ES2952779T3 - ARN mensajero modificado que comprende elementos de ARN funcionales - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona ARN mensajeros (ARNm) que tienen modificaciones químicas y/o estructurales, incluidos elementos de ARN y/o nucleótidos modificados, que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada al ARNm. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
ARN mensajero modificado que comprende elementos de ARN funcionales
Antecedentes
El ARN mensajero (ARNm) diseñado para codificar y expresar transitoriamente un producto proteico o peptídico farmacológicamente activo es la quintaesencia de una nueva clase de agentes terapéuticos basados en ARNm. La administración de un ARNm sintético y/o generado in vitro que se parece estructuralmente al ARNm natural puede dar como resultado la producción controlada de proteínas o péptidos terapéuticos a través de la maquinaria de traducción endógena y constitutivamente activa (p. ej., ribosomas) que existe dentro de las propias células del paciente. En los últimos años, el desarrollo y uso de ARNm como agente terapéutico ha demostrado potencial para el tratamiento de numerosas enfermedades y para el desarrollo de enfoques novedosos en medicina regenerativa y vacunación (Sahin et al., (2014) Nat Rev Drug Discov 13 (10):759-780). Se reconoce que el control y la regulación de la traducción del ARNm es un componente de desarrollo importante con el fin de que esta clase de fármacos establezca el efecto terapéutico deseado. Dentro del campo de los agentes terapéuticos de ARNm, existe la necesidad de desarrollar ARNm con un efecto terapéutico mejorado.
Brabendure et al., RNA, vol. 12, n.° 5, se refiere al control de la traducción en mamíferos por la estructura del ARNm cerca de las caperuzas.
Compendio
La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona un ARN mensajero (ARNm) que comprende
(i) una región 5' no traducida (UTR) que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR,
en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende nucleobases guanina (G) y citosina (C) y, opcionalmente, nucleobases adenina (A) y uracilo (U), o derivados o análogos de las mismas, en donde el elemento de ARN rico en GC tiene al menos 50% o más de nucleobases citosina (C) y tiene al menos 6 nucleótidos de longitud,
en donde el elemento de ARN rico en GC está ubicado aproximadamente 5-10 nucleótidos, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak, o secuencia arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de consenso de Kozak, y en donde la actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(f).
Otros aspectos de la invención también se definen en las reivindicaciones.
La presente descripción proporciona ARN mensajeros (ARNm), incluidos ARNm modificados (ARNmm) que tienen modificaciones químicas y/o estructurales, incluidos elementos de ARN y/o nucleótidos modificados, como se define en las reivindicaciones, que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada al ARNm. En un aspecto, los ARNm de la descripción comprenden modificaciones que reducen el escaneo con fugas de las 5' UTR por la maquinaria de traducción celular. El barrido con fugas puede dar como resultado la omisión del codón de iniciación deseado que inicia el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de interés o un producto de traducción. Esta omisión puede dar como resultado además el inicio de la síntesis del polipéptido a partir de un codón de inicio alterno o alternativo y, por lo tanto, promover la traducción de marcos de lectura abiertos parciales, aberrantes o de otro modo indeseables dentro del ARNm. El impacto negativo causado por el fallo para iniciar la traducción de la proteína o péptido terapéutico en el codón iniciador deseado, como consecuencia del escaneo con fugas u otros mecanismos, plantea un desafío en el desarrollo agentes terapéuticos de ARNm.
En consecuencia, la presente descripción proporciona ARNm, incluidos los ARNmm que tienen modificaciones químicas y/o estructurales novedosas, como se define en las reivindicaciones, que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada, incluida la promoción de la traducción de solo un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido o producto de traducción deseado. En algunos aspectos, la actividad reguladora de la traducción deseada reduce, inhibe o elimina el fallo en el inicio de la traducción de la proteína o el péptido terapéutico en el codón iniciador deseado, como consecuencia del escaneo con fugas u otros mecanismos. Por lo tanto, la presente descripción proporciona ARNm que tienen modificaciones químicas y/o estructurales (p. ej., ARNmm) que son útiles para modular (p. ej., controlar) la traducción de un ARNmm para producir un producto de traducción deseado.
En consecuencia, en un aspecto, la descripción proporciona ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprenden una región no traducida (UTR) 5', un codón de iniciación, un marco de lectura abierto completo que codifica un polipéptido, una 3' UTR, y al menos una modificación, en donde la al menos una modificación proporciona una actividad reguladora de la traducción. La actividad reguladora de la traducción se define en las reivindicaciones.
La al menos una modificación es una modificación estructural en donde la modificación estructural es un elemento de ARN en donde la modificación estructural es un elemento de ARN rico en GC como se define en las reivindicaciones.
La 5' UTR de un ARNm comprende al menos una modificación como se describe en el presente documento.
La descripción proporciona un ARNm que comprende al menos una modificación, en donde la al menos una modificación es un elemento rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, ubicados secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR, como se define en las reivindicaciones. En una realización, el elemento rico en GC está ubicado aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido(s) secuencia arriba de una secuencia consenso de Kozak en la 5' UTR. En otra realización, el elemento rico en GC está ubicado aproximadamente 5-10 nucleótidos secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR. En otra realización, el elemento rico en GC está ubicado secuencia arriba e inmediatamente adyacente a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR. El elemento rico en GC se define en las reivindicaciones. En una realización preferida, el elemento rico en GC comprende la secuencia V1 como se expone en la Tabla 1.
En otro aspecto, la descripción proporciona un ARNm que comprende al menos una modificación, en donde la al menos una modificación es un elemento rico en GC como se define en las reivindicaciones que comprende una estructura secundaria de ARN estable situada secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR, como se define en las reivindicaciones. En una realización, el elemento de ARN rico en GC que comprende una estructura secundaria de ARN estable se encuentra aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 3 o aproximadamente 1 nucleótido(s) secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR. En otra realización, el elemento de ARN rico en GC que comprende una estructura secundaria de ARN estable se encuentra aproximadamente 5­ 10 nucleótidos secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR. En realización, el elemento de ARN rico en GC que comprende una estructura secundaria de ARN estable se encuentra secuencia arriba e inmediatamente adyacente a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR.
En otro aspecto, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos uno o más nucleótidos modificados, en donde la secuencia que comprende el codón de iniciación comprende uno o más nucleótidos modificados que aumentan la afinidad de unión con el iniciador Met-tARNiMet. En una realización, el uno o más nucleótidos modificados comprenden 2-tiouridina, 2'-O-metil-2-tiouridina, 2-selenouridina, 2'-O-metil-ribosa, un nucleótido modificado en el que el resto de ribosa está modificado con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4', inosina, 2-metilguanosina, 6-metil-adenosina, un desoxirribonucleótido.
En otro aspecto, la descripción proporciona un ARNm, incluidos los ARNmm, como se define en las reivindicaciones, en donde el ARNm comprende un primer polinucleótido, en donde el primer polinucleótido se sintetiza químicamente y en donde el primer polinucleótido comprende una 5' UTR, un codón de iniciación y al menos una modificación, y un segundo polinucleótido, en donde el segundo polinucleótido se sintetiza mediante transcripción in vitro, y en donde el segundo polinucleótido comprende un marco de lectura abierto completo que codifica un polipéptido, y una 3' UTR. En una realización, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están entrecruzados químicamente. En otra realización, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están ligados enzimáticamente. En una realización, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están unidos operativamente.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende 50% de nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >50% nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >60% nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >70% nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 50%-55% citosina, aproximadamente 55%-60% citosina, aproximadamente 60%-65% citosina, aproximadamente 65%-70% citosina, aproximadamente 70%-75% citosina, aproximadamente 75%-80% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 50%-55% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 55%-60% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 60%-65% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 65%-70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 70%-75% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 75%-80% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >80% nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es 90% nucleobases citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es 100% nucleobases citosina (C).
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-10 nucleótidos de longitud, aproximadamente 10-15 nucleótidos de longitud, aproximadamente 15-20 nucleótidos de longitud, aproximadamente 20-25 nucleótidos de longitud, aproximadamente 25-30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 6 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 7 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 8 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 9 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 11 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 12 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 13 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 14 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 16 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 17 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 18 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 19 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 20 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 22 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 23 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 24 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 26 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 27 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 28 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 29 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 30 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende adenina (A) o uracilo (U) o tanto A como U (o T). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende adenina (A). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende uracilo (U).
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 6 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 6 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 7 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 7 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 8 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 8 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 9 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 9 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 10 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 10 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina.
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 11 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 12 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 13 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 14 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 15 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 16 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 18 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 19 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% de citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 21 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 22 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 23 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 24 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 25 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 26 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 27 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 28 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 29 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 30 nucleótidos de longitud, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la secuencia es >50% citosina.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-30 nucleótidos de guanina (G) y citosina (C), o derivados o análogos de los mismos, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina, y en donde el elemento de ARN rico en GC comprende un motivo de secuencia que se repite. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, en donde n = 2 a 10, 2 a 5, 4, 3 o 2. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, en donde n = 2 a 10. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, donde n = 2 a 5. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, donde n = 4. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, donde n = 3. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [CCG]n, donde n = 2. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 2 a 10, 2 a 5, 4, 3 o 2. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 2 a 10. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 2 a 5. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 4. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 3. En algunas realizaciones, el motivo de secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 2.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR, en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos 5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3' expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde la 5' UTR comprende un elemento de ARN rico en GC de la descripción que se encuentra aproximadamente 20-30 nucleótidos, aproximadamente 10-20 nucleótidos o aproximadamente 6-10 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia 5' UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC se encuentra aproximadamente 6 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia 5' UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33.
La estructura secundaria de ARN estable puede ser una horquilla o en tallo-bucle.
La estructura secundaria de ARN estable puede tener un deltaG de aproximadamente -30 kcal/mol, aproximadamente de -20 a -30 kcal/mol, aproximadamente -20 kcal/mol, aproximadamente de -10 a -20 kcal/mol, aproximadamente -10 kcal/mol, aproximadamente de -5 a -10 kcal/mol.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el codón de iniciación comprende al menos un nucleótido modificado, y en donde el al menos un nucleótido modificado aumenta la afinidad de unión con el iniciador Met-tARNiMet. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2 ­ tiouridina, 2'-O-metil-2-tiouridina, 2-selenouridina, 2'-O-metil-ribosa, un nucleótido modificado en el que el resto de ribosa está modificado con un puente extra que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4', inosina, 2-metilguanosina, 6-metil-adenosina, un desoxirribonucleótido.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende:
(i) un primer polinucleótido, en donde el primer polinucleótido se sintetiza químicamente, en donde el primer polinucleótido comprende una 5' UTR;
(ii) un segundo polinucleótido, en donde el segundo polinucleótido se sintetiza mediante transcripción in vitro, y en donde el segundo polinucleótido comprende un marco de lectura abierto completo que codifica un polipéptido y una 3' UTR. En algunas realizaciones, (i) y (ii) están entrecruzados químicamente o ligados enzimáticamente. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están unidos operativamente.
En una cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el elemento de ARN proporciona una actividad reguladora de la traducción que aumenta o mejora la potencia del ARNm en relación con un ARNm sin el elemento de ARN.
En una cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el ARNm puede comprender una cola poli A (p. ej., una cola poli A de aproximadamente 100 nucleótidos). En una cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el ARNm comprende una estructura de caperuza 15'.
En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el ARNm puede comprender al menos una modificación química. En algunas realizaciones, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desazapseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metiluridina. En algunas realizaciones, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina o un análogo de pseudouridina. En algunas realizaciones, la modificación química es una N1-metilpseudouridina. En algunas realizaciones, el ARNm está completamente modificado con N1-metilpseudouridina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición que comprende uno cualquiera de los ARNm mencionados anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una nanopartícula lipídica que comprende uno cualquiera de los ARNm mencionados anteriormente, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una nanopartícula lipídica que comprende uno cualquiera de los ARNm mencionados anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método, como se define en las reivindicaciones, para identificar un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, comprendiendo el método: (i) sintetizar un 1er ARNm de control que comprende: (a) un secuencia de polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido indicador, un 1er codón AUG secuencia arriba de, en el marco, y unido operativamente al marco de lectura abierto que codifica el polipéptido indicador; una secuencia codificante para un primer marcador de epítopo secuencia arriba de, en el marco y unida operativamente al 1er codón AUG; un 2° codón AUG secuencia arriba, en el marco, y unido operativamente a la secuencia codificante para el primer marcador de epítopo; una secuencia codificante para un segundo marcador de epítopo secuencia arriba de, en el marco, y operativamente unida al 2 ° codón AUG, un 3er codón AUG secuencia arriba, en el marco y operativamente unido a la secuencia codificante del segundo marcador del epítopo, una 5' UTR y una 3' UTR; y (ii) sintetizar un 2° ARNm de ensayo que comprende: (b) una secuencia de polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido indicador, un 1er codón AUG secuencia arriba, en el marco, y unido operativamente al marco de lectura abierto que codifica el polipéptido indicador; una secuencia codificante para un primer marcador de epítopo secuencia arriba, en el marco, y operativamente unido al 1er codón AUG, un 2° codón AUG secuencia arriba, en el marco, y operativamente unido a la secuencia codificante del primer marcador del epítopo, una secuencia codificante para un segundo marcador de epítopo secuencia arriba, en el marco, y unida operativamente al 2° codón AUG; un 3er codón AUG secuencia arriba, en el marco, y unido operativamente a la secuencia codificante para el segundo marcador de epítopo, una 5' UTR y una 3' UTR, en donde la 5' UTR comprende un elemento de ARN de ensayo; y (iii) introducir el 1er ARNm de control y el 2° ARNm de ensayo en condiciones adecuadas para la traducción de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido indicador; medir el efecto del elemento de ARN sobre el inicio de la traducción de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido indicador de cada uno de los tres codones AUG.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra una representación esquemática del ARNm indicador.
La Figura 1B es una representación de secuencias 5' UTR representativas.
La Figura 2A representa un SDS-PAGE/transferencia Western de lisados derivados de células HeLa o fibroblastos embrionarios murinos (MEF) que se transfectaron con ARNm indicadores que contenían 5' UTR que variaban en longitud y/o composición de bases. Los productos de traducción de longitud completa y truncados se detectaron utilizando un anticuerpo específico de eGFP.
La Figura 2B representa un SDS-PAGE/transferencia Western de lisados derivados de hígados de ratones a los que se les administró ARNm indicadores que contenían 5' UTR que variaban en longitud y/o composición de bases. Los productos de traducción de longitud completa y truncados se detectaron utilizando un anticuerpo específico de eGFP.
Las Figuras 2C y 2D representan gráficos que representan los resultados del análisis cuantitativo de la formación de proteína truncada de los experimentos descritos en (A) y (B), respectivamente.
La Figura 3A proporciona una representación esquemática del ARNm indicador que contiene una 5' UTR que consiste en 1x, 2x, 3x o 4x copias de la 5' UTR de referencia representada en la Figura 1B.
La Figura 3B representa una SDS-PAGE/transferencia Western de lisados derivados de células HeLa a las que se administró ARNm indicador que contiene 5' UTR que consisten en 1x, 2x, 3x o 4x copias de la 5' UTR estándar como se representa en la Figura 3A.
La Figura 3C proporciona un gráfico que representa los resultados de un análisis cuantitativo de la formación de proteína truncada de los experimentos que se muestran en la Figura 3B.
La Figura 3D proporciona un gráfico que representa los resultados de un análisis cuantitativo de la formación de proteína de longitud completa de los experimentos que se muestran en la Figura 3B.
La Figura 4A proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de huella de subunidades ribosómicas pequeñas, en donde las lecturas de secuenciación se mapearon frente a un transcriptoma humano y se contó el número de lecturas que se superponen con cada AUG en cada ARNm. El número de lecturas que se superponen con cada AUG luego se normalizó respecto al primer AUG.
La Figura 4B proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de la huella ribosómica pequeña, en donde la frecuencia de escaneo con fugas para cada ARNm en hepatocitos humanos primarios se estimó dividiendo la densidad media de lectura de subunidades pequeñas en los primeros 500 nt de la secuencia codificante por la densidad media de lectura de subunidades pequeñas en la 5' UTR. Esta métrica se trazó frente a la longitud de las 5' UTR. Cada punto representa un ARNm individual con al menos 100 lecturas mapeadas. La línea negra representa un promedio móvil.
La figura 5A proporciona una representación esquemática del ARNm indicador que contiene elementos ricos en GC en la 5' UTR.
La Figura 5B proporciona una imagen y un gráfico que representan los resultados de los experimentos, en donde se transfectaron células HeLa o fibroblastos embrionarios murinos (MEF) con ARNm indicadores que contenían 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC como se indica en la Figura 5A. Los productos de traducción de longitud completa y truncados se visualizaron por análisis de SDS-PAGE/transferencia Western utilizando un anticuerpo específico de eGFP. El análisis cuantitativo de la formación de proteína truncada se muestra debajo de las transferencias Western.
Las Figuras 6A y 6B proporcionan gráficos que representan los resultados de los experimentos, en donde células HeLa o hepatocitos humanos, como se indica, se transfectaron con ARNm indicadores para eritropoyetina humana (Epo) que contenían 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC representados en la Figura 5A y se cuantificó la cantidad de Epo.
Las Figuras 6C y 6D proporcionan gráficos que representan los resultados de los experimentos, en donde células HeLa o hepatocitos humanos, como se indica, se transfectaron con ARNm indicadores para luciferasa (Luc) que contenían las 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC representados en la Figura 5A y se cuantificó la cantidad de Luc.
La Figura 7A proporciona un gráfico que representa la eficiencia de escaneo con fugas de 2545' UTR diferentes de fuentes naturales y sintéticas, que varían en la composición de bases y longitud, que se ensayaron en células HeLa con el indicador eGFP representado en la Figura 3, medido por análisis cuantitativo de inmunotransferencias.
La Figura 7B proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de huella de subunidades ribosómicas pequeñas, en donde se cuantificó la frecuencia de escaneo con fugas para cada ARNm en hepatocitos humanos primarios y se representó frente al número de bases G y C en los 20 nt finales de las 5' UTR. Cada punto representa un ARNm individual con al menos 100 lecturas mapeadas. La línea negra representa un promedio móvil.
La Figura 8A es una tabla que representa la secuencia de las 5' UTR analizadas en la construcción del indicador representada en la Figura 8B.
La figura 8B es un diagrama que representa la construcción de indicador y el sistema utilizados para ensayar el efecto de varias 5' UTR que comprenden elementos de ARN ricos en GC, como se muestra en la figura 8a .
La Figura 9A representa una SDS-PAGE/transferencia Western de lisados derivados de hepatocitos a los que se les administró ARNm indicador que contiene las 5' UTR indicadas como 5' UTR mostradas en la Figura 8a .
La Figura 9B proporciona un gráfico que representa los resultados de un análisis cuantitativo de la formación de proteína truncada de los experimentos que se muestran en la Figura 9A.
La figura 10 proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de imágenes de todo el cuerpo de los ratones a los que se administraron los ARNm que comprenden varias 5' UTR, como se indica, y que codifican luciferasa. La señal de luminiscencia se da en flujo total (p/s).
Las Figuras 11A, 11B y 11C proporcionan gráficos que representan los resultados del análisis de imágenes de fluorescencia de las células a las que se administró los ARNm que comprenden V1-UTR y codifican eGFP en varios tipos de células, como se indica.
La Figura 12A proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de huella de subunidades ribosómicas pequeñas usando células HeLa, en donde las lecturas de secuenciación se mapearon frente a un transcriptoma humano y se contó el número de lecturas que se superponen con cada AUG en cada ARNm. El número de lecturas que se superponen con cada AUG luego se normalizó respecto al primer AUG.
La Figura 12B proporciona un gráfico que representa los resultados del análisis de huella de subunidades ribosómicas pequeñas, en donde las lecturas de secuenciación se mapearon frente a un transcriptoma humano y se contó el número de lecturas que se superponen con cada AUG en cada ARNm. El número de lecturas que se superponen con cada AUG luego se normalizó respecto al primer AUG.
Polinucleótidos modificados que comprenden elementos de ARN funcionales
La presente descripción proporciona polinucleótidos sintéticos (es decir, ARNm) que comprenden una modificación (es decir, un elemento de ARN), en donde la modificación proporciona una actividad reguladora de la traducción deseada.
Los ARNm de la invención y la actividad reguladora de la traducción se definen en las reivindicaciones.
Elementos de ARN
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm que comprenden elementos de ARN que proporcionan una o más actividades reguladoras de la traducción. En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm que comprenden elementos de ARN que proporcionan una o más actividades reguladoras de la traducción que mejoran la potencia de un ARNm que tiene el elemento de ARN (es decir, un elemento de ARN rico en G C situado en la 5' UTR), respecto a un ARNm sin el elemento de ARN. Un elemento de ARN es una porción, fragmento o segmento de una molécula de ARN que tiene importancia biológica (p. ej., proporciona una función o actividad biológica tal como una actividad reguladora de la traducción). El elemento de ARN comprende un elemento de ARN rico en GC. El elemento de ARN proporciona una o más actividades reguladoras de la traducción.
Los ARNm de la invención y el elemento de ARN se definen en las reivindicaciones.
Elementos de ARN ricos en GC
La descripción proporciona ARNm con 5' UTR que comprenden un elemento de ARN que es un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción. La descripción proporciona ARNm con 5' UTR que comprenden un elemento de ARN que es un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción que mejora la potencia del ARNm que tiene el elemento de ARN en relación con un ARNm sin el elemento. La actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(g).
Los ARNm de la invención, el elemento de ARN rico en GC y la actividad reguladora de la traducción se definen en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende nucleobases guanina (G) y citosina (C), o derivados o análogos de los mismos y, opcionalmente, nucleobases adenina (A) y uracilo (U), o derivados o análogos de los mismos. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende nucleobases adenina (A). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende nucleobases uracilo (U). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC no comprende nucleobases adenina (A) o uracilo (U).
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene al menos 50% o más nucleobases de citosina (C). En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 50%-55% citosina, aproximadamente 55%-60% citosina, aproximadamente 60%-65% citosina, aproximadamente 65%-70% citosina, aproximadamente 70%-75% citosina o aproximadamente 75%-80% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >50% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >60% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC es >70% citosina.
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene al menos 6 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-10 nucleótidos de longitud, aproximadamente 10-15 nucleótidos de longitud, aproximadamente 15-20 nucleótidos de longitud, aproximadamente 20-25 nucleótidos de longitud o aproximadamente 25-30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC tiene 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 6 nucleótidos de longitud y comprende >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 7 nucleótidos de longitud y comprende >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 8 nucleótidos de longitud y comprende >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 9 nucleótidos de longitud y comprende >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 10 nucleótidos de longitud y comprende >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos de longitud, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina. En algunas realizaciones, el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-30 nucleótidos de guanina (G) y citosina (C), o derivados o análogos de los mismos, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina, y en donde la secuencia comprende un motivo de secuencia que se repite.
En cualquiera de los aspectos anteriores o relacionados, la descripción proporciona un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de 3-30, 5-25, 10-20, 15-20, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 12, aproximadamente 10, aproximadamente 7, aproximadamente 6 derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la composición de la secuencia es 70-80% citosina, 60-70% citosina, 50%-60% citosina. En cualquiera de los aspectos anteriores o relacionados, la descripción proporciona un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de 3-30, 5-25, 10-20, 15-20, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 12, aproximadamente 10, aproximadamente 7, aproximadamente 6 o aproximadamente 3 nucleótidos, derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la composición de la secuencia es aproximadamente 80% citosina, aproximadamente 70% citosina, aproximadamente 60% citosina, aproximadamente 50% citosina.
Los ARNm de la invención que comprenden un elemento de ARN rico en GC se definen en las reivindicaciones.
En cualquiera de los aspectos anteriores o relacionados, la descripción proporciona un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, nucleótidos, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la composición de la secuencia es 70-80% citosina, 60-70% citosina, 50%-60% citosina. En cualquiera de los aspectos anteriores o relacionados, la descripción proporciona un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, nucleótidos, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la composición de la secuencia es aproximadamente 80% de citosina, aproximadamente 70% de citosina, aproximadamente 60% de citosina, aproximadamente 50% de citosina.
Los ARNm de la invención que comprenden un elemento de ARN rico en GC se definen en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm modificado, como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos una modificación, en donde al menos una modificación es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que preceden a una secuencia de consenso de Kozak en una 5' UTR del ARNm, en donde el elemento de ARN rico en GC se encuentra aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido(s) secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm, y en donde el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos, o derivados o análogos de los mismos, unidos en cualquier orden, en donde la composición de la secuencia es >50% citosina. En algunas realizaciones, la composición de la secuencia es >55% citosina, > 60% citosina, > 65% citosina, > 70% citosina, >75% citosina, >80% citosina, >85% citosina o >90% citosina.
En otros aspectos, la descripción proporciona un ARNm que comprende un elemento de ARN rico en GC, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende un motivo de secuencia que se repite.
Los ARNm de la invención, el elemento de ARN rico en GC y el motivo de secuencia que se repite se definen en las reivindicaciones.
En una realización, el elemento de ARN rico en GC se encuentra aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido(s) secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En otra realización, el elemento de ARN rico en GC se encuentra aproximadamente 5-10 nucleótidos secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak. En otra realización, el elemento de ARN rico en GC se encuentra inmediatamente adyacente a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm.
En algunas realizaciones, el ARNm proporcionado por la descripción comprende un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el ARNm proporcionado por la descripción comprende un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm que comprende un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En otros aspectos, la descripción proporciona un ARNm modificado que comprende al menos una modificación, en donde al menos una modificación es un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1, o derivados o análogos de los mismos, que preceden a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1 situada inmediatamente adyacente y secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1 situada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm.
Los ARNm de la invención y el elemento de ARN rico en GC se definen en las reivindicaciones.
En otros aspectos, la descripción proporciona un ARNm modificado que comprende al menos una modificación, en donde al menos una modificación es un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia de nucleótidos V2 [CCCCGGC] (SEQ ID NO: 3) como se expone en la Tabla 1, o derivados o análogos de los mismos, que preceden a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos V2 [CCCCGGC] (SEQ ID NO: 3) como se expone en la Tabla 1 situada inmediatamente adyacente y secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos V2 [CCCCGGC] (SEQ ID NO: 3) como se expone en la Tabla 1 situada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm.
Los ARNm de la invención y el elemento de ARN rico en GC se definen en las reivindicaciones.
En otros aspectos más, la descripción proporciona un ARNm modificado que comprende al menos una modificación, en donde al menos una modificación es un elemento de ARN rico en GC que comprende la secuencia V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1, o derivados o análogos de la misma, que preceden a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm, en donde la 5' UTR comprende la siguiente secuencia mostrada en la Tabla 1:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC (SEQ ID NO: 33).
En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia V1 (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1 situada inmediatamente adyacente y secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la secuencia de 5' UTR mostrada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el elemento rico en GC comprende la secuencia V1 (SEQ ID NO: 2) como se expone en la Tabla 1 situada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm, en donde la 5' UTR comprende la siguiente secuencia mostrada en la Tabla 1:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC (SEQ ID NO: 33).
En algunas realizaciones, la 5' UTR comprende la siguiente secuencia expuesta en la Tabla 1:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC (SEQ ID NO: 33).
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR, en donde la 5' u Tr comprende la secuencia de nucleótidos
5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3'
expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde la 5' UTR comprende un elemento de ARN rico en GC situado aproximadamente 6-10 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia de 5' UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende: (i) una región no traducida (UTR) 5' que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción descrita en el presente documento; (ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y codifica un polipéptido; y (iii) una 3' UTR, en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos
5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3'
expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, y en donde la 5' UTR comprende el elemento de ARN rico en GC situado aproximadamente 6-10 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia 5' UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende: (i) una región no traducida (Ut R) 5' que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción descrita en el presente documento; (ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y codifica un polipéptido; y (iii) una 3' UTR, en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos
5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3'
expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, y en donde el elemento de ARN rico en GC está situado aproximadamente 6-10 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia 5'UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende: (i) una región no traducida (UTR) 5' que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción descrita en el presente documento; (ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y codifica un polipéptido; y (iii) una 3' UTR, en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos
5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3'
expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, y en donde el elemento de ARN rico en GC está situado aproximadamente 6-10 nucleótidos secuencia arriba del extremo 3' de la secuencia de la 5'UTR expuesta en la SEQ ID NO: 33.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende (i) una región no traducida (UTR) 5' que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 34; (ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y codifica un polipéptido; y (iii) una 3' UTR.
Estructuras secundarias estables de ARN
En algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se definen en las reivindicaciones, que comprenden elementos de ARN que proporcionan una o más actividades reguladoras de la traducción que surgen de la formación de una estructura secundaria. Sin estar ligado a la teoría, se cree que un elemento de ARN que proporciona una función (p. ej., una actividad reguladora de la traducción) mediante la formación de una estructura secundaria (p. ej., una estructura secundaria de ARN estable) se diferencia de un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción proporcionada por la estructura o secuencia primaria del elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en GC). Los ejemplos típicos de estructuras secundarias de ARN estables incluyen dúplex, horquillas y tallo-bucles. Los ARNm de la invención y los elementos de ARN se definen en las reivindicaciones.
En consecuencia, en algunas realizaciones, la descripción proporciona ARNm, como se definen en las reivindicaciones, que comprenden un elemento de ARN que comprende una estructura secundaria de ARN estable que proporciona una actividad reguladora de la traducción. La actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(f).
En otra realización, la secuencia del elemento de ARN rico en GC está compuesta exclusivamente por nucleobases guanina (G) y citosina (C).
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que tiene una o más modificaciones estructurales que inhiben el escaneo con fugas y/o promueven la fidelidad de traducción de la traducción del ARNm, en donde al menos una de las modificaciones estructurales es un elemento de ARN rico en GC. En algunos aspectos, la descripción proporciona un ARNm modificado, como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos una modificación, en donde al menos una modificación es un elemento de ARN rico en GC que comprende una secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que preceden a una secuencia de consenso de Kozak en una 5' UTR del ARNm. En una realización, el elemento de ARN rico en GC se encuentra aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido(s) secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En otra realización, el elemento de ARN rico en GC está situado 5-10 nucleótidos secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak. En otra realización, el elemento de ARN rico en GC está situado inmediatamente adyacente a una secuencia de consenso de Kozak en la 5' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, el elemento de ARN comprende nucleótidos naturales y/o modificados. En algunas realizaciones, el elemento de ARN comprende una secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que proporciona una actividad reguladora de la traducción deseada como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el elemento de ARN comprende una secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que forma o se pliega en una estructura secundaria de ARN estable, en donde la estructura secundaria de ARN proporciona una actividad reguladora de la traducción deseada como se describe en el presente documento, como se define en las reivindicaciones. Los elementos de ARN se pueden identificar y/o caracterizar basándose en la secuencia primaria del elemento (p. ej., elemento de ARN rico en GC), por la estructura secundaria de ARN formada por el elemento (p. ej., tallo-bucle), por la situación del elemento dentro de la molécula de ARN (p. ej., situado dentro de la 5' UTR de un ARNm), por la función y/o actividad biológica del elemento (p. ej., "elemento potenciador de la traducción"), y cualquier combinación de los mismos.
Las 5' UTR de ejemplo y las modificaciones que incluyen elementos ricos en GC y las estructuras secundarias de ARN estables (p. ej., horquillas) proporcionadas por la descripción se exponen en la Tabla 1. Estas 5' UTR y las modificaciones que incluyen elementos ricos en GC y estructuras secundarias de ARN estables, y cualquier combinación de los mismos, son útiles en los ARNm de la descripción. Los ARNm de la invención se definen en las reivindicaciones.
Tabla 1
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Métodos para identificar y caracterizar la función de los elementos de ARN
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para identificar y/o caracterizar elementos de ARN que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada de la descripción, incluidos aquellos que modulan (p. ej., reducen) el escaneo con fugas, a polinucleótidos (p. ej., ARNm).
Los métodos de la invención se definen en las reivindicaciones.
Perfilado de ribosomas
En un aspecto, los elementos de ARN que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada, incluida la modulación del escaneo con fugas, a polinucleótidos, por ejemplo, ARNm, se identifican y/o caracterizan mediante perfilado de ribosomas.
El perfilado de ribosomas es una técnica que permite la determinación del número y la posición de los ribosomas unidos a ARNm (véase, p. ej., Ingolia et al., (2009) Science 324(5924):218-23). La técnica se basa en la protección por el ribosoma de una región o segmento de ARNm de la digestión con ribonucleasas, cuya región o segmento se analiza posteriormente. En este planteamiento, un lisado celular se trata con ribonucleasas, conduciendo a la generación de ribosomas 80S con fragmentos de ARNm al que están unidos. A continuación, los ribosomas 80S se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica (p. ej., centrifugación en gradiente de densidad) y se aíslan fragmentos de ARNm que están protegidos por los ribosomas. La protección da como resultado la generación de un fragmento de ARN de 30 pb denominado "huella". El número y la secuencia de huellas de ARN pueden analizarse mediante métodos conocidos en la técnica (p. ej., Riboseq, RNA-seq). La huella está aproximadamente centrada en el sitio A del ribosoma. Durante la traducción, un ribosoma puede permanecer en una posición o ubicación particular a lo largo de un ARNm (p. ej., en un codón de iniciación). Las huellas generadas en estas posiciones de permanencia son más abundantes que las huellas generadas en posiciones a lo largo del ARNm donde el ribosoma tiene mayor procesividad. Los estudios han demostrado que se generan más huellas en las posiciones donde el ribosoma presenta una procesividad reducida (posiciones de permanencia) y menos huellas en donde el ribosoma presenta una mayor procesividad (Gardin et al., (2014) eLife 3:e03735). La secuenciación de alto rendimiento de estas huellas proporciona información sobre las ubicaciones de ARNm (secuencia de huellas) de los ribosomas y genera una medida cuantitativa de la densidad de ribosomas (número de huellas que comprenden una secuencia particular) a lo largo de un ARNm. En consecuencia, los datos de perfiles de ribosomas proporcionan información que puede usarse para identificar y/o caracterizar elementos de ARN que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada de la descripción, incluidos aquellos que reducen el escaneo con fugas, a polinucleótidos como se describe en este documento, p. ej., ARNm.
El perfilado de ribosomas también se puede usar para determinar el grado de densidad de ribosomas (también conocido como "carga de ribosomas") en un ARNm. Se sabe que las subunidades ribosómicas disociadas inician la traducción en el codón de iniciación dentro de la región terminal 5' del ARNm. Tras la iniciación, el ribosoma de traducción se mueve a lo largo de la cadena de ARNm hacia el extremo 3' del ARNm, dejando vacante el sitio de iniciación para cargar el siguiente ribosoma en el ARNm. De esta manera se forma un grupo de ribosomas que se desplazan uno tras otro y traducen la misma cadena de ARNm. Dicho grupo se denomina "polirribosoma" o "polisoma" (Warner et al., (1963) Proc Natl Acad Sci USA 49:122-129). El número de fragmentos de ARNm diferentes protegidos por ribosomas por ARNm, por región de un ARNm (p. ej., una 5' UTR) o por ubicación en un ARNm (p. ej., un codón de iniciación) indica un grado de densidad de ribosomas. En general, un aumento en el número de ribosomas unidos a un ARNm (es decir, la densidad de los ribosomas) se asocia con mayores niveles de síntesis de proteínas.
En consecuencia, un aumento en la densidad de ribosomas de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse mediante perfilado de ribosomas. Un aumento en la densidad de ribosomas de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, puede determinarse mediante la densidad de ribosomas.
El perfilado de ribosomas también se usa para determinar el tiempo, la extensión, la velocidad y/o la fidelidad de la descodificación de los ribosomas de un codón particular de un ARNm (y, por extensión, el número esperado de lecturas de RNA-seq correspondientes en una biblioteca de huellas aisladas), que a su vez está determinado por la cantidad de tiempo que un ribosoma pasa en un codón en particular (tiempo de permanencia). Esta última se denomina "tasa de elongación de codones" o "tasa de descodificación de codones". El tiempo de permanencia relativo de los ribosomas entre dos ubicaciones en un ARNm, en lugar del tiempo de permanencia real o absoluto en una sola ubicación, también se puede determinar comparando el número de lecturas de secuenciación de fragmentos de ARNm protegidos en cada ubicación ( p. ej., un codón) (O'Connor et al., (2016) Nature Commun 7:12915). Por ejemplo, el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde un codón de iniciación puede determinarse a partir de un aumento observado en el tiempo de permanencia de los ribosomas en el codón de iniciación con respecto al tiempo de permanencia de los ribosomas en un codón de iniciación alterno o alternativo secuencia abajo en un ARNm. En consecuencia, el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde un codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más modificaciones o elementos de ARN de la descripción, con respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse a partir de un aumento observado en el tiempo de permanencia de los ribosomas en el codón de iniciación con respecto al tiempo de permanencia de los ribosomas en un codón de iniciación alterno o alternativo secuencia abajo en cada polinucleótido (p. ej., ARNm).
Un aumento en el tiempo de retención o el tiempo de ocupación (tiempo de permanencia) de un ribosoma en una posición o ubicación discreta (p. ej., un codón de iniciación) a lo largo de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, con respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por perfilado de ribosomas. Un aumento en el tiempo de retención o el tiempo de ocupación de un ribosoma en un codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar mediante el perfilado de ribosomas.
Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por perfilado de ribosomas. Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por el ribosoma en un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Una disminución en una tasa de descodificación de un codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Una disminución en una tasa de descodificación de un codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, puede determinarse por perfilado de ribosomas.
Mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas
Los elementos de ARN que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada, incluida la modulación del escaneo con fugas, a polinucleótidos, p. ej., ARNm, pueden identificarse y/o caracterizarse por mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas.
El mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas (SSU) es una técnica similar al perfilado de ribosomas que permite la determinación del número y la posición de subunidades ribosómicas 40S pequeñas o complejos de preiniciación (PIC) que comprenden subunidades ribosómicas 40S pequeñas unidas a los ARNm. De manera similar a la técnica de perfilado de ribosomas descrita en el presente documento, el mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas implica el análisis de una región o segmento de ARNm protegido por la subunidad 40S de la digestión por la ribonucleasa, lo que da como resultado una "huella", cuyo número y secuencia pueden analizarse por métodos conocidos en la técnica (p. ej., RNA-seq). Como se describe en el presente documento, el modelo actual de inicio de la traducción del ARNm postula que el complejo de preiniciación (alternativamente, "complejo de preiniciación 43S"; abreviado como "PIC") se transloca desde el sitio de reclutamiento en el ARNm (típicamente la caperuza 5') al codón de iniciación por escaneo de los nucleótidos en una dirección de 5' a 3' hasta que se encuentre el primer codón AUG que reside dentro de un contexto de nucleótido promotor de la traducción específico (la secuencia de Kozak) (Kozak (1989) J Cell Biol 108:229-241). El "escaneo con fugas" por el PIC, mediante el cual el PIC pasa por alto el codón de iniciación de un ARNm y en su lugar continúa escaneando secuencia abajo hasta que se reconoce un codón de iniciación alterno o alternativo, puede ocurrir y dar como resultado una disminución en la eficiencia de la traducción y/o la producción de un producto de traducción no deseado y aberrante. Por lo tanto, el análisis del número de SSU situadas o mapeadas sobre los AUG secuencia abajo del primer AUG en un ARNm permite determinar el grado o frecuencia con la que se produce el escaneo con fugas. El mapeo de SSU proporciona información que puede usarse para identificar o determinar una característica (p. ej., una actividad reguladora de la traducción) de una modificación o elemento de ARN de la descripción, que afecta a la actividad de una subunidad ribosómica pequeña 40S (SSU o un PIC que comprende la SSU.
En consecuencia, una inhibición o reducción del escaneo con fugas por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende una o más modificaciones o elementos de ARN puede determinarse mediante mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas. Una inhibición o reducción del escaneo con fugas por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC se puede determinar mediante el mapeo de subunidades ribosómicas pequeñas.
Un aumento en el tiempo de retención o el tiempo de ocupación (tiempo de permanencia) de una SSU o un PIC que comprende una SSU en una posición o ubicación discreta (p. ej., un codón de iniciación) a lo largo de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, con respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por perfilado de ribosomas. Un aumento en el tiempo de retención o el tiempo de ocupación de una SSU o un PIC que comprende una SSU en un codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar mediante el perfilado de ribosomas.
Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por perfilado de ribosomas. Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación en un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Un aumento en la fidelidad de la descodificación del codón de iniciación por una SSU o un PIC que comprende una SSU de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por perfilado de ribosomas.
Una disminución en una tasa de descodificación de un codón de iniciación que comprende un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una cualquiera o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, se puede determinar por perfilado de ribosomas. Una disminución en una tasa de descodificación de un codón de iniciación por el ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, puede determinarse por perfilado de ribosomas.
RiboFrame-seq
Los elementos de ARN que proporcionan una actividad reguladora de la traducción deseada, incluida la modulación del escaneo con fugas, a polinucleótidos, p. ej., ARNm, pueden identificarse y/o caracterizarse por RiboFrame-seq.
RiboFrame-seq es un ensayo que permite la medición de alto rendimiento del escaneo con fugas para muchas secuencias 5' UTR diferentes. Se genera una población de ARNm con una biblioteca de diferentes secuencias de 5' UTR, cada una de las cuales contiene una caperuza 5' y una secuencia codificante que codifica un polipéptido que comprende dos o tres marcadores de epítopos diferentes, cada una en un marco diferente y precedida por un AUG. La población de ARNm se transfecta en células y se deja que sea traducida. A continuación, las células se lisan y se realizan inmunoprecipitaciones contra cada uno de los marcadores de epítopo codificados. Cada una de estas inmunoprecipitaciones está diseñada para aislar una cadena polipeptídica naciente que codifica el epítopo particular, así como el ribosoma activo que realiza su síntesis y el ARNm que lo codifica. A continuación, se analiza el complemento de las 5' UTR presentes en cada inmunoprecipitado mediante métodos conocidos en la técnica (p. ej., RNA-seq). Las 5'-UTR que comprenden secuencias (p. ej., elementos de ARN) que se correlacionan con un escaneo con fugas reducido, inhibido o bajo se caracterizan por ser abundantes en el inmunoprecipitado correspondiente al primer marcador de epítopo respecto a los otros inmunoprecipitados.
En consecuencia, una modificación o elemento de ARN que tiene una actividad reguladora de la traducción de la descripción puede identificarse o caracterizarse mediante RiboFrame-seq. Una modificación o elemento de ARN que tiene un escaneo con fugas reducido, inhibido o bajo cuando se encuentra en una 5' UTR de un ARNm puede identificarse o caracterizarse por ser abundante en el inmunoprecipitado correspondiente al primer marcador de epítopo respecto a los otros inmunoprecipitados según lo determinado por RiboFrameseq.
Transferencia Western (inmunodetección)
La descripción proporciona un método para identificar una modificación (es decir, un elemento de ARN) que proporciona una actividad reguladora de la traducción, como se define en las reivindicaciones, mediante la síntesis de un 1er ARNm de control que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido indicador (p. ej., eGFP) y un 1er codón AUG secuencia arriba de, en el marco, y unido operativamente al marco de lectura abierto que codifica el polipéptido indicador. El 1er ARNm de control también comprende una secuencia codificante para un primer marcador de epítopo (p. ej., 3xFLAG) secuencia arriba de, en el marco, y unido operativamente al 1er codón AUG, un 2° codón AUG secuencia arriba de, en el marco, y unido operativamente a la secuencia codificante para el primer marcador de epítopo. Opcionalmente, el 1er ARNm de control comprende además una secuencia codificante para un segundo marcador de epítopo (p. ej., V5) secuencia arriba, en el marco y operativamente unida al 2° codón AUG, y un 3er codón AUG secuencia arriba de, en el marco operativamente unido a la secuencia codificante para el segundo marcador de epítopo. El 1er ARNm de control también comprende una 5' UTR y una 3' UTR. El método comprende además sintetizar un 2° ARNm de ensayo que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende el 1er ARNm de control y que comprende además una modificación (p. ej., un elemento de ARN). El método comprende además introducir el 1er ARNm de control y el 2° ARNm de ensayo en condiciones adecuadas para la traducción de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido indicador. El método comprende además medir el efecto de la modificación candidata sobre la cantidad de polipéptido indicador a partir de cada uno de los tres codones AUG. Después de la transfección de este ARNm en células, el lisado celular se analiza mediante transferencia Western utilizando anticuerpos que se unen específicamente a y detectan el polipéptido indicador. Este análisis genera dos o tres bandas: una banda superior que corresponde a la proteína generada a partir del primer AUG y bandas inferiores derivadas de la proteína generada a partir del segundo AUG y, opcionalmente, del tercer AUG.
El escaneo con fugas se calcula como la abundancia de las bandas inferiores dividida por la suma de la abundancia de ambas bandas, según se determina mediante métodos conocidos en la técnica (p. ej., densitometría). Un ARNm de ensayo que comprende una o más modificaciones o elementos de ARN de la descripción, que se correlacionan con un escaneo con fugas reducido, inhibido o bajo, se caracteriza por un aumento en la cantidad de polipéptido que comprende el segundo marcador de epítopo en comparación con la cantidad de polipéptido que no comprende un marcador de epítopo, opcionalmente, la cantidad de polipéptido que comprende el primer marcador de epítopo, traducido del ARNm de ensayo, respecto al ARNm de control que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN. Por consiguiente, una modificación o elemento de ARN que tenga una actividad reguladora de la traducción de la descripción puede identificarse mediante transferencia Western.
Una inhibición o reducción en el escaneo con fugas de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por transferencia Western. Una inhibición o reducción en el escaneo con fugas de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por transferencia Western.
Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación que comprende un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una cualquiera o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por transferencia Western. Un aumento en el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación que comprende un polinucleótido (p. ej., ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción respecto a un polinucleótido (p. ej., ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por transferencia Western.
Un aumento en una cantidad de polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo que comprende un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una cualquiera o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por transferencia Western. Un aumento en una cantidad de polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo que comprende un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por transferencia Western.
Una inhibición o reducción en una cantidad de polipéptido traducido de cualquier marco de lectura abierto distinto de un marco de lectura abierto completo que comprende un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, puede determinarse por transferencia Western. Una inhibición o reducción en una cantidad de polipéptido traducido de cualquier marco de lectura abierto distinto de un marco de lectura abierto completo que comprenda un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, puede determinarse por transferencia Western.
Una inhibición o reducción en la producción de productos de traducción aberrantes traducidos de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, pueden determinarse por transferencia Western. Una inhibición o reducción en la producción de productos de traducción aberrantes traducidos de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende un elemento rico en GC de la descripción, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende el elemento rico en GC, se puede determinar por transferencia Western.
El escaneo con fugas por un complejo de preiniciación (PIC) 43S o un ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN (es decir, un elemento rico en GC) de la descripción se puede disminuir en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1%-5% respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, según se determina por métodos de mapeo de SSU y/o de perfilado de ribosomas, como se describe en el presente documento.
El escaneo con fugas por un complejo de preiniciación (PIC) 43S o ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una cualquiera o más de las modificaciones o elementos de ARN de la descripción se puede disminuir en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1%-5% y se aumenta una cantidad de un polipéptido traducido de un marco de lectura completo en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente un 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1%-5% respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de ARN, según se determina por mapeo de SSU y transferencia Western, respectivamente, como se describe en el presente documento.
El escaneo con fugas por el complejo de preiniciación (PIC) 43S o ribosoma de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que comprende una o más de las modificaciones o elementos de ARN (es decir, elemento rico en GC) de la descripción se puede disminuir en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1 %- 5%, se aumenta la cantidad de un polipéptido traducido de un marco de lectura abierto completo en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1%-5%, y se aumenta la potencia del polipéptido en aproximadamente 80%-100%, aproximadamente 60%-80%, aproximadamente 40%-60%, aproximadamente 20%-40%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 5%-10%, aproximadamente 1%-5%, respecto a un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que no comprende la una o más modificaciones o elementos de a Rn , según se determina por mapeo de SSU y transferencia Western.
Otro elemento de ARN que se sabe que regula la traducción de ARNm es la caperuza de cinco prima (caperuza 5'), que es un nucleótido en el extremo 5' del ARNm natural especialmente alterado co-transcripcionalmente. Este proceso, conocido como formación de caperuza del ARNm, está altamente regulado y es vital en la creación de ARN mensajero estable y maduro capaz de experimentar traducción. En los eucariotas, la estructura de la caperuza 5' consiste en un nucleótido de guanina conectado al extremo 5' de un ARNm a través de un enlace trifosfato de 5' a 5' inusual. Esta guanosina se metila en la posición 7 directamente después de la formación de caperuza in vivo por una metiltransferasa y, como tal, a veces se denomina una caperuza de 7-metilguanilato y se abrevia m7G. Una estructura de caperuza 5' o especie de caperuza es un compuesto que incluye dos restos de nucleósidos unidos por un enlazador y puede seleccionarse de una caperuza de origen natural, una caperuza de origen no natural o un análogo de caperuza o un análogo de caperuza anti­ inverso (ARCA). Una especie de caperuza puede incluir uno o más nucleósidos modificados y/o restos enlazadores. Por ejemplo, una caperuza de ARNm natural puede incluir un nucleótido de guanina y un nucleótido de guanina (G) metilado en la posición 7 unidos por un enlace trifosfato en sus posiciones 5', p. ej., m7G(5')ppp(5')G, comúnmente escrito como m7GpppG. Una especie de caperuza también puede ser un análogo de caperuza anti-inverso. Una lista no limitante de posibles especies de caperuza incluye m7GpppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m27,O3'GpppG, m27,O3'GppppG, m27,O2'GppppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m27,O3'GpppG, m27,O3'GppppG, y m27,O2'GppppG. Por consiguiente, los ARNm pueden comprender una caperuza 5', o un derivado, análogo o modificación de la misma.
Un suceso temprano en el inicio de la traducción implica la formación del complejo de preiniciación (PIC) 43S compuesto por la subunidad ribosómica pequeña 40S, el ARN de transferencia iniciador (Met-tARNiMet) y varios elF diferentes. Después del reclutamiento al ARNm, el PIC interroga o "escanea" bioquímicamente la secuencia de la molécula de ARNm en busca de un codón de iniciación. En algunas realizaciones de los ARNm descritos en el presente documento, los ARNm comprenden al menos un codón de iniciación. El codón de iniciación puede ser un codón AUG. El codón de iniciación puede comprender uno o más nucleótidos modificados.
Similar a los polipéptidos, los polinucleótidos, particularmente el ARN, pueden plegarse en una variedad de estructuras tridimensionales complejas. La capacidad de un ácido nucleico para formar una estructura tridimensional compleja funcional se ejemplifica mediante una molécula de ARN de transferencia (ARNt), que es una cadena única de ~70-90 nucleótidos de longitud que se pliega en una estructura 3D en forma de L que le permite encajar en los sitios P y A de un ribosoma y funcionar como enlace físico entre la secuencia codificante del polipéptido del ARNm y la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Dado que el apareamiento de bases entre secuencias complementarias de nucleobases determina la estructura secundaria general (y, en última instancia, terciaria) de las moléculas de ácido nucleico, las secuencias predichas o que se sabe que pueden adoptar una estructura particular (p. ej., un tallo-bucle) son consideraciones vitales en el diseño y utilidad de algunos tipos de elementos o motivos funcionales (p. ej., elementos de ARN). La estructura secundaria de los ácidos nucleicos generalmente se divide en dúplex (pares de bases contiguos) y varios tipos de bucles (nucleótidos no apareados flanqueados o rodeados por dúplex). Como se sabe en la técnica, las estructuras secundarias de ARN estables, o combinaciones de ellas, pueden clasificarse adicionalmente y describirse de manera útil como, pero no limitada a, bucles simples, tetrabucles, pseudonudos, horquillas, hélices y bucles troncales. La estructura secundaria también se puede representar de manera útil como una lista de nucleobases que se emparejan en una molécula de ácido nucleico.
La(s) función(es) de una estructura secundaria de ácido nucleico emerge(n) de las propiedades termodinámicas de la estructura secundaria. Por ejemplo, la estabilidad termodinámica de una estructura de ARN de horquilla/tallo-bucle se caracteriza por su cambio de energía libre (deltaG). Para un proceso espontáneo, es decir, la formación de una horquilla/tallo-bucle de ARN estable, deltaG es negativo. Cuanto más bajo sea el valor deltaG, más energía se requiere para invertir el proceso, es decir, más energía se requiere para desnaturalizar o fundir ("desplegar") la horquilla/tallo-bucle de ARN. La estabilidad de una horquilla/tallobucle de ARN contribuirá a su función biológica: p. ej., en el contexto de la traducción, una estructura de ARN más estable con un deltaG relativamente bajo puede actuar como una barrera física para el ribosoma (Kozak, 1986; Babendure et al. , 2006), lo que conduce a la inhibición de la síntesis de proteínas. Por el contrario, una estructura de ARN más débil o moderadamente estable puede ser beneficiosa como potenciador de la traducción, ya que la maquinaria de traducción lo reconocerá como una señal para una pausa temporal, pero finalmente la estructura se abrirá y permitirá que continúe la traducción (Kozal, 1986; Kozak, 1990; Babendure et al., 2006). Asignar un número absoluto al valor deltaG que define una horquilla/tallo-bucle de ARN estable frente a uno débil/moderadamente estable es difícil y depende en gran medida de su contexto (secuencia y contexto estructural, contexto biológico). En el contexto de los ejemplos mencionados anteriormente de Kozak, 1986, Kozak, 1990 y Babendure et al., 2006, las horquillas/tallo-bucles estables se caracterizan por valores deltaG aproximados inferiores a -30 kcal/mol, mientras que las horquillas débiles/moderadamente estables se caracterizan por valores aproximados deltaG entre -10 y -30 kcal/mol.
En consecuencia, un ARNm, como se define en las reivindicaciones comprende al menos una modificación, en donde la al menos una modificación es una modificación estructural, en donde la modificación estructural es un elemento de ARN, en donde la modificación estructural es un elemento de ARN rico en GC. En algunas realizaciones, la modificación estructural es una estructura secundaria de ARN estable.
Los ARNm de la presente descripción, o regiones de los mismos, pueden tener codones optimizados. Los métodos de optimización de codones son conocidos en la técnica y pueden ser útiles para una variedad de propósitos: hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos hospedantes para garantizar el plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones de repetición en tándem o los desplazamientos de bases que pueden alterar la construcción o expresión de genes, personalizar regiones de control transcripcional y traduccional, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/añadir sitios de modificación postraduccional en proteínas codificadas (p. ej., sitios de glicosilación), añadir, eliminar o barajar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar los sitios de unión al ribosoma y los sitios de degradación del ARNm, ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen correctamente o reducir o eliminar las estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica, los ejemplos no limitantes incluyen servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o métodos patentados. En una realización, la secuencia de ARNm se optimiza utilizando algoritmos de optimización, p. ej., para optimizar la expresión en células de mamíferos o mejorar la estabilidad del ARNm. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un ARNmm comprende una modificación estructural, en donde la modificación estructural es un marco de lectura abierto de codones optimizados. En algunas realizaciones, la modificación estructural es una modificación de la composición de bases.
Componentes de construcción de ARNm
Un ARNm puede ser un ARNm de origen natural o no natural. Un ARNm puede incluir una o más nucleobases, nucleósidos o nucleótidos modificados, como se describe a continuación, en cuyo caso puede denominarse un "ARNm modificado" o "ARNmm". Tal como se describe en el presente documento, "nucleósido" se define como un compuesto que contiene una molécula de azúcar (p. ej., una pentosa o ribosa) o derivado de la misma en combinación con una base orgánica (p. ej., una purina o pirimidina) o un derivado de la misma (también denominado en el presente documento como "nucleobase"). Tal como se describe en el presente documento, "nucleótido" se define como un nucleósido que incluye un grupo fosfato.
Un ARNm puede incluir una región 5' no traducida (5' UTR), una región 3' no traducida (3' UTR) y/o una región codificante (p. ej., un marco de lectura abierto). En la SEQ ID NO: 33 se muestra un ejemplo de 5' UTR para usar en las construcciones. Un ARNm puede incluir cualquier número adecuado de pares de bases, incluidas decenas (p. ej., 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100), cientos (p. ej., 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900) o miles (p. ej., 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000) de pares de bases. Cualquier número (p. ej., todos, algunos o ninguno) de nucleobases, nucleósidos o nucleótidos puede ser un análogo de una especie canónica, sustituido, modificado o de otra forma no natural. En ciertas realizaciones, se pueden modificar todos de un tipo de nucleobase particular.
En algunas realizaciones, un ARNm puede incluir una estructura de caperuza 5', un nucleótido de terminación de cadena, opcionalmente una secuencia de Kozak (también conocida como una secuencia de consenso de Kozak), un tallo-bucle, una secuencia poliA y/o una señal de poliadenilación.
Una estructura de caperuza 5' o especie de caperuza es un compuesto que incluye dos restos de nucleósidos unidos por un enlazador y puede seleccionarse de una caperuza de origen natural, una caperuza de origen no natural o análogo de caperuza o un análogo de caperuza anti-inverso (ARCA). Una especie de caperuza puede incluir uno o más nucleósidos modificados y/o restos enlazadores. Por ejemplo, una caperuza de ARNm natural puede incluir un nucleótido de guanina y un nucleótido de guanina (G) metilados en la posición 7 unidos por un enlace trifosfato en sus posiciones 5', por ejemplo, m7G(5')ppp(5')G, comúnmente escrito como m7GpppG. Una especie de caperuza también puede ser un análogo de caperuza anti-inverso. Una lista no limitante de posibles especies de caperuza incluye m7GpppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m2703'GpppG, m2703'GppppG, m2702'GppppG, m7Gpppm7G, m73'dGpppG, m2703'GpppG, m703'GppppG y m2703'GppppG.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente un nucleósido de terminación de la cadena. Por ejemplo, un nucleósido de terminación de la cadena puede incluir aquellos nucleósidos desoxigenados en las posiciones 2' y/o 3' de su grupo azúcar. Dichas especies pueden incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina y 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina y 2',3'-didesoxitimina. La incorporación de un nucleótido de terminación de cadena en un ARNm, por ejemplo en el extremo 3', puede dar como resultado la estabilización del ARNm, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente internacional N.° WO 2013/103659.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente un tallo-bucle, tal como un tallo-bucle de histona. Un tallobucle puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más pares de bases de nucleótidos. Por ejemplo, un tallo-bucle puede incluir 4, 5, 6, 7 u 8 pares de bases de nucleótidos. Un tallo-bucle puede estar situado en cualquier región de un ARNm. Por ejemplo, un tallo-bucle puede estar situado en, antes o después de una región no traducida (una región no traducida 5' o una región no traducida 3'), una región codificante o una secuencia o cola poliA. Un tallo-bucle puede afectar a una o más funciones de un ARNm, tales como el inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción y/o la terminación de la transcripción.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente una secuencia de poliA y/o señal de poliadenilación. Una secuencia de poliA puede estar compuesta en su totalidad o en su mayor parte por nucleótidos de adenina o análogos o derivados de los mismos. Una secuencia de poliA puede ser una cola situada adyacente a una región no traducida 3' de un ARNm.
Una secuencia de poliA puede afectar a la exportación nuclear, traducción y/o estabilidad de un ARNm.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente un sitio de unión a microARN.
Un ARNm es un ARNm bicistrónico que comprende una primera región codificante y una segunda región codificante con una secuencia intermedia que comprende una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que permite el inicio de la traducción interna entre la primera y la segunda región codificante, o con una secuencia intermedia que codifica un péptido de autoescisión, tal como un péptido 2A. Las secuencias IRES y los péptidos 2A se usan típicamente para mejorar la expresión de múltiples proteínas del mismo vector. Una variedad de secuencias IRES son conocidas y están disponibles en la técnica y pueden usarse, incluyendo, p. ej., el IRES del virus de la encefalomiocarditis.
5' UTR e Inicio de la traducción
El polinucleótido (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido de la presente descripción comprende una 5' UTR y una secuencia de inicio de la traducción. Las 5' UTR naturales comprenden secuencias implicadas en el inicio de la traducción. Por ejemplo, las secuencias de Kozak comprenden 5' UTR naturales y se sabe que están implicadas normalmente en el proceso por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. También se sabe que las 5' UTR forman estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de elongación.
Mediante la modificación de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los polinucleótidos de la descripción. Por ejemplo, la introducción de 5' UTR de ARNm que se sabe que está regulado por aumento en cánceres, tales como c-myc, podría usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, tal como un polinucleótido, en células cancerosas. Las regiones no traducidas útiles en el diseño y la fabricación de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la publicación de patente internacional N.° WO 2014/164253 (véase también, US20160022840).
En la Tabla 2 se muestra una lista de 5' UTR de ejemplo. Pueden utilizarse variantes de 5' UTR en donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.
Tabla 2: 5' UTR de ejemplo
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También pueden usarse otras secuencias que no sean UTR como regiones o subregiones dentro de los polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones en regiones de los polinucleótidos. La incorporación de secuencias intrónicas puede aumentar la producción de proteínas así como los niveles de polinucleótidos.
Las combinaciones de características pueden incluirse en regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una 5' UTR que puede contener una señal fuerte de inicio de la traducción de Kozak y/o una 3' UTR que puede incluir una secuencia oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola poli-A. Una UTR en 5' puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido del mismo y/o de genes diferentes, tales como las 5' Ut R descritas en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2010-0293625.
Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en el transcrito del que se seleccionaron o pueden alterarse en orientación o localización. Por lo tanto, una 5' UTR o 3' puede invertirse, acortarse, alargarse, prepararse con una o más de otras 5' UTR o 3' UTR.
En algunas realizaciones, las secuencias UTR se pueden cambiar de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una 3' o 5' UTR puede alterarse con respecto a una UTR de tipo natural o nativa por el cambio en la orientación o localización como se ha enseñado anteriormente o puede alterarse por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprende una UTR variante.
Se puede utilizar una UTR, tal como una 5' o 3', doble, triple o cuádruple. Como se usa en el presente documento, una UTR "doble" es aquella en la que dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una 3' UTR doble de beta-globina como se describe en la publicación de solicitud de patente de e E. UU. 2010-0129877.
Las regiones flanqueantes pueden ser heterólogas. La región no traducida 5' puede derivar de una especie diferente que la región no traducida 3'. La región no traducida también puede incluir elementos potenciadores de la traducción (TEE). Como ejemplo no limitante, el TEE puede incluir los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2009-0226470.
En otra realización, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR, en donde la secuencia de nucleótidos de la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 33. En otra realización, la descripción proporciona un ARNm, como se define en las reivindicaciones, que comprende una 5' UTR, en donde la secuencia de nucleótidos de la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 34.
3' UTR y los elementos ricos en AU
El polinucleótido (es decir, el ARNm), como se define en las reivindicaciones y que codifica un polipéptido, comprende además una 3' UTR. La 3' UTR es la sección de ARNm que sigue inmediatamente al codón de terminación de la traducción y, a menudo, contiene regiones reguladoras que influyen postranscripcionalmente en la expresión génica. Las regiones reguladoras dentro de la 3' UTR pueden influir en la poliadenilación, eficiencia de la traducción, localización y estabilidad del ARNm. La 3' UTR útil para la descripción puede comprender un sitio de unión para proteínas reguladoras o microARN. La 3' UTR puede tener una región silenciadora, que se une a proteínas represoras e inhibe la expresión del ARNm. La 3' UTR puede comprender un elemento rico en AU. Las proteínas se unen a los ARE para afectar a la estabilidad o la velocidad de descomposición de los transcritos de manera localizada o afectar al inicio de la traducción. En otras realizaciones la 3' UTR comprende la secuencia AAUAAA que dirige la adición de varios cientos de restos de adenina llamados la cola poli(A) al final del transcrito de ARNm.
La tabla 3 muestra una lista de regiones no traducidas 3' útiles para los ARNm que codifican un polipéptido. Pueden utilizarse variantes de las 3' UTR en donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.
Tabla 3: Regiones no traducidas 3' de ejemplo
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La secuencia 3' UTR útil para la descripción puede comprender una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 497-515 y cualquier combinación de las mismas. La secuencia 3' UTR puede comprender además un sitio de unión de miARN, p. ej., el sitio de unión de miR-122. Una secuencia 3' UTR útil para la descripción puede comprender la 3'UTR-018 (SEQ ID NO: 514).
La secuencia 3' UTR puede comprender uno o más sitios de unión de miARN, p. ej., sitios de unión de miR-122, o cualquier otra secuencia de nucleótidos heteróloga en el mismo, sin alterar la función de la 3' UTR. En la Tabla 4B se indican algunos ejemplos de secuencias de 3' UTR que comprenden un sitio de unión de miARN.
T l 4 ' TR m l n i i ni n miAR
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La secuencia 3' UTR útil para la descripción puede comprender una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente t90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 514 o 515.
Regiones que tienen una caperuza 5'
El polinucleótido que comprende un ARNm, como se define en las reivindicaciones y que codifica un polipéptido de la presente descripción, puede comprender además una caperuza 5'. La caperuza 5' útil para el ARNm que codifica el polipéptido puede unirse a la proteína de unión a la caperuza del ARNm (CBP), aumentando así la estabilidad del ARNm. La caperuza puede ayudar además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el corte y empalme del ARNm.
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de la presente descripción puede comprender una estructura de caperuza no hidrolizable que evita la eliminación de la caperuza y, por lo tanto, aumenta la semivida del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la caperuza requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de formación de la caperuza. Por ejemplo, se puede usar una enzima de formación de caperuza de Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de a-tio-guanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la caperuza 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y seleno-fosfato.
La caperuza 5' puede comprender la 2'-O-metilación de los azúcares de ribosa de los nucleótidos 5'-terminales y/o 5'-anteterminales en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. Las caperuzas para el ARNm que codifica el polipéptido incluyen análogos de caperuza, que en la presente invención también se denominan análogos de caperuza sintéticos, caperuzas químicas, análogos de caperuzas químicas o análogos de caperuzas estructurales o funcionales, que difieren de las caperuzas 5' naturales (es decir endógenas, de tipo natural o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de la caperuza. Los análogos de caperuza pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/o unirse a los polinucleótidos de la descripción. Los ARNm de la invención se definen en las reivindicaciones.
Por ejemplo, la caperuza análogo de caperuza anti-inverso (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, en donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse de manera equivalente 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, queda unido al nucleótido 5' terminal del polinucleótido con caperuza. La guanina N7 y 3'-O-metilada proporciona el resto terminal del polinucleótido con caperuza.
Otra caperuza ilustrativa es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).
La caperuza puede ser un análogo de caperuza dinucleótido. Como ejemplo no limitante, el análogo de caperuza dinucleótido puede estar modificado en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato, tal como los análogos de caperuza dinucleótidos descritos en la patente de EE. UU. N.° 8,519,110.
La caperuza puede ser un análogo de caperuza que es una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza incluyen un análogo de caperuza N7-(4-clorofenoxietil)-G(5')ppp(5')G y N7-(4-clorofenoxietil)-m3'-0G(5')ppp(5')G. Véase, p. ej., los diversos análogos de caperuza y los métodos para sintetizar análogos de caperuza descritos en Kore et al. (2013) Bioorganic & Medicinal Chemistry 21: 4570-4574. Un análogo de caperuza de la presente descripción puede ser un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.
Si bien los análogos de caperuza permiten la formación concomitante de una caperuza en un polinucleótido o una región del mismo, en una reacción de transcripción in vitro, hasta 20% de los transcritos permanecen sin caperuza. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de caperuza de una estructura endógena de caperuza 5' de ácidos nucleicos producidos por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y a una estabilidad celular reducida.
Un ARNm de la presente descripción, como se define en las reivindicaciones, también puede formar la caperuza después de la fabricación (ya sea IVT o síntesis química), utilizando enzimas, con el fin de generar estructuras de caperuza 5' más auténticas. Tal y como se usa en el presente documento, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja estrechamente o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo natural. Es decir, una característica "más auténtica" representa mejor una función y/o estructura celular endógena, de tipo natural, natural o fisiológica en comparación con características o análogos sintéticos, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo natural, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos.
Los ejemplos no limitantes de estructuras de caperuza 5' más auténticas de la presente descripción son aquellos que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la caperuza, semivida aumentada, susceptibilidad reducida a las 5' endonucleasas y/o eliminación de la caperuza 5' reducida, en comparación con las estructuras de caperuza 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de caperuza 5' de tipo natural, natural o fisiológica). Por ejemplo, la enzima de formación de caperuza del virus vaccinia recombinante y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5' terminal de un polinucleótido y un nucleótido de caperuza de guanina en donde la caperuza de guanina contiene una metilación en N7 y el nucleótido 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Dicha estructura se denomina estructura Cap1. Esta caperuza da como resultado una mayor competencia de traducción y estabilidad celular y una activación reducida de citoquinas proinflamatorias celulares, en comparación, p. ej., con otras estructuras análogas de caperuza 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1) y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2).
Según la presente descripción, las caperuzas 5' terminales pueden incluir caperuzas endógenas o análogos de caperuza. Según la presente descripción, una caperuza 5' terminal puede comprender un análogo de guanina. Los análogos de guanina útiles incluyen, pero no se limitan a, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoroguanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.
Colas de poli-A
Un polinucleótido que comprende un ARNm, como se define en las reivindicaciones y que codifica un polipéptido de la presente descripción, puede comprender además una cola poli-A. Se pueden incorporar grupos terminales en la cola poli-A para la estabilización. Una cola poli-A comprende colas des-3'-hidroxilo. Las colas poli-A útiles también pueden incluir restos estructurales o modificaciones de 2'-Ometilo como enseñan Li et al. (2005) Current Biology 15:1501-1507.
La longitud de una cola poli-A, cuando está presente, puede ser mayor de 30 nucleótidos de longitud. La cola poli-A puede ser mayor de 35 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000 nucleótidos).
El polinucleótido o región del mismo puede incluir de aproximadamente 30 a aproximadamente 3.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1.000, de 30 a 1.500, de 30 a 2.000, de 30 a 2.500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1.000, de 50 a 1.500, de 50 a 2.000, de 50 a 2.500, de 50 a 3.000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1.000, de 100 a 1.500, de 100 a 2.000, de 100 a 2.500, de 100 a 3.000, de 500 a 750, de 500 a 1.000, de 500 a 1.500, de 500 a 2.000, de 500 a 2.500, de 500 a 3.000, de 1.000 a 1.500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 2.500, de 1.000 a 3.000, de 1.500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).
La cola poli-A se puede diseñar en relación con la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región particular del polinucleótido. Este diseño puede basarse en la longitud de una región codificante, la longitud de una característica o región particular o basarse en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos.
En este contexto, la cola poli-A puede tener una longitud 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% mayor que la del polinucleótido o característica del mismo. La cola poli-A también puede diseñarse como una fracción de los polinucleótidos a los que pertenece. En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la longitud total de la construcción, una región de la construcción o la longitud total de la construcción menos la cola poli-A. Además, los sitios de unión modificados y la conjugación de polinucleótidos para proteína de unión a poli-A pueden mejorar la expresión.
Además, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir entre sí mediante la PABP (proteína de unión a poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola poli-A. Los experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.
Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden diseñar para incluir una región de poliA-cuarteto de G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que puede formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En esta realización, el cuarteto G se incorpora al final de la cola poli-A. El polinucleótido resultante se somete a ensayo en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluida la semivida en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el poliA-cuarteto de G da como resultado una producción de proteínas a partir de un ARNm equivalente a al menos 75% de la observada usando una cola poli-A de 120 nucleótidos sola.
Región de codón de inicio
Un ARNm de la presente descripción, como se define en las reivindicaciones, puede comprender regiones que son análogas o funcionan como una región de codón de inicio.
La traducción de un polinucleótido se puede iniciar en un codón que no es el codón de inicio AUG. La traducción del polinucleótido puede iniciarse en un codón de inicio alternativo tal como, pero no limitado a, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATAAUA, ATT/AUU, TTG/UUG. Véase, Touriol et al. (2003) Biology of the Cell 95:169-178 y Matsuda y Mauro (2010) PLoS ONE 5:11. Como ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitante, la traducción de polinucleótidos comienza en el codón de inicio alternativo CTG o CUG. Como otro ejemplo no limitante más, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo GTG o GUG.
Se sabe que los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción, tales como, pero no limitados a, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo, afectan a la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido. Véase, p. ej., Matsuda y Mauro (2010) PLoS ONE 5:11. El enmascaramiento de cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción puede usarse para alterar la posición de inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura de un polinucleótido.
Se puede usar un agente de enmascaramiento cerca del codón de inicio o codón de inicio alternativo con el fin de enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de inicio de la traducción en el codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo. Los ejemplos no limitantes de agentes de enmascaramiento incluyen polinucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) antisentido y complejos de unión de exón (EJC). Véase, p. ej., Matsuda y Mauro (2010) PLoS ONE 5:11, que describen agentes de enmascaramiento polinucleótidos LNA y EJC.
Se puede usar un agente de enmascaramiento para enmascarar un codón de inicio de un polinucleótido con el fin de aumentar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio alternativo. Se puede usar un agente de enmascaramiento para enmascarar un primer codón de inicio o codón de inicio alternativo con el fin de aumentar la posibilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio o codón de inicio alternativo secuencia abajo del codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo.
Un codón de inicio o codón de inicio alternativo está situado dentro de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR. El complemento perfecto de un sitio de unión de miR puede ayudar a controlar la traducción, longitud y/o estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como ejemplo no limitante, el codón de inicio o codón de inicio alternativo está situado en el medio de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR-122. El codón de inicio o codón de inicio alternativo puede estar situado después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido, decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.
El codón de inicio de un polinucleótido se puede eliminar de la secuencia polinucleotídica con el fin de que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no es el codón de inicio. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón que sigue al codón de inicio eliminado o en un codón de inicio secuencia abajo o un codón de inicio alternativo. En un ejemplo no limitante, el codón de inicio ATG o AUG se elimina como los primeros 3 nucleótidos de la secuencia de polinucleótido con el fin de que se inicie la traducción en un codón de inicio secuencia abajo o un codón de inicio alternativo. La secuencia de polinucleótido donde se eliminó el codón de inicio puede comprender además al menos un agente de enmascaramiento para el codón de inicio secuencia abajo y/o codones de inicio alternativos para controlar o intentar controlar el inicio de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.
