ES2882110T3 - Métodos y composiciones para administrar anticuerpos codificados con ARNm - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un primer ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo y un segundo ARNm que codifica la cadena ligera del anticuerpo a una relación molar que varía de 2:1 a 1:2 para su uso en terapia en un paciente, en donde el primer ARNm y el segundo ARNm (i) comprenden cada uno una estructura de caperuza 5', una cola poli-A 3', una región no traducida 5' y una región no traducida 3' y (ii) están encapsulados dentro de liposomas que comprenden un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido a base de colesterol y un lípido modificado con PEG y que tienen un tamaño no mayor de 150 nm, en donde el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están encapsulados en el mismo liposoma, en donde el anticuerpo es un tetrámero y cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena ligera de aproximadamente 25 kD y una cadena pesada de aproximadamente 50-70 kD, y en donde la composición se administra por vía intravenosa al paciente y el anticuerpo se distribuye sistémicamente en el paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para administrar anticuerpos codificados con ARNm
ANTECEDENTES
Se sabe que los anticuerpos tienen poderosos efectos terapéuticos y actualmente se usan para el tratamiento de una variedad de enfermedades incluyendo el cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares y rechazo de trasplantes. Tradicionalmente, los anticuerpos terapéuticos se producen mediante tecnología recombinante, se formulan y luego se administran a pacientes que necesitan terapia con anticuerpos. Sin embargo, la producción y formulación de anticuerpos es muy cara. Además, muchos anticuerpos solo tienen una vida media muy corta in vivo y, por lo tanto, es posible que no alcancen su antígeno o tejido objetivo antes de degradarse. Para lograr la eficacia deseada, la terapia con anticuerpos requiere a menudo dosis altas y una administración frecuente.
La terapia génica y la vacunación genética, también conocida como vacunación con ADN, proporcionan enfoques alternativos para la administración de grandes cantidades de anticuerpos in vivo. Sin embargo, el uso de ADN como agente en terapia génica y la vacunación genética pueden provocar algunos problemas de seguridad. Por ejemplo, el ADN se degrada lentamente en el torrente sanguíneo. Puede producirse la formación de anticuerpos anti-ADN (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402). La posible persistencia de ADN (extraño) en el organismo puede por tanto llevar a una hiperactivación del sistema inmunológico, que se sabía que daría como resultado esplenomegalia en ratones (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12(5):421- 432). Además, la integración del ADN puede provocar mutaciones en el genoma del huésped al interrumpir un gen intacto.
La WO 2012/170930 enseña que el ARNm que codifica una proteína secretada puede cargarse en nanopartículas lipídicas y administrarse a las células objetivo in vivo. Las células objetivo actúan luego como una fuente de depósito para la producción de proteína soluble secretada en el sistema circulatorio a niveles terapéuticos. La WO 2008/083949 enseña que un único ARNm, que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo, puede introducirse en forma desnuda o como un complejo con portadores adecuados (por ejemplo, liposomas) en un organismo. La US 2012/237975 describe la transfección de células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón embrionario humano (HEK) con ARN usando complejos RNAiMax (véase el párrafo [0208]). El RNAiMax es una lipofectamina™, que es un agente de transfección usado para aumentar la eficiencia de transfección de ARN en cultivos celulares in vitro mediante lipofección y consiste de una formulación de liposomas catiónicos (Mamoru Nakanishi et al., Pharmaceutics Vol. 5, No. 3:411 -420, 2013). Stanley T. Crooke (Capítulo 9.1: Liposomal Formulations for Nucleic Acid Delivery, Antisense Drug Technology, 2008, ISBN: 978-0-8493-8796-8) analiza la encapsulación liposomal de ARNip para su uso en terapia antisentido. Pisani et al. (Neutral Liposomes and DNA Transfection, Non-Viral Gene Therapy, Prof. Xubo Yuan (Ed.), 2011, ISBN: 978-953-307-538-9) analiza la encapsulación liposomal de ADN para la transfección in vitro de líneas celulares de fibroblastos de ratón, para su uso en terapia génica. Martinon et al. (Eur J Immunol. Julio de 1993; 23(7): 1719-22) analiza la encapsulación liposomal de ARNm para uso en vacunas de ARN. Geall et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 4 de septiembre de 2012; 109(36): 14604-9) analiza la encapsulación liposomal de ARN autoamplificante para su uso en vacunas de ARN. Philippot et al. (Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes Volumen 734, Número 2, 12 de octubre de 1983, páginas 137-143) analiza la encapsulación de ARNm en liposomas muy grandes (1000 nm). Love et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2 de febrero de 2010; 107(5):1864-9) analiza la encapsulación liposomal de ARNip para su uso en la terapia de interferencia de ARN.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una composición para la administración más segura y eficaz de anticuerpos in vivo basada en la tecnología de administración de ARN mensajero (ARNm). La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la producción de anticuerpos multicatenarios completamente ensamblados puede lograrse in vivo administrando ARNm exógenos que codifican una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo, incluso cuando la cadena pesada y la cadena ligera se son administradas por ARNm separados. Como se ilustra con los ejemplos no limitativos descritos en la sección de Ejemplos a continuación, cuando se inyectaron por vía intravenosa en ratones constructos de ARNm que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras, encapsulados en liposomas, pueden detectarse cantidades significativas del anticuerpo codificado por ARNm deseado en suero de ratón en el plazo de seis horas después de la inyección con un pico después de 72 o 96 horas. La expresión sistémica del anticuerpo persistió incluso después de tres semanas después de la inyección. Por tanto, los presentes inventores han demostrado con éxito que pueden administrarse anticuerpos terapéuticos multicatenarios por ARNm y producirse por el propio cuerpo del paciente, lo que hace posible eliminar el altamente costoso proceso de fabricación de anticuerpos recombinantes. Además, contrariamente a la naturaleza transitoria y vulnerable de los ARNm, los anticuerpos producidos a partir de los ARNm son sorprendentemente duraderos y pueden lograr una distribución sistémica de manera eficiente. La naturaleza transitoria de los ARNm también puede minimizar el problema de seguridad asociado típicamente con los ácidos nucleicos extraños. Por tanto, la presente invención proporciona un enfoque de administración de anticuerpos más seguro, económico y eficaz para usos terapéuticos.
La invención se refiere a una composición que comprende un primer ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo y un segundo ARNm que codifica la cadena ligera del anticuerpo en una relación molar que varía de 2:1 a 1:2 para su uso en terapia en un paciente, en donde el primer ARNm y el segundo ARNm (i) comprenden cada uno una estructura de caperuza 5', una cola poli-A 3', una región no traducida 5' y una región no traducida 3' y (ii) están encapsulados dentro de liposomas que comprenden un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido a base de colesterol y un lípido modificado con PEG y que tiene un tamaño de no más de 150 nm, en donde el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están encapsulados en el mismo liposoma, en donde el anticuerpo es un tetrámero y cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena ligera de aproximadamente 25 kD y una cadena pesada de aproximadamente 50-70 kD y en donde la composición se administra por vía intravenosa al paciente y el anticuerpo se expresa sistémicamente en el paciente.
En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada o la cadena ligera comprende una secuencia que codifica un péptido señal. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada o la cadena ligera comprende una secuencia que codifica un péptido señal de la hormona del crecimiento humana (hGH) (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, la secuencia que codifica una secuencia de péptido señal (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10) está enlazada, directa o indirectamente, a la secuencia de ARNm que codifica la cadena pesada o la cadena ligera en el extremo N-terminal.
En algunas realizaciones, el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están presentes en una relación molar que varía de 2:1 a 1:2. En algunas realizaciones, el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están presentes en una relación molar de 1:1.
En algunas realizaciones, los liposomas comprenden uno o más de lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos a base de colesterol y lípidos modificados con PEG. En algunas realizaciones, los liposomas comprenden lípido catiónico, lípido neutro, lípido a base de colesterol y lípido modificado con PEG.
En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 150 nm (por ejemplo, de no más de aproximadamente 125 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm). En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 125 nm. En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 75 nm. En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 50 nm.
En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño que varía de aproximadamente 150 a 10 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 125 a 10 nm, 100 a 10 nm, 75 a 10 nm o 50 a 10 nm). En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño que varía de aproximadamente 150 a 100 nm (por ejemplo, de aproximadamente 125 a 100 nm). En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño que varía de aproximadamente 100 a 10 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 90 a 10 nm, 80 a 10 nm, 70 a 10 nm, 60 a 10 nm o 50 a 10 nm).
En algunas realizaciones, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. En algunas realizaciones, los ARNm se modifican para incluir un nucleótido modificado.
En algunas realizaciones, los ARNm se administran por vía intravenosa.
En algunas realizaciones, la expresión sistémica del anticuerpo es detectable por lo menos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 156 horas, 168 horas. o 180 horas después de la administración (por ejemplo, después de la administración única). En algunas realizaciones, la expresión sistémica del anticuerpo es detectable por lo menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 22 días, 25 días o 30 días después de la administración (por ejemplo, después de la administración única). En algunas realizaciones, la expresión sistémica del anticuerpo es detectable por lo menos aproximadamente 0,5 semanas, 1 semana, 1,5 semanas, 2 semanas, 2,5 semanas, 3 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas, 4,5 semanas, 5 semanas, 5,5 semanas, 6 semanas, 6,5 semanas, 7 semanas, 7,5 semanas, o 8 semanas después de la administración (por ejemplo, después de la administración única). En algunas realizaciones, la expresión sistémica del anticuerpo es detectable por lo menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses o 4 meses después de la administración (por ejemplo, después de la administración única).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgG.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anti-CCL2, anti-lisil oxidasa tipo-2 (LOXL2), anti-Fit-1, anti-TNF-a, anti-receptor de interleucina-2Ra (CD25), anti-TGFp, anti-factor de activación de células B, anti-integrina-alfa-4, anti-BAGE, anti-p-catenina/m, anti-Bcr-abl, anti-C5, anti-CA125, anti-CAMEL, anti-CAP-1, anti-CASP-8, anti-CD4, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD25, anti-CDC27/m, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD52, anti-CD56, anti-CD80, anti-CDK4/m, anti-CEA, anti-CT, anti-CTL4, anti-Cyp-B, anti-DAM, anti-EGFR, anti-ErbB3, anti-ELF2M, anti-EMMPRIN, anti-EpCam, anti-ETV6-AML1, anti-HER2, anti-G250, anti-GAGE, anti-GnT-V, anti-Gp100, anti-HAGE, anti-HER-2/neu, anti-HLA-A*0201-R170I, anti-IGF-lR, anti-IL-2R, anti-IL-5, anti-MCIR, anti-miosina/m, anti-MUC1, anti-MUM-1, -2, -3, anti-proteinasa-3, anti-p190 menor bcr-abl, anti-Pml/RARa, anti-PRAMS, anti-PSA, anti-PSM, anti-PSMA, anti-RAGE, anti-RANKL, anti-RUI o RU2, anti-SAGE, anti-SART-1 o anti-SART-3, anti-survivina, anti-TEL/AMLI, anti-TPI/m, anti-TRP-1, anti-TRP-2, anti-TRP-2/INT2 y anti-VEGF o anti­ receptor de VEGF.
