ES2880306T3 - Formulaciones de vacunas de un solo vial - Google Patents

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Ryan Kramer
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Abstract

Una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende un aceite metabolizable, 1,2-dimiristoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta, en donde el aceite metabolizable es escualeno, y en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, o trehalosa, y en donde la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua y la formulación de emulsión de aceite en agua no comprende glicerol; y en donde la composición comprende además un adyuvante, en donde el adyuvante es un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA).

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de vacunas de un solo vial
Campo
La presente descripción se refiere en general a los campos de las formulaciones farmacéuticas y de vacunas.
Antecedentes
Los adyuvantes de vacunas de última generación diseñados racionalmente representan un avance significativo en el desarrollo de vacunas contra enfermedades desafiantes como la tuberculosis, el VIH y la malaria. Sin embargo, estos nuevos adyuvantes también requieren el mantenimiento de un proceso de la cadena de frío para garantizar la estabilidad a largo plazo. Esto presenta una barrera financiera y tecnológica significativa para la implementación mundial de tales vacunas. Además, el mantenimiento de la cadena de frío no puede garantizarse durante desastres naturales cuando las fuentes de alimentación pueden verse comprometidas. La liofilización de los productos farmacéuticos que contienen proteínas, como las vacunas, es un método comúnmente empleado para prolongar la vida útil y aumentar la resistencia al estrés térmico (Kasper y otros, 2013, Eur J Pharm Biopharm. Octubre de 2013; 85(2): 162-9; Wang y otros, Int J Pharm, 203:1-60), y varias vacunas comercializadas se distribuyen como productos liofilizados (PATH and Working in Tandem Ltd, 2012, Resumen de datos de estabilidad para vacunas autorizadas, Seattle, WA). Las nuevas vacunas en desarrollo para enfermedades complejas mediadas por inmunidad celular, como la malaria o la tuberculosis, pueden requerir componentes adyuvantes para mejorar y dar forma a las respuestas inmunitarias de manera efectiva (Reed y otros, 2009, Trends Immunol, 30:23-32). Sin embargo, la adición de adyuvante(s) a un antígeno de vacuna da como resultado una formulación más compleja con el potencial de múltiples interacciones entre los componentes. Por tanto, mantener la estabilidad a largo plazo en las vacunas con adyuvante puede representar un desafío importante para los desarrolladores de vacunas. Por esta razón, algunas vacunas con adyuvante se administran después de mezclarlas junto a la cama del enfermo con un vial con adyuvante separado (Agencia de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, 2012, Reunión del Comité Asesor de Vacunas y Productos Biológicos Relacionados). Además, ninguna de las vacunas liofilizadas comercializadas existentes contiene adyuvante en la formulación liofilizada (PATH and Working in Tandem Ltd, 2012, Resumen de datos de estabilidad para vacunas autorizadas, Seattle, WA). De hecho, las formulaciones con adyuvantes que ya se usan en vacunas humanas aprobadas, como las sales de aluminio o las emulsiones de aceite en agua, pueden ser particularmente difíciles de liofilizar (Clausi y otros, 2008, J Pharm Sci, 97:2049-2061; Rossi y otros, 2007, Role of Lipid Excipients in Modifying Oral and Parenteral Drug Delivery: Basic Principles and Biological Examples, pp 88-123, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken NJ). Aunque la liofilización de las vacunas que contienen bacterias, virus vivos atenuados o inactivados o proteínas es una práctica de rutina, hasta la fecha no ha habido informes de caracterización exitosa de liofilización y termoestabilidad de un candidato vacunal clínico con adyuvante (PATH and Working in Tandem Ltd, 2012, Resumen de datos de estabilidad para vacunas autorizadas, Seattle, WA). Se ha informado de la liofilización del antígeno protector del ántrax en una emulsión de escualeno; sin embargo, no se incluyó una descripción de la termoestabilidad y una caracterización biofísica del sistema reconstituido (Ivins y otros, 1995, Vaccine, 13:1779-1784). La naturaleza compleja de los adyuvantes de vacunas aprobados clínicamente (por ejemplo, alumbre, emulsiones de aceite en agua y/o monofosforil lípido A (MPLA) presenta un obstáculo sustancial para desarrollar vacunas con adyuvante liofilizadas.
El desarrollo de vacunas con adyuvante que no requieran el mantenimiento de la cadena de frío reduciría significativamente el costo y los obstáculos tecnológicos de la implementación de nuevas vacunas en todo el mundo, especialmente en entornos de bajos recursos. Por consiguiente, existe la necesidad de vacunas con adyuvante termoestables que sean químicamente estables a temperaturas sostenidas y que retengan la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno de vacuna. Como se describe en la presente descripción, la presente invención satisface estas necesidades y ofrece otras ventajas relacionadas.
Orr y otros (2013) se relaciona con la eliminación de la dependencia de la cadena de frío de una vacuna con adyuvante en nanoemulsión contra la tuberculosis por liofilización.
Breve resumen
La presente invención proporciona una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende un aceite metabolizable, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta, en donde el aceite metabolizable es escualeno, y en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, o trehalosa, y en donde la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y la formulación de emulsión de aceite en agua no comprende glicerol; y en donde la composición comprende además un adyuvante, en donde el adyuvante es un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA).
La presente invención también proporciona un solo vial que comprende la composición descrita en la presente descripción, en donde la composición está contenida en el vial.
La presente invención proporciona además un método para almacenar una composición de vacuna que comprende almacenar la composición de vacuna liofilizada termoestable descrita en la presente descripción entre 25 °C y 60 °C durante al menos 1 mes.
La presente invención también proporciona un método para generar una composición de vacuna liofilizada termoestable, que comprende la etapa de liofilizar una emulsión de aceite en agua para formar una composición de vacuna liofilizada termoestable, en donde la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización comprende un aceite metabolizable, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), y un excipiente formador de torta, en donde el aceite metabolizable es escualeno, en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, o trehalosa, en donde la composición de vacuna está en la forma de una torta, en donde la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización no comprende glicerol, y en donde la composición comprende además un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA).
La presente invención proporciona además una composición de vacuna liofilizada termoestable descrita en la presente descripción para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende: (a) reconstituir la composición en una emulsión de aceite en agua; y (b) administrar la emulsión al sujeto, que estimula de este modo una respuesta inmunitaria en el sujeto, en donde la composición comprende además un antígeno.
En un aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende un aceite metabolizable y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución, y en donde el excipiente formador de torta es (1) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; o (2) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa. En algunas modalidades, la composición comprende además un antígeno y/o un adyuvante.
En un aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende una cantidad eficaz de un antígeno, un aceite metabolizable y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución, y en donde el excipiente formador de torta es (1) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; o (2) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa. En algunas modalidades, la composición comprende además un adyuvante.
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende una cantidad eficaz de un adyuvante, un aceite metabolizable y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución, y en donde el excipiente formador de torta es (1) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; o (2) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa. En algunas modalidades, la composición comprende además un antígeno.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en lactosa, rafinosa y lactulosa.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y la formulación de emulsión de aceite en agua comprende menos de o aproximadamente 1 % (p/v) de glicerol.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la formulación de emulsión de aceite en agua comprende menos de o aproximadamente un 0,5 % (p/v) de glicerol.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la formulación de emulsión de aceite en agua no comprende glicerol.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y en donde el excipiente formador de torta es trehalosa, que se encuentra en una concentración de aproximadamente 10 % (p/v) en la formulación de emulsión de aceite en agua.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y en donde el excipiente formador de torta es trehalosa, que se encuentra en una concentración de aproximadamente 5 % (p/v) en la formulación de emulsión de aceite en agua.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, en donde el manitol en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de aproximadamente 0,1 % (p/v) y la trehalosa en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de aproximadamente 5 % (p/v) en la formulación de emulsión de aceite en agua.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, y en donde el manitol en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de aproximadamente 2,5 % (p/v) y la trehalosa en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de aproximadamente 2,5 % (p/v).
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la formulación de emulsión de aceite en agua no comprende glicerol.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a una temperatura entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a una temperatura entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 3 meses.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a una temperatura entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 6 meses.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a una temperatura entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 12 meses.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 25 °C durante al menos 1 día.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 25 °C durante al menos 1 semana.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 25 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 37 °C durante al menos 1 día.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 37 °C durante al menos 1 semana.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 37 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 50 °C durante al menos 1 día.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 50 °C durante al menos 1 semana.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 50 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición es termoestable de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 50 °C durante al menos 1 día, al menos 1 semana o al menos 1 mes.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición está en la forma de una torta elegante.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición está en la forma de una torta que no exhibe una pigmentación marrón por inspección visual cuando se almacena en cualquiera de las condiciones de temperatura y duración descritas en la presente descripción.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la termoestabilidad de la composición se determina antes de la reconstitución de la composición liofilizada.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la forma de una torta y en donde la termoestabilidad se determina mediante la observación de la torta para ver si se encoge, se agrieta y/o se pone marrón.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la termoestabilidad se determina después de la reconstitución de la composición liofilizada.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la termoestabilidad se determina mediante la inspección de la emulsión de aceite en agua formada tras la reconstitución para la formación de crema.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y la concentración de antígeno o adyuvante en la emulsión de aceite en agua formada tras la reconstitución no exhibe más de o aproximadamente un 25 % de degradación de la concentración de antígeno o adyuvante en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la termoestabilidad se determina mediante el ensayo de los componentes de la emulsión de aceite en agua formada tras la reconstitución. En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, la emulsión reconstituida tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el antígeno es un polipéptido, un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un patógeno.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el adyuvante es un aceite metabolizable. En algunas modalidades, el aceite metabolizable es escualeno, escualeno sintético, aceite de semilla de uva, aceite de oliva o un isoprenoide sintético.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el adyuvante es un agonista de TLR4. En algunas modalidades, el agonista de TLR4 es MPL, 3d-MPL o GLA sintético. En algunas modalidades, el adyuvante de GLA sintético tiene la siguiente estructura:
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en donde R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20; y R 2 y R 4 son alquilo C9-C20. En algunas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
En algunas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción, el aceite metabolizable es escualeno, aceite mineral, aceite de semilla de uva, escualeno sintético o isoprenoide sintético.
En algunas modalidades, la composición comprende además 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), PC de huevo, leticina, tween o una combinación de estos.
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden además un tensioactivo. En algunas modalidades, el tensioactivo es pluronic F68. En algunas modalidades, la composición comprende además un antioxidante. En algunas modalidades, el antioxidante es la vitamina E.
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción un solo vial que comprende las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables descritas en la presente descripción, en donde la composición está contenida en el vial.
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción un método para almacenar las composiciones de vacunas termoestables descritas en la presente descripción que comprende almacenar las composiciones entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C o entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 1 mes, en donde la formulación de la vacuna es termoestable.
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción un método para generar una composición de vacuna liofilizada termoestable, que comprende la etapa de liofilizar una emulsión de aceite en agua para formar una composición de vacuna liofilizada termoestable, en donde la emulsión de aceite en agua comprende (1) un antígeno, (2) un aceite metabolizable y (3) un excipiente formador de torta, en donde el excipiente formador de torta es (a) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; o (b) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa, y en donde la composición de vacuna está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción un método para generar una composición de vacuna liofilizada termoestable, que comprende la etapa de liofilizar una emulsión de aceite en agua para formar una composición de vacuna liofilizada termoestable, en donde la emulsión de aceite en agua comprende (1) un adyuvante, (2) un aceite metabolizable y (3) un excipiente formador de torta, en donde el excipiente formador de torta es (1) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; o (2) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa, y en donde la composición de vacuna está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en lactosa, rafinosa y lactulosa.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización comprende menos de o aproximadamente un 1 % (p/v) de glicerol.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización comprende menos de o aproximadamente un 0,5 % (p/v) de glicerol.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización no comprende glicerol.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta es trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 % (p/v) en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta es trehalosa al 5 % (p/v) a una concentración de aproximadamente 5 % (p/v) en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, y en donde el manitol en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización es aproximadamente 0,1 % (p/v) y la trehalosa en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización es de aproximadamente 5 % (p/v).
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el excipiente formador de torta en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización es una combinación de manitol y trehalosa, y en donde el manitol en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización es aproximadamente 2,5 % (p/v) y la trehalosa en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización es aproximadamente 2,5 % (p/v).
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización no comprende glicerol.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable a una temperatura entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable durante al menos 3 meses.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable durante al menos 6 meses.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable durante al menos 12 meses.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 25 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 37 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición es termoestable a aproximadamente 50 °C durante al menos 1 mes.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la etapa de liofilización se realiza en un solo vial.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 100 nm. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la concentración del antígeno y/o el adyuvante en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución no exhibe más de o aproximadamente un 25 % de degradación en comparación con la concentración del antígeno y/o el adyuvante en la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición liofilizada está en la forma de una torta.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la termoestabilidad se determina antes de la reconstitución de la composición liofilizada.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la composición liofilizada está en la forma de una torta y en donde la termoestabilidad se determina mediante la observación de que la torta se encoge o se pone marrón.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la termoestabilidad se determina después de la reconstitución de la composición liofilizada.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la termoestabilidad se determina mediante la inspección de la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución para la formación de crema.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la termoestabilidad se determina visualmente.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la termoestabilidad se determina mediante el ensayo de los componentes de la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión se liofiliza en un solo vial. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión reconstituida tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización comprende un antígeno y un adyuvante.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el antígeno es un polipéptido, un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un patógeno.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el adyuvante es un aceite metabolizable. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el adyuvante de aceite metabolizable es escualeno, escualeno sintético, aceite de semilla de uva, aceite de oliva o un isoprenoide sintético. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el antígeno es un polipéptido, un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un patógeno.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el adyuvante es un agonista de TLR4. En algunas modalidades, el agonista de TLR4 es MPL, 3d-MPL o GLA sintético. En algunas modalidades, el adyuvante de GLA sintético tiene la siguiente estructura:
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en donde R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20; y R2 y R4 son alquilo C9-C20. En algunas modalidades, R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 ; y R2 y R4 son alquilo C9.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el aceite metabolizable es escualeno, aceite mineral, aceite de semilla de uva, escualeno sintético o isoprenoide sintético.
En algunas modalidades, la composición de vacuna comprende además 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), PC de huevo, leticina, tween o una combinación de estos.
En algunas modalidades, la composición de vacuna comprende además un tensioactivo. En algunas modalidades, el tensioactivo es pluronic F68. En algunas modalidades, la composición de vacuna comprende además un antioxidante (por ejemplo, vitamina E).
En otro aspecto de la descripción, se describe en la presente descripción un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende: (a) reconstituir cualquiera de las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables descritas en la presente descripción en una emulsión de aceite en agua; y (b) administrar la emulsión al sujeto, que estimula de este modo una respuesta inmunitaria en el sujeto. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria inespecífica. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria específica de antígeno. En algunas modalidades, la emulsión de aceite en agua se administra por vía intradérmica u oral. En algunas modalidades, la composición comprende GLA. En algunas modalidades, el mamífero es un ser humano, un perro o una vaca.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra que la liofilización de SE al 2 % v/v en trehalosa al 5 % p/v retuvo las características de la emulsión. Figura 1A) Aspecto de la emulsión antes de la liofilización (izquierda), como torta liofilizada (centro) y después de la reconstitución de la torta liofilizada (derecha). Figura 1B) Las distribuciones de volumen del tamaño de partículas se midieron mediante dispersión dinámica de la luz (DLS).
La Figura 2 muestra que la liofilización mejoró significativamente la estabilidad física y del pH de la emulsión a 37 °C y la estabilidad química a 90 °C. Figura 2A) Tamaño de partículas en la emulsión líquida antes de la liofilización (cuadrado relleno) y la emulsión liofilizada reconstituida (círculo relleno) cuando se almacena a lo largo del tiempo a 25 °C (panel superior) o 37 °C (panel inferior). Figura 2B) pH en la emulsión líquida (cuadrado relleno) y la emulsión liofilizada reconstituida (círculo relleno) cuando se almacena a lo largo del tiempo a 25 °C (panel superior) o 37 °C (panel inferior). Figura 2C) Cantidad de componentes en la emulsión cuando se almacena en una condición de degradación acelerada de 90 °C a lo largo del tiempo. El por ciento (%) de fosfatidilcolina derivada de huevo (PC-huevo líquida; círculo relleno), escualeno (escualeno líquido; triángulo relleno) y a-tocoferol (a-tocoferol líquido; diamante relleno) en la emulsión líquida muestra cambios rápidos en la concentración del componente en comparación con la fosfatidilcolina derivada de huevo (PC-huevo liofilizada; cuadrado relleno), el escualeno (escualeno liofilizado; triángulo relleno invertido) y el a-tocoferol (a-tocoferol liofilizado; círculo vacío) en la emulsión liofilizada reconstituida.
La Figura 3 muestra los cambios fisicoquímicos de la emulsión liofilizada durante el almacenamiento a 25 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C y 90 °C que se reconstituyó periódicamente durante 1500 horas. Figura 3A) Tamaño de partículas en la emulsión liofilizada reconstituida almacenada a 25 °C (círculo relleno), 37 °C (cuadrado relleno), 50 °C (triángulo relleno), 60 °C (triángulo relleno invertido) o 90 °C (círculo vacío) a lo largo del tiempo. Figura 3B) pH en la emulsión liofilizada reconstituida almacenada a 25 °C (círculo relleno), 37 °C (cuadrado relleno), 50 °C (triángulo relleno), 60 °C (triángulo relleno invertido) o 90 °C (círculo vacío) a lo largo del tiempo. Figura 3C) Relación del ancho de la torta en la emulsión liofilizada almacenada a 25 °C (círculo relleno), 37 °C (cuadrado relleno), 50 °C (triángulo relleno), 60 °C (triángulo relleno invertido) o 90 °C (círculo vacío) a lo largo del tiempo.
Figura 3D) La fusión, medida por el encogimiento del ancho de la torta, se correlacionó inversamente con el tamaño de partículas cuando la emulsión liofilizada se almacenó a 60 °C en condiciones de estabilidad en estrés. La Figura 4 muestra que la selección de excipientes afecta el mantenimiento de la emulsión después de la reconstitución. Figura 4a ) Índice de polidispersidad (Pdl) de la formulación con cada excipiente. Figura 4B) Tamaño de partículas (nM) de la emulsión con cada excipiente. De izquierda a derecha, SE (material a granel), trehalosa (pre-liofilización), trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa, lactulosa, ribosa, dextrano 40000, PEG 3350, manitol, estaquiosa, sorbitol, ácido dipicolínico (0,5 %), ácido nicotínico (0,5 %) y prolina.
La Figura 5 muestra la formulación y las características de la torta de SE de aceite reconstituido al 2 % (v/v) en trehalosa, ribosa, manitol o prolina al 5 % (p/v). Figura 5A) Imágenes de la torta de las emulsiones liofilizadas.
Figura 5B) Comparación de la formación de crema entre las formulaciones liofilizadas reconstituidas en trehalosa y manitol. Las flechas indican la formación de crema. Figura 5C) Distribuciones de volumen del tamaño de partículas medidas por DLS.
La Figura 6 muestra que la selección de excipientes y la estructura química impactan en la termoestabilidad de la torta. Figura 6A) Termogramas del aparato de punto de fusión de la transición de fusión para las formulaciones representativas. Figura 6B) Inicio de la torta y temperatura de tm dentro de cada excipiente. La Figura 7 muestra que la estabilidad del tamaño de la emulsión depende de la morfología de la torta y de la susceptibilidad a la fusión inducida térmicamente. Figura 7A) La estabilidad del tamaño de partículas depende del tipo de agente espesante y de la concentración del agente espesante usado. SE en excipientes de dextrosa al 5 % (cuadrado relleno), sacarosa al 5 % (diamante relleno), maltosa al 5 % (triángulo relleno invertido), trehalosa al 5 % (círculo relleno) y al 15 % de lactosa (triángulo relleno). Figura 7B) La tasa de crecimiento del tamaño de partículas se correlaciona con la temperatura de transición, una propiedad del agente espesante. La línea de puntos representa la temperatura de estabilidad en estrés de 90 °C.
La Figura 8 muestra que la formulación con manitol y excipientes de la clase 1 aumentaba en gran medida la termoestabilidad de la torta sin afectación de la emulsión. Comparación de la Tm de la torta entre SE de aceite al 2 % (v/v) en las formulaciones al 5 % (p/v) que contienen trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa o sacarosa con manitol al 0,2 %, 5 % (p/v) o sin manitol.
La Figura 9 muestra imágenes representativas de viales líquidos (izquierda), liofilizados (centro) y reconstituidos (derecha) de ID93+GLA-SE. Los viales no se sometieron a estrés (fila superior) o se sometieron a estrés (fila inferior) a 50 °C durante 30 días.
La Figura 10 muestra la caracterización de las partículas de las muestras liofilizadas líquidas y reconstituidas que contienen ID93 y/o GLA-SE como se indica en las etiquetas de las figuras. Figura 10A) Diámetro promedio Z de los experimentos DLS, Figura 10B) Índice de polidispersidad (Pdl) de los experimentos DLS, Figura 10C) Mediciones de potencial zeta a partir del análisis de seguimiento de las nanopartículas y Figura 10D) Mediciones de la concentración de las partículas a partir del análisis de seguimiento de las nanopartículas. Las barras rellenas representan las muestras sin estrés (es decir, almacenadas a 4 °C durante 30 días) y las barras abiertas representan las muestras sometidas a estrés a 50 °C durante 30 días.
La Figura 11 muestra una SDS-PAGE reductora con tinción del líquido ID93+GLA-SE de vial conjunto (carriles 1 y 3) y las muestras liofilizadas reconstituidas (carriles 2 y 4). Las muestras no se sometieron a estrés (carriles 1 y 2) o se sometieron a estrés (carriles 3 y 4) a 50 °C durante 30 días. Se muestran GLA-SE e ID93 sin estrés para la comparación (carriles 5 y 6, respectivamente).
La Figura 12 muestra las muestras liofilizadas reconstituidas y líquidas que contienen ID93 y/o GLA-SE. Las concentraciones de Figura 12A) GLA, Figura 12B) DMPC y Figura 12C) escualeno se determinaron a partir de las curvas estándar del análisis de HPLC de fase inversa. Figura 12D) Un cromatograma representativo que muestra los componentes DMPC, escualeno y GLA. Las barras rellenas representan las muestras sin estrés y las barras abiertas representan las muestras sometidas a estrés a 50 °C durante 30 días.
La Figura 13 muestra que la liofilización de ID93+GLA-SE evitó la pérdida de la actividad biológica debido al estrés por calor. Los ratones se inmunizaron con solución salina o líquida, de vial conjunto líquido o de vial conjunto liofilizado ID93+GLA-SE expuestos a 4 °C o 50 °C durante un mes. Figura 13A) Los recuentos sanguíneos de linfocitos B y T se determinaron 18 horas después de la inmunización. Figura 13B) Los títulos de anticuerpos séricos específicos de ID93 se determinaron tres semanas después de la primera inmunización.
Figura 13C) La frecuencia de linfocitos T CD4 específicos de ID93 en el bazo se evaluó un mes después de la inmunización final mediante el análisis de la producción de citocinas tras la estimulación nuevamente in vitro con ID93.
La Figura 14 muestra la exposición y la enumeración de M. tuberculosis en aerosol en ratones inmunizados con ID93+GLA-SE. Un mes después de la inmunización final, los animales se expusieron a una dosis baja de M. tuberculosis en aerosol. Carga bacteriana en la Figura 14A) pulmón y la Figura 14B) bazo se determinaron tres semanas después. Los datos se muestran como media DE de N=5-7 ratones/grupo. Datos mostrados de uno de dos experimentos con resultados similares. *, **, *** y **** indican P<0,05, 0,01, 0,001 y 0,0001, respectivamente, en relación con la solución salina. n.s. no significativo en relación con la solución salina. Se indican las comparaciones estadísticas entre las muestras de 4 °C y 50 °C.
La Figura 15 muestra las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas y liofilizadas después de 30 días de estrés a 50 °C. Muestras por duplicado que se muestran para los puntos de tiempo de 0 días y 30 días.
La Figura 16 muestra las imágenes de los geles de SDS-PAGE reductora teñidos con Coomassie de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Se cargó 1 pg de ID93+SLA-SE por carril.
La Figura 17 muestra el tamaño de partículas DLS de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Figura 17A) Distribuciones de tamaño de partículas (diámetro) por intensidad. Figura 17B) Diámetro promedio Z. Figura 17C) Índice de polidispersidad (Pdl). Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 4 corridas.
La Figura 18 muestra el potencial zeta de DLS (mV) de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 4 corridas.
La Figura 19 muestra las concentraciones de SLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3 corridas.
La Figura 20 muestra la formación de la torta de las muestras ID93+GLA-SE liofilizadas por duplicado y el aspecto de la emulsión después de la reconstitución en el tiempo cero (inmediatamente después de la liofilización) y un mes después de la liofilización cuando se almacena a 4 °C, 25 °C y 37 °C. La muestra almacenada a 4 °C representa la emulsión liofilizada de control mantenida en condiciones normales de almacenamiento en la cadena de frío de 2-8 °C. La torta tiene un aspecto blanco y ligeramente encogido sin evidencia de pigmentación marrón y la emulsión reconstituida no se pone como una crema una hora o 24 horas después de la reconstitución.
La Figura 21 muestra las características de estabilidad de las formulaciones liofilizadas de ID93+GLA-SE por duplicado después de 3 meses de almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C. Figura 21A) La torta no muestra ningún signo de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución. Figura 21B) La tabla muestra el diámetro promedio Z de los experimentos DLS, el índice de polidispersidad de los experimentos DLS, el pH y la concentración de GLA de las emulsiones reconstituidas. Las barras de error representan 1 SD sobre la media de 2 viales para el pH y 2 viales x 3 diluciones x 3 corridas para las medidas de tamaño DLS y PDI. Concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3. Los datos no demuestran un aumento apreciable en el tamaño de partículas, la polidispersidad o el pH de la emulsión reconstituida después de la reconstitución de cualquiera de las temperaturas de almacenamiento. La Figura 21C) muestra las imágenes de los geles de SDS-PAGE reductora teñidos con Coomassie de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Se cargó 1 pg de ID93+SLA-SE por carril. La presencia de la banda de 98 kD no demuestra una degradación apreciable del polipéptido ID93. Figura 21D). Seguimiento por HPLC de los componentes de la emulsión escualeno y DMPC. El análisis de HPLC no demuestra una degradación apreciable a ninguna temperatura probada del componente de la emulsión DMPC o escualeno como lo demuestra la ausencia de picos adicionales o el ensanchamiento de los picos. La Figura 21E) muestra las concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3 corridas. A los tres meses, las muestras de la emulsión reconstituidas muestran poca pérdida apreciable de GLA a 4 °C y 25 °C (GLA a 51 pg/ml (102 %) en la muestra a 4 °C y 46 pg/ml (92 %) en la muestra a 25 °C). La muestra a 37 °C puede mostrar una tendencia de cierta pérdida de concentración de GLA a 42 pg/ml (84 %) a los 3 meses.