Región de codón de terminación
Un ARNm de la presente descripción, como se define en las reivindicaciones, puede comprender además al menos un codón de terminación o al menos dos codones de terminación antes de la región no traducida (UTR) 3'. El codón de terminación se puede seleccionar de entre UGA, UAA y UAG. Los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir el codón de terminación UGA y un codón de terminación adicional. El codón de terminación adicional puede ser UAA. Los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir tres codones de terminación, cuatro codones de terminación o más.
ARNm modificados
Un ARNm de la descripción, como se define en las reivindicaciones, puede comprender una o más nucleobases, nucleósidos o nucleótidos modificados (denominados "ARNm modificados" o "ARNmm"). Los ARNm modificados pueden tener propiedades útiles, que incluyen estabilidad mejorada, retención intracelular, traducción mejorada y/o la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduce el ARNm, en comparación con un ARNm no modificado de referencia. Por lo tanto, el uso de ARNm modificados puede mejorar la eficacia de la producción de proteínas, la retención intracelular de ácidos nucleicos, así como poseer una inmunogenicidad reducida.
En consecuencia, en algunas realizaciones, un ARNm descrito en el presente documento comprende una modificación, como se define en las reivindicaciones, en donde la modificación es la incorporación de uno o más nucleótidos modificados químicamente. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos modificados químicamente se incorporan en el codón de iniciación del ARNm y funcionan para aumentar la afinidad de unión entre el codón de iniciación y el anticodón del Met-tRNAiMet iniciador. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados químicamente son 2-tiouridina. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados químicamente son 2'-O-metil-2-tiouridina. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados químicamente son 2-selenouridina. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados químicamente son 2'-O-metil-ribosa. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados químicamente se seleccionan de un ácido nucleico bloqueado, inosina, 2-metilguanosina o 6-metiladenosina. En algunas realizaciones, los desoxirribonucleótidos se incorporan al ARNmm. Los ARNm de la invención y las modificaciones se definen en las reivindicaciones.
Un ARNmm de la descripción puede incluir cualquier número adecuado de pares de bases, incluidas decenas (p. ej., 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100), cientos (p. ej., 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900) o miles (p. ej., 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000) de pares de bases. Cualquier número (p. ej., todos, algunos o ninguno) de nucleobases, nucleósidos o nucleótidos puede ser un análogo de una especie canónica, sustituido, modificado o de otra forma no natural. En ciertas realizaciones, se pueden modificar todos de un tipo de nucleobase particular.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente un nucleósido de terminación de la cadena. Por ejemplo, un nucleósido de terminación de la cadena puede incluir aquellos nucleósidos desoxigenados en las posiciones 2' y/o 3' de su grupo azúcar. Dichas especies pueden incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina y 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina y 2',3'-didesoxitimina. La incorporación de un nucleótido de terminación de cadena en un ARNm, por ejemplo en el extremo 3', puede dar como resultado la estabilización del ARNm, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente internacional N.° WO 2013/103659.
Un ARNm puede incluir en su lugar o adicionalmente un tallo-bucle, tal como un tallo-bucle de histona. Un tallobucle puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más pares de bases de nucleótidos. Por ejemplo, un tallo-bucle puede incluir 4, 5, 6, 7 u 8 pares de bases de nucleótidos. Un tallo-bucle puede estar situado en cualquier región de un ARNm. Por ejemplo, un tallo-bucle puede estar situado en, antes o después de una región no traducida (una región no traducida 5' o una región no traducida 3'), una región codificante o una secuencia o cola poliA. En algunas realizaciones, un tallo-bucle puede afectar a una o más funciones de un ARNm, tales como el inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción y/o la terminación de la transcripción.
Se conocen numerosos enfoques para la modificación química del ARNm para mejorar la eficiencia de la traducción y reducir la inmunogenicidad, que incluyen modificaciones en la caperuza 5', 5' y 3' UTR, el marco de lectura abierto y la cola poli(A) (Sahin et al., (2014) Nat Rev Drug Discovery 13:759-780). Por ejemplo, se mostró que el ARNm modificado con pseudouridina (y ) aumentaba la expresión de la eritropoyetina codificada (Kariko et al., (2012) Mol Ther 20:948-953). Se mostró que una combinación de 2-tiouridina (s2U) y 5-metilcitidina (5meC) en ARNm modificados extendía la expresión de la proteína codificada (Kormann et al., (2011) Nat Biotechnol 29: 154-157). Un estudio reciente demostró la inducción de la regeneración vascular utilizando ARNm modificado (5meC y y ) que codifica factor de crecimiento endotelial vascular humano (Zangi et al., (2013) Nat Biotechnol 31:898-907). Estos estudios demuestran la utilidad de incorporar nucleótidos modificados químicamente para lograr la optimización estructural y funcional del ARNm.
Un ARNm puede incluir una o más (p. ej., 1, 2, 3 o 4) nucleobases, nucleósidos o nucleótidos modificados diferentes. Un ARNm puede incluir uno o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más) nucleobases, nucleósidos o nucleótidos modificados diferentes. El ARNm modificado puede tener una degradación reducida en una célula en la que se introduce el ARNm, respecto a un ARNm no modificado correspondiente.
La nucleobase modificada es un uracilo modificado. Nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (S2U), 4-tio-uridina (S4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina (hoAU), 5-aminoalil-uridina, 5-halo-uridina (p. ej., 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), 3-metil-uridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), ácido uridina-5-oxiacético (cmo5U), éster metílico del ácido uridina-5-oxiacético (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uridina (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina (cmnm5S2U), 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometilpseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina(Tm5S2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, es decir, que tiene la nucleobase desoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1Y), 5-metil-2-tio-uridina (m5S2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1S4Y), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metilpseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tio-dihidrouridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tiouridina (inm5S2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (Ym), 2-tio-2'-O-metil-uridina (S2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uridina, desoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil) uridina y 5-[3-(1-E-propenilamino)]uridina.
La nucleobase modificada puede ser una citosina modificada. Nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej. 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tio-citidina (S2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1 -metilpseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metilcitidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, lisidina (k2C), a-tio-citidina, 2'-O-metilcitidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f®Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1 -tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina y 2'-OH-ara-citidina.
La nucleobase modificada puede ser una adenina modificada. Nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen □-tio-adenosina, 2-amino-purina, 2 , 6-diaminopurina, 2 -amino-6-halopurina (p. ej., 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (p. ej., 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azidoadenosina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-aza-adenina, 7-desaza-2-amino-purina, 7-desaza-8-aza-2-aminopurina, 7-desaza-2,6-diaminopurina, 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metiladenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoiladenosina (f6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina (Am), N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2'-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-OH-araadenosina, y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.
La nucleobase modificada puede ser una guanina modificada. Nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen □-tio-guanosina, inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OhyW), hidroxiwibutosina submodificada (OhyW*), 7-desaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosil-queuosina (galQ), manosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-desazaguanosina (preQo), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQi), archaeosina (G+), 7-desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6-tio-7-desaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina (m7G), 6- tio-7-metil-guanosina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metil-guanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m27G), N2, N2,7-dimetil-guanosina (m227G), 8-oxoguanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tioguanosina, a-tio-guanosina, 2'-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m27Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1Im), 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)), 1 -tioguanosina, O6-metil-guanosina, 2'-F-ara-guanosina, y 2'-F-guanosina.
Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
La nucleobase modificada puede ser pseudouridina (y ), N1-metilpseudouridina (m1^ ), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina o 2'-O-metil-uridina. Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
La nucleobase modificada puede ser una citosina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos de ejemplo que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (acAC), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C) y 2-tio-5-metilcitidina. Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
La nucleobase modificada puede ser una adenina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A) y N6-metil-adenosina (m6A). Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
La nucleobase modificada puede ser guanina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQo), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQ-i), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina. Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
La nucleobase modificada puede ser 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina o a-tio-adenosina. Un ARNm de la descripción puede incluir una combinación de una o más de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente (p. ej., una combinación de 2, 3 o 4 de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente).
En algunas realizaciones, el ARNm comprende pseudouridina (y ). El ARNm puede comprender pseudouridina (Y) y 5-metil-citidina (m5C). El ARNm puede comprender 1-metil-pseudouridina (m1^ ). El ARNm puede comprender 1-metil-pseudouridina (m1^ ) y 5-metil-citidina (m5C). El ARNm puede comprender 2-tiouridina (s2U). El ARNm puede comprender 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). El ARNm puede comprender 5-metoxiuridina (mo5U). El ARNm puede comprender 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). El ARNm puede comprender 2'-O-metil-uridina. El ARNm puede comprender 2'-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). El ARNm puede comprender N6-metil-adenosina (m6A). El ARNm puede comprender N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).
En ciertas realizaciones, un ARNm de la descripción está uniformemente modificado (es decir, completamente modificado, modificado a lo largo de toda la secuencia) para una modificación particular, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un ARNm se puede modificar uniformemente con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los restos citosina en la secuencia de ARNm con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, los ARNm de la descripción se pueden modificar uniformemente para cualquier tipo de resto nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un resto modificado tal como los expuestos anteriormente.
Un ARNm de la descripción puede modificarse en una región codificante (p. ej., un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido). Un ARNm puede modificarse en regiones al lado de una región codificante. Por ejemplo, se describen una 5' UTR y/o una 3' UTR, en donde una o ambas pueden contener independientemente una o más modificaciones de nucleósidos diferentes. Las modificaciones de nucleósidos también pueden estar presentes en la región codificante.
Los ejemplos de modificaciones de nucleósidos y combinaciones de las mismas que pueden estar presentes en los ARNmm de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a los descritos en las publicaciones de solicitud de patente PCT: WO2012045075, WO2014081507, WO2014093924, WO2014164253 y WO2014159813.
Los ARNmm de la descripción pueden incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase y/o el enlace internucleósidos. Estas combinaciones pueden incluir una cualquiera o más modificaciones descritas en el presente documento.
Los ejemplos de nucleósidos modificados y combinaciones de nucleósidos modificados se proporcionan a continuación en la Tabla 5 y la Tabla 6. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los ARNmm de la descripción. Los nucleósidos modificados pueden sustituir parcial o completamente a los nucleótidos naturales de los ARNm de la descripción. Como ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede sustituirse con un nucleósido modificado descrito en el presente documento. En otro ejemplo no limitante, el nucleósido natural uridina puede ser parcialmente sustituido (p. ej., aproximadamente 0,1%, 1 %, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99,9% de las uridinas naturales) por al menos uno de los nucleósidos modificados descritos en el presente documento. Los ARNm de la invención se definen en las reivindicaciones.
Tabla 5: Combinaciones de modificaciones de nucleósidos
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Tabla 6: Nucleósidos modificados y combinaciones de los mismos
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Según la descripción, los polinucleótidos de la descripción pueden sintetizarse para comprender las combinaciones o modificaciones individuales de la Tabla 5 o la Tabla 6.
Cuando se indica una sola modificación, el nucleósido o nucleótido indicado representa el 100 por cien de ese nucleótido o nucleósido de A, U, G o C que se ha modificado. Cuando se indican porcentajes, estos representan el porcentaje de ese trifosfato de nucleobase A, U, G o C particular de la cantidad total de trifosfato A, U, G o C presente. Por ejemplo, la combinación: 25% 5-Aminoalil-CTP 75% CTP/ 25% 5-Metoxi-UTP 75% UTP se refiere a un polinucleótido donde el 25% de los trifosfatos de citosina son 5-Aminoalil-CTP mientras que el 75% de las citosinas son CTP; mientras que el 25% de los uracilos son 5-metoxi-UTP mientras que el 75% de los uracilos son UTP. Cuando no se indica UTP modificado, entonces se utiliza ATP, UTP, GTP y/o CTP de origen natural en el 100% de los sitios de esos nucleótidos que se encuentran en el polinucleótido. En este ejemplo, todos los nucleótidos de GTP y ATP se dejan sin modificar.
Los ARNm de la presente descripción, o regiones de los mismos, pueden tener codones optimizados. Los métodos de optimización de codones son conocidos en la técnica y pueden ser útiles para una variedad de propósitos: hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos hospedantes para garantizar el plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones de repetición en tándem o los desplazamientos de bases que pueden alterar la construcción o expresión de genes, personalizar regiones de control transcripcional y traduccional, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/añadir sitios de modificación postraduccional en proteínas codificadas (p. ej., sitios de glicosilación), añadir, eliminar o barajar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar los sitios de unión al ribosoma y los sitios de degradación del ARNm, ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen correctamente o reducir o eliminar las estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica; los ejemplos no limitantes incluyen servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o métodos patentados. La secuencia de ARNm se optimiza utilizando algoritmos de optimización, p. ej., para optimizar la expresión en células de mamíferos o mejorar la estabilidad del ARNm.
La presente descripción incluye polinucleótidos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento.
Los ARNm de la presente descripción se pueden producir por medios disponibles en la técnica, incluidos, pero no limitados transcripción in vitro (IVT) y métodos sintéticos. Pueden utilizarse métodos enzimáticos (IVT), en fase sólida, en fase líquida, sintéticos combinados, síntesis de regiones pequeñas y métodos de ligadura. Los ARNm se pueden hacer usando métodos de síntesis enzimática IVT. Los métodos para producir polinucleótidos por IVT se conocen en la técnica y se describen en la solicitud internacional PCT/US2013/30062. Por consiguiente, la presente descripción también incluye polinucleótidos, p. ej., ADN, construcciones y vectores que pueden usarse para transcribir in vitro un ARNm descrito en el presente documento.
Las nucleobases modificadas no naturales pueden introducirse en polinucleótidos, p. ej., ARNm, durante la síntesis o después de la síntesis. Las modificaciones pueden estar en enlaces internucleósidos, bases purina o pirimidina, o azúcar. La modificación puede introducirse en el extremo de una cadena de polinucleótido o en cualquier otro lugar de la cadena de polinucleótido; con síntesis química o con una enzima polimerasa. Ejemplos de ácidos nucleicos modificados y su síntesis se describen en la solicitud PCT N.° PCT/US2012/058519. La síntesis de polinucleótidos modificados también se describe en Verma y Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998).
Se pueden usar métodos de ligación enzimáticos o químicos para conjugar polinucleótidos o sus regiones con diferentes restos funcionales, tales como agentes de direccionamiento o administración, marcadores fluorescentes, líquidos, nanopartículas, etc. Los conjugados de polinucleótidos y polinucleótidos modificados se revisan en Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990).
Sitios de unión de microARN (miARN)
Los polinucleótidos de la descripción pueden incluir elementos reguladores, por ejemplo, sitios de unión de microARN (miARN), sitios de unión de factores de transcripción, secuencias y/o motivos de ARNm estructurados, sitios de unión artificiales diseñados para actuar como pseudorreceptores para moléculas de unión de ácidos nucleicos endógenos, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que incluyen dichos elementos reguladores se mencionan como que incluyen "secuencias sensoras". Los ejemplos no limitantes de secuencias sensoras se describen en la publicación de EE. UU.
2014/0200261.
Un polinucleótido (es decir, un ácido ribonucleico (ARN), es decir, un ARN mensajero (ARNm)) de la descripción, como se define en las reivindicaciones, puede comprender un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de interés y además comprende uno o más sitios de unión de miARN. La inclusión o incorporación de sitio(s) de unión de miARN proporciona la regulación de los polinucleótidos de la descripción y, a su vez, de los polipéptidos codificados por los mismos, basándose en la expresión específica de tejido y/o específica de tipo celular de miARN de origen natural.
Un miARN, p. ej., un miARN de origen natural, es un ARN no codificante de 19-25 nucleótidos de longitud que se une a un polinucleótido y regula por disminución la expresión génica ya sea reduciendo la estabilidad o inhibiendo la traducción del polinucleótido. Una secuencia de miARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-8 del miARN maduro. Una semilla de miARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 del miARN maduro. En algunas realizaciones, una semilla de miARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-8 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión de miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. Una semilla de miARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-7 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión del miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol. Cell. 6 de julio de 2007;27(1 ):91 -105. Puede realizarse un perfil de miARN de las células o tejidos diana para determinar la presencia o ausencia de miARN en las células o tejidos. Un polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (ARN), p. ej., un ARN mensajero (ARNm)) de la descripción puede comprender uno o más sitios de unión de microARN, secuencias diana de microARN, secuencias complementarias de microARN o secuencias complementarias de semilla de microARN. Dichas secuencias pueden corresponder a, p. ej., tener complementariedad con, cualquier microARN conocido, tal como los que se enseñan en la publicación de EE. UU. US2005/0261218 y Publicación de EE. UU. US2005/0059005.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión de microARN (miARN o miR)" se refiere a una secuencia dentro de un polinucleótido, p. ej., dentro de un ADN o dentro de un transcrito de ARN, incluyendo en la 5' UTR y/ o 3' UTR, que tiene suficiente complementariedad con la totalidad o una región de un miARN para interaccionar con, asociarse con o unirse al miARN. En algunas realizaciones, un polinucleótido de la descripción que comprende un ORF que codifica un polipéptido de interés y además comprende uno o más sitios de unión a miARN. En realizaciones de ejemplo, una 5' UTR y/ o 3' UTR del polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (ARN), p. ej., un ARN mensajero (ARNm)) comprende uno o más sitios de unión de miARN.
Un sitio de unión del miARN que tiene suficiente complementariedad con un miARN se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la regulación mediada por miARN de un polinucleótido, p. ej., represión traduccional o degradación del polinucleótido mediada por el miARN. Un sitio de unión del miARN que tiene suficiente complementariedad con el miARN se puede referir a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la degradación del polinucleótido mediada por miARN, p. ej., escisión de ARNm mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) guiado por miARN. El sitio de unión del miARN puede tener complementariedad, por ejemplo, con una secuencia de miARN de 19-25 nucleótidos, con una secuencia de miARN de 19-23 nucleótidos, o con una secuencia de miARN de 22 nucleótidos. Un sitio de unión de miARN puede ser complementario de solo una parte de un miARN, p. ej., de una parte de menos de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos de la longitud total de una secuencia de miARN de origen natural. Se prefiere la complementariedad total o completa (p. ej., la complementariedad total o la complementariedad completa frente a todo o una parte significativa de la longitud de un miARN de origen natural) cuando la regulación deseada es la degradación del ARNm.
Un sitio de unión de miARN puede incluir una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia semilla de miARN. El sitio de unión de miARN puede incluir una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia semilla de miARN.
Un sitio de unión de miARN puede incluir una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia de miARN. El sitio de unión de miARN puede incluir una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de miARN. Un sitio de unión de miARN puede tener una complementariedad completa con una secuencia de miARN, salvo por sustituciones, adiciones terminales y/o truncamientos de 1, 2 o 3 nucleótidos.
El sitio de unión de miARN puede tener la misma longitud que el miARN correspondiente. El sitio de unión de miARN puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce nucleótidos más corto que el miARN correspondiente en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. El sitio de unión de microARN puede ser dos nucleótidos más corto que el microARN correspondiente en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. Los sitios de unión de miARN que son más cortos que los miARN correspondientes aún son capaces de degradar el ARNm incorporando uno o más de los sitios de unión de miARN o evitando que el ARNm se traduzca.
El sitio de unión de miARN puede unirse al miARN maduro correspondiente que forma parte de un RISC activo que contiene Dicer. La unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente en el RISC degrada el ARNm que contiene el sitio de unión del miARN o impide que se traduzca el ARNm. El sitio de unión del miARN puede tener suficiente complementariedad con el miARN para que un complejo RISC que comprende el miARN escinda el polinucleótido que comprende el sitio de unión del miARN. El sitio de unión de miARN puede tener complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN induce inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión de miARN. El sitio de unión de miARN puede tener complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN reprime la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión de miARN.
El sitio de unión de miARN puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce discordancias con el miARN correspondiente.
El sitio de unión de miARN puede tener al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte, o al menos aproximadamente veintiún, respectivamente, nucleótidos contiguos del miARN correspondiente.
Mediante el diseño de uno o más sitios de unión de miARN en un polinucleótido de la descripción, el polinucleótido puede ser objetivo para una degradación o traducción reducida, siempre que el miARN en cuestión esté disponible. Esto puede reducir los efectos fuera de la diana después de la administración del polinucleótido. Por ejemplo, si un polinucleótido de la descripción no está destinado a ser administrado a un tejido o célula pero termina en dicho tejido o célula, entonces un miARN abundante en el tejido o célula puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o múltiples sitios de unión del miARN se modifican en la 5' UTR y/o 3' UTR del polinucleótido.
A la inversa, los sitios de unión de miARN se pueden eliminar de las secuencias de polinucleótidos en las que se encuentran de forma natural con el fin de aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, se puede eliminar un sitio de unión para un miARN específico de un polinucleótido para mejorar la expresión de proteínas en tejidos o células que contienen el miARN.
Un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un sitio de unión de miARN en la 5' UTR y/o 3' UTR con el fin de regular los productos terapéuticos de ARNm citotóxicos o citoprotectores para células específicas tales como, pero no limitado a, células normales y/o cancerosas. Un polinucleótido de la descripción puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más sitios de unión de miARN en la 5' UTR y/ o 3' UTR con el fin de regular productos terapéuticos de ARNm citotóxicos o citoprotectores para células específicas tales como, pero no limitado a, células normales y/o cancerosas.
La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr mediante la introducción o eliminación de uno o más sitios de unión de miARN, p. ej., uno o más sitios de unión de miARN distintos. La decisión de eliminar o insertar un sitio de unión de miARN se puede tomar basándose en los patrones de expresión de miARN y/o sus perfiles en tejidos y/o células en desarrollo y/o enfermedad. Se ha descrito la identificación de miARN, sitios de unión de miARN y sus patrones de expresión y la función en biología (p. ej., Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh, Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007129:1401-1414; Gentner y Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 y todas las referencias en los mismos).
Los miARN y sitios de unión de miARN pueden corresponder a cualquier secuencia conocida, incluyendo, pero no limitado a ejemplos descritos en las publicaciones de EE. UU. n.° 2014/0200261, 2005/0261218 y 2005/0059005. Los microARN y sitios de unión de microARN representativos de ejemplo se muestran en la Tabla 7.
T l Mi r AR i i ni n mi r AR r r n i
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Ejemplos de tejidos donde se sabe que los miARN regulan el ARNm y, por lo tanto, la expresión de proteínas incluyen, pero no se limitan a, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR-17-92, miR-126), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (let-7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales de pulmón (let-7, miR-133, miR-126).
Específicamente, se sabe que los miARN se expresan diferencialmente en las células inmunitarias (también llamadas células hematopoyéticas), tales como las células presentadoras de antígenos (APC) (p. ej., células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, células citolíticas naturales, etc. Los miARN específicos de células inmunitarias están implicados en la inmunogenicidad, la autoinmunidad, la respuesta inmunitaria a la infección, la inflamación, así como la respuesta inmunitaria no deseada después de la terapia génica y el trasplante de tejidos/órganos. Los microARN específicos de las células inmunitarias también regulan muchos aspectos del desarrollo, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis de las células hematopoyéticas (células inmunitarias). Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en células inmunitarias, particularmente abundantes en células dendríticas mieloides. Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria a un polinucleótido se puede detener añadiendo sitios de unión de miR-142 a la 3'-UTR del polinucleótido, lo que permite una transferencia de genes más estable en tejidos y células. miR-142 degrada de manera eficiente los polinucleótidos exógenos en células presentadoras de antígenos y suprime la eliminación citotóxica de las células transducidas (p. ej., Annoni A et al., blood, 2009,114,5152-5161; Brown BD, et al., Nat med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., blood, 2007, 110(13): 4144-4152).
Una respuesta inmunitaria mediada por antígeno puede referirse a una respuesta inmunitaria producida por antígenos extraños que, cuando entran en un organismo, son procesados por las células presentadoras de antígenos y presentados en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Las células T pueden reconocer el antígeno presentado e inducir una eliminación citotóxica de las células que expresan el antígeno.
La introducción de un sitio de unión de miR-142 en la 5'UTR y/o la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción puede reprimir selectivamente la expresión génica en células presentadoras de antígenos a través de la degradación mediada por miR-142, lo que limita la presentación de antígenos en células presentadoras de antígenos (p. ej., células dendríticas) y, por lo tanto, previene la respuesta inmunitaria mediada por antígeno después de la administración del polinucleótido. El polinucleótido después se expresa de forma estable en tejidos o células diana sin desencadenar la eliminación citotóxica.
Los sitios de unión para miARN que se sabe que se expresan en células inmunitarias, en particular, células presentadoras de antígenos, pueden diseñarse en un polinucleótido de la descripción para suprimir la expresión del polinucleótido en las células presentadoras de antígenos a través de la degradación del ARN mediada por miARN, debilitando la respuesta inmunitaria mediada por el antígeno. La expresión del polinucleótido se mantiene en células no inmunitarias donde no se expresan los miARN específicos de células inmunitarias. Por ejemplo, para prevenir una reacción inmunogénica contra una proteína específica del hígado, se puede eliminar cualquier sitio de unión de miR-122 y se puede diseñar un sitio de unión de miR-142 (y/o mirR-146) en la 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción.
Para impulsar aún más la degradación selectiva y la supresión en APC y macrófagos, un polinucleótido de la descripción puede incluir un elemento regulador negativo adicional en la 5'UTR y/o 3'UTR, ya sea solo o en combinación con sitios de unión de miR-142 y/o miR-146. Como ejemplo no limitante, un elemento regulador es un Elemento de Desintegración Constitutivo (CDE).
Los sitios de unión de miARN específicos de células madre embrionarias pueden incluirse o eliminarse de la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción para modular el desarrollo y/o diferenciación de células madre embrionarias, para inhibir la senescencia de células madre en una afección degenerativa (p. ej., enfermedades degenerativas), o para estimular la senescencia y la apoptosis de las células madre en un estado patológico (p. ej., células madre cancerosas).
Muchos estudios de expresión de miARN se llevan a cabo en la técnica para el perfilado de la expresión diferencial de miARN en diversas células cancerosas/tejidos y otras enfermedades. Algunos miARN son sobreexpresados de forma anormal en ciertas células cancerosas y otros son subexpresados.
Como ejemplo no limitante, los sitios de unión de miARN para miARN que son sobreexpresados en ciertas células cancerosas y/o tumorales pueden eliminarse de la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción, restaurando la expresión suprimida por los miARN sobreexpresados en células cancerosas, mejorando así la función biológica correspondiente, por ejemplo, estimulación y/o represión de la transcripción, detención del ciclo celular, apoptosis y muerte celular. Las células y los tejidos normales, en donde la expresión de los miARN no está regulada por aumento, no se verán afectados.
El miARN también puede regular procesos biológicos complejos tales como la angiogénesis (p. ej. miR-132) (Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polinucleótidos de la descripción, los sitios de unión de miARN que están implicados en dichos procesos pueden eliminarse o introducirse con el fin de adaptar la expresión de los polinucleótidos a tipos de células biológicamente relevantes o procesos biológicos relevantes. En este contexto, los polinucleótidos de la descripción se definen como polinucleótidos auxotróficos.
La ventana terapéutica y/o la expresión diferencial (p. ej., expresión específica de tejido) de un polipéptido de la descripción puede alterarse mediante la incorporación de un sitio de unión de miARN en un ARNm que codifica el polipéptido. En un ejemplo, un ARNm puede incluir uno o más sitios de unión de miARN a los que se unen miARN que tienen una mayor expresión en un tipo de tejido en comparación con otro. En otro ejemplo, un ARNm puede incluir uno o más sitios de unión de miARN a los que se unen miARN que tienen menor expresión en una célula cancerosa en comparación con una célula no cancerosa del mismo tejido de origen. Cuando está presente en una célula cancerosa que expresa niveles bajos de dicho miARN, el polipéptido codificado por el ARNm normalmente mostrará una mayor expresión.
Las células de cáncer de hígado (p. ej., células de carcinoma hepatocelular) normalmente expresan niveles bajos de miR-122 en comparación con las células de hígado normales. Por lo tanto, un ARNm que codifica un polipéptido que incluye al menos un sitio de unión de miR-122 (p. ej., en la 3'-UTR del ARNm) típicamente expresará niveles comparativamente bajos del polipéptido en células hepáticas normales y niveles comparativamente altos del polipéptido en células de cáncer de hígado.
Se puede insertar un sitio de unión de miARN en el polinucleótido de la descripción en cualquier posición del polinucleótido (p. ej., 5'UTR y/o 3'UTR). La 5'UTR puede comprender un sitio de unión de miARN. La 3'UTR puede comprender un sitio de unión de miARN. La 5'UTR y la 3'UTR pueden comprender un sitio de unión a miARN. El sitio de inserción en el polinucleótido puede estar en cualquier parte del polinucleótido siempre que la inserción del sitio de unión del miARN en el polinucleótido no interfiera con la traducción de un polipéptido funcional en ausencia del miARN correspondiente; y en presencia del miARN, la inserción del sitio de unión de miARN en el polinucleótido y la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del polinucleótido.
La regulación del gen del miARN puede estar influida por la secuencia circundante del miARN, tal como, pero no limitado a, la especie de la secuencia circundante, el tipo de secuencia (p. ej., heteróloga, homóloga, exógena, endógena o artificial), los elementos reguladores de la secuencia circundante y/o elementos estructurales en la secuencia circundante. En el miARN puede influir la 5'UTR y/o la 3'UTR. Como un ejemplo no limitante, una 3'UTR no humana puede aumentar el efecto regulador de la secuencia de microARN sobre la expresión de un polipéptido de interés en comparación con una 3'UTR humana del mismo tipo de secuencia.
Otros elementos reguladores y/o los elementos estructurales de la 5'UTR pueden influir en la regulación génica mediada por miARN. Un ejemplo de un elemento regulador y/o elemento estructural es un IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) estructurado en la 5'UTR, que es necesario para la unión de los factores de elongación traduccionales para iniciar la traducción de proteínas. La unión de EIF4A2 a este elemento estructurado secundariamente en la 5'-UTR es necesaria para la expresión génica mediada por miARN (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85). Los polinucleótidos de la descripción pueden incluir además esta 5'UTR estructurada para potenciar la regulación génica mediada por microARN.
Al menos un sitio de unión de miARN puede diseñarse en la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. En este contexto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o más sitios de unión de miARN pueden diseñarse en una 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. Por ejemplo, se pueden diseñar de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, 2 o 1 sitios de unión de miARN en la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. Los sitios de unión de miARN incorporados en un polinucleótido de la descripción pueden ser los mismos o pueden ser sitios de miARN diferentes. Una combinación de diferentes sitios de unión de miARN incorporados en un polinucleótido de la descripción puede incluir combinaciones en las que se incorpora más de una copia de cualquiera de los diferentes sitios de miARN. Los sitios de unión de miARN incorporados en un polinucleótido de la descripción pueden dirigirse al mismo tejido o a diferentes tejidos del cuerpo. Como un ejemplo no limitante, mediante la introducción de sitios de unión de miARN específicos de tejido, tipo de célula o enfermedad en la 3'-UTR de un polinucleótido de la descripción, puede reducirse el grado de expresión en tipos de células específicos (p. ej., hepatocitos, células mieloides, células endoteliales, células cancerosas, etc.).
Se puede diseñar un sitio de unión de miARN cerca del extremo 5' de la 3'UTR, aproximadamente a medio camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR y/o cerca del extremo 3' de la 3'UTR en un polinucleótido de la descripción. Como un ejemplo no limitante, un sitio de unión de miARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'UTR y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. Como un ejemplo no limitante, un sitio de unión de miARN puede diseñarse cerca del extremo 3' de la 3'UTR y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. Como otro ejemplo no limitante más, un sitio de unión de miARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'UTR y cerca del extremo 3' de la 3'UTR.
Una 3'UTR puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de unión de miARN. Los sitios de unión de miARN pueden ser complementarios de un miARN, secuencia semilla de miARN y/o secuencias de miARN que flanquean la secuencia semilla.
Un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incluir más de un sitio de miARN expresado en diferentes tejidos o diferentes tipos de células de un sujeto. Como un ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incluir miR-192 y miR-122 para regular la expresión del polinucleótido en el hígado y los riñones de un sujeto. Un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incluir más de un sitio de miARN para el mismo tejido.
La ventana terapéutica y/o la expresión diferencial asociada con el polipéptido codificado por un polinucleótido de la descripción se puede alterar con un sitio de unión de miARN. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido que proporciona una señal de muerte puede diseñarse para que sea más expresado en células cancerosas en virtud de la firma de miARN de esas células. Cuando una célula cancerosa expresa un nivel más bajo de un miARN en particular, el polinucleótido que codifica el sitio de unión para ese miARN (o esos miARN) sería expresado con un nivel mayor. Por lo tanto, el polipéptido que proporciona una señal de muerte desencadena o induce la muerte celular en la célula cancerosa. Las células vecinas no cancerosas, que albergan una mayor expresión del mismo miARN, estarían menos afectadas por la señal de muerte codificada, ya que el polinucleótido se expresaría en un nivel más bajo debido a los efectos de la unión del miARN al sitio de unión o "sensor" codificado en la 3'UTR. Por el contrario, las señales de supervivencia celular o citoprotectoras pueden ser enviadas a tejidos que contienen células cancerosas y no cancerosas donde un miARN tiene una mayor expresión en las células cancerosas, siendo el resultado una señal de supervivencia más baja para la célula cancerosa y una señal de supervivencia mayor para la célula normal. Pueden diseñarse y administrarse múltiples polinucleótidos que tengan diferentes señales basado en el uso de sitios de unión de miARN como se describe en el presente documento.
La expresión de un polinucleótido de la descripción se puede controlar incorporando al menos una secuencia sensora en el polinucleótido y formulando el polinucleótido para su administración. Como un ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción puede dirigirse a un tejido o célula incorporando un sitio de unión de miARN y formulando el polinucleótido en una nanopartícula lipídica que comprende un lípido catiónico, incluido cualquiera de los lípidos descritos en el presente documento.
Un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para una expresión más dirigida en tejidos, tipos de células o condiciones biológicas específicos basado en los patrones de expresión de los miARN en los diferentes tejidos, tipos de células o condiciones biológicas. A través de la introducción de sitios de unión de miARN específicos de tejido, se puede diseñar un polinucleótido de la descripción para la expresión de proteínas óptima en un tejido o célula, o en el contexto de una condición biológica.
Un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incorporar sitios de unión de miARN que tienen una identidad de 100% con las secuencias semilla de miARN conocidas o que tienen una identidad inferior a 100% con las secuencias semilla de miARN. Un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incorporar sitios de unión de miARN que tienen al menos: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con secuencias semilla de miARN conocidas. La secuencia semilla del miARN se puede mutar parcialmente para disminuir la afinidad de unión del miARN y, como tal, dar como resultado una modulación por disminución reducida del polinucleótido. En esencia, el grado de coincidencia o discordancia entre el sitio de unión de miARN y la semilla de miARN puede actuar como un reóstato para ajustar más finamente la capacidad del miARN para modular la expresión de proteínas. Además, la mutación en la región que no es semilla de un sitio de unión de miARN también puede afectar a la capacidad de un miARN para modular la expresión de proteínas.
Se puede incorporar una secuencia de miARN en el bucle de un tallo-bucle.
Se puede incorporar una secuencia semilla de miARN en el bucle de un tallo-bucle y se puede incorporar un sitio de unión de miARN en el tallo 5' o 3' del tallo-bucle.
Se puede incorporar un elemento potenciador de la traducción (TEE) en el extremo 5' del tallo de un tallo-bucle y se puede incorporar una semilla de miARN en el tallo del tallo-bucle. Se puede incorporar un TEE en el extremo 5' del tallo de un tallo-bucle, se puede incorporar una semilla de miARN en el tallo del tallo-bucle y se puede incorporar un sitio de unión de miARN en el extremo 3' del tallo o la secuencia después del tallo-bucle. La semilla de miARN y el sitio de unión de miARN pueden ser para secuencias de miARN iguales y/o diferentes.
La incorporación de una secuencia de miARN y/o una secuencia de TEE puede cambiar la forma de la región del tallo-bucle que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (véase p. ej, Kedde et al. "A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility". Nature Cell Biology. 2010).
La 5'-UTR de un polinucleótido de la descripción puede comprender al menos una secuencia de miARN. La secuencia de miARN puede ser, pero no se limita a, una secuencia de 19 o 22 nucleótidos y/o una secuencia de miARN sin la semilla.
La secuencia de miARN en la 5'UTR se puede usar para estabilizar un polinucleótido de la descripción descrito en el presente documento.
