspectos específicos, primero se puede utilizar la corrección recursiva para crear un fenotipo celular y luego se pueden utilizar series de corrección posteriores para revertir el fenotipo y/o acelerar otras propiedades celulares.

En algunos aspectos, la colección de células comprende correcciones para la creación de aminoácidos no naturales en una célula.

En aspectos específicos, la divulgación proporciona colecciones de células corregidas que tienen correcciones en uno o más elementos reguladores creados utilizando los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación. La expresión "elemento regulador" se refiere a moléculas de ácido nucleico que pueden influir en la transcripción y/o traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un entorno y/o contexto particular. Esta expresión pretende incluir todos los elementos que potencian o regulan la transcripción y la estabilidad del ARN, incluidos los promotores, elementos centrales necesarios para la interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, elementos en dirección 5', potenciadores y elementos de respuesta (véase, p. ej., Lewin, "Genes V" (Oxford University Press, Oxford) páginas 847-873). Los elementos reguladores ilustrativos en procariotas incluyen, pero sin limitación, promotores, secuencias operadoras y sitios de unión al ribosoma. Los elementos reguladores que se utilizan en las células eucariotas pueden incluir, pero sin limitación, promotores, potenciadores, aislantes, señales de corte y empalme, y señales de poliadenilación.

Preferentemente, la colección de células corregida incluye correcciones diseñadas racionalmente que se diseñan en función de las predicciones de la estructura de la proteína, la expresión y/o la actividad en un tipo de célula en particular. Por ejemplo, el diseño racional puede basarse en un modelo biofísico de todo el sistema de corrección del genoma con una nucleasa particular y regulación de genes para predecir cómo diferentes parámetros de corrección, incluida la expresión y/o unión de nucleasas, las condiciones de crecimiento y otras condiciones experimentales, controlan colectivamente la dinámica de la corrección nucleásica. Véase, p. ej., Farasat y Salis, PLoS Comput Biol., 29:12(1):e1004724 (2016).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona la creación de una colección de células corregidas con diferentes secuencias reguladoras diseñadas racionalmente creadas utilizando la instrumentación, los sistemas y los métodos de corrección automatizados de la invención. Por ejemplo, la colección de células corregida puede incluir poblaciones celulares procarióticas creadas utilizando un conjunto de promotores constitutivos y/o inducibles, secuencias potenciadoras, secuencias operadoras y/o sitios de unión al ribosoma. En otro ejemplo, la colección de células corregida puede incluir secuencias eucarióticas creadas utilizando un conjunto de promotores constitutivos y/o inducibles, secuencias potenciadoras, secuencias operadoras y/o diferentes secuencias de Kozak para la expresión de proteínas de interés.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona colecciones de células que incluyen células con correcciones diseñadas racionalmente que comprenden una o más clases de correcciones en secuencias de interés de todo el genoma de un organismo. En aspectos específicos, la divulgación proporciona colecciones de células que incluyen células con correcciones diseñadas racionalmente que comprenden una o más clases de correcciones en secuencias de interés de todo un subconjunto del genoma. Por ejemplo, la colección de células puede incluir células con correcciones diseñadas racionalmente que comprenden una o más clases de correcciones en secuencias de interés a lo largo del exoma, p. ej., todos o la mayoría de los marcos de lectura abiertos del genoma. Por ejemplo, la colección de células puede incluir células con correcciones diseñadas racionalmente que comprenden una o más clases de correcciones en secuencias de interés a lo largo del cinoma. En otro ejemplo más, la colección de células puede incluir células con correcciones diseñadas racionalmente que comprenden una o más clases de correcciones en secuencias de interés a través del secretoma. En otros aspectos más, la colección de células puede incluir células con correcciones diseñadas racionalmente creadas para analizar diferentes isoformas de proteínas codificadas dentro del exoma, y las colecciones celulares pueden diseñarse para controlar la expresión de una o más isoformas específicas, p. ej., para el análisis del transcriptoma.

Es importante destacar que, en determinados aspectos, las colecciones de células pueden comprender correcciones que utilizan secuencias aleatorias, p. ej., secuencias de promotor aleatorias, para reducir la similitud entre la expresión de una o más proteínas en células individuales dentro de la colección. Adicionalmente, los promotores de la colección de células pueden ser constitutivos, inducibles o de ambos tipos para permitir una expresión potente y/o valorable.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados para crear una colección de células que comprenda correcciones para identificar la expresión óptima de un gen diana seleccionado. Por ejemplo, la producción de productos bioquímicos a través de la ingeniería metabólica a menudo requiere la expresión de enzimas de la vía, y los mejores rendimientos de producción no siempre se logran con la mayor cantidad de enzimas de la vía diana en la célula, sino, más bien, ajustando perfectamente los niveles de expresión de las enzimas individuales y las proteínas y/o vías reguladoras relacionadas. De manera análoga, los niveles de expresión de proteínas heterólogas a veces pueden ajustarse experimentalmente para obtener rendimientos óptimos.