La Figura 22 muestra las características de estabilidad de las formulaciones liofilizadas de ID93+GLA-SE por duplicado después de 6 meses de almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C. La muestra almacenada a 4 °C representa la emulsión liofilizada de control mantenida en condiciones normales de almacenamiento en la cadena de frío de 2-8 °C. Figura 22A) La torta no muestra ningún signo de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución. Figura 22B) La tabla muestra el diámetro promedio Z de los experimentos DLS y el índice de polidispersidad de los experimentos DLS, el pH y la concentración de GLA de las emulsiones reconstituidas. Las barras de error representan 1 SD sobre la media de 2 viales para el pH y 2 viales x 3 diluciones x 3 corridas para las medidas de tamaño DLS y PDI. Concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3. La tabla demuestra que el pH se mantiene dentro de los intervalos fisiológicos de 7,21-7,49 para las muestras reconstituidas y almacenadas durante los seis meses. La Figura 22C) muestra las imágenes de los geles de SDS-PAGE reductora teñidos con Coomassie de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Se cargó 1 pg de ID93+GLA-SE por carril. La presencia de la banda de 98 kD no demuestra una degradación apreciable del polipéptido ID93 a los seis meses, como lo demuestra la ausencia de bandas adicionales o el ensanchamiento de la banda de 98 kD. Figura 22D).
Seguimiento por HPLC de los componentes de la emulsión escualeno y DMPC. El análisis de HPLC no demuestra una degradación apreciable a ninguna temperatura probada de estos componentes de la emulsión, como lo demuestra la ausencia de picos adicionales o el ensanchamiento de los picos. La Figura 22E) muestra las concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3 corridas. A los seis meses, las muestras a 4 °C y 25 °C no muestran una pérdida apreciable de GLA (GLA a 47 pg/ml (94 %) en la muestra a 4 °C y 42 pg/ml (84 %) en la muestra a 25 °C), pero la muestra almacenada a 37 °C muestra una pérdida de aproximadamente el 50 % de la concentración inicial de GLA, 25 pg/ml (84 %).
La Figura 23 muestra las características de estabilidad de las formulaciones liofilizadas de ID93+GLA-SE por duplicado después de 9 meses de almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C. La muestra almacenada a 4 °C representa la emulsión liofilizada de control mantenida en condiciones normales de almacenamiento en la cadena de frío de 2-8 °C. Figura 23A) La torta no muestra ningún signo de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución. Figura 23B) La tabla muestra el diámetro promedio Z de los experimentos DLS y el índice de polidispersidad de los experimentos DLS, el pH y la concentración de GLA. Las barras de error representan 1 SD sobre la media de 2 viales para el pH y 2 viales x 3 diluciones x 3 corridas para las medidas de tamaño DLS y PDI. Concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3. La tabla demuestra que el pH se mantiene dentro de los intervalos fisiológicos de 7,19-7,53 para las muestras reconstituidas y almacenadas durante nueve meses. La Figura 23C) muestra las imágenes de los geles de SDS-PAGE reductora teñidos con Coomassie de las formulaciones coliofilizadas de ID93+SLA-SE reconstituidas. Se cargó 1 pg de ID93+GLA-SE por carril. La presencia de la banda de 98 kD no demuestra una degradación apreciable del polipéptido ID93 a los nueve meses, como lo demuestra la ausencia de bandas adicionales o el ensanchamiento de la banda de 98 kD. Figura 23D). Seguimiento por HPLC de los componentes de la emulsión escualeno y DMPC. El análisis por HPLC no demuestra una degradación apreciable a ninguna temperatura probada de los componentes de la emulsión, como lo demuestra la ausencia de picos adicionales o el ensanchamiento de los picos. La Figura 23E) muestra las concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3 corridas. A los nueve meses, las muestras a 4 °C y 25 °C no muestran una pérdida apreciable de GLA (GLA a 40 pg/ml (80 %) en la muestra a 4 °C y a 40 pg/ml (80 %) en la muestra a 25 °C), pero la muestra almacenada a 37 °C muestra una pérdida de aproximadamente el 69 % (15 pg/ml) de la concentración inicial de GLA que fluye durante nueve meses de almacenamiento.
La Figura 24 muestra las características de estabilidad de las formulaciones liofilizadas de ID93+GLA-SE por duplicado después de 12 meses de almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C. La muestra almacenada a 4 °C representa la emulsión liofilizada de control mantenida en condiciones normales de almacenamiento en la cadena de frío de 2-8 °C. Figura 24A) La torta no muestra ningún signo de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución. Figura 24B) La tabla muestra el diámetro promedio Z de los experimentos DLS y el índice de polidispersidad de los experimentos DLS, el pH y la concentración de GLA. Las barras de error representan 1 SD sobre la media de 2 viales para el pH y 2 viales x 3 diluciones x 3 corridas para las medidas de tamaño DLS y PDI. Concentraciones de GLA derivadas de HPLC (pg/ml) en las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Las barras de error representan 1 desviación estándar sobre la media, n = 3. La tabla demuestra que el pH se mantiene dentro de los intervalos fisiológicos de 7,15-7,48 para las muestras reconstituidas y almacenadas durante los 12 meses. La Figura 24C) muestra las imágenes de los geles de SDS-PAGE reductora teñidos con Coomassie de las formulaciones coliofilizadas de ID93+GLA-SE reconstituidas. Se cargó 1 pg de ID93+GLA-SE por carril. La presencia de la banda de 98 kD no demuestra una degradación apreciable del polipéptido ID93 a los doce meses, como lo demuestra la ausencia de bandas adicionales o el ensanchamiento de la banda de 98 kD.
La Figura 25 muestra el efecto sobre las emulsiones liofilizadas de la adición o la eliminación de glicerol como un excipiente formador de torta, la variación en el porcentaje de aceite en la emulsión, la inclusión de Tris al 2 % como agente de tonicidad en un intervalo de las concentraciones de GLA (ng/ml) probado inmediatamente después de la liofilización (0 días) o después de 30 días almacenado a 50 °C. La Figura 25A muestra que las formulaciones de emulsión liofilizadas con concentraciones crecientes del aceite biodegradable, escualeno (2-10 % v/v) y que carecen de glicerol al 0,5 % (etiquetado como Sin glicerol) formaron tortas elegantes después de la liofilización sin encogimiento adicional del torta o la decoloración visible incluso después de 30 días a 50 °C en comparación con las formulaciones que contienen glicerol al 0,5 % v/v (etiquetado como Con glicerol). Las tortas que contienen glicerol se encogen y deprimen levemente inmediatamente después de la liofilización (tiempo 0 días y 30 días después del almacenamiento a 50 °C) con las muestras almacenadas a 50 °C que demuestran más (encogimiento) o colapso de la estructura de la torta 30 días después del almacenamiento a 50 °C. La Figura 25B y la Figura 25C) demuestran que no hay una diferencia apreciable en el tamaño de partículas (Z-Promedio nm) Figura 25B y la polidispersidad (PDI) Figura 25C para cualquiera de las formulaciones después del almacenamiento a 50 °C durante 30 días y todas las formulaciones muestran tamaños de partículas de aproximadamente 200 nm o menos después de la reconstitución de la torta. La Figura 25D) muestra que la presencia de glicerol al 0,5 % v/v afecta la estabilidad del adyuvante de GLA en la formulación de liofilización.
Las formulaciones de liofilización que contenían concentraciones variables de escualeno (2 %-10 % v/v) contenían concentraciones variables de adyuvante de GLA. La concentración en el tiempo cero se comparó con la concentración de GLA obtenida después del almacenamiento de la formulación de liofilización durante 30 días a 50 °C. Los datos muestran que las formulaciones de liofilización que no contenían glicerol (representadas como Sin glicerol) demostraron todas más del 85 % de la concentración inicial de GLA, mientras que las formulaciones de liofilización que contenían glicerol demostraron una pérdida de concentración de g La superior al 80 % después del almacenamiento a 50 °C durante un mes.
La Figura 26 muestra cuatro formulaciones de liofilización evaluadas por su capacidad para termoproteger la emulsión de GLA-SE, todas las formulaciones de liofilización evaluadas carecen de glicerol. Para la Figura 26­ 31, la concentración del adyuvante, GLA, se incrementó en la emulsión de GLA-SE a 100 ng/ml para permitir una cuantificación más reproducible de la concentración de GLA después de la reconstitución de la torta liofilizada. Las formulaciones se evaluaron para la formación y el aspecto de la torta y la formación de crema después de la reconstitución un tiempo 0 (inmediatamente después de la liofilización), una semana (1 sm), 2 semanas (2 sm), 1 mes (1 ms) y 3 meses (3 ms) después de la liofilización para las muestras almacenadas el tiempo indicado a 4 °C, 25 °C, 37 °C y 50 °C. Figura 26A) Trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), Figura 26B) Trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, Figura 26C) Trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, Figura 26D) Trehalosa al 10 % p/v. Los datos demuestran que todas las formulaciones de liofilización probadas que carecen o no tienen glicerol demostraron una formación de la torta de buena a elegante sin decoloración ni pigmentación marrón de la torta liofilizada en ninguno de los momentos (después de la liofilización, al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 1 mes, o al menos aproximadamente 3 meses) o las temperaturas probadas (al menos aproximadamente 4 °C, al menos aproximadamente 25 °C, al menos aproximadamente 37 °C y al menos aproximadamente 50 °C). Todas las tortas también mostraron poco o ningún colapso, encogimiento o decoloración y formaron emulsiones que no formaron cremas después de la reconstitución.
La Figura 27 muestra la comparación de la emulsión de GLA-SE preliofilizada antes de la adición de los componentes de liofilización (excipientes formadores de torta) como se indica debajo de cada juego de barras como trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v (etiquetado en las barras como Preliof), la emulsión de GLA-SE inmediatamente después de la adición de los componentes de liofilización (etiquetados en las barras como Lio) y después de la liofilización después de la reconstitución (etiquetados como 0, o si no están etiquetados, la tercera barra en cada conjunto de formulación de liofilización) para cada formulación de liofilización. La comparación inicial de las formulaciones de liofilización no demostró diferencias apreciables entre las formulaciones de liofilización con cada formulación y que tienen las características de emulsión reconstituida apropiadas (características deseadas) que incluyen un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm, falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad, pH fisiológico y sin pérdida apreciable de GLA (valores superiores al 90 % del contenido inicial).
La Figura 28 muestra las diversas formulaciones de liofilización de GLA-SE de un solo vial (la emulsión que contiene los excipientes formadores de torta) como se indica debajo de cada juego de barras como trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v almacenado a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (bar 3) y 50 °C (bar 4) para una formulación particular) durante una semana (1 sm). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). Figura 28A) Las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm, Figura 28B) las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan la falta deseada de agregados apreciables medidos por polidispersidad, Figura 28C) las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el pH fisiológico deseado. Figura 28D) No muestran ninguna pérdida apreciable de GLA (valores que varían entre aproximadamente 105 %-95 %) cuando se almacenan como la torta liofilizada y se reconstituyen como la emulsión de GLA-SE en comparación con la concentración original de GLA.
La Figura 29 muestra las diversas formulaciones de liofilización de GLA-SE de un solo vial (la emulsión que contiene los excipientes formadores de torta) como se indica debajo de cada juego de barras como trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v almacenado a 37 °C (barra 3) y 50 °C (barra 4) para una formulación de liofilización particular) durante dos semanas (2 sm). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). La Figura 29A) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas de 37 °C y 50 °C durante 2 semanas cuando se reconstituyen forman emulsiones de GLA-SE que presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm, la Figura 29B) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas de 37 °C y 50 °C durante 2 semanas cuando se reconstituyen forman emulsiones de GLA-SE que presentan la falta deseada de agregados apreciables medidos por polidispersidad, la Figura 29C) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas de 37 °C y 50 °C durante 2 semanas cuando se reconstituyen forman emulsiones de GLA-SE que presentan el pH fisiológico deseado de aproximadamente pH 7,0. Figura 29D) todas las formulaciones de liofilización para GLA-SE no muestran una pérdida apreciable de GLA (valores que varían entre aproximadamente 105 %-95 %) de la concentración original de GLA cuando se almacenan como torta liofilizada a 37 °C o 50 °C durante 2 semanas y se reconstituyen para formar la emulsión de GLA-SE.
La Figura 30 muestra las diversas formulaciones de liofilización de GLA-SE de un solo vial (la emulsión que contiene los excipientes formadores de torta) como se indica debajo de cada juego de barras como trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v almacenado a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (bar 3) y 50 °C ((bar 4) para una formulación particular) durante un mes (1 ms). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). La Figura 30A) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm, la Figura 30B) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan la falta deseada de agregados apreciables medidos por polidispersidad, y la Figura 30C) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el pH fisiológico deseado. Figura 30D) Todas las formulaciones de liofilización para GLA-SE no muestran una pérdida apreciable de GLA (valores que varían de aproximadamente 105 %-94 %) de la concentración original de GLA cuando se almacenan como torta liofilizada a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C para un mes y se reconstituyen para formar la emulsión de GLA-SE.
La Figura 31 muestra las diversas formulaciones de liofilización de GLA-SE de un solo vial (la emulsión que contiene los excipientes formadores de torta) como se indica debajo de cada juego de barras como trehalosa al 5 % sola (sin glicerol), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v, trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v almacenado a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (bar 3) y 50 °C (bar 4) para una formulación de liofilización particular) durante un mes (1 ms). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml), la Figura 31A) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm, la Figura 31B) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan la falta deseada de agregados apreciables medidos por polidispersidad, y la Figura 31C) demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el pH fisiológico deseado de al menos aproximadamente pH 7,0.
Descripción detallada
En un aspecto, la descripción describe las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables que comprenden (1) un aceite metabolizable y (2) un excipiente formador de torta. Las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables incluyen además opcionalmente un antígeno y/o un adyuvante. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en lactosa, rafinosa y lactulosa. En algunas modalidades, la composición se forma mediante la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua y la formulación de aceite en agua antes de la liofilización o tras la reconstitución contiene menos de o aproximadamente 1 % (p/v) de glicerol, menos de o aproximadamente 0,5 % (p/v) de glicerol o sin glicerol. En algunas modalidades, la composición está en la forma de una torta y forma una emulsión de aceite en agua tras la reconstitución. En algunas modalidades, la composición se almacena en un solo vial.
Como apreciará un experto en la técnica, los términos la composición de vacuna liofilizada termoestable, la composición de vacuna liofilizada, la torta termoestable liofilizada y la torta liofilizada se usan indistintamente en la presente descripción. Este término generalmente se refiere a una emulsión estable de aceite en agua liofilizada que comprende un aceite biodegradable o aceite metabolizable y/o uno o más antígenos y/o uno o más adyuvantes así como también excipientes formadores de torta usados para producir la torta. Tras la reconstitución de la composición de vacuna liofilizada termoestable, se forma una emulsión de aceite en agua líquida que posee las características deseadas: un tamaño de partículas promedio de menos de o aproximadamente 200 nm, un pH fisiológico de aproximadamente 7,4 y sin la pérdida de la concentración de cada ingrediente activo (como el antígeno o el adyuvante) a aproximadamente el 25 % o más de la concentración de cada ingrediente activo en la formulación de aceite en agua inicial antes de la liofilización, o cualquier degradación o alteración significativa de cada ingrediente activo (por ejemplo, el antígeno, el adyuvante) que es adecuado para inducir o estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Como se proporciona en la presente descripción, la composición de vacuna liofilizada es termoestable. Por ejemplo, la composición es estable entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C. Dichas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes (portadores) farmacéuticamente aceptables que incluyen amortiguadores, ácidos, bases, azúcares, diluyentes, conservantes y similares, que se conocen bien en la técnica y se describen en la presente descripción. En otro aspecto más, la descripción describe los métodos para generar una composición de vacuna liofilizada termoestable descrita en la presente descripción.
En algunos aspectos, la descripción describe los métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprenden reconstituir una composición de vacuna liofilizada termoestable descrita en la presente descripción en una emulsión y administrar la emulsión al sujeto. En algunas modalidades, la emulsión es una emulsión de aceite en agua. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria inespecífica. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un método descrito en la presente descripción para estimular una respuesta inmunitaria, o una composición de vacuna liofilizada termoestable reconstituida descrita en la presente descripción, puede usarse solo o en combinación con otros métodos convencionales de tratamiento (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos).
En algunas modalidades, la referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente descripción incluye (y describe) las variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Definiciones
Se entiende que los aspectos y las modalidades descritos en la presente descripción incluyen "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente en" de los aspectos y las modalidades
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, con mayor preferencia un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros, caballos), primates, ratones y ratas.
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El excipiente formador de torta y el agente espesante formador de torta se usan en la presente descripción de manera intercambiable. Un excipiente formador de torta se refiere a una sustancia añadida a una formulación de emulsión de aceite en agua líquida estable antes de la liofilización que produce una torta después de la liofilización. Tras la reconstitución de la torta liofilizada, se forma una emulsión estable, que es adecuada para la administración de un fármaco farmacológicamente activo que incluye las vacunas de la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, los excipientes formadores de torta son aquellas sustancias que no afectan una emulsión tras la reconstitución de la torta liofilizada.
Los excipientes, como se usan en la presente descripción, se refieren a sustancias distintas de los fármacos farmacológicamente activos, que se incluyen en el proceso de fabricación o en el proceso de llenado y acabado para el almacenamiento o el envío del fármaco farmacológicamente activo, que incluye, sin limitación, la liofilización, y están contenidos en un proceso farmacéutico terminado.
Los excipientes de liofilización, como se usan en la presente descripción, pueden referirse a sustancias distintas del fármaco farmacológicamente activo que se incluyen en el proceso de liofilización para contribuir a la forma o la formulación de una estructura de torta adecuada. Los excipientes de liofilización pueden incluir agentes espesantes, agentes amortiguadores o agentes solubilizantes.
Técnicas generales
La práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, ADN recombinante, bioquímica y química, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2da Ed., Sambrook y otros, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y otros, la patente de Estados Unidos núm. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); y en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
Características de las composiciones de vacunas liofilizadas
En la presente descripción se describen las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables que comprenden un antígeno y/o un adyuvante. La presente descripción describe que las formulaciones de emulsión de aceite en agua pueden liofilizarse y almacenarse, mantenerse o exponerse a temperaturas entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 60 °C, que cuando se reconstituyen, forman emulsiones que pueden tener una o más de las siguientes características: (1) que no demuestran la formación de crema, (2) mantienen un pH deseable alrededor de 7,4 fisiológico, (3) mantienen una partícula con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm, con poca o ninguna agregación, (4) no exhiben pérdida de concentración del ingrediente activo de aproximadamente el 25 % o más de la formulación de emulsión de aceite en agua inicial antes de la liofilización, o cualquier degradación o alteración significativa de cada ingrediente activo (por ejemplo, el antígeno, el adyuvante), y (5) son adecuadas para inducir o estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Estas formulaciones liofilizadas comprenden excipientes formadores de torta que incluyen (a) una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa; (b) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa; o (c) un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en lactosa, rafinosa y lactulosa. Estas formulaciones termoestables son una mejora con respecto a la técnica y pueden reducir significativamente la pérdida de más del 50 % de las formulaciones de vacunas anualmente debido a las fallas en el mantenimiento del almacenamiento de la cadena de frío en gran parte del mundo desarrollado. El almacenamiento en la cadena de frío está descrito por los Centros para el Control de Enfermedades, CDC, y la Agencia Federal de Medicamentos de Estados Unidos (UAFDA) en http://www.vac-storagecdcpDF.pdf. Además, en muchas regiones del mundo en desarrollo, se producen temperaturas ambientales superiores a 25 °C, por lo que las formulaciones de vacunas termoestables descritas en la presente descripción pueden almacenarse, exponerse o mantenerse a temperaturas superiores a la temperatura ambiente de 25 °C.
En un aspecto, las características de termoestabilidad deseadas de la composición de vacuna liofilizada termoestable es que la composición liofilizada debe poseer determinadas características deseables que incluyen: estabilidad a largo plazo; tiempo de reconstitución corto; mantenimiento del aspecto de la torta después del almacenamiento equivalente al aspecto de la torta inmediatamente después de la liofilización; mantenimiento de las características de la forma de dosificación original tras la reconstitución, que incluyen las propiedades de la solución, la estructura o la conformación de las proteínas; y el tamaño de partículas y la distribución de partículas. (Frank Kofi Bedu-Addo en Understanding Lyophilization Development. Pharmaceutical Technology). Las características adicionales deseadas de una composición de vacuna liofilizada termoestable pueden incluir una o más de las siguientes características que incluyen: estabilidad a largo plazo a temperaturas superiores a 8 °C típicas de los productos de almacenamiento en la cadena de frío; tiempo de reconstitución corto; mantenimiento del aspecto de la torta sustancialmente similar después del almacenamiento, exposición o mantenimiento a aproximadamente 8 °C o por encima del aspecto de la torta inmediatamente después de la liofilización; mantenimiento de las características de la forma de dosificación original (más o menos el 25 % de la concentración o función original) de los ingredientes activos de la vacuna (los ingredientes activos incluyen, pero no se limitan a, la concentración del antígeno o la conformación y la concentración de adyuvantes) y que tras la reconstitución mantiene las propiedades de la solución, la estructura o la conformación de las proteínas si se incluyen; y tamaño de partículas y distribución de partículas no superior al menos o aproximadamente un tamaño de partículas promedio de 200 nm.
En una modalidad, una torta termoestable como se usa en la presente descripción se refiere a una torta producida a partir de la liofilización de un solo vial de una emulsión estable de aceite en agua (SE) descrita en la presente descripción, que puede comprender ingredientes activos adicionales descritos en la presente descripción que incluyen los antígenos y/o los adyuvantes en presencia de los excipientes formadores de torta adecuados descritos en la presente descripción, que cuando se almacena o se expone al almacenamiento o el transporte a temperaturas superiores a la temperatura típica de almacenamiento en la cadena de frío de 2-8 °C demuestran las características deseables de una emulsión de aceite en agua de vacuna.
En una modalidad, una vacuna termoestable como se usa en la presente descripción se refiere a una composición de vacuna que se produce a partir de la reconstitución de una torta termoestable/composición de vacuna liofilizada termoestable descrita en la presente descripción. Además, como se usa en la presente descripción, una vacuna termoestable también puede referirse a la composición de torta/liofilizada termoestable que se va a reconstituir en la vacuna termoestable.
Evaluación de la termoestabilidad
La termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción puede evaluarse en el estado liofilizado, antes de la reconstitución o después de la reconstitución. La termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción puede evaluarse mediante la observación visual y/o con la ayuda de uno o más ensayos proporcionados en la presente descripción. Estos ensayos pueden proporcionar una estimación de la integridad de la emulsión, el antígeno y/o el adyuvante después de la liofilización y la reconstitución.
Los ensayos de termoestabilidad y las observaciones descritas en la presente descripción pueden llevarse a cabo tras la liofilización, 1 hora después de la liofilización, 6 horas después de la liofilización, 12 horas después de la liofilización, 24 horas después de la liofilización, 36 horas después de la liofilización, 48 horas después de la liofilización, 1 semana después de la liofilización, 2 semanas después de la liofilización, 1 mes después de la liofilización, 2 meses después de la liofilización, 3 meses después de la liofilización, 4 meses después de la liofilización, 6 meses después de la liofilización, 12 meses después de la liofilización o más. Antes de realizar los ensayos y las observaciones, la composición liofilizada puede mantenerse, almacenarse o exponerse a temperaturas de aproximadamente 8 °C o más, por ejemplo, aproximadamente 25 °C o más, aproximadamente 37 °C o más, aproximadamente 50 °C o más, o aproximadamente 60 °C.
Los ensayos de termoestabilidad y las observaciones descritas en la presente descripción pueden llevarse a cabo tras la reconstitución de la composición liofilizada, inmediatamente después de la reconstitución, 1 hora después de la reconstitución, 6 horas después de la reconstitución, 12 horas después de la reconstitución, 24 horas después de la reconstitución, 36 horas después de la reconstitución, 48 horas después de la reconstitución o 1 semana después de la reconstitución. Antes de la reconstitución, y de llevar a cabo los ensayos y las observaciones, la composición liofilizada puede mantenerse, almacenarse o exponerse a temperaturas de aproximadamente 8 °C o más, por ejemplo, aproximadamente 25 °C o más, aproximadamente 37 °C o más, aproximadamente 50 °C o más, o aproximadamente 60 °C.
Un experto en la técnica entendería que la presente descripción está diseñada para proporcionar las composiciones de vacunas liofilizadas que pueden almacenarse o enviarse a temperaturas que se acercan más a la temperatura ambiente en el mundo desarrollado o en desarrollo, por lo que en algunas modalidades la composición liofilizada se mantiene, se almacena o se expone a más de una temperatura o una combinación de temperaturas de aproximadamente 8 °C o más, por ejemplo, aproximadamente 25 °C o más, aproximadamente 37 °C o más, aproximadamente 50 °C o más, o aproximadamente 60 °C.
En algunas modalidades, la termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción se evalúa mediante la observación visual antes de la reconstitución. En otras modalidades, la termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción se evalúa después de la reconstitución con la ayuda de uno o más ensayos, por ejemplo, los ensayos biofísicos y bioquímicos. En algunas modalidades, la termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción se evalúa mediante la observación visual después de la reconstitución. En otras modalidades, la termoestabilidad de las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción se evalúa después de la reconstitución con la ayuda de uno o más ensayos, por ejemplo, los ensayos biofísicos y bioquímicos. En una modalidad, puede observarse el color y la consistencia de la torta liofilizada resultante de la liofilización de la formulación de emulsión de aceite en agua. En algunas modalidades, la torta a la que se hace referencia en la presente descripción es un material similar a una estructura porosa y esponjosa resultante del proceso de liofilización; o la torta es el contenido sólido que queda después del proceso de liofilización. En algunas modalidades, el aspecto de la torta puede describirse como una torta espongiforme, una torta agradable y una torta elegante. En algunas modalidades, una torta puede inspeccionarse visualmente por falta de agrietamiento, colapso (también puede describirse como encogimiento o que tira de los lados del vial, depresión o leve hendidura de la parte superior de la torta, o una disminución en el volumen total de la torta), y/o un cambio de coloración o decoloración o pigmentación marrón de la torta. En algunas modalidades, la torta puede clasificarse como una torta elegante, una torta blanca, una torta blanca elegante, una torta blanca espongiforme, una torta blanca con mayor volumen, una torta marrón, una torta con pigmentación marrón o una torta contraída/encogida. En algunas modalidades, la decoloración o la pigmentación marrón, como se usa en la presente descripción, se refiere a una formulación que contiene azúcares reductores (por ejemplo, lactosa y maltosa) que tras la liofilización y el almacenamiento de la torta a una temperatura de 8 °C o superior, por ejemplo, a 25 °C, 37 °C y/o 60 °C puede sufrir una reacción de Maillard o una reducción de los azúcares que da como resultado una decoloración de la torta original que da como resultado visualmente un tinte de amarillo a marrón a la torta. En algunas modalidades, si no se forma la torta después de la liofilización, la composición resultante puede caracterizarse como una película transparente, una película fina, una película blanca espesa o burbujas solidificadas. En algunas modalidades, las tortas deseadas descritas en la presente descripción se refieren a las tortas que después de la exposición, el almacenamiento o el mantenimiento de la torta a las temperaturas descritas anteriormente, el almacenamiento típico en la cadena de frío de 2-8 °C, o superior o aproximadamente a 8 °C muestra las características deseadas de una formulación de vacuna liofilizada. ("Excipients used in lyophilization of small molecules" Ankit Bahetia, Lokesh Kumarb, Arvind K. Bansal, J. Excipients and Food Chem. 1 (1) 2010; 41-54.)