Puede usarse una secuencia de miARN en la 5'UTR de un polinucleótido de la descripción para disminuir la accesibilidad del sitio de iniciación de la traducción tal como, pero no limitado a un codón de inicio. Véase, p. ej., Matsuda et al., PLoS One. 201011 (5):e15057) que utilizaron oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos de unión de exones (EJC) alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones a Ug es 1) con el fin de disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG). Matsuda mostró que la alteración de la secuencia alrededor del codón de inicio con un LNA o EJC afectaba a la eficiencia, longitud y estabilidad estructural de un polinucleótido. Un polinucleótido de la descripción pueden comprender una secuencia de miARN, en lugar de la secuencia de LNA o EJC descrita por Matsuda et al, cerca del sitio de inicio de la traducción para disminuir la accesibilidad al sitio de inicio de la traducción. El sitio de inicio de la traducción puede ser anterior, posterior o dentro de la secuencia de miARN. Como un ejemplo no limitante, el sitio de inicio de la traducción puede encontrarse dentro de una secuencia de miARN tal como una secuencia semilla o sitio de unión. Como otro ejemplo no limitante, el sitio de inicio de la traducción puede encontrarse dentro de una secuencia de miR-122 tal como la secuencia semilla o el sitio de unión de mir-122.
Un polinucleótido de la descripción pueden incluir al menos un miARN con el fin de amortiguar la presentación de antígenos por las células presentadoras de antígenos. El miARN puede ser la secuencia de miARN completa, la secuencia semilla de miARN, la secuencia de miARN sin la semilla o una combinación de las mismas. Como un ejemplo no limitante, un miARN incorporado en un polinucleótido de la descripción puede ser específico del sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitante, un miARN incorporado en un polinucleótido de la descripción para amortiguar la presentación de antígenos es miR-142-3p.
Un polinucleótido de la descripción pueden incluir al menos un miARN para amortiguar la expresión del polipéptido codificado en un tejido o célula de interés. Como ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un sitio de unión de miR-122 con el fin de amortiguar la expresión de un polipéptido codificado de interés en el hígado. Como otro ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un sitio de unión de miR-142-3p, secuencia semilla de miR-142-3p, sitio de unión de miR-142-3p sin la semilla, sitio de unión de miR-142-5p, secuencia de semilla de miR-142-5p, sitio de unión de miR-142-5p sin la semilla, sitio de unión de miR-146, secuencia de semilla de miR-146 y/o sitio de unión de miR-146 sin la secuencia semilla.
Un polinucleótido de la descripción puede comprender al menos un sitio de unión de miARN en la 3'UTR con el fin de degradar selectivamente los productos terapéuticos de ARNm en las células inmunitarias para suavizar las reacciones inmunogénicas no deseadas provocadas por la administración terapéutica. Como ejemplo no limitante, el sitio de unión de miARN puede hacer que un polinucleótido de la descripción sea más inestable en las células presentadoras de antígenos. Los ejemplos no limitantes de estos miARN incluyen mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p y mir-146-3p.
Un polinucleótido de la descripción puede comprender al menos una secuencia de miARN en una región del polinucleótido que puede interaccionar con una proteína de unión a ARN.
El polinucleótido de la descripción (es decir, un ARN, es decir, un ARNm) puede comprender (i) una secuencia de nucleótidos de secuencia optimizada (p. ej., un ORF) y (ii) un sitio de unión de miARN (p. ej., un sitio de unión de miARN que se une a miR-142).
El polinucleótido de la descripción puede comprender una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido descrito en el presente documento y un sitio de unión de miARN descrito en el presente documento, p. ej., un sitio de unión de miARN que se une a miR-142 o miR-122. La secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido puede comprender al menos una nucleobase modificada químicamente, p. ej., 5-metoxiuracilo. Al menos el 95% de un tipo de nucleobase (p. ej., uracilo) en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de la descripción pueden ser nucleobases modificadas. Al menos 95% de un uracilo en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido puede ser 5-metoxiuridina. El polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento y un sitio de unión de miARN puede formularse con un agente de administración, p. ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los compuestos 1-147.
Preparación de ARN de alta pureza
Con el fin de mejorar la pureza del ARN producido sintéticamente, pueden usarse procedimientos de transcripción in vitro (IVT) modificados que producen preparaciones de ARN que tienen propiedades muy diferentes del ARN producido utilizando un procedimiento de IVT tradicional. Las preparaciones de ARN producidas según estos métodos tienen propiedades que permiten la producción de composiciones cualitativa y cuantitativamente superiores. Incluso cuando se combina con procedimientos de purificación extensos, el ARN producido mediante métodos de IVT tradicionales es cualitativa y cuantitativamente distinto de las preparaciones de ARN producidas por los procedimientos de IVT modificados. Por ejemplo, las preparaciones de ARN purificado son menos inmunogénicas en comparación con las preparaciones de ARN hechas usando la IVT tradicional. Además, se producen mayores niveles de expresión de proteína con mayor pureza a partir de las preparaciones de ARN purificado.
Las reacciones tradicionales de IVT se realizan incubando una plantilla de ADN con una ARN polimerasa y cantidades equimolares de trifosfatos de nucleótidos, que incluyen GTP, ATP, CTP y UTP en un tampón de transcripción. A partir de esta reacción se produce un transcrito de ARN que tiene un trifosfato de guanosina 5' terminal. Estas reacciones también dan como resultado la producción de una serie de impurezas, tales como ARN bicatenarios y monocatenarios, que son inmunoestimuladores y pueden tener un impacto aditivo. Los métodos de pureza descritos en el presente documento evitan la formación de complementos inversos y, por lo tanto, evitan el reconocimiento inmunitario innato de ambas especies. Los métodos de IVT modificados pueden dar como resultado la producción de ARN que tiene una actividad de células T significativamente menor que una preparación de ARN realizada utilizando métodos de la técnica anterior con NTP equimolares. La técnica anterior intenta eliminar estos componentes indeseables utilizando una serie de etapas de purificación posteriores. Dichos métodos de purificación son indeseables porque implican tiempo y recursos adicionales y también dan como resultado la incorporación de disolventes orgánicos residuales en el producto final, lo que es indeseable para un producto farmacéutico. Es difícil en mano de obra y capital aumentar de escala procedimientos como la cromatografía de fase inversa (RP): utilizando, por ejemplo, instalaciones a prueba de explosiones, columnas de HPLC y sistemas de purificación clasificados para alta presión, alta temperatura, disolventes inflamables, etc. La escala y el rendimiento para la fabricación a gran escala están limitadas por estos factores. También se requiere una purificación posterior para eliminar el par iónico de alquilamonio utilizado en el procedimiento de RP. Por el contrario, los métodos descritos en el presente documento incluso mejoran los métodos utilizados actualmente (p. ej., RP). Una menor carga de impurezas conduce a una mayor recuperación en la purificación de ARN de longitud completa desprovisto de contaminantes inductores de citocinas, p. ej., mayor calidad de los materiales desde el principio.
Los métodos de IVT modificados implican la manipulación de uno o más de los parámetros de reacción en la reacción de IVT para producir una preparación de ARN de ARN altamente funcional sin uno o más de los contaminantes indeseables producidos usando los procedimientos de la técnica anterior. Un parámetro en la reacción de IVT que puede manipularse es la cantidad relativa de un nucleótido o análogo de nucleótido en comparación con uno o más de otros nucleótidos o análogos de nucleótidos en la mezcla de reacción (p. ej., cantidades o concentraciones de nucleótidos dispares). Por ejemplo, la reacción de IVT puede incluir un exceso de nucleótidos, p. ej., monofosfato de nucleótido, difosfato de nucleótido o trifosfato de nucleótido y/o un exceso de análogos de nucleótidos y/o análogos de nucleósidos. Los métodos producen un producto de alto rendimiento que es significativamente más puro que los productos producidos por los métodos de IVT tradicionales.
Los análogos de nucleótidos son compuestos que tienen la estructura general de un nucleótido o son estructuralmente similares a un nucleótido o una porción del mismo. En particular, los análogos de nucleótidos son nucleótidos que contienen, por ejemplo, un análogo de la porción de ácido nucleico, porción de azúcar y/o grupos fosfato del nucleótido. Los nucleótidos incluyen, por ejemplo, monofosfatos de nucleótidos, difosfatos de nucleótidos y trifosfatos de nucleótidos. Un análogo de nucleótido, como se usa en el presente documento, es estructuralmente similar a un nucleótido o a una porción del mismo, pero no tiene la estructura de nucleótido típica (nucleobase-ribosa-fosfato). Los nucleósidos son compuestos que tienen la estructura general de un nucleósido o son estructuralmente similares a un nucleósido o una porción del mismo. En particular, los análogos de nucleósidos son nucleósidos que contienen, por ejemplo, un análogo del ácido nucleico y/o la porción de azúcar del nucleósido.
Los análogos de nucleótidos útiles en los métodos son estructuralmente similares a los nucleótidos o porciones de los mismos pero, por ejemplo, no son polimerizables por T7. Los análogos de nucleótidos/nucleósidos como se usan en el presente documento (incluidos los análogos de C, T, A, U, G, dC, dT, dA, dU o dG) incluyen, por ejemplo, análogos de nucleótidos antivirales, análogos de fosfato (solubles o inmovilizados, hidrolizables o no hidrolizable), dinucleótido, trinucleótido, tetranucleótido, p. ej., un análogo de caperuza, o un precursor/sustrato para la formación enzimática de caperuza (vaccinia o ligasa), un nucleótido marcado con un grupo funcional para facilitar el ligado/conjugación de la caperuza o resto 5' (IRES), un nucleótido marcado con PO4 en 5' para facilitar la ligado de la caperuza o resto 5', o un nucleótido marcado con un grupo funcional/grupo protector que se puede escindir química o enzimáticamente. Los análogos de nucleótidos/nucleósidos antivirales incluyen, pero no se limitan a, ganciclovir, entecavir, telbivudina, vidarabina y cidofovir.
La reacción de IVT normalmente incluye lo siguiente: una ARN polimerasa, p. ej., una ARN polimerasa de T7 en una concentración final de, p. ej., 1000-12000 U/ml, p. ej., 7000 U/ml; la plantilla de ADN en una concentración final de, p. ej., 10-70 nM, p. ej., 40 nM; nucleótidos (NTP) en una concentración final de, p. ej., 0,5-10 mM, p. ej., 7,5 mM cada uno; magnesio en una concentración final de, p. ej., 12-60 mM, p. ej., acetato de magnesio 40 mM; un tampón tal como, p. ej., HEPES o Tris a un pH de, p. ej., 7-8,5, p. ej., Tris HCl 40 mM, pH 8. En algunas realizaciones se puede incluir ditiotreitol (DTT) 5 mM y/o espermidina 1 mM. En algunas realizaciones, se incluye un inhibidor de RNasa en la reacción de IVT para asegurar que no haya degradación inducida por RNasa durante la reacción de transcripción. Por ejemplo, el inhibidor de la ARNasa murina se puede utilizar en una concentración final de 1000 U/ml. En algunas realizaciones, se incluye una pirofosfatasa en la reacción de IVT para escindir el pirofosfato inorgánico generado después de la incorporación de cada nucleótido en dos unidades de fosfato inorgánico. Esto asegura que el magnesio permanece en solución y no precipita como pirofosfato de magnesio. Por ejemplo, se puede utilizar una pirofosfatasa inorgánica de E. coli en una concentración final de 1 U/ml.
De manera similar a los métodos tradicionales, el método modificado también se puede producir formando una mezcla de reacción que comprende una plantilla de ADN y uno o más NTP tal como ATP, CTP, UTP, GTP (o el análogo correspondiente de los componentes antes mencionados) y un tampón. A continuación, la reacción se incuba en condiciones tales que se transcriba el ARN. Sin embargo, los métodos modificados utilizan la presencia de una cantidad en exceso de uno o más nucleótidos y/o análogos de nucleótidos que pueden tener un impacto significativo en el producto final. Estos métodos implican una modificación en la cantidad (p. ej., cantidad molar o cantidad) de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos en la mezcla de reacción. En algunos aspectos, se pueden añadir uno o más nucleótidos y/o uno o más análogos de nucleótidos en exceso a la mezcla de reacción. Un exceso de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos es cualquier cantidad mayor que la cantidad de uno o más de los otros nucleótidos tales como los NTP en la mezcla de reacción. Por ejemplo, un exceso de un nucleótido y/o análogo de nucleótido puede ser una cantidad mayor que la cantidad de cada uno o al menos uno de los otros NTP individuales en la mezcla de reacción o puede referirse a una cantidad mayor que las cantidades equimolares de los otros NTP.
Cuando el nucleótido y/o el análogo de nucleótido que se incluye en la mezcla de reacción es un NTP, el NTP puede estar presente en una concentración más alta que los otros tres NTP incluidos en la mezcla de reacción. Los otros tres NTP pueden estar en una concentración equimolar entre sí. Alternativamente, uno o más de los otros tres NTP pueden estar en una concentración diferente a la de uno o más de los otros NTP.
La reacción de IVT puede incluir una cantidad equimolar de trifosfato de nucleótido en relación con al menos uno de los otros trifosfatos de nucleótidos.
El ARN se puede producir por un procedimiento o se puede preparar mediante un procedimiento que comprende
(a) formar una mezcla de reacción que comprende una plantilla de ADN y NTP que incluyen trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP), trifosfato de guanosina (GTP) y, opcionalmente, difosfato de guanosina (GDP), y (p. ej., tampón que contiene cofactor T7, p. ej., magnesio).
(b) incubar la mezcla de reacción en condiciones tales que se transcriba el ARN,
en donde la concentración de al menos uno de GTP, CTP, ATP y UTP es al menos 2 veces mayor que la concentración de uno cualquiera o más de ATP, CTP o UTP o la reacción comprende además un análogo de nucleótido y en donde la concentración del análogo de nucleótido es al menos 2 veces mayor que la concentración de uno cualquiera o más de ATP, CTP o UTP.
La relación de la concentración de GTP a la concentración de uno cualquiera de ATP, CTP o UTP puede ser de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1 o al menos 6:1. La relación de la concentración de GTP a la concentración de ATP, CTP y UTP puede ser 2:1, 4:1 y 4:1, respectivamente.
La proporción de la concentración de GTP a la concentración de ATP, CTP y UTP puede ser 3:1, 6:1 y 6:1 respectivamente. La mezcla de reacción puede comprender GTP y GDP y en donde la relación de la concentración de GTP más GDP a la concentración de uno cualquiera de ATP, CTP o UTP es al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1 o al menos 6:1 La relación de la concentración de GTP más GDP a la concentración de ATP, CTP y UTP puede ser 3:1,6:1 y 6:1, respectivamente.
El método puede implicar la incubación de la mezcla de reacción en condiciones tales que se transcriba el ARN, en donde la concentración efectiva de fosfato en la reacción es de al menos 150 mM, al menos 160 mM, al menos 170 mM, al menos 180 mM, al menos 190 mM, al menos 200 mM, al menos 210 mM o al menos 220 mM. La concentración efectiva de fosfato en la reacción puede ser de 180 mM. La concentración efectiva de fosfato en la reacción puede ser de 195 mM. La concentración efectiva de fosfato en la reacción puede ser de 225 mM.
El ARN se puede producir por un procedimiento o se puede preparar por un procedimiento que comprende un tampón en donde se usa un tampón que contiene magnesio cuando se forma la mezcla de reacción que comprende una plantilla de ADN y ATP, CTP, UTP, GTP. El tampón que contiene magnesio puede comprender Mg2+ y la relación molar de la concentración de ATP más CTP más UTP más GTP a la concentración de Mg2+ puede ser al menos 1,0, al menos 1,25, al menos 1,5, al menos 1,75, al menos 1,85, al menos 3 o superior. La relación molar de la concentración de ATP más CTP más UTP más GTP a la concentración de Mg2+ puede ser 1,5. La relación molar de la concentración de ATP más CTP más UTP más GTP a la concentración de Mg2+ puede ser 1,88. La relación molar de la concentración de ATP más CTP más UTP más GTP a la concentración de Mg2+ puede ser 3.
La composición se puede producir por un procedimiento que no comprende una etapa de tratamiento con dsRNasa (p. ej., RNasalll).
La composición se puede producir por un procedimiento que no comprende una etapa de purificación por cromatografía de fase inversa (RP). La composición se puede producir por un procedimiento que no comprende una etapa de purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
La relación de la concentración de GTP a la concentración de uno cualquiera de ATP, CTP o UTP puede ser de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1 o al menos 6:1 para producir el ARN.
La pureza de los productos puede evaluarse utilizando métodos y ensayos analíticos conocidos. Por ejemplo, la cantidad de producto de transcripción del complemento inverso o contaminante de ARN inductor de citocinas puede determinarse mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (tal como cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño), sistema de electroforesis basado en chip Bioanalyzer, ELISA, citometría de flujo, gel de acrilamida, un ensayo de tipo reconstitución o sustitutivo. Los ensayos se pueden realizar con o sin tratamiento con nucleasas (P1, RNasa III, RNasa H, etc.) de la preparación de ARN. También se pueden realizar análisis electroforéticos, cromatográficos o de espectro de masas de los productos de digestión con nucleasas.
Las preparaciones de ARN purificado pueden comprender transcritos contaminantes que tienen una longitud inferior a un transcrito de longitud completa, tal como por ejemplo al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos menos que la longitud completa. Los transcritos de contaminantes pueden incluir productos de transcripción inversa o directa (transcritos) que tienen una longitud inferior a un transcrito de longitud completa, tal como por ejemplo al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos menos de la longitud completa. Los transcritos directos de ejemplo incluyen, por ejemplo, transcritos abortivos. La composición puede comprender un complemento inverso de trifosfato de poli-U de menos de 30 nucleótidos. La composición puede comprender un complemento inverso de trifosfato de poli-U de cualquier longitud hibridado con un transcrito de longitud completa. La composición puede comprender un transcrito directo de trifosfato monocatenario.
La composición puede comprender un ARN monocatenario que tiene un trifosfato-G terminal. La composición puede comprender ARN monocatenario o bicatenario de menos de 12 nucleótidos o pares de bases (incluidos transcritos del complemento directo o inverso). La composición puede incluir menos de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0,5% de uno cualquiera de estos o una combinación de estos transcritos de longitud menor que la total.
Agentes de administración
a. Compuesto lipídico
La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas con propiedades ventajosas. Las composiciones de lípidos descritas en el presente documento pueden usarse ventajosamente en composiciones de nanopartículas lipídicas para el suministro de agentes terapéuticos y/o profilácticos, p. ej., ARNm, a células u órganos de mamíferos. Por ejemplo, los lípidos descritos en el presente documento tienen poca o ninguna inmunogenicidad. Por ejemplo, los compuestos lipídicos descritos en el presente documento tienen una inmunogenicidad más baja en comparación con un lípido de referencia (p. ej., MC3, KC2 o DLinDMA). Por ejemplo, una formulación que comprende un lípido descrito en el presente documento y un agente terapéutico o profiláctico, p. ej., ARNm, tiene un índice terapéutico mayor en comparación con una formulación correspondiente que comprende un lípido de referencia (p. ej., MC3, KC2 o DLinDMA) y el mismo agente terapéutico o profiláctico. Las composiciones y nanopartículas lipídicas de la invención se definen en las reivindicaciones.
Formulaciones de nanopartículas lipídicas
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención (es decir, ARNm, como se define en las reivindicaciones) se formulan en una nanopartícula de lípidos (LNP). Las nanopartículas lipídicas normalmente comprenden componentes de lípidos catiónicos ionizables, lípidos no catiónicos, esteroles y lípidos PEG junto con la carga de ácido nucleico de interés. Las nanopartículas lipídicas se pueden generar utilizando componentes, composiciones y métodos que se conocen generalmente en la técnica, véase por ejemplo PCT/US2016/052352, PCT/US2016/068300; PCT/US2017/037551; PCT/US2015/027400; PCT/US2016/047406; PCT/US2016000129; PCT/US2016/014280; PCT/US2016/014280; PCT/US2017/038426; PCT/US2014/027077; PCT/US2014/055394; PCT/US2016/52117; PCT/US2012/069610; PCT/US2017/027492; PCT/US2016/059575 y PCT/US2016/069491.
Los ácidos nucleicos de la presente descripción (es decir, ARNm, como se define en las reivindicaciones) se formulan normalmente en nanopartículas lipídicas. La nanopartícula lipídica puede comprender al menos un lípido catiónico ionizable, al menos un lípido no catiónico, al menos un esterol y/o al menos un lípido modificado con polietilenglicol (PEG).
La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 20-60% de lípido catiónico ionizable. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 20-50%, 20-40%, 20-30%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 40-60%, 40-50% o 50-60% de lípido catiónico ionizable. La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 20%, 30%, 40%, 50 o 60% de lípido catiónico ionizable.
La nanopartícula lipídica puede comprender una proporción molar de 5-25% de lípido no catiónico. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-25%, 10-20%, 10-25%, 15-25%, 15-20% o 20-25% de lípidos no catiónicos. La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de lípido no catiónico.
La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 25-55% de esterol. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 25-50%, 25-45%, 25-40%, 25-35%, 25-30%, 30-55%, 30-50%, 30-45%, 30-40%, 30-35%, 35-55%, 35-50%, 35-45%, 35-40%, 40-55%, 40-50%, 40-45%, 45-55%, 45-50% o 50-55% de esterol. La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o 55% de esterol.
La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 0,5-15% de lípido modificado con PEG. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 0,5-10%, 0,5-5%, 1-15%, 1-10%, 1-5%, 2-15%, 2-10%, 2-5% , 5-15%, 5-10% o 10-15%. La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de lípido modificado con PEG.
La nanopartícula lipídica puede comprender una relación molar de 20-60% de lípido catiónico ionizable, 5-25% de lípido no catiónico, 25-55% de esterol y 0,5-15% de lípido modificado con PEG.
Lípidos ionizables
Los lípidos ionizables pueden ser uno o más compuestos de Fórmula (I):
Figure imgf000054_0001
o sus N-óxidos, o sus sales o isómeros, en donde:
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR" y -R*OR" o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, - OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN,
- N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8,
- N(R)S(O)2R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR8)N(R)2, -N(R)C(=CHR8)N(R)2, -OC(O)N(R)2,
- N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2,
- N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR8)N(R)2, -N(OR)C(=CHR8)N(R)2, -C(=NR8)N(R)2,
- C(=NR8)R, -C(O)N(R)OR y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;
cada Rs se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 e H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 e H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M"-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo, en el que M" es un enlace, alquilo C1-13 o alquenilo C2-13;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 e H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R8 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 e H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR" e H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-15 y
alquenilo C3-15;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y
alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y en donde cuando R4 es -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)2, entonces (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2.
Un subconjunto de compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (IA):
Figure imgf000055_0001
o su N-óxido, o una de sus sales o isómeros, en donde l se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es hidrógeno, alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb, -NHC(=NR8)N(R)2, -NHC(=CHR8)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M"-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo un grupo heteroarilo y,; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. Por ejemplo, m es 5, 7 o 9. Por ejemplo, Q es OH, -NHC(S)N(R)2 o -NHC(O)N(R)2. Por ejemplo, Q es -N(R)C(O)R o -N(R)S(O)2R.
Un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (IB):
Figure imgf000056_0001
o su N-óxido, o una de sus sales o isómeros en los que todas las variables son como se definen en el presente documento. Por ejemplo, m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; R4 es hidrógeno, alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M"-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. Por ejemplo, m es 5, 7 o 9. Por ejemplo, Q es OH, -NHC(S)N(R)2 o -NHC(O)N(R)2. Por ejemplo, Q es -N(R)C(O)R o -N(R)S(O)2R.
Un subconjunto de compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (II):
Figure imgf000056_0002
o su N-óxido, o una de sus sales o isómeros, en donde l se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R4 es hidrógeno, alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 2 , 3 o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb,
-NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(o )o -, -o C(O)-, -Oc (O)-M"-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14.
Los compuestos de fórmula (I) pueden ser de Fórmula (I Ia),
Figure imgf000056_0003
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R4 es como se describe en el presente documento. Los compuestos de fórmula (I) pueden ser de Fórmula (I Ib),
Figure imgf000057_0001
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R4 es como se describe en el presente documento. Los compuestos de fórmula (I) pueden ser de Fórmula (IIc) o (IIe):
Figure imgf000057_0002
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R4 es como se describe en el presente documento. Los compuestos de fórmula (1) pueden ser de fórmula (IIf):
Figure imgf000057_0003
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos,
en donde M es -C(O)O- o -OC(O)-, M" es alquilo C1-6 o alquenilo C2-6, R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14, y n se selecciona de 2, 3 y 4. Los compuestos de fórmula (I) pueden ser de fórmula (IId),
Figure imgf000057_0004
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde n es 2, 3 o 4; y m, R', R”, y R2 a R6 son como se describen en el presente documento. Por ejemplo, cada uno de R2 y R3 pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14.
Los compuestos de fórmula (I) pueden ser de fórmula (llg),
Figure imgf000057_0005
o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde l se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; Mi es un enlace o M'; M y M' se seleccionan independientemente de
-C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M"-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. Por ejemplo, M" es alquilo C1-6 (p. ej., alquilo C1-4) o alquenilo C2-6 (p. ej., alquenilo C2-4). Por ejemplo, R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14.
Los lípidos ionizables pueden ser uno o más de los compuestos descritos en las solicitudes de EE. UU. N.° 62/220,091, 62/252,316, 62/253,433, 62/266,460, 62/333,557, 62/382,740, 62/393,940, 62/471,937, 62/471,949,62/475,140, y 62/475,166, y solicitud PCT N.° PCT/US2016/052352.
Los lípidos ionizables pueden seleccionarse de los Compuestos 1-280 descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/475,166.
El lípido ionizable puede ser
Figure imgf000058_0001
o una de sus sales.
El lípido ionizable puede ser
Figure imgf000058_0002
o una de sus sales.
El lípido ionizable puede ser
Figure imgf000058_0003
o una de sus sales.
El lípido ionizable puede ser
Figure imgf000058_0004
o una de sus sales.
El resto de amina central de un lípido según la fórmula (I), (IA), (IB), (II), (Ila), (IIb), (IIe), (Ild), (IIe), (Ilf) o (IIg) puede protonarse a un pH fisiológico. Así, un lípido puede tener carga positiva o positiva parcial a pH fisiológico. Dichos lípidos pueden denominarse (amino)lípidos catiónicos o ionizables. Los lípidos también pueden ser de ion híbrido, es decir, moléculas neutras que tienen tanto una carga positiva como una negativa.
Los lípidos ionizables pueden ser uno o más compuestos de fórmula (III):
Figure imgf000059_0001
o sales o isómeros de los mismos, en donde
Figure imgf000059_0002
el anillo A es
Figure imgf000059_0003
t es 1 o 2 ;
A1 y A2 se selecciona cada uno independientemente de CH o N;
Z es CH2 o está ausente en donde cuando Z es CH2, las líneas discontinuas (1) y (2) representan cada una un enlace sencillo; y cuando Z está ausente, las líneas discontinuas (1) y (2) están ambas ausentes;
R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R"M R', -R*YR", -YR" y -R*OR";
Rx1 y Rx2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3;
cada M se selecciona independientemente del grupo que consiste en -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -C(O)S-, -SC(O)-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
M* es alquilo C1-C6,
W1 y W2 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en -O- y -N(R6)-;
cada Rs se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-5;
X1, X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un enlace, -CH2-,
-(CH2)2-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -(CH2)n-C(O)-, -C(O)-(CH2)n
-(CH2)n-C(O)O-, -OC(O)-(CH2)n-, -(CH2)n-OC(O)-, -C(O)O-(CH2)n-, -CH(OH)-, -C(S)- y -CH(SH)-;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3 y un carbociclo C3-6; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12, alquenilo C2-12 e H; cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-12, alquenilo C3-12 y -R*MR'; y n es un número entero de 1-6;
cuando el anillo A es
Figure imgf000060_0001
entonces
i) al menos uno de X1, X2 y X3 no es -CH2-, y/o
ii) al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es -R"MR',
El compuesto puede tener cualquiera de las fórmulas (MIa1 )-(M!a8):
Figure imgf000060_0002
Figure imgf000061_0001
Los lípidos ionizables pueden ser uno o más de los compuestos descritos en las solicitudes de EE. UU. N.° 62/271,146, 62/338,474, 62/413,345 y 62/519,826, y solicitud PCT N.° PCT/US2016/068300.
Los lípidos ionizables se pueden seleccionar de los Compuestos 1-156 descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/519,826.
Los lípidos ionizables pueden seleccionarse de los Compuestos 1-16, 42-66, 68-76 y 78-156 descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/519,826.
El lípido ionizable es
Figure imgf000061_0002
o una de sus sales.
El lípido ionizable es
Figure imgf000061_0003
o una de sus sales.
El resto de amina central de un lípido según la fórmula (III), (IIIa1), (Illa2), (Illa3), (H!a4), (Illa5), (Illa6), (IIIa7), o (H!a8) puede estar protonado a un pH fisiológico. Así, un lípido puede tener carga positiva o positiva parcial a pH fisiológico. Dichos lípidos pueden denominarse (amino)lípidos catiónicos o ionizables. Los lípidos también pueden ser de ion híbrido, es decir, moléculas neutras que tienen tanto una carga positiva como una negativa. Fosfolípidos
La composición lipídica de las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento y como se define en las reivindicaciones puede comprender uno o más fosfolípidos, por ejemplo, uno o más fosfolípidos saturados o (poli)insaturados o una combinación de los mismos. En general, los fosfolípidos comprenden un resto de fosfolípido y uno o más restos de ácidos grasos.
Se puede seleccionar un resto de fosfolípido, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidilcolina y una esfingomielina.
Un resto de ácido graso puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.
Los fosfolípidos particulares pueden facilitar la fusión a una membrana Por ejemplo, un fosfolípido catiónico puede interaccionar con uno o más fosfolípidos cargados negativamente de una membrana (p. ej., una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido a una membrana puede permitir que uno o más elementos (p. ej., un agente terapéutico) de una composición que contiene lípidos (p. ej., LNP) pasen a través de la membrana permitiendo, p. ej., la administración de uno o más elementos a un tejido diana.
También están contempladas especies de fosfolípidos no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclación y alquinos. Por ejemplo, un fosfolípido se puede funcionalizar o reticular con uno o más alquinos (p. ej., un grupo alquenilo en el que uno o más enlaces dobles se reemplazan por un enlace triple). En condiciones de reacción apropiadas, un grupo alquino puede sufrir una cicloadición catalizada por cobre tras exposición a una azida. Dichas reacciones pueden ser útiles para funcionalizar una bicapa lipídica de una composición de nanopartículas para facilitar la permeación de la membrana o el reconocimiento celular o para conjugar una composición de nanopartículas con un componente útil tal como un resto de direccionamiento o de generación de imágenes (p. ej., un colorante).
Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tales como esfingomielina.
Un fosfolípido puede comprender 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), I,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 diéter PC), 1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso-PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (ME 16.0 PE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal sódica de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), esfingomielina y mezclas de los mismos.
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil es un análogo o variante de DSPC. Un fosfolípido útil o potencialmente útil es un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000062_0001
o una de sus sales, en donde:
cada R1 es independientemente alquilo opcionalmente sustituido; u opcionalmente dos R1 se unen junto con los átomos intermedios para formar carbociclilo monocíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo monocíclico opcionalmente sustituido; u opcionalmente tres R1 se unen junto con los átomos intermedios para formar carbociclilo bicíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo bicíclico opcionalmente sustituido;
n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
A es de fórmula:
Figure imgf000062_0002
cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno Ci-6 opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno Ci-6 opcionalmente sustituido está opcionalmente reemplazado con O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NRNC(O)N(RN); cada caso de R2 es alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, alquenilo C1-30 opcionalmente sustituido, o alquinilo C1-30 opcionalmente sustituido; en donde opcionalmente una o más unidades de metileno de R2 se reemplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(Rn), NRnC(O)O, -C(O)S, SC(O), C(=NRn), C(=NRn)N(Rn), NRnC(=NRn), NRnC(=NRn)N(Rn), C(S), C(S)N(Rn), NRnC(S), NRnC(S)N(Rn), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(Rn)S(O)2, S(O)2N(Rn), N(Rn)S(O)2N(Rn), OS(O)2N(Rn), o N(Rn)S(O)2O;
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno;
el anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
p es 1 o 2 ;
con la condición de que el compuesto no sea de fórmula:
Figure imgf000063_0001
en donde cada caso de R2 es independientemente alquilo no sustituido, alquenilo no sustituido o alquinilo no sustituido.
Los fosfolípidos pueden ser uno o más de los fosfolípidos descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/520,530. (i) Modificaciones de la cabeza de fosfolípidos
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil puede comprender una cabeza de fosfolípido modificada (p. ej., un grupo colina modificado). En determinadas realizaciones, un fosfolípido con una cabeza modificada es DSPC, o un análogo del mismo, con una amina cuaternaria modificada. Por ejemplo, en la Fórmula (IV), al menos uno de R1 puede no ser metilo. Al menos uno de R1 puede no ser hidrógeno ni metilo. El compuesto de fórmula (IV) puede tener una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000063_0002
o una de sus sales, en donde:
cada t es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
cada u es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y
cada v es independientemente 1, 2 o 3.
Un compuesto de fórmula (IV) puede ser de fórmula (IV-a):
Figure imgf000064_0001
o una de sus sales.
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil puede comprender un resto cíclico en lugar del resto glicérido. Un fosfolípido que es útil puede ser DSPC, o un análogo del mismo, con un resto cíclico en lugar del resto glicérido.
Un compuesto de fórmula (IV) puede ser de fórmula (IV-b):
Figure imgf000064_0002
o una de sus sales.
(ii) Modificaciones de la cola de fosfolípidos
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil puede comprender una cola modificada. Un fosfolípido útil o potencialmente útil puede ser DSPC, o un análogo del mismo, con una cola modificada. Como se describe en el presente documento, una "cola modificada" puede ser una cola con cadenas alifáticas más cortas o más largas, cadenas alifáticas con ramificación introducida, cadenas alifáticas con sustituyentes introducidos, cadenas alifáticas en donde uno o más pueden ser metilenos sustituidos por grupos cíclicos o heteroátomos, o cualquier combinación de los mismos. El compuesto de (IV) puede ser de fórmula (IV-a), o una de sus sales, en donde al menos un caso de R2 es cada caso R2 es alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades metileno de R2 se reemplazan independientemente con carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(Rn), NRnC(O), NRnC(O)N(Rn), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(Rn), NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NRN), C(=NRn)N(Rn),-NRnC(=NRn), NRnC(=NRn)N(Rn), C(S), C(S)N(Rn), NRNC(S), NRNC(S)N(RN), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(Rn)S(O), S(O)N(Rn), -N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(Rn), N(Rn)S(O)O, S(O)2, N(Rn)S(O)2, S(O)2N(Rn), N(Rn)S(O)2N(Rn), OS(O)2N(Rn) o N(Rn)S(O)2O. El compuesto de fórmula (IV) puede ser de fórmula (IV-c):
Figure imgf000064_0003
o una de sus sales, en donde:
cada x es independientemente un número entero entre 0-30, inclusive; y
cada caso es G, se selecciona independientemente del grupo que consiste en carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), - NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NRN), C(=NRN)N(RN), NRNC(=NRN), NRnC(=NRn)N(Rn), C(S), C(S)N(Rn), NRnC(S), NRnC(S)N(Rn), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, -OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(Rn)S(O), S(O)N(Rn), N(Rn)S(O)N(Rn), OS(O)N(Rn), N(Rn)S(O)O, S(O)2, N(Rn)S(O)2, S(O)2N(Rn), N(Rn)S(O)2N(Rn), OS(O)2N(Rn) o -N(Rn)S(O)2O.
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil puede comprender un resto de fosfocolina modificada, en donde la cadena de alquilo que une la amina cuaternaria al grupo fosforilo no es etileno (p. ej., n no es 2). Por lo tanto, un fosfolípido útil o potencialmente útil puede ser un compuesto de fórmula (IV), en donde n es 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Por ejemplo, un compuesto de fórmula (IV) puede tener una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000065_0001
o una de sus sales.
Lípidos alternativos
Un fosfolípido que es útil o potencialmente útil puede comprender un resto de fosfocolina modificada, en donde la cadena de alquilo que une la amina cuaternaria al grupo fosforilo no es etileno (p. ej., n no es 2). Por lo tanto, un fosfolípido puede ser útil.
Se puede usar un lípido alternativo en lugar de un fosfolípido.
Un lípido alternativo de la invención puede ser ácido oleico.
El lípido alternativo puede ser uno de los siguientes:
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Lípidos estructurales
La composición lipídica de una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más lípidos estructurales. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "lípido estructural" se refiere a esteroles y también a lípidos que contienen restos de esteroles.
La incorporación de lípidos estructurales en la nanopartícula lipídica puede ayudar a mitigar la agregación de otros lípidos en la partícula. Los lípidos estructurales se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, fomafina, ácido ursólico, alfa-tocoferol, hopanoides, fitoesteroles, esteroides y mezclas de los mismos. El lípido estructural puede ser un esterol. Tal como se define en el presente documento, los "esteroles" son un subgrupo de esteroides que consiste en alcoholes esteroideos. El lípido estructural puede ser un esteroide. El lípido estructural puede ser colesterol.
El lípido estructural puede ser un análogo de colesterol. El lípido estructural puede ser alfa-tocoferol.
Los lípidos estructurales pueden ser uno o más de los lípidos estructurales descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/520,530.
Polietilenglicol (PEG)-Lípidos
La composición lipídica de una composición farmacéutica descrita en el presente documento y como se define en las reivindicaciones puede comprender uno o más de un polietilenglicol (PEG)-lípido.