Entre otras cosas, la presente invención también proporciona ARNm ejemplares que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de anticuerpos específicos como, por ejemplo, un anticuerpo anti-CCL2, y composiciones que contienen los mismos. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un ARNm que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una secuencia por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, como se describe en la presente. En ciertas realizaciones específicas, la presente invención proporciona un ARNm que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un ARNm que codifica una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una secuencia por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, como se describe en la presente. En ciertas realizaciones específicas, la presente invención proporciona un ARNm que codifica una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, como se describe en la presente.
Como se usa en esta solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Se pretende que cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente cubra cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante.
Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica realizaciones de la presente invención, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
Las siguientes figuras son solo para propósitos ilustrativos y no limitativos.
La Figura 1 muestra un gráfico de barras ejemplar de los niveles de proteína de IgG, determinados por ELISA, observados después de tratar células HCL1 con ARNm usando los métodos proporcionados.
La Figura 2 muestra un gráfico de barras ejemplar de niveles de proteína de IgG, determinados por ELISA, observados después de tratar células con ARNm usando los métodos proporcionados.
La Figura 3 representa los resultados de una transferencia Western que examina los niveles de proteína resultantes de la introducción de ARNm, de acuerdo con los métodos proporcionados, en células HCL1 después de 24 y 48 horas.
La Figura 4 muestra un gráfico de barras ejemplar de los niveles de anticuerpos de CCL2 determinados mediante ELISA en el suero de ratones expuestos al ARNm de acuerdo con los métodos proporcionados durante 6, 24, 48 o 72 horas.
La Figura 5 muestra un gráfico de barras ejemplar de los niveles de anticuerpos de a-VEGF determinados mediante ELISA en el suero de ratones después de una única dosis de ARNm de a-VEGF.
La Figura 6 muestra un gráfico de barras ejemplar de los niveles de anticuerpos de a-VEGF determinados mediante ELISA en el suero de ratones identificados individualmente después de una única dosis de ARNm de a-VEGF.
La Figura 7 muestra un gráfico de barras ejemplar de la producción in vivo de un anticuerpo anti-VEGF humano en ratones de tipo salvaje 24 horas después de la dosificación con nanopartículas lipídicas de cKK-E12 cargadas con ARNm de a-VEGF (LNP). Los ratones se dosificaron mediante inyección en la vena de la cola o inyección subcutánea (SC).
DEFINICIONES
Para que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos a continuación. Se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos a lo largo de la memoria descriptiva.
Aminoácido: Como se usa en la presente, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un 1-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte 1-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en la presente, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos químicamente modificados, que incluyen pero no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi y/o amino terminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones postraduccionales, como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, fracciones de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, fracciones de polietilenglicol, fracciones de lípidos, fracciones de carbohidratos, fracciones de biotina, etc.). El término "aminoácido" se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido.
Animal: como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.
Anticuerpo: Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un "anticuerpo" intacto, que es una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno particular. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica, como se entiende en la técnica, comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Cada región variable se subdivide adicionalmente en regiones hipervariables (HV) y marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden tres áreas de secuencia de hipervariabilidad llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR 1, CDR 2 y CDR 3), separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4) que forman una estructura de lámina beta y sirven como un andamiaje para mantener en posición las regiones HV. El extremo C-terminal de cada cadena ligera y pesada define una región constante que consiste de un dominio para la cadena ligera (CL) y tres para la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Los términos "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completamente ensamblado" se usan en referencia a un anticuerpo para que signifique que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociado mediante enlaces disulfuro como ocurre con los anticuerpos producidos de manera natural. Como se usa en la presente, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto como, por ejemplo, la región de unión al antígeno o variable de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera.
Aproximadamente o alrededor de: como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
Biodisponibilidad: como se usa en la presente, el término "biodisponibilidad" se refiere de manera general al porcentaje de la dosis administrada que llega al torrente sanguíneo de un sujeto.
Biológicamente activo: como se usa en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activo.
Expresión: como se usa en la presente, "expresión" de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a la traducción de un ARNm en un polipéptido (por ejemplo, cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo), ensamblar múltiples polipéptidos (por ejemplo, cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo) en una proteína intacta (por ejemplo, anticuerpo) y/o modificación postraduccional de un polipéptido o proteína completamente ensamblada (por ejemplo, anticuerpo). En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción" y equivalentes gramaticales se usan indistintamente.
Funcional: como se usa en la presente, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que presenta una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Contenido de GC: como se usa en la presente, el "contenido de GC" es la fracción o porcentaje de residuos de nucleobases totales en una secuencia de ácidos nucleicos que son residuos de guanina, residuos de citosina o análogos de los mismos. Por ejemplo, una secuencia de 100 nt que contiene exactamente 30 citosinas, exactamente 30 guaninas, exactamente un análogo de citosina y exactamente un análogo de guanina tiene una riqueza de GC del 62%.
Vida media: como se usa en la presente, el término "vida media" es el tiempo requerido para que una cantidad, como la concentración de proteína o la actividad, caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un período de tiempo.
Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un sujeto de control (o múltiples sujetos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que se está tratando.
In Vitro: Como se usa en la presente, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.
In vivo: como se usa en la presente, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que se producen dentro de una célula viva (en oposición a, por ejemplo, sistemas in vitro).
Aislado: Como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de por lo menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental) y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre . Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que estaba asociada inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tienen aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% de pureza. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en la presente, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.).
Conector. como se usa en la presente, el término "conector" se refiere, en una proteína de fusión, a una secuencia de aminoácidos distinta a la que aparece en una posición particular en la proteína natural y generalmente está diseñada para ser flexible o para interponer una estructura, como una hélice a, entre dos fracciones de proteína. A un conector también se hace referencia como espaciador. Un conector o un espaciador típicamente no tiene una función biológica por sí solo.
Distribución o administración local: como se usa en la presente, los términos "distribución local", "administración local" o equivalentes gramaticales, se refieren a la administración o distribución específica de tejido. Típicamente, la distribución o administración local requiere que una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) codificada por los ARNm se traduzca y exprese intracelularmente o con secreción limitada que evite entrar en el sistema circulatorio del paciente.
ARN mensajero (ARNm): como se usa en la presente, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes.
Ácido nucleico: como se usa en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que sea o pueda incorporarse en una cadena de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. "Ácido nucleico" se refiere a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). "Ácido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleótidos que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. "Ácido nucleico" abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o doble. Además, los términos "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen una cadena principal distinta de fosfodiéster. Los "ácidos nucleicos peptídicos" tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la estructura principal. El término "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o a Rn pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos como análogos que tienen bases o azúcares modificadas químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ácidos nucleicos se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención se dirige específicamente a "ácidos nucleicos no modificados", es decir, ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o lograr la administración.
Paciente: como se usa en la presente, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano.
Farmacéuticamente aceptable: el término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Distribución o administración sistémica: como se usa en la presente, los términos "distribución sistémica", "administración sistémica" o equivalentes gramaticales, se refieren a un mecanismo o enfoque de administración o distribución que afecta a todo el cuerpo o un organismo completo. Típicamente, la distribución o administración sistémica se logra a través del sistema de circulación del cuerpo, por ejemplo, el torrente sanguíneo. En comparación con la definición de "distribución o administración local".
Sujeto: Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdo, oveja, caballo o primate). Un humano incluye formas prenatales y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, lo que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa en la presente de manera intercambiable con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede presentar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.
Sustancialmente: como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a ser completos o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en la presente para capturar la falta potencial de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Tejidos objetivo: como se usa en la presente, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que se ve afectado por una enfermedad a tratar. En algunas realizaciones, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que presentan patologías, síntomas o características asociados a la enfermedad.
Cantidad terapéuticamente eficaz: como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente mediante un régimen de dosificación que comprende por lo menos una dosis unitaria.
Tratamiento: como se usa en la presente, el término "tratar", "tratamiento" o "tratando" se refiere a cualquier método usado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia parcial o completamente de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o presenta solo signos tempranos de la enfermedad con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada con la enfermedad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención proporciona una composición para administrar anticuerpos in vivo basada en tecnología de administración de ARNm. En particular, la invención proporciona una composición que comprende un primer ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo y un segundo ARNm que codifica la cadena ligera del anticuerpo en una relación molar que varía de 2:1 a 1:2, para su uso en el tratamiento de un paciente con una enfermedad o trastorno que necesita la administración de dicho anticuerpo, en donde el primer ARNm y el segundo ARNm están encapsulados dentro de liposomas que comprenden un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido a base de colesterol y un lípido modificado con PEG y que tienen un tamaño de no más de 150 nm, en donde el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están encapsulados en el mismo liposoma, en donde el anticuerpo es un tetrámero y cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena ligera de aproximadamente 25 kD y una cadena pesada de aproximadamente 50-70 kD, y en donde la composición se administra al paciente por vía intravenosa o subcutánea. Los anticuerpos codificados por ARNm pueden expresarse localmente (por ejemplo, de una manera específica de tejido) o sistemáticamente en el sujeto.
Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones.
Anticuerpos codificados por ARNm
La presente invención se usa para administrar anticuerpos. Un "anticuerpo" intacto es una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno particular. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgE, IgA e IgD. Un anticuerpo intacto es un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas regiones correspondientes en la cadena ligera y pesada, respectivamente. Cada región variable puede subdividirse en regiones hipervariables (HV) y de marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden tres áreas de secuencia de hipervariabilidad llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR 1, CDR 2 y CDR 3), separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4) que forman una estructura de hoja beta y sirven como un andamiaje para mantener en posición las regiones HV. El extremo C-terminal de cada cadena ligera y pesada define una región constante que consiste de un dominio para la cadena ligera (CL) y tres para la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Una cadena ligera de inmunoglobulinas puede diferenciarse aún más en los isotipos kappa y lamda.
Los términos "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completamente ensamblado" se usan en referencia a un anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas por enlaces disulfuro como ocurre con los anticuerpos producidos de manera natural.
Como se usa en la presente, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto como, por ejemplo, la región de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Un fragmento de anticuerpo contiene una secuencia suficiente del anticuerpo original del cual es un fragmento que se une al mismo antígeno al que lo hace el anticuerpo original; un fragmento se une al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo original y/o compite con el anticuerpo original por unirse al antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2 y fragmento Fv.