En algunas modalidades, se mide la temperatura de fusión (Tm) de la torta resultante de la liofilización.
En algunas modalidades, el tamaño de partículas de la emulsión se evalúa después de la reconstitución de la composición liofilizada. Por ejemplo, la dispersión dinámica de la luz (DLS) puede usarse para evaluar el tamaño de partículas de la emulsión. En algunas modalidades, esto se compara con el tamaño de partículas de la emulsión antes de la liofilización, por ejemplo en el estado de la emulsión estable líquida antes de la liofilización. En algunas modalidades, el tamaño de partículas de la emulsión no se compara con el tamaño de partículas antes de la liofilización. En algunas modalidades en la presente descripción, el tamaño de partículas se determina por la medición del diámetro promedio Z (Z-Prom) de la composición liofilizada líquida. En modalidades particulares, se indica una composición termoestable cuando la emulsión líquida reconstituida de la composición liofilizada mantenida, almacenada o expuesta a una temperatura de aproximadamente 8 °C o más tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm, menos de aproximadamente 190 nm, menos de aproximadamente 180 nm, menos de aproximadamente 170 nm, menos de aproximadamente 160 nm, menos de aproximadamente 150 nm, menos de aproximadamente 140 nm, menos de aproximadamente 130 nm, menos de aproximadamente 120 nm, menos de aproximadamente 110 nm, menos de aproximadamente 100 nm, o menos de aproximadamente 90 nm, menos de aproximadamente 80 nm, menos de aproximadamente 70 nm o menos de aproximadamente 60 nm. En modalidades particulares, la emulsión reconstituida tiene un tamaño de partículas con un intervalo de diámetro promedio Z de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades, el índice de polidispersidad (Pdl) se evalúa después de la reconstitución de la composición liofilizada. Por ejemplo, la dispersión dinámica de la luz (DLS) puede usarse para evaluar el PdI. En algunas modalidades, esto se compara con el PDI de la emulsión líquida antes de la liofilización, por ejemplo en el estado de la emulsión estable líquida antes de la liofilización.
En una modalidad, el potencial zeta se evalúa después de la reconstitución de la composición liofilizada. Por ejemplo, la dispersión dinámica de la luz (DLS) puede usarse para evaluar el potencial zeta. En algunas modalidades, esto se compara con el potencial zeta antes de la liofilización, por ejemplo en el estado de la emulsión estable líquida antes de la liofilización.
En algunas modalidades, el pH de la emulsión se evalúa después de la reconstitución de la composición liofilizada. En algunas modalidades, esto se compara con el pH antes de la liofilización, por ejemplo en el estado de la emulsión estable líquida antes de la liofilización.
En algunas modalidades, se evalúa la formación de crema de la emulsión después de la reconstitución de la composición liofilizada.
En algunas modalidades, se evalúa el % de deterioro o el % de degradación del antígeno, el adyuvante y/u otros componentes de la composición liofilizada, tras la reconstitución de la composición liofilizada. En algunas modalidades, se usa la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para evaluar la degradación química, si la hay, de los componentes. En una modalidad ilustrativa, la degradación química de escualeno, DMPC y GLA se controla mediante RP-HPLC. En otras modalidades, la tinción de geles con Coomassie se usa para evaluar la degradación del antígeno proteico de la vacuna, si existe, de la composición liofilizada, tras la reconstitución. Una composición termoestable como se proporciona en la presente descripción es una que no exhibe más de o aproximadamente 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de la degradación del antígeno y/o el adyuvante, u otro componente, la pérdida o la descomposición después de la reconstitución de la composición liofilizada termoestable que se mantuvo a una temperatura de aproximadamente 8 °C o más.
Características de la termoestabilidad
En un aspecto, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más. En algunas modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 9 °C o más, a aproximadamente 10 °C o más, a aproximadamente 11 °C o más, a aproximadamente 12 °C o más, a aproximadamente 13 °C o más, a aproximadamente 14 °C o más, a aproximadamente 15 °C o más, a aproximadamente 16 °C o más, a aproximadamente 17 °C o más, a aproximadamente 18 °C o más, a aproximadamente 19 °C o más, a aproximadamente 20 °C o más, a aproximadamente 25 °C o más, a aproximadamente 30 °C o más, a aproximadamente 32 °C o más, a aproximadamente 35 °C o más, a aproximadamente 37 °C o más, a aproximadamente 40 °C o más, a aproximadamente 42 °C o más, a aproximadamente 45 °C o más, a aproximadamente 50 °C o más, y a aproximadamente 60 °C o más. En otras modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables de aproximadamente 8 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 8 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 8 °C a aproximadamente 50 °C, o de aproximadamente 8 °C a aproximadamente 60 °C. En una modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a 25 °C o aproximadamente. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a 37 °C o aproximadamente. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a 50 °C o aproximadamente. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 60 °C.
En algunas modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más durante al menos 1 hora, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, al menos 1,5 años, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años y al menos 5 años. En una modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más durante al menos tres meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más durante al menos seis meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más durante al menos doce meses. En una modalidad, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 8 °C o más indefinidamente.
En algunas modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 25 °C o más durante al menos 1 hora, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, al menos 1,5 años, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años y al menos 5 años. En una modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 25 °C durante al menos un mes. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 25 °C durante al menos tres meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 25 °C durante al menos seis meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 25 °C durante al menos doce meses. En una modalidad, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 25 °C indefinidamente.
En algunas modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 37 °C o más durante al menos 1 hora, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, al menos 1,5 años, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años y al menos 5 años. En una modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 37 °C durante al menos un mes. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 37 °C durante al menos tres meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 37 °C durante al menos seis meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 37 °C durante al menos doce meses. En una modalidad, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 37 °C indefinidamente.
En algunas modalidades, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a aproximadamente 50 °C o más durante al menos 1 hora, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, al menos 1,5 años, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años y al menos 5 años. En una modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 50 °C durante al menos un mes. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 50 °C durante al menos tres meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 50 °C durante al menos seis meses. En otra modalidad ilustrativa, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 50 °C durante al menos doce meses. En una modalidad, las composiciones de vacunas liofilizadas descritas en la presente descripción son termoestables a más de 50 °C indefinidamente.
Excipientes y agentes para su uso en composiciones de vacunas termoestables
En la presente descripción se describen las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables que comprenden un antígeno y/o un adyuvante. En algunas modalidades, las composiciones comprenden agentes y/o excipientes adicionales, tales como excipientes formadores de torta, agentes espesantes formadores de torta, agentes amortiguadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, tensioactivos y/o emulsionantes.
Excipientes
Los excipientes descritos en la presente descripción pueden usarse solos o en combinación con otros excipientes que incluyen, pero no se limitan a, excipientes formadores de torta, agentes espesantes formadores de torta, agentes espesantes, agentes amortiguadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes tonificantes, tensioactivos, emulsionantes, agentes antimicrobianos y/o modificadores de la temperatura de colapso.
En algunas modalidades, los excipientes son sustancias distintas del fármaco farmacológicamente activo, que se incluyen en el proceso de fabricación o en el proceso de llenado y acabado para el almacenamiento o el envío del fármaco farmacológicamente activo que incluye, sin limitación, la liofilización, y están contenidos en un proceso farmacéutico terminado.
En algunas modalidades, un excipiente es una sustancia añadida a una formulación de emulsión de aceite en agua líquida estable antes de la liofilización que produce una torta después de la liofilización.
Los excipientes adecuados para las formulaciones de vacunas y/o la liofilización se conocen en la técnica (Ver, por ejemplo Bahetia y otros, 2010: J. Excipients and Food Chem.: 1 (1)41-54, Grabenstein JD. ImmunoFacts: Vaccines and Immunologic Drugs - 2012 (37a revisión). St Louis, MO: Wolters Kluwer Health, 2011 y, por Vaccine) e incluyen excipientes formadores de torta, agentes espesantes formadores de torta, agentes espesantes, agentes amortiguadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes tonificantes, tensioactivos, emulsionantes, agentes antimicrobianos y/o modificadores de la temperatura de colapso. Puede encontrarse una lista de excipientes en las vacunas aprobadas actualmente a través de los Centros para el Control de Enfermedades (consulte la web mundial en cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/B/excipient-table-2.pdf., septiembre de 2013, "Vaccine Excipient & Media Summary. Excipients Included in U.S. Vaccines, por Vaccine") e incluyen, sin limitación, sacarosa, D-manosa, D-fructosa, dextrosa, fosfato de potasio, plasdona C, lactosa anhidra, celulosa microcristalina, polacrilina potásica, estearato de magnesio, acetato ftalato de celulosa, alcohol, acetona, aceite de ricino, tinte de laca de aluminio amarillo FD&C # 6, albúmina de suero humano, suero fetal bovino, bicarbonato de sodio, cultivos de células de fibroblastos diploides humanos (WI-38), medio de Eagle modificado por Dulbecco, hidróxido de aluminio, cloruro de bencetonio, formaldehído, glutaraldehído, aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, azúcares, glicerina, asparagina, ácido cítrico, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, citrato de amonio y hierro, lactosa, sulfato de aluminio y potasio, hidroxifosfato de aluminio, sulfato de aluminio y potasio, peptona, extracto bovino, timerosal (trazas), medio Mueller y Miller modificado, beta-propiolactona, timerosol (solo viales multidosis), fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, glutamato de potasio, cloruro de calcio, taurodesoxicolato de sodio, sulfato de neomicina, polimixina B, proteína de huevo, hidrolizado de lactoalbúmina y sulfato de neomicina.
Excipientes formadores de torta/Agentes espesantes formadores de torta
En algunas modalidades, un excipiente formador de torta es una sustancia añadida a una formulación de emulsión de aceite en agua líquida estable antes de la liofilización que produce una torta después de la liofilización. Tras la reconstitución de la torta liofilizada, se forma una emulsión de aceite en agua estable que es adecuada para la administración de un fármaco farmacológicamente activo que incluye las vacunas de la presente descripción.
En algunas modalidades, los excipientes formadores de torta son aquellas sustancias que no afectan una emulsión tras la reconstitución de la torta.
En algunas modalidades, los agentes útiles como los excipientes formadores de torta, también denominados agentes espesantes, para la presente descripción incluyen azúcares/sacáridos o azúcares/sacáridos en combinación con alcoholes de azúcar. En algunas modalidades descritas en la presente descripción, los azúcares/sacáridos o azúcares/sacáridos en combinación con alcoholes de azúcar son útiles como agentes espesantes o excipientes formadores de torta. Estos incluyen, pero no se limitan a, trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, estaquiosa, fructosa, lactulosa, glucosa y opcionalmente glicerol, sorbitol y/o manitol.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, estaquiosa, fructosa y lactulosa.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es una combinación de sorbitol y un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, estaquiosa, fructosa y lactulosa.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, lactosa, rafinosa y lactulosa.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido que se selecciona del grupo que consiste en lactosa, rafinosa y lactulosa.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido o un sacárido en combinación con un alcohol de azúcar sin la presencia de glicerol. En otras modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido o un sacárido en combinación con un alcohol de azúcar en presencia de menos de aproximadamente 1 % p/v de glicerol, menos de aproximadamente 0,5 % de glicerol o menos de aproximadamente 0,1 % de glicerol.
En algunas modalidades, el excipiente formador de torta es un sacárido y el sacárido está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, o en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución a una concentración de aproximadamente 5 % p/v. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v o aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades, el excipiente formador de torta se proporciona en presencia de menos de aproximadamente 1 % p/v de glicerol, menos de aproximadamente 0,5 % de glicerol, menos de aproximadamente 0,1 % de glicerol, o se proporciona sin glicerol presente (el % de glicerol se refiere a la concentración de glicerol en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización).
En algunas modalidades ilustrativas, el excipiente formador de torta es trehalosa y la trehalosa está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, o en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v. En algunas modalidades, la trehalosa está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución a una concentración de aproximadamente 5 % p/v. En algunas modalidades, la trehalosa está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v o aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades en las que el excipiente formador de torta es trehalosa, la trehalosa se proporciona en presencia de menos de aproximadamente 1 % p/v de glicerol, menos de aproximadamente 0,5 % de glicerol, menos de aproximadamente 0,1 % de glicerol o se proporciona sin glicerol presente (el % de glicerol se refiere a la concentración de glicerol en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización).
En algunas modalidades ilustrativas, el excipiente formador de torta es un sacárido en combinación con un alcohol de azúcar. En tales modalidades, el sacárido está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v, y el alcohol de azúcar está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades, el sacárido está presente en combinación con un alcohol de azúcar y el sacárido está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, o aproximadamente 5 % p/v y el alcohol de azúcar está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 0,1 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 0,05 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 0,1 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v o a aproximadamente 0,1 % p/v. En algunas modalidades, el sacárido está presente en combinación con un alcohol de azúcar donde el sacárido está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v, o aproximadamente 20 % p/v, y el alcohol de azúcar está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v o aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades, el sacárido en combinación con un alcohol de azúcar se proporciona en presencia de menos de aproximadamente 1 % p/v de glicerol, menos de aproximadamente 0,5 % de glicerol, menos de aproximadamente 0,1 % de glicerol o se proporciona sin glicerol presente (el % de glicerol se refiere a la concentración de glicerol en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización).
En algunas modalidades ilustrativas, el excipiente formador de torta es trehalosa en combinación con manitol. En tales modalidades, la trehalosa en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v, y el manitol está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades, la trehalosa está presente en combinación con manitol, y la trehalosa está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,5 % en p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 2,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, o aproximadamente 5 % p/v y el manitol está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 0,1 % p/v, de aproximadamente 0,01 % p/v a aproximadamente 0,05 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,05 % p/v a aproximadamente 0,1 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,1 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v, de aproximadamente 0,5 % p/v a aproximadamente 1 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 10 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 7,5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 5 % p/v, de aproximadamente 1 % p/v a aproximadamente 2,5 % p/v o aproximadamente 0,1 % p/v. En algunas modalidades, la trehalosa está presente en combinación con manitol donde la trehalosa está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución a una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v o aproximadamente 20 % p/v, y el manitol está presente en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución a una concentración de aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v, aproximadamente 10 % p/v, aproximadamente 11 % p/v, aproximadamente 12 % p/v, aproximadamente 13 % p/v, aproximadamente 14 % p/v, aproximadamente 15 % p/v, aproximadamente 16 % p/v, aproximadamente 17 % p/v, aproximadamente 18 % p/v, aproximadamente 19 % p/v o aproximadamente 20 % p/v. En algunas modalidades, la trehalosa en combinación con el manitol se proporciona en presencia de menos de aproximadamente 1 % p/v de glicerol, menos de aproximadamente 0,5 % de glicerol, menos de aproximadamente 0,1 % de glicerol, o se proporciona sin glicerol presente (el % de glicerol se refiere a la concentración de glicerol en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización).
En otras modalidades, los agentes útiles como excipientes formadores de torta, para la presente descripción, incluyen cualquier aminoácido. Los aminoácidos ilustrativos útiles como agentes espesantes en la presente descripción incluyen arginina, glicina, prolina, ácido glutámico, metionina, cisteína, prolina e histidina solas o en combinación, ya sea como moléculas puras o formuladas.
En otras modalidades, los agentes espesantes incluyen polímeros tales como dextrano y polietilenglicol.
Agentes amortiguadores
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un agente amortiguador. Los agentes amortiguadores útiles como excipientes incluyen acetato de Tris, base de Tris, Tris HCl, fosfato de amonio, ácido cítrico, citrato de sodio, citrato de potasio, ácido tartico, fosfato de sodio, cloruro de zinc, arginina e histidina. En algunas modalidades, los agentes amortiguadores incluyen agentes de ajuste del pH tales como ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y meglumina.
Agentes solubilizantes
En algunas modalidades, los agentes solubilizantes adecuados incluyen excipientes formadores de complejos, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), alfa ciclodextrina, hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD). También pueden incluirse tensioactivos como excipientes solubilizantes que incluyen polisorbato 80 y Tween. Pueden usarse otros codisolventes conocidos en la técnica como agentes solubilizantes e incluyen alcohol terc-butílico, alcohol isopropílico, diclorometano, etanol y acetona.
Los agentes tonificantes para su uso como excipientes en la presente descripción incluyen glicerol, cloruro de sodio, sacarosa, manitol y dextrosa. Los modificadores de la temperatura de colapso incluyen dextrano, almidón de hidroxietilo, ficol y gelatina. Los agentes antimicrobianos incluyen alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metil parabeno, etil parabenos, timerosol.
Agentes de isotonicidad
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un agente de isotonicidad. En algunas modalidades, el agente de isotonicidad es glicerol. En una modalidad particular, el agente de isotonicidad está presente a una concentración de aproximadamente 0,36 % v/v en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
Tensioactivos
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un tensioactivo. En algunas modalidades, el tensioactivo es pluronic F68. En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en una relación de aproximadamente 100:1 (aceite:tensioactivo). En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente 0,018 % p/v. En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente 0,0001 % p/v, aproximadamente 0,0005 % p/v, aproximadamente 0,001 % p/v, aproximadamente 0,005 % p/v, aproximadamente 0,01 % p/v, aproximadamente 0,011 % p/v, aproximadamente 0,012 % p/v, aproximadamente 0,013 % p/v, aproximadamente 0,014 % p/v, aproximadamente 0,015 % p/v, aproximadamente 0,016 % p/v, aproximadamente 0,017 % p/v, aproximadamente 0,018 % p/v, aproximadamente 0,019 % p/v, aproximadamente 0,02 % p/v, aproximadamente 0,03 % p/v, aproximadamente 0,04 % p/v, aproximadamente 0,05 % p/v, aproximadamente 0,06 % p/v, aproximadamente 0,07 % p/v, aproximadamente 0,08 % p/v, aproximadamente 0,09 % p/v, aproximadamente 0,1 % p/v, aproximadamente 0,2 % p/v, aproximadamente 0,3 % p/v, aproximadamente 0,4 % p/v, aproximadamente 0,5 % p/v, aproximadamente 0,6 % p/v, aproximadamente 0,7 % p/v, aproximadamente 0,8 % p/v, aproximadamente 0,9 % p/v o aproximadamente 1 % p/v. Los porcentajes y las relaciones descritas en la presente descripción se refieren a las relaciones y los porcentajes en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
Emulsionantes
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un emulsionante. En algunas modalidades, el emulsionante es 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC). En algunas modalidades, el emulsionante es lecitina. En algunas modalidades, el emulsionante está presente en una relación de aproximadamente 1:5 (emulsionante:aceite). En algunas modalidades, el emulsionante está presente en una concentración de aproximadamente 0,38 % p/v. En algunas modalidades, el emulsionante está presente en una concentración de aproximadamente 0,002 % p/v, aproximadamente 0,005 % p/v, aproximadamente 0,010 % p/v, aproximadamente 0,015 % p/v, aproximadamente 0,020 % p/v, aproximadamente 0,025 % p/v, aproximadamente 0,030 % p/v, aproximadamente 0,035 % p/v, aproximadamente 0,040 % p/v, aproximadamente 0,045 % p/v, aproximadamente 0,050 % p/v, aproximadamente 0,055 % p/v, aproximadamente 0,060 % p/v, aproximadamente 0,065 % p/v, aproximadamente 0,070 % p/v, aproximadamente 0,075 % p/v, aproximadamente 0,080 % p/v, aproximadamente 0,085 % p/v, aproximadamente 0,090 % p/v, aproximadamente 0,095 % p/v, aproximadamente 0,10 % p/v, aproximadamente 0,15 % p/v, aproximadamente 0,20 % p/v, aproximadamente 0,25 % p/v, aproximadamente 0,30 % p/v, aproximadamente 0,35 % p/v, aproximadamente 0,40 % p/v, aproximadamente 0,45 % p/v, aproximadamente 0,50 % p/v, aproximadamente 0,55 % p/v, aproximadamente 0,60 % p/v, aproximadamente 0,65 % p/v, aproximadamente 0,70 % p/v, aproximadamente 0,75 % p/v, aproximadamente 0,80 % p/v, aproximadamente 0,85 % p/v, aproximadamente 0,90 % p/v, aproximadamente 0,95 % p/v, aproximadamente 1 % p/v, aproximadamente 2 % p/v, aproximadamente 3 % p/v, aproximadamente 4 % p/v, aproximadamente 5 % p/v, aproximadamente 6 % p/v, aproximadamente 7 % p/v, aproximadamente 7,5 % p/v, aproximadamente 8 % p/v, aproximadamente 9 % p/v o aproximadamente 10 % p/v. Los porcentajes y las relaciones descritas en la presente descripción se refieren a las relaciones y los porcentajes en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
Adyuvantes para su uso en composiciones de vacunas liofilizadas termoestables
En algunos aspectos de la descripción descritos en la presente descripción, una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, vacuna liofilizada termoestable) comprende un adyuvante. En algunas modalidades, el adyuvante se proporciona solo, por ejemplo, para uso en un agente terapéutico. En otras modalidades, el adyuvante se proporciona en combinación con un antígeno. Los adyuvantes para su uso en las composiciones que modifican la respuesta inmunitaria se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los adyuvantes para su uso en las composiciones descritas en la presente descripción pueden comprender uno o más de un adyuvante inmunoestimulador, un adyuvante de administración, un adyuvante inorgánico o un adyuvante orgánico. Pueden encontrarse ejemplos no limitantes de adyuvantes para su uso en las composiciones descritas en la presente descripción, entre otros, en Barouch D.H., 2008, Nature, 455(7213):613-9; Morrow y otros, 2008, AIDS, 22(3):333-8; y McGeary y otros, 2003, Peptide Sci., 9(7):405-181.
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, una vacuna liofilizada termoestable) es un adyuvante inmunoestimulador. Los adyuvantes inmunoestimuladores pueden ser adyuvantes que actúan directamente sobre el sistema inmunológico como, por ejemplo, una citocina, un ligando TLR o una toxina microbiana. En algunas modalidades en la presente descripción, el adyuvante es un adyuvante de citocina. Una o más citocinas pueden ser adecuadas como un adyuvante solo o en combinación con uno o más adyuvantes adicionales en una composición descrita en la presente descripción. Las citocinas adecuadas incluyen un interferón (IFN), una interleucina (IL), una quimiocina, un factor estimulante de colonias o un factor de necrosis tumoral. En algunas modalidades, el interferón es un IFN de tipo I, un IFN de tipo II o un IFN de tipo III. En algunas modalidades, el interferón es IFN-a, IFN-p, IFN-y o IFN-A y subtipos de entre estos (por ejemplo, IFN-A, IFN-A2 e IFN-A3). En algunas modalidades, la citoquina es una interleucina. Los ejemplos no limitantes de interleucinas que pueden usarse como un adyuvante en una composición descrita en la presente descripción incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 e IL-36. En algunas modalidades, la citocina es una quimiocina. En algunas modalidades, la quimiocina es una quimiocina CC, una quimiocina CXC, una quimiocina C o una quimiocina CX3C. Los ejemplos no limitantes de quimiocinas CC que pueden usarse como un adyuvante en una composición descrita en la presente descripción incluyen CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 y CCL28. Los ejemplos no limitantes de quimiocinas CXC que pueden usarse en una composición descrita en la presente descripción incluyen CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16 y CXCL17. En algunas modalidades, la citoquina es un factor estimulante de colonias. En algunas modalidades, el factor estimulante de colonias es el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). En algunas modalidades, la citocina es un factor de necrosis tumoral. Los ejemplos no limitantes de una proteína de la familia del factor de necrosis tumoral que puede usarse como un adyuvante en una composición descrita en la presente descripción incluyen TNF-a y 4-1BBL.
En algunas modalidades, el adyuvante inmunoestimulador es un ligando del receptor tipo Toll (TLR) (por ejemplo, un agonista de TLR). Uno o más ligandos de TLR pueden ser adecuados como un adyuvante solo o en combinación con uno o más adyuvantes adicionales en una composición descrita en la presente descripción. Los TLR incluyen los receptores transmembrana de la superficie celular del sistema inmunológico innato que confieren capacidad de reconocimiento de fase temprana a las células huésped para una variedad de estructuras moleculares microbianas conservadas, tales como las que pueden estar presentes en o sobre un gran número de patógenos infecciosos. (por ejemplo, Armant y otros, 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon y otros, 1996 Science 272:50; Medzhitov y otros, 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien y otros, 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda y otros, 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda y otros, 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho y otros, 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta y otros, 2003 J. Immunol. 170:4102).
La inducción de la transducción de señales mediada por TLR para potenciar la iniciación de las respuestas inmunitarias a través del sistema inmunológico innato puede efectuarse por agonistas de TLR (es decir, un ligando de TLR), que activan el TLR de la superficie celular. Por ejemplo, el lipopolisacárido (LPS) puede ser un agonista de TLR a través de TLR2 o TLR4 (Tsan y otros, 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan y otros, 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin y otros, 2005 Shock 24:206); la poli(inosina-citidina) (polil:C) puede ser un agonista de TLR a través de TLR3 (Salem y otros, 2006 Vaccine 24:5119); las secuencias CpG (oligodesoxinucleótidos que contienen citosina-guanosina sin metilar o motivos dinucleótidos "CpG", por ejemplo, CpG 7909, Cooper y otros, 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes y otros, Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer y otros, Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer y otros, 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng y otros, 2004 J. Immunol. 173:5148) pueden ser agonistas de TLR a través de TLR9 (Andaloussi y otros, 2006 Glia 54:526; Chen y otros, 2006 J. Immunol. 177:2373); los peptidoglucanos pueden ser agonistas de TLR2 y/o TLR6 (Soboll y otros, 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao y otros, 2005 J. Immunol. 174:1566); el 3M003 (hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol, peso molecular 318 Da de 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que también es una fuente de los compuestos relacionados 3M001 y 3M002; Gorden y otros, 2005 J. Immunol. 174:1259) puede ser un agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) y/o un agonista de TLR8 (Johansen 2005); la flagelina puede ser un agonista de TLR5 (Feuillet y otros, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); una profilina puede ser un agonista de TLR11 (Hedhli y otros, 2009, Vaccine, 27(16):2274-87); un lipopéptido puede ser un agonista de TLR1, TLR2 y/o TLR6 (Gao y otros, 2013, Vaccine, 31(26):2796-803); y los antígenos de la hepatitis C pueden actuar como agonistas de TLR a través de TLR7 y/o TLR9 (Lee y otros, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans y otros, 2005 Hepatol. 42:724). Se conocen otros agonistas de TLR (por ejemplo, Schirmbeck y otros, 2003 J. Immunol. 171:5198) y pueden usarse de acuerdo con algunas de las modalidades descritas actualmente.