Como se usa en el presente documento, el término "PEG-lípido" se refiere a lípidos modificados con polietilenglicol (PEG). Los ejemplos no limitantes de PEG-lípidos incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (p. ej., PEG-C6rC14 o PEG-C6rC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Dichos lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un lípido PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, o un lípido PEG-DSPE.
El PEG-lípido puede incluir, pero no se limita a 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diesteril-glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-o-DMA).
El PEG-lípido se puede seleccionar del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG, y mezclas de los mismos.
El resto lipídico de los PEG-lípidos puede incluir los que tienen longitudes de aproximadamente C14 a aproximadamente C22, preferiblemente de aproximadamente C14 a aproximadamente C16. Un resto de PEG, por ejemplo, un mPEG-NH2, puede tener un tamaño de aproximadamente 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 15.000 o 20.000 daltons. El PEG-lípido puede ser PEG2k-DMG.
Las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento pueden comprender un lípido PEG que es un PEG no difundible. Los ejemplos no limitantes de PEG no difundibles incluyen PEG-DSG y PEG-DSPE.
Los PEG-lípidos son conocidos en la técnica, tales como los descritos en la patente de EE. UU. N.° 8158601 y la Publ. internacional N.° WO 2015/130584 A2.
En general, algunos de los otros componentes lipídicos (p. ej., lípidos PEG) de varias fórmulas, descritos en el presente documento, pueden sintetizarse como se describe en la solicitud de patente internacional N.° PCT/US2016/000129, presentada el 10 de diciembre de 2016, titulada "Composiciones y métodos para la administración de agentes terapéuticos".
El componente lipídico de una composición de nanopartículas lipídicas puede incluir una o más moléculas que comprenden polietilenglicol, tal como PEG o lípidos modificados con PEG. Dichas especies pueden denominarse alternativamente como lípidos PEGilados. Un PEG-lípido es un lípido modificado con polietilenglicol. Un PEG-lípido puede seleccionarse del grupo no limitante que incluye fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, ácidos fosfatídicos modificados con PEG, ceramidas modificadas con PEG, dialquilaminas modificadas con PEG, diacilgliceroles modificados con PEG, dialquilgliceroles modificados con PEG y mezclas de los mismos. Por ejemplo, un PEG-lípido puede ser PEG-o-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, o un lípido PEG-DSPE.
Los lípidos modificados con PEG pueden ser una forma modificada de PEG-DMG. PEG-DMG tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000067_0001
Los PEG-lipidos que son útiles pueden ser lípidos PEGilados descritos en la publicación internacional N.° WO2012099755.
Cualquiera de estos PEG-lípidos de ejemplo descritos en el presente documento puede modificarse para comprender un grupo hidroxilo en la cadena de PEG. El PEG-lípido puede ser un PEG-OH-lípido. Como se define generalmente en el presente documento, un "PEG-OH-lípido" (también denominado en el presente documento como "lípido hidroxi-PEGilado") es un lípido PEGilado que tiene uno o más grupos hidroxilo (-OH) en el lípido. El PEG-OH-lípido puede incluir uno o más grupos hidroxilo en la cadena de PEG. Un PEG-OH o un lípido hidroxi-PEGilado puede comprender un grupo -OH en el extremo de la cadena de PEG.
Un PEG-lípido que es útil puede ser un compuesto de Fórmula (V). En la presente se describen compuestos de fórmula (V):
Figure imgf000067_0002
o una de sus sales, en donde:
R3 es -OR0;
R0 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno;
r es un número entero entre 1 y 100, inclusive;
L1 es alquileno C1-10 opcionalmente sustituido, en donde al menos un metileno del alquileno C1-10 opcionalmente sustituido se reemplaza independientemente con carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), -NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NRNC(O)N(RN);
D es un resto obtenido por química clic o un resto escindible en condiciones fisiológicas;
m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
A es de fórmula:
Figure imgf000067_0003
cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno Ci-6 opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno Ci-6 opcionalmente sustituido está opcionalmente reemplazado con O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NRNC(O)N(RN);
cada caso de R2 es independientemente alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, alquenilo C1-30 opcionalmente sustituido, o alquinilo C1-30 opcionalmente sustituido; en donde opcionalmente una o más unidades de metileno de R2 se reemplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, -C(O)S, SC(O), C(=NRN), C(=NRN)N(RN), NRnC(=NRn), NRnC(=NRn)N(Rn), C(S), C(S)N(Rn), NRnC(S), NRnC(S)N(Rn), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(Rn)S(O), S(O)N(Rn), N(Rn)S(O)N(Rn), OS(O)N(Rn), N(Rn)S(O)O, S(O)2, N(Rn)S(O)2, S(O)2N(Rn), N(Rn)S(O)2N(Rn), OS(O)2N(Rn) o N(Rn)S(O)2O;
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno;
el anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
p es 1 o 2.
El compuesto de fórmula (V) puede ser un PEG-OH-lípido (es decir, R3 es -OR0 y R0 es hidrógeno). El compuesto de fórmula (V) puede ser de fórmula (V-OH): puede ser
Figure imgf000068_0001
o una de sus sales.
Un PEG-lípido que es útil puede ser un ácido graso PEGilado. El PEG-lípido que es útil puede ser un compuesto de fórmula (VI). En el presente documento se describen compuestos de fórmula (VI):
Figure imgf000068_0002
o una de sus sales, en donde:
R3 es -OR0;
R0 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno;
r es un entero entre 1 y 100, inclusive;
R5 es alquilo C10-40 opcionalmente sustituido, alquenilo C10-40 opcionalmente sustituido o alquinilo C10-40 opcionalmente sustituido; y opcionalmente uno o más grupos metileno de R5 se reemplazan con carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRnC(O)N(Rn), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRnC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NRn), C(=NRn)N(Rn),-NRnC(=NRn), NRnC(=NRn)N(Rn), C(S), C(S)N(Rn), NRnC(S), NRnC(S)N(Rn), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), -N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)2N(Rn), N(Rn)S(O)2N(Rn), OS(O)2N(Rn), o N(Rn)S(O)2O; y
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno.
El compuesto de Fórmula (VI) puede ser de fórmula (VI-OH):
Figure imgf000068_0003
o una de sus sales. r puede ser 45.
El compuesto de Fórmula (VI) puede ser:
Figure imgf000069_0001
o una de sus sales.
El compuesto de Fórmula (VI) puede ser
Figure imgf000069_0002
(Compuesto I).
La composición lipídica de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y definidas en las reivindicaciones no comprende un PEG-lípido.
Los PEG-lípidos pueden ser uno o más de los PEG-lípidos descritos en la solicitud de EE. UU. N.° 62/520,530. Un PEG-lípido puede comprender una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG, y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el lípido modificado con PEG es PEG-DMG, PEG-o-DOMG (también denominado PEG-DOMG), PEG-DSG y/o PEG-DPG.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de cualquiera de las fórmulas I, II o III, un fosfolípido que comprende DSPC, un lípido estructural y un lípido PEG que comprende PEG-DMG.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de cualquiera de las fórmulas I, II o III, un fosfolípido que comprende DSPC, un lípido estructural y un lípido PEG que comprende un compuesto que tiene la fórmula VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de fórmula I, II o III, un fosfolípido que comprende un compuesto que tiene la fórmula IV, un lípido estructural y el PEG-lípido que comprende un compuesto de fórmula V o VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de fórmula I, II o III, un fosfolípido que comprende un compuesto que tiene la fórmula IV, un lípido estructural y el PEG-lípido que comprende un compuesto de fórmula V o V i.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de fórmula I, II o III, un fosfolípido que tiene la fórmula IV, un lípido estructural y un PEG-lípido que comprende un compuesto de fórmula VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de
Figure imgf000069_0003
y un PEG-lípido que comprende la fórmula VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de
Figure imgf000070_0001
y un lípido alternativo que comprende ácido oleico.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de
Figure imgf000070_0002
un lípido alternativo que comprende ácido oleico, un lípido estructural que comprende colesterol y un PEG-lípido que comprende un compuesto que tiene la fórmula VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de
Figure imgf000070_0003
un fosfolípido que comprende DOPE, un lípido estructural que comprende colesterol y un PEG-lípido que comprende un compuesto que tiene la fórmula VI.
Una LNP puede comprender un lípido catiónico ionizable de
Figure imgf000070_0004
un fosfolípido que comprende DOPE, un lípido estructural que comprende colesterol y un PEG-lípido que comprende un compuesto que tiene la fórmula VII.
Una LNP puede comprender una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1.
Una LNP puede comprender una relación N:P de aproximadamente 6:1.
Una LNP puede comprender una relación N:P de aproximadamente 3:1.
Una LNP puede comprender una relación en peso/peso del componente de lípido catiónico ionizable al ARN de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 100:1.
Una LNP puede comprender una relación en peso/peso del componente de lípido catiónico ionizable al ARN de aproximadamente 20:1.
Una LNP puede comprender una relación en peso/peso del componente de lípido catiónico ionizable al ARN de aproximadamente 10:1.
Una LNP puede tener un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm.
Una LNP puede tener un diámetro medio de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 120 nm.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo", "grupo alquilo" o "alquileno" significa un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que incluye uno o más átomos de carbono (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono), que está opcionalmente sustituido. La notación "alquilo C1-14" significa un hidrocarburo saturado, lineal o ramificado, opcionalmente sustituido que incluye 1 14 átomos de carbono. A menos que se especifique lo contrario, un grupo alquilo descrito en el presente documento se refiere tanto a grupos alquilo no sustituidos como sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término "alquenilo", "grupo alquenilo" o "alquenileno" significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye dos o más átomos de carbono (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un doble enlace, que está opcionalmente sustituido. La notación "alquenilo C2-14" significa un hidrocarburo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que incluye 2 14 átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. Un grupo alquenilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más dobles enlaces carbono-carbono. Por ejemplo, alquenilo C18 puede incluir uno o más dobles enlaces. Un grupo alquenilo C18 que incluye dos dobles enlaces puede ser un grupo linoleilo. A menos que se especifique lo contrario, un grupo alquenilo descrito en el presente documento se refiere tanto a grupos alquenilo no sustituidos como sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término "alquinilo", "grupo alquinilo" o "alquinileno" significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye dos o más átomos de carbono (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un triple enlace carbono-carbono, que está opcionalmente sustituido. La notación "alquinilo C2-14" significa un hidrocarburo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que incluye 2 14 átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. Un grupo alquinilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más triples enlaces carbono-carbono. Por ejemplo, el alquinilo C18 puede incluir uno o más triples enlaces carbono-carbono. A menos que se especifique lo contrario, un grupo alquinilo descrito en el presente documento se refiere tanto a grupos alquinilo no sustituidos como sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término "carbociclo" o "grupo carbocíclico" significa un sistema mono o multicíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos de átomos de carbono. Los anillos pueden ser de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte miembros en los anillos. La notación "carbociclo C3-6" significa un carbociclo que incluye un solo anillo que tiene 3-6 átomos de carbono. Los carbociclos pueden incluir uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono y pueden ser no aromáticos o aromáticos (p. ej., grupos cicloalquilo o arilo). Los ejemplos de carbociclos incluyen grupos ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo y 1,2-dihidronaftilo. El término "cicloalquilo", como se usa en el presente documento, significa un carbociclo no aromático y puede incluir o no cualquier doble o triple enlace. A menos que se especifique lo contrario, los carbociclos descritos en el presente documento se refieren tanto a grupos carbociclo no sustituidos como sustituidos, es decir, carbociclos opcionalmente sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término "heterociclo" o "grupo heterocíclico" significa un sistema mono o multicíclico que incluye uno o más anillos, donde al menos un anillo incluye al menos un heteroátomo. Los heteroátomos pueden ser, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden tener tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce miembros en el anillo. Los heterociclos pueden incluir uno o más dobles o triples enlaces y pueden ser no aromáticos o aromáticos (p. ej., grupos heterocicloalquilo o heteroarilo). Los ejemplos de heterociclos incluyen grupos imidazolilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tiofenilo, piridinilo, piperidinilo, quinolilo e isoquinolilo. El término "heterocicloalquilo", como se usa en el presente documento, significa un heterociclo no aromático y puede incluir o no cualquier doble o triple enlace. A menos que se especifique lo contrario, los heterociclos descritos en el presente documento se refieren tanto a grupos heterociclo no sustituidos como sustituidos, es decir, heterociclos opcionalmente sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término "heteroalquilo", "heteroalquenilo" o "heteroalquinilo", se refiere respectivamente a un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, como se define en el presente documento, que además comprende uno o más (p. ej., 1,2, 3 o 4) heteroátomos (p. ej., oxígeno, azufre, nitrógeno, boro, silicio, fósforo) en donde el uno o más heteroátomos están insertados entre átomos de carbono adyacentes dentro de la cadena de carbonos original y/o uno o más heteroátomos están insertado entre un átomo de carbono y la molécula original, es decir, entre el punto de unión. A menos que se especifique lo contrario, los heteroalquilos, heteroalquenilos o heteroalquinilos descritos en el presente documento se refieren tanto a heteroalquilos, heteroalquenilos o heteroalquinilos sustituidos como no sustituidos, es decir, heteroalquilos, heteroalquenilos o heteroalquinilos opcionalmente sustituidos.
Como se usa en el presente documento, un "grupo biodegradable" es un grupo que puede facilitar un metabolismo más rápido de un lípido en una entidad de mamífero. Un grupo biodegradable se puede seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O), -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, - S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo. Como se usa en el presente documento, un "grupo arilo" es un grupo carbocíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo. Como se usa en el presente documento, un "grupo heteroarilo" es un grupo heterocíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo y tiazolilo. Tanto los grupos arilo como heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Por ejemplo, M y M' pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en fenilo, oxazol y tiazol opcionalmente sustituidos. En las fórmulas en el presente documento, M y M' pueden seleccionarse independientemente de la lista anterior de grupos biodegradables. A menos que se especifique lo contrario, los grupos arilo o heteroarilo descritos en el presente documento se refieren tanto a grupos no sustituidos como sustituidos, es decir, grupos arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos.
Los grupos alquilo, alquenilo y ciclilo (p. ej., carbociclilo y heterociclilo) pueden estar opcionalmente sustituidos a menos que se especifique lo contrario. Los sustituyentes opcionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en, pero no se limitan a, un átomo de halógeno (p. ej., un grupo cloruro, bromuro, fluoruro o yoduro), un ácido carboxílico (p. ej., -C(O)OH), un alcohol (p. ej., un hidroxilo, -OH), un éster (p. ej., -C(O)OR o -OC(O)R), un aldehído (p. ej.,-C(O)H), un carbonilo (p. ej., -C(O)R, representado alternativamente por C=O), un haluro de acilo (p. ej., -C(O)X, en el que X es un haluro seleccionado de bromuro, fluoruro, cloruro y yoduro), un carbonato (p. ej., -OC(O)OR), un alcoxi (p. ej., -OR), un acetal (p. ej., -C(OR)2R"”, en el que cada OR son grupos alcoxi que pueden ser iguales o diferentes y R"” es un grupo alquilo o alquenilo), un fosfato (p. ej., P(O) 43-), un tiol (p. ej., -SH), un sulfóxido (p. ej., -S(O)R), un ácido sulfínico (p. ej., -S(O)OH), un ácido sulfónico (p. ej., -S(O)2OH), un tial (p. ej., -c (s )H), un sulfato (p. ej., S(O)42-), un sulfonilo (p. ej., -S(O)2-), una amida (p. ej., -c (o )NR2, o -N(R)C(O)R), un azido (p. ej., -N3), un nitro (p. ej., -NO2), un ciano (p. ej., -CN), un isociano (p. ej.,-NC), un aciloxi (p. ej., -OC(O)R), un amino (p. ej., -Nr 2, -NRH o -NH2), un carbamoilo (p. ej., -OC(O)NR2, -OC(O)NRH o -OC(O)NH2), una sulfonamida (p.ej., -S(O)2NR2, -S(O)2NRH, -S(O)2NH2, -N(R)S(O)2R, -N(h )s (O)2R, -N(R)S(O)2H, o -N(H)S(O)2H), un grupo alquilo, un grupo alquenilo y un grupo ciclilo (p. ej., carbociclilo o heterociclilo). En cualquiera de los anteriores, R es un grupo alquilo o alquenilo, como se define en el presente documento. Los propios grupos sustituyentes pueden estar sustituidos adicionalmente con, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se define en el presente documento. Por ejemplo, un grupo alquilo C16 puede estar sustituido adicionalmente con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se describe en el presente documento.
Los compuestos de la descripción que contienen nitrógenos se pueden convertir en N-óxidos mediante tratamiento con un agente oxidante (p. ej., ácido 3-cloroperoxibenzoico (mCPBA) y/o peróxidos de hidrógeno) para producir otros compuestos de la descripción. Por lo tanto, se considera que todos los compuestos que contienen nitrógeno mostrados y reivindicados, cuando lo permitan la valencia y la estructura, incluyen tanto el compuesto como se muestra como su derivado de N-óxido (que puede designarse como N^O o N+-O-). Además, en otros casos, los nitrógenos en los compuestos de la descripción se pueden convertir en compuestos N-hidroxi o N-alcoxi. Por ejemplo, los compuestos N-hidroxi pueden prepararse por oxidación de la amina original con un agente oxidante tal como m CPBA. Todos los compuestos que contienen nitrógeno mostrados y reivindicados también se considera que cubren, cuando lo permiten la valencia y la estructura, tanto el compuesto como se muestra como sus derivados de N-hidroxi (es decir, N-OH) y N-alcoxi (es decir, N-OR, en donde R es alquilo C1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, carbociclo de 3-14 miembros o heterociclo de 3-14 miembros sustituidos o no sustituidos).
Otros componentes de la composición lipídica
La composición lipídica de una composición farmacéutica descrita en el presente documento y definida en las reivindicaciones puede incluir uno o más componentes además de los descritos anteriormente. Por ejemplo, la composición lipídica puede incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes de alteración de la superficie (p. ej., tensioactivos) u otros componentes. Por ejemplo, una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2005/0222064. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (p. ej., glucosa) y polisacáridos (p. ej., glucógeno y derivados y análogos del mismo).
Se puede incluir un polímero en y/o utilizarse para encapsular o encapsular parcialmente una composición farmacéutica descrita en la presente memoria (p. ej., una composición farmacéutica en forma de nanopartículas lipídicas). Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero puede seleccionarse de, pero no está limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.
La relación entre la composición lipídica y el polinucleótido varía de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1 (p/p).
La relación entre la composición lipídica y el polinucleótido puede ser de aproximadamente 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 o 60:1 (p/p). La relación en peso/peso de la composición lipídica al polinucleótido que codifica un agente terapéutico puede ser de aproximadamente 20:1 o aproximadamente 15:1.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se define en las reivindicaciones y puede contener más de un polipéptido. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede contener dos o más polinucleótidos (es decir ARN, es decir, ARNm).
Las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento pueden comprender polinucleótidos (es decir, ARNm) en una relación en peso de lípido:polinucleótido de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1 o 70:1, o un intervalo o cualquiera de estas relaciones tales como, pero no limitado a, de 5:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 5:1 aproximadamente 20:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 5:1 aproximadamente 30:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 5:1 aproximadamente 40:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 5:1 aproximadamente 50:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 5:1 aproximadamente 60:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 10:1 aproximadamente 15:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 aproximadamente 25:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1, , de aproximadamente 10:1 aproximadamente 35:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1, , de aproximadamente 10:1 aproximadamente 45:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1, , de aproximadamente 10:1 aproximadamente 55:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1, , de aproximadamente 10:1 aproximadamente 70:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1, , de aproximadamente 15:1 aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1, , de aproximadamente 15:1 aproximadamente 35:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 40:1, , de aproximadamente 15:1 aproximadamente 45:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 50:1, , de aproximadamente 15:1 aproximadamente 55:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 60:1 o de aproximadamente 15:1 aproximadamente 70:1.
Las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento pueden comprender el polinucleótido en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 2 mg/ml tal como, pero no limitado a, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml o mayor de 2,0 mg/ml.
Composiciones de nanopartículas
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se formulan como nanopartículas lipídicas (LNP), como se define en las reivindicaciones. En consecuencia, la presente descripción también proporciona composiciones de nanopartículas que comprenden (i) una composición lipídica que comprende un agente de suministro tal como el compuesto descrito en el presente documento, y (ii) un polinucleótido, como se define en las reivindicaciones que codifican un polipéptido. En dicha composición de nanopartículas, la composición de lípidos descrita en el presente documento puede encapsular el polinucleótido que codifica un polipéptido.
Las composiciones de nanopartículas suelen tener un tamaño del orden de micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (p. ej., vesículas lipídicas) y lipoplejos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede ser un liposoma que tiene una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.
Las composiciones de nanopartículas incluyen, por ejemplo, nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas y lipoplejos. En algunas realizaciones, las composiciones de nanopartículas son vesículas que incluyen una o más bicapas lipídicas. Una composición de nanopartículas puede incluir dos o más bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos. Las bicapas lipídicas pueden funcionalizarse y/o reticularse entre sí. Las bicapas lipídicas pueden incluir uno o más ligandos, proteínas o canales.
Una nanopartícula lipídica puede comprender un lípido ionizable, un lípido estructural, un fosfolípido y ARNm. La LNP puede comprender un lípido ionizable, un lípido modificado con PEG, un esterol y un lípido estructural. El LNP puede tener una relación molar de aproximadamente 20-60% de lípido ionizable: aproximadamente 5-25% de lípido estructural: aproximadamente 25-55% de esterol; y aproximadamente 0,5-15% de lípido modificado con PEG.
La LNP puede tener un valor de polidispersidad de menos de 0,4. La LNP puede tener una carga neutra neta a un pH neutro. La LNP puede tener un diámetro medio de 50-150 nm. El LNP puede tener un diámetro medio de 80-100 nm.
Como se define en general en el presente documento, el término "lípido" se refiere a una molécula pequeña que tiene propiedades hidrófobas o anfifílicas. Los lípidos pueden ser naturales o sintéticos. Los ejemplos de clases de lípidos incluyen, pero no se limitan a, grasas, ceras, metabolitos que contienen esteroles, vitaminas, ácidos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos y policétidos y lípidos de prenol. En algunos casos, las propiedades anfifílicas de algunos lípidos los conducen a formar liposomas, vesículas o membranas en medios acuosos.
Una nanopartícula lipídica (LNP) puede comprender un lípido ionizable. Como se usa en el presente documento, la expresión "lípido ionizable" tiene su significado habitual en la técnica y puede referirse a un lípido que comprende uno o más restos cargados. En algunas realizaciones, un lípido ionizable puede estar cargado positivamente o cargado negativamente. Un lípido ionizable puede estar cargado positivamente, en cuyo caso puede denominarse "lípido catiónico". Una molécula de lípido ionizable puede comprender un grupo amina, y puede denominarse un aminolípido ionizable. Tal y como se usa en el presente documento, un "resto cargado" es un resto químico que lleva una carga electrónica formal, p. ej., monovalente (+1, o -1), divalente (+2, o -2), trivalente (+3, o -3), etc. El resto cargado puede ser aniónico (es decir, cargado negativamente) o catiónico (es decir, cargado positivamente). Los ejemplos de restos cargados positivamente incluyen grupos amina (p. ej., amina primaria, secundaria, y/o terciaria), grupos amonio, grupo piridinio, grupos guanidina y grupos imidizolio. Los restos cargados comprenden grupos amina. Los ejemplos de grupos cargados negativamente o precursores de los mismos incluyen grupos carboxilato, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfonato, grupos fosfato, grupos hidroxilo y similares. La carga del resto cargado puede variar, en algunos casos, con las condiciones ambientales, por ejemplo, los cambios en el pH pueden alterar la carga del resto, y/o hacer que el resto se convierta en cargado o no cargado. En general, la densidad de carga de la molécula se puede seleccionar como se desee.
Debe entenderse que los términos "cargado" o "resto cargado" no se refieren a una "carga negativa parcial" o "carga positiva parcial" en una molécula. A las expresiones "carga negativa parcial" y "carga positiva parcial" se les da su significado ordinario en la técnica. Una "carga negativa parcial" puede resultar cuando un grupo funcional comprende un enlace que se polariza de tal manera que la densidad de electrones es atraída hacia un átomo del enlace, creando una carga negativa parcial en el átomo. Los expertos en la técnica reconocerán, en general, enlaces que pueden polarizarse de esta manera.
El lípido ionizable puede ser un aminolípido ionizable, a veces denominado en la técnica un "lípido catiónico ionizable". El aminolípido ionizable puede tener una cabeza hidrófila cargada positivamente y una cola hidrófoba que están conectadas a través de una estructura conectora.
Además de estos, un aminolípido ionizable también puede ser un lípido que incluye un grupo amina cíclica.
El lípido ionizable se puede seleccionar de, pero no se limita a, un lípido ionizable descrito en las publicaciones internacionales N.° WO2013086354 y WO2013116126.
El lípido ionizable se puede seleccionar de, pero no se limita a, la fórmula CLI-CLXXXXII de la patente de EE. UU. N.° 7,404,969.
El lípido puede ser un lípido escindible tal como los descritos en la publicación internacional N.° WO2012170889.
El lípido puede sintetizarse por métodos conocidos en la técnica y/o como se describe en la publicación internacional N.° WO2013086354.
Las composiciones de nanopartículas se pueden caracterizar por una variedad de métodos. Por ejemplo, puede usarse microscopía (p.ej., microscopía electrónica de transmisión o microscopía electrónica de barrido) para examinar la morfología y distribución de tamaños de una composición de nanopartículas. La dispersión dinámica de la luz o la potenciometría (p. ej., titulaciones potenciométricas) pueden usarse para medir los potenciales zeta. La dispersión dinámica de la luz también se puede utilizar para determinar el tamaño de las partículas. También se pueden utilizar instrumentos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para medir múltiples características de una composición de nanopartículas, tales como el tamaño de las partículas, el índice de polidispersidad y el potencial zeta.
El tamaño de las nanopartículas puede ayudar a contrarrestar reacciones biológicas tales como, pero no limitadas a, inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del polinucleótido.
Como se usa en el presente documento, "tamaño" o "tamaño medio" en el contexto de las composiciones de nanopartículas se refiere al diámetro medio de una composición de nanopartículas.
El polinucleótido que codifica un polipéptido se puede formular en nanopartículas lipídicas que tienen un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm tal como, pero no limitado a, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
Las nanopartículas pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. La nanopartícula puede tener un diámetro mayor de 100 nm, mayor de 150 nm, mayor de 200 nm, mayor de 250 nm, mayor de 300 nm, mayor de 350 nm, mayor de 400 nm, mayor de 450 nm, mayor de 500 nm, mayor de 550 nm, mayor de 600 nm, mayor de 650 nm, mayor de 700 nm, mayor de 750 nm, mayor de 800 nm, mayor de 850 nm, mayor de 900 nm, mayor de 950 nm o mayor de 1.000 nm.
La dimensión más grande de una composición de nanopartículas puede ser 1 μm o más corta (p. ej., 1 μm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm o más corta).
Una composición de nanopartículas puede ser relativamente homogénea. Se puede usar un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, p. ej., la distribución del tamaño de partículas de la composición de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (p. ej., inferior a 0,3) generalmente indica una distribución de tamaño de partículas estrecha. Una composición de nanopartículas puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,25, tal como 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. El índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas descrita en el presente documento puede ser de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,20.
El potencial zeta de una composición de nanopartículas puede usarse para indicar el potencial electrocinético de la composición. Por ejemplo, el potencial zeta puede describir la carga superficial de una composición de nanopartículas. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más altamente cargadas pueden interaccionar de manera indeseable con células, tejidos y otros elementos del cuerpo. El potencial zeta de una composición de nanopartículas descrita en el presente documento puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV, o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.
El potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 60 mV, y de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 50 mV. En algunas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 15 mV a aproximadamente 45 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, y de aproximadamente 25 mV a aproximadamente 35 mV. En algunas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV, aproximadamente 20 mV, aproximadamente 30 mV, aproximadamente 40 mV, aproximadamente 50 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 70 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 90 mV, y aproximadamente 100 mV.
La expresión "eficiencia de encapsulación" de un polinucleótido describe la cantidad del polinucleótido que se encapsula o se asocia de otro modo con una composición de nanopartículas después de la preparación, en relación con la cantidad inicial proporcionada. Como se usa en el presente documento, "encapsulación" puede referirse a un encierro, confinamiento, envuelta o recubrimiento completo, sustancial o parcial.
La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (p. ej., cerca de 100%). La eficiencia de encapsulación puede medirse, por ejemplo, comparando la cantidad de polinucleótido en una solución que contiene la composición de nanopartículas antes y después de romper la composición de nanopartículas con uno o más disolventes orgánicos o detergentes.
La fluorescencia puede usarse para medir la cantidad de polinucleótido libre en una solución. Para las composiciones de nanopartículas descritas en el presente documento, la eficiencia de encapsulación de un polinucleótido puede ser al menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. La eficiencia de encapsulación puede ser de al menos 80%. La eficiencia de encapsulación puede ser de al menos 90%.
La cantidad de un polinucleótido presente en una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede depender de múltiples factores, tales como el tamaño del polinucleótido, la diana deseada y/o aplicación, u otras propiedades de la composición de nanopartículas, así como de las propiedades del polinucleótido.
Por ejemplo, la cantidad de un ARNm útil en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño (expresado como longitud o masa molecular), la secuencia y otras características del ARNm. Las cantidades relativas de un polinucleótido en una composición de nanopartículas también pueden variar.
Las cantidades relativas de la composición lipídica y el polinucleótido presente en una composición de nanopartículas lipídicas de la presente descripción pueden optimizarse según consideraciones de eficacia y tolerabilidad. Para las composiciones que incluyen un ARNm como polinucleótido, la relación N:P puede servir como una medida útil.
Como la relación N:P de una composición de nanopartículas controla tanto la expresión como la tolerabilidad, son deseables las composiciones de nanopartículas con bajas relaciones N:P y expresión fuerte. Las relaciones N:P varían según la relación de lípidos a ARN en una composición de nanopartículas.
En general, se prefiere una relación N:P más baja. El uno o más ARN, lípidos y cantidades de los mismos se pueden seleccionar para proporcionar una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26: 1, 28:1 o 30:1. La relación puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. La relación N:P puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. La relación N:P puede estar entre 5:1 y 6:1. En un aspecto específico, la relación N:P es aproximadamente de aproximadamente 5,67:1.
Además de proporcionar composiciones de nanopartículas, la presente descripción también proporciona métodos para producir nanopartículas lipídicas que comprenden encapsular un polinucleótido. Dicho método comprende usar cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y producir nanopartículas lipídicas según los métodos de producción de nanopartículas lipídicas conocidos en la técnica. Véase, Wang et al. (2015) "Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles" Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al. (2015) "Delivery Systems for Biopharmaceuticals. Part I: Nanoparticles and Microparticles" Curr. Pharm. Technol. 16: 940-954; Naseri et al. (2015) "Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application" Adv. Pharm. Bull. 5:305-13; Silva et al. (2015) "Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals" Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, y las referencias citadas en estas.
La invención se define en las reivindicaciones.
Otros agentes de administración
a. Liposomas, lipoplejos y nanopartículas lipídicas
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender un agente de administración, p. ej., un liposoma, un lipoplejo, una nanopartícula lipídica o cualquier combinación de los mismos. Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) se pueden formular utilizando uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. Se pueden usar liposomas, lipoplejos o nanopartículas de lípidos para mejorar la eficacia de la producción de proteínas dirigida por polinucleótidos, ya que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular por el polinucleótido; y/o aumentar la traducción de la proteína codificada. Los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas también se pueden usar para aumentar la estabilidad de los polinucleótidos.
Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículo de suministro para la administración de formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños. Una vesícula multilaminar (MLV) puede tener cientos de nanómetros de diámetro y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por estrechos compartimentos acuosos. Una vesícula unicelular pequeña (SUV) puede tener menos de 50 nm de diámetro, y una vesícula unilamelar grande (LUV) puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligandos para mejorar la unión de los liposomas a tejidos enfermos o para activar sucesos tales como, pero no limitados a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH alto o bajo con el fin de mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.
La formación de liposomas puede depender de la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en el que se dispersan las vesículas lipídicas, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su toxicidad potencial, cualquier proceso adicional implicado durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño óptimo, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad de lote a lote y la producción a gran escala de productos liposomales seguros y eficientes, etc.
Como un ejemplo no limitante, los liposomas tales como vesículas de membrana sintética se pueden preparar por los métodos, aparatos y dispositivos descritos en las publicaciones de Patente de EE. UU. N.° US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 y US20130183372. Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden ser encapsulados por el liposoma y/o pueden estar contenidos en un núcleo acuoso, que puede ser encapsulado luego por el liposoma, como se describe en, p. ej., las Pub. Intl. N.° WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901, WO2012006378, y WO2013086526; y Pub. de EE. UU. N.° US20130189351, US20130195969 y US20130202684.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprende un núcleo de aceite y un lípido catiónico que puede interaccionar con el polinucleótido que ancla la molécula a la partícula de emulsión. Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una emulsión de agua en aceite que comprende una fase hidrófoba continua en la que se dispersa la fase hidrófila. Las emulsiones de ejemplo se pueden preparar mediante los métodos descritos en las Pub. Intl. N.° WO2012006380 y WO201087791.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un complejo de lípido-policatión. La formación del complejo lípido-policatión puede lograrse mediante métodos como se describen en la Pub. de EE. UU. US20120178702. Como ejemplo no limitante, el policatión puede incluir un péptido catiónico o un polipéptido tal como, pero no limitado a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en las Pub. Intl. N.° WO2012013326 o publicación de EE. UU. N.° US20130142818.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una nanopartícula lipídica (LNP) como las descritas en las Pub. Intl. N.° WO2013123523, WO2012170930, WO2011127255 y WO2008103276; y Pub. de EE. UU. N.° US20130171646.
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas normalmente comprenden uno o más lípidos. El lípido puede ser un lípido ionizable (p. ej., un aminolípido ionizable), a veces denominado en la técnica un "lípido catiónico ionizable". Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden comprender además otros componentes, incluidos un fosfolípido, un lípido estructural y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un PEG o un lípido modificado con PEG.
Los lípidos ionizables de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera de los Compuestos 1-342 descritos en el presente documento, DLin-MC3-DMA (MC3), DLin-DMA, DLenDMA, DLin-D-DMA, DLin-K-DMA, DLin-M-C2-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-KC3-DMA, DLin-KC4-DMA, DLin-C2K-DMA, DLin-MP-DMA, DODMA, 98N12-5, C12-200, DLin-C-DAP, DLin-DAC, DLinDAP, DLinAP, DLin-EG-DMA, DLin-2-DMAP, KL10, KL22, KL25, Octil-CLinDMA, Octil-CLinDMA (2R), Octil-CLinDMA (2S), y cualquier combinación de los mismos. Otros lípidos ionizablrd de ejemplo incluyen (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1- amina (L608), (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (16Z,19Z)-N5N-dimetilpentacosa-16,19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildocosa-13,16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21 -dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihilocfacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriaconta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-1 -nonilicosa-11, 14-dien-1 -il]pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-10-amina, (15Z)-N,N-dimetilheptacos-15-en-10-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-10-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-10-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12,15-dien-1-amina, N,N-dimetil-1-[(IS,2R)-2-octilciclopropil] eptadecan-8-amina, I-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-I-[(1S,2R)-2- octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetil-[(IR,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(IS,2R)-2-octilciclopropil]heptil}-dodecan-1-amina, 1-[(1 R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1 -[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1 -{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1 -iloxi]propan-2-amina, 1 -{2-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-I-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-I-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-Mloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-I-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-I-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-I-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctil)oxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1 R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina y (11E,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-11,20,2-trien-10-amina, y cualquier combinación de los mismos.
Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tales como esfingomielina. En
Los fosfolípidos pueden ser DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 Diéter PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE,DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos. Los fosfolípidos pueden ser MPPC, MSPC, PMPC, PSPC, SMPC, SPPC, DHAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos. La cantidad de fosfolípidos (p. ej., DSPC) en la composición de lípidos puede variar de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 20% en moles.
Los lípidos estructurales incluyen esteroles y lípidos que contienen restos de esteroles. Los lípidos estructurales pueden incluir colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, fomafina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y mezclas de los mismos. El lípido estructural puede ser colesterol. La cantidad de lípidos estructurales (p. ej., colesterol) en la composición lipídica puede variar de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 60% en moles.
Los PEG-lípidos incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (p. ej., PEG-C6rC14 o PEG-C6rC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Dichos lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un lípido PEG puede ser PEG-o-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido PEG-DSPE. El PEG-lípido puede ser 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diesteril-glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-o-DMA). El resto de PEG puede tener un tamaño de aproximadamente 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 15.000 o 20.000 daltons. La cantidad de PEG-lípido en la composición lipídica puede variar de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 5% en moles.
Las formulaciones de LNP descritas en el presente documento pueden comprender adicionalmente una molécula que mejore la permeabilidad. Moléculas que mejoran la permeabilidad no limitantes se describen en la Pub. de EE. UU. N.° US20050222064.
Las formulaciones de LNP pueden contener además un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulación in vivo y/o aumentar la administración dirigida de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato se pueden hacer por los métodos descritos en, p. ej., la Pub. Intl. N.° WO2013033438 o Pub. de EE. UU. N° US20130196948. La formulación de LNP también puede contener un conjugado polimérico (p. ej., un conjugado soluble en obleas) como se describe, p. ej., en las Pub. de EE. UU. N.° US20130059360, US20130196948y US20130072709.