Los anticuerpos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anti-quimioquina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2), anti-lisil oxidasa-tipo-2 (lOx l 2), anti-Fit-1, anti-TNF-a, anti-receptor de interleucina-2Ra (CD25), anti-TGFp, anti­ factor de activación de células B, anti-integrina alfa-4, anti-BAGE, anti-p-catenina/m, anti-Bcr-abl, anti-C5, anti-CA125, anti-CAMEL, anti-CAP-1, anti-CASP-8, anti-CD4, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD25, anti-CDC27/m, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD52, anti-CD56, anti-CD80, anti-CDK4/m, anti-CEA, anti-CT, anti-CTL4, anti-Cyp-B, anti-DAM, anti-EGFR, anti-ErbB3, anti-ELF2M, anti-EMMPRIN, anti-EpCam, anti-ETV6-AML1, anti-HER2, anti-G250, anti-GAGE, anti-GnT-V, anti-Gp100, anti-HAGE, anti-HER-2/neu, anti-HLA-A*0201-R170I, anti-IGF-lR, anti-IL-2R, anti-IL-5, anti-MClR, anti-miosina/m, anti-MUC1, anti-MUM-1, -2, -3, anti-proteinasa-3, anti-p190 menor bcr-abl, anti-Pm1/RARa, anti-PRAMS, anti-PSA, anti-PSM, anti-PSMA, anti-RAGE, anti-RANKL, anti-RUl o RU2, anti-SAGE, anti-SART-1 o anti-SART-3, anti-survivina, anti-TEL/AMLI, anti-TPI/m, anti-TRP-1, anti-TRP-2, anti-TRP-2/INT2 y anti-VEGF o receptor anti-VEGF.
ARNm que codifican cadena pesada y cadena ligera
De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos pueden producirse en una célula u organismo vivo mediante la traducción de ARNm exógeno dentro de la célula y el organismo vivo. En particular, de acuerdo con la presente invención, la producción de anticuerpos multicatenarios completamente ensamblados puede lograrse en una célula u organismo vivo mediante la administración de ARNm exógenos que codifican una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo. Específicamente, se produce un tetrámero que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.
Como se usa en la presente, el término "cadena pesada" abarca todos los tipos de cadenas pesadas de origen natural de diferentes clases de inmunoglobulinas, incluyendo pero no limitado a, IgM (|j), IgD (8), IgG (y), IgA (a) e IgE (£), y variantes biológicamente activas de los mismos. Típicamente, una cadena pesada de acuerdo con la presente invención contiene la región variable N-terminal responsable del reconocimiento de antígenos, que incluye típicamente CDR 1, CDR 2 y CDR 3, separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4). Típicamente, la región variable N-terminal contiene aproximadamente de 100 a 110 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, una cadena pesada de acuerdo con la presente invención contiene uno o más dominios constantes (por ejemplo, Ch1, Ch2 y/o Ch3). En algunas realizaciones, un ARNm que codifica una cadena pesada de un anticuerpo tiene o tiene más de 0,3 kb, 0,5 kb, 0,75 kb, 1,0 kb, 1,25 kb, 1,5 kb, 1,75 kb, 2,0 kb, 2,5 kb, 3,0 kb, 3,5 kb, 4,0 kb de longitud.
Como se usa en la presente, el término "cadena ligera" abarca todos los tipos de cadenas ligeras de origen natural de diferentes clases de inmunoglobulinas, incluyendo pero no limitado a, los isotipos k o A, y variantes biológicamente activas de los mismos. Típicamente, una cadena ligera de acuerdo con la presente invención comprende un dominio variable (Vl) N-terminal. En algunas realizaciones, una cadena ligera de acuerdo con la presente invención contiene un dominio constante (Cl) C-terminal. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica una cadena ligera de un anticuerpo tiene o tiene más de 0,1 kb, 0,2 kb, 0,3 kb, 0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,8 kb, 0,9 kb, 1,0 kb, 1,25 kb, 1,5 kb, 1,75 kb, 2,0 kb, 2,5 kb o 3,0 kb de longitud.
Típicamente, un anticuerpo tetramérico contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras codificadas por ARNm, cada una unida por un puente disulfuro.
De acuerdo con la presente invención, una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo se codifican y administran mediante ARNm separados. El ARNm que codifica la cadena pesada (al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una relación molar que varía de 2:1 a 1:2. En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la cadena pesada (al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (t al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una relación molar de 2:1 o 1:1. En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la cadena pesada (al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una proporción de aproximadamente 1:1 (es decir, igual molar). En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la cadena pesada (al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una relación distinta de 1:1 (igual molar). Por ejemplo, el ARNm que codifica la cadena pesada (al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una relación mayor de 1 (por ejemplo, que varía de 2:1 a 1:1). Alternativamente, el ARNm que codifica la cadena pesada al que también se hace referencia como primer ARNm) y el ARNm que codifica la cadena ligera (al que también se hace referencia como segundo ARNm) se administran en una relación menor de 1 (por ejemplo, que varía de 1:1 a 1:2).
Péptido señal
Un ARNm que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera incorpora una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. Como se usa en la presente, el término "péptido señal" se refiere a un péptido presente en una proteína recién sintetizada que puede dirigir la proteína hacia la vía secretora. Típicamente, el péptido señal se escinde después de la translocación en el retículo endoplásmico después de la traducción del ARNm. También se hace referencia al péptido señal como secuencia señal, secuencia líder o péptido líder. Típicamente, un péptido señal es un péptido corto (por ejemplo, de 5-30, 5-25, 5-20, 5-15 o 5-10 aminoácidos de longitud). Un péptido señal puede estar presente en el extremo N-terminal de una proteína recién sintetizada. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, la incorporación de un péptido señal que codifica un ARNm que codifica la secuencia en una cadena pesada y/o cadena ligera puede facilitar la secrección y/o producción del anticuerpo producido a partir del ARNm in vivo.
Un péptido señal adecuado para la presente invención puede ser una secuencia heterogénea derivada de varias proteínas eucariotas y procariotas, en particular proteínas secretadas. En algunas realizaciones, un péptido señal adecuado es una secuencia rica en leucina, como se describe en Yamamoto Y et al. (1989), Biochemistry, 28:2728-2732. Un péptido señal adecuado puede derivarse de una hormona de crecimiento humana (hGH), preproproteína de albúmina sérica, precursor de la cadena ligera kappa de Ig, preproproteína de azurocidina, precursor de cistatina-S, precursor de tripsinógeno 2, bloqueador de los canales de potasio, alfa conotoxina lp1.3, alfa conotoxina, alfa-galactosidasa, celulosa, proteinasa aspártica nepentenina-1, quitinasa ácida, preprotoxina K28, precursor de zigocina de la toxina asesina y toxina del cólera. Las secuencias de péptidos señal ejemplares se describen en Koberet al., Biotechnol. Bioeng., 110:1164-73, 2012.
En algunas realizaciones, un ARNm que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera puede incorporar una secuencia que codifica un péptido señal derivado de la hormona del crecimiento humana (hGH), o un fragmento de la misma. A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos no limitativa que codifica un péptido señal de hGH.
Secuencia de la hormona del crecimiento humana (hGH) 5' (SEQ ID NO: 9):
AU GGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGC CCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCC
Secuencia alternativa de la hormona del crecimiento humana (hGH) 5' (SEQ ID NO: 10):
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCC CAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCG
En algunas realizaciones, un ARNm de acuerdo con la presente invención puede incorporar una secuencia que codifica el péptido señal que tiene por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.
Síntesis de ARNm
Los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse mediante transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, una agrupación de ribonucleótidos trifosfatos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio y una ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T3, T7 o SP6 ARN polimerasa)., ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán dependiendo de la aplicación específica.
En algunas realizaciones, para la preparación de ARNm que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención, se transcribe in vitro una plantilla de ADN. Una plantilla de ADN adecuada típicamente tiene un promotor, por ejemplo, un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripción in vitro, seguido de la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm que codifica el anticuerpo deseado (por ejemplo, que codifica la cadena pesada o la cadena ligera) y una señal de terminación.
La secuencia de ARNm que codifica el anticuerpo deseado (por ejemplo, que codifica la cadena pesada o la cadena ligera) de acuerdo con la invención puede determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN usando métodos estándar. Por ejemplo, partiendo de una secuencia de aminoácidos deseada (por ejemplo, una secuencia deseada de cadena pesada o cadena ligera), se lleva a cabo una traducción inversa virtual en base al código genético degenerado. Luego pueden usarse algoritmos de optimización para la selección de los codones adecuados. Típicamente, el contenido de G/C puede optimizarse para lograr el contenido de G/C más alto posible por un lado, teniendo en la mejor cuenta posible la frecuencia de los ARNt de acuerdo con el uso de codones por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y mostrarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). También puede analizarse una estructura secundaria para calcular las propiedades de estabilización y desestabilización o, respectivamente, las regiones del ARN.
El ARNm de acuerdo con la presente invención puede sintetizarse como ARNm modificado o no modificado. Típicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Por tanto, un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. En algunas realizaciones, los ARNm que codifican anticuerpos (por ejemplo, ARNm que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras) pueden sintetizarse a partir de nucleótidos de origen natural y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como nucleótidos modificados análogos o derivados de purinas y pirimidinas, como por ejemplo 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidrouracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, p-D-manosil-queosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, de la Patente de Estados Unidos N° 4.373.071, Patente de Estados Unidos N° 4.401.796, Patente de Estados Unidos N° 4.415.732, Patente de Estados Unidos N° 4.458.066, Patente de Estados Unidos N° 4.500.707, Patente de Estados Unidos N° 4.668.777, Patente de Estados Unidos N° 4.973.679, Patente de Estados Unidos N° 5.047.524, Patente de Estados Unidos N° 5.132.418, Patente de Estados Unidos N° 5.153.319, Patentes de Estados Unidos N° 5.262.530 y 5.700.642, cuya divulgación se incluye en la presente en su alcance completo por referencia.
En algunas realizaciones, los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) pueden contener modificaciones de la estructura principal del ARN. Típicamente, una modificación de la estructura principal es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Los ejemplos de modificaciones de la estructura principal incluyen típicamente, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste de metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc. lo que significa la sustitución del enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.
En algunas realizaciones, los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) pueden contener modificaciones de azúcar. Una modificación de azúcar típica es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene, incluyendo pero no limitado a, modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste de 2'-desoxi-2'-fluoro-oligoribonucleótido
(2'-fluoro-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-desaminaoligoribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligoribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligoribonucleótido e isómeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato) o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).
En algunas realizaciones, los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de bases). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de base también se denomina nucleótido de base modificada. Ejemplos de tales nucleótidos de base modificada incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'- trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7 deazaadenosina 5'-trifosfato, 7-deazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribósido 5'-trifosfato, Nl-metiladenosina 5'-trifosfato, Nl-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, 5'-seudouridina trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.
Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas.
Los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) incluyen una estructura de caperuza 5'. Típicamente, se añade una caperuza 5' de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego se añade trifosfato de guanosina (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, produciendo un enlace trifosfato 5'5'5; y el nitrógeno 7 de la guanina se metila luego mediante una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')AyG(5')ppp(5')G.
Los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) incluyen una estructura de cola poli(A) 3'. Una cola poli-A en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 175 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 125 nucleótidos de adenosina nucleótidos, de 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 75 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de adenosina o aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) incluyen una estructura de cola poli(C) 3'. Una cola poli-C adecuada en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de citosina (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de citosina o aproximadamente de 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola poli-C puede añadirse a la cola poli-A o puede sustituir a la cola poli-A.
Los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) incluyen una región no traducida 5' y 3'. En algunas realizaciones, una región 5' no traducida incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región 5' no traducida puede tener entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, entre aproximadamente 50 y 400 nucleótidos de longitud, entre aproximadamente 50 y 300 nucleótidos de longitud, entre aproximadamente 50 y 200 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 50 y 100 nucleótidos de longitud).