Por ejemplo, y a modo de antecedentes (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,544,518) los oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen dinucleótidos CpG sin metilar ("CpG") se conocen como adyuvantes cuando se administran tanto por vía sistémica como mucosal (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis y otros, J. Immunol, 1998. 160(2):870-876; McCIuskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161 (9):4463-6). CpG es una abreviatura de motivos dinucleótidos de citosina-guanosina presentes en el ADN. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación se aclaró por Krieg, Nature 374, p546 1995. Un análisis detallado ha demostrado que el motivo CG tiene que estar en un determinado contexto de secuencia, y que tales secuencias son comunes en el ADN bacteriano pero son raras en el ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimuladora es a menudo: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en donde el motivo CG de dinucleótido no está metilado, pero se sabe que otras secuencias CpG sin metilar son inmunoestimuladoras y pueden usarse en determinadas modalidades de la presente descripción. Cuando el CpG se formula en vacunas, puede administrarse en la solución libre junto con el antígeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, arriba) o conjugarse covalentemente a un antígeno (publicación PCT núm. WO 98/16247), o formularse con un portador tal como hidróxido de aluminio (por ejemplo, Davis y otros, arriba, Brazolot-Millan y otros, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
En algunas modalidades, los oligonucleótidos para su uso como un adyuvante de la presente descripción contienen dos o más motivos CpG de dinucleótidos separados por al menos tres, con mayor preferencia al menos seis o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente descripción son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o con mayor preferencia un enlace fosforotioato, aunque los enlaces fosfodiéster y otros enlaces internucleotídicos están dentro del alcance de la descripción, que incluyen los oligonucleótidos con uniones internucleotídicas mixtas. Los métodos para producir los oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 5,666,153, 5,278,302 y el documento WO95/26204.
Los ejemplos de oligonucleótidos preferidos tienen las secuencias que se describen en las siguientes publicaciones; para determinadas modalidades descritas en la presente descripción, las secuencias contienen preferentemente uniones internucleotídicas modificadas con fosforotioato: (1) c Pg 7909: Cooper y otros, "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults." AIDS, 23 de septiembre de 2005; 19(14):1473-9; (2) CpG 10101: Bayes y otros, "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. Abril de 2005; 27(3):193-219; y (3) Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Expert Opinion on Biological Therapy. Mayo de 2005; 5(5): 673-682.
Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender variantes de las secuencias preferidas descritas en las publicaciones citadas anteriormente que se diferencian en que tienen sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de nucleótidos intrascendentes. Los oligonucleótidos CpG usados en determinadas modalidades de la presente descripción pueden sintetizarse mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, el documento núm. EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden sintetizarse mediante el uso de un sintetizador automatizado. Los oligonucleótidos son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida, el enlace internucleotídico en el oligonucleótido es fosforoditioato, o con mayor preferencia un enlace fosforotioato, aunque los fosfodiésteres también están dentro del alcance de las modalidades actualmente contempladas. También se contemplan los oligonucleótidos que comprenden diferentes uniones internucleotídicas, por ejemplo, fosfodiésteres de fosforotioato mixtos. También pueden usarse otros enlaces internucleotídicos que estabilizan el oligonucleótido.
En determinadas modalidades, el adyuvante es un agonista de TLR4. En algunas modalidades, el agonista de TLR4 usado en una composición de la descripción comprende un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA), como los descritos en las publicaciones de patentes de Estados Unidos núms. US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 y US 2010/0310602.
Por ejemplo, en determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000025_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde:
L1, L2 , L3 , L4 , L5 y L 6 son iguales o diferentes e independientemente -O-, -NH- o -(CH2)-;
L7, Ls , L9 y L10 son iguales o diferentes y están independientemente ausentes o -C(=O)-;
Y i es un grupo funcional ácido;
Y2 y Y3 son iguales o diferentes e independientemente -OH, -SH o un grupo funcional ácido;
Y 4 es -OH o -SH;
R1, R3 , R5 y R 6 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C8-13; y
R2 y R4 son los mismos o diferentes e independientemente alquilo C6-11.
En algunas modalidades de la estructura de GLA sintético, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C10; y R 2 y R 4 son alquilo C 8 . En determinadas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
Por ejemplo, en determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000026_0001
En una modalidad específica, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20; y R 2 y R 4 son alquilo C12-C20.
En otra modalidad específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente en donde R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C13.
En otra modalidad específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente en donde R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C10; y R 2 y R 4 son alquilo C 8 .
En otra modalidad específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente en donde R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20 y R 2 y R 4 son alquilo C9-C20. En determinadas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000026_0002
En determinadas modalidades de la estructura de GLA anterior, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20; y R 2 y R 4 son alquilo C9-C20. En determinadas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000027_0001
En determinadas modalidades de la estructura de GLA anterior, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20; y R 2 y R 4 son alquilo C9-C20. En determinadas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000027_0002
En determinadas modalidades de la estructura de GLA anterior, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11-C20; y R 2 y R 4 son alquilo C9-C20. En determinadas modalidades, R 1 , R 3 , R 5 y R 6 son alquilo C11; y R 2 y R 4 son alquilo C9.
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000027_0003
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000027_0004
En determinadas modalidades, el agonista de TLR4 es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000028_0001
En otra modalidad, el adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción es un derivado de lípido A atenuado (ALD). Los ALD son moléculas similares al lípido A que se han alterado o construido de modo que la molécula muestre efectos adversos menores o diferentes de los del lípido A. Estos efectos adversos incluyen pirogenicidad, reactividad local de Shwarzman y toxicidad según se evaluó en el ensayo de dosis letal del 50 % (CELD50) en embrión de pollo. Los ALD útiles de acuerdo con la descripción objeto incluyen el monofosforil lípido A (MLA) y el monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MLA). MLA y 3D-MLA se conocen y no es necesario describirlos en detalle en la presente descripción. Ver por ejemplo la patente de Estados Unidos núm. 4,436,727, expedida el 13 de marzo de 1984, cedida a Ribi ImmunoChem Research, Inc., que describe el monofosforil lípido A y su fabricación. La patente de Estados Unidos núm. 4,912,094 y el certificado de revisión B1 de la patente de Estados Unidos núm.
4,912,094 a Myers y otros, también asignada a Ribi ImmunoChem Research, Inc., incorpora el monofosforil lípido A 3-desacilado y un método para su fabricación.
En algunas modalidades, los modificadores de la respuesta tales como la imidazoquinolina y otros modificadores de la respuesta inmunitaria conocidos en la técnica también pueden incluirse como adyuvantes en determinadas modalidades descritas actualmente. Determinados modificadores preferidos de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina incluyen, a modo de ejemplo no limitante, resiquimod (R848), imiquimod y gardiquimod (Hemmi y otros, 2002 Nat. Immunol. 3:196; Gibson y otros, 2002 Cell. Immunol. 218:74; Gorden y otros, 2005 J. Immunol.
174:1259); estos y otros modificadores de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina pueden, en condiciones apropiadas, también tienen actividad agonista de TLR como se describe en la presente descripción. Otros modificadores de la respuesta inmunitaria son los modificadores inmunitarios de doble tallo en bucle (dSLIM) a base de ácidos nucleicos. Pueden encontrarse ejemplos específicos de dSLIM que se contemplan para su uso en algunas de las modalidades descritas en Schmidt y otros, 2006 Allergy 61:56; Weihrauch y otros, 2005 Clin Cancer Res.
11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knablein (Editor). John Wiley & Sons, 6 de diciembre de 2005. (dSLIM discutido en las páginas 183 a ~200), y de Mologen Ag (Berlín, RFA: [recuperado en línea el 18/8/06, ver la web mundial en mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml]).
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción es un polisacárido derivado de bacterias o plantas. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes a base de polisacáridos que pueden usarse solos o en combinación con uno o más adyuvantes adicionales en una composición descrita en la presente descripción incluyen glucanos (por ejemplo, betaglucanos), dextranos (por ejemplo, dietilaminoetildextranos y sulfatados), glucomananos, galactomananos, levanos, xilanos, fructanos (por ejemplo, inulina), quitosano, endotoxinas (por ejemplo, lipopolisacárido), biobran MGN-3, polisacáridos de Actinidia eriantha, eldexómero y las variaciones de estos.
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción es un proteosoma o una subunidad de este. En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción comprende las secuencias peptídicas antigénicas idénticas o diferentes ensambladas alrededor de un núcleo de lisina. En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción es una toxina (por ejemplo, una toxina bacteriana). En algunas modalidades, la toxina es de una o más bacterias que se seleccionan del grupo que consiste en Escherichia coli, Vibrio cholera, Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis.
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, la vacuna liofilizada termoestable) es un adyuvante de administración. Un adyuvante de administración puede servir como un adyuvante y/o puede administrar un antígeno. Los ejemplos no limitantes de un adyuvante que puede usarse solo o en combinación con uno o más adyuvantes adicionales en una composición descrita en la presente descripción incluyen sales minerales (por ejemplo, fosfato de calcio), emulsiones (por ejemplo, escualeno en agua), liposomas (por ejemplo, liposomas de DPpC:colesterol), virosomas (por ejemplo, virosomas inmunopotenciadores reconstituidos de influenza) y microesferas.
Otros adyuvantes para su uso de acuerdo con determinadas modalidades descritas en la presente descripción incluyen un copolímero de bloque o polímero biodegradable, que se refiere a una clase de compuestos poliméricos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Los ejemplos de un copolímero de bloque o polímero biodegradable que puede incluirse en una composición descrita en la presente descripción incluyen Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Olive, NJ; ver, por ejemplo, Yeh y otros, 1996 Pharm. Res. 13:1693; patente de Estados Unidos núm. 5,565,209), CRL1005 (por ejemplo, Triozzi y otros, 1997 Clin Canc. Res. 3:2355), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poli(ácido láctico) (PLA), poli-(D,L-láctido-co-glicólido) (PLG) y polil:C. (Ver, por ejemplo, Powell y Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, Nueva York).
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, la vacuna liofilizada termoestable) es un adyuvante orgánico. Los adyuvantes orgánicos pueden ser adyuvantes que se derivan de organismos vivos o que contienen carbono químicamente. En alguna modalidad, el adyuvante es un péptido derivado de una pared celular microbiana (por ejemplo, un dipéptido de muramilo y las variantes de este). En algunas modalidades, el adyuvante es trehalosa 6,6'-dimicolato o las variantes de este. Ver Schweneker y otros, 2013, Immunobiology, 218(4):664-73. En algunas modalidades, el adyuvante es estearil tirosina.
Las saponinas y los miméticos de saponina, que incluyen QS21 y los compuestos estructuralmente relacionados que confieren efectos similares y denominados en la presente descripción como miméticos de QS21 (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 5,057,540; documento núm. EP 0362279 B1; documento núm. Wo 95/17210), los alcaloides vegetales como la tomatina, los detergentes como (pero no limitados a) la saponina, el polisorbato 80, el Span 85 y la estearil tirosina, un modificador de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina y un modificador inmunitario de doble tallo en bucle (dSLIM, por ejemplo, Weeratna y otros, 2005 Vaccine 23:5263) pueden usarse como un adyuvante de acuerdo con algunas de las modalidades descritas actualmente.
En algunas modalidades, el adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción es una saponina o un mimético de saponina. Los detergentes que incluyen las saponinas se enseñan en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,544,518; Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996 Phytomedicine 2:363-386), la patente de Estados Unidos núm. 5,057,540, Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1 -2): 1 -55 y el documento núm. EP 0 362 279 B1. Las estructuras particuladas, denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), que comprenden fracciones de Quil A (saponina) son hemolíticas y se han usado en la fabricación de vacunas (Morein, B., documento núm. EP 0 109 942 B1). Se ha informado que estas estructuras tienen actividad adyuvante (documento núm. EP 0109942 B1; documento núm. WO 96/11711). Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) se han descrito como potentes adyuvantes sistémicos, y el método de su producción se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,057,540 y el documento núm. EP 0 362279 B1. QS21 puede comprender una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. La producción de QS21 se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,057,540. (Ver también patentes de Estados Unidos núms. 6,936,255, 7,029,678 y 6,932,972). También se describe en estas referencias el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) que actúa como un potente adyuvante para las vacunas sistémicas. El uso de QS21 se describe con más detalle en Kensil y otros (1991. J. Immunology 146:431-437). También se conocen las combinaciones de QS21 y el polisorbato o ciclodextrina (documento núm. WO 99/10008). Los sistemas de adyuvantes particulados que comprenden fracciones de QuilA, como QS21 y QS7, se describen en los documentos núms. WO 96/33739 y Wo 96/11711. Otras saponinas que se han usado en estudios de vacunación sistémica incluyen las derivadas de otras especies de plantas como Gypsophila y Saponaria (Bomford y otros, Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
En algunas modalidades, el adyuvante es un "complejo inmunoestimulador" conocido como ISCOMS (por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 6,869,607, 6,846,489, 6,027,732, 4,981,684), que incluyen Is Co m At r Ix ® derivado de saponina, que está disponible comercialmente, por ejemplo, en Iscotec (Estocolmo, Suecia) y CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Australia).
La escina es otro detergente relacionado con las saponinas para su uso en las composiciones adyuvantes de las modalidades descritas en la presente descripción. La escina se describe en el índice Merck (12a Ed.: entrada 3737) como una mezcla de saponina presente en la semilla del castaño de Indias, Aesculus hippocastanum. Su aislamiento se describe mediante cromatografía y purificación (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) y por resinas de intercambio iónico (Erbring y otros, patente de Estados Unidos núm. 3,238,190). Se han purificado fracciones de escina (también conocida como escina) y se ha demostrado que son biológicamente activas (Yoshikawa M y otros (Chem Pharm Bull (Tokio) agosto de 1996; 44(8): 1454-1464)). La digitonina es otro detergente, que también se describe en el índice Merck (12a edición, entrada 3204) como una saponina, que se deriva de las semillas de Digitalis purpurea y se purifica de acuerdo con el procedimiento descrito por Gisvold y otros, J. Am. Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; y Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621.
En algunas modalidades, un adyuvante usado en una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, una vacuna liofilizada termoestable) es un adyuvante inorgánico. Los adyuvantes inorgánicos pueden ser adyuvantes que generalmente no están basados en carbono tales como, por ejemplo, sales minerales, emulsiones y fosfatos de calcio. Los adyuvantes de sales minerales contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, compuestos a base de aluminio tales como fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio. Como se usa en la presente descripción, los adyuvantes de fosfato de calcio incluyen, pero no se limitan a, iones de calcio (Ca2+) junto con ortofosfatos (PO43-), metafosfatos (PO3-) o pirofosfatos (P2O74-).
Como también se señaló anteriormente, un tipo de adyuvante para su uso en una composición como se describe en la presente descripción pueden ser los adyuvantes de aluminio, que generalmente se denominan "alumbre". Los adyuvantes de alumbre se basan en lo siguiente: oxihidróxido de aluminio; hidroxifosfato de aluminio; o varias sales patentadas. Las vacunas que usan adyuvantes de alumbre pueden incluir vacunas para cepas de tétanos, VPH, hepatitis A, virus de polio inactivado y otros antígenos como se describe en la presente descripción. Los adyuvantes de alumbre son ventajosos porque tienen un buen historial de seguridad, aumentan las respuestas de anticuerpos, estabilizan los antígenos y son relativamente simples para la producción a gran escala. (Edelman 2002 Mol.
Biotechnol. 21: 129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2: 370-383.).
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un adyuvante. En algunas modalidades, el adyuvante es un agonista de TLR4. En algunas modalidades, el adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 12 mg/ml. En algunas modalidades, el adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 0,5 pg/ml, aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente g/ml, aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente
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pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 60 pg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 80 pg/ml, aproximadamente 90 pg/ml o aproximadamente 100 pg/ml. En algunas modalidades, el adyuvante es un MPL o GLA descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml o aproximadamente 12 mg/ml.
Los adyuvantes adecuados para su uso en determinadas composiciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, una composición de vacuna liofilizada termoestable) incluyen adyuvantes disponibles comercialmente tales como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan); adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, Nueva Jersey); AS-2 y derivados de este (SmithKline Beecham, Filadelfia, Pensilvania); AddaVax (InvivoGen); MF59 (Norvartis); AS03 (GlaxoSmithKline); AS01B (GlaxoSmithKline); AS02A (GlaxoSmithKline).
Algunas modalidades como se describen en la presente descripción incluyen las composiciones (por ejemplo, las composiciones de vacunas liofilizadas termoestables) que contienen un adyuvante y al menos un adyuvante más que es diferente del primer adyuvante. Por ejemplo, una composición descrita en la presente descripción puede comprender GLA y un segundo adyuvante distinto de GLA. En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende dos, tres, cuatro o cinco adyuvantes. En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende dos adyuvantes.
Un adyuvante como se describe en la presente descripción incluye un adyuvante que, cuando se administra a un sujeto tal como un ser humano (por ejemplo, un paciente humano), un primate no humano, un mamífero u otro organismo eucariota superior que tiene un sistema inmunológico reconocido, es capaz de alterar (es decir, aumentar o disminuir de una manera estadísticamente significativa y, en determinadas modalidades, mejorar o aumentar) la potencia y/o la longevidad de una respuesta inmunitaria. (Ver, por ejemplo, Powell y Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, Nueva York) En determinadas modalidades descritas en la presente descripción, el GLA y un antígeno deseado, y opcionalmente uno o más adyuvantes, pueden alterar, por ejemplo, provocar o potenciar, una respuesta inmunitaria que está dirigida contra el antígeno deseado.
Antígenos para su uso en composiciones de vacunas liofilizadas termoestables
En algunas modalidades, la composición de vacuna termoestable se usa para provocar o mejorar la inmunorreactividad o una respuesta inmunitaria en un huésped hacia un antígeno.
En algunas modalidades, el antígeno ya puede estar presente en el huésped, como un antígeno autoinmunitario, alérgeno o antígeno de cáncer y la composición de vacuna solo puede incluir la emulsión estable y, opcionalmente, un adyuvante que, cuando se administra, provoca o mejora la inmunorreactividad hacia el antígeno ya presente en un sujeto. Esta administración de una composición de vacuna que comprende la emulsión liofilizada termoestable y un adyuvante para provocar una respuesta inmunitaria hacia un antígeno ya presente en un huésped como se usa en la presente descripción es una monoterapia.
En algunas modalidades, una composición de vacuna descrita en la presente descripción comprende uno o más antígenos.
Un antígeno, para su uso en determinadas modalidades de las composiciones descritas en la presente descripción y los métodos para generar y usar tales composiciones, puede ser cualquier epítopo diana, molécula (que incluye una biomolécula), complejo molecular (que incluye complejos moleculares que contienen biomoléculas), ensamblaje subcelular, célula o tejido contra el que se desea la provocación o la potenciación de la inmunorreactividad en un sujeto. Con frecuencia, el término antígeno se referirá a un antígeno polipeptídico de interés. Sin embargo, el antígeno, como se usa en la presente descripción, también puede referirse a un constructo recombinante que codifica un antígeno polipeptídico de interés (por ejemplo, un constructo de expresión). En determinadas modalidades preferidas, el antígeno puede ser, o puede derivarse de, o puede tener reactividad cruzada inmunológica con, un patógeno infeccioso y/o un epítopo, biomolécula, célula o tejido que está asociado con una infección, cáncer, enfermedad autoinmunitaria, alergia, asma o cualquier otra afección en la que sería conveniente o beneficiosa la estimulación de una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
En algunas modalidades, un antígeno puede estar presente en cualquier concentración suficiente para provocar o mejorar la inmunorreactividad en un sujeto al nivel deseado. En algunas modalidades, un antígeno puede estar presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 2,5 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de 0,1 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de aproximadamente 2,5 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 2,5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de 0,1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 2,5 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de 0,1 pg/ml a aproximadamente 2,5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2,5 pg/ml o de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. Las concentraciones proporcionadas se refieren a las concentraciones del antígeno en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
En determinadas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, una composición de vacuna liofilizada termoestable) comprenden un antígeno o una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno humano u otro mamífero, cuyo antígeno o composición antigénica puede incluir una composición derivada de un virus tal como de VIH-1, (como tat, nef, gp120 o gp160), virus del herpes humano, como gD o los derivados de este o la proteína inmediata temprana como ICP27 de HSV1 o HSV2, citomegalovirus ((esp. Humano) (como gB o los derivados de este), rotavirus (que incluyen los virus vivos atenuados), virus de Epstein Barr (como gp350 o los derivados de este), virus de la varicela zóster (como gpl, II e IE63) o de un virus de la hepatitis como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, el antígeno de superficie de la hepatitis B o un derivado de este), el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis C y el virus de la hepatitis E, o de otros patógenos virales, como los paramixovirus: virus sincitial respiratorio (como las proteínas F y G o los derivados de estos), virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo, VPH6, 11, 16, 18, etc.), flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la influenza (virus entero vivo o inactivado, virus de la influenza dividido, cultivado en huevos o células MDCK, o virosomas de la influenza completos (como se describe en Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de estas, tales como proteínas HA, NP, NA o M o las combinaciones de estas).
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, una composición de vacuna liofilizada termoestable) comprenden un antígeno o una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno humano o de otro mamífero, cuyo antígeno o composición antigénica puede incluir una composición derivada de uno o más patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, que incluyen N. gonorrhoeae y N. meningitidis (por ejemplo polisacáridos capsulares y los conjugados de estos, proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo, proteínas M o los fragmentos de estas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; Moraxella spp, que incluye M. catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, que incluye B. pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina pertussis o los derivados de esta, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., que incluye M. tuberculosis (por ejemplo, ESAT6, antígeno 85A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, que incluye L. pneumophila; Escherichia spp, que incluye E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de colonización, toxina termolábil o los derivados de esta, toxina termoestable o los derivados de esta), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por ejemplo, toxina similar a la toxina shiga o los derivados de esta); Vibrio spp, que incluye V. cholera (por ejemplo, toxina del cólera o derivados de esta); Shigella spp, que incluye S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, que incluye Y. enterocolítica (por ejemplo, una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, que incluye C. jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, que incluye S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., que incluye L. monocytogenes; Helicobacter spp, que incluye H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, que incluye P. aeruginosa; Staphylococcus spp., que incluye S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., que incluye E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., que incluye C. tetani (por ejemplo, toxina del tétanos y el derivado de esta), C. botulinum (por ejemplo, toxina botulínica y el derivado de esta), C. difficile (por ejemplo, toxinas A o B de clostridium y los derivados de estas); Bacillus spp., que incluye B. anthracis (por ejemplo, toxina botulínica y los derivados de estas); Corynebacterium spp., que incluye C. diphtheriae (por ejemplo, toxina diftérica y los derivados de esta); Borrelia spp., que incluye B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., que incluye E. equi y el agente de la erliquiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, que incluye R. rickettsii; Chlamydia spp., que incluye C. trachomatis (por ejemplo, MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo, MOMP, proteínas de unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., que incluye L. interrogans; Treponema spp., que incluye T. pallidum (por ejemplo, las proteínas raras de la membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; u otros patógenos bacterianos.
En determinadas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, una composición de vacuna liofilizada termoestable) comprenden un antígeno o una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno humano u otro mamífero, cuyo antígeno o composición antigénica puede incluir una composición derivada de uno o más parásitos (ver, por ejemplo, John, D.T. y Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology, 9a edición, 2006, WB Saunders, Filadelfia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians - 8a edición, 2002, WB Saunders, Filadelfia) tales como Plasmodium spp., que incluye P. falciparum; Toxoplasma spp., que incluye T. gondii (por ejemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., que incluye E. histolytica; Babesia spp., que incluye B. microti; Trypanosoma spp., que incluye T. cruzi; Giardia spp., que incluye G. lamblia; Leshmania spp., que incluye L. major; Pneumocystis spp., que incluye P. carinii; Trichomonas spp., que incluye T. vaginalis; o de un helminto capaz de infectar a un mamífero, como: (i) infecciones por nematodos (que incluyen, entre otros, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis y Strongyloides stercoralis); (ii) infecciones por trematodos (que incluyen, pero no se limitan a, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); e (iii) infecciones por cestodos (que incluyen, pero no se limitan a, Taenia saginata y Taenia solium). Por tanto, determinadas modalidades pueden contemplar las composiciones de vacunas que incluyen un antígeno derivado de Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium y/o Schistosoma japonicum, o un derivado de levadura como Candida spp., que incluye C. albicans; Cryptococcus spp., que incluye C. neoformans.
En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende al menos dos polipéptidos heterólogos de una especie de Mycobacterium del complejo de la tuberculosis. Una especie de Mycobacterium del complejo de la tuberculosis incluye aquellas especies tradicionalmente consideradas como causantes de la enfermedad tuberculosis, así como también las especies ambientales y oportunistas de Mycobacterium que causan la tuberculosis y la enfermedad pulmonar en pacientes inmunodeprimidos, como pacientes con SIDA, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis o Mycobacterium africanum, BCG, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium celatum, Mycobacterium genavense, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium simiae, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium scrofulaceum (ver, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, volume 1, pp. 1004-1014 y 1019-1020). Las secuencias de antígenos de las especies de Mycobacterium están fácilmente disponibles. Por ejemplo, las secuencias de Mycobacterium tuberculosis pueden encontrarse en Cole y otros, Nature 393:537 (1998) y pueden encontrarse en sitios web como los mantenidos por Wellcome Trust, Sanger Institute e Institut Pasteur.
Otros antígenos específicos para M. tuberculosis que pueden usarse en una composición descrita en la presente descripción son, por ejemplo, Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DpV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento núm. WO 99/51748). Las proteínas para M. tuberculosis también incluyen las proteínas de fusión y las variantes de estas en las que al menos dos, preferentemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se fusionan en una proteína más grande. En determinadas modalidades, las proteínas de fusión incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento núm. WO 99151748). Otros antígenos que pueden usarse incluyen los antígenos, la combinación de antígenos y las proteínas de fusión descritas en los documentos núms. US 2010/0129391 y WO 2008/124647.
En determinadas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende una proteína de fusión aislada que comprende una combinación de dos o más antígenos de M. tuberculosis unidos covalentemente o los fragmentos inmunogénicos de estos, en donde los antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv0164, Rv0496, Rv2608, Rv3020, Rv3478, Rv3619, Rv3620, Rv1738, Rv1813, Rv3810, Rv2389, Rv2866, Rv3876, Rv0054, Rv0410, Rv0655, Rv0831, Rv1009, Rv1099, Rv1240, Rv1288, Rv1410, Rv1569, Rv1789, Rv1818, Rv1860, Rv1886, Rv1908, Rv2220, Rv2032, Rv2623, Rv2875, Rv3044, Rv3310, Rv3881, Rv0577, Rv1626, Rv0733, Rv2520, Rv1253, Rv1980, Rv3628, Rv1884, Rv3872, Rv3873, Rv151 1 y Rv3875, y los antígenos que tienen al menos un 90 % de identidad con cualquiera de las secuencias anteriores.