Las formulaciones de LNP pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente invención en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir el aclaramiento fagocítico de las nanopartículas en un sujeto. El conjugado puede ser un “autopéptido” diseñado a partir de la proteína de membrana humana CD47 (p. ej., las “autopartículas” descritas por Rodriguez et al., Science 2013 339, 971-975). Como se muestra en Rodriguez et al., los autopéptidos retrasaron el aclaramiento mediado por macrófagos de las nanopartículas, lo cual mejoró la administración de las nanopartículas.
Las formulaciones de LNP pueden comprender un vehículo de carbohidrato. A modo de ejemplo no limitante, el vehículo de carbohidrato puede incluir, pero no se limitan a, un material similar a glicógeno o fitoglicógeno modificado con anhídrido, succinato de fitoglicógeno de octenilo, fitoglicógeno de beta-dextrina, fitoglicógeno de beta-dextrina modificado con anhídrido (p. ej., Pub. Intl. N.° WO2012109121).
Las formulaciones de LNP pueden recubrirse con un tensioactivo o polímero para mejorar la administración de la partícula. La LNP se puede recubrir con un recubrimiento hidrófilo, tal como, pero no limitado a, recubrimientos de PEG y/o recubrimientos que tienen una carga superficial neutra como se describe en la Pub. de EE. UU. N.° US20130183244.
Las formulaciones de LNP pueden diseñarse por ingeniería para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa como se describe en la Pat. de EE. UU. N.° 8,241,670 o Pub. Intl. N.° WO2013110028.
La LNP diseñada para penetrar la mucosa puede comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero-vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, pero no se limita a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.
El LNP diseñado para penetrar en la mucosa también puede incluir agentes que alteran la superficie tales como pero no limitados a, polinucleótidos, proteínas aniónicas (p. ej., albúmina de suero bovino), tensioactivos (p. ej., tensioactivos catiónicos tales como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcar (p. ej., ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (p. ej., heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (p. ej., N-acetilcisteína, artemisa, bromelina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol , sobrerol, domiodol, letosteína, stepronina, tiopronina, geIsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y varias DNasas, incluida la rhDNasa.
Las LNP que penetran la mucosa pueden ser una formulación hipotónica que comprende un recubrimiento que mejora la penetración en la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio al cual se está administrando. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de formulaciones hipotónicas en, p. ej., la Pub. Intl.
N.° WO2013110028.
El polinucleótido descrito en el presente documento se formula como un lipoplejo, tal como, sin limitación, el sistema ATUPLEXTM, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de ARNpi-lipoplejo de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECTTM de STEMGENT® (Cambridge, Ma ) y polietilenimina (PEI) o suministro dirigido y no dirigido de ácidos nucleicos basado en protamina (AAleku et al. Cáncer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther.201023:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31 : 180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA.
2007 6;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se formulan como una nanopartícula lipídica sólida (SLN), que puede ser esférica con un diámetro promedio entre 10 y 1000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipófilas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. Los SLN de ejemplo pueden ser los descritos en la Pub. Intl. N.° WO2013105101.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden formularse para liberación controlada y/o administración dirigida. Como se usa en el presente documento, “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se cumple con un patrón particular de liberación para producir un resultado terapéutico. En una realización, los polinucleótidos se pueden encapsular en un agente de administración descrito en el presente documento y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Como se usa en el presente documento, el término "encapsular" significa envolver, rodear o encerrar. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la invención, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. La expresión "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o más de 99% de la composición o compuesto farmacéutico puede estar envuelta, rodeada o encerrada dentro del agente de administración. "Encapsulación parcial" significa que menos de 10, 10, 20, 30, 40 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto puede estar encerrado, rodeado o envuelto dentro del agente de administración.
Ventajosamente, la encapsulación puede estar determinada mediante la medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la invención mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos el 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9 o más de 99% de la composición farmacéutica o compuesto se encapsula en el agente de administración.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden encapsular en una nanopartícula terapéutica, denominada en el presente documento "polinucleótidos en nanopartículas terapéuticas". Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular mediante métodos descritos, p. ej., en las Pub. Intl N.° W02010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, y WO2012054923; y Pub. de EE. UU. N.° US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20120140790, US20130123351 y US20130230567; y Pat. de EE. UU. N.° 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 y 8,318,211.
El polinucleótido en nanopartícula terapéutica se puede formular para liberación sostenida. Como se usa en el presente documento, "liberación sostenida" se refiere a una composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, pero no se limita a, horas, días, semanas, meses y años. Como un ejemplo no limitante, la nanopartícula de liberación sostenida de los polinucleótidos descritos en el presente documento se puede formular como se describe en las Pub. Intl N.° WO2010075072 y Pub. de EE. UU. N.° US20100216804, US20110217377, US20120201859 y US20130150295.
El polinucleótido en nanopartícula terapéutica se puede formular para que sea específico de la diana, como los descritos en las Pub. Intl. N.° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y WO2011084518; y Pub. de EE. UU. N.° US20100069426, US20120004293 y US20100104655.
Las LNP se pueden preparar utilizando mezcladores de microfluidos o micromezcladores. Los mezcladores de microfluidos de ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, un micromezclador interdigital de hendidura que incluye, pero no se limita a los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador en espiga escalonada (SHM) (véase Zhigaltsevet al., "Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing," Langmuir 28:3633-40 (2012); Belliveau et al., "Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA," Molecular Therapy-Nucleic Acids. 1 :e37 (2012); Chen et al., "Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation," J. Am. Chem. Soc.
134(16):6948-51 (2012)). Los micromezcladores de ejemplo incluyen el mezclador microestructurado interdigital de hendidura (SIMM-V2) o un micromezclador interdigital de hendidura estándar (SSIMM) o Caterpillar (CPMM) o chorro de impacto (IJMM) del Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania. Los métodos para hacer LNP usando SHM pueden comprender además mezclar al menos dos corrientes de entrada en donde la mezcla ocurre por advección caótica inducida por microestructura (MICA). Según este método, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espiga, produciendo un flujo rotacional y plegando los fluidos uno alrededor del otro. Este método también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, en donde la superficie cambia de orientación durante el ciclado de fluido. Los métodos para generar LNP usando SHM incluyen los descritos en las Pub. de EE. UU. N.° US20040262223 y US20120276209.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en nanopartículas lipídicas usando tecnología de microfluidos (véase Whitesides, George M., "The Origins and the Future of Microfluidics," Nature 442: 368-373 (2006); y Abraham et al., "Chaotic Mixer for Microchannels", Science 295: 647-651 (2002)). Los polinucleótidos se pueden formular en nanopartículas lipídicas utilizando un chip micromezclador tal como, pero no limitado a, los de Harvard Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, RU). Un chip de micromezcladora puede utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de división y recombinación.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en nanopartículas líquidas que tienen un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm tal como, pero no se limitan a, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
Las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. La nanopartícula lipídica puede tener un diámetro mayor de 100 nm, mayor de 150 nm, mayor de 200 nm, mayor de 250 nm, mayor de 300 nm, mayor de 350 nm, mayor de 400 nm, mayor de 450 nm, mayor de 500 nm, mayor de 550 nm, mayor de 600 nm, mayor de 650 nm, mayor de 700 nm, mayor de 750 nm, mayor de 800 nm, mayor de 850 nm, mayor de 900 nm, mayor de 950 nm o mayor de 1.000 nm.
Los polinucleótidos se pueden administrar utilizando LNP más pequeños. Dichas partículas pueden comprender un diámetro de menos de 0,1 |jm hasta 100 nm tal como, pero no limitado a, menos de 0,1 |jm, menos de 1,0 jm , menos de 5 jm , menos de 10 jm , menos de 15 um, menos de 20 um, menos de 25 um, menos de 30 um, menos de 35 um, menos de 40 um, menos de 50 um, menos de 55 um, menos de 60 um, menos de 65 um, menos de 70 um, menos de 75 um, menos de 80 um, menos de 85 um, menos de 90 um, menos de 95 um, menos de 100 um, menos de 125 um, menos de 150 um, menos de 175 um, menos de 200 um, menos de 225 um, menos de 250 um, menos de 275 um, menos de 300 um, menos de 325 um, menos de 350 um, menos de 375 um, menos de 400 um, menos de 425 um, menos de 450 um, menos de 475 um, menos de 500 um, menos de 525 um, menos de 550 um, menos de 575 um, menos de 600 um, menos de 625 um, menos de 650 um, menos de 675 um, menos de 700 um, menos de 725 um, menos de 750 um, menos de 775 um, menos de 800 um, menos de 825 um, menos de 850 um, menos de 875 um, menos de 900 um, menos de 925 um, menos de 950 um, o menos de 975 um.
Las nanopartículas y micropartículas descritas en el presente documento pueden diseñarse geométricamente para modular la respuesta inmunitaria y/o de macrófagos. Las partículas diseñadas geométricamente pueden tener formas, tamaños y/o cargas superficiales variadas para incorporar los polinucleótidos descritos en el presente documento para la administración dirigida, tal como, pero no limitada a, la administración pulmonar (véase, p. ej., la Pub. Intl. N.° WO2013082111). Otras características físicas que las partículas diseñadas geométricamente pueden incluir, pero no se limitan a, fenestraciones, brazos en ángulo, asimetría y rugosidad de la superficie, carga que pudiera alterar las interacciones con las células y los tejidos.
Las nanopartículas descritas en el presente documento pueden ser nanopartículas enmascaradas (stealth) o nanopartículas sigilosas enmascaradas de la diana tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Pub de EE. UU. N.° US20130172406. Las nanopartículas enmascaradas o enmascaradas específicas de la diana pueden comprender una matriz polimérica, que puede comprender dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli (ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, poliésteres, polianhídridos, poliéteres, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos, policianoacrilatos, o combinaciones de los mismos.
b. Lipidoides
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender un agente de administración, p. ej., un lipidoide. Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) se pueden formular con lipidoides. Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contengan estos lipidoides y, por lo tanto, lograr un suministro efectivo del polinucleótido, considerado por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación de lipidoide a través de vías de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos de lipidoides de polinucleótidos pueden administrarse por diversos medios, incluyendo, pero no limitados a, las vías intravenosa, intramuscular o subcutánea.
La síntesis de lipidoides se describe en la bibliografía (véase Mahon et al., Bioconjug. Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011108:12996-3001).
Las formulaciones con los diferentes lipidoides, que incluyen, pero no se limitan a, hidrocloruro de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilenetetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluidos derivados y variantes) y MD1, se pueden ensayar para determinar la actividad in vivo. El lipidoide "98N12-5" es descrito por Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879. El lípidoide "C12-200" es descrito por Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 y Liu y Huang, Molecular Therapy. 2010669-670.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un lipidoide de aminoalcohol. Los lipidoides de aminoalcohol se pueden preparar por los métodos descritos en la Patente de EE. UU. N.° 8,450,298.
Las formulaciones de lipidoides pueden incluir partículas que comprenden 3 o 4 o más componentes además de los polinucleótidos. Las formulaciones de lipidoides y polinucleótidos que comprenden lipidoides se describen en la Pub. Int. N.° WO 2015051214.
c. Hialuronidasa
Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) pueden comprender hialuronidasa para inyección (p. ej., inyección intramuscular o subcutánea). La hialuronidasa cataliza la hidrólisis del hialuronano, que es un constituyente de la barrera intersticial. La hialuronidasa reduce la viscosidad del hialuronano, por lo que aumenta la permeabilidad de los tejidos (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Alternativamente, la hialuronidasa puede usarse para aumentar el número de células expuestas a los polinucleótidos administrados por vía intramuscular o subcutánea.
d. Miméticos de nanopartículas
Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) se pueden encapsular y/o absorber en un mimético de nanopartículas. Un mimético de nanopartículas puede imitar la función de administración de organismos o partículas tales como, pero no limitado a, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como un ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden encapsular en una partícula no virión que pueda imitar la función de administración de un virus (véase, p. ej., la Pub. Intl. N.° WO2012006376 y Pub. de EE. UU. N.° US20130171241 y US20130195968).
e. Nanopartículas autoensambladas o macromoléculas autoensambladas
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) en nanopartículas autoensambladas o macromoléculas anfifílicas (AM) para la administración. Las AM comprenden polímeros anfifílicos biocompatibles que tienen una cadena principal de azúcar alquilado unida covalentemente a poli(etilenglicol). En solución acuosa, las AM se autoensamblan para formar micelas. Las nanopartículas autoensambladas de ácido nucleico se describen en la Solicitud Intl. N.° PCT/US2014/027077, y las AM y los métodos para formar AM se describen en la Pub. de EE. UU. N.° US20130217753.
f. Cationes y aniones
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) y un catión o anión, tal como Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+ y combinaciones de los mismos. Las formulaciones de ejemplo pueden incluir polímeros y un polinucleótido en complejo con un catión metálico como se describe en, p. ej., las Pat. de EE. UU. N.° 6,265,389 y 6,555,525. Las nanopartículas catiónicas pueden contener una combinación de cationes divalentes y monovalentes. El suministro de polinucleótidos en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprenden nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad de los polinucleótidos al actuar como un depósito de acción prolongada y/o reduciendo la tasa de degradación por nucleasas.
g. Aminoácido-lípidos
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) que está formulado con un aminoácido-lípido. Los aminoácido-lípidos son compuestos lipófilos que comprenden un resto de aminoácido y una o más colas lipófilas. Los ejemplos no limitantes de aminoácido-lípidos y métodos para preparar aminoácido-lípidos se describen en la Pat. de EE. UU. N.° 8,501,824. Las formulaciones de aminoácido-lípidos pueden administrar un polinucleótido en forma liberable que comprende un aminoácido-lípido que se une y libera los polinucleótidos. Como un ejemplo no limitante, la liberación de los polinucleótidos descritos en el presente documento puede proporcionarse mediante un conector lábil frente a ácidos como se describe en, p. ej., las Pat. de EE. u U. N.° 7,098,032, 6,897,196, 6,426,086, 7,138,382, 5,563,250, y 5,505,931.
h. Complejos de interpolielectrolitos
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) en un complejo de interpolielectrolitos. Los complejos de interpolielectrolitos se forman cuando los polímeros de carga dinámica forman complejos con una o más moléculas aniónicas. Los ejemplos no limitantes de polímeros de carga dinámica y complejos de interpolielectrolitos y métodos para preparar complejos de interpolielectrolitos se describen en la Pat. de EE. UU. N.° 8,524,368.
i. Sistemas poliméricos cristalinos
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) en sistemas poliméricos cristalinos. Los sistemas poliméricos cristalinos son polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos. Los polímeros de ejemplo se describen en la Pat. de EE. UU. N.° 8,524,259.
j. Polímeros, nanopartículas biodegradables y nanopartículas de núcleo-cubierta
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) y un polímero natural y/o sintético. Los polímeros incluyen, pero no se limitan a, polietilenos, polietilenglicol (PEG), poli(l-lisina) (PLL), PEG injertado en PLL, lipopolímero catiónico, lipopolímero catiónico biodegradable, polietilenimina (PEI), poli(alquileniminas) ramificadas reticuladas, un derivado de poliamina, un poloxámero modificado, polímero biodegradable elástico, copolímero biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímeros multibloques, poli[a-(4-aminobutil)-L-ácido glicólico) (PAGA), copolímeros multibloque catiónicos reticulados biodegradables, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfacenos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, polietilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), polímeros que contienen amina, polímeros de dextrano, derivados de polímeros de dextrano o combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de polímeros incluyen, formulaciones DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA) de MIRu S® Bio (Madison, WI) y Roche Madison (Madison, Wl), formulaciones de polímeros PHASERXTM tales como, sin limitación, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (PHASERX®, Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxámero, adyuvante VAXFECTINO de Vical (San Diego, CA), quitosano, ciclodextrina de Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros y polímeros de poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA). Polímeros RONDELTM (Administración de nanopartículas de ARNi/Oligonucleótido) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) y polímeros de co-bloques sensibles al pH tales como PHASERX® (Seattle, WA).
La formulación de polímero permite la liberación sostenida o retardada del polinucleótido (p. ej., después de una inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado para el polinucleótido puede dar como resultado, por ejemplo, la traducción de una proteína codificada durante un período de tiempo prolongado. La formulación de polímero también se puede usar para aumentar la estabilidad del polinucleótido. Las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir, pero no se limitan a, microesferas de PLGA, etilenoacetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEALO (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
Como ejemplo no limitante, se puede formular ARNm modificado en microesferas de PLGA preparando las microesferas de PLGA con velocidades de liberación ajustables (p. ej., días y semanas) y encapsulando el ARNm modificado en las microesferas de PLGA mientras se mantiene la integridad del ARNm modificado durante el procedimiento de encapsulación. Los EVAc son polímeros biocompatibles no biodegradables que se utilizan ampliamente en aplicaciones preclínicas de implantes de liberación sostenida (p. ej., productos de liberación prolongada Ocusert, un inserto oftálmico de pilocarpina para el glaucoma o Progestasert un dispositivo intrauterino de progesterona de liberación sostenida; sistemas de administración transdérmica Testoderm, Duragesic y Selegiline; catéteres). El poloxámero F-407 NF es un copolímero tribloque hidrofílico, tensioactivo no iónico de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno que tiene una baja viscosidad a temperaturas inferiores a 5°C y forma un gel sólido a temperaturas superiores a 15°C.
Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular con el compuesto polimérico de PEG injertado con PLL como se describe en la Pat. de EE. UU. N.° 6,177,274. Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular con un copolímero de bloques tal como un copolímero de bloques de PLGA-PEG (véase, p. ej. la Pub. de EE. UU. N.° US20120004293 y Pat. de EE. UU. N.° 8,236,330 y 8,246,968), o un copolímero de bloques de PLGA-PEG-PLGA (véase, p. ej., la Pat. de EE. UU. N.° 6,004,573).
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden formularse con al menos un polímero que contiene amina tal como, pero no limitado a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli(amidoamina), poli(amina-co-ésteres) o combinaciones de los mismos. Polímeros de poliamina de ejemplo y su uso como agentes de administración se describen, p. ej., en las Pat. de EE.UU. N.° 8,460,696, 8,236,280.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un lipopolímero catiónico biodegradable, un polímero biodegradable o un copolímero biodegradable, un copolímero de poliéster biodegradable, un polímero de poliéster biodegradable, un copolímero biodegradable lineal, PAGA, un copolímero de multibloques catiónico reticulado biodegradable o combinaciones de los mismos como se describe, p. ej., en las Pat. de EE. UU. N.° 6,696,038, 6,517,869, 6,267,987, 6,217,912, 6,652,886, 8,057,821, y 8,444,992; Pat. de EE. UU. N.° US20030073619, US20040142474, US20100004315, US2012009145 y US20130195920; y Pub. Intl. N.° WO2006063249 y WO2013086322.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en o con al menos un polímero de ciclodextrina como se describe en la publicación de EE. UU. N.° US20130184453. Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en o con al menos un polímero de unión a cationes reticulado como se describe en las Pub. Intl. N.° WO2013106072, WO2013106073 y WO2013106086. Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden formularse en o con al menos polímero de albúmina PEGilada como se describe en la publicación de EE. UU. N.° US20130231287.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento también se pueden formular como una nanopartícula usando una combinación de polímeros, lípidos y/u otros agentes biodegradables, tales como, pero no limitado a, fosfato de calcio. Los componentes pueden combinarse en una arquitectura de núcleo-cubierta, híbrido, y/o capa por capa, para permitir el ajuste fino de la nanopartícula para la administración (Wang et al., Nat Mater.
2006 5:791-796; Fuller et al., Biomaterials. 2008 29:1526-1532; DeKoker et al., Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su et al., Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87 ). Como ejemplo no limitante, la nanopartícula puede comprender una pluralidad de polímeros tales como, pero no limitados a, polímeros hidrófilos-hidrófobos (p. ej., PEG-PLGA), polímeros hidrófobos (p. ej., PEG) y/o polímeros hidrófilos (Pub. Intl. N.° WO20120225129).
El uso de nanopartículas de núcleo-cubierta se ha centrado además en un estrategia de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel catiónicos reticulados y varias cubiertas (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-13001). La complejación, administración e internalización de las nanopartículas poliméricas se pueden controlar con precisión alterando la composición química en los componentes tanto del núcleo como de la cubierta de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de núcleo-cubierta pueden administrar eficazmente ARNip a los hepatocitos de ratón después de unir covalentemente colesterol a la nanopartícula.
Se puede usar un núcleo lipídico hueco que comprende una capa media de PLGA y una capa lipídica neutra externa que contiene PEG para administrar los polinucleótidos como se describe en la presente descripción. Las nanopartículas lipídicas pueden comprender un núcleo de los polinucleótidos descritos en el presente documento y una cubierta de polímero, que se usa para proteger los polinucleótidos en el núcleo. La cubierta de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en el presente documento y son conocidos en la técnica. La cubierta de polímero se puede usar para proteger a los polinucleótidos en el núcleo.
Las nanopartículas de núcleo-cubierta para uso con los polinucleótidos descritos en el presente documento se describen en la Pat. de EE. UU. N.° 8,313,777 o Pub. Intl. N.° WO2013124867.
k. Péptidos y proteínas
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción pueden comprender los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) que se formula con péptidos y/o proteínas para aumentar la transfección de células por el polinucleótido, y/o para alterar la biodistribución del polinucleótido (p. ej., dirigiéndose a tejidos o tipos de células específicos) y/o aumentar la traducción de la proteína codificada (p. ej., Pub. Intl. N.° WO2012110636 y WO2013123298. Los péptidos pueden ser los descritos en la publicación de EE. UU. N.° US20130129726, US20130137644y US20130164219.
l. Conjugados
Las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido) que están unidos covalentemente a un transportador o grupo de direccionamiento, o que incluye dos regiones codificantes que juntas producen una proteína de fusión (p. ej., que lleva un grupo de direccionamiento y una proteína o péptido terapéutico) como un conjugado. El conjugado puede ser un péptido que dirige selectivamente la nanopartícula a las neuronas en un tejido u organismo, o ayuda a cruzar la barrera hematoencefálica.
Los conjugados incluyen una sustancia de origen natural, tal como una proteína (p. ej., albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un carbohidrato (p. ej., un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, p. ej., un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (p. ej., un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicólido), copolímero de diviniléteranhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa-helicoidal
El conjugado puede funcionar como un vehículo para el polinucleótido descrito en el presente documento. El conjugado puede comprender un polímero catiónico tal como, pero no limitado a, poliamina, polilisina, polialquilenimina y polietilenimina que pueden injertarse con poli(etilenglicol). Los ejemplos de conjugados y sus preparaciones se describen en la Patente de EE. UU. N.° 6,586,524 y Pub. de EE. UU. N.° US20130211249.
Los conjugados también pueden incluir grupos de direccionamiento, p. ej., un agente dirigido a célula o tejido, p. ej., una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como una célula de riñón. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un peptidomimético de RGD o un aptámero.
Los grupos de direccionamiento pueden ser proteínas, p. ej., glucoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico, tal como una célula endotelial, o célula ósea. Los grupos de direccionamiento también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetil-gulucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido o un activador de p38 MAP quinasa.
El grupo de direccionamiento puede ser cualquier ligando que sea capaz de dirigirse a un receptor específico. Los ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, aptámeros, ligandos de receptores de integrina, ligandos de receptores de quimiocinas, transferrina, biotina, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, LDL y ligandos de HDL. El grupo de direccionamiento puede ser un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descritas en el presente documento. Como un ejemplo no limitante, el grupo de direccionamiento puede ser un conjugado de unión al receptor de glutatión (Gr ) para la administración dirigida a través de la barrera hematoencefálica-sistema nervioso central como se describe, p. ej., en la Pub. de EE. UU. N.° US2013021661012.
El conjugado puede ser un conjugado biomolécula-polímero sinérgico, que comprende un sistema de liberación continua de acción prolongada para proporcionar una mayor eficacia terapéutica. El conjugado biomoléculapolímero sinérgico puede ser los descritos en la publicación de EE. UU. N.° US20130195799. El conjugado puede ser un conjugado de aptámero como se describe en. Pub. Pat. Intl. N.° WO2012040524. El conjugado puede ser un conjugado de polímero que contiene amina como se describe en la Patente de EE. UU. N.° 8,507,653. Los polinucleótidos se pueden conjugar con SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PHASERX®, Inc. Seattle, WA).
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden conjugarse covalentemente con un polipéptido de penetración celular, que también puede incluir una secuencia señal o una secuencia dirigida. Los conjugados pueden diseñarse para que tengan una mayor estabilidad, y/o aumento de la transfección celular; y/o la biodistribución alterada (p. ej., dirigida a tejidos o tipos celulares específicos).
Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden conjugar con un agente para mejorar la administración. El agente puede ser un monómero o polímero tal como un monómero dirigido o un polímero que tiene bloques dirigidos como se describe en la Pub. Intl. N.° WO2011062965. El agente puede ser un agente de transporte acoplado covalentemente a un polinucleótido como se describe, p. ej., en las Pat. de EE. UU. N.° 6,835.393 y 7,374,778. El agente puede ser un agente potenciador del transporte de la barrera de la membrana tal como los descritos en las Pat. de EE. UU. N.° 7,737,108 y 8,003,129.
Composiciones farmacéuticas
La presente descripción incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un ARNm o una nanopartícula (p. ej., una nanopartícula lipídica) descritos en el presente documento y definidos en las reivindicaciones, en combinación con uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. El ARNm puede estar presente en una nanopartícula, p. ej., una nanopartícula lipídica. El ARNm o nanopartícula puede estar presente en una composición farmacéutica. El uno o más ARNm presentes en la composición farmacéutica pueden estar encapsulados en una nanopartícula, p. ej., una nanopartícula lipídica. La relación molar del primer ARNm al segundo ARNm puede ser de aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1 o aproximadamente 50:1. La relación molar del primer ARNm al segundo ARNm puede ser superior a 1:1.
Una composición descrita en el presente documento puede comprender un ARNm que codifica un polipéptido. El polipéptido puede ser un polipéptido terapéutico. El polipéptido puede ser una enzima. El polipéptido puede ser un anticuerpo. El polipéptido puede comprender un antígeno.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser estériles y/o estar libre de pirógenos. Se pueden encontrar consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 . Una composición farmacéutica puede comprender un ARNm y una nanopartícula lipídica, o complejos de los mismos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes auxiliares y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, moldear y/o envasar el producto en una unidad monodosis o multidosis deseada.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la descripción variarán dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la afección del sujeto tratado y adicionalmente dependiendo de la vía mediante la que se va a administrar la composición. Como ejemplo, la composición puede incluir entre 0,1% y 100%, p. ej., entre 0,5% y 70%, entre 1% y 30%, entre 5% y 80%, o al menos 80% (p/p) del ingrediente activo.
Los ARNm de la descripción se definen en las reivindicaciones y se pueden formular utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (p. ej., a partir de una formulación de depósito del ARNm); (4) alterar la biodistribución (p. ej., dirigir el ARNm a tejidos o tipos de células específicos); (5) aumentar la traducción de un polipéptido codificado por el ARNm in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de un polipéptido codificado por el ARNm in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente descripción pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas (p. ej., liposomas y micelas), polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo-cubierta, péptidos, proteínas, carbohidratos, células transfectadas con ARNm (p. ej., para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, miméticos de nanopartículas y combinaciones de los mismos. En consecuencia, las formulaciones de la descripción pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que en conjunto aumenta la estabilidad del ARNm, aumenta la transfección celular por el ARNm, aumenta la expresión de un polipéptido codificado por el ARNm y/o altera el perfil de liberación de un polipéptido codificado por ARNm. Además, los ARNm de la presente descripción pueden formularse utilizando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas.
En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). El uso de un medio excipiente convencional puede contemplarse que está dentro de la presente descripción, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como al producir algún efecto biológico indeseable o al interaccionar de otra manera de forma nociva con cualquier otro(s) componente(s) de la composición farmacéutica. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, disgregantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, deslizantes (que mejoran el flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma de laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato de sodio, glicolato sódico de almidón, sorbitol, almidón (de maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Las formulaciones descritas en el presente documento pueden incluir al menos una sal farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en una formulación de la descripción incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido, sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, sales de ácidos minerales u orgánicos de restos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de restos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen sales de acetato, ácido acético, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, ácido bencenosulfónico, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como también cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, pero no limitado a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares.
Las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener al menos un tipo de polinucleótido. Como un ejemplo no limitante, las formulaciones pueden contener 1, 2, 3, 4, 5 o más de 5 ARNm descritos en el presente documento. Las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener al menos un ARNm que codifica un polipéptido y al menos una secuencia de ácido nucleico tal como, pero no limitado a un ARNip, un ARNhp, un ARNnop y un miARN.
Las formas farmacéuticas líquidas para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, nanoemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y/o de suspensión. Para administración parenteral, las composiciones pueden mezclarse con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros, y/o combinaciones de los mismos.
Se pueden formular las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida utilizando agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los disolventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como un disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un ARNm descrito en el presente documento se pueden administrar a mamíferos (p. ej., seres humanos). Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento están dirigidas principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para la administración a cualquier otro animal, p. ej., a un mamífero no humano. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a varios animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario con experiencia ordinaria puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación meramente ordinaria, si es que la hay. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluyendo mamíferos comercialmente relevantes, tales como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves comercialmente relevantes, tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos. A un sujeto se le pueden proporcionar dos o más ARNm descritos en el presente documento. El primer y segundo ARNm se pueden proporcionar al sujeto al mismo tiempo o en momentos diferentes, p. ej., secuencialmente. El primer y segundo ARNm se pueden proporcionar al sujeto en la misma composición o formulación farmacéutica, p. ej., para facilitar la absorción de ambos ARNm por las mismas células.
Métodos y uso
Las composiciones de la descripción se pueden administrar al sujeto en una cantidad efectiva o dosis efectiva. En general, una cantidad eficaz de la composición permitirá la producción eficaz del polipéptido codificado en la célula. Las medidas para la eficacia pueden incluir la traducción de polipéptidos (indicada por la expresión de polipéptidos), el nivel de degradación del ARNm y los indicadores de respuesta inmunitaria.
Una composición farmacéutica que incluye uno o más ARNm de la descripción se puede administrar a un sujeto por cualquier vía adecuada. Las composiciones de la descripción se pueden administrar por una o más de una variedad de vías, que incluyen la vía parenteral (p. ej., inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional o intracraneal, así como cualquier técnica de infusión adecuada), oral, trans o intradérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, tópica (p. ej., en polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas), mucosa, nasal, bucal, enteral, vítrea, intratumoral, sublingual, intranasal; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; como una pulverización y/o polvo oral, pulverización nasal y/o aerosol, y/o a través de un catéter en la vena porta. Una composición puede administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraarterial, intratumoral, subcutánea o por inhalación. En algunas realizaciones, una composición se administra por vía intramuscular. Sin embargo, la presente descripción abarca la administración de las composiciones de la descripción por cualquier vía apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias de la administración de fármacos. En general, la vía de administración más apropiada dependerá de una variedad de factores, incluida la naturaleza de la composición farmacéutica que incluye uno o más ARNm (p. ej., su estabilidad en varios entornos corporales, tales como el torrente sanguíneo y el tracto gastrointestinal), y el estado del paciente (p. ej., si el paciente es capaz de tolerar determinadas vías de administración).
Las composiciones de la descripción pueden administrarse en niveles de dosificación suficientes para administrar de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg en una dosis dada, donde una dosis de 1 mg/kg proporciona 1 mg de ARNm o nanopartícula por 1 kg de peso corporal del sujeto. Puede administrarse una dosis de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de ARNm o nanopartícula de la descripción.
Se puede administrar una dosis una o más veces al día, en la misma cantidad o en una diferente, para obtener un nivel deseado de expresión y/o efecto del ARNm (p. ej., un efecto terapéutico). La dosis deseada se puede administrar, por ejemplo, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En determinadas realizaciones, es posible administrar la dosis deseada en administraciones múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Se puede administrar una sola dosis, por ejemplo, antes o después de un procedimiento quirúrgico o en el caso de una enfermedad, trastorno o afección aguda. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz, profilácticamente eficaz o de otro modo apropiado para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la gravedad y la identificación de un trastorno que se está tratando, si lo hay; el uno o más ARNm empleados; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción de la composición farmacéutica específica empleada; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con la composición farmacéutica específica empleada; y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
Un ARNm o composición (p. ej., una composición farmacéutica) de la descripción puede administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente eficaz. Esto incluye, pero no se limita a, la administración intradérmica, intranasal, intramuscular y/o subcutánea. La presente descripción proporciona métodos que comprenden administrar composiciones de ARN y nanopartículas lipídicas de la descripción a un sujeto que lo necesite. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad, y similares. Las composiciones de ARN y las nanopartículas lipídicas de la descripción se formulan normalmente en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. No obstante, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de ARN (p. ej., ARNm) puede decidirlo el médico tratante dentro del alcance de la opinión médica bien fundada. El nivel de dosis específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado de formación de imágenes para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
La cantidad efectiva de una composición de ARN o nanopartícula lipídica de la descripción, como se proporciona en el presente documento, puede ser tan baja como 10 |jg, administrada por ejemplo como una dosis única o como dos dosis de 5 jg . En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis total de 10 jg-300 jg . Por ejemplo, la cantidad efectiva puede ser una dosis total de 10 jg , 20 jg , 25 jg , 30 jg , 35 jg , 40 jg , 45 jg , 50 jg , 55 jg , 60 jg , 65 jg , 70 jg , 75 jg , 80 jg , 85 jg , 90 jg , 95 jg , 100 jg , 1 l0 jg , 120 jg , 130 jg , 140 jg , 150 jg , 160 jg , 170 jg , 180 jg , 190 jg o 200 jg , 210 jg , 220 jg , 230 jg , 240 jg , 250 jg , 260 jg , 270 jg , 280 jg , 290 jg o 300 jg . En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis total de 10 jg -300 jg . La cantidad efectiva puede ser una dosis total de 30 jg-100 jg o 50 jg-200 jg .
Las composiciones de ARN (es decir, ARNm) y las nanopartículas lipídicas pueden administrarse en niveles de dosificación suficientes para administrar de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg, de 0,001 mg/kg a 0,05 mg/kg, de 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg, de 0,001 mg/kg a 0,005 mg/kg, de 0,05 mg/kg a 0,5 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg, de 0,5 mg/kg a 30 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, o de 1 mg/kg a 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, por semana, por mes, etc. para obtener el efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado (véase, p. ej., el intervalo de dosis unitarias descrito en la Publicación Internacional N.° WO2013078199). La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada 2 meses, cada tres meses, cada 6 meses, etc. En ciertas realizaciones, la dosificación deseada se puede administrar usando múltiples administraciones (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en el presente documento. Las composiciones de a Rn (es decir, ARNm) se pueden administrar en niveles de dosificación suficientes para administrar de 0,0005 mg/kg a 0,01 mg/kg, p. ej., de aproximadamente 0,0005 mg/kg a aproximadamente 0,0075 mg/kg, p. ej., aproximadamente 0,0005 mg/kg, aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,002 mg/kg, aproximadamente 0,003 mg/kg, aproximadamente 0,004 mg/kg o aproximadamente 0,005 mg/kg.
Las composiciones de ARN (es decir, ARNm) se pueden administrar una o dos veces (o más) en niveles de dosificación suficientes para administrar de 0,025 mg/kg a 0,250 mg/kg, de 0,025 mg/kg a 0,500 mg/kg, de 0,025 mg/kg a 0,750 mg/kg o de 0,025 mg/kg a 1,0 mg/kg.
Las composiciones de ARN (es decir, ARNm) pueden administrarse dos veces (p. ej., día 0 y día 7, día 0 y día 14, día 0 y día 21, día 0 y día 28, día 0 y día 60, día 0 y día 90, día 0 y día 120, día 0 y día 150, día 0 y día 180, día 0 y 3 meses después, día 0 y 6 meses después, día 0 y 9 meses después, día 0 y 12 meses después, día 0 y 18 meses después, día 0 y 2 años después, día 0 y 5 años después, o día 0 y 10 años después) en una dosis total o a niveles de dosificación suficientes para administrar una dosis total de 0,0100 mg, 0,025 mg, 0,050 mg, 0,075 mg, 0,100 mg, 0,125 mg, 0,150 mg, 0,175 mg, 0,200 mg, 0,225 mg, 0,250 mg, 0,275 mg, 0,300 mg, 0,325 mg, 0,350 mg, 0,375 mg, 0,400 mg, 0,425 mg, 0,450 mg, 0,475 mg, 0,500 mg, 0,525 mg, 0,550 mg, 0,575 mg, 0,600 mg, 0,625 mg, 0,650 mg, 0,675 mg, 0,700 mg, 0,725 mg, 0,750 mg, 0,775 mg, 0,800 mg, 0,825 mg, 0,850 mg, 0,875 mg, 0,900 mg, 0,925 mg, 0,950 mg, 0,975 mg o 1,0 mg. La presente descripción abarca dosis y frecuencias de administración mayores y menores. Por ejemplo, una composición de ARN (es decir, ARNm) puede administrarse tres o cuatro veces.