Una región 5' de los ARNm que codifican los anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) incluye una secuencia que codifica un péptido señal, como las descritas en la presente. En realizaciones particulares, se incorpora un péptido señal derivado de la hormona del crecimiento humana (hGH) (por ejemplo, SEQ ID NO: 9) en la región 5'. Típicamente, una secuencia que codifica un péptido señal (por ejemplo, una secuencia que codifica un péptido señal de hGH como la SEQ ID NO: 9) se une, directa o indirectamente, a la secuencia que codifica la cadena pesada o la cadena ligera en el extremo N-terminal.
ARNm ejemplares que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de anti-CCL2
Como ejemplo no limitativo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 se describen en el Ejemplo 1. Los ARNm que codifican la cadena pesada sin y con las secuencias UTR 5' y 3' se muestran a continuación como la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. Los ARNm que codifican la cadena ligera sin y con las secuencias de UTR 5' y 3' se muestran a continuación como la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente.
ARNm de cadena pesada anti-CCL2 (HC-aCCL2) sin UTR 5 y 3' (SEQ ID NO: 1):
AU GGAAUUCGGCCU GAGCU GGCUGUUCCU GGU GGCCAUCCUGAAGGGCGUGCAG UGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGGCGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCCG UGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGCGGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCUG GGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCUGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAUC UUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAAAUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCCG ACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUGGAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACAC CGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACGACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUGG GGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUCCUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUGU ACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCCAGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCUG CCU GGUC AAGGGCU ACUUCCCCGAGCCCGU GACCGU G ACCUGGAACUCCGGCUCC CUGUCCUCCGGCGUGCACACCUUCCCUGCCGUGCUGCAGUCCGACCUCUACACCC UGUCCAGCAGCGUGACCGUGCCCUCCUCCACCUGGCCCUCCGAGACAGUGACCUG CAACGUGGCCCACCCCGCCUCCAGCACCAAGGUGGACAAGAAAAUCGUGCCCCGG GACUGCGGCUGCAAGCCCUGCAUCUGUACCGUGCCCGAGGUGUCCUCCGUGUUCA UCUUCCCACCCAAGCCCAAGGACGUGCUGACCAUCACACUGACCCCCAAAGUGAC CUGCGU GGU GGU GGAC AUCUCC AAGGACGACCCCGAGGU GC AGUUC AGUUGGUUC GUGGACGACGUGGAAGUGCACACCGCUCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGUUCA ACUCCACCUUCAGAUCCGUGUCCGAGCUGCCCAUCAUGCACCAGGACUGGCUGAA CGGCAAAGAAUUCAAGUGCAGAGUGAACUCCGCCGCCUUCCCAGCCCCCAUCGAA AAGACCAUCUCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGUCUACACCAUCC CCCCACCCAAAGAACAGAUGGCCAAGGACAAGGUGUCCCUGACCUGCAUGAUCAC CGAUUUCUUCCCAGAGGACAUCACCGUGGAAUGGCAGUGGAACGGCCAGCCCGCC GAGAACUACAAGAACACCCAGCCCAUCAUGGACACCGACGGCUCCUACUUCGUGU ACUCCAAGCUGAACGUGCAGAAGUCCAACUGGGAGGCCGGCAACACCUUCACCUG UAGCGUGCUGCACGAGGGCCUGCACAACCACCACACCGAGAAGUCCCUGUCCCAC UCCCCCGGCAAGUGA
ARNm de cadena pesada anti-CCL2 (HC-aCCL2) con UTR 5 y 3' (SEQ ID NO: 2):
(Las secuencias UTR 5 'y 3' están subrayadas)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAGAGU G ACU C ACCGUCCUU GAC ACGAU GGAAUUCGGCCUGAGCU GGCUGU UCCU GGU GGCCAUCCUGAAGGGCGU GCAGUGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGG CGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCCGUGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGC GGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCUGGGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCC UGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAUCUUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAA AUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCCGACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUG GAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACACCGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACG ACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUGGGGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUC CUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUGUACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCC AGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCUGCCUGGUCAAGGGCUACUUCCCCGAGCC CGUGACCGUGACCUGGAACUCCGGCUCCCUGUCCUCCGGCGUGCACACCUUCCCU GCCGUGCUGCAGUCCGACCUCUACACCCUGUCCAGCAGCGUGACCGUGCCCUCCU CC ACCU GGCCCUCCGAGAC AGU G ACCUGC AACGU GGCCC ACCCCGCCUCC AGC ACC AAGGUGGACAAGAAAAUCGUGCCCCGGGACUGCGGCUGCAAGCCCUGCAUCUGUA CCGUGCCCGAGGUGUCCUCCGUGUUCAUCUUCCCACCCAAGCCCAAGGACGUGCU GACC AUC AC ACUGACCCCC AAAGU GACCU GCGU GGU GGU GGAC AUCUCC AAGGAC GACCCCGAGGUGCAGUUCAGUUGGUUCGUGGACGACGUGGAAGUGCACACCGCUC AGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGUUCAACUCCACCUUCAGAUCCGUGUCCGAGCU GCCC AUC AU GC ACC AGGACUGGCU G AACGGC AAAGAAUUC AAGU GC AGAGU GAAC UCCGCCGCCUUCCCAGCCCCCAUCGAAAAGACCAUCUCCAAGACCAAGGGCAGAC CCAAGGCCCCCCAGGUCUACACCAUCCCCCCACCCAAAGAACAGAUGGCCAAGGA CAAGGUGUCCCUGACCUGCAUGAUCACCGAUUUCUUCCCAGAGGACAUCACCGUG GAAUGGCAGUGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACUACAAGAACACCCAGCCCAUCA UGGACACCGACGGCUCCUACUUCGUGUACUCCAAGCUGAACGUGCAGAAGUCCAA CUGGGAGGCCGGCAACACCUUCACCUGUAGCGUGCUGCACGAGGGCCUGCACAAC CACCACACCGAGAAGUCCCUGUCCCACUCCCCCGGCAAGUGACGGGUGGCAUCCC U GU GACCCCUCCCC AGU GCCUCUCCU GGCCCU GGAAGUU GCC ACUCC AGU GCCC A CCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
ARNm de cadena ligera anti-CCL2 (LC-a7CL2) sin UTR 5' y 3' (SEQ ID NO: 3):
AU GGAA ACCCCUGCCC AGCUGCU GUUCCU GCUGCU GCUGU GGCUGCCU GAUACC A CCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUCCCCCGCCACCCUGUCUCUGAGCCCUGGCGA GAGAGCCACCCUGAGCUGCAGAGCCUCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGGCC UGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUCCU CUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAGAUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGACUU CACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAACCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCCAC CAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCACCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAUCA AGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUCCAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUGAC CUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGCUUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACAUC AACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCUCCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUCCU GGACCGACCAGGACUCCAAGGACAGCACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACCCU GACCAAGGACGAGUACGAGCGGCACAACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACAAG ACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGUCCUUCAACCGGAACGAGUGCUGA
ARNm de cadena ligera anti-CCL2 (LC-aCCL2) con UTR 5 'y 3' (SEQ ID NO: 4): (Las secuencias UTR 5' y ' están subrayadas)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAGAGU G ACU C ACCGUCCUU GAC ACGAU GGAAACCCCU GCCC AGCU GCUGU UCCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCUGAUACCACCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUC CCCCGCC ACCCU GUCUCUGAGCCCU GGCGAGAGAGCC ACCCUGAGCU GC AGAGCC UCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGGCCUGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGG CCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUCCUCUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAG AUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGACUUCACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAA CCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCCACCAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCA CCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAUCAAGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUC CAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUGACCUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGC UUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACAUCAACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCU CCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUCCUGGACCGACCAGGACUCCAAGGACAG CACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACCCUGACCAAGGACGAGUACGAGCGGCAC AACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACAAGACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGU CCUUCAACCGGAACGAGUGCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGC CUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAA AUUAAGUUGCAUCAAGCU
Entre otras cosas, la presente invención también proporciona ARNm que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 sustancialmente idéntico o similar a las secuencias descritas en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-CCL2 tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-CCL2 tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homóloga a la SEQ ID NO: 1 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homóloga a la SEQ ID NO: 3 como se describe en la presente.
En algunas realizaciones, el ARNm proporcionado en la presente contiene uno o más nucleótidos modificados como los descritos en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo anti-CCL2 puede contener por lo menos un 10%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95% de nucleótidos modificados de todos los nucleótidos modificables de la secuencia.