En determinadas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende la proteína de fusión ID93, que comprende los antígenos Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la combinación de antígenos. En otra modalidad, la composición comprende la proteína de fusión ID93, que comprende los antígenos Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813, en donde las secuencias de los antígenos son de M. tuberculosis. En otra modalidad, la proteína de fusión ID93 comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con esta. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con esta. En algunas modalidades, la vacuna terapéutica comprende una proteína de fusión que comprende una combinación de antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3620 y Rv1813, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la combinación de antígenos. En algunas modalidades, los antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3620 y Rv1813 son los antígenos de M. tuberculosis Rv2608, Rv3620 y Rv1813. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3 o 4, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, el antígeno Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el antígeno Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas modalidades, el antígeno Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el antígeno Rv3619 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Un experto en la técnica comprenderá que pueden eliminarse uno o más aminoácidos de extremo N (tales como las secuencias señal). Estas secuencias se describen en el documento núm. US 8,486,414.
En algunas modalidades, la composición comprende la proteína de fusión ID93, o un polinucleótido que codifica la misma, que comprende cuatro antígenos pertenecientes a las familias de proteínas Mtb asociadas con la virulencia (Rv2608, Rv3619, Rv3620) o la latencia (Rv1813), como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2010/0129391.
En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende un antígeno para Chlamydia. Los antígenos para la clamidia incluyen, por ejemplo, la proteína de alto peso molecular (HWMP) (documentos núms. WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) y las supuestas proteínas de membrana (Pmps). Otros antígenos de Chlamydia de la composición pueden seleccionarse del grupo descrito en el documento núm. WO 99128475. En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende los antígenos derivados de Streptococcus spp, que incluyen S. pneumoniae (por ejemplo, polisacáridos capsulares y conjugados de estos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina) y el antígeno proteico Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y otros, Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) y los derivados desintoxicados mutantes de estos (WO 90/06951; WO 99/03884). Otros antígenos bacterianos se derivan de Haemophilus spp., que incluyen H. influenzae tipo B (por ejemplo, PRP y los conjugados de este), H. influenzae no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y los péptidos derivados de fimbrina (patente de Estados Unidos núm. 5,843,464) o múltiples variantes de copia o proteínas de fusión de estas.
Los derivados del antígeno de superficie de la hepatitis B se conocen bien en la técnica e incluyen, entre otros, los antígenos PreS1, Pars2 S descritos en las solicitudes de patentes europeas núms. EP-A414374; EP-A-0304578 y EP 198474. En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende el antígeno del VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en células CHO. En una modalidad adicional, la composición comprende gD2t como se definió anteriormente.
En algunas modalidades, una composición descrita en la presente descripción comprende un antígeno derivado del virus del papiloma humano (VPH) considerado responsable de las verrugas genitales (VPH 6 o VPH 11 y otros), y los virus VPH responsables del cáncer de cuello uterino (VPH16, VPH18 y otros). En algunas modalidades, la composición es una vacuna profiláctica o terapéutica de verrugas genitales que comprende capsómeros o partículas L1 y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos que se seleccionan de las proteínas E6, E7, L1 y L2 del VPH 6 y VPH 11. Determinadas formas de proteínas de fusión incluyen L2E7 como se describe en el documento núm. WO 96/26277, y la proteína D (1/3)-E7 descrita en el documento núm. GB 9717953.5 ( PCT/EP98/05285). En algunas modalidades, la composición es una vacuna de profilaxis o terapéutica, para la infección o el cáncer de cuello uterino por VPH, que comprende los antígenos de VPH 16 o 18. Por ejemplo, los monómeros de antígeno L1 o L2, o los antígenos L1 o L2 se presentan juntos como una partícula similar al virus (VLP) o la proteína L1 sola se presenta sola en una estructura de capsómero o VLP. Dichos antígenos, las partículas similares al virus y los capsómeros son de por sí conocidos. Ver por ejemplo los documentos núms. WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 y WO93/02184.
Las proteínas tempranas adicionales pueden incluirse solas o como proteínas de fusión tales como E7, E2 o preferentemente f5, por ejemplo; algunas modalidades incluyen una v Lp que comprende las proteínas de fusión L1E7 (documento núm. Wo 96/11272). En algunas modalidades, los antígenos de HPV 16 comprenden las proteínas tempranas E6 o F7 en fusión con un portador de la proteína D para formar fusiones de la proteína D-E6 o E7 a partir de HPV 16, o las combinaciones de estas; o las combinaciones de E6 o E7 con L2 (documento núm. WO 96/26277). Alternativamente, las proteínas tempranas E6 y E7 de HPV 16 o 18, pueden presentarse en una sola molécula, preferentemente una fusión de la proteína D-E6/E7. Dicha composición (por ejemplo, una composición de vacuna liofilizada termoestable) puede contener opcionalmente una o ambas proteínas E6 y E7 frente al VPH 18, preferentemente en la forma de una proteína de fusión de la proteína D-E6 o proteína D-E7 o una proteína de fusión de la proteína D E6/E7. Una composición descrita en la presente descripción puede comprender adicionalmente los antígenos de otras cepas de HPV, preferentemente a partir de las cepas de h Pv 31 o 33.
Las composiciones descritas en la presente descripción pueden comprender además los antígenos derivados de los parásitos que provocan la malaria. Por ejemplo, los antígenos de Plasmodia falciparum incluyen RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción del extremo C de la proteína circumsporozoito (CS) de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de la hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la solicitud de patente internacional núm. PCT/EP92/02591, publicada como el documento núm. WO 93/10152 reclamando la prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido núm. 9124390.7. Cuando se expresa en levadura, el RTS se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se coexpresa con el antígeno S del VHB, se produce una partícula mixta conocida como RTS,S.
Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente internacional núm. PCT/GB89/00895 publicada como el documento núm. WO 90/01496. Una modalidad de la presente descripción es una vacuna contra la malaria en donde la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodios que probablemente sean candidatos a ser componentes de una vacuna contra la malaria de múltiples etapas son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum y sus análogos en Plasmodium spp.
Determinadas modalidades descritas en la presente descripción contemplan un antígeno que se deriva de al menos un patógeno infeccioso como una bacteria, un virus o un hongo, que incluyen una Actinobacterium como M. tuberculosis o M. leprae u otra micobacteria; una bacteria tal como un miembro del género Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia o Bordetella; un virus como el virus del herpes simple, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el citomegalovirus, el virus de la varicela zóster, el virus de la hepatitis, el virus de Epstein Barr (VEB), el virus sincitial respiratorio, el virus del papiloma humano (VPH) y un citomegalovirus; VIH como VIH-1 o VIH-2; un hongo como Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides y Pneumocysti o una levadura, que incluye especies de Candida tales como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis y C. parapsilosis; un parásito tal como un protozoo, por ejemplo, una especie de Plasmodium que incluye P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale; u otro parásito tal como uno o más de Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia y Leishmania.
Por ejemplo, en las modalidades de las composiciones que contienen los antígenos derivados de Borrelia sp., los antígenos pueden incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno o preparaciones antigénicas, proteínas o péptidos producidos de forma recombinante y proteínas de fusión quiméricas. Uno de esos antígenos es OspA. La OspA puede ser una proteína madura completa en forma lipidada en virtud de su biosíntesis en una célula huésped (Lipo-OspA) o puede ser alternativamente un derivado no lipidado. Dichos derivados no lipidados incluyen la proteína de fusión NS1-OspA no lipidada que tiene los primeros 81 aminoácidos del extremo N de la proteína no estructural (NS1) del virus de la influenza, y la proteína OspA completa, y otra, MDP-OspA es una forma no lipidada de OspA que tiene 3 aminoácidos adicionales en el extremo N.
Se conocen en la técnica las composiciones y los métodos para identificar los sujetos que tienen, o se sospecha que tienen riesgo de tener, una infección con un patógeno infeccioso como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, la bacteria Mycobacterium tuberculosis provoca la tuberculosis (TB). Las bacterias suelen atacar los pulmones, pero también pueden atacar los riñones, la columna vertebral y el cerebro. Si no se trata adecuadamente, la enfermedad de la tuberculosis puede ser fatal. La enfermedad se transmite de una persona a otra en el aire cuando una persona infectada estornuda o tose. En 2003, se notificaron más de 14000 casos de tuberculosis en los Estados Unidos.
Aunque la tuberculosis generalmente puede controlarse mediante el uso de una terapia prolongada con antibióticos, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la propagación de la enfermedad y existen preocupaciones con respecto a la posible selección de cepas resistentes a los antibióticos. Las personas infectadas pueden permanecer asintomáticas, pero contagiosas, durante algún tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es fundamental, el comportamiento del paciente es difícil de controlar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de la resistencia a los fármacos. (por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 7,087,713)
Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir la inmunidad protectora contra la tuberculosis. La Mycobacterium más común empleada para este propósito es Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y la eficacia de BCG es una fuente de controversia y algunos países, como Estados Unidos, no vacunan al público en general. El diagnóstico se logra comúnmente mediante una prueba cutánea, que implica la exposición intradérmica a la tuberculina PPD (derivado purificado de proteínas). Las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno dan como resultado una induración medióle en el lugar de la inyección entre 48 y 72 horas después de la inyección, lo que indica exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema con esta prueba y los individuos vacunados con BCG no pueden distinguirse de los infectados. (por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 7,087,713).
Si bien se ha demostrado que los macrófagos actúan como los principales efectores de la inmunidad contra M. tuberculosis, los linfocitos T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de los linfocitos T en la protección contra la infección por M. tuberculosis se ilustra por la frecuente aparición de M. tuberculosis en los pacientes con SIDA, debido a la disminución de los linfocitos T CD4 asociados con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha demostrado que los linfocitos T CD4 reactivos a micobacterias son potentes productores de interferón gamma (IFN-gamma), que, a su vez, ha demostrado desencadenar los efectos antimicobacterianos de los macrófagos en ratones. Si bien el papel del IFN-gamma en humanos es menos claro, los estudios han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, ya sea sola o en combinación con el IFN-gamma o el factor de necrosis tumoral alfa, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Además, se sabe que el IFN-gamma estimula a los macrófagos humanos para que produzcan 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De manera similar, se ha demostrado que la IL-12 juega un papel en la estimulación de la resistencia a la infección por M. tuberculosis. Para obtener una revisión de la inmunología de la infección por M. tuberculosis, consulte Chan y Kaufmann, en Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994).
Los compuestos y los métodos existentes para diagnosticar la tuberculosis o para inducir la inmunidad protectora contra la tuberculosis incluyen el uso de polipéptidos que contienen al menos una porción inmunogénica de una o más proteínas de Mycobacterium y moléculas de ADN que codifican dichos polipéptidos. Pueden usarse kits de diagnóstico que contienen tales polipéptidos o secuencias de ADN y un reactivo de detección adecuado para la detección de la infección por Mycobacterium en los pacientes y las muestras biológicas. También se describen los anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos. Además, dichos compuestos pueden formularse en las composiciones descritas en la presente descripción para la inmunización contra la infección por Mycobacterium. (Patentes de Estados Unidos núms. 6,949,246 y 6,555,653).
La malaria se eliminó en muchas partes del mundo en la década de 1960, pero la enfermedad aún persiste y están surgiendo nuevas cepas de la enfermedad que son resistentes a los fármacos existentes. La malaria es un importante problema de salud pública en más de 90 países. Nueve de cada diez casos de malaria ocurren en África subsahariana. Más de un tercio de la población mundial está en riesgo y entre 350 y 500 millones de personas se infectan con malaria cada año. Cuarenta y cinco millones de mujeres embarazadas corren el riesgo de contraer malaria este año. De los individuos que ya están infectados, más de 1 millón de los infectados mueren cada año por lo que es una enfermedad prevenible. La mayoría de esas muertes son niños en África.
La malaria generalmente se transmite cuando una persona es picada por un mosquito Anopheles hembra infectado. Para transmitir el mosquito debe haberse infectado por haber extraído sangre de una persona ya infectada con malaria. La malaria es provocada por un parásito y los síntomas clínicos de la enfermedad incluyen fiebre y una enfermedad similar a la gripe, como escalofríos, dolor de cabeza, dolores musculares y cansancio. Estos síntomas pueden ir acompañados de náuseas, vómitos y diarrea. La malaria también puede provocar anemia e ictericia debido a la pérdida de glóbulos rojos. La infección por un tipo de malaria, Plasmodium falciparum, si no se trata con prontitud, puede provocar insuficiencia renal, convulsiones, confusión mental, coma y muerte.
Se conoce un método de diagnóstico in vitro para la malaria en un individuo, que comprende poner un tejido o un fluido biológico tomado de un individuo en contacto con una molécula o composición polipeptídica, en donde dicha molécula o composición polipeptídica comprende una o más secuencias peptídicas que tienen todo o parte de uno o más epítopos T de las proteínas resultantes de la actividad infecciosa de P. falciparum, en condiciones que permitan una reacción inmunológica in vitro entre dicha composición y los anticuerpos que puedan estar presentes en el tejido o el fluido biológico, y la detección in vitro de los complejos antígeno-anticuerpo formados (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 7,087,231).
Se ha descrito la expresión y la purificación de un ectodominio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante. Los métodos anteriores han producido una proteína altamente purificada que retiene el plegamiento y la formación de puentes disulfuro de la molécula nativa. El AMA-1 recombinante es útil como reactivo de diagnóstico, así como también en la producción de anticuerpos, y como una proteína para su uso solo o como parte de una vacuna para prevenir la malaria. (Patente de Estados Unidos núm. 7,029,685).
Se han descrito en la técnica los polinucleótidos que codifican los antígenos peptídicos de la malaria de P. vivax específicos de especie que son proteínas o fragmentos de proteínas secretadas en el plasma de un huésped mamífero susceptible después de la infección, al igual que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra estos antígenos. Los antígenos peptídicos, los anticuerpos monoclonales y/o los anticuerpos policlonales se usan en los ensayos empleados para diagnosticar la malaria, así como también para determinar si Plasmodium vivax es la especie responsable de la infección. (Patente de Estados Unidos núm. 6,706,872) También se han antígeno es un polipéptido de fusión que comprende al menos una secuencia polipeptídica de esterol 24-cmetiltransferasa (SMT) de Leishmania y una secuencia polipeptídica de nucleósido hidrolasa no específica (NH) de Leishmania. En algunas modalidades, la secuencia polipeptídica de NH de Leishmania comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de NH de Leishmania de L. donovani, L. infantum y L. major. En algunas modalidades, la secuencia polipeptídica de NH de Leishmania comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con estas. En algunas modalidades, la secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de SMT de Leishmania de L. donovani, L. infantum y L. major. En algunas modalidades, la secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11, o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con estas. En algunas modalidades, el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos 90 % con esta. Las secuencias de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 se proporcionan en los documentos núms. WO 2012/064659 y US 20120114688.
Aproximadamente 40 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el VIH, el virus que provoca el SIDA. Alrededor de 3 millones de personas mueren a causa de la enfermedad cada año, el 95 por ciento de ellos en el mundo en desarrollo. Cada año, cerca de 5 millones de personas se infectan con el VIH. Actualmente, el África subsahariana tiene la mayor carga de morbilidad, pero se está extendiendo rápidamente a otros países como India, China y Rusia. La epidemia está creciendo más rápidamente entre las poblaciones minoritarias. En los Estados Unidos se han reportado más de 950,000 casos de SIDA desde 1981. El SIDA afecta a las personas durante sus años más productivos. Las mujeres, tanto por razones biológicas como sociales, tienen un mayor riesgo de contraer el VIH/SIDA.
El SIDA es provocado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que mata y daña las células del sistema inmunológico del cuerpo y destruye progresivamente la capacidad del cuerpo para combatir las infecciones y determinados cánceres. El VIH se transmite con mayor frecuencia al tener relaciones sexuales sin protección con una pareja infectada. La solución más sólida al problema es evitar que el virus se propague. Hacer una vacuna contra el VIH segura, eficaz y asequible es una forma de alcanzar este objetivo. En todo el mundo, menos de una de cada cinco personas con alto riesgo de infección por el VIH tiene acceso a una prevención eficaz.
Se conocen los métodos para diagnosticar infecciones por VIH, que incluyen el cultivo del virus, la PCR de secuencias definitivas de ácido nucleico de muestras de pacientes y las pruebas de anticuerpos para detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH en sueros de pacientes (ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms.
6,979,535, 6,544,728, 6,316,183, 6,261,762, 4,743,540).
De acuerdo con otras modalidades como se describe en la presente descripción, las composiciones y los métodos de uso pueden incluir un antígeno que se deriva de una célula cancerosa, que puede ser útil para el tratamiento inmunoterapéutico de cánceres. Por ejemplo, la composición puede resultar útil con antígenos de rechazo de tumores tales como los de cánceres de próstata, mama, colorrectal, pulmón, páncreas, renales o melanoma. Los antígenos cancerosos o derivados de células cancerosas ilustrativos incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antígenos MAGE tales como los descritos en el documento núm. WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (también conocido como NY Eos 1) SAGE y HAGE (documento núm. WO 99/53061) o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde y otros, International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale y otros (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293. Estos ejemplos no limitantes de antígenos de cáncer se expresan en una amplia gama de tipos de tumores como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,544,518.
Otros antígenos específicos de tumores que son adecuados para su uso en las composiciones descritas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, gangliósidos específicos de tumores o asociados a tumores tales como GM2 y GM3 o los conjugados de estos hasta proteínas portadoras; o un antígeno para su uso en una composición de vacuna de g La para provocar o mejorar una respuesta inmunitaria contra el cáncer puede ser una hormona auto-peptídica como la hormona liberadora de hormona gonadotropina de longitud completa (GnRH, documento núm. WO 95/20600), un péptido corto de 10 aminoácidos de largo, útil en el tratamiento de muchos cánceres. En otra modalidad, se usan los antígenos de próstata, tales como el antígeno prostático específico (PSA), PAP, PSCA (por ejemplo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 (4) 1735-1740 1998), PSMA o, en una modalidad preferida, un antígeno conocido como prostasa. (por ejemplo, Nelson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114­ 3119; Ferguson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; documento núm. WO 98/12302; patente de Estados Unidos núm. 5,955,306; documento núm. WO 98/20117; patentes de Estados Unidos núms. 5,840,871 y 5,786,148; documento núm. WO 00/04149. Se conocen otros antígenos específicos de próstata a partir de los documentos núms. WO 98/137418 y WO/004149. Otro es STEAP (PNAS 9614523145287-121999).
Otros antígenos asociados a tumores útiles en el contexto de la presente descripción incluyen: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon y otros, Bioessays 199, 21:61-70, patente de Estados Unidos núm. 5,654,140) y Criptin (patente de Estados Unidos núm. 5,981,215). Además, los antígenos particularmente relevantes para las vacunas en la terapia del cáncer también comprenden tirosinasa y survivina.
Las modalidades descritas en la presente descripción que pertenecen a las composiciones que comprenden un antígeno de cáncer pueden ser útiles contra cualquier cáncer caracterizado por la expresión de un antígeno asociado al tumor, tal como la expresión de HER-2/neu u otros antígenos específicos del cáncer o asociados al cáncer.
El diagnóstico de cáncer en un sujeto que tiene o se sospecha que está en riesgo de tener cáncer puede lograrse mediante cualquiera de una amplia gama de metodologías aceptadas en la técnica, que pueden variar según una variedad de factores, que incluyen la presentación clínica, el grado de progresión del cáncer, el tipo de cáncer y otros factores. Los ejemplos de diagnósticos de cáncer incluyen exámenes histopatológicos, histocitoquímicos, inmunohistocitoquímicos e inmunohistopatológicos de muestras de pacientes (por ejemplo, sangre, biopsia de piel, biopsia de otros tejidos, muestras quirúrgicas, etc.), pruebas de PCR para marcadores genéticos definidos (por ejemplo, ácidos nucleico), pruebas serológicas para hacer circular antígenos asociados al cáncer o células que tienen tales antígenos, o para anticuerpos de especificidad definida, u otras metodologías con las que los expertos en la técnica estarán familiarizados. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,734,172; 6,770,445; 6,893,820; 6,979,730; 7,060,802; 7,030,232; 6,933,123; 6,682,901; 6,587,792; 6,512,102; 7,078,180; 7,070,931; JP5-328975; Waslylyk y otros, 1993 Eur. J Bioch. 211(7): 18.
Las composiciones y los métodos de acuerdo con determinadas modalidades de la presente descripción también pueden usarse para la profilaxis o la terapia de enfermedades autoinmunitarias, que incluyen enfermedades, afecciones o trastornos en donde el sistema inmunológico de un huésped o sujeto media de forma perjudicial una respuesta inmunitaria dirigida contra tejidos, células, biomoléculas "propias" (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, proteolípidos, lípidos, glicolípidos, ácidos nucleicos como ARN y ADN, oligosacáridos, polisacáridos, proteoglicanos, glucosaminoglucanos o similares, y otros componentes moleculares de la células y tejidos de los sujetos) o epítopos (por ejemplo, estructuras de reconocimiento definidas inmunológicamente específicas tales como las reconocidas por una región determinante de complementariedad de la región variable del anticuerpo (CDR) o por una CDR del receptor de linfocitos T).
Por tanto, las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por una respuesta inmunitaria anormal que implica células o anticuerpos que en cualquier caso se dirigen contra tejidos autólogos normales. Las enfermedades autoinmunitarias en los mamíferos generalmente pueden clasificarse en una de dos categorías diferentes: enfermedad mediada por células (es decir, linfocitos T) o trastornos mediados por anticuerpos. Los ejemplos no limitantes de las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide, tiroiditis de Hashimoto, diabetes mellitus tipo I (diabetes de inicio juvenil) y uvoretinitis autoinmunitaria. Los trastornos autoinmunitarios mediados por anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico (o LES), enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, asma autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica trombótica, escleroris biliar primaria y anemia perniciosa. El antígeno o los antígenos asociados con: el lupus eritematoso sistémico son las proteínas de ácido ribonucleico nucleares pequeñas (snRNP); la enfermedad de Graves es el receptor de tirotropina, tiroglobulina y otros componentes de las células epiteliales tiroideas (Akamizu y otros, 1996; Kellerman y otros, 1995; Raju y otros, 1997; y Texier y otros, 1992); el pénfigo son los antígenos de pénfigo de tipo cadherina, tales como desmogleína 3 y otras moléculas de adhesión (Memar y otros, 1996: Stanley, 1995; Plott y otros, 1994; y Hashimoto, 1993); y la púrpura trombocitopénica trombótica son los antígenos de las plaquetas. (Ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,929,796; Gorski y otros (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch y Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY.)
La autoinmunidad juega un papel en más de 80 enfermedades diferentes, que incluyen diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, lupus, artritis reumatoide, esclerodermia y enfermedades de la tiroides. Faltan las estimaciones cuantitativas rigurosas de la morbilidad de la mayoría de las enfermedades autoinmunitarias. Los estudios más recientes realizados a fines de la década de 1990 revelan que las enfermedades autoinmunitarias son la tercera enfermedad importante más común en los Estados Unidos; y las enfermedades autoinmunitarias más comunes afectan a más de 8,5 millones de estadounidenses. Las estimaciones actuales de la prevalencia de la enfermedad varían del 5 al 8 por ciento de la población de los Estados Unidos. La mayoría de las enfermedades autoinmunitarias afectan de manera desproporcionada a las mujeres. Las mujeres tienen 2,7 veces más probabilidades que los hombres de adquirir una enfermedad autoinmunitaria. Las mujeres son más susceptibles a las enfermedades autoinmunitarias; los hombres parecen tener niveles más altos de actividad de las células asesinas naturales que las mujeres. (Jacobsen y otros, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.)
Las enfermedades autoinmunitarias ocurren cuando el sistema inmunológico confunde los tejidos propios con los no propios y realiza un ataque inapropiado. El cuerpo puede verse afectado de diferentes formas a las enfermedades autoinmunitarias, como por ejemplo, el intestino (enfermedad de Crohn) y el cerebro (esclerosis múltiple). Se sabe que un autoanticuerpo ataca a las células o tejidos propios para dañar su función y, como resultado, provoca enfermedades autoinmunitarias, y que el autoanticuerpo puede detectarse en el suero del paciente antes de la aparición real de una enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, aparición de signos y síntomas clínicos). La detección de un autoanticuerpo permite de este modo el descubrimiento o el reconocimiento temprano de la presencia o el riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria. En función de estos hallazgos, se han descubierto una variedad de autoanticuerpos contra autoantígenos y los autoanticuerpos contra autoantígenos se han medido en pruebas clínicas (por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 6,919,210, 6,596,501, 7,012,134, 6,919,078) mientras que otros diagnósticos autoinmunitarios pueden implicar la detección de un metabolito relevante (por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,659,659) o reactividad inmunológica (por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 4,614,722 y 5,147,785, 4,420,558, 5,298,396, 5,162,990, 4,420,461, 4,595,654, 5,846,758, 6,660,487).
En determinadas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción serán particularmente aplicables en el tratamiento de ancianos y/o inmunosuprimidos, que incluyen los sujetos en diálisis renal, los sujetos en quimioterapia y/o radioterapia, receptores de trasplantes y similares. Dichos individuos generalmente exhiben respuestas inmunitarias disminuidas a las vacunas y, por lo tanto, el uso de las composiciones descritas en la presente descripción puede mejorar las respuestas inmunitarias logradas en estos sujetos.
En otras modalidades, el antígeno o los antígenos usados en las composiciones descritas en la presente descripción incluyen los antígenos asociados con las enfermedades respiratorias, tales como las provocadas o exacerbadas por infección bacteriana (por ejemplo, neumocócica), para la profilaxis y la terapia de afecciones tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La EPOC se define fisiológicamente por la presencia de la obstrucción de las vías respiratorias irreversible o parcialmente reversible en pacientes con bronquitis crónica y/o enfisema (Am J Respir Crit Care Med. Noviembre de 1995; 152(5 Pt 2):S77-121). Las exacerbaciones de la EPo C a menudo son provocadas por una infección bacteriana (por ejemplo, neumocócica) (Clin Microbiol Rev. Abril de 2001; 14(2):336-63).
Aceites para su uso en las composiciones termoestables
Determinadas modalidades contemplan las composiciones descritas en la presente descripción que incluyen un aceite, que en algunas de tales modalidades puede contribuir a la actividad adyuvante y en otras de tales modalidades pueden proporcionar adicional o alternativamente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se conoce cualquier número de aceites adecuados y pueden seleccionarse para su inclusión en las composiciones basándose en la presente descripción. Los ejemplos de tales aceites, a modo de ilustración y no de limitación, incluyen escualeno, escualeno sintético, aceite mineral, aceite de semilla de uva, un isoprenoide sintético, aceite de oliva, colesterol y un monooleato de manida.