Las composiciones de ARN (es decir, ARNm) o las nanopartículas lipídicas que los comprenden pueden administrarse dos veces (p. ej., día 0 y día 7, día 0 y día 14, día 0 y día 21, día 0 y día 28, día 0 y día 60, día 0 y día 90, día 0 y día 120, día 0 y día 150, día 0 y día 180, día 0 y 3 meses después, día 0 y 6 meses después, día 0 y 9 meses después, día 0 y 12 meses después, día 0 y 18 meses después, día 0 y 2 años después, día 0 y 5 años después o día 0 y 10 años después) en una dosis total o en niveles de dosificación suficientes para administrar una dosis total de 0,010 mg, 0,025 mg, 0,100 mg o 0,400 mg.
Una composición de ARN (p. ej., ARNm) o nanopartículas de lípidos que lo comprenden descritas en el presente documento se puede formular en una forma de dosificación descrita en el presente documento, tal como intranasal, intratraqueal o inyectable (p. ej., intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intradérmica, intracardiaca, intraperitoneal y subcutánea).
Una composición farmacéutica de la descripción se puede administrar en combinación con otro agente, por ejemplo, otro agente terapéutico, un agente profiláctico y/o un agente de diagnóstico. Por "en combinación con", no se pretende implicar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o que deben formularse para su administración conjunta, aunque estos métodos de administración están dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, se pueden administrar en combinación una o más composiciones que incluyen uno o más ARNm diferentes. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o según un calendario determinado para ese agente. En algunas realizaciones, la presente descripción abarca la administración de composiciones de la descripción, o composiciones profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes de las mismas en combinación con agentes que mejoran su biodisponibilidad, reducen y/o modifican su metabolismo, inhiben su excreción y/o modifican su distribución dentro del cuerpo.
Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la descripción incluyen, pero no se limitan a agentes citotóxicos, quimioterapéuticos y otros agentes terapéuticos. Los agentes citotóxicos pueden incluir, por ejemplo, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, rachelmicina y análogos de los mismos. Los iones radiactivos también se pueden usar como agentes terapéuticos y pueden incluir, por ejemplo, yodo radiactivo, estroncio, fósforo, paladio, cesio, iridio, cobalto, itrio, samario y praseodimio. Otros agentes terapéuticos pueden incluir, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo y decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepá, clorambucilo, rachelmicina, melfalán, carmustina, lomustina, ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) y cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina, bleomicina, mitramicina y antramicina) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).
La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación deberá tener en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o los procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado a conseguir. También se apreciará que las terapias empleadas pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, se puede administrar una composición útil para tratar el cáncer simultáneamente con un agente quimioterapéutico), o pueden alcanzar efectos diferentes (p. ej., control de cualquier efecto adverso).
Los inhibidores de puntos de control inmunitarios tales como pembrolizumab o nivolumab, que se dirigen a la interacción entre el receptor de muerte programada 1 /ligando de muerte programada 1 (PD-1/PD-L1) y PD-L2, se han aprobado recientemente para el tratamiento de diversas neoplasias malignas y actualmente se están investigando en ensayos clínicos para diversos cánceres que incluyen melanoma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC).
La descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula lipídica y un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se define en las reivindicaciones. La composición farmacéutica se puede formular para administración intramuscular.
Descripción detallada
Definiciones
Como se usa en el presente documento, los términos "aproximado" o “aproximadamente”, aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas realizaciones, el término "aproximado" o “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo que dicho número supere 100% de un valor posible).
Composición de bases: como se usa en el presente documento, la expresión "composición de bases" se refiere a la proporción de las bases totales de un ácido nucleico que consiste en guanina citosina o timina (o uracilo) nucleótidos de adenina.
Par de bases: como se usa en el presente documento, la expresión "par de bases" se refiere a dos nucleobases en cadenas de ácido nucleico complementarias opuestas que interaccionan a través de la formación de enlaces de hidrógeno específicos. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "emparejamiento de bases de Watson-Crick", utilizado de manera intercambiable con "emparejamiento de bases complementarias", se refiere a un conjunto de reglas de emparejamiento de bases, en donde una purina siempre se une a una pirimidina de manera que la nucleobase adenina (A) forma una par de bases complementarias con timina (T) y la guanina (G) forma un par de bases complementarias con citosina (C) en moléculas de ADN. En las moléculas de ARN, la timina se reemplaza por uracilo (U), que, al igual que la timina (T), forma un par de bases complementarias con la adenina (A). Los pares de bases complementarios están unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y el número de enlaces de hidrógeno difiere entre los pares de bases. Como se sabe en la técnica, los pares de bases de guanina (G)-citosina (C) están unidos por tres (3) enlaces de hidrógeno y los pares de bases de adenina (A)-timina (T) o uracilo (U) están unidos por dos (2) enlaces de hidrógeno. Las interacciones de emparejamientos de bases que no siguen estas reglas pueden ocurrir en ácidos nucleicos naturales, no naturales y sintéticos y se denominan en el presente documento "emparejamiento de bases no Watson-Crick" o, alternativamente, "emparejamiento de bases no complementarias".
Codón: como se usa en el presente documento, el término "codón" se refiere a una secuencia de tres nucleótidos que juntos forman una unidad de código genético en una molécula de ADN o ARN. Un codón está operativamente definido por el nucleótido inicial a partir del cual comienza la traducción y establece el marco para una serie de tripletes de nucleótidos sucesivos, lo que se conoce como un "marco de lectura abierto" (ORF). Por ejemplo, la cadena GGGAAACCC, si se lee desde la primera posición, contiene los codones GGG, AAA y CCC; si se lee desde la segunda posición, contiene los codones GGA y AAC; y si se lee desde la tercera posición, GAA y ACC. Por lo tanto, cada secuencia nucleica leída en su dirección 5' ^ 3' comprende tres marcos de lectura, cada uno de los cuales produce una secuencia de aminoácidos posiblemente distinta (en el ejemplo dado, Gly-Lys-Pro, Gly-Asn o Glu-Thr, respectivamente). El ADN es bicatenario que define seis posibles marcos de lectura, tres en la orientación directa en una cadena y tres inversos en la cadena opuesta. Los marcos de lectura abiertos que codifican los polipéptidos se definen normalmente por un codón de inicio, normalmente el primer codón AUG de la secuencia.
Conjugado: como se usa en el presente documento, el término "conjugado", cuando se usa con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o a través de uno o más restos adicionales que sirven como agente de conexión, para formar una estructura que es suficientemente estable para que los restos permanezcan físicamente asociados bajo las condiciones en las que se usa la estructura, p. ej., condiciones fisiológicas. Se pueden conjugar dos o más restos mediante enlace químico covalente directo. En otras realizaciones, se pueden conjugar dos o más restos mediante enlace iónico o enlace de hidrógeno.
Poner en contacto: Como se usa en el presente documento, la expresión "poner en contacto" significa establecer una conexión física entre dos o más entidades. Por ejemplo, poner en contacto una célula con un ARNm o una composición de nanopartículas lipídicas significa que la célula y el ARNm o la nanopartícula lipídica están hechos para compartir una conexión física. Los métodos para poner en contacto células con entidades externas tanto in vivo, in vitro como ex vivo son bien conocidos en la técnica biológica. La etapa de poner en contacto una célula de mamífero con una composición (p. ej., un ARNm aislado, nanopartícula o composición farmacéutica de la descripción) se puede realizar in vivo. Por ejemplo, el poner en contacto una composición de nanopartículas lipídicas y una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) que puede estar dispuesta dentro de un organismo (p. ej., un mamífero) puede realizarse por cualquier vía de administración adecuada (p. ej., administración parenteral al organismo, incluida administración intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea). Para una célula presente in vitro, se puede poner en contacto una composición (p. ej., una nanopartícula lipídica o un ARNm aislado) y una célula, por ejemplo, añadiendo la composición al medio de cultivo de la célula y puede implicar o dar como resultado la transfección. Además, más de una célula de mamífero puede ponerse en contacto con una composición de nanopartículas.
Desnaturalización: como se usa en el presente documento, el término "desnaturalización" se refiere al proceso por el cual se altera el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos de bases apareadas en un ácido nucleico, lo que da como resultado la pérdida de la estructura secundaria y/o terciaria del ácido nucleico (ej., la separación de cadenas previamente reasociadas). La desnaturalización puede ocurrir por la aplicación de una sustancia externa, energía o proceso bioquímico a un ácido nucleico. Por ejemplo, la desnaturalización local de la estructura del ácido nucleico por la actividad enzimática ocurre cuando es necesario que ocurran transacciones biológicamente importantes, tales como la replicación, transcripción, traducción del ADN o reparación del ADN. Las estructuras plegadas (p. ej., estructuras de ácido nucleico secundarias y terciarias) de un ARNm pueden constituir una barrera para la función de escaneo del PIC o la función de elongación del ribosoma, dando como resultado una tasa de traducción más baja. Durante el inicio de la traducción, la actividad de helicasa proporcionada por eIFs (p. ej., eIF4A) puede desnaturalizar o desenrollar la estructura de ARN bicatenario en dúplex para facilitar el escaneo del PIC.
Marcador de epítopo: como se usa en el presente documento, la expresión "marcador de epítopo" se refiere a un epítopo artificial, también conocido como determinante antigénico, que se fusiona con una secuencia polipeptídica colocando la secuencia que codifica el epítopo en marco con la secuencia codificante o marco de lectura abierto de un polipéptido. Un polipéptido marcado con epítopo se considera una proteína de fusión. Los marcadores de epítopos son secuencias peptídicas relativamente cortas que varían de aproximadamente 10­ 30 aminoácidos de longitud. Los marcadores de epítopos generalmente se fusionan con el extremo N o C con el fin de minimizar las alteraciones de la estructura terciaria que pueden alterar la función de la proteína. Los marcadores de epítopos son reactivos para anticuerpos de alta afinidad que se pueden producir de forma fiable en muchas especies diferentes. Los marcadores de epítopos de ejemplo incluyen el marcador V5, marcador Myo, marcador HA y marcador 3xFLAG. Estos marcadores son útiles para la detección o purificación de proteínas de fusión mediante técnicas de transferencia Western, inmunofluorescencia o inmunoprecipitación.
Expresión: Como se usa en el presente documento, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes sucesos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p.ej., por transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (p. ej., mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Identidad: como se usa en el presente documento, el término "identidad" se refiere al vínculo general entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de polinucleótidos (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias a efectos de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para la alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a efectos de comparación). La longitud de una secuencia alineada para propósitos de comparación es de al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en el documento Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. El software informático de ejemplo para determinar la homología entre dos secuencias incluye, pero no se limita a, el paquete de programas Gc G, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387,1984, BLASTP, BLASTN, y FASTA, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403,1990.
Fragmento: Un "fragmento", como se usa en el presente documento, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden incluir polipéptidos obtenidos mediante la digestión de proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas u obtenidas mediante técnicas de ADN recombinante.
Proteína de fusión: la expresión "proteína de fusión" significa una secuencia polipeptídica que está compuesta de dos o más secuencias polipeptídicas unidas por un enlace(s) peptídico(s). Las "proteínas de fusión" que no existen en la naturaleza pueden generarse utilizando técnicas de ADN recombinante.
Rico en GC: como se usa en el presente documento, la expresión "rico en GC" se refiere a la composición de nucleobases de un polinucleótido (p. ej., ARNm), o cualquier porción del mismo (p. ej., un elemento de ARN), que comprende nucleobases guanina (G) y/o citosina (C), o derivados o análogos de los mismos, en donde el contenido de GC es mayor que 50%. La expresión "rico en GC" se refiere a todo o a una parte de un polinucleótido, incluidos, pero no limitados a, un gen, una región no codificante, una 5'UTR, una 3'UTR, un marco de lectura abierto, un elemento de ARN, un motivo de secuencia o cualquier secuencia discreta, fragmento o segmento del mismo que comprenda un contenido de GC mayor que 50%. Los polinucleótidos ricos en GC, o cualquiera de sus porciones, pueden estar compuestos exclusivamente por nucleobases guanina (G) y/o citosina (C).
Contenido de GC: como se usa en el presente documento, la expresión "contenido de GC" se refiere al porcentaje de nucleobases en un polinucleótido (p. ej., ARNm) o una porción del mismo (p. ej., un elemento de ARN), que son nucleobases de guanina (G) y citosina (C), o derivados o análogos de las mismas, (de un número total de posibles nucleobases, que incluyen adenina (A) y timina (T) o uracilo (U), y derivados o análogos de los mismos, en el ADN y en el ARN). La expresión "contenido de GC" se refiere a todo o a una parte de un polinucleótido, incluidos, pero no limitados, un gen, una región no codificante, una UTR 5' o 3', un marco de lectura abierto, un elemento de ARN, un motivo de secuencia o cualquier secuencia discreta, fragmento o segmento del mismo.
Código genético: como se usa en el presente documento, la expresión "código genético" se refiere al conjunto de reglas mediante las cuales el ribosoma traduce la información genética codificada dentro del material genético (secuencias de ADN o ARN) en polipéptidos. El código define cómo las secuencias de tripletes de nucleótidos, denominados "codones", especifican qué aminoácido se añadirá a continuación durante la síntesis de proteínas. Un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un solo aminoácido.
La gran mayoría de los genes están codificados con un único esquema de reglas denominado código genético canónico o estándar, o simplemente código genético, aunque existen códigos variantes (tal como en las mitocondrias humanas).
Heterólogo: como se usa en el presente documento, "heterólogo" indica que una secuencia (p. ej., una secuencia de aminoácidos o el polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos) normalmente no está presente en un polipéptido o polinucleótido natural dado. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que corresponde a un dominio o motivo de una proteína puede ser heteróloga para una segunda proteína.
Hibridación: como se usa en el presente documento, el término "hibridación" se refiere al proceso de un primer ácido nucleico monocatenario, o una porción, fragmento o región del mismo, que se reasocia con un segundo ácido nucleico monocatenario, o una porción, fragmento o región del mismo, ya sea de la misma molécula de ácido nucleico o de moléculas separadas, mediada por el apareamiento de bases de Watson-Crick para formar una estructura secundaria y/o terciaria. Las cadenas complementarias de nucleobases unidas capaces de experimentar hibridación pueden ser del mismo ácido nucleico o de ácidos nucleicos separados. Debido a la interacción de enlaces de hidrógeno termodinámicamente favorable entre pares de bases complementarias, la hibridación es una propiedad fundamental de las secuencias de ácidos nucleicos complementarias. Dicha hibridación de ácidos nucleicos, o una porción o fragmento de los mismos, puede ocurrir con complementariedad "casi" o "sustancial", así como con complementariedad exacta.
Codón de iniciación: como se usa en el presente documento, la expresión "codón de iniciación", usado de manera intercambiable con la expresión "codón de inicio", se refiere al primer codón de un marco de lectura abierto que es traducido por el ribosoma y está compuesto por un triplete de nucleobases de adenina-uraciloguanina unidas. El codón de iniciación se representa por los códigos de la primera letra de adenina (A), uracilo (U) y guanina (G) y, a menudo, se escribe simplemente como "AUG". Aunque los ARNm naturales pueden usar codones distintos de AUG como el codón de iniciación, que se denominan en el presente documento "codones de iniciación alternativos", los codones de iniciación de los polinucleótidos descritos en el presente documento usan el codón AUG. Durante el proceso de inicio de la traducción, la secuencia que comprende el codón de iniciación es reconocida por medio del emparejamiento de bases complementarias con el anticodón de un tARN iniciador (Met-tARNiMet) unido por el ribosoma. Los marcos de lectura abiertos pueden contener más de un codón de iniciación AUG, que se denominan en el presente documento "codones de iniciación alternativos".
El codón de iniciación juega un papel crítico en el inicio de la traducción. El codón de iniciación es el primer codón de un marco de lectura abierto que es traducido por el ribosoma. Por lo general, el codón de iniciación comprende el triplete de nucleótidos AUG, sin embargo, en algunos casos, el inicio de la traducción puede ocurrir en otros codones compuestos por nucleótidos distintos. El inicio de la traducción en eucariotas es un proceso bioquímico de varias etapas que implica numerosas interacciones proteína-proteína, proteína-ARN y ARN-ARN entre moléculas de ARN mensajero (ARNm), la subunidad ribosomal 40S, otros componentes de la maquinaria de traducción (p. ej., factores de iniciación eucariotas, eIFs). El modelo actual de inicio de la traducción del ARNm postula que el complejo de preiniciación (alternativamente, "complejo de preiniciación 43S"; abreviado como "PIC") se transloca desde el sitio de reclutamiento en el ARNm (típicamente la caperuza 5') al codón de iniciación por escaneo de los nucleótidos en una dirección de 5' a 3' hasta que se encuentre el primer codón AUG que reside dentro de un contexto de nucleótido promotor de la traducción específico (la secuencia de Kozak) (Kozak (1989) J Cell Biol 108:229 -241). El escaneo por el PIC termina tras el emparejamiento de bases complementarias entre nucleótidos que comprenden el anticodón del ARN de transferencia iniciador Met-tARNiMet y nucleótidos que comprenden el codón de iniciación del ARNm. El emparejamiento de bases productivo entre el codón AUG y el anticodón Met-tARNiMet produce una serie de sucesos estructurales y bioquímicos que culminan en la unión de la subunidad ribosómica grande 60S al PIC para formar un ribosoma activo que es competente para la elongación de la traducción.
Inserción: como se usa en el presente documento, una "inserción" o una "adición" se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que resulta en la adición de uno o más restos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, a una molécula en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo, la secuencia que se encuentra en una molécula de origen natural.
Sitio de inserción: como se usa en el presente documento, un "sitio de inserción" es una posición o región de un polipéptido de armazón que es susceptible de inserción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo. Debe entenderse que un sitio de inserción también puede referirse a la posición o región del polinucleótido que codifica el polipéptido (p. ej., un codón de un polinucleótido que codifica un aminoácido dado en el polipéptido de armazón). En algunas realizaciones, la inserción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo en un polipéptido de armazón tiene poco o ningún efecto sobre la estabilidad (p. ej., estabilidad conformacional), nivel de expresión o estructura secundaria general del polipéptido de armazón.
Aislado: Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una sustancia o entidad que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias a partir de las cuales han sido asociadas. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de los otros componentes a los cuales estaban inicialmente asociadas. Los agentes aislados son más de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99% puros. Como se usa en el presente documento, una sustancia es "pura” si se encuentra sustancialmente libre de otros componentes.
Secuencia de Kozak: la expresión "secuencia de Kozak" (también denominada "secuencia de consenso de Kozak") se refiere a un elemento potenciador del inicio de la traducción para potenciar la expresión de un gen o marco de lectura abierto, y que en eucariotas, se encuentra en la 5' UTR. La secuencia de consenso de Kozak se definió originalmente como la secuencia GCCRCC, donde R = una purina, después de un análisis de los efectos de mutaciones únicas que rodean el codón de iniciación (AUG) en la traducción del gen de la preproinsulina (Kozak (1986) Cell 44: 283-292). Los polinucleótidos descritos en el presente documento comprenden una secuencia de consenso de Kozak, o un derivado o modificación de la misma. (Ejemplos de composiciones potenciadoras de la traducción y métodos de uso de las mismas, véase la Pat. de Ee . UU. N.° 5,807,707 de Andrews et al., Pat. de EE. UU. N.° 5,723,332 de Chernajovsky; Pat. de EE. UU. N.° 5,891,665 de Wilson).
Escaneo con fugas: como se usa en el presente documento, la expresión "escaneo con fugas" se refiere a un fenómeno biológico por el cual el PIC pasa por alto el codón de iniciación de un ARNm y en su lugar continúa escaneando secuencia abajo hasta que se reconoce un codón de iniciación alterno o alternativo. Dependiendo de la frecuencia de aparición, la omisión del codón de iniciación por parte del PIC puede dar como resultado una disminución en la eficiencia de la traducción. Además, puede ocurrir la traducción desde este codón AUG secuencia abajo, lo que dará como resultado la producción de un producto de traducción aberrante no deseado que puede no ser capaz de producir la respuesta terapéutica deseada. En algunos casos, el producto de traducción aberrante puede, de hecho, producir una respuesta perjudicial (Kracht et al., (2017) Nat Med 23(4):501-507).
ARNm: como se usa en el presente documento, un "ARNm" se refiere a un ácido ribonucleico mensajero. Un ARNm puede ser de origen natural o no natural o sintético. Por ejemplo, un ARNm puede incluir componentes modificados y/o de origen no natural tales como una o más nucleobases, nucleósidos, nucleótidos o enlazadores. Un ARNm puede incluir una estructura de caperuza, un líder de transcripción en 5', una región no traducida 5', un codón iniciador, un marco de lectura abierto, un codón de parada, un nucleósido que termina la cadena, un tallo-bucle, una horquilla, una secuencia de poliA, una señal de poliadenilación y/o uno o más elementos reguladores en cis. Un ARNm puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. La traducción de un ARNm, por ejemplo, la traducción in vivo de un ARNm dentro de una célula de mamífero puede producir un polipéptido. Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm natural incluyen al menos una región codificante, una región no traducida 5' (5'-UTR), una 3'UTR, una caperuza 5' y una secuencia de poliA.
Modificado: como se usa en el presente documento, "modificado" o "modificación" se refiere a un estado cambiado o un cambio en la composición o estructura de un polinucleótido (p. ej., ARNm). Los polinucleótidos pueden modificarse de diversas formas, incluidas química, estructural y/o funcionalmente. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden modificarse estructuralmente mediante la incorporación de uno o más elementos de ARN, en donde el elemento de ARN comprende una secuencia y/o una estructura(s) secundaria(s) de ARN que proporciona una o más funciones (p. ej., actividad reguladora de la traducción). Por consiguiente, los polinucleótidos de la descripción pueden estar compuestos por una o más modificaciones (p. ej., pueden incluir una o más modificaciones químicas, estructurales o funcionales, incluida cualquier combinación de las mismas).
Nucleobase: como se usa en el presente documento, el término "nucleobase" (alternativamente, "base de nucleótido" o "base nitrogenada") se refiere a un compuesto heterocíclico de purina o pirimidina que se encuentra en los ácidos nucleicos, incluidos los derivados o análogos de las purinas y pirimidinas de origen natural que confieren propiedades mejoradas (p. ej., afinidad de unión, resistencia a nucleasas, estabilidad química) a un ácido nucleico o a una porción o segmento del mismo. La adenina, citosina, guanina, timina y uracilo son las nucleobases predominantes en los ácidos nucleicos naturales. Otras nucleobases naturales, no naturales y/o sintéticas, como se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento, pueden incorporarse en ácidos nucleicos.
Nucleósido/Nucleótido: como se usa en el presente documento, el término "nucleósido" se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (p. ej., una ribosa en el ARN o una desoxirribosa en el ADN), o un derivado o análogo del mismo, unido covalentemente a una nucleobase (p. ej., una purina o pirimidina), o un derivado o análogo de la misma (también denominado en el presente documento "base nucleotídica"), pero que carece de un grupo de unión internucleósidos (p. ej., un grupo fosfato). Como se usa en el presente documento, el término "nudeótido" se refiere a un nucleósido unido covalentemente a un grupo de unión interucleósidos (p. ej., un grupo fosfato), o cualquier derivado, análogo o modificación del mismo que confiera propiedades químicas y/o funcionales mejoradas (p. ej., unión afinidad, resistencia a nucleasas, estabilidad química) a un ácido nucleico o una porción o segmento del mismo.
Ácido nucleico: como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" se usa en su sentido más amplio y abarca cualquier compuesto y/o sustancia que incluye un polímero de nucleótidos, o derivados o análogos de los mismos. Estos polímeros a menudo se denominan "polinucleótidos". En consecuencia, tal como se usan en el presente documento, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" son equivalentes y se usan indistintamente. Los ejemplos de ácidos nucleicos o polinucleótidos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), híbridos de ADN-ARN, agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, ARNip, ARNhp, ARNm, ARNm modificados, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARN que inducen la formación de triple hélice, ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, incluido LNA que tiene una configuración p-D-ribo, a-LNA que tiene una configuración a-L-ribo (un diastereómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino y 2'-amino-a-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino) o híbridos de los mismos.
Estructura de ácido nucleico: como se usa en el presente documento, la expresión "estructura de ácido nucleico" (usado indistintamente con "estructura de polinucleótido") se refiere a la disposición u organización de átomos, constituyentes químicos, elementos, motivos y/o secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que comprenden un ácido nucleico (p. ej., un ARNm). El término también se refiere al estado bidimensional o tridimensional de un ácido nucleico. En consecuencia, la expresión "estructura de ARN" se refiere a la disposición u organización de átomos, constituyentes químicos, elementos, motivos y/o secuencia de nucleótidos unidos, o derivados o análogos de los mismos, que comprenden una molécula de ARN (p. ej., un ARNm) y/o se refiere a un estado bidimensional y/o tridimensional de una molécula de ARN. La estructura del ácido nucleico se puede demarcar adicionalmente en cuatro categorías organizativas denominadas en el presente documento "estructura molecular", "estructura primaria", "estructura secundaria" y "estructura terciaria" basándose en una complejidad organizativa creciente.
Marco de lectura abierto: como se usa en el presente documento, la expresión "marco de lectura abierto", abreviado como "ORF", se refiere a un segmento o región de una molécula de ARNm que codifica un polipéptido. El ORF comprende un tramo continuo de codones en marco que no se superponen, comenzando con el codón de iniciación y terminando con un codón de parada, y es traducido por el ribosoma.
Complejo de preiniciación: como se usa en el presente documento, la expresión "complejo de preiniciación" (alternativamente "complejo de preiniciación 43S"; abreviado como "PIC") se refiere a un complejo de ribonucleoproteína que comprende una subunidad ribosómica 40S, factores de iniciación eucarióticos (eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5), y el complejo ternario eIF2-GTP-Met-tARNiMet, que es intrínsecamente capaz de unirse a la caperuza 5' de una molécula de ARNm y, después de la unión, realizar un escaneo de ribosoma de la 5'UTR.
Polipéptido: como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere a un polímero de restos de aminoácidos normalmente unidos por enlaces peptídicos que se pueden producir de forma natural (p. ej., aislado o purificado) o sintéticamente.
Potencia: como se usa en el presente documento, el término "potencia" se refiere a una cantidad, nivel o concentración de una sustancia (p. ej., un ARNm) que se requiere para producir una respuesta o efecto dado. La potencia de una sustancia puede definirse por su valor de EC50 si la sustancia produce una respuesta o efecto agonista o su valor IC50 si la sustancia produce una respuesta o efecto antagonista. Como se usa en el presente documento, el término "EC50" se refiere a la concentración de una sustancia (p. ej., un ARNm) que induce una respuesta o efecto, ya sea en un ensayo in vitro o uno in vivo, que es el 50% de la respuesta o efecto máximo, es decir, a mitad de camino entre la respuesta o efecto máximo y el valor base. Como se usa en el presente documento, el término "IC50" se refiere a la concentración de una sustancia (p. ej., un ARNm) que inhibe una respuesta o efecto, ya sea en un ensayo in vitro o uno in vivo, que es el 50% de la respuesta o efecto máximo, es decir, a mitad de camino entre la respuesta o efecto máximo y el valor base.
Aumento de potencia: como se usa en el presente documento, la expresión "aumento de potencia" (p. ej., de una sustancia, por ejemplo, un ARNm) se refiere a una potencia que se mejora (aumenta o potencia) en relación con la potencia de una sustancia similar o comparable cuya potencia no ha sido mejorada. El aumento de potencia normalmente se observa como una disminución en la cantidad, el nivel o la concentración de una sustancia (p. ej., un ARNm) necesaria para producir una respuesta o un efecto determinado. Un aumento en la potencia se puede observar como una respuesta o efecto mejorado (aumentado o potenciado), que resulta de una cantidad, nivel o concentración dados de una sustancia (p. ej., un ARNm).
Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que proporciona una actividad reguladora de la traducción deseada. Un aumento en la potencia puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que aumenta la cantidad de polipéptido traducido de un ARNm. Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que aumenta el número de moléculas de polipéptido traducidas por molécula de ARNm. Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que aumenta el número de moléculas polipeptídicas traducidas por molécula de ARNm por unidad de tiempo. Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que aumenta una cantidad de polipéptido funcional traducido de un ARNm en relación con la cantidad total de polipéptido traducido de un ARNm. Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) debido a un aumento en la fidelidad de traducción del ARNm por (i) una inhibición o reducción en escaneo con fugas (ii) un aumento en la fidelidad de decodificación de codones, o (iii) minimización o inhibición de la lectura completa de codones de parada, o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) debido a un aumento en la cantidad de polipéptido funcional en un sitio o ubicación particular (p. ej., dirigiendo el polipéptido a un sitio o ubicación específica en una célula o en el entorno extracelular). Un aumento en la potencia de un ARNm puede resultar de un elemento de ARN (p. ej., un elemento de ARN rico en G C ubicado en la 5' UTR del ARNm) que aumenta una cantidad de polipéptido traducido de un ARNm aumentando la semivida del ARNm.
La descripción proporciona un ARNm que comprende una 5' UTR que comprende un elemento de ARN que aumenta la potencia del ARNm, como se define en las reivindicaciones. El elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC y puede ser una estructura secundaria de ARN estable descrita en el presente documento, como se define en las reivindicaciones. El ARNm puede comprender una modificación que aumenta la potencia del ARNm. La potencia del ARNm se puede aumentar 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 10 veces en relación con un ARNm sin la modificación (p. ej., sin el elemento de ARN). La potencia de la molécula de ARNm se puede aumentar en 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. La potencia de la molécula de ARNm se puede aumentar en aproximadamente 5%-10%, en aproximadamente 10%-20%, en aproximadamente 20%-40%, en aproximadamente 40%-60%, en aproximadamente 60%-80%, en aproximadamente 90% con respecto a un ARNm sin la modificación (p. ej., sin el elemento de ARN).
Elemento de ARN: como se usa en el presente documento, la expresión "elemento de ARN" se refiere a una porción, fragmento o segmento de una molécula de ARN que proporciona una función biológica y/o tiene actividad biológica (p. ej., actividad reguladora de la traducción). La modificación de un polinucleótido mediante la incorporación de uno o más elementos de ARN, tales como los descritos en el presente documento, proporciona una o más propiedades funcionales deseables al polinucleótido modificado. Los elementos de ARN, como se describe en el presente documento, pueden ser de origen natural, no natural, sintéticos, modificados o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los elementos de ARN de origen natural que proporcionan una actividad reguladora incluyen elementos que se encuentran en los transcriptomas de virus, organismos procarióticos y eucarióticos (p. ej., seres humanos). Se ha mostrado que los elementos de ARN, en particular los ARNm eucarióticos y los ARN virales traducidos, están implicados en la mediación de muchas funciones en las células. Los elementos de ARN natural de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, elementos de iniciación de la traducción (p. ej., sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), véase Kieft et al., (2001) RNA 7(2):194-206), elementos potenciadores de la traducción (p. ej., el elemento potenciador de la traducción APP de ARNm, véase Rogers et al., (1999) J Biol Chem 274(10):6421-6431), elementos de estabilidad del ARNm (p. ej., elementos ricos en AU (ARE), véase Garneau et al., (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8(2):113-126), elemento de represión traduccional (véase, p. ej., Blumer et al., (2002) Mech Dev 110(1-2):97-112), elementos de ARN de unión a proteínas (p. ej., elemento sensible al hierro, véase Selezneva et al., (2013) J Mol Biol 425(18):3301-3310), elementos de poliadenilación citoplasmática (Villalba et al., (2011) Curr Opin Genet Dev 21 (4):452-457) y elementos de ARN catalítico (p. ej., ribozimas, véase Scott et al., (2009) Biochim Biophys Acta 1789(9-10):634-641).
Los ARNm de la invención y el elemento de ARN se definen en las reivindicaciones.
Tiempo de retención: como se usa en el presente documento, la expresión "tiempo de retención" se refiere al tiempo de ocupación de un complejo de preiniciación (PIC) o un ribosoma en una posición o ubicación discreta a lo largo de una molécula de ARNm.
Estructura secundaria de ARN estable: como se usa en el presente documento, la expresión "estructura secundaria de ARN estable" se refiere a una estructura, plegado o conformación adoptada por una molécula de ARN, o un segmento local o porción de la misma, que se mantiene persistentemente bajo condiciones fisiológicas y se caracteriza por un estado de baja energía libre. Los ejemplos típicos de estructuras secundarias de ARN estables incluyen dúplex, horquillas y tallo-bucles. Se sabe en la técnica que las estructuras secundarias de ARN estable presentan diversas actividades biológicas.
Sujeto: Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición según la invención, p. ej., con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y seres humanos) y/o plantas. Un sujeto puede ser un paciente.
Sustancialmente: Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de presentar un nivel o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en la técnica biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que se producen, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible falta de compleción inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Que padece: A un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección se le ha diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Sitio de inicio de la transcripción: como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de inicio de la transcripción" se refiere a un nucleótido específico en la cadena homosentido de una molécula de ADN donde se inicia la transcripción por una ARN polimerasa y que corresponde al primer nucleótido en el transcrito. El sitio de inicio de la transcripción generalmente se encuentra secuencia abajo de un promotor, que es una región de ADN que inicia la transcripción. Por ejemplo, la ARN polimerasa T7 inicia la transcripción en la G subrayada en la secuencia promotora 5' TAATACGACTCACTATAG 3'. La polimerasa luego transcribe usando la cadena de ADN opuesta como plantilla. En algunas realizaciones, el sitio de inicio de la transcripción para una ARN polimerasa T7 se denomina "sitio de inicio de T7". La primera base en la transcripción será una G. Los contactos de ADN realizados por la ARN polimerasa T7 se han mapeado durante la unión y durante el posterior inicio de la transcripción. La ARN polimerasa sola protege 19 bases en una región de -21 a -3. La síntesis del trinucleótido r(GGG) amplía la longitud de la secuencia protegida por la ARN polimerasa y estabiliza el complejo. La formación de un ARNm de hexanucleótido, r(GGGAGA) amplía aún más la región protegida, estabiliza el complejo y da como resultado una mayor eficiencia transcripcional (Ikeda y Richardson (1986) Proc Natl Acad Sci 83:3614-3618). La secuencia GGGAGA se denomina "secuencia líder de T7". Por consiguiente, los ARNm proporcionados por la descripción pueden comprender una 5' UTR que comprende una secuencia líder de T7 en el extremo 5' de la 5' UTR. El ARNm de la descripción puede comprender una 5' UTR que comprende una secuencia líder de T7 que comprende la secuencia GGGAGA en el extremo 5' de la 5' UTR. El ARNm de la descripción puede comprender una 5' UTR que comprende una secuencia líder de T7 que comprende la secuencia GGGAAA en el extremo 5' de la 5' UTR. El ARNm puede comprender una 5' UTR que no comprende una secuencia líder de T7.
Resto de direccionamiento: como se usa en el presente documento, un "resto de direccionamiento" es un compuesto o agente que puede dirigir una nanopartícula a un tipo de célula, tejido y/u órgano particular.
Agente terapéutico: La expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, tras ser administrado a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado.
Actividad reguladora de la traducción: como se usa en el presente documento, la expresión "actividad reguladora de la traducción" (usado de manera intercambiable con "función reguladora de la traducción") se refiere a una función, mecanismo o proceso biológico que modula (p. ej., regula, influye, controla, varía) la actividad del aparato de traducción, incluida la actividad del PIC y/o el ribosoma. La actividad reguladora de la traducción deseada puede promover y/o potenciar la fidelidad traduccional de la traducción del ARNm.
La actividad reguladora de la traducción deseada puede reducir y/o inhibir el escaneo con fugas.
La traducción de un polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido puede controlarse y regularse mediante una variedad de mecanismos proporcionados por diversas estructuras de ácido nucleico que actúan en cis. Por ejemplo, los elementos de ARN que actúan en cis de origen natural que forman horquillas u otras estructuras secundarias de ARNm intramoleculares de orden superior (p. ej., pseudonudo) pueden proporcionar una actividad reguladora de la traducción a un polinucleótido, en donde el elemento de ARN influye o modula el inicio de la traducción del polinucleótido, particularmente cuando el elemento de ARN se sitúa en la 5' UTR cerca de la estructura de caperuza 5' (Pelletier y Sonenberg (1985) Cell 40(3):515-526; Kozak (1986) Proc Natl Acad Sci 83:2850-2854). Los elementos de ARN que actúan en cis también pueden afectar el alargamiento de la traducción, estando implicados en numerosos sucesos de cambio de marco (Namy et al., (2004) Mol Cell 13 (2): 157-168). Las secuencias de entrada interna al ribosoma (IRES) representan otro tipo de elemento de ARN que actúa en cis que normalmente se encuentran en 5' UTR, pero también se ha informado que se encuentra dentro de la región codificante de ARNm de origen natural (Holcik et al. (2000) Trends Genet 16(10):469-473). En los ARNm celulares, los IRES a menudo coexisten con la estructura de caperuza 5' y proporcionan ARNm con la capacidad funcional para traducirse en condiciones en las que la traducción dependiente de caperuza está comprometida (Gebauer et al., (2012) Cold Spring Harb Perspect Biol 4(7):a012245). Otro tipo de elemento de ARN que actúa en cis de origen natural comprende los marcos de lectura abiertos secuencia arriba (uORF). Los uORF de origen natural aparecen de forma singular o múltiple dentro de las 5' UTR de numerosos ARNm e influyen en la traducción del ORF principal secuencia abajo, generalmente de manera negativa (con la notable excepción del ARNm de GCN4 en levadura y el ARNm de ATF4 en mamíferos, donde los uORF sirven para promover la traducción del ORF principal secuencia abajo en condiciones de fosforilación aumentada de eIF2 (Hinnebusch (2005) Annu Rev Microbio! 59:407-450)). Las actividades reguladoras de la traducción de ejemplo adicionales proporcionadas por componentes, estructuras, elementos, motivos y/o secuencias específicas que comprenden polinucleótidos (p. ej., ARNm) incluyen, pero no se limitan a, estabilización o desestabilización de ARNm (Baker y Parker (2004) Curr Opin Ce!! Bio! 16(3):293-299), activación traduccional (Villalba et al., (2011) Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457) y represión traduccional (Blumer et al., (2002) Mech Dev 110(1-2):97-112). Los estudios han demostrado que los elementos de ARN que actúan en cis de origen natural pueden conferir sus respectivas funciones cuando se utilizan para modificar, mediante la incorporación en, polinucleótidos heterólogos ( Goldberg-Cohen et al., (2002) J Biol Chem 277(16): 13635-13640).