ARNm ejemplares que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de anti-VEGF
ARNm de cadena pesada anti-VEGF (HC-aVEGF) sin UTR 5 'y 3' (SEQ ID NO: 5): AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCC CAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCGGAGGUUCAGCU GGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCCAGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUGC GCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAACUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCGC CGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGCUGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCUA CCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGUUCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGUC AACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCUGCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUAC UGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGCUCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGUGGG GUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCGUCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGUU UCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGACGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUGC UUGGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCCGGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCGC UCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCUGCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACUC GCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGAGCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAUU UGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAACACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCGA AGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGCCCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGGG GGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGCCAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUCA C GGACGCCAGAAGU GACCUGUGUGGUC GUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCC GGAA GUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGGGGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACC AAA CCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACCUACCGGGUGGUGUCCGUGCUGACUGUGC U GC ACC AGGACU GGCU GAAU GGA AAGGAGUAC AAAU GC AAGGUC AGC AAC AAGG CCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGAUCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAGA GCCUC A AGU GU AC ACUCUGCC GCC GU C A AGAGA AG AAAU G ACU A AG A ACC A AGUU UCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUUCUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGGG AGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAACUAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACUC GGAUGGUUCCUUCUUCCUUUACAGCAAGCUGACCGUGGAUAAAUCGCGGUGGCA GCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAGUCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUAC ACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCCAGGAAAAUAA
ARNm de cadena pesada anti-VEGF (HC-aVEGF) con UTR 5 'y 3' (SEQ ID NO: 6):
(Las secuencias de UTR 5' y 3' están subrayadas, las secuencias de péptidos señal están en cursiva y en negrita)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAGAGU G ACU C ACCGUCCUU GAC ACGA UGGCAA CUGGA UCAA GAA CCUCCC UCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUC CCCA CU A UCCCCCUCUCGGAGGUUCAGCUGGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCC AGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUGCGCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAA CUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCGCCGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGC UGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCUACCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGU UCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGUCAACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCU GCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUACUGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGC UCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGU GGGGUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCG UCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGUUUCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGA CGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUGCUUGGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCC GGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCGCUCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCU GCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACUCGCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGA GCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAUUUGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAA CACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCGAAGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGC CCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGGGGGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGC CAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUCACGGACGCCAGAAGUGACCUGUGUGGU CGUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCCGGAAGUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGG GGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACCAAACCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACC UACCGGGU GGU GUCCGU GCUGACU GU GCUGCACCAGGACUGGCUGAAUGGAAAG GAGUACAAAUGCAAGGUCAGCAACAAGGCCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGA UCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAGAGCCUCAAGUGUACACUCUGCCGCCGUC AAGAGAAGAAAUGACUAAGAACCAAGUUUCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUU CUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAAC UAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACUCGGAUGGUUCCUUCUUCCUUUACAGCA AGCUGACCGUGGAUAAAUCGCGGUGGCAGCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAG UCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUACACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCC AGGAAAAUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCU GGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC AAGCU
ARNm de cadena ligera anti-VEGF (HC-aVEGF) sin UTR 5 'y 3' (SEQ ID NO: 7):
AU GGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGC CCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCCGACAUUCAAAU GACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAGCAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCACU
UGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAAUUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCCUG GAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUACUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUCCC GUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCAGGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCUCG CUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUUACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCCUU GGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGUUGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCCUC CGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGACGAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUGUC GU GU GCCUCCU GAAC AACUUCUACCCGCGGGAAGCC AAGGU GC AGU GGAAAGU GG AUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUUCGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCGAA GGACUCAACCUACUCCCUCAGCUCAACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACGAG AAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAAGUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGUGA CUAAAUCCUUCAAUAGGGGGGAAUGUUAA
ARNm de cadena ligera anti-VEGF (HC-aVEGF) con UTR 5 y 3' (SEQ ID NO: 8):
(Las secuencias de UTR 5' y 3' están subrayadas, las secuencias de péptidos señal están en cursiva y en negrita)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAGAGU G ACU C ACCGUCCUU GACACGA UGGCCA CUGGA UCAA GAA CCUCA C UGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUU CCCGACCAl/CCCACl/Cl/CCGACAUUCAAAUGACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAG CAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCACUUGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAA UUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCCUGGAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUA CUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUCCCGUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCA GGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCUCGCUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUU ACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCCUUGGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGU UGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCCUCCGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGAC GAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUGUCGUGUGCCUCCUGAACAACUUCUACC CGCGGGAAGCCAAGGUGCAGUGGAAAGUGGAUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUU CGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCGAAGGACUCAACCUACUCCCUCAGCUC AACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACGAGAAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAA GUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGUGACUAAAUCCUUCAAUAGGGGGGAAU GUUAACGGGU GGC AUCCCUGU GACCCCUCCCC AGU GCCUCUCCUGGCCCU GGAAG UUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Entre otras cosas, la presente invención también proporciona ARNm que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF sustancialmente idéntico o similar a las secuencias descritas en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homóloga a la SEQ ID NO: 5 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8 como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homóloga a la SEQ ID NO: 7 como se describe en la presente.
En algunas realizaciones, el ARNm proporcionado en la presente contiene uno o más nucleótidos modificados como los descritos en la presente. En algunas realizaciones, un ARNm que codifica la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF puede contener por lo menos un 10%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95% de nucleótidos modificados de todos los nucleótidos modificables de la secuencia.
Como se usa en la presente, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, puede realizarse alineando las dos secuencias con propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas pueden descartarse para propósitos de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con propósitos de comparación es por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos por lo menos el 95%, o sustancialmente el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es la función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse alternativamente usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz NWSgapdna.CMP.
Vehículos de administración liposomal
Los ARNm que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo pueden administrarse mediante un único vehículo de administración liposomal.
Como se usa en la presente, los vehículos de administración liposomal se caracterizan habitualmente como vesículas microscópicas que tienen un espacio interior acuoso secuestrado de un medio externo por una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas están formadas típicamente por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfofílicos y surfactantes (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.). En el contexto de la presente invención, un vehículo de administración liposomal sirve para transportar un ARNm deseado a una célula o tejido objetivo. A menudo se hace referencia al proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma como "carga". Los métodos ejemplares se describen en Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados en liposomas pueden estar localizados total o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. También se hace referencia a la incorporación de un ácido nucleico en los liposomas en la presente como "encapsulación", en la que el ácido nucleico está contenido por completo dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o sustancias químicas que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un vehículo de administración adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar la administración del ARNm a la célula o tejido objetivo.
Un vehículo de administración liposomal adecuado se formula como una nanopartícula lipídica. Como se usa en la presente, la frase "nanopartícula lipídica" se refiere a un vehículo de administración que comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido a base de colesterol y un lípido modificado con PEG). Las nanopartículas lipídicas pueden prepararse incluyendo mezclas de lípidos multicomponente de proporciones variables empleando lípidos catiónicos, no catiónicos, a base den colesterol y modificados con PEG.
En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado contiene un lípido catiónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como pH fisiológico. En la bibliografía se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos particularmente adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 (y particularmente, CI 2-200 descrito en el párrafo [00225]) y la WO 2012/170930. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención emplean nanopartículas lipídicas que comprenden un lípido catiónico ionizable descrito en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012, como, por ejemplo, (15Z, 18Z) -N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001) y (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien-1-amina (HGT5002).
En algunas realizaciones, se usa el lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4.897.355). El DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o "DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal o una nanopartícula lipídica, y tales liposomas pueden usarse para mejorar la administración de ácidos nucleicos a las células objetivo. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxiespermilglicinodioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al., Proc. Nat.l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5.171.678; Patente de Estados Unidos N° 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano o "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,Ndiestearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil 1-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin- -DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA" y 2-(2,2-di ((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)) , o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107:276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de PCT WO2005/121348A1).
En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos presentes en dicha composición comprenden por lo menos uno de una fracción de imidazol, dialquilamino o guanidinio.
En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos presentes en dicha composición se eligen de XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano), Mc 3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo 4-(dimetilamino)butanoato), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] [1, 3] dioxol-5-amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo)-3-(undecilamino)propil)-N1,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), ICE (WO 2011/068810), HGT5000 (Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/617,468) o HGT5001 (cis o trans) (Solicitud de Patente Provisional N° 61/617,468), lipidoides de aminoalcohol como los divulgados en la WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "La saturación de lípidos catiónicos influye en la administración intracelular de ácidos nucleicos encapsulados" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al."Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869).
En algunas realizaciones, un lípido catiónico presente en dicha composición es un lípido catiónico descrito en la WO 2013063468 y en la Solicitud Provisional de Estados Unidos número de serie. 61/894.299, titulada "Lipid Formulations for Delivery of Messernger RNA" presentada el 22 de octubre de 2013. En algunas realizaciones, un lípido catiónico comprende un compuesto de fórmula I-c1-a:
Figure imgf000020_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
cada R2 es independientemente hidrógeno o alquilo C1-3;
cada q es independientemente de 2 a 6;
cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo C1-3;
y cada RL es independientemente alquilo C8-12.
En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno.
En algunas realizaciones, cada q es independientemente de 3 a 6. En algunas realizaciones, cada q es independientemente de 3 a 5. En algunas realizaciones, cada q es 4.
En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno.
En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C10. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C10.
En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno o metilo; cada q es independientemente de 3 a 5; cada R' es independientemente hidrógeno o metilo; y cada EL es independientemente alquilo C8-12.
En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno; cada q es independientemente de 3 a 5; cada R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C8-12.
En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno; cada q es 4; cada R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C8-12.
En algunas realizaciones, un lípido catiónico comprende un compuesto de fórmula Ig:
Figure imgf000021_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada RL es independientemente alquilo C8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C10. En algunas realizaciones, cada RL es n-alquilo C10.
En realizaciones particulares, las composiciones proporcionadas incluyen un lípido catiónico cKK-E12 o (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona). La estructura de cKK-E12 se muestra a continuación:
Figure imgf000022_0001
En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado contiene lípidos no catiónicos. En algunas realizaciones, un lípido no catiónico es un lípido neutro, es decir, un lípido que no lleva una carga neta en las condiciones en las que se formula y/o administra la composición. Tales lípidos no catiónicos o neutros ejemplares pueden elegirse entre DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1, 2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)) y colesterol.
Los lípidos catiónicos a base deen colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys Res. Comm. 179, 280 (1991), Wolfet al., BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.744.335) o ICE.
En otras realizaciones, las nanopartículas lipídicas adecuadas comprenden uno o más lípidos escindibles como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro escindible (S-S) (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), como se describe con más detalle en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N°: 61/494.745.
Además, varios reactivos están disponibles comercialmente para mejorar la eficacia de la transfección. Los ejemplos adecuados incluyen LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTA INE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) y EFFECTENE.
En algunas realizaciones, el lípido catiónico puede comprender una relación molar de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40% del lípido total presente en el vehículo de transferencia, o preferiblemente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
El uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo la N-octanoil-esfingosina-1-[succinil (metoxi polietilenglicol)-2000] (ceramida C8 PEG-2000) está en combinación con otros lípidos juntos que comprenden el vehículo de transferencia liposomal. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena o cadenas de alquilo de longitud C6-C20. La adición de tales componentes puede prevenir la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar la administración de la composición de lípidos-ácidos nucleicos a la célula objetivo, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para intercambiarse rápidamente fuera de la formulación in vivo (ver Patente de Estados Unidos N° 5.885.613).
Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos derivatizados de la presente invención pueden comprender una relación molar de aproximadamente el 0% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, o de aproximadamente el 2% del lípido total presente en el vehículo de transferencia liposomal.
Como se usa en la presente, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwiteriónico o aniónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga neta negativa a un pH seleccionado, como pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOpG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (d PPg ), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. Tales lípidos no catiónicos pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. Cuando se usan en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar del 5% a aproximadamente el 90%, o preferiblemente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.
En realizaciones particulares, se prepara un vehículo de transferencia liposomal adecuado combinando múltiples componentes de lípidos y/o polímeros. Por ejemplo, puede prepararse un vehículo de transferencia liposomal usando C 12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:30:25:5, o DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K a una relación molar de 18:56:20:6, o HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:20:35:5, o HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K a una relación molar de 40:20:35:5. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG que comprenden la nanopartícula lipídica, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del o de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células objetivo previstas, las características del ARNm a administrar. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena de alquilo, así como el tamaño, carga, pH, pKa, fusiogenicidad y toxicidad del o de los lípidos seleccionados. Por tanto, las relaciones molares pueden ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, en las realizaciones, el porcentaje de lípido catiónico en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30%, mayor del 40%, mayor del 50%, mayor del 60% o mayor del 70%. El porcentaje de lípido no catiónico en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 5%, mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30% o mayor del 40%. El porcentaje de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30% o mayor del 40%. El porcentaje de lípido modificado con PEG en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 1%, mayor del 2%, mayor del 5%, mayor del 10% o mayor del 20%.
En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas adecuadas de la invención comprenden por lo menos uno de los siguientes lípidos catiónicos: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 o HGT5001. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia liposomal adecuado comprende colesterol y/o un lípido modificado con PEG. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia adecuados comprenden DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia liposomal adecuado comprende una de las siguientes combinaciones de lípidos: C12-200, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5001, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; XTC, DSPC, colesterol, PEG-DMG; MC3, DSPC, colesterol, PEG-DMG; y ALNY-100, DSPC, colesterol, PEG-DSG.