Un aceite contemplado en la presente descripción puede usarse en un sistema de emulsión y tales sistemas de emulsión se denominan adyuvante de emulsión. Los adyuvantes de emulsión incluyen las mezclas de aceite en agua, agua en aceite o agua en aceite en agua. Sin estar unido a ninguna teoría, tales adyuvantes de emulsión pueden funcionar permitiendo la liberación lenta de los antígenos para proporcionar una estimulación continua del sistema inmunológico. Determinados adyuvantes de emulsión también pueden usarse como un sistema de administración para otros adyuvantes, que incluyen los adyuvantes inmunoestimuladores tales como, pero sin limitarse a, oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN), adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA), monofosforil lípido A (MLA) y monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MLA). Se han descrito determinados sistemas de emulsión para formular las composiciones de adyuvantes, que incluyen los sistemas de emulsión de una o varias fases. Se ha sugerido que los adyuvantes de emulsión de aceite en agua per se son útiles como una composición adyuvante (documento núm. e P 0399 843B), también se han descrito las combinaciones de emulsiones de aceite en agua y otros agentes activos como los adyuvantes para vacunas (documentos núms. WO 95/17210; WO 98/56414; w O 99/12565; WO 99/11241). Se han descrito otros adyuvantes de emulsión de aceite, tales como las emulsiones de agua en aceite (patente de Estados Unidos núm. 5,422,109; documento núm. EP 0480982 B2) y las emulsiones de agua en aceite en agua (patente de Estados Unidos núm. 5,424,067; documento núm. EP 0480981 B).
Los adyuvantes de emulsión de aceite para su uso en la presente descripción pueden ser naturales o sintéticos y pueden ser minerales u orgánicos. Los ejemplos de aceites minerales y orgánicos resultarán evidentes para el experto en la técnica. En una modalidad particular, una composición descrita en la presente descripción (por ejemplo, una vacuna liofilizada termoestable) comprende una emulsión de aceite en agua en donde el adyuvante se incorpora en la fase oleosa. Para que una composición de aceite en agua sea adecuada para la administración humana, la fase oleosa del sistema de emulsión comprende preferentemente un aceite metabolizable. El significado del término aceite metabolizable se conoce bien en la técnica. Metabolizable puede definirse como "ser capaz de ser transformado por el metabolismo" (Dorland's illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25a edición (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite de planta, aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintético, que no sea tóxico para el receptor y pueda ser transformado por metabolismo. Los frutos secos (como el aceite de cacahuete), las semillas y los cereales son fuentes habituales de aceites vegetales. También pueden usarse aceites sintéticos.
El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano), por ejemplo, es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón, y en cantidades menores en el aceite de oliva, el germen de trigo nulo, el aceite de salvado de arroz y la levadura, y es un aceite particularmente preferido para su uso en esta descripción. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un producto intermedio en la biosíntesis del colesterol (Índice Merck, 10a edición, entrada no. 8619). Los aceites metabolizables ilustrativos que pueden ser útiles incluyen, pero no se limitan a, escualeno, aceite de soja, aceite de sésamo y triglicéridos de ácido caprílico/cáprico (aceite MIGLYCOL 810). En una modalidad, el aceite metabolizable comprende escualeno. En otra modalidad, el aceite metabolizable comprende uno o más isoprenoides derivados de levadura, tales como el escualeno derivado de la levadura o una estructura isoprenoide relacionada derivada de la levadura.
En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción comprenden un aceite metabolizable que está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 %-5 % v/v, aproximadamente 0,01 %-4 % v/v, aproximadamente 0,01 %-3 % v/v, aproximadamente 0,01 %-2 % v/v, aproximadamente 0,01 %-1 % v/v, o aproximadamente 0,01 %-0,5 % v/v. En algunas modalidades, el aceite metabolizable está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 % v/v, aproximadamente 0,05 % v/v, aproximadamente 0,1 % v/v, aproximadamente 0,5 % v/v, aproximadamente 1 % v/v, aproximadamente 1,5 % v/v, aproximadamente 2 % v/v, aproximadamente 2,5 % v/v, aproximadamente 3 % v/v, aproximadamente 3,5 % v/v, aproximadamente 4 % v/v, aproximadamente 4,5 % v/v, aproximadamente 5 % v/v, aproximadamente 6 % v/v, aproximadamente 7 % v/v, aproximadamente 8 % v/v, aproximadamente 9 % v/v, aproximadamente 10 % v/v, aproximadamente 11 % v/v, aproximadamente 12 % v/v, aproximadamente 13 % v/v, aproximadamente 14 % v/v, aproximadamente 15 % v/v, aproximadamente 16 % v/v, aproximadamente 17 % v/v, aproximadamente 18 % v/v, aproximadamente 19 % v/v o aproximadamente 20 % v/v. En algunas modalidades, el aceite metabolizable está presente en una concentración de aproximadamente 2 % v/v. En algunas modalidades, el aceite metabolizable está presente en una concentración por debajo del 1 % v/v. Los porcentajes descritos se refieren a los porcentajes en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización o en la emulsión de aceite en agua tras la reconstitución.
El tamaño de las gotas de aceite que se encuentran dentro de la emulsión de aceite en agua estable es preferentemente menor de 1 micra, puede estar en el intervalo de sustancialmente 30-600 nm, preferentemente de manera sustancial alrededor de 30-500 nm de diámetro y con la máxima preferencia sustancialmente 150-500 nm de diámetro, y en particular aproximadamente 150 nm de diámetro medido por espectroscopia de correlación de fotones. A este respecto, el 80 % de las gotas de aceite en número debe estar dentro de los intervalos preferidos, con mayor preferencia más del 90 % y con la máxima preferencia más del 95 % de las gotas de aceite en número están dentro de los intervalos de tamaño definidos.
El equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de una emulsión permite estimar la fuerza hidrófila o lipófila de un tensioactivo. El HLB de una molécula anfifílica generalmente se calcula de la siguiente manera:
HLB= (20X Peso de la parte hidrófila)/(Peso de la molécula anfifílica) El HLB puede tener un valor que varía de 0 (para la molécula más lipófila) a 20 (para la molécula más hidrófila). De acuerdo con la composición química del tensioactivo (en particular, por ejemplo, la adición de grupos etoxilo o de óxidos de alqueno), esta estimación puede cambiar y el dominio del valor de HLB puede aumentar (por ejemplo, LUTROL F68® tiene un HLB de 29). Con una mezcla de tensioactivos, el HLB de la mezcla es la adición de1HLB de cada tensioactivo, equilibrado por su relación en peso:
HLB= (HLB del tensioactivo X x peso del tensioactivo X) (HLB del tensioactivo Y x peso del tensioactivo Y)/(peso del tensioactivo X peso del tensioactivo Y)
En una modalidad de una emulsión preparada de acuerdo con la presente descripción, e1HLB final de la emulsión es de aproximadamente 9 a aproximadamente 12, preferentemente de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5 y con mayor preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 11,5. En algunas modalidades, e1HLB de la emulsión es de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,0. Los expertos en la técnica conocen bien el método de producción de las emulsiones de aceite en agua. Comúnmente, el método comprende mezclar la fase oleosa con un tensioactivo adecuado tal como una solución de PBS/TWEEN80®, seguido de la homogeneización mediante el uso de un homogeneizador. Por ejemplo, un método que comprende pasar la mezcla una, dos o más veces a través de una aguja de jeringa sería adecuado para homogeneizar pequeños volúmenes de líquido. Asimismo, el proceso de emulsificación en un microfluidizador (máquina de microfluidos M110S, máximo de 50 pasadas, durante un período de 2 minutos a una entrada de presión máxima de 6 bar (presión de salida de aproximadamente 850 bar)) podría adaptarse para producir volúmenes menores o mayores de emulsión. Esta adaptación podría lograrse mediante la experimentación de rutina que comprende la medición de la emulsión resultante hasta que se logre una preparación con gotas de aceite del diámetro requerido.
Uso de composiciones termoestables farmacéuticas
En otro aspecto, se describen en la presente descripción los métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una composición de vacuna termoestable reconstituida descrita en la presente descripción. El método puede comprender además una etapa de reconstituir la composición de vacuna liofilizada termoestable en una emulsión de aceite en agua antes de la administración.
Por consiguiente, la presente descripción es útil para potenciar o provocar, en un huésped, un paciente o un sujeto, o en un cultivo celular, una respuesta inmunitaria. Un paciente puede estar afectado por una enfermedad infecciosa, cáncer, como cáncer de mama, o una enfermedad autoinmunitaria, o puede ser normal (es decir, libre de enfermedad y/o infección detectable). Un "cultivo celular" es cualquier preparación que contiene células inmunocompetentes o células aisladas del sistema inmunológico (que incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, macrófagos, monocitos, linfocitos B y células dendríticas). Dichas células pueden aislarse mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, la centrifugación de densidad Ficoll-hypaque). Las células pueden (pero no es necesario) haberse aislado de un paciente que padece cáncer y pueden reintroducirse en un paciente después del tratamiento.
Vías de administración
La presente descripción está dirigida a los métodos y las composiciones para la vacunación, el tratamiento y la prevención de afecciones tales como una enfermedad infecciosa, el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria. Los métodos de la presente descripción comprenden las vías de administración que incluyen la administración parenteral y no parenteral. Las vías de administración no parenterales incluyen, pero no se limitan a, las vías oral, bucal, sublingual, tópica, transdérmica, oftálmica, ótica, nasal, rectal y vaginal. Los métodos inyectables incluyen, pero no se limitan a, las vías de administración parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intraarterial y otras vías de inyección. La descripción contempla las composiciones que pueden proporcionar una liberación controlada, lenta o sostenida del antígeno y/o el adyuvante durante un período de tiempo predeterminado.
Formulaciones
Las formulaciones se conocen por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, las formulaciones tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, comprimidos masticables, comprimidos efervescentes, gránulos, cápsulas, jarabes, supositorios, formulaciones inyectables y dispersión del agente activo en un medio que es insoluble en fluidos fisiológicos o donde la liberación del antígeno y/o el adyuvante se libera después de la degradación de la formulación debido a la actividad mecánica, química o enzimática.
Debe entenderse que esta descripción no se limita a las formulaciones particulares, las etapas del proceso y los materiales descritos en la presente descripción, ya que tales formulaciones, etapas del proceso y materiales pueden variar algo.
Kits y paquetes farmacéuticos
También se contemplan en determinadas modalidades los kits que comprenden las composiciones de vacunas descritas en la presente descripción, que pueden proporcionarse en uno o más recipientes. En una modalidad, todos los componentes de las composiciones de vacunas están presentes juntos en un solo recipiente, pero las modalidades de la descripción no pretenden ser tan limitadas y también contemplan dos o más recipientes.
Un recipiente de acuerdo con tales modalidades del kit puede ser cualquier recipiente, contenedor, vial, ampolla, tubo, taza, caja, botella, matraz, frasco, plato, pozo de un aparato de pozo único o de pozos múltiples, depósito, tanque o similar, u otro dispositivo en el que las composiciones descritas en la presente descripción puedan colocarse, almacenarse y/o transportarse, y accederse a ellas para eliminar el contenido. Normalmente, dicho recipiente puede estar hecho de un material que sea compatible con el uso previsto y del que se pueda recuperar fácilmente el contenido. Los ejemplos preferidos de tales recipientes incluyen tubos y ampollas de vidrio y/o plástico sellados o resellables, que incluyen los que tienen un tabique de caucho u otros medios de sellado que sean compatibles con la extracción del contenido mediante el uso de una aguja y una jeringa. Dichos recipientes pueden, por ejemplo, estar hechos de vidrio o de un plástico o resina químicamente compatible, que puede estar hecho de, o puede estar recubierto con, un material que permita la recuperación eficiente del material del recipiente y/o proteja el material de, por ejemplo, las condiciones degradantes como la luz ultravioleta o las temperaturas extremas, o por la introducción de contaminantes no deseados, que incluyen los contaminantes microbianos. Los recipientes son preferentemente estériles o esterilizables y están hechos de materiales que serán compatibles con cualquier portador, excipiente, disolvente, vehículo o similar, tal como puede usarse para suspender o disolver las composiciones de vacunas descritas en la presente descripción y/o las composiciones de adyuvantes inmunológicos y/o los antígenos y/o los constructos de expresión recombinante, etc.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Formulación de emulsión de vacuna liofilizada y estabilidad en sistemas de excipiente único y múltiple Se deseaba la liofilización de una emulsión de aceite en agua (SE) estable para su uso en vacunas. Se investigó la capacidad de un excipiente para formar una torta elegante térmicamente estable tras la liofilización y/o preservar la integridad de la emulsión tras la reconstitución con el fin de desarrollar sistemas de vacunas térmicamente estables que redujeran o eliminaran la necesidad de mantener la cadena de frío a todas las temperaturas terrestres relevantes.
Materiales y métodos
Formulación y liofilización
Una emulsión estable que contiene escualeno (SE) descrita previamente (EM001; Fox y otros, 2012, Influenza and Other Respiratory Viruses) se liofilizó a una concentración final de escualeno al 2,0 % (v/v) (diluido a una concentración de inyección final objetivo de una formulación inicial al 10 %), con un volumen de llenado total de 1,0 ml. Las concentraciones del excipiente se informaron como porcentaje de masa (% p/v) y las concentraciones de la emulsión como porcentaje de volumen (% v/v) de la fase de aceite de escualeno. Se adquirieron maltosa, D-(-)-ribosa, D-(-)-fructosa, lactosa, polietilenglicol (PEG; mw 3350 Da), lactulosa, ácido nicotínico, pentahidrato de D(+)-rafinosa, ácido 2,6-piridindicarboxílico, y L-prolina de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se adquirieron dihidrato de D(+)-trehalosa y D(+)-manitol de calidad USP, monohidrato de lactosa y sacarosa de calidad NF y dextrano (pm 40 000 Da) de Spectrum Chemical (New Brunswick, NJ). Se adquirieron D(+)-manosa, hidrato de estaquiosa y monohidrato de dextrosa de calidad USP de Thermo Scientific (Waltham, MA). Las muestras se formularon mediante el use de los excipientes anteriores a diversas concentraciones disueltas en agua que se había desionizado y filtrado a través de un sistema de filtración Barnstead/Thermolyne (Dubuque IA) E-Pure D4631 seguido de un filtro Whatman de 20 nm (Maidstone, Kent, Reino Unido) Anotop plus. Las formulaciones que producían cambios extremos de pH (por debajo de 5,0 o por encima de 7,0) tras la reconstitución se volvieron a formular a pH 5,5 antes de la liofilización mediante el uso de NaCl y NaOH. La liofilización se realizó mediante el uso de un liofilizador de mesa VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85. La receta de liofilización usó un programa de tratamiento térmico que incluía una etapa de congelación de 10 horas de 4 a -40 °C y una etapa de recocido a -15 °C. La fase primaria de secado (a 100 mTorr) duró 18,3 horas de -40 °C a 25 °C. Finalmente, se empleó una fase secundaria de secado a 50 mTorr a 25 °C durante 9 horas. Todas las muestras se taparon con gas atmosférico a 500 mTorr, se sellaron mediante el uso de tapas de aluminio y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
Reconstitución
Antes de la reconstitución, las tortas se caracterizaron visualmente como una torta blanca elegante (lo que significa que la torta era blanca, aproximadamente del mismo volumen que se llenó y parecía tener un entramado uniforme), una película o cualquier cosa diferente de una torta blanca elegante. Todas las muestras se reconstituyeron mediante el uso de agua filtrada a 20 nm (descrita anteriormente) y se agitaron suavemente a mano hasta que todos los componentes se solubilizaran o hasta que hubieran transcurrido tres minutos, lo que ocurriera primero. Después de la reconstitución, las formulaciones se describieron como una emulsión de color blanco lechoso (que parecía similar a la formulación preliofilizada), o de otra manera, al notar cualquier diferencia con una emulsión de color blanco lechoso. A continuación, se dejaron reposar alícuotas de cada formulación a temperatura ambiente durante 1 hora y se evaluaron visualmente en busca de evidencia de una fase blanca y espesa en la superficie que se denominó crema. También se evaluó el pH de cada formulación, mediante el uso de un medidor de pH MP225 de Mettler-Toledo (Columbus, OH).
Determinación del punto de fusión
Los puntos de fusión de cada formulación liofilizada se evaluaron por triplicado mediante el uso de un sistema de punto de fusión automatizado OptiMelt de Stanford Research Systems (Sunnyvale, CA). Cada capilar de fusión se sondeó una vez en la torta y se apretó hasta que el material se depositó en el fondo. La fusión se realizó de 27 °C a 200 °C (normalmente truncada una vez que se había completado la fusión) con una velocidad de rampa de 1 °C por minuto.
Una métrica alternativa para el punto de fusión implicaba el uso de un aparato de formación de imágenes del punto de fusión. Los viales de SE liofilizada con varios excipientes se fundieron por triplicado como se describió anteriormente. La transición de fusión se observó como una torta opaca que se fundía en un líquido transparente que disminuía la intensidad de la luz de la muestra en la imagen. Los puntos de inicio se estimaron visualmente como la primera reducción notable en el volumen de la torta al comienzo de la transición de fusión (el comienzo de la torta cambia inmediatamente antes de la fusión), y el punto medio de fusión de la torta (Tm) se determinó como la temperatura a la que las tortas había perdido la mitad de la intensidad de los píxeles entre una torta completamente sólida y una torta completamente derretida. De manera similar, las temperaturas a las que la torta había perdido e n t r e e l 25 y e l 75 p o r c i e n t o d e i n t e n s i d a d ( n o r m a l i z a d a s a l c o m i e n z o y a l f i n a l d e l a t r a n s i c i ó n ) s e c a l c u l a r o n c o m o u n a m é t r i c a d e l i n t e r v a l o d e f u s i ó n .
Determinación de la humedad
Figure imgf000043_0001
Tamaño de partículas y potencial zeta
E l t a m a ñ o d e p a r t í c u l a s d e l a e m u l s i ó n , l a p o l i d i s p e r s i d a d ( P d I ) y e l p o t e n c i a l z e t a s e e v a l u a r o n m e d i a n t e e l u s o d e l a d i s p e r s i ó n d i n á m i c a d e l a l u z ( D L S ) e n u n M a l v e r n ( W o r c e s t e r s h i r e , R e i n o U n i d o ) N a n o - Z S . L a s m e d i c i o n e s s e r e a l i z a r o n g e n e r a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e ( F o x y o t r o s , 2011 , P h a r m a c e u t i c a l D e v e l o p m e n t a n d T e c h n o l o g y , 16 ( 5 ) : 511 - 519 ) . B r e v e m e n t e , t o d a s l a s m e d i d a s d e t a m a ñ o d e D L S s e r e a l i z a r o n e n d i l u c i o n e s d e 10 ' 2 e n a g u a f i l t r a d a a 20 n m ( d e s c r i t a a n t e r i o r m e n t e ) y s e e v a l u a r o n p o r t r i p l i c a d o e n a l í c u o t a s i n d i v i d u a l e s . P a r a l a s m e d i c i o n e s d e p o t e n c i a l z e t a , s e e v a l u ó l a m i s m a a l í c u o t a m e d i a n t e e l u s o d e l a s m e d i c i o n e s p o r t r i p l i c a d o y u n a d e t e r m i n a c i ó n a u t o m á t i c a p o r p r o g r a m a i n f o r m á t i c o d e l a d u r a c i ó n d e l a m e d i c i ó n e n t r e 20 y 40 c o r r i d a s .
Cromatografía líquida de alta resolución
L a d e g r a d a c i ó n q u í m i c a d e e s c u a l e n o , D M P C y G L A s e c o n t r o l ó m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e a l t a r e s o l u c i ó n e n f a s e i n v e r s a ( R P - H P L C ) . S e u s a r o n u n A g i l e n t 1200 ( S a n t a C l a r a , C A ) y u n d e t e c t o r d e a e r o s o l c a r g a d o E S A B i o s c i e n c e s C o r o n a ( C A D ; C h e l m s f o r d , M A ) c o n u n a c o l u m n a W a t e r s A t l a n t i c s C 18 p m ( 4 , 6 m m x 250 m m ; M i l f o r d , M A ) . V e r F o x y o t r o s , 2008 , C o l l o i d s a n d S u f a c e s B: B i o i n t e r f a c e s , 65 : 98 - 105. L a f a s e m ó v i l A c o n t e n í a 75 : 15 : 10 ( v / v / v ) d e m e t a n o l : c l o r o f o r m o : a g u a y a c e t a t o d e a m o n i o 20 m M c o n á c i d o a c é t i c o a l 1 % y l a f a s e m ó v i l B c o n t e n í a 50 : 50 ( v / v ) d e m e t a n o l : c l o r o f o r m o c o n a c e t a t o d e a m o n i o 20 m M y á c i d o a c é t i c o a l 1 % . L a s m u e s t r a s s e p r e p a r a r o n m e d i a n t e l a d i l u c i ó n d e m u e s t r a s r e c o n s t i t u i d a s 1 : 20 e n l a f a s e m ó v i l B . S e u s ó u n a i n y e c c i ó n d e 9 p l c o n u n g r a d i e n t e l i n e a l d e l 100 % a l 10 % d e l a f a s e m ó v i l A d u r a n t e 45 m i n u t o s y l a t e m p e r a t u r a d e l a c o l u m n a d e 30 ° C . T o d o s l o s d i s o l v e n t e s u s a d o s f u e r o n d e c a l i d a d H P L C .
Selección de reconstitución
L a s f o r m u l a c i o n e s q u e c o n t e n í a n S E a l 2 % y c a d a u n a d e t r e h a l o s a , d e x t r o s a , l a c t o s a , m a l t o s a , s a c a r o s a , r a f i n o s a , m a n o s a , f r u c t o s a , l a c t u l o s a , r i b o s a , d e x t r a n o , P E G , m a n i t o l , e s t a q u i o s a , s o r b i t o l y p r o l i n a a l 5 % s e g e n e r a r o n c o m o s e d e s c r i b e e n 3.1. T a m b i é n s e g e n e r a r o n l a s f o r m u l a c i o n e s c o n á c i d o d i p i c o l í n i c o y á c i d o n i c o t í n i c o , p e r o s e f o r m u l a r o n a l 0 , 5 % d e b i d o a l i m i t a c i o n e s d e s o l u b i l i d a d . C a d a f o r m u l a c i ó n s e r e c o n s t i t u y ó c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e . L a s m u e s t r a s s e c a r a c t e r i z a r o n d e a c u e r d o c o n e l a s p e c t o d e l a t o r t a , l a f o r m a c i ó n d e c r e m a , e l t a m a ñ o d e p a r t í c u l a s , e l p o t e n c i a l z e t a , e l P d I y e l p H c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e .
Selección de estabilidad de la torta
L o s p u n t o s d e f u s i ó n d e u n s u b c o n j u n t o d e c o m p u e s t o s a l 5 % s e e v a l u a r o n c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e . E s t o s c o m p u e s t o s i n c l u í a n t r e h a l o s a , d e x t r o s a , l a c t o s a , m a l t o s a , s a c a r o s a , m a n o s a , f r u c t o s a , l a c t u l o s a , r a f i n o s a , r i b o s a , e s t a q u i o s a , m a n i t o l y p r o l i n a . C o m o e s t u d i o d e s e g u i m i e n t o , s e g e n e r a r o n l a s f o r m u l a c i o n e s q u e c o n t e n í a n t r e h a l o s a , d e x t r o s a , l a c t o s a , m a l t o s a o s a c a r o s a a l 5 % c o n m a n i t o l a l 0 , 2 o 5 % y S E a l 2 % . E s t a s f o r m u l a c i o n e s s e e v a l u a r o n d e a c u e r d o c o n l a f u s i ó n d e l a t o r t a , l a f o r m a c i ó n d e c r e m a , e l p H , e l P d I y e l t a m a ñ o d e p a r t í c u l a s , c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e .
Caracterización de estabilidad acelerada
L o s v i a l e s d e l a S E l i o f i l i z a d a e n t r e h a l o s a a l 5 % s e a l m a c e n a r o n a 25 , 37 , 50 , 60 y 90 ° C y s e r e c o n s t i t u y e r o n p e r i ó d i c a m e n t e d u r a n t e 1500 h o r a s o h a s t a q u e s e o b s e r v ó u n f a l l o c o m p l e t o . L a s m u e s t r a s s e c a r a c t e r i z a r o n p o r D L S , p H , H P L C y e l a s p e c t o d e l a t o r t a e n c a d a m o m e n t o . U n a S E n o l i o f i l i z a d a s e c a r a c t e r i z ó d e m a n e r a s i m i l a r p a r a l a c o m p a r a c i ó n . L a s f o r m u l a c i o n e s i d e n t i f i c a d a s p o r t e n e r a l t a s t e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n d e l a t o r t a s e s e l e c c i o n a r o n p a r a u n a c a r a c t e r i z a c i ó n d e e s t a b i l i d a d a c e l e r a d a a d i c i o n a l p a r a d e s a r r o l l a r u n s i s t e m a m á s e s t a b l e . L a s f o r m u l a c i o n e s i n c l u í a n d e x t r o s a , m a l t o s a , s a c a r o s a y t r e h a l o s a a l 5 % . T a m b i é n s e i n c l u y ó u n a f o r m u l a c i ó n e x p e r i m e n t a l q u e c o n t e n í a l a c t o s a a l 15 % . L a e s t a b i l i d a d a c e l e r a d a d e e s t a s f o r m u l a c i o n e s s e c a r a c t e r i z ó c o m o s e d e s c r i b i ó a n t e r i o r m e n t e a 90 ° C p a r a c a p t u r a r l o s c a m b i o s e n t o d a s e s t a s f o r m u l a c i o n e s .
Resultados
Liofilización de SE en trehalosa
Debido al amplio uso de la trehalosa en las formulaciones liofilizadas, se evaluó una formulación que contenía trehalosa para investigar la viabilidad de la liofilización de la emulsión. Después de la liofilización, las tortas que contenían SE de trehalosa al 5 % y escualeno al 2 % v/v produjeron una torta blanca ligeramente encogida con un contenido de humedad de 0,3 % p/p y buena solubilidad de reconstitución (Figura 1A). La emulsión reconstituida apareció visualmente similar a la formulación no liofilizada. Tras la reconstitución, se observó un aumento de 21 nm en el diámetro medio de partícula (Figura 1B), junto con un aumento de PdI de 0,02. La liofilización y la reconstitución no cambiaron el pH. Estos resultados proporcionaron una estimación inicial de que la emulsión se mantuvo después de la liofilización y la reconstitución.
Caracterización de estabilidad acelerada de SE en trehalosa
Después de la liofilización y la reconstitución exitosa de la SE en trehalosa, se evaluó la estabilidad de la SE liofilizada y no liofilizada para determinar si la liofilización mejoraba la estabilidad de la emulsión. En función del tamaño de partículas de la SE liofilizada reconstituida (Figura 2A) y el pH (Figura 2B), la formulación liofilizada fue más estable que la formulación líquida a 25 °C y 37 °C. No se observaron cambios significativos en la composición química de la SE liofilizada reconstituida o líquida a estas temperaturas. La liofilización también aumentó la estabilidad química de la emulsión a las temperaturas elevadas necesarias para inducir cambios de composición en la formulación líquida (Figura 2C). Específicamente, el a-tocoferol, el escualeno y la fosfatidilcolina derivada de huevo (PC-huevo) estaban todos protegidos en una formulación liofilizada en comparación con la formulación líquida. Además, no se detectó una fase oleosa separada, que sería indicativa de pérdida de aceite. Por lo tanto, debido a que el aceite no pareció redistribuirse dentro de este sistema o entrar en una fase diferente, las partículas permanecieron como emulsiones después de la reconstitución.