La forma más evidente en que la transcripción tiene un impacto en los niveles de expresión génica es a través de la velocidad de iniciación de Pol II, que puede ser modulada por combinaciones de fuerza promotora o potenciadora y factores transactivadores (Kadonaga, et al., Cell, 116(2):247-57 (2004). En eucariotas, la velocidad de alargamiento también puede determinar los patrones de expresión génica al influir en el corte y empalme alternativo (Cramer et al., PNAS, EE.UU., 94(21): 11456-60 (1997). La finalización fallida de un gen puede afectar a la expresión de los genes en dirección 3' al reducir la accesibilidad del promotor a Pol II (Greger, et al., 2000 PNAS EE. UU., 97(15):8415-20 (2000). Este proceso, conocido como interferencia transcripcional, es particularmente relevante en eucariotas inferiores, ya que a menudo tienen genes estrechamente espaciados.

En algunos casos, la presente divulgación proporciona métodos para optimizar la transcripción de genes celulares. La transcripción de genes es el resultado de varios fenómenos biológicos distintos, incluyendo la iniciación de la transcripción (reclutamiento de ARNp y formación de complejos de transcripción), alargamiento (síntesis/extensión de cadena) y finalización de la transcripción (desprendimiento y finalización de ARNp).

Mutagénesis de sitio

Las colecciones de células se pueden crear utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados que emplean mutagénesis dirigida, es decir, cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína u otra característica genómica puede alterarse de forma deliberada y exacta mediante la mutación de la proteína o la característica genómica. Estas estirpes celulares pueden ser útiles para diferentes fines, p. ej., para determinar la función de la proteína dentro de las células, la identificación de sitios activos enzimáticos dentro de las células y el diseño de nuevas proteínas. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida se puede utilizar de forma multiplexada para intercambiar un solo aminoácido en la secuencia de una proteína por otro aminoácido con diferentes propiedades químicas. Esto permite determinar el efecto de una mutación diseñada racionalmente o generada aleatoriamente en células individuales dentro de una población celular. Véase, p. ej., Berg, et al. Biochemistry, Sexta ed. (Nueva York: W. H. Freeman and Company, 2007).

En otro ejemplo, se pueden realizar correcciones en células individuales dentro de una colección de células para sustituir los aminoácidos en los sitios de unión, tales como la sustitución de uno o más aminoácidos en un sitio de unión a proteínas para la interacción dentro de un complejo proteico o la sustitución de uno o más aminoácidos en bolsillos enzimáticos que pueden alojar un cofactor o ligando. Esta clase de correcciones permite la creación de manipulaciones específicas de una proteína para medir determinadas propiedades de una o más proteínas, incluyendo la interacción con otros cofactores, ligandos, etc. dentro de un complejo proteico.

En otros ejemplos más, se realizar diferentes tipos de corrección en células individuales dentro de una colección de células utilizando mutagénesis específica para estudiar locus de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL, expression Quantitative Trait locus). Un eQTL es un locus que explica una fracción de la variación genética de un fenotipo de expresión génica. Las colecciones de la invención serían útiles para evaluar y vincular los eQTL con estados patológicos reales.

En aspectos específicos, las correcciones introducidas en las colecciones de células de la divulgación pueden crearse utilizando un diseño racional en función de estructuras de proteínas conocidas o predichas. Véase, p. ej., Chronopoulou E. G. y Labrou, Curr Protoc Protein Sci.; Capítulo 26: Unidad 26.6 (2011). Dicha mutagénesis dirigida puede proporcionar células individuales dentro de una colección con una o más correcciones dirigidas, y preferentemente dos o más correcciones dirigidas (p. ej., correcciones combinatorias) dentro de una población celular.

En otros aspectos, las colecciones de células de la divulgación se crean utilizando "exploración" de mutación de codón dirigida de todos o esencialmente todos los codones de la región codificante de un gen. De este modo, se pueden examinar correcciones individuales de codones específicos en busca de pérdida de función o ganancia de función en función de polimorfismos específicos en uno o más codones del gen. Estas colecciones pueden ser una herramienta poderosa para determinar qué cambios genéticos son silenciosos o causales de un fenotipo específico en una célula o población de células. Las correcciones de los codones pueden generarse aleatoriamente o pueden diseñarse racionalmente basándose en polimorfismos y/o mutaciones conocidas que se han identificado en el gen que se va a analizar. Asimismo, el uso de estas técnicas en dos o más genes en una sola vía de una célula puede determinar posibles interacciones proteína:proteína o redundancias en funciones o vías celulares.