Transfecta: como se usa en el presente documento, los términos "transfecta", "transfección" o "transfectar" se refieren al acto o método de introducir una molécula, generalmente un ácido nucleico, en una célula.
No modificado: Como se usa en el presente documento, "no modificado" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. No modificado puede, pero no siempre, referirse al tipo natural o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.
Contenido de uridina: Las expresiones "contenido de uridina" o "contenido de uracilo" son intercambiables y se refieren a la cantidad de uracilo o uridina presente en una determinada secuencia de ácido nucleico. El contenido de uridina o contenido de uracilo se puede expresar como un valor absoluto (número total de uridina o uracilo en la secuencia) o relativo (porcentaje de uridina o uracilo con respecto al número total de nucleobases en la secuencia de ácido nucleico).
Secuencia modificada en uridina: Las expresiones "secuencia modificada en uridina" se refieren a un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con un contenido de uridina global o local diferente (contenido de uridina mayor o menor) o con patrones de uridina diferentes (p. ej., distribución de gradiente o agrupamiento) con respecto al contenido de uridina y/o patrones de uridina de una secuencia de ácido nucleico candidata. En el contenido de la presente descripción, las expresiones "secuencia modificada en uridina" y "secuencia modificada en uracilo" se consideran equivalentes e intercambiables.
Un "codón alto en uridina" se define como un codón que comprende dos o tres uridinas, un "codón bajo en uridina" se define como un codón que comprende una uridina, y un "codón sin uridina" es un codón sin ninguna uridina. La secuencia modificada en uridina puede comprender sustituciones de codones altos en uridina con codones bajos en uridina, sustituciones de codones altos en uridina con codones sin uridina, sustituciones de codones bajos en uridina con codones altos en uridina, sustituciones de codones bajos en uridina con codones sin uridina, sustitución de codones sin uridina con codones bajos en uridina, sustituciones de codones sin uridina con codones altos en uridina, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un codón alto en uridina se puede reemplazar con otro codón alto en uridina. Un codón bajo en uridina se puede reemplazar con otro codón bajo en uridina. Un codón sin uridina se puede reemplazar con otro codón sin uridina. Una secuencia modificada en uridina puede estar enriquecida en uridina o enrarecida en uridina.
Enriquecido en uridina: Como se usa en el presente documento, las expresiones "enriquecido en uridina" y variantes gramaticales se refieren al aumento en el contenido de uridina (expresado en valor absoluto o como valor porcentual) en un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la correspondiente secuencia de ácido nucleico candidata. El enriquecimiento en uridina se puede implementar mediante la sustitución de codones en la secuencia de ácido nucleico candidata con codones sinónimos que contienen menos nucleobases uridina. El enriquecimiento en uridina puede ser global ( es decir, en relación con la longitud total de una secuencia de ácido nucleico candidata) o local (es decir, en relación con una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico candidata).
Enrarecido en uridina: Como se usa en el presente documento, las expresiones "enrarecido en uridina" y variantes gramaticales se refieren a una disminución en el contenido de uridina (expresado en valor absoluto o como valor porcentual) en un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la correspondiente secuencia de ácido nucleico candidata. El enrarecimiento en uridina se puede implementar mediante la sustitución de codones en la secuencia de ácido nucleico candidata con codones sinónimos que contienen menos nucleobases uridina. El enrarecimiento en uridina puede ser global (es decir, en relación con la longitud total de una secuencia de ácido nucleico candidata) o local (es decir, en relación con una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico candidata).
Ejemplos
Material y métodos
Síntesis de ARNm. Los ARNm se sintetizaron in vitro a partir de plantillas de ADN linealizados que incluyen la 5'UTR, 3'UTR y cola poliA, seguido de la adición de una 5'CAP. Todas las 5' UTR representadas en las Figuras se muestran como secuencias de ADN con fines de transcripción in vitro. Las secuencias de 5'UTR ensayadas en los ejemplos se resumen en la Tabla 8 y se representan como ARN.
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Cultivo celular y transfección. Células HeLa (ATCC), hepatocitos humanos primarios (BioReclamation IVT), AML12 (ATCC n.° CRL-2254) y MEF (Oriental Bioservice Inc., Minamiyayamashiro Laboratory) se cultivaron en condiciones estándar. Las células se transfectaron con ARNm indicador usando Lipofectamina 2000 o MC3 siguiendo protocolos estándar.
Ensayo de luciferasa en ratones. Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Moderna Therapeutics. Ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad, con un peso de 18-23 g, y ratas Sprague Dawley hembra, de 8 semanas de edad, con un peso de 275-300 g (Charles River Laboratories, Wilmington, Ma ), se precalentaron usando una lámpara de calentamiento antes de inyectar en la vena lateral de la cola, utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja 27G 1/2' (Becton Dickson, San Diego, MA), ARNm 0,05 mg/kg encapsulado en MC3 que codifica Luc. La luciferina, el sustrato de la luciferasa, se inyectó por vía intraperitoneal en los ratones o ratas en una dosis de ~ 150 mg/kg de peso corporal. 20 minutos después de la inyección de Luciferina, los animales se sacrificaron. La formación de imágenes de todo el cuerpo se llevó a cabo en el IVIS Spectrum utilizando el software Living Image (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Análisis de escaneo con fugas utilizando una construcción de indicador eGFP. Las células se recogieron y lisaron utilizando tampón 5xRIPA (Boston BlOproducts; Cat: BP-115-5X) en presencia de inhibidores de proteasa y fosfatasa (ThermoScientific; Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cat: 78446). La concentración de proteínas se evaluó mediante el ensayo de proteínas BioRad DC (Cat: 5000113) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los lisados de proteínas totales se analizaron mediante SDS-PAGE/transferencia Western usando anticuerpos primarios contra eGFP (Abcam; ab290 conejo, ab6673 cabra), V5-marcador (Abcam; ab27671 ratón) y FLAG-marcador (Abcam; ab18230 ratón) en combinación con anticuerpos secundarios (LICOR; Verde, cabra, anti-ratón 926-32210; Rojo, cabra, anti-conejo 926-68071; Rojo, burro, anti-ratón 926­ 68072). Se usó un anticuerpo contra la vinculina (Abcam; ab18058 ratón) como control de carga. Se utilizó un sistema LI-COR Odyssey CLx para la formación de imágenes de transferencias Western y análisis densitométrico de los productos de traducción. Se cuantificaron las cantidades de eGFP sintetizadas a partir del primer (M1), segundo (M2) o tercer codón AUG (M3), respectivamente. El porcentaje de proteína truncada se determinó como (M2+M3)/(M1+M2+M3), ajustando (M1+M2+M3) al 100%. La expresión total de eGFP se determinó como (M1+M2+M3)/(vinculina).
Huella 40S. Las células se lisaron y luego se reticularon inmediatamente con formaldehído a una concentración final del 1,5%. Después del intercambio de tampón, el lisado se trató con un cóctel de RNasas T1, A e I. El lisado digerido se centrifugó a través de un gradiente de sacarosa y el pico de la subunidad pequeña se seleccionó para entrecruzamiento inverso y extracción de ARN. El ARNr se agotó usando el kit de agotamiento de ARNr NEBNext y el ARN resultante se convirtió en una biblioteca de ADNc con el conjunto de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext. Después de la secuenciación profunda, las lecturas se mapearon respecto a las células HeLa del transcriptoma humano de hepatocitos humanos, como se indica.
Ejemplo 1: La longitud y la composición de bases de las 5' UTR que comprenden ARNm indicadores afectan el escaneo con fugas y la fidelidad del inicio de la traducción
Se generaron construcciones de plásmidos de ADN y se usaron para producir ARNm indicadores, por medio de la transcripción in vitro, como se describe en Materiales y métodos. Los ARNm indicadores contienen una 5' UTR con una secuencia de consenso de Kozak que precede o secuencia arriba de una secuencia que codifica un marcador de epítopo V5 y un marcador de epítopo 3X FLAG fusionado en marco con una secuencia que codifica eGFP, seguida de una 3' UTR. Las secuencias que codifican el marcador de epítopo V5 y el marcador de epítopo 3X FLAG están precedidas cada una por un codón AUG en marco secuencia arriba del codón AUG de eGFP, como se muestra en la Figura 1A. Los ARNm indicadores están diseñados de tal manera que el inicio de la traducción desde el 1er codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría un polipéptido eGFP fusionado con un marcador de epítopo V5 y con un marcador de epítopo 3xFLAG en el extremo N-terminal. El inicio de la traducción desde el 2° codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría un polipéptido eGFP fusionado solo con un marcador de epítopo 3xFLAG en el extremo N-terminal. El inicio de la traducción en el 3er codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría solo un polipéptido eGFP que no contiene marcadores de epítopo. Este diseño proporciona la capacidad de evaluar el efecto de varias 5' UTR (Figura 1B) en el inicio de la traducción en cada codón AUG en función de la producción de polipéptidos de longitudes discretas (cada uno detectable usando un anticuerpo anti-GFP) y con reactividad diferencial para anticuerpos anti-V5 y/o anti-FLAG, dependiendo de la presencia o ausencia del marcador del epítopo correspondiente. La producción de un producto de traducción de longitud completa (reactivo para un anticuerpo específico de V5) y productos de escaneo con fugas que surgen del inicio de la traducción en el 2° y 3er de AUG (no reactivo para un anticuerpo específico de V5, pero reactivo para anticuerpos específico FLAG y eGFP, respectivamente) se controla mediante técnicas estándar de SDS-PAGE/transferencia Western, como se describe en Materiales y métodos.
En experimentos basados en células, se detectaron mediante transferencia Western un producto de traducción de longitud completa (V5-Flag-eGFP (M1)) y productos de traducción truncados (Flag-eGFP (M2); eGFP(M3)) (Figura 2A) después de la separación electroforética de proteínas de células HeLa o fibroblastos embrionarios murinos (MEF) que se transfectaron de forma independiente con ARNm indicadores que contenían 5' UTR que varían en longitud y/o composición de bases, como se describe en Materiales y métodos (Tabla 8). Sorprendentemente, una 5' UTR relativamente larga derivada del gen de tubulina de mamíferos (designada como "262nt tipo-tub"; Figura 2A y 2B) redujo drásticamente la formación de los productos de traducción truncados FLAG-eGFP (M2) y eGFP (m 3), demostrando que la longitud de la 5' UTR de los ARNm indicadores afecta el inicio de la traducción y al escaneo con fugas en estos tipos de células. Además, se evaluó la cantidad de productos de proteínas truncadas traducidos de los ARNm indicadores que contenían dos 5' UTR cortos (designados como "6nt" y "6nt (TISU)"; Figura 2A) que variaban solo en la composición de bases. Las células transfectadas con ARNm indicador que contiene la 5' UTR de 6 nt (TISU) produjeron menos productos de traducción truncados respecto a las células transfectadas con ARNm indicador que contiene la 5' UTR de 6 nt, lo que demuestra que la composición de bases de las 5' UTR también afecta al inicio de la traducción y el escaneo con fugas. La cantidad de productos truncados traducidos de los ARNm indicadores se cuantificó por densitometría y se muestra como un porcentaje de la cantidad total de todos los productos de traducción detectables por transferencia Western (Figuras 2C y 2D). Se obtuvieron resultados similares a partir de experimentos in vivo utilizando células derivadas del hígado después de la administración intravenosa de 0,5 mg/kg de ARNm indicador como se muestra en la Figura 2B y 2D.
Ejemplo 2: el aumento de la longitud de las 5' UTR de los ARNm indicadores disminuye tanto el escaneo con fugas como la eficiencia de traducción
Para poner de manifiesto mejor la contribución de la longitud de 5' UTR en el escaneo con fugas, se generaron ARNm indicadores que contenían 5' UTR de longitud creciente (Tabla 8) secuencia arriba de una secuencia que codifica un marcador de epítopo 3X FLAG fusionada en marco con una secuencia que codifica eGFP, seguido de una 3' UTR. La secuencia que codifica el marcador del epítopo 3X FLAG está precedida por un codón AUG en marco y está secuencia arriba del codón eGFP AUG, como se muestra en la Figura 3A. Los ARNm indicadores están diseñados de tal manera que el inicio de la traducción desde el 1er codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría un polipéptido eGFP fusionado con un marcador de epítopo 3xFLAG en el extremo N-terminal. El inicio de la traducción desde el 2° codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría solo un polipéptido eGFP que no contiene marcadores de epítopo. Este diseño proporciona la capacidad de evaluar el efecto de la 5' UTR en el inicio de la traducción en cada codón AUG en función de la producción de polipéptidos de longitudes discretas (cada uno detectable usando un anticuerpo anti-GFP) y con reactividad diferencial para el anticuerpo anti-FLAG, dependiendo de la presencia o ausencia del marcador de epítopo. La producción de un producto de traducción de longitud completa (reactivo para los anticuerpos específicos de FLAG y eGFP) y los productos de escaneo con fugas que surgen del inicio de la traducción en el 2° AUG (solo reactivo para los anticuerpos específicos de eGFP) se controla mediante técnicas estándar de SDS-PAGE/transferencia Western, como se describe en Materiales y métodos.
En experimentos basados en células, se detectaron un producto de traducción de longitud completa (FLAG-eGFP (M1)) y un producto de traducción truncado (eGFP (M2)) mediante transferencia Western después de la separación electroforética de proteínas de células HeLa que se transfectaron de forma independiente con ARNm indicadores que contenían 5' UTR que varían en longitud, como se muestra (Figura 3B). Como sugerían los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 1, los ARNm indicadores que contenían las 5' UTR de longitud creciente se correlacionaban con una menor traducción del producto de traducción truncado eGFP (M2) (Figura 3C), demostrando nuevamente que la longitud de la 5' UTR de los ARNm indicadores puede afectar al inicio de la traducción y al escaneo con fugas. Además, la cantidad de producto de traducción total traducido de los ARNm indicadores disminuyó con el aumento de longitud de la 5' UTR (Figura 3D), según lo medido por el análisis densitométrico de todas las bandas reactivas anti-eGFP de la transferencia Western en la Figura 3B.
Estos hallazgos también están respaldados por el análisis de la huella de la subunidad ribosómica pequeña en los ARNm celulares. La Figura 4A ilustra la densidad relativa de las subunidades pequeñas, donde las lecturas de secuenciación profunda se mapearon frente al transcriptoma de las células HeLa y se contó el número de lecturas que se superponen con cada AUG en cada ARNm. El número de lecturas superpuestas con cada AUG se normalizó luego respecto al 1er AUG, mostrando una densidad significativa de subunidades ribosómicas pequeñas en el 2°, 3er, etc. codón AUG. En un experimento separado realizado en ausencia de entrecruzamiento, se observa un patrón similar tanto en células HeLa (Figura 12A) como en bazos de ratón (Figura 12B), donde la densidad de subunidades ribosómicas pequeñas en el 1er AUG disminuye con cada subsiguiente AUG en el ARNm.
La frecuencia de escaneo con fugas dependiente de la longitud de 5' UTR (Figura 4B) para cada ARNm en hepatocitos humanos primarios se estimó dividiendo la densidad media de lectura de subunidades pequeñas en los primeros 500 nt de la secuencia de codificación por la densidad media de lectura de subunidades pequeñas en la 5'UTR. En la Figura 4B, se representó el escaneo con fugas frente a la longitud de la 5'UTR; cada punto representa un ARNm individual con al menos 100 lecturas mapeadas. La línea negra representa un promedio móvil.
Ejemplo 3: Los elementos de ARN ricos en GC situados proximales a la secuencia de consenso de Kozak de los ARNm indicadores reducen el escaneo con fugas y aumentan la fidelidad del inicio de la traducción
La secuencia de consenso de Kozak [GCCACC] ubicada inmediatamente secuencia arriba del 1er codón AUG desde el extremo 5' no es suficiente para garantizar una alta fidelidad en el inicio de la traducción para los ARNm indicadores descritos en los ejemplos anteriores, como se muestra por un significativo nivel de escaneo con fugas observado por dos sistemas de ensayo independientes.
Para poner de manifiesto mejor la contribución de la composición de bases de la 5' UTR en el escaneo con fugas, se generaron ARNm indicadores con 5' UTR que contenían elementos de ARN ricos en GC (Tabla 8). La ubicación aproximada de estos elementos de ARN ricos en GC se representa en la Figura 5A. Estas 5' UTR van seguidas de una secuencia que codifica un marcador de epítopo 3X FLAG fusionado en marco con una secuencia que codifica eGFP, seguida de una 3' UTR. La secuencia que codifica el marcador de epítopo 3X FLAG está precedida por un codón AUG en marco y está secuencia arriba del codón AUG de eGFP, como se muestra en la Figura 5A. Como en los ejemplos previos, estos ARNm indicadores están diseñados de tal manera que el inicio de la traducción desde el 1er codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría un polipéptido eGFP fusionado con un marcador de epítopo 3xFLAG en el extremo N-terminal. El inicio de la traducción en el 2° codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría solo un polipéptido eGFP que no contiene marcadores de epítopo. Este diseño proporciona la capacidad de evaluar el efecto de la presencia y posición de los elementos de ARN ricos en GC en el inicio de la traducción en cada codón AUG en función de la producción de polipéptidos de longitudes discretas (cada uno detectable usando un anticuerpo anti-GFP) y con reactividad diferencial para el anticuerpo anti-FLAG, dependiendo de la presencia o ausencia del marcador de epítopo. La producción de un producto de traducción de longitud completa (reactivo para los anticuerpos específicos tanto de FLAG como de eGFP) y los productos de escaneo con fugas que surgen del inicio de la traducción en el 2° AUG (solo reactivo para anticuerpos específicos de eGFP) se controla mediante técnicas estándar de SDS-PAGE/tansferencia Western, como se describe en Materiales y métodos.
En experimentos basados en células, se detectaron un producto de traducción de longitud completa (FlageGFP (M1)) y un producto de traducción truncado (eGFP (M2)) mediante transferencia Western después de la separación electroforética de proteínas de células HeLa o MEF que se transfectaron de forma independiente con ARNm indicadores que contenían 5' UTR que codifican elementos de ARN ricos en GC situados proximales o distales a la secuencia de consenso de Kozak que precede al 1er codón AUG desde el extremo 5', como se muestra (Figura 5A). La inserción de un elemento de ARN de 10 nt compuesto por restos C y G [CCCCGGCGCC; V1] (SEQ ID NO: 2) secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak redujo significativamente el escaneo con fugas (Figura 5B), sin afectar a la eficiencia de traducción general como se ilustra para dos construcciones de indicadores diferentes, eritropoyetina humana (Epo, Figura 6A y B) y luciferasa (Luc, Figura 6C y D). Un elemento de ARN de 7 nt relacionado insertado secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak también compuesto por restos C y G [CCCCGGC; V2] (SEQ ID NO: 3) también disminuyó la cantidad del producto de traducción truncado eGFP (M2) tanto en células HeLa como en MEF. Como sugerían los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 1, la modificación de la composición de bases de las 5' UTR mediante inserción de elementos de a Rn ricos en GC se correlacionó con una menor traducción del producto de traducción truncado eGFP (M2) (Figura 5B), demostrando nuevamente que la composición de bases de la 5' UTR de los ARNm indicadores puede afectar el inicio de la traducción y al escaneo con fugas en estos tipos de células. Además, también se demostró que la posición del elemento de ARN rico en GC V1 tiene un efecto en el escaneo con fugas. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, el escaneo con fugas se reduce cuando estos elementos de ARN ricos en GC están próximos a la secuencia de consenso de Kozak o al codón de iniciación (M1). Los V3-UTR (V3) y V4-UTR (V4), que comprenden el elemento de ARN rico en GC V1 pero situados secuencia más arriba del codón de iniciación AUG (M1) (Tabla 8), no son tan efectivos para disminuir la fuga con escaneo, como se muestra en la Figura 5B.
Ejemplo 4: el contenido de GC de los 20 nts que preceden a la secuencia de consenso de Kozak en los ARNm indicadores se correlaciona con el escaneo con fugas
Para evaluar el impacto del contenido de GC en el escaneo con fugas, se ensayaron 2545' UTR diferentes de fuentes naturales y sintéticas, con composición de bases y longitud variables, con el indicador eGFP descrito en el Ejemplo 3, donde el inicio de la traducción desde el 1er codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría un polipéptido eGFP fusionado con un marcador de epítopo 3xFLAG en el extremo N-terminal. El inicio de la traducción en el 2° codón AUG secuencia abajo de la 5' UTR produciría solo un polipéptido eGFP que no contiene marcadores de epítopo. Las 24 secuencias principales que funcionaron bien en términos de eficiencia de traducción general se analizaron más a fondo para el escaneo con fugas. La Figura 7A muestra el escaneo con fugas observado para cada una de las construcciones de 5' UTR, todas más cortas de 100 nucleótidos de longitud, normalizadas respecto al escaneo con fugas observado para la 5' UTR estándar (Figura 1, Tabla 8).
Claramente, el mayor contenido de GC en los nucleótidos finales de la 5' UTR, es decir, los nucleótidos que preceden al codón de iniciación, disminuye el escaneo con fugas. Como se muestra arriba, la inserción de un elemento de ARN de 10 nt compuesto de restos C y G [CCCCGGCGCC; V1] (SEQ ID NO: 2) en la 5' UTR estándar dio como resultado una disminución significativa del escaneo con fugas.
Una correlación similar se encuentra globalmente en los ARNm humanos. En la Figura 7B, la frecuencia de escaneo con fugas para cada ARNm en hepatocitos primarios se estimó dividiendo la densidad media de lecturas de subunidades pequeñas en los primeros 500 nt de la secuencia codificante por la densidad media de lecturas de subunidades pequeñas en la 5' UTR y se representó gráficamente frente al número de bases G y C en los 20 nt finales de la 5' UTR; cada punto representa un ARNm individual con al menos 100 lecturas mapeadas. La línea negra representa un promedio móvil.
Ejemplo 5: Los ARNm con 5' UTR que comprenden elementos de ARN ricos en GC con más de 40% de citosina situados secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak disminuyen el escaneo con fugas
Para caracterizar aún más la capacidad de los elementos de ARN ricos en GC para disminuir el escaneo con fugas, se ensayaron 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC que comprendían más de 40% de nucleobases citosina con el indicador eGFP descrito en el Ejemplo 1. Las UTR de 5' (ensayadas se muestran en la tabla de la Figura 8A. Un esquema de la construcción indicadora con la situación relativa de los elementos de ARN ricos en GC se muestra en la Figura 8B.
Similar a los resultados que se muestran en la Figura 5B, la presencia del elemento de ARN rico en GC V1, así como GC aleatorio n.°2, GC aleatorio n.°3 y GC1, que comprenden 60%-70% de nucleobases citosina, disminuyó el escaneo con fugas del ARNm indicador, como se muestra como una reducción en la cantidad de polipéptido FLAG-eGFP (M2) y eGFP (M3) (Figuras 9A y 9B), determinada por técnicas estándar de SDS-PAGE/transferencia Western, como se describe en Materiales y métodos. La 5' UTR que contiene el elemento de ARN rico en GC, GC aleatorio n.°1, que comprende 40% de nucleobases citosina, no disminuyó apreciablemente el escaneo con fugas en comparación con el 5' UTR de referencia, que no comprende un elemento de ARN rico en GC. En conjunto, estos datos demuestran que el contenido de citosina del elemento de ARN rico en GC afecta a la capacidad de la 5' UTR para disminuir el escaneo con fugas.
Ejemplo 6: los ARNm con 5' UTR que comprenden elementos de ARN ricos en GC aumentan la potencia de los polipéptidos traducidos
Para determinar el efecto de los elementos de ARN ricos en GC sobre la potencia de los polipéptidos traducidos del ARNm, se generaron ARNm indicadores que codificaban luciferasa o eGFP que contenían 5' UTR que comprenden los elementos de ARN ricos en GC V1 o V2, como se describe en la Tabla 8, y evaluado tanto in vivo como in vitro.
Para evaluar la potencia de los polipéptidos traducidos del ARNm que comprende 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC in vivo, se inyectó por vía intravenosa a ratones BALB/c 0,05 mg/kg de ARNm que codifica luciferasa secuencia abajo de una 5'UTR que comprende un elemento de ARN rico en GC (V1 o V2) formulado en una nanopartícula lipídica. En varios puntos de tiempo posteriores a la inyección, como se indica, se realizaron imágenes de todo el cuerpo usando IVIS para cuantificar la señal de luciferasa (flujo total). A las 6 horas, el ARNm que codifica la luciferasa y que comprende V1-UTR o V2-UTR produjo mayor luminiscencia que con el ARNm de control de comparación que no comprende un elemento de ARN rico en GC (Figura 10) o con el ARNm que comprende V3-UTR o V4- UTR. Los V3-UTR (V3) y V4-UTR (V4) (Tabla 8) comprenden el elemento de ARN rico en GC V1 pero situado secuencia más arriba del codón de iniciación AUG del gen de la luciferasa. En particular, el V1-UTR produjo la señal de luciferasa más alta. Estos datos sugieren que los elementos de ARN ricos en GC ensayados aumentan la potencia del polipéptido traducido del ARNm.
Para evaluar la potencia de polipéptidos traducidos del ARNm que comprende 5' UTR con elementos de ARN ricos en GC in vitro, células HeLa (Figura 11A), células AML12 (línea celular de hepatocitos de ratón) (Figura 11B) y hepatocitos humanos primarios ( Figura 11C) se transfectaron con ARNm que codifica deg-eGFP (eGFP fusionado con un dominio PEST en el extremo C-terminal para mediar en la degradación rápida de la proteína) y que comprende una 5' UTR con el elemento de ARN rico en GC V1 (v1) o con un ARNm de control que codifica eGFP y que comprende una 5' UTR que no contiene un elemento de ARN rico en GC (Ctrl). Se tomó una imagen de las células fluorescentes cada hora durante 48 horas utilizando un sistema de análisis de células vivas (IncuCyte). La intensidad fluorescente total de las células (AUC) para cada tipo de célula transfectada con cada ARNm se muestra en las Figuras 11A, 11B y 11C. La fluorescencia total es mayor en todos los tipos de células transfectadas con el ARNm que comprende V1 en comparación con el ARNm de control, lo que sugiere que el elemento de ARN rico en GC V1 aumentaba la potencia del polipéptido eGFP in vitro.
Los artículos tales como “un”, “una”, “el” y “la” pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. Las descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, son empleados en o, de otra forma, son relevantes para un producto o proceso dado, a no ser que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. La descripción incluye exactamente un miembro del grupo que está presente en, se emplea en, o es de otra forma relevante para un producto o procedimiento dado. La descripción incluye más de uno o todos los miembros del grupo que están presentes en, se emplean en, o son de otra forma relevantes para un producto o procedimiento dado.
También se indica que la expresión "que comprende" pretende ser abierta y permite, pero no requiere, la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando la expresión "que comprende" se usa en el presente documento, también describe, por tanto, la expresión "que consiste en".
Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen los puntos finales. Además, a no ser que se indique lo contrario o resulte evidente de otra manera a partir del contexto y la comprensión de un experto en la técnica, se entiende que los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o subintervalo dentro de los intervalos establecidos en la descripción, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a no ser que el contexto indique claramente otra cosa.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ARN mensajero (ARNm) que comprende
(i) una región 5' no traducida (UTR) que comprende al menos un elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR,
en donde el al menos un elemento de ARN es un elemento de ARN rico en GC que comprende nucleobases guanina (G) y citosina (C) y, opcionalmente, nucleobases adenina (A) y uracilo (U), o derivados o análogos de las mismas, en donde el elemento de ARN rico en GC tiene al menos 50% o más de nucleobases citosina (C) y tiene al menos 6 nucleótidos de longitud,
en donde el elemento de ARN rico en GC está situado aproximadamente 5-10 nucleótidos, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido secuencia arriba de una secuencia de consenso de Kozak en la 5'UTR, o secuencia arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de consenso de Kozak, y en donde la actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(f).
2. El ARNm de la reivindicación 1, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-10 nucleótidos de longitud, aproximadamente 10-15 nucleótidos de longitud, aproximadamente 15-20 nucleótidos de longitud, aproximadamente 20-25 nucleótidos de longitud o aproximadamente 25-30 nucleótidos de longitud,
en donde opcionalmente el elemento de ARN rico en GC es aproximadamente 50%-55% citosina, aproximadamente 55%-60% citosina, aproximadamente 60%-65% citosina, aproximadamente 65%-70% citosina, aproximadamente 70%-75% citosina o aproximadamente 75%-80% citosina.
en donde además opcionalmente el elemento de ARN rico en GC no comprende nucleobases adenina (A) o uracilo (U).
3. El ARNm de la reivindicación 1 o 2, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6-30 nucleótidos de guanina (G) y citosina (C), o derivados o análogos de los mismos, en donde la secuencia es >50% nucleobases citosina, >60% citosina o >70% citosina, y en donde el elemento de ARN rico en GC comprende un motivo de secuencia que se repite,
en donde opcionalmente el motivo de la secuencia que se repite es [CCG]n, en donde n = 2 a 10, 2 a 5, 4, 3 o 2, o
en donde opcionalmente el motivo de la secuencia que se repite es [GCC]n, donde n = 2 a 10, 2 a 5, 4, 3 o 2.
4. Un ARNm que comprende:
(i) una región 5' no traducida (UTR) que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR,
en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos 5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3' expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, y en donde la 5' UTR comprende el elemento de ARN rico en GC de aproximadamente 5-10 nucleótidos, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak, o secuencia arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de consenso de Kozak expuesta en la SEQ ID NO: 33.
5. Un ARNm que comprende:
(i) una región 5' no traducida (UTR) que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR,
en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos 5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3' expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, y en donde el elemento de ARN rico en GC está situado aproximadamente 5-10 nucleótidos, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak, o secuencia arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de consenso de Kozak expuesta en la SEQ ID NO: 33; o
un ARNm que comprende:
(i) una región no traducida (UTR) 5' que comprende un elemento de ARN rico en GC que proporciona una actividad reguladora de la traducción;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR,
en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos
5'-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3' expuesta en la SEQ ID NO: 33, en donde el elemento de ARN rico en GC comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, y en donde el elemento de ARN rico en GC está situado aproximadamente 5-10 nucleótidos, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 nucleótido secuencia arriba de la secuencia de consenso de Kozak, o secuencia arriba e inmediatamente adyacente a la secuencia de consenso de Kozak expuesta en la SEQ ID NO: 33; o
un ARNm que comprende
(i) una región no traducida (UTR) 5' que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 34;
(ii) un marco de lectura abierto completo que comprende un codón de iniciación y que codifica un polipéptido; y
(iii) una 3' UTR.
6. El ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende un segundo elemento de ARN que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde el segundo elemento de ARN comprende una estructura secundaria de ARN estable, y en donde la actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(f).
7. El ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende al menos un nucleótido modificado que proporciona una actividad reguladora de la traducción, en donde la actividad reguladora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en:
(a) inhibe o reduce el escaneo con fugas del ARNm por el PIC o el ribosoma;
(b) aumenta una cantidad de un polipéptido traducido del marco de lectura abierto completo;
(c) aumenta el inicio de la síntesis de polipéptidos en o desde el codón de iniciación;
(d) inhibe o reduce el inicio de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro del ARNm que no sea el codón de iniciación;
(e) inhibe o reduce una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro del ARNm que no sea el marco de lectura abierto completo;
(f) inhibe o reduce la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes del ARNm; y
(g) una combinación de cualquiera de (a)-(f), en donde opcionalmente el codón de iniciación comprende al menos un nucleótido modificado, y en donde el al menos un nucleótido modificado aumenta la afinidad de unión con el iniciador Met-tARNiMet, y/o
en donde opcionalmente el al menos un nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2-tiouridina, 2'-O-metil-2-tiouridina, 2-selenouridina, 2'-O-metil-ribosa, un nucleótido modificado en el que el resto de ribosa está modificado con un puente extra que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4', inosina, 2-metilguanosina, 6-metil-adenosina, un desoxirribonucleótido.
8. El ARNm de la reivindicación 7, en donde el ARNm comprende:
(i) un primer polinucleótido, en donde el primer polinucleótido se sintetiza químicamente, en donde el primer polinucleótido comprende una 5' UTR;
(ii) un segundo polinucleótido, en donde el segundo polinucleótido se sintetiza mediante transcripción in vitro, y en donde el segundo polinucleótido comprende un marco de lectura abierto completo que codifica un polipéptido y una 3' UTR,
en donde opcionalmente (i) y (ii) están entrecruzados químicamente o ligados enzimáticamente, y/o en donde opcionalmente el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están ligados operativamente.
9. El ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la actividad reguladora de la traducción aumenta o mejora la potencia del ARNm,
que comprende opcionalmente una cola poli A (p. ej., una cola poli A de aproximadamente 100 nucleótidos), en donde además opcionalmente, el ARNm comprende una estructura 5' Cap 1.
10. El ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ARNm comprende al menos una modificación química,
en donde opcionalmente la modificación química se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina o un análogo de pseudouridina,
en donde opcionalmente la modificación química es Nl-metilpseudouridina, y
en donde opcionalmente el ARNm está completamente modificado con Nl-metilpseudouridina.
11. Una composición que comprende el ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Una nanopartícula lipídica que comprende el ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
13. Una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula lipídica de la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. El ARNm de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, la composición de la reivindicación 11, la nanopartícula lipídica de la reivindicación 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en un método terapéutico, en donde dicho método comprende:
a) inhibir o reducir el escaneo con fugas de un ARNm por un PIC o ribosoma;
b) aumentar una cantidad de un polipéptido traducido de un marco de lectura abierto completo
c) aumentar la potencia de un polipéptido traducido de un ARNm;
d) aumentar la iniciación de la síntesis de polipéptidos en o desde un codón de iniciación
e) inhibir o reducir la iniciación de la síntesis de polipéptidos en cualquier codón dentro de un ARNm que no sea un codón de iniciación;
f) inhibir o reducir una cantidad de polipéptido traducido desde cualquier marco de lectura abierto dentro de un ARNm que no sea un marco de lectura abierto completo; y/o
g) inhibir o reducir la traducción de productos de traducción truncados o aberrantes de un ARNm, y el método comprende además poner en contacto una célula in vivo con una composición farmacéutica según la reivindicación 13, una nanopartícula lipídica según la reivindicación 12, una composición según la reivindicación 11 o un ARNm según cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
15. Un método para identificar un elemento de ARN, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que proporciona una actividad reguladora de la traducción, comprendiendo el método:
(i) sintetizar un 1er ARNm de control que comprende:
(a) una secuencia de polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido indicador, un 1er codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente al marco de lectura abierto que codifica el polipéptido indicador; una secuencia codificante para un primer marcador de epítopo secuencia arriba de, en marco y unida operativamente al 1er codón AUG; un 2° codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente a la secuencia codificante para el primer marcador de epítopo; una secuencia codificante para un segundo marcador de epítopo secuencia arriba de, en marco y unida operativamente al 2° codón AUG; un 3er codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente a la secuencia codificante para el segundo marcador de epítopo, una 5' UTR y una 3' UTR; y,
(ii) sintetizar un 2° ARNm de ensayo que comprende:
(b) una secuencia de polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido indicador, un 1er codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente al marco de lectura abierto que codifica el polipéptido indicador; una secuencia codificante para un primer marcador de epítopo secuencia arriba de, en marco y unida operativamente al 1er codón AUG; un 2° codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente a la secuencia codificante para el primer marcador de epítopo; una secuencia codificante para un segundo marcador de epítopo secuencia arriba de, en marco y unida operativamente al 2° codón AUG; un 3er codón AUG secuencia arriba de, en marco y unido operativamente a la secuencia codificante para el segundo marcador de epítopo, una 5' UTR y una 3' UTR, en donde la 5' UTR comprende un elemento de ARN de ensayo; y,
(iii) introducir el 1er ARNm de control y el 2a ARNm de ensayo en condiciones adecuadas para la traducción de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido indicador; y medir el efecto del elemento de ARN sobre el inicio de la traducción de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido indicador a partir de cada uno de los tres codones AUG.
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