Determinación de un mecanismo de falla primario
Con el fin de avanzar en la estabilidad de la SE liofilizada más allá de la trehalosa, se realizó una investigación para determinar el mecanismo de falla primario, con la intención de seleccionar las formulaciones futuras que inhiban este mecanismo. La SE liofilizada se almacenó en un intervalo de temperaturas de 25, 37, 50, 60 y 90 °C durante hasta 1500 horas o hasta que las formulaciones fallaron más allá de los límites de la caracterización (Figura 3). La emulsión liofilizada fue mucho menos estable por encima de 50 °C. Los primeros cambios observados fueron el crecimiento del tamaño de partículas que se produjo al mismo tiempo (Figura 3A y Figura 3C) con la fusión de la torta. Los grandes cambios en el pH solo comenzaron a ocurrir una vez que las partículas habían fallado por el tamaño (Figura 3B) y, por lo tanto, no se consideró el mecanismo de falla principal. Por tanto, debido a que las concentraciones del componente de la emulsión (Figura 2C) y el pH (Figura 3B) no cambiaron primero, se asumió que el mecanismo no era de origen covalente. Sin embargo, la fusión de la torta se correlacionó directamente con el crecimiento del tamaño de partículas a lo largo del tiempo (Figura 3D). Dado que la fusión de la torta parece ocurrir más rápido que el crecimiento del tamaño de partículas, la resistencia de la torta a la fusión es un atributo crítico para mantener la estabilidad del tamaño de partículas de la emulsión en condiciones de estrés.
Selección de excipientes para reconstitución de SE
En función del supuesto mecanismo de falla, se llevó a cabo una selección de excipientes para identificar los compuestos que mantenían las características de la emulsión y eran resistentes a la fusión (Tabla 1, Figura 4). Los excipientes se agruparon en cuatro clases dependiendo de la estructura de la torta y el mantenimiento de las características de la emulsión después de la reconstitución. Los datos representativos de estas clases se muestran en la Figura 5.
Tabla 1. Comparación de las características de la formulación entre la SE de aceite al 2 % (v/v) reconstituida en las formulaciones al 5 % (p/v).
Figure imgf000045_0001
Los excipientes de la clase 1 formaron tortas blancas con una variedad de morfologías de torta y no cambiaron significativamente las características de las emulsiones después de la liofilización (Tabla 1, Figura 4A-B). Esta clase incluía trehalosa, dextrosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, manosa, fructosa y lactulosa. El tamaño de partículas de la emulsión reconstituida fue inferior a 200 nm, no se observó la formación de crema durante una hora y el PdI fue inferior a 0,25. Los potenciales zeta disminuyeron, de -9 mV a -15 a -25 mV. El pH varió de 5,4 a 6,2. El aspecto de la torta de la SE liofilizada en trehalosa al 5 %, una formulación representativa de la clase 1, fue aceptable a pesar de estar ligeramente encogida (Figura 5A). No se observó la formación de crema en 24 horas (Figura 5B) y las distribuciones de tamaño de partículas permanecieron homogéneas por debajo de 150 nm (Figura 5C).
La ribosa, un excipiente de la clase 2, no formó una torta cuando se liofilizó y en su lugar formó una película (Figura 5A), pero la emulsión pudo reconstituirse con un tamaño de partículas, PdI, potencial zeta y pH aceptables (Tabla 1, Figura 4A-B).
Los excipientes de la clase 3 formaron buenas tortas, pero afectaron la emulsión después de la reconstitución (Tabla 1, Figura 4 y Figura 5). Los tamaños de partículas reconstituidos estuvieron por encima de 200 nm y los valores de PdI fueron grandes, entre 0,59 y 0,93. El pH y consecuentemente el potencial zeta variaron ampliamente dentro de este grupo. El gran cambio de pH observado para las formulaciones que contienen PEG y manitol se produjo durante la liofilización. El pH previo a la liofilización se ajustó a 5,5. Como era de esperar por el gran tamaño de partículas y la alta polidispersidad, los excipientes de la clase 3 provocaron la formación de crema después de la reconstitución (Tabla 1, Figura 5B).
Los excipientes de la clase 4 no formaron tortas y afectaron la emulsión de la misma manera que los compuestos de la clase 3, aunque en lugar de la formación de crema, estas formulaciones no se reconstituyeron completamente (Tabla 1, Figura 4 y Figura 5). Cada uno de estos excipientes dio como resultado partículas de SE grandes con valores altos de PdI y valores de pH entre 4,3 y 5,1. El ácido dipicolínico y el ácido nicotínico eran bastante insolubles en agua, lo que significa que estas formulaciones se generaron al 10 % de la concentración en masa de las otras formulaciones. Esto puede haber sido un factor que contribuyó al mantenimiento deficiente de la emulsión con estos excipientes.
Selección estructural de un solo excipiente para la termoestabilidad de la torta
Después de identificar los excipientes de liofilización alternativos, se evaluó la termoestabilidad de la torta para una selección de excipientes formadores de torta. Esto se empleó como un método para identificar los excipientes con puntos de fusión más altos y mayor resistencia a la fusión (Tabla 2). Los excipientes de la clase 1 tuvieron los puntos de inicio más bajos que van desde instantáneo, es decir, a la temperatura inicial de 27 °C o por debajo de ella, hasta 78 °C. Los puntos medios de fusión variaron de 36 °C a 94 °C. Los excipientes de la clase 3 tenían puntos de inicio por encima de 90 °C y todos tenían puntos medios de fusión por encima de 100 °C. El manitol demostró la mayor estabilidad de la torta, con un intervalo de punto de fusión estrecho centrado en 160,1 °C. Los termogramas de fusión de la torta representativos se muestran en la Figura 6A. La comparación de los excipientes en función de los puntos de inicio y fusión de la torta se muestra en la Figura 6B. Los azúcares monoméricos parecían tener puntos de fusión mucho más bajos que los excipientes de azúcares poliméricos.
Tabla 2. Comparación de las características de fusión de la torta entre SE de aceite al 2 % (v/v) en las formulaciones al 5 % (p/v).
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Impacto de la termoestabilidad de la torta en la estabilidad de la formulación
Para evaluar la correlación entre el punto de fusión de la torta y la estabilidad térmica, se evaluaron a 90 °C las tasas de crecimiento del tamaño de partículas para la SE en varios azúcares con diferentes puntos de fusión. Se investigó la diferencia de estabilidad entre las formulaciones al 5 % de dextrosa, sacarosa, maltosa, trehalosa y una formulación de lactosa al 15 % con puntos de fusión muy diferentes (Figura 7). Se identificó que una formulación de lactosa al 15 % tenía un punto de fusión más alto que la lactosa al 5 % y se seleccionó porque su punto de fusión estaba muy por encima de la temperatura de almacenamiento en estrés de 90 °C. Se observó que la dextrosa tenía el punto de fusión más bajo y experimentó el crecimiento del tamaño de partículas más rápido (Figura 7A). La sacarosa, la maltosa y la trehalosa tenían puntos de fusión intermedios y experimentaron tasas de fusión intermedias. A medida que aumentaron los puntos de fusión de la torta entre las formulaciones, este crecimiento del tamaño de partículas disminuyó, la lactosa al 15 % tiene el punto de fusión más alto y la tasa de crecimiento del tamaño de partículas más baja. Además, se observó una bifurcación en la tasa de crecimiento de las partículas (Figura 7B) entre las muestras con tm por encima y por debajo de la temperatura de almacenamiento, lo que proporciona evidencia adicional de que la fusión de la torta fue el mecanismo primario de falla por degradación térmica.
Selección de la combinación de excipientes para la termoestabilidad de la torta
Debido a la observación de que el manitol aumentó la termoestabilidad de la torta (Tabla 2), se combinaron varios excipientes de la clase 1 con manitol en un intento de generar formulaciones que mantuvieran las emulsiones, pero que tuvieran una estabilidad de la torta superior (Tabla 3, Figura 8) . Los excipientes de la clase 1 redujeron el crecimiento del tamaño de partículas de la emulsión en presencia de manitol. La adición de manitol al 0,2 % p/v no aumentó el tamaño de partículas ni la Tm. El manitol al 5 % p/v aumentó en gran medida la Tm de la torta pero también aumentó el tamaño de partículas de la emulsión y el PdI, y al mismo tiempo disminuyó el pH.
Tabla 3. Comparación de las características de la torta entre SE de aceite al 2 % (v/v) en las formulaciones al 5 % (p/v) con manitol al 0,2 % o al 0,5 % (p/v).
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Ejemplo 2: Estabilidad de las vacunas con adyuvante liofilizadas contra la tuberculosis
La única vacuna aprobada para la tuberculosis (TB), Bacillus Calmette-Guérin (BCG), se usó por primera vez en humanos en 1921 y ha sido eficaz para reducir la incidencia de la TB diseminada en niños. Sin embargo, BCG ha demostrado ser ineficaz para prevenir la TB pulmonar en adolescentes y adultos (Checkley y otros, 2011, Trends Pharmacol Sci, 32:601-606; Rowland y otros, 2011, Expert Rev Vaccines, 10:645-658; Anderson y otros, 2005, Nat Rev Microbiol, 3:656-662). El modelo matemático del impacto de la implementación de una nueva vacuna hipotética contra la TB con una eficacia del 60 % predice una caída del 80 % en la incidencia para el año 2050 (Abu-Raddad y otros, 2009, PNAS, 106:13980-13985). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una nueva vacuna contra la t B para estimular la inmunidad preparada por BCG o reemplazar a BCG. La inmunidad protectora contra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) requiere la producción de t Nf e IFN-y por los linfocitos T CD4 (Flynn y otros, 2001, Annu Rev Immunol, 19:93-129; Cooper A.M., Annu Rev Immunol; 27:393-422). Se ha desarrollado un antígeno de proteína de fusión recombinante que consiste en cuatro proteínas Mtb, Rv3619, Rv1813, Rv3260 y RV2608, denominado ID93. Estas proteínas componentes se identificaron como reconocidas por los linfocitos T humanos de donantes infectados con TB o inmunizados con BCG y protegen contra la exposición a Mtb en modelos de ratón y cobaya cuando se combinan con un adyuvante (Bertholet y otros, 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74; Bertholet y otros, 2008, J Immunol, 181:7948-7947) que induce respuestas de TH1 robustas, como el adyuvante de glucopiranosil lípido agonista de TLR4 sintético formulado en una emulsión estable de escualeno en agua (GLA-SE). ID93+GLA-SE se está sometiendo actualmente a pruebas de seguridad de fase I en voluntarios humanos.
Tanto ID93 como GLA-SE se mantuvieron estables durante más de un año cuando se almacenaron bajo mantenimiento continuo de la cadena de frío. En estas condiciones, no se observaron cambios en la concentración de proteína, concentración de GLA, tamaño de partículas o aspecto físico. Las observaciones de la estabilidad estaban en curso sin un tiempo estimado de degradación a 4 °C. Aunque la estabilidad de ID93+GLA-SE estaba a la par con otras vacunas, se deseaba un aumento en la termoestabilidad de la vacuna para disminuir el requisito de mantenimiento continuo de la cadena de frío. Un enfoque para mejorar la estabilidad de la vacuna a temperaturas elevadas fue liofilizar el componente antigénico de la vacuna, que luego se mezcla con el adyuvante en el momento de su uso. Sin embargo, esto requirió el mantenimiento de la cadena de frío para el adyuvante y aumentó la carga tecnológica de la vacunación. Para superar este problema, se desarrolló un solo vial tanto del antígeno ID93 como del adyuvante GLA-SE (denominado "vial conjunto").
Materiales y métodos
Preparación y liofilización de muestras
La construcción, la expresión y la purificación de la proteína de fusión en tándem ID93 que contiene los genes Mtb Rv3619, Rv1813, Rv3620 y Rv2608 se han descrito previamente (Bertholet y otros, 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74). Brevemente, la proteína de fusión ID93 se expresó en E. coli, se purificó en condiciones desnaturalizantes mediante cromatografía en columnas DEAE y Q Sepharose, y se analizó mediante SDS-PAGE en un gel de glicina Tris al 4-20 % (Invitrogen). El GLA (también conocido como PHAD) se adquirió de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). El GLA-SE que contiene 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) se formuló de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Orr y otros, 2013 J Control Release 172:190-200; Anderson y otros, 2010 Colloids Surf B: Biointerfaces 75:123-32). Brevemente, las emulsiones de GLA-SE se produjeron al mezclar una fase acuosa amortiguada (poloxámero 188 y glicerol en amortiguador de fosfato de amonio pH 5,1) y una fase oleosa (DMPC y GLA dispersos en escualeno por sonicación a 70 °C) y luego al microfluidizar la mezcla mediante el uso del Microfluidics M110P (Newton, MA) para 12 pasadas a 30000 psi. Las concentraciones de los componentes en las emulsiones consistieron en escualeno al 10 % v/v, fosfatidilcolina al 1,9 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, glicerol al 2,3 % p/v y amortiguador fosfato de amonio 25 mM. El GLA-SE se diluyó a las concentraciones especificadas para su uso.
Para el análisis de la vacuna con adyuvante GLA-SE, se prepararon muestras líquidas y liofilizadas con volúmenes de llenado de 1,5 ml en viales de vidrio de 3 ml. Se prepararon muestras de vial conjunto que contenían ID93 (5 pg/ml) GLA-SE (50 pg/ml, 2 % de aceite total) en trometamina (Tris) 20 mM a pH 8,0 (Coler y otros, 2011, PLoS One, 6, e16333). Se prepararon viales separados de ID93 o GLA-SE al doble de la concentración de las muestras de vial conjunto (10 pg/ml de ID93 o 100 pg/ml de GLA, 4 % de GLA-SE de aceite total) y se mezclaron 1:1 antes de la inyección. Las muestras para SDS-PAGE se prepararon a 100 pg/ml de ID93 para facilitar el análisis. Las muestras liofilizadas también contenían D-trehalosa deshidratada al 5 % (p/v) como estabilizador y se liofilizaron mediante el uso de un liofilizador de mesa VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85. La receta de liofilización usó un programa de tratamiento térmico que incluía una etapa de congelación de 10 horas de 4 a -40 °C y una etapa de recocido a -15 °C. La fase primaria de secado (a 100 mTorr) duró 18 horas desde -40 °C a 25 °C. Finalmente, se empleó una fase secundaria de secado a 50 mTorr a 25 °C durante 9 horas. Todas las muestras se taparon con gas atmosférico a 500 mTorr, se sellaron mediante el uso de tapas de aluminio y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Las muestras sometidas a estrés por calor se incubaron a 50 °C durante 30 días y las muestras sin estrés se almacenaron a 4 °C antes de la inyección.
Para el análisis de la vacuna con adyuvante SLA-SE, las muestras liofilizadas se prepararon con volúmenes de llenado de 1,5 ml en viales de vidrio de 3 ml. Se prepararon muestras de vial conjunto que contenían SE de aceite al 2 % (v/v), 50 pg/ml de SLA, 100 pg/ml de ID93, Tris 20 mM pH 8,0 y trehalosa al 5 % (p/v). Las muestras se liofilizaron mediante el uso de un liofilizador de mesa VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85. La receta de liofilización usó un programa de tratamiento térmico que incluía una etapa de congelación de 10 horas de 4 a -40 °C y una etapa de recocido a -15 °C. La fase primaria de secado (a 100 mTorr) duró 18 horas desde -40 °C a 25 °C. Finalmente, se empleó una fase secundaria de secado a 50 mTorr a 25 °C durante 9 horas. Todas las muestras se taparon con gas atmosférico a 500 mTorr, se sellaron mediante el uso de tapas de aluminio y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Las muestras sometidas a estrés por calor se incubaron a 50 °C durante 30 días y las muestras sin estrés se almacenaron a 4 °C. Se caracterizaron los viales por duplicado (indicados A y B). La reconstitución de la muestra se realizó con 1,5 ml de H2O filtrada.
SDS-PAGE reductora
La SDS-PAGE reductora se realizó mediante el uso de un amortiguador de muestras NuPAGE LDS de Life Technologies (Grand Island, NY), con p-mercaptoetanol al 1,25 % añadido, y se incubó a 90 °C durante 15 minutos. Las muestras se procesaron a 180 V durante 65 minutos mediante el uso de 1 pg de ID93 por carril en casetes de gel prefabricados de tris-glicina de acrilamida al 4-20 % Novex de Life Technologies. Los geles se tiñeron durante la noche mediante el uso de SimplyBlue SafeStain de Life Technologies antes de decolorar, secar y obtener las imágenes. Las intensidades de las bandas se compararon mediante el uso del programa informático ImageJ (NIH) (Schneider y otros, 2012, Nat Methods, 9:671-675.
Análisis de partículas
Las medidas de tamaño de partículas, polidispersidad y potencial zeta se realizaron como se describió anteriormente (Fox y otros, 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105) mediante el uso de un Nano-ZS de Malvern (Worcestershire, Reino Unido) después de una dilución 100 veces en agua ultrapura filtrada a través de un filtro Whatman (Maidstone, Kent, Reino Unido) de 20 nm Anotop plus. El análisis de seguimiento de las nanopartículas se realizó con un NanoSight LM10 (Amesbury, Reino Unido) con un láser de 405 nm y una cámara Hamamatsu Orca Flash 2.8 CMOS (Hamamatsu, JP). Las muestras se diluyeron 1:105 en agua ultrapura filtrada a 20 nm en tres etapas. Cada muestra se diluyó y se analizó cuatro veces, de forma independiente, para tener en cuenta el error de dilución. Se grabaron noventa segundos de video para cada muestra con ajustes de ganancia y obturador optimizados. La compuerta del histograma de la cámara se ajustó para maximizar la sensibilidad. El análisis de los datos se realizó mediante el uso del programa informático NanoSight NTA 2.3 (Wiltshire, Reino Unido) en modo estándar.
Integridad química del adyuvante
Las concentraciones de escualeno, DMPC, GLA y SLA se controlaron mediante el uso de HPLC de fase inversa (RP-HPLC) como se describió anteriormente (Fox y otros, 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105).
Se usaron un Agilent 1200 (Santa Clara, CA) y un detector de aerosol cargado ESA Biosciences Corona (CAD; Chelmsford, MA) con una columna Waters (Milford, MA) Atlantics C18 de 5 pm (4,6 mm x 250 mm). La fase móvil A contenía 75:15:10 (v/v/v) de metanol, cloroformo y agua con acetato de amonio 20 mM y ácido acético al 1 %. La fase móvil B contenía metanol y cloroformo 50:50 (v/v), acetato de amonio 20 mM y ácido acético al 1 %. Las muestras se prepararon mediante dilución (1:20) en la fase móvil B, se inyectaron 9 pl en una columna a 30 °C y se usó la elución con un gradiente de 100 % a 10 % de fase móvil A durante 45 minutos. Las curvas estándar se ajustaron con un polinomio de segundo orden, según lo recomendado por el fabricante del detector, y las concentraciones de la muestra se determinaron por interpolación.
Animales e inmunizaciones
Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra de 6-8 semanas de edad de Charles River y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Después de la infección, los animales se mantuvieron en contención de nivel 3 de bioseguridad animal. Los ratones se inmunizaron tres veces con tres semanas de diferencia mediante inyección intramuscular de 100 pl de la preparación de la vacuna indicada. Para la inmunización con BCG, se inyectaron 5x104 CFU (cepa Pasteur, Sanofi Pasteur) intradérmicamente una vez en el momento de la primera inmunización de subunidades.
Recuentos de células sanguíneas
Se recogió la sangre periférica de los ratones (N=5/grupo) dieciocho horas después de la inmunización. La sangre completa se tiñó para CD90.2 (clon 53-2.1) y CD19 (clon 6D5). Se añadieron partículas Sphero AccuCount Rainbow (Spherotech, Lake Forest, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS. Se recogieron hasta 106 eventos en un citómetro de flujo LSRFortessa de cuatro láseres (BD Biosciences). Los datos se analizaron con FlowJo. Se calcularon los números absolutos de linfocitos B CD19+ y linfocitos T CD90.2+ por microlitro de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Respuestas de anticuerpos
Se prepararon sueros de ratón (N=5/grupo) 21 días después de la inmunización mediante la recogida de sangre retroorbital en tubos de recogida de suero microtainer (VWR International, West Chester, PA), seguido de centrifugación. A continuación, cada muestra de suero se analizó mediante ELISA de captura de anticuerpos. Brevemente, se recubrieron placas de ELISA (Nunc, Rochester, NY) con 1 pg/ml de antígeno recombinante en amortiguador de bicarbonato 0,1 M y se bloquearon con BSA-PBS al 1 %. Luego, en orden consecutivo y después de lavados en PBS/Tween20, se añadieron a las placas las muestras de suero diluidas en serie, anti- IgG de ratón, IgG1 o IgG2c-HRP (todos de Southern Biotech, Birmingham, AL) y ABTS-H2O2 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las placas se analizaron a 405 nm (ELX808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT).
Tinción de citocinas intracelulares
Un mes después de la inmunización final, se aislaron los esplenocitos de cinco animales por grupo. Los glóbulos rojos se lisaron mediante el uso del amortiguador de lisis de glóbulos rojos (eBioscience) y se resuspendieron en RPMI 1640 y FBS al 10 %. Las células se sembraron en placas a 2x106 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se estimularon durante 1 hora con medio o ID93 (10 pg/ml) a 37 °C. Se añadió GolgiPlug (BD Biosciences) y las células se incubaron durante 7 horas más a 37 °C. Las células se lavaron y se tiñeron en la superficie con anticuerpos marcados con fluorocromo para CD4 (clon GK1.5), CD8 (clon 53-6. 7) y CD44 (clon IM7) (BioLegend y eBioscience) en presencia de anticuerpos contra CD16/32 (clon 2.4G2) durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron y se permeabilizaron con Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con Perm/Wash (BD Biosciences) y se tiñeron intracelularmente con anticuerpos marcados con fluorocromo para IFN-y (clon XMG-1.2), IL-2 (JES6-5H4), TNF (MP6-XT22), CD154 (clon MR1), IL-5 (clon TRFK5) e IL-17A (clon TC11-18H10.1) (BioLegend y eBioscience) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS. Se recogieron hasta 106 eventos en un citómetro de flujo LSRFortessa de cuatro láseres (BD Biosciences). Los datos se analizaron con FlowJo. Las células se seleccionaron como singletes > linfocitos > CD4+ CD8-> CD44+ > citocinas positivas.
Exposición y enumeración de aerosoles de M. tuberculosis
Cuatro semanas después de la última inmunización, los ratones (n = 7/grupo) se infectaron aerogénicamente con M. tuberculosis H37Rv (ATCC No. 35718; American Type Culture Collection) mediante el uso de un generador de aerosoles GlasCol calibrado para administrar 50-100 bacterias a los pulmones. Para confirmar la cantidad de bacterias liberadas, se sacrificaron tres animales no inmunizados adicionales por infección un día después y se enumeró la carga bacteriana en los pulmones. La protección se determinó tres semanas después de la exposición mediante la recolección de los pulmones de los ratones infectados al homogeneizar el tejido en PBS-Tween 80 al 0,1 % y colocar en placas de agar 7H10 diluciones seriadas de 5 veces (Molecular Toxicology) para el crecimiento bacteriano. Las colonias bacterianas se contaron después de la incubación a 37 °C con 5 % de CO2 durante 14-21 días.
Métodos de estadística
Las cargas bacterianas se normalizaron mediante la transformación de log 10. La significación estadística de las diferencias en las cargas bacterianas, la producción de citocinas, el recuento de células sanguíneas y los títulos de anticuerpos se determinaron mediante el uso de un análisis de varianza de una vía con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni mediante el uso de Prism 5 (programa informático GraphPad).
Resultados
Caracterización fisicoquímica de la formulación de vacuna con adyuvante GLA-SE
Se desarrolló un régimen de liofilización para esta vacuna con adyuvante de vial conjunto. Tras la liofilización, se formó una torta blanca parcialmente encogida y, después de la reconstitución con agua, la emulsión se reformó y pareció similar a la emulsión preliofilizada (Figura 9, fila superior). El potencial para aumentar la estabilidad al estrés por calor mediante la liofilización se evaluó al incubar ID93+GLA-SE líquido o liofilizado a 50 °C durante 30 días. Después del estrés por calor, no se observó ningún cambio visible en la calidad de la muestra (Figura 9, fila inferior) en comparación con la muestra sin estrés (Figura 9, fila superior). Las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión y las tortas liofilizadas no mostraron más signos de colapso o decoloración.
Las características de las partículas son fundamentales para el desarrollo eficaz de una vacuna, ya que el tamaño de partículas determina la velocidad y el mecanismo del tráfico de vacunas in vivo. Es conveniente mantener un tamaño de partículas por debajo de 200 nm para permitir la filtración estéril terminal del producto; además, los tamaños de partículas <200 nm pueden acceder rápidamente al ganglio linfático (Bachmann y otros, 2010, Nature Rev Immunol, 10:787-796). Para evaluar si el vial conjunto o la liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE de vial conjunto alteraron las propiedades biofísicas del tamaño de partículas, la concentración, la polidispersidad y el potencial zeta general de ID93, se evaluaron GLA-SE, ID93+GLA-SE de vial conjunto y ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado. Las características de las partículas medidas después de la mezcla reflejaban principalmente la contribución de GLA-SE debido a la concentración de las partículas de cinco órdenes de magnitud más alta en comparación con ID93. El vial conjunto de ID93 y GLA-SE no afectó al tamaño de partículas en relación con GLA-SE solo (80 nm en ambos casos) (Figura 10A). La liofilización y la posterior reconstitución de ID93+GLA-SE dieron como resultado un aumento menor de aproximadamente 10 nm, dentro del error de la medición. ID93 formó agregados polidispersos con un diámetro promedio Z de aproximadamente 70 nm. El estrés por calor de ID93 solo redujo el tamaño de partículas promedio observado; sin embargo, esto no fue estadísticamente significativo (p> 0,05) (Figura 10A). El estrés por calor de GLA-SE solo o en combinación con ID93 no afectó al tamaño de partículas ni a la concentración en ninguna de las plataformas ensayadas (Figura 10A y Figura 10D). El GLA-SE fue una solución muy homogénea como se refleja por el bajo valor de polidispersidad (Figura 10B). Aunque el grado de polidispersidad observado para ID93 fue mucho mayor, la mezcla de ID93 y GLA-SE retuvo la característica general de baja polidispersidad de GLA-SE, lo que refleja las proporciones relativas de partículas de ID93 y GLA-SE. Es importante destacar que ID93+GLA-SE liofilizada y reconstituida retuvo este tamaño de partículas uniforme. La exposición al estrés por calor no afectó la polidispersidad de ID93, GLA-SE o ID93+GLA-SE de vial conjunto en formatos líquidos o liofilizados. Tanto ID93 como GLA-SE tienen un potencial zeta negativo general en la configuración actual. La mezcla de los dos dio como resultado un potencial zeta medio de -13 mV, que no se vio afectado por la liofilización (Figura 10C). Tras el estrés por calor, se observó un potencial zeta más negativo para todas las muestras que contenían GLA-SE; sin embargo, este cambio sólo fue estadísticamente significativo para ID93+GLA_SE liofilizada (p<0,025). La liofilización y la reconstitución global de ID93+GLA-SE no altera las características fisicoquímicas en comparación con ID93+GLA-SE sin liofilizar. Las características fisicoquímicas de ID93, pero no GLA-SE, se vieron afectadas significativamente por la exposición a temperaturas elevadas durante un tiempo prolongado.