Los vehículos de transferencia liposomal para su uso en las composiciones de la invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Las vesículas multilaminares (MLV) pueden prepararse con técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un recipiente o vaso adecuado, disolviendo el lípido en un solvente apropiado y luego evaporando el solvente para dejar una película delgada en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. Luego, puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de MLV. Las vesículas unilamelares (ULV) pueden formarse luego por homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Además, pueden formarse vesículas unilaminares mediante técnicas de eliminación de detergentes.
En ciertas realizaciones de esta invención, las composiciones de la presente invención comprenden un vehículo de transferencia liposomal en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del vehículo de transferencia liposomal como encapsulado dentro del mismo vehículo de transferencia liposomal. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomales catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.
Los vehículos de administración liposomal adecuados de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse en varios tamaños. La selección de un tamaño apropiado puede tener en cuenta el sitio de la célula o tejido objetivo y, hasta cierto punto, la aplicación para la que se está elaborando el liposoma. En algunas realizaciones, se selecciona un tamaño apropiado de vehículos de administración liposomal para facilitar la distribución sistémica del anticuerpo codificado por el ARNm. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, para dirigirse a los hepatocitos, un vehículo de transferencia liposomal puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean más pequeñas que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; por consiguiente, el vehículo de transferencia liposomal puede penetrar fácilmente tales fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos objetivo. Alternativamente, un vehículo de transferencia liposomal puede estar dimensionado de tal manera que las dimensiones del liposoma sean de un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en determinadas células o tejidos. Por ejemplo, un vehículo de transferencia liposomal puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar de este modo la distribución del vehículo de transferencia liposomal a los hepatocitos.
En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado tiene un tamaño de no más de aproximadamente 150 nm (por ejemplo, de no más de aproximadamente 125 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm). En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 150 a 10 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 125 a 10 nm, 100 a 10 nm, 75 a 10 nm o 50 a 10 nm). En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 150 a 100 nm (por ejemplo, de aproximadamente 125 a 100 nm). En algunas realizaciones, un vehículo de administración liposomal adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 100 a 10 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 90 a 10 nm, 80 a 10 nm, 70 a 10 nm, 60 a 10 nm o 50 a 10 nm).
En la técnica están disponibles una variedad de métodos alternativos conocidos para dimensionar una población de vehículos de transferencia liposomal. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación en baño o sonda produce una reducción progresiva del tamaño hasta una ULV pequeña de menos de aproximadamente 0,05 micras de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de las vesículas liposomales puede determinarse mediante dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-150 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitente pueden alternarse con la evaluación QELS para guiar la síntesis de liposomas eficiente.
Expresión de anticuerpos codificados por ARN in vivo
De acuerdo con la presente invención, los ARNm que codifican los anticuerpos (es decir, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) se administran mediante vehículos de administración liposomal a un sujeto que necesita administración, de tal manera que se expresa in vivo un anticuerpo deseado completamente ensamblado.
Un anticuerpo deseado codificado por los ARNm se expresa sistémicamente en el sujeto. Esto puede lograrse secretando anticuerpos completamente ensamblados de una célula o tejido en el que el anticuerpo se expresa inicialmente en el sistema de circulación del sujeto. Las composiciones de la invención que contienen los ARNm que codifican los anticuerpos y los vehículos liposomales se distribuyen en las células del hígado para facilitar la administración y la posterior expresión del ARNm comprendido en el mismo por las células del hígado (por ejemplo, hepatocitos). Los hepatocitos objetivo pueden funcionar como un "reservorio" o "depósito" biológico capaz de producir y excretar un anticuerpo deseado completamente ensamblado, dando como resultado una distribución sistémica del anticuerpo. Células distintas de los hepatocitos (por ejemplo, células de pulmón, bazo, corazón, ocular, o células del sistema nervioso central) pueden servir como un lugar de depósito para la producción de proteínas. Típicamente, la producción y secreción sostenidas de anticuerpos completamente ensamblados del depósito o de las células de depósito dan como resultado una distribución sistémica eficaz.
En algunas realizaciones, la expresión sistémica de un anticuerpo deseado codificado por ARNm en el suero del paciente (es decir, sangre) es detectable durante más de 1 hora, más de 4 horas, más de 6 horas, más de 12 horas, más de 18 horas, más más de 24 horas, más de 30 horas, más de 36 horas, más de 42 horas, más de 48 horas, más de 54 horas, más de 60 horas, más de 66 horas, más de 72 horas, más de 96 horas, más más de 120 horas, más de 144 horas, más de 168 horas, más de 2 semanas, más de 3 semanas, más de 1 mes o más de 2 meses después de la administración. En algunas realizaciones, la concentración sérica del anticuerpo codificado por ARNm alcanza un nivel máximo de aproximadamente 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, o 96 horas después de la administración. En algunas realizaciones, se observa la circulación sostenida del anticuerpo deseado codificado por ARNm. Por ejemplo, la expresión sistémica del anticuerpo codificado por ARNm en el suero del paciente (es decir, sangre) puede detectarse durante más de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más después de la administración.
Los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo pueden administrarse a células o tejidos objetivo para la expresión intracelular o la distribución local del anticuerpo. Típicamente, la distribución local se produce cuando se produce un anticuerpo completamente ensamblado y se secreta desde una célula objetivo al fluido extracelular circundante sin entrar en el sistema de circulación, como el torrente sanguíneo.
Como se usa en la presente, el término "célula objetivo" o "tejido objetivo" se refiere a una célula o tejido al que se va a dirigir un o unos ARNm que codifican los anticuerpos. Por ejemplo, cuando se desea administrar un ARNm a un hepatocito, el hepatocito representa la célula objetivo. Los ARNm que codifican anticuerpos (por ejemplo, los ARNm que codifican la cadena pesada y la cadena ligera) descritos en la presente pueden administrarse a una variedad de células o tejidos objetivo que incluyen, pero no se limitan a, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales (por ejemplo, meninges, astrocitos, neuronas motoras, células de los ganglios de la raíz dorsal y neuronas motoras del asta anterior), células fotorreceptoras (por ejemplo, bastones y conos), células epiteliales pigmentadas de la retina, células secretoras, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
La administración de los ARNm a las células y tejidos objetivo puede lograrse mediante medios dirigidos tanto pasivos como activos. El fenómeno del direccionamiento pasivo explota los patrones de distribución naturales de un vehículo de transferencia in vivo sin depender del uso de excipientes o medios adicionales para mejorar el reconocimiento del vehículo de transferencia por las células objetivo. Por ejemplo, es probable que los vehículos de transferencia que están sujetos a fagocitosis por las células del sistema retículo-endotelial se acumulen en el hígado o el bazo y, en consecuencia, pueden proporcionar medios para dirigir pasivamente la administración de las composiciones a tales células objetivo.
Alternativamente, la administración de ARNm a las células y tejidos objetivo puede lograrse mediante direccionamiento activo, que implica el uso de excipientes adicionales, a los que se hace referencia en la presente como "ligandos de direccionamiento" que pueden unirse (covalente o no covalentemente) al vehículo de transferencia para fomentar la localización de dicho vehículo de transferencia en ciertas células objetivo o tejidos objetivo. Por ejemplo, el direccionamiento puede estar mediado por la inclusión de uno o más ligandos de direccionamiento endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre el vehículo de transferencia para fomentar la distribución a las células o tejidos objetivo. El reconocimiento del ligando de direccionamiento por los tejidos objetivo facilita activamente la distribución tisular y la captación celular del vehículo de transferencia y/o su contenido en las células y tejidos objetivo (por ejemplo, la inclusión de un ligando de direccionamiento de apolipoproteína-E en o sobre el vehículo de transferencia fomenta el reconocimiento y la unión del vehículo de transferencia a receptores de lipoproteínas de baja densidad endógenos expresados por hepatocitos). Como se proporciona en la presente, la composición puede comprender un ligando capaz de mejorar la afinidad de la composición por la célula objetivo. Los ligandos de direccionamiento pueden enlazarse a la bicapa externa de la partícula lipídica durante la formulación o post-formulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas formulaciones de partículas lipídicas pueden emplear polímeros fusogénicos como PEAA, hemaglutinina y otros lipopéptidos (ver las Solicitudes de Patente de Estados Unidos N° de serie 08/835.281, y 60/083.294) y otras características útiles para la administración in vivo y/o intracelular. Se contemplan composiciones que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) que son capaces de mejorar la afinidad de las composiciones y su contenido de ácidos nucleicos por las células o tejidos objetivo. Los ligandos adecuados pueden opcionalmente unirse o enlazarse a la superficie del vehículo de transferencia. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento puede abarcar la superficie de un vehículo de transferencia o estar encapsulado dentro del vehículo de transferencia. Los ligandos adecuados se seleccionan basándose en sus propiedades físicas, químicas o biológicas (por ejemplo, afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características de superficie de la célula objetivo). Los sitios objetivo específicos de la célula y su ligando de direccionamiento correspondiente pueden variar ampliamente. Los ligandos de direccionamiento adecuados se seleccionan de tal manera que se aprovechen las características únicas de una célula objetivo, permitiendo así que la composición discrimine entre células objetivo y no objetivo. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir marcadores de superficie (por ejemplo, apolipoproteína-B o apolipoproteína-E) que mejoran selectivamente el reconocimiento o la afinidad por los hepatocitos (por ejemplo, mediante el reconocimiento mediado por receptor y la unión a dichos marcadores de superficie). Además, se esperaría que el uso de galactosa como ligando de direccionamiento dirigiera las composiciones a los hepatocitos parenquimatosos o, alternativamente, se esperaría que el uso de residuos de azúcar que contienen manosa como ligando de direccionamiento dirigiera las composiciones a las células endoteliales del hígado (por ejemplo, residuos de azúcar que contienen manosa que pueden unirse preferentemente al receptor de asialoglicoproteína o al receptor de manosa presente en los hepatocitos). (Ver Hillery AM et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc). La presentación de tales ligandos de direccionamiento que se han conjugado con fracciones presentes en el vehículo de transferencia (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) puede facilitar el reconocimiento y captación de las composiciones en células y tejidos objetivo. Los ejemplos de ligandos de direccionamiento adecuados incluyen uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo pero no limitado a, humanos, primates no humanos, roedores y similares, a los que se administran los ARNm y las composiciones de la presente invención. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en la presente en referencia a un sujeto humano.
Composición y administración farmacéutica
Para facilitar la expresión de anticuerpos in vivo, pueden formularse ARNm que codifican anticuerpos (por ejemplo, ARNm que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras) y vehículos de administración en combinación con uno o más ácidos nucleicos, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizadores adicionales, o en composiciones farmacológicas donde se mezclan con excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.
Los ARNm que codifican los anticuerpos y las composiciones que contienen los mismos pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta el estado clínico del sujeto, el lugar y el método de administración, el programa de administración, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los practicantes clínicos con experiencia ordinaria en la técnica. La "cantidad eficaz" para los propósitos de la presente puede determinarse mediante consideraciones relevantes conocidas por los expertos en la investigación clínica experimental, las técnicas farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para lograr por lo menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionan como medidas apropiadas del progreso, regresión o mejora de la enfermedad por parte de los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan por lo menos una producción transitoria de anticuerpos.