Por ejemplo, se puede utilizar la exploración con alanina para determinar la contribución de un resto específico a la estabilidad o función de una proteína dada. Véase, p. ej., Lefévre, et al., Nucleic Acids Research, volumen 25(2):447-448 (1997). La alanina se suele utilizar en esta técnica de exploración de codones debido a su grupo funcional metilo, químicamente inerte, no voluminoso, que puede imitar las preferencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. También se puede utilizar la exploración de codones para determinar si la cadena lateral de un resto específico desempeña un papel importante en la función y/o actividad celular. A veces, se pueden utilizar otros aminoácidos tales como la valina o la leucina en la creación de colecciones de células de exploración de codones si se necesita la conservación del tamaño de los restos mutados.

En otros aspectos específicos, se pueden crear colecciones de células utilizando los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la invención para determinar el sitio activo de una proteína tal como una enzima u hormona, y para dilucidar el mecanismo de acción de una o más de estas proteínas en una colección de células. Se puede utilizar la mutagénesis dirigida asociada con estudios de modelado molecular para descubrir la estructura del sitio activo de una enzima y, por consiguiente, su mecanismo de acción. El análisis de estas colecciones celulares puede proporcionar un conocimiento del papel que ejercen los restos de aminoácidos específicos en los sitios activos de las proteínas, en los contactos entre subunidades de complejos proteicos, sobre el tráfico intracelular y la estabilidad/semivida de las proteínas en diferentes antecedentes genéticos.

Mutagénesis de saturación

En algunos aspectos, las colecciones de células creadas utilizando los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación pueden saturar las colecciones de mutagénesis, en las que se aleatoriza un solo codón o conjunto de codones para producir todos los aminoácidos posibles en la posición de un gen o genes de interés en particular. Estas colecciones de células pueden ser particularmente útiles para generar variantes, p. ej., para la evolución dirigida. Véase, p. ej., Chica, et al., Current Opinión in Biotechnology 16 (4): 378-384 (2005); y shivange, Current Opinión in Chemical Biology, 13 (1): 19-25.

En algunos aspectos, se pueden utilizar correcciones que comprenden diferentes codones degenerados para codificar conjuntos de aminoácidos en las células individuales de las colecciones. Debido a que algunos aminoácidos están codificados por más codones que otros, la proporción exacta de aminoácidos no puede ser igual. En determinados aspectos, se utilizan codones degenerados más restringidos. "NNK" y "NNS" tienen la ventaja de codificar los 20 aminoácidos, pero siguen codificando un codón finalizador el 3 % de las veces. Los codones alternativos tales como "NDT", "DBK" evitan por completo los codones finalizadores y codifican un conjunto mínimo de aminoácidos que sigue abarcando todos los tipos biofísicos principales (aniónicos, catiónicos, hidrófobos alifáticos, hidrófobos aromáticos, hidrófilos, pequeños).

En aspectos específicos, la mutagénesis de saturación no redundante, en la que se utiliza el codón más utilizado para un organismo en particular en el proceso de corrección de mutagénesis de saturación.

Intercambios de promotores y escaleras

Un mecanismo para analizar y/u optimizar la expresión de uno o más genes de interés es a través de la creación de una colección de células de "intercambio de promotores", en la que las células comprenden correcciones genéticas que tienen promotores específicos unidos a uno o más genes de interés. Por consiguiente, las colecciones de células creadas utilizando los métodos, los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación pueden ser colecciones de células de intercambio de promotores, que se puede utilizar, p. ej., para aumentar o disminuir la expresión de un gen de interés a fin de optimizar una vía metabólica o genética. En algunos aspectos, se puede utilizar la colección de células de intercambio de promotores para identificar un aumento o una reducción en la expresión de un gen que afecta a la vitalidad o viabilidad celular, p. ej., un gen que codifica una proteína que afecta a la velocidad de crecimiento o a la salud general de las células. En algunos aspectos, la colección de células de intercambio de promotores se puede utilizar para crear células que tengan dependencias y lógica entre los promotores para crear redes de genes sintéticos. En algunos aspectos, se pueden utilizar intercambios de promotores para controlar la comunicación de célula a célula entre células de poblaciones tanto homogéneas como heterogéneas (tejidos complejos) en la naturaleza.

Las colecciones de células pueden utilizar cualquier número dado de promotores que se hayan agrupado en función de la presentación de un intervalo de intensidades de expresión y cualquier número dado de genes diana. La escalera de secuencias promotoras varía la expresión de al menos un locus en al menos una condición. Luego, esta escalera se aplica sistemáticamente a un grupo de genes del organismo utilizando los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación.