Para valuar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectaron la integridad química de ID93+GLA-SE, se evaluaron la concentración de ID93 mediante SDS PAGE y GLA, y las concentraciones de escualeno y DMPC (los dos últimos fueron los componentes principales de la emulsión estable) mediante RP-HPLC. Las muestras que contenían 100 pg/ml de ID93 se evaluaron debido a la incapacidad de detectar ID93 a 5 pg/ml por SDS-PAGE. Se encontró que las muestras de vial conjunto que contienen 100 pg/ml y 5 pg/ml de ID93 se comportan de manera similar en términos del tamaño de partículas, la concentración de las partículas, el potencial zeta y los perfiles de degradación de GLA en condiciones líquidas, liofilizadas y de estrés por calor. El GLA-SE se ejecutó como un frotis difuso, probablemente debido a la afectación de las partículas de emulsión por SDS, y fue visible después de la tinción. La liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE de vial conjunto dio como resultado una disminución del 5-10 % en la concentración de ID93, esperada debido a la dilución tras la reconstitución, lo que indica que no se había producido una hidrólisis sustancial de ID93 (Figura 11). Tras la exposición al estrés por calor a 50 °C durante un mes, hubo una reducción drástica en el ID93 presente en ID93+GLA-SE. La liofilización de ID93+GLA-SE hizo que la proteína fuera resistente a esta degradación con un 6 % y un 90 % de la intensidad de la banda de ID93 observada después del estrés por calor para las muestras líquidas y liofilizadas, en relación con las muestras sin estrés respectivamente (Figura 11). Por tanto, la liofilización de ID93+GLA-SE protegió a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor.
Como se esperaba, después de mezclar GLA-SE 1:1 con ID93, se midió aproximadamente la mitad de la concentración original de GLA, DMPC y escualeno, y no se perdió material después de la liofilización y la reconstitución (Figura 12A). La exposición de GLA-SE líquido al estrés por calor provocó una pérdida del 50 % de la concentración de GLA (p <0,001). Esto se vio exacerbado por el vial conjunto con ID93 hasta el punto de que no hubo GLA detectable después del estrés por calor (Figura 12a ). Esta susceptibilidad mejorada puede deberse al pH más básico de ID93+GLA-SE de vial conjunto en comparación con el GLA-SE solo. Esta pérdida de GLA se mejoró mediante la liofilización de ID93+GLA-SE de vial conjunto, con ~50 % de GLA recuperada después de la reconstitución de ID93+GLA-SE liofilizado sometido a estrés por calor (figura 12D). El GLA fue el principal componente termolábil de GLA-SE ya que ni la concentración de DMPC ni de escualeno se vieron afectados por el estrés por calor (Figura 12B-D). Tomados en conjunto, estos datos mostraron que los dos componentes activos de ID93+GLA-SE estaban protegidos de la degradación inducida por calor por liofilización.
En general, la liofilización de ID93+GLA-SE dio como resultado una torta de color blanco a blanquecino que retuvo las propiedades químicas y biofísicas de ID93+GLA-SE de vial conjunto tras la reconstitución. La exposición de ID93+GLA-SE al estrés por calor dio como resultado una pérdida significativa tanto de ID93 como de GLA. La liofilización de ID93+GLA-SE de vial conjunto mejoró en gran medida estas pérdidas debido al estrés por calor, lo que indica que este enfoque podría reducir o eliminar la necesidad de mantener la cadena de frío de este candidato vacunal.
Inmunogenicidad de la vacuna y eficacia de la formulación de la vacuna con adyuvante GLA-SE
Para determinar cómo el estrés por calor afectó la actividad biológica de ID93+GLA-SE y si la liofilización mejoró los efectos perjudiciales, los ratones se inmunizaron con solución salina o ID93+GLA-SE que se almacenó como viales separados de antígeno líquido y adyuvante (líquido), un mezcla de antígeno y adyuvante (de vial conjunto líquido) o antígeno coliofilizado y adyuvante (de vial conjunto lio). El material de inmunización se almacenó a 4 °C (es decir, sin estrés) o 50 °C (es decir, sometido a estrés por calor) durante un mes antes de la inmunización. Después de la inmunización, hubo una pérdida transitoria de linfocitos B y T circulantes de la sangre, ya que estas células se dirigieron al ganglio linfático de drenaje donde encontraron el antígeno (Shiow y otros, 2006, Nature, 440:540-544). Esta linfopenia transitoria se ha denominado parada de los ganglios linfáticos, ya que los linfocitos quedan atrapados transitoriamente en el ganglio linfático en un proceso necesario para las interacciones eficientes entre las células presentadoras de antígenos y los linfocitos afines. El adyuvante GLA-SE aumentó este efecto, lo que puede explicar en parte su excelente actividad adyuvante. La inmunización con ID93+GLA-SE líquido sin estrés provocó una pérdida dramática de linfocitos B y T de la sangre (Figura 13A). El estrés en el ID93+GLA-SE líquido a 50 °C durante un mes redujo este efecto, lo que sugiere que la actividad de GLA se vio afectada por el estrés por calor. El ID93+GLA-SE de vial conjunto líquido sin estrés indujo el cierre de los ganglios linfáticos tan eficientemente como la vacuna líquida; sin embargo, este material de vial conjunto líquido se vio más afectado por el estrés por calor, ya que el grado de cierre de los ganglios linfáticos se redujo notablemente, probablemente como reflejo de la pérdida de GLA detectable (Figura 13A). El ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado provocó linfopenia transitoria en un grado similar al del material líquido, sin embargo, a diferencia del material de vial conjunto líquido, este efecto no se vio afectado por el estrés por calor de la vacuna de vial conjunto liofilizada. Estos datos sugirieron que la actividad biológica del adyuvante GLA-SE era susceptible al estrés por calor y esto se exacerbó por el vial conjunto con el antígeno ID93. Es importante destacar que la liofilización hizo que el ID93+GLA-SE de vial conjunto fuera resistente a los daños del estrés por calor, según se lee en este parámetro.
Para examinar más a fondo los impactos del estrés por calor y la liofilización sobre la actividad biológica de ID93+GLA-SE, se evaluaron los títulos de anticuerpos específicos de ID93 después de la inmunización. La inmunización con ID93+GLA-SE provocó una respuesta mixta de IgG1, IgG2c que está sesgada hacia la producción de IgG2c. Esto reflejaba las respuestas de linfocitos T CD4 dominadas por IFN-y producidas por ID93+GLA-SE. La exposición al estrés por calor afectó significativamente la capacidad del líquido ID93+GLA-SE para provocar títulos de anticuerpos medibles (Figura 13B). Esto probablemente se debió a la degradación de la proteína ID93 por estrés por calor (Figura 11). Aunque el vial conjunto de ID93+GLA-SE no alteró la magnitud de la respuesta de anticuerpos cuando la vacuna se almacenó a 4 °C, esto no fue suficiente para evitar la pérdida del potencial de inducción de anticuerpos provocada por el estrés por calor. Por el contrario, el ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado provocó respuestas de anticuerpos robustas de magnitud similar e IgG1/IgG2c sesgadas al material líquido sin estrés y esto no se vio afectado por el estrés por calor (Figura 13B).
El ID93+GLA-SE protegió contra M. tuberculosis al inducir linfocitos T CD4 específicos de ID93 que producían IFN-y, TNF e IL-2 (es decir, linfocitos TH1). La exposición al estrés por calor redujo la frecuencia de linfocitos TH1 específicos de ID93 medida por la producción de cualquiera de estas citocinas en casi un 50 % después de la tercera inmunización con ID93+GLA-SE líquido (Figura 13C). El hecho de que la respuesta de TH1 al ID93+GLA-SE líquido sometido a estrés se mantuviera a pesar de la degradación de la proteína ID93 probablemente reflejaba la presencia de péptidos inmunogénicos y GLA residual después de la exposición al calor. El vial conjunto de ID93+GLA-SE líquido mejoró ligeramente la magnitud de la respuesta de TH1 cuando se almacenó a 4 °C, sin embargo, la exposición al estrés por calor anuló por completo la capacidad de ID93+GLA-SE sin vial conjunto líquido para provocar dicha respuesta. El ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado indujo respuestas de TH1 a un nivel similar al producido con ID93+GLA-SE líquido. Críticamente, a diferencia de ID93+GLA-SE de vial conjunto líquido o diferente de líquido, el ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado retuvo completamente la capacidad de provocar linfocitos TH1 específicos de ID93 después del estrés por calor (Figura 13C). Se determinó previamente que los linfocitos T CD4 específicos de ID93 que provocaron la inmunización con ID93+GLA-SE nativo son exclusivamente linfocitos TH1, que no producen IL-5 (TH2) o IL-17 (TH17) tras la estimulación nuevamente (Orr y otros, 2013, Eur J Immunol.). El vial conjunto, la liofilización y/o la exposición al estrés por calor no potenciaron la inducción de linfocitos TH2 o TH17 por ID93+GLA-SE medida por la producción detectable de IL-5 o IL-17. Se ha propuesto que la producción de CD154 después de la estimulación es un marcador generalizado de la activación de los linfocitos T c D4 independientemente de la producción de citocinas (Frentsch y otros, 2005, Nat Med, 11:1118:1124). En todos los casos, los niveles de expresión de CD154 reflejaban estrechamente los de IFN-y y TNF, lo que indica además que no hubo desviación de la programación de TH1. En general, la salida de linfocitos de deterioro temprano de la sangre (Figura 13A) se correlacionó fuertemente con la pérdida subsiguiente tanto del anticuerpo (Figura 13B) como de la respuesta de linfocitos T CD4 (Figura 13C) a la vacuna ID93+GLA-SE.
Para evaluar cómo el estrés por calor, el vial conjunto y la liofilización afectaron la eficacia protectora de ID93+GLA-SE, los ratones inmunizados se expusieron a una dosis baja de M. tuberculosis en aerosol. Tres semanas más tarde, los animales inmunizados con ID93+GLA-SE líquido estaban significativamente protegidos contra M. tuberculosis en relación con los animales inmunizados con solución salina, medido por la reducción de las cargas bacterianas en los pulmones y el bazo (Figura 14A y Figura 14B). El ID93+GLA-SE líquido sometido a estrés por calor por separado no perjudicó esta eficacia protectora, probablemente refleja la respuesta de TH1 específica de ID93 residual provocada por esta inmunización (Figura 13C). El vial conjunto de ID93+GLA-SE no afectó la eficacia protectora cuando se almacenó a 4 °C, pero la vacuna de vial conjunto líquida perdió toda la eficacia protectora cuando se expuso al estrés por calor. La liofilización del ID93+GLA-SE de vial conjunto mantuvo la eficacia protectora y, lo que es más importante, la liofilización de ID93+GLA-SE anuló la pérdida de eficacia protectora debida al estrés por calor (Figura 14A y Figura 14B).
La coliofilización y la reconstitución del antígeno y el adyuvante de la nanoemulsión no alteraron significativamente las características fisicoquímicas de la vacuna. Tras la reconstitución, las concentraciones tanto del antígeno como del GLA agonista de TLR4, así como también el aceite de escualeno, no fueron sustancialmente diferentes de las del material de partida. La exposición prolongada al estrés por calor tuvo poco efecto sobre las características físicas de la vacuna de vial conjunto líquida o coliofilizada; sin embargo, la exposición al calor condujo a la degradación química tanto del antígeno como del agonista de TLR4, pero no del escualeno o los componentes fosfolípidos del adyuvante. La coliofilización protegió parcialmente contra esta pérdida de agonista de TLR4.
La pérdida de GLA debido al estrés por calor fue un fuerte predictor de las respuestas inmunitarias deterioradas y la eficacia protectora de la vacuna cuando se administró a los animales de experimentación. Aunque esta relación no fue completamente lineal, la reducción de GLA en las muestras líquidas dio como resultado una disminución de las frecuencias de linfocitos T CD4 específicas de ID93 después de la inmunización. La pérdida completa de GLA en el ID93+GLA-SE de vial conjunto líquido sometido a estrés por calor coincidió con la pérdida de la inducción de linfocitos T CD4. Por el contrario, la degradación de la proteína ID93 en las muestras líquidas tuvo poco impacto en la magnitud de la respuesta de los linfocitos T CD4. Sin desear estar unido a la teoría, esto probablemente puede atribuirse a la retención de los péptidos inmunodominantes necesarios para cebar la respuesta de los linfocitos T en las muestras sometidas a estrés por calor. Por otro lado, la degradación de ID93 inducida por calor afectó significativamente la magnitud de la respuesta del anticuerpo a la vacuna. Muchos de los anticuerpos específicos de ID93 pueden ser conformacionalmente dependientes. Además, la respuesta de anticuerpo residual fue preferentemente IgG1, lo que indica una pérdida de la desviación de IgG2c impulsada por GLA. La coliofilización de ID93+GLA-SE evitó en gran medida la pérdida inducida por estrés por calor de las respuestas de los anticuerpos específicos de ID93, lo que indica que la estructura de la proteína estaba protegida por este proceso. Esto sugeriría que la protección de los antígenos contra el estrés por calor es un parámetro más crítico para las vacunas que dependen de las respuestas de anticuerpos para la eficacia protectora que las vacunas como ID93+GLA-SE que dependen de los linfocitos T para la eficacia protectora. De hecho, la vacuna líquida de viales separados sometida a estrés por calor retuvo un grado de eficacia protectora contra la exposición experimental con Mtb en aerosol. Existe una relación clara entre la capacidad de retener la concentración de GLA por la liofilización frente al estrés térmico, la retención de la inducción de TH1 y el mantenimiento de la eficacia protectora.
Caracterización fisicoquímica de la formulación de vacuna con adyuvante SLA-SE
Se desarrolló un régimen de liofilización para la vacuna de ID93 con adyuvante SLA-SE de vial conjunto. Tras la liofilización, se formó una torta blanca parcialmente encogida y, después de la reconstitución con agua, se reformó la emulsión (Figura 15). El potencial para aumentar la estabilidad al estrés por calor por la liofilización se evaluó mediante la incubación de las muestras por duplicado (A y B) de ID93+SLA-SE liofilizado a 50 °C durante 30 días. Después del estrés por calor, no se observó ningún cambio visible en la calidad de la muestra (Figura 15; 30 días, A y 30 días, B) en comparación con la muestra sin estrés (Figura 15; 0 días, A y 0 días, B). Las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión, no mostraron la formación de crema 24 horas después de la reconstitución y las tortas liofilizadas no mostraron más signos de colapso o decoloración.
Para evaluar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectaron la integridad química de ID93+SLA-SE, se evaluó la concentración de ID93 en las formulaciones reconstituidas mediante SDS-PAGE (Figura 16). Se cargaron las muestras reconstituidas que contenían 1 pg/ml de ID93 por carril. Se observó ID93 como una banda de 98 kDa en todas las muestras analizadas. La liofilización y la reconstitución de ID93+SLA-SE de vial conjunto sometido a estrés no dio como resultado una hidrólisis sustancial de ID93 en comparación con ID93+SLA-SE de vial conjunto sometido a estrés (Figura 16). Por tanto, la liofilización de ID93+SLA-SE protegió a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor.
Para evaluar si el estrés por calor de ID93+SLA-SE de vial conjunto liofilizado reconstituido alteró las propiedades biofísicas de la vacuna con adyuvante, se examinó el tamaño de partículas, la concentración, la polidispersidad y el potencial zeta general de ID93+SLA-SE de vial conjunto liofilizado cuando se sometió a condiciones de estrés o sin estrés. El estrés por calor de ID93+SLA-SE de vial conjunto liofilizado reconstituido no alteró significativamente el tamaño de partículas o los agregados polidispersos (Figura 17A-C) o el potencial zeta (Figura 18) en comparación con ID93+SLA-SE de vial conjunto sin estrés. Similar a ID93+GLA-SE de vial conjunto liofilizado reconstituido, el estrés por calor de ID93+SLA-SE de vial conjunto liofilizado reconstituido dio como resultado aproximadamente ~50 % de recuperación de SLA (Figura 19).
Ejemplo 3: Formulación de emulsión de vacuna liofilizada y estabilidad a largo plazo
Se desarrolló un régimen de liofilización para la vacuna de ID93 con adyuvante GLA-SE de vial conjunto. La formulación evaluada para la estabilidad a largo plazo fue la misma formulación que se describe en el Ejemplo 1, para la formulación de GLA-SE que consistió en escualeno al 2 % v/v, DMPC al 0,4 % p/v, poloxámero 188 al 0,02 % p/v, glicerol al 0,5 % p/v y fosfato de amonio 5 mM más el polipéptido ID93 liofilizado en presencia de trometamina 20 mM y trehalosa al 5 % p/v. Tras la liofilización, se formó una torta blanca parcialmente encogida y, después de la reconstitución con agua, la emulsión se reformó sin signos visibles de la formación de crema (Figura 20). El potencial para aumentar la estabilidad al estrés por calor por la liofilización se evaluó mediante la incubación de muestras por duplicado (A y B) de ID93+GLA-SE liofilizado a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante un año.
Datos de estabilidad a 3 meses
El almacenamiento durante tres meses a 4 °C, 25 °C y 37 °C no demuestra ningún cambio en el aspecto de la torta o la capacidad de formar una emulsión adecuada tras la reconstitución en comparación con el tiempo cero (Figura 21A y Figura 21B). Las tortas liofilizadas no mostraron más signos de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin la formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución.
Las propiedades biofísicas de la vacuna liofilizada con adyuvante ID93+GLA-SE, se examinaron a los tres meses para las muestras almacenadas a 4 °C, 25 °C y 37 °C en términos del tamaño de partículas (Z-Prom nm) y la polidispersidad (PDI). A los tres meses, las formulaciones no demostraron ninguna alteración significativa en el tamaño de partículas o los agregados a ninguna de las temperaturas de almacenamiento hasta 37 °C (Figura 21B). Para evaluar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectan la integridad química del polipéptido ID93, en la emulsión liofilizada almacenada a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante tres meses, la formulación reconstituida se evaluó mediante SDS-PAGE (Figura 21C). Se cargaron las muestras reconstituidas que contenían 1 pg/ml de ID93 por carril. Se observó ID93 como una banda de 98 kDa en todas las muestras analizadas. La liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE no da como resultado una hidrólisis sustancial del polipéptido ID93. Por lo tanto, la liofilización de ID93+GLA-SE protege a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor.
La integridad química de la formulación de SE se evaluó mediante HPLC y se analizó para DMPC y escualeno. Los resultados de la Figura 21D no demuestran una pérdida o degradación de ninguno de los componentes de la emulsión de aceite en agua.
Se evaluó la concentración del adyuvante en la formulación liofilizada de ID93+GLA-SE almacenada a 4 °C, 25 °C y 37 °C (Figura 21E). Los datos demuestran que no hubo una pérdida significativa de GLA a partir de la concentración inicial de 50 pg/ml a cualquier temperatura de almacenamiento a los 3 meses.
Datos de estabilidad de 6 meses
El almacenamiento durante seis meses a 4 °C, 25 °C o 37 °C no demuestra ningún cambio en el aspecto de la torta o la capacidad de formar una emulsión adecuada tras la reconstitución (Figura 22A y Figura 22B) en comparación con el tiempo cero. Las tortas liofilizadas no muestran más signos de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin la formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución.
Las propiedades biofísicas de la vacuna liofilizada con adyuvante ID93+GLA-SE, se examinaron a los seis meses para las muestras liofilizadas almacenadas a 4 °C, 25 °C y 37 °C para el tamaño de partículas (Z-Prom nm) y la polidispersidad (PDI). A los seis meses, las formulaciones no demostraron ninguna alteración significativa en el tamaño de partículas o los agregados a ninguna de las temperaturas de almacenamiento hasta 37 °C (Figura 22B). Para evaluar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectan la integridad química del polipéptido ID93 en la formulación liofilizada ID93+GLA-SE después del almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante seis meses, se evaluó la formulación reconstituida por SDS PAGE (Figura 22C). Se cargaron las muestras reconstituidas que contenían 1 pg/ml de ID93 por carril. Se observó ID93 como una banda de 98 kDa en todas las muestras analizadas. La liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE no da como resultado una hidrólisis sustancial de ID93. Por lo tanto, la liofilización de ID93+GLA-SE protege a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor.
La integridad química de la formulación de SE se evaluó mediante HPLC y se analizó para DMPC y escualeno. Los resultados de la Figura 22D no demuestran una pérdida o degradación de ninguno de los componentes de la emulsión de aceite en agua.
Se evaluó la concentración del adyuvante en la formulación liofilizada de ID93+GLA-SE almacenada a 4 °C, 25 °C y 37 °C (Figura 22E). Los datos demuestran que no hubo una pérdida significativa de GLA en comparación con la concentración inicial de 50 pg/ml a temperaturas de almacenamiento de 4 °C o 25 °C, pero la temperatura de almacenamiento de 37 °C demuestra una pérdida aproximada del 50 % de GLA a los seis meses.
Datos de estabilidad de 9 meses
El almacenamiento durante nueve meses a 4 °C, 25 °C o 37 °C no demuestra ningún cambio en el aspecto de la torta o la capacidad para formar una emulsión adecuada tras la reconstitución (Figura 23A y Figura 23B) en comparación con el tiempo cero. Las tortas liofilizadas no mostraron más signos de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin la formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución.
Las propiedades biofísicas de la vacuna liofilizada con adyuvante ID93+GLA-SE, se examinaron a los nueve meses para las muestras almacenadas a 4 °C, 25 °C y 37 °C en términos del tamaño de partículas (Z-Prom nm) y la polidispersidad (PdI). A los nueve meses, las formulaciones no demostraron ninguna alteración significativa en el tamaño de partículas o agregados a ninguna de las temperaturas de almacenamiento hasta 37 °C (Figura 23B). Para evaluar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectan la integridad química del polipéptido ID93 después del almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante nueve meses, la formulación reconstituida se evaluó mediante SDS PAGE (Figura 23C). Se cargaron las muestras reconstituidas que contenían 1 pg/ml de ID93 por carril. Se observó ID93 como una banda de 98 kDa en todas las muestras analizadas. La liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE no da como resultado una hidrólisis sustancial de ID93. Por lo tanto, la liofilización de ID93+GLA-SE protege a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor.
La integridad química de la formulación de SE se evaluó mediante HPLC y se analizó para DMPC y escualeno. Los resultados de la Figura 23D no demuestran una pérdida o degradación de ninguno de los componentes de la emulsión de aceite en agua después de nueve meses de almacenamiento.
Se evaluó la concentración del adyuvante en la formulación liofilizada de ID93+GLA-SE almacenada a 4 °C, 25 °C y 37 °C (Figura 23E). Los datos demuestran que no hubo una pérdida significativa de GLA en comparación con la concentración inicial de 50 pg/ml a 4 °C o 25 °C, pero 37 °C demuestra la misma pérdida aproximada del 69 % de GLA a los nueve meses que se observó seis meses.
Datos de estabilidad de 12 meses
El almacenamiento durante doce meses a 4 °C, 25 °C o 37 °C no demuestra ningún cambio en el aspecto de la torta o la capacidad para formar una emulsión adecuada tras la reconstitución (Figura 24A y Figura 24B) en comparación con el tiempo cero. Las tortas liofilizadas no mostraron más signos de colapso o decoloración, y las muestras reconstituidas mantuvieron el aspecto de una emulsión sin la formación de crema hasta 24 horas después de la reconstitución.
Las propiedades biofísicas de la vacuna liofilizada con adyuvante ID93+GLA-SE, se examinaron a los doce meses para muestras almacenadas a 4 °C, 25 °C y 37 °C en términos del tamaño de partículas (Z-Prom nm) y la polidispersidad (PDI). A los doce meses, las formulaciones no demostraron una alteración significativa en el tamaño de partículas o agregados a ninguna de las temperaturas de almacenamiento hasta 37 °C (Figura 24B).
Para evaluar cómo el vial conjunto, la liofilización y el estrés por calor afectan la integridad química del polipéptido ID93 después del almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante doce meses, la formulación reconstituida se evaluó mediante SDS PAGE (Figura 24C). Se cargaron las muestras reconstituidas que contenían 1 pg/ml de ID93 por carril. Se observó ID93 como una banda de 98 kDa en todas las muestras analizadas. La liofilización y la reconstitución de ID93+GLA-SE no da como resultado una hidrólisis sustancial de ID93. Por lo tanto, la liofilización de ID93+GLA-SE protege a la proteína ID93 de la degradación inducida por estrés por calor a los doce meses. Se evaluó la concentración del adyuvante en la formulación liofilizada de ID93+GLA-SE almacenada a 4 °C, 25 °C y 37 °C (Figura 23E). Los datos demuestran que no hubo una pérdida significativa de GLA en comparación con la concentración inicial de 50 pg/ml a 4 °C o 25 °C, pero 37 °C demuestra una pérdida del 69 % de GLA a los doce meses.
Ejemplo 4: Formulación de emulsión de vacuna liofilizada y estabilidad en sistemas de excipiente único y múltiple con estabilidad térmica mejorada y sin pérdida de adyuvante a temperaturas más altas
Las emulsiones estables de aceite en agua, liofilizadas y formuladas se prepararon y se liofilizaron mediante el uso de los materiales y de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Las propiedades de la formulación de emulsión estable de aceite en agua liofilizada (SE) se reconstituyeron y se caracterizaron por su punto de fusión, la determinación de humedad, el tamaño de partículas y el potencial zeta, la degradación química por cromatografía líquida de alto rendimiento, la selección de reconstitución, la selección de estabilidad de la torta y la caracterización de la estabilidad acelerada como se describe en el Ejemplo 1.
En función de los experimentos preliminares, se postuló que el uso de glicerol como un agente tónico puede estar contribuyendo a la termolabilidad de las formulaciones a temperaturas superiores a 25 °C. Se llevaron a cabo investigaciones para determinar si la eliminación de glicerol como un agente tónico en las formulaciones proporcionaría una mayor termoestabilidad a temperaturas superiores a 25 °C durante más de tres meses. Además de la eliminación de glicerol, se evaluó el porcentaje de aceite biodegradable, en este ejemplo escualeno, para determinar la termoestabilidad y la caracterización de la torta cuando se liofilizó en las formulaciones de liofilización mejoradas termostables a 50 °C de trehalosa al