En una realización, las composiciones se formulan de tal manera que sean adecuadas para la liberación prolongada del ARNm contenido en ellas. Tales composiciones de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o en días alternos. En una realización preferida, las composiciones se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y vehículos liposomales que se formulan para administración de depósito para administrar o liberar un ARNm durante períodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones realizadas en el ARNm para mejorar la estabilidad.
También se contemplan en la presente composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden una o más de las nanopartículas liposomales divulgadas en la presente y métodos relacionados para el uso de tales composiciones liofilizadas como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/494.882, presentada el 8 de junio de 2011. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas de acuerdo con la invención pueden reconstituirse antes de la administración o pueden reconstituirse in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada puede formularse en una forma de dosificación apropiada (por ejemplo, una forma de dosificación intradérmica como un disco, varilla o membrana) y administrarse de tal manera que la forma de dosificación sea rehidratada con el tiempo in vivo por los fluidos corporales del individuo.
Expresión de anticuerpos codificados por ARN in vitro
Pueden usarse ARNm que codifican anticuerpos (por ejemplo, ARNm que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras) para producir anticuerpos in vitro. Por ejemplo, las células pueden transfectarse mediante ARNm que codifican anticuerpos (por ejemplo, ARNm que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras) y pueden cultivarse en condiciones de cultivo celular que permitan la producción del anticuerpo por las células. Alternativamente, el anticuerpo se expresa intracelularmente. Alternativamente, el anticuerpo es secretado por las células de tal manera que el anticuerpo pueda recogerse del sobrenadante.
Pueden usarse células de mamífero. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC N°: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59, 1977); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT1080); células de riñón de cría de hámster (BHK21, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC Cr L-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, a Tc C CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982); células MRC 5; Células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Pueden usarse medios y condiciones de cultivo celular estándar para cultivar células transfectadas y producir los anticuerpos deseados codificados por los ARNm.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Producción de ARNm
El ligando 2 de anti-quimiocina de cadena pesada (motivo C-C) (HC-aCCL2, SEQ ID NO: 1) y el anti-CCL2 de cadena ligera (LC-aCCL2, SEQ ID NO: 2) se sintetizaron mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, lo que fue seguido por la adición de una estructura de caperuza 5' (Capí) de acuerdo con métodos conocidos (ver Fechter, P.; Brownlee, G.G. " Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola poli (A) 3' de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud determinada por electroforesis en gel. Las secuencias de HC-aCCL2 y LC-aCCL2 fueron las que se muestran a continuación, y las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen a continuación:
ARNm de cadena pesada anti-CCL2 (HC-aCCL2):
XiAUGGAAUUCGGCCUGAGCUGGCUGUUCCUGGUGGCCAUCCUGAAGGGCGUGCA GUGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGGCGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCC GUGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGCGGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCU GGGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCUGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAU CUUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAAAUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCC GACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUGGAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACA CCGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACGACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUG GGGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUCCUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUG UACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCCAGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCU GCCUGGUCAAGGGCUACUUCCCCGAGCCCGUGACCGUGACCUGGAACUCCGGCUC
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ARNm de cadena ligera anti-CCL2 (LC-aCCL2):
Xi AUGGAAACCCCU GCCC AGCU GCUGUUCCUGCU GCUGCU GU GGCUGCCUGAUAC CACCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUCCCCCGCCACCCUGUCUCUGAGCCCUGGC GAGAGAGCCACCCUGAGCUGCAGAGCCUCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGG CCUGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUC CUCUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAGAUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGAC UUCACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAACCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCC ACCAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCACCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAU CAAGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUCCAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUG ACCUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGCUUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACA UCAACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCUCCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUC CUGGACCGACCAGGACUCCAAGGACAGCACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACC CUGACCAAGGACGAGUACGAGCGGCACAACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACA AGACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGUCCUUCAACCGGAACGAGUGCUGAYi
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Ejemplo 2. Materiales y condiciones de transfección de ARNm in vitro
A. Materiales lipídicos ejemplares
Las formulaciones de lípidos usadas para la transfección en los ejemplos de la presente consistían de uno o más lípidos o una mezcla de lípidos multicomponente de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, lípidos auxiliares y lípidos PEGilados diseñados para encapsular varios materiales basados en ácidos nucleicos. Los lípidos catiónicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (ver Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "La saturación de lípidos catiónicos influye en la liberación intracelular de ácidos nucleicos encapsulados" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276 -287), DLin-KC2-DMA (ver Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869), HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol, a base de guanidinio, etc. Los lípidos auxiliares pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados pueden incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena o cadenas de alquilo de C6-C20 de longitud.
B. Formulaciones experimentales
En estos experimentos, se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de HC-aCCL2 y ARNm de LC-aCCL2 (1:1 peso:peso) mediante la adición de 500 microgramos de cada constructo a partir de un 1 mg/ml de existencias. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1,35 mg/ml de ARNm de aCCL2 (encapsulado). Zave = 89,2 nm (Dv(50) = 64,0 nm; Dv(90) = 115 nm).
Ejemplo 3. Detección de anticuerpos después de una transfección de ARNm in vitro
A. Vía ELISA
En este ejemplo, se recubrieron placas F96 MaxiSorp Nunc-Immuno con 100 |jl de 1 jg/ml de IgG1 de cabra anti ratón (Invitrogen A10538) en tampón de carbonato de sodio, pH 9,6 y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (IxPBS, Tween 20 al 0,05%), los pocillos se bloquearon con 320 j l de tampón de bloqueo (IxPBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 2%) durante 1 hora a 37° C. Se prepararon diluciones en serie de estándares de IgG monoclonales en tampón de bloqueo en el intervalo de 250-0 ng/ml. Se prepararon diluciones en serie de las muestras en tampón de bloqueo para que estuvieran en el intervalo de la curva estándar (1:100 a 1:10.000). Tanto las muestras como los estándares se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se usó anticuerpo secundario conjugado con IgG Fc HRP anti ratón de cabra (Pierce 31439) a una dilución de 1:40.000 y se incubó a 37° C durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se preparó el reactivo de sustrato TMB EIA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 15 min de incubación a 37° C, la reacción se detuvo añadiendo H2SO42N y la placa leyó a 450 nm.
B. Vía transferencia Western
En este ejemplo, el medio acondicionado de células 293T transfectadas o células HCL2 electroporadas se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno usando un aparato de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de la incubación con leche desnatada en polvo al 5% en TBST (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,5%) durante 1 hora, la membrana se lavó tres veces con PBST y se incubó con IgG1 de cabra anti ratón (Invitrogen A10538) para 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces en PBST y se incubaron con una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario anti ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Promega W4021) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron en PBST tres veces más y se desarrollaron con el sistema ECL (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 4. Análisis in vitro del anticuerpo aCCL2 producido a partir de la transfección de HC-aCCL2 y LC-aCCL2 Tanto el ARNm de HC-aCCL2 como el de LC-aCCL2 se produjeron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Posteriormente, de acuerdo con el Ejemplo 2A y B, el ARNm de HC-aCCL2 y LC-aCCL2 se transfectó en células HCL1 (es decir, línea celular humana 1) o células HCL2 en varias raciones (peso: peso) de acuerdo con métodos conocidos.
Los resultados de estos estudios en células HCL1 y células HCL2 se demuestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Varias mezclas de constructos de ARNm de cadena pesada y cadena ligera de a-CCL2 (quimiocina (motivo C-C) 2) se mezclaron (peso: peso) y se transfectaron en células HCL1 (Figura 1) o células HCL2 (Figura 2). Los sobrenadantes celulares se recogieron en puntos temporales seleccionados después de la transfección y se analizaron para determinar la presencia de IgG anti ratón usando métodos basados en ELISA como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3A.
Como se muestra en las Figuras 1 y 2, la variación de la proporción de cadena pesada a cadena ligera (peso: peso) produjo una diferencia significativa en la producción de proteínas determinada mediante ELISA. Mientras que una mezcla 1:1 (peso: peso) de ARNm de a-CCL2 de cadena pesada: cadena ligera proporcionó una señal fuerte en las células HCL2, una proporción 4:1 (peso: peso) proporcionó una mayor producción de proteínas en las células HCL1. Aunque hubo diferencias entre las diferentes proporciones, se observó una fuerte producción de proteínas para todas las proporciones probadas. Además, en ambos casos, 48 horas después de la transfección (Día 2 o D2) dio la señal más fuerte de la proteína deseada en este ejemplo.
Para confirmar adicionalmente la presencia del anticuerpo derivado de ARNm exógeno, se emplearon técnicas de inmunotransferencia (Western) para una caracterización adicional (ver Figura 3) de muestras derivadas de HCL1. Los fragmentos de cadena pesada y cadena ligera se detectaron con éxito en el sobrenadante de células HCL1 transfectadas con ARNm usando métodos de transferencia Western como se describe en el ejemplo 3B. Las muestras se analizaron 24 y 48 horas después de la transfección de varias mezclas de constructos de ARNm de cadena pesada y cadena ligera de a-CCL2 (peso: peso). Las intensidades de banda observadas reflejaban las proporciones de ARNm empleadas en cada ejemplo.
Ejemplo 5. Análisis in vivo del anticuerpo aCCL2 producido a partir de nanopartículas cargadas de ARNm administradas por vía intravenosa
En este ejemplo, la producción de anticuerpos completamente procesados se logró in vivo mediante la administración de ARN mensajero exógeno, específicamente, se encapsularon constructos de ARNm de cadena pesada y cadena ligera de a-CCL2 (ARNm de HC-aCCL2:LC-aCCL2, 1:1 (peso: peso)) en nanopartículas de lípidos catiónicos como se describe en el Ejemplo 2A y se administraron a ratones como una inyección intravenosa de un solo bolo.
Brevemente, se utilizaron ratones CD-1 macho de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Se introdujeron muestras de ARNm de HC-aCCL2 y ARNm de LC-aCCL2 encapsulado (1:1 peso: peso) mediante una única inyección de bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente de 30 microgramos. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos temporales designados.
Se recogieron el hígado y el bazo de cada ratón, se repartieron en tres partes y se almacenaron en formalina tamponada neutra al 10% o se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80° C para su análisis.
Todos los animales se sacrificaron mediante asfixia con CO2 en puntos temporales determinados después de la administración de la dosis, seguido de toracotomía y extracción de sangre cardíaca terminal. Se recogió sangre completa (volumen máximo obtenible) mediante punción cardíaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos, se centrifugó a 22° C ± 5° C a 9300 g durante 10 minutos, y se extrajo el suero. Para las extracciones de sangre provisionales, se recogieron aproximadamente 40-50 pl de sangre completa mediante punción en la vena facial o corte de cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se utilizaron como niveles de referencia para la comparación con los animales de estudio.