En aspectos específicos, la colección de células formada utilizando los procesos, los módulos y los sistemas de corrección automatizados de la divulgación incluyen células individuales que son representativas de un promotor dado unido operativamente a uno o más genes diana de interés en un antecedente genético por lo demás idéntico. Se pueden encontrar ejemplos de estrategias de corrección no automatizadas que se pueden modificar para utilizar los sistemas automatizados, p. ej., en la patente de EE.UU. n.° 9.988.624.

En aspectos específicos, la colección de células de intercambio de promotores se produce mediante la corrección de un conjunto de genes diana para unirlos operativamente a un conjunto preseleccionado de promotores que actúan como una "escalera de promotores" para la expresión de los genes de interés. Por ejemplo, las células se corrigen de manera que uno o más genes individuales de interés se corrigen para unirlos operativamente con los diferentes promotores en la escalera de promotores. Cuando no existe un promotor endógeno, se desconoce su secuencia o se ha cambiado previamente de alguna manera, los promotores individuales de la escalera de promotores pueden introducirse delante de los genes de interés. Estas colecciones de células producidas tienen células individuales con un promotor individual de la escalera unido operativamente a uno o más genes diana en un contexto genético por lo demás idéntico.

Los promotores generalmente se seleccionan para producir una expresión variable en diferentes locus y pueden incluir promotores inducibles, promotores constitutivos, o ambos.

El conjunto de genes diana corregidos con la escalera de promotores puede incluir todos o la mayoría de los marcos de lectura abiertos (ORF, Open Reading Frames) de un genoma o un subconjunto seleccionado del genoma, p. ej., los ORF del cinoma o un secretoma. En algunos aspectos, los genes diana pueden incluir regiones codificantes para diferentes isoformas de los genes, y las colecciones celulares pueden diseñarse para la expresión de una o más isoformas específicas, p. ej., para el análisis del transcriptoma utilizando diferentes promotores.

El conjunto de genes diana también puede ser genes que se sabe o se sospecha que participan en una determinada vía celular, p. ej., una vía reguladora o vía de señalización. El conjunto de genes diana pueden ser ORF relacionados con la función, en relación con correcciones beneficiosas previamente demostradas (intercambios de promotores anteriores o intercambios de SNP anteriores), mediante selección algorítmica basada en interacciones epistáticas entre correcciones generadas previamente, otros criterios de selección basados en hipótesis sobre ORF beneficioso para la diana o mediante selección aleatoria. En realizaciones específicas, los genes diana pueden comprender genes que no codifican proteínas, incluidos los ARN no codificantes.

También se puede utilizar la corrección de otros elementos genéticos funcionales, incluidos los elementos aislantes y otros elementos de organización genómica, para variar sistemáticamente el nivel de expresión de un conjunto de genes diana, y se puede introducir utilizando los métodos, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación. En un aspecto, se corrige una población de células utilizando una escalera de secuencias potenciadoras, ya sea sola o en combinación con promotores seleccionados o una escalera de promotores, para crear una colección de células que tenga diferentes correcciones en estos elementos potenciadores. En otro aspecto, se corrige una población de células utilizando una escalera de secuencias de unión al ribosoma, ya sea sola o en combinación con promotores seleccionados o una escalera de promotores, para crear una colección de células que tenga diferentes correcciones en estas secuencias de unión al ribosoma.

En otro aspecto, se corrige una población de células para permitir la unión de diferentes secuencias estabilizadoras o desestabilizadoras de ARNm y/o proteínas al extremo 5' o 3', o en cualquier otra ubicación, de una transcripción o proteína.

En determinados aspectos, se puede corregir una población de células de una estirpe celular previamente establecida utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados de la divulgación para crear una colección de células a fin de mejorar la función, salud y/o viabilidad de las células. Por ejemplo, se han desarrollado muchas cepas industriales que se utilizan actualmente para la fabricación a gran escala utilizando procesos de mutagénesis aleatoria de forma iterativa durante un período de muchos años, a veces décadas. Se introdujeron mutaciones neutras y perjudiciales no deseadas en las cepas junto con cambios beneficiosos y, con el tiempo, esto produjo cepas con deficiencias en la robustez general y características clave como las velocidades de crecimiento. En otro ejemplo, las estirpes celulares de mamíferos siguen mutando a través del pase de las células durante períodos de tiempo y, de la misma manera, estas estirpes celulares pueden volverse inestables y adquirir rasgos que no son deseables. Los métodos de corrección automatizados, los instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación pueden usar estrategias de corrección tales como el intercambio de SNP y/o STR, la creación indel u otras técnicas para eliminar o cambiar las secuencias genómicas no deseables y/o introducir nuevas secuencias genómicas para abordar las deficiencias mientras se conservan las propiedades deseables de las células.

Cuando se utiliza la corrección recursiva, la corrección en las células individuales de la colección de células corregida puede tener incorporada la inclusión de "plataformas de aterrizaje" en un sitio ectópico del genoma (p. ej., un locus CarT) para optimizar la expresión, estabilidad y/o control.

En algunos casos, cada colección producida que tiene células individuales que comprenden una o más correcciones (ya sea introduciendo o eliminando) se cultiva y analiza según uno o más criterios (p. ej., producción de una sustancia química o producto de interés). Las células que poseen los criterios específicos se asocian, o correlacionan, con una o más correcciones particulares en la célula. De esta manera, se puede determinar el efecto de una corrección dada en cualquier número de rasgos genéticos o fenotípicos de interés. La identificación de múltiples correcciones asociadas con criterios particulares o funcionalidad/robustez mejorada puede conducir a células con características muy deseables.

Colecciones de desactivaciones o inserciones

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados para crear una colección de células que tienen correcciones "de desactivación" (KO, KnockOut) o "inserción" (KI, Knock-In) de diferentes genes de interés. Por tanto, la divulgación pretende cubrir las colecciones de células corregidas creadas por los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación que tienen una o más mutaciones que eliminan o reducen la expresión de genes seleccionados de interés para cuestionar el efecto de estas correcciones sobre la función génica en células individuales de dentro de la colección de células.

Las colecciones de células se pueden crear utilizando genes KO dirigidos (p. ej., mediante inserción/deleción) o KO (p. ej., mediante reparación homóloga dirigida). Por ejemplo, las roturas bicatenarias se suelen reparar a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos no homólogos. Se sabe que la reparación es propensa a errores y, por lo tanto, se pueden introducir inserciones y deleciones que pueden alterar la función del gen. Preferentemente, las correcciones se diseñan racionalmente para afectar específicamente a los genes de interés, y se pueden crear células individuales que tengan una KI o KI de uno o más locus de interés. Se pueden crear células que tengan una KO o KI de dos o más locus de interés utilizando la corrección recursiva automatizada de la divulgación.

En aspectos específicos, las colecciones de células KO o KI se crean utilizando la corrección multiplexada simultánea de células dentro de una población de células, y diferentes células dentro de una población de células se corrigen en una sola serie de corrección, es decir, se producen múltiples cambios dentro de las células de la colección de células en una sola operación automatizada. En otros aspectos específicos, las colecciones de células se crean utilizando la corrección recursiva de células individuales dentro de una población celular y produce la fusión de múltiples correcciones de dos o más sitios en el genoma en células individuales.

SNP o Intercambios cortos de repetición en tándem

En un aspecto, se crean colecciones de células utilizando los métodos de corrección automatizados, instrumentos de corrección celular multimodulares automatizados de la divulgación mediante la introducción sistemática o la sustitución de polimorfismos de un solo nucleótido ("SNP") en los genomas de las células individuales para crear una colección de células de "intercambio de SNP". En algunas realizaciones, los métodos de intercambio de SNP de la presente divulgación incluyen tanto la adición de SNP beneficiosos como la eliminación de SNP perjudiciales y/o neutrales. Los intercambios de SNP pueden dirigirse a secuencias codificantes, secuencias no codificantes o a ambas.

En otro aspecto, se crea una colección de células utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados de la divulgación mediante la introducción sistemática o la sustitución de repeticiones cortas en tándem ("STR", Short Tándem Repeats) en los genomas de las células individuales para crear una colección de células de "intercambio de STR". En algunas realizaciones, los métodos de intercambio de STR de la presente divulgación incluyen tanto la adición de STR beneficiosos como la eliminación de STR perjudiciales y/o neutrales. Los intercambios de STR pueden dirigirse a secuencias codificantes, secuencias no codificantes o a ambas.

En algunos casos, el intercambio de SNP y/o STR utilizado para crear la colección de células se multiplexa, y se corrigen múltiples células dentro de una población de células en una sola serie de corrección, es decir, se producen múltiples cambios dentro de las células de la colección de células en una sola operación automatizada. En otros casos, el intercambio de SNP y/o STR utilizado para crear la colección de células es recursivo, y produce la fusión de múltiples secuencias beneficiosas y/o la eliminación de secuencias perjudiciales en células individuales. Los múltiples cambios pueden ser un conjunto específico de cambios definidos o una colección combinatoria, parcialmente aleatoria, de mutaciones. La eliminación de mutaciones perjudiciales y la consolidación de mutaciones beneficiosas pueden proporcionar mejoras inmediatas en diferentes procesos celulares. La eliminación de la carga genética o la consolidación de cambios beneficiosos en una cepa sin carga genética también proporciona un nuevo punto de partida consolidado para la mutagénesis aleatoria adicional que puede permitir mejoras adicionales.

El intercambio de SNP supera las limitaciones fundamentales de los enfoques de mutagénesis aleatoria, ya que no es un enfoque aleatorio, sino más bien la introducción o eliminación sistemática de mutaciones individuales en las células.

Corrección del sitios de corte y empalme

El corte y empalme de ARN es el proceso durante el que se escinden los intrones y se empalman los exones para crear el ARNm que se traduce en una proteína. El reconocimiento exacto de las señales de corte y empalme por parte de la maquinaria celular es fundamental para este proceso. Por consiguiente, en algunos aspectos, se corrige una población de células utilizando una corrección sistemática de sitios donantes y/o aceptores de corte y empalme conocidos y/o predichos en diferentes locus para crear una colección de variantes de sitios de corte y empalme de diferentes genes. Dicha corrección puede ayudar a dilucidar la relevancia biológica de diferentes isoformas de genes en un contexto celular. Se pueden predecir secuencias para el diseño racional de sitios de corte y empalme de diferentes regiones de codificación, incluyendo mutaciones reales o predichas asociadas con diversos trastornos de mamíferos, utilizando técnicas de análisis tales como las que se encuentran en Nalla y Rogan, Hum Mutat, 25:334-342 (2005); Divina, et al., Eur J Hum Genet, 17:759-765 (2009); Desmet, et al., Nucleic Acids Res, 37:e67 (2009); Faber, et al., BMC Bioinformatics, 12 (supl. 4):S2 (2011).

Intercambios de codones de inicio/parada e incorporación de análogos de ácidos nucleicos

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona la creación de colecciones de células utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados de la divulgación, donde las colecciones se crean intercambiando variantes de codones de inicio y parada en todo el genoma de un organismo o para un subconjunto seleccionado de regiones codificantes en el genoma, p. ej., el cinoma o secretoma. En la colección de células, las células individuales tendrán uno o más codones de inicio o parada que reemplazan el codón de inicio o parada nativo para uno o más genes de interés.

Por ejemplo, los codones de inicio típicos utilizados por los eucariotas son ATG (AUG), y los procariotas son los que más utilizan ATG (AUG), seguido de GTG (GUG) y TTG (UUG). La colección de células puede incluir células individuales que tengan sustituciones de los codones de inicio nativos para uno o más genes de interés.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio ATG por TTG frente a los genes de interés seleccionados. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio ATG por GTG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio GTG por ATG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio GTG por TTG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio TTG por ATG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones de inicio TTG por GTG.

En otros ejemplos, los codones finalizadores típicos para S. cerevisiae y mamíferos UAA y UGA, respectivamente. El codón finalizador típico para las plantas monocotiledóneas es TGA (UGA), mientras que los insectos y E. coli normalmente utilizan UAA como codón finalizador (Dalphin et al., Nucl. Acids Res., 24: 216-218 (1996)). La colección de células puede incluir células individuales que tengan sustituciones de los codones finalizadores nativos para uno o más genes de interés.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TAA por TAG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TAA por TGA. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TGA por t Aa . En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TGA por TAG. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TAG por TAA. En otros aspectos, la presente invención enseña la creación automatizada de una colección de células reemplazando los codones finalizadores TAG por TGA.

Intercambios y escaleras de finalizadores

Un mecanismo para identificar la finalización óptima de un ARNm previamente cortado y empalmado de uno o más genes de interés es a través de la creación de una colección de células de "intercambio de finalizadores", en la que las células comprenden correcciones genéticas que tienen secuencias finalizadoras específicas unidas a uno o más genes de interés. Por consiguiente, las colecciones de células creadas utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de la divulgación pueden ser colecciones de células de intercambio de finalizadores, que se puede utilizar, p. ej., para afectar a la estabilidad del ARNm mediante la liberación de productos de transcripción de los sitios de síntesis. En otras realizaciones, la colección de células de intercambio de finalizadores se puede utilizar para identificar un aumento o una reducción en la eficiencia de la finalización de la transcripción y, por lo tanto, la acumulación de pre-ARNm sin cortar y empalmar (p. ej., West y Proudfoot, Mol Cell.; 33(3-9); 354-364 (2009) y/o procesamiento del extremo 3' (p. ej., West, et al., Mol Cell. 29(5):600-10 (2008)). En el caso de que un gen esté unido a múltiples sitios de finalización, las correcciones pueden corregir una combinación de correcciones a múltiples finalizadores que estén asociadas con un gen. También se pueden añadir aminoácidos adicionales a los extremos de las proteínas para determinar el efecto sobre la longitud de la proteína en los finalizadores.

Las colecciones de células pueden utilizar cualquier número dado de correcciones de finalizadores que se hayan seleccionado para la escalera de finalizadores en función de la presentación de un intervalo de actividad y cualquier número dado de genes diana. La escalera de secuencias finalizadoras varía la expresión de al menos un locus en al menos una condición. Luego, esta escalera se aplica sistemáticamente a un grupo de genes del organismo utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados de la divulgación.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona la creación de colecciones de células utilizando los métodos, módulos, instrumentos y sistemas de corrección automatizados de la divulgación, donde las colecciones se crean para corregir señales finalizadoras en una o más regiones del genoma de las células individuales de la colección. La finalización de la transcripción en eucariotas funciona a través de señales finalizadoras que son reconocidas por factores proteicos asociados con la ARN polimerasa II. Por ejemplo, la colección de células puede contener células eucariotas individuales con correcciones en genes que codifican el factor de especificidad de poliadenilación (CPSF, Polyadenylation Specificity Factor) y el factor de estimulación de escisión (CstF, Cleavage stimulation Factor) y/o proteínas que codifican genes reclutados por factores CPSF y CstF en sitios finalizadores. En procariotas, dos mecanismos principales, denominados finalización independiente de Rho y dependiente de Rho, median en la finalización de la transcripción. Por ejemplo, la colección de células puede contener células procariotas individuales con correcciones en genes que codifican proteínas que afectan a la unión, eficiencia y/o actividad de estas vías de finalización.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para seleccionar secuencias de finalización ("finalizadoras") con propiedades óptimas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgación enseña métodos para introducir y/o corregir uno o más finalizadores y/o generar variantes de uno o más finalizadores, dentro de una célula hospedadora, que presenten un intervalo de actividad. Se puede agrupar una combinación particular de finalizadores como una escalera de finalizadores, y las colecciones de células de la divulgación incluyen células individuales que son representativas de finalizadores unidos operativamente a uno o más genes diana de interés en antecedentes genéticos idénticos. Se pueden encontrar ejemplos de estrategias de corrección no automatizadas que se pueden modificar para utilizar los instrumentos automatizados, p. ej., en la patente de EE.UU. n.° 9.988.624, concedida a Serber et al., titulada "Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform".

En aspectos específicos, la colección de células de intercambio de finalizadores se produce mediante la corrección de un conjunto de genes diana para unirlos operativamente a un conjunto preseleccionado de finalizadores que actúan como una "escalera de finalizadores" para la expresión de los genes de interés. Por ejemplo, las células se corrigen de modo que el promotor endógeno esté unido operativamente a los genes individuales de interés que se corrigen con los diferentes promotores en la escalera de promotores. Cuando el promotor endógeno no existe, se desconoce su secuencia o se ha cambiado previamente de alguna manera, los promotores individuales de la escalera de promotores pueden introducirse delante de los genes de interés. Estas colecciones de células producidas tienen células individuales con un promotor individual de la escalera unido operativamente a uno o más genes diana en un contexto genético por lo demás idéntico. La escalera de finalización en cuestión se asocia entonces con un gen de interés dado.

La escalera de finalización se puede utilizar para afectar de manera más general a la finalización de todos o la mayoría de los ORF de un genoma, o un subconjunto seleccionado del genoma, p. ej., los ORF de un cinoma o un secretoma. El conjunto de genes diana también puede ser genes que se sabe o se sospecha que participan en una determinada vía celular, p. ej., una vía reguladora o vía de señalización. El conjunto de genes diana pueden ser ORF relacionados con la función, en relación con correcciones beneficiosas previamente demostradas (intercambios de promotores anteriores o intercambios de SNP anteriores), mediante selección algorítmica basada en interacciones epistáticas entre correcciones generadas previamente, otros criterios de selección basados en hipótesis sobre ORF beneficioso para la diana o mediante selección aleatoria. En realizaciones específicas, los genes diana pueden comprender genes que no codifican proteínas, incluidos los ARN no codificantes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un instrumento de corrección celular multimodular automatizado, que comprende:

un alojamiento (100) configurado para contener todos o algunos de los módulos;

un receptáculo (626a) configurado para recibir células;

uno o más receptáculos (626b) configurados para recibir ácidos nucleicos;

un módulo de transformación (110c) configurado para introducir los ácidos nucleicos en las células;

un módulo de recuperación (110a, 110b) configurado para recibir células del módulo de transformación y para permitir que las células se recuperen después de la transformación celular en el módulo de transformación; un módulo de corrección nucleásica (922) configurado para permitir que los ácidos nucleicos introducidos corrijan ácidos nucleicos en las células; y

un procesador (126) configurado para hacer funcionar el instrumento de corrección celular multimodular automatizado en función de la entrada del usuario y/o la selección de una secuencia de órdenes preprogramada; un sistema robótico de manipulación (108) para mover materiales a o entre módulos; y que comprende un sistema automatizado de manipulación de líquidos (120) para mover líquidos directamente desde uno del módulo de recuperación, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica a otro del módulo de recuperación, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica sin la intervención del usuario.

2. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, en donde los ácidos nucleicos de uno o más receptáculos comprenden una cadena principal y un casete de corrección, y el instrumento de corrección celular multimodular automatizado comprende además un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos.

3. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, en donde el sistema automatizado de manipulación de líquidos comprende un succionador (518) o una pipeta.

4. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 2, en donde el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos (400) está configurado para realizar un ensamblaje isotérmico de ácidos nucleicos.

5. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, en donde el módulo de corrección y el módulo de recuperación están combinados en un solo módulo.

6. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, que comprende además un módulo de crecimiento (850) configurado para cultivar las células, opcionalmente, en donde el módulo de crecimiento mide la densidad óptica de las células en crecimiento, opcionalmente, en donde el módulo de crecimiento está configurado para medir de forma continua la densidad óptica de las células en crecimiento.

7. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 6, en donde el procesador está configurado para ajustar las condiciones de crecimiento en el módulo de crecimiento de tal modo que las células alcancen una densidad óptica diana en el momento solicitado por un usuario.

8. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, en donde el receptáculo configurado para recibir células y uno o más receptáculos configurados para recibir ácidos nucleicos están contenidos dentro de un cartucho de reactivos (104), opcionalmente, en donde algunos o todos los reactivos requeridos para la corrección celular son recibidos por el cartucho de reactivos.

9. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 8, en donde los reactivos contenidos dentro del cartucho de reactivos se pueden localizar mediante una secuencia de órdenes leída por el procesador.

10. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 9, en donde el cartucho de reactivos incluye reactivos y se proporciona en un kit.

11. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, en donde el módulo de transformación comprende un dispositivo de electroporación (500), en donde, opcionalmente, el dispositivo de electroporación es un dispositivo de electroporación de flujo continuo.

12. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, que comprende además un módulo de filtración (700) configurado para concentrar las células y volverlas electrocompetentes.

13. Un instrumento de corrección celular multimodular automatizado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos configurado para ensamblar una cadena principal y un casete de corrección, en donde el módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos está configurado para aceptar y ensamblar ácidos nucleicos a fin de facilitar las actividades de corrección del genoma deseadas en las células; y

un módulo de crecimiento configurado para cultivar las células;

y en donde:

el módulo de transformación comprende un electroporador para introducir en las células ácidos nucleicos ensamblados; y

el sistema automatizado de manipulación de líquidos mueve líquidos directamente desde uno del módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica a otro del módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos, el módulo de transformación o el módulo de corrección nucleásica sin la intervención del usuario.

14. El instrumento de corrección celular multimodular automatizado de la reivindicación 1, que comprende además al menos un cartucho de reactivos que contiene reactivos para realizar la corrección celular en el instrumento de corrección celular multimodular automatizado, opcionalmente, en donde los receptáculos para las células y los ácidos nucleicos están dispuestos dentro del cartucho de reactivos.

15. Un instrumento de corrección celular multimodular automatizado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, además:

un módulo de ensamblaje de ácidos nucleicos configurado para a) ensamblar una estructura principal y un casete de corrección; y b) desalinizar los ácidos nucleicos ensamblados después del ensamblaje;

un módulo de crecimiento configurado para cultivar las células;

un módulo de filtración configurado para concentrar las células y volverlas electrocompetentes; y

un módulo combinado de recuperación y corrección nucleásica configurado para permitir que las células se recuperen después de la electroporación en el módulo de transformación y para permitir que los ácidos nucleicos corrijan las células;

y en donde:

el módulo de transformación comprende un electroporador de flujo continuo para introducir en las células los ácidos nucleicos ensamblados; y

el sistema automatizado de manipulación de líquidos mueve líquidos directamente desde uno del módulo de crecimiento, el módulo de filtración, el módulo de transformación o el módulo combinado de recuperación y corrección nucleásica a otro del módulo de crecimiento, el módulo de filtración, el módulo de transformación o el módulo combinado de recuperación y corrección nucleásica sin la intervención del usuario.