Para el análisis ELISA de la producción de anticuerpos aCCL2, se recubrieron placas F96 MaxiSorp Nunc-Immuno con 100 ml de 1 mg/ml de anticuerpo monoclonal purificado de conejo recombinante MCP-1 en tampón carbonato, pH 9,6 y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (1xPBS, Tween 20 al 0,05%), los pocillos se bloquearon con 320 ml de tampón de bloqueo (1xPBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 2%) durante 1 hora a 37°C. Se añadieron aproximadamente 100 ng/ml de proteína recombinante humana o de ratón MCP-1 a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se añadieron diluciones en serie de las muestras (1:5 a 1:200) y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se usó anticuerpo secundario conjugado con IgG Fc HRP anti ratón de cabra a una dilución de 1:40.000 y se incubó a 37° C durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se preparó el reactivo de sustrato TMB EIA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 15 min de incubación a 37° C, la reacción se detuvo añadiendo H2SO42N y la placa leyó a 450 nm.
Los niveles séricos de los ratones tratados se monitorizaron en puntos de temporales seleccionados después de la administración (6 h, 24 h, 48 h, 72 h). Los niveles de anticuerpo CCL2 a-humano completamente formado presente en suero de ratón se cuantificaron usando métodos basados en ELISA (ver Figura 4). Se puede observar un aumento significativo en el anticuerpo derivado de ARNm de a-CCL2 exógeno deseado en el plazo de seis horas después de la administración con un pico después de 24 horas.
Ejemplo 6. Producción de anticuerpos a-VEGF in vivo
En este ejemplo, la producción de anticuerpo a-VEGF completamente procesado se logró in vivo mediante la administración de ARN mensajero exógeno.
Las secuencias para HC-aVEGF y LC-aVEGF son las que se muestran a continuación, y las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen a continuación:
ARNm de cadena pesada anti-VEGF (HC-aVEGF):
XiAUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUC CCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCGGAGGUUCAGC UGGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCCAGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUG CGCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAACUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCG CCGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGCUGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCU ACCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGUUCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGU CAACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCUGCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUA CUGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGCUCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGUGG GGUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCGUCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGU UUCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGACGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUG CUU GGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCCGGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCG CUCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCUGCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACU CGCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGAGCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAU UUGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAACACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCG AAGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGCCCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGG
GGGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGCCAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUC ACGGACGCCAGAAGUGACCUGUGUGGUCGUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCCGGA AGUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGGGGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACCAA ACCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACCUACCGGGUGGUGUCCGUGCUGACUGUG CUGCACCAGGACUGGCUGAAUGGAAAGGAGUACAAAUGCAAGGUCAGCAACAAG GCCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGAUCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAG AGCCUCAAGUGUACACUCUGCCGCCGUCAAGAGAAGAAAUGACUAAGAACCAAGU UUCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUUCUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGG GAGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAACUAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACU C GGAU GGUU CCUUCUU CCUUU AC AGC A AGCUG ACC GU GG AU A A AU C GC GGU GGC A GCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAGUCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUAC ACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCCAGGAAAAUAA Yi
ARNm de cadena ligera anti-VEGF (LC-aVEGF):
Xi AU GGCC ACUGGAUC A AGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACU GCUUU GCCU GCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCCGACAUUCAA AUGACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAGCAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCA CUUGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAAUUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCC UGGAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUACUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUC CCGUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCAGGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCU CGCUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUUACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCC UUGGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGUUGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCC UCCGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGACGAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUG UCGUGUGCCUCCUGAACAACUUCUACCCGCGGGAAGCCAAGGUGCAGUGGAAAGU GGAUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUUCGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCG AAGGACUCAACCUACUCCCUCAGCUCAACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACG AGAAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAAGUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGU GACU A A AU CCUU C A AU AGGGGGG A AU GUU A A Yi
Secuencias UTR 5 'y 3':
X i (secuencia UTR 5') =
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAGAGU G ACU C ACCGUCCUU GAC ACG
Yi (secuencia UTR 36’) =
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Los constructos de ARNm de cadena pesada y cadena ligera de a-VEGF (ARNm de HC-a-VEGF: LC-a-VEGF, 1:1 (peso: peso)) se encapsularon en nanopartículas lipídicas catiónicas como se describe a continuación:
En estos experimentos, se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de HC-acVEGF y ARNm de LC-aVEGF (1:1 peso: peso) mediante la adición de 500 microgramos de cada constructo a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución de ARNm acuosa y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C. Concentración final = 0,20 mg/ml de ARNm de aVEGF (encapsulado). Zave = 81,0 nm (PDI = 0,16).
Se administraron nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de HC-a-VEGF y LC-a-VEGF a ratones de tipo salvaje mediante una única inyección intravenosa en la vena de la cola o inyección subcutánea a una dosificación de 1,0 mg/kg y se monitorizó la producción de anticuerpo anti-VEGF a lo largo del tiempo en suero mediante ELISA.
Brevemente, se usaron ratones CD-1 macho de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Se introdujeron muestras de ARNm de HC-a-VEGF y ARNm de LC-a-VEGF encapsulado (1:1 peso: peso) mediante una única inyección de bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente de 1,0 mg/kg (-30 microgramos). Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos temporales designados (0,50 horas, 3 horas, seis horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas después de la administración.
Todos los animales se sacrificaron mediante asfixia con CO2 en puntos temporales determinados después de la administración de la dosis seguido de toracotomía y extracción de sangre cardíaca terminal. Se recogió sangre completa (volumen máximo obtenible) mediante punción cardíaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos, se centrifugó a 22° C ± 5° C a 9300 g durante 10 minutos, y se extrajo el suero. Para las extracciones de sangre provisionales, se recogieron aproximadamente 40-50 pl de sangre completa mediante punción en la vena facial o corte de cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se usaron como niveles de referencia para la comparación con los animales del estudio.
Para el análisis ELISA de la producción de anticuerpos a-VEGF, la placa F96 MaxiSorp Nunc-Immuno se recubrió con 100 microlitros de 0,50 microgramos/ml/pocillo de proteína VEGF humana recombinante (Invitrogen N° PHC9391) en tampón de recubrimiento (NaHCO350 mM, pH 9,6). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, los pocillos se bloquearon usando un tampón de bloqueo (1X DPBS, BSA al 2%, Tween-20 al 0,05%) durante una hora a 37° C. Tras un lavado adicional como se ha descrito anteriormente, se añadió suero de ratón recogido de ratones inyectados a cada pocillo y se usó anticuerpo secundario conjugado de IgG Fc HRP antihumano de conejo (Pierce N° PA-28587) a una dilución de 1:10.000 y se incubó a 37° C durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado, se preparó el reactivo de sustrato TMB EIA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 10 min de incubación a 37° C, la reacción se detuvo añadiendo H2SO42 N y la placa se leyó a 450 nm. Los niveles séricos de los ratones tratados se monitorizaron en puntos temporales seleccionados después de la administración (por ejemplo, 0,5 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 8 días y 15 días). La Figura 5 representa resultados ejemplares que ilustran el anticuerpo a-VEGF detectado en suero de ratones de tipo salvaje después de una dosis única de nanopartículas cargadas con ARNm de HC-a-VEGF y ARNm de LC-a-VEGF. Puede observarse un aumento significativo en el anticuerpo derivado de ARNm de a-VEGF exógeno deseado en el plazo de seis horas después de la administración con un pico después de 24 horas y continuado hasta 2 semanas después de una dosis única de ARNm de a-VEGF. La Figura 6 representa los mismos resultados ejemplares que la Figura 5, pero representado por número de ratón específico. La Figura 7 muestra una comparación de los niveles de anticuerpo a-VEGF presentes en el suero de ratones inyectados por vía intravenosa o subcutánea después de 24 horas.
Este ejemplo proporciona una confirmación adicional de que la terapia basada en ARNm puede usarse para Ċ
la producción eficaz de anticuerpos in vivo.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un primer ARNm que codifica la cadena pesada de un anticuerpo y un segundo ARNm que codifica la cadena ligera del anticuerpo a una relación molar que varía de 2:1 a 1:2 para su uso en terapia en un paciente, en donde el primer ARNm y el segundo ARNm (i) comprenden cada uno una estructura de caperuza 5', una cola poli-A 3', una región no traducida 5' y una región no traducida 3' y (ii) están encapsulados dentro de liposomas que comprenden un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido a base de colesterol y un lípido modificado con PEG y que tienen un tamaño no mayor de 150 nm, en donde el primer ARNm que codifica la cadena pesada y el segundo ARNm que codifica la cadena ligera están encapsulados en el mismo liposoma, en donde el anticuerpo es un tetrámero y cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena ligera de aproximadamente 25 kD y una cadena pesada de aproximadamente 50-70 kD, y en donde la composición se administra por vía intravenosa al paciente y el anticuerpo se distribuye sistémicamente en el paciente.
2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer ARNm y el segundo ARNm están en una relación molar de 1:1.
3. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los liposomas tienen un tamaño de no más de aproximadamente 100 nm o 75 nm.
4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los liposomas tienen un tamaño que varía de 10 nm a 100 nm.
5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los ARNm (i) se modifican para mejorar la estabilidad, en donde los ARNm se modifican para incluir análogos de nucleósidos, bases modificadas química o biológicamente, bases intercaladas, grupos fosfato modificados y/o azúcares modificados, o (ii) no se modifican químicamente.
6. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los ARNm se sintetizan a partir de (i) nucleótidos de origen natural adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (D), o análogos de nucleótidos modificados seleccionados del grupo que consiste de 1-metiladenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N-6-metil-adenina, N-6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetilcitosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7 -metilguanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, p-D-manosil-queosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.
7. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es una IgG.
8. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anti-CCL2, anti-lisil oxidasa-tipo-2 (LOXL2), anti-Flt-1, anti-TNF-a, anti­ receptor de interleucina-2Ra (CD25), anti-TGFp, anti-factor de activación de células B, anti-integrina alfa-4, anti-BAGE, anti-p-catenina/m, anti-Bcr-abl, anti-C5, anti-CA125, anti-CAMEL, anti-CAP-1, anti-CASP-8, anti-CD4, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD25, anti-CDC27/m, anti-CD 30, anti-CD33, anti-CD52, anti-CD56, anti-CD80, anti-CDK4/m, anti-CEA, anti-CT, anti-CTL4, anti-Cyp-B, anti-DAM, anti-EGFR, anti-ErbB3, anti-ELF2M, anti-EMMPRIN, anti-EpCam, anti-ETV6-AML1, anti-HER2, anti-G250, anti-GAGE, anti-GnT-V, anti-Gp100, anti-HAGE, anti-HER-2/neu, anti-HLA-A*0201-R170I, anti-IGF-lR, anti-IL-2R, anti-IL-5, anti-MC1R, anti-miosina/m, anti-MUC1,anti-MUM-1, -2, -3, anti-proteinasa-3, anti-p190 menor bcr-abl, anti-Pml/RARa, anti-PRAMS, anti-PSA, anti-PSM, anti-PSMA, anti-RAGE, anti-RANKL, anti-RUl o RU2, anti-SAGE, anti-SART-1 o anti-SART-3, anti-survivina, anti-TEL/AML1, anti-TPI/m, anti-TRP-1, receptor anti-TRP-2, anti-TRP-2/INT2, anti-VEGF y anti-receptor de VEGF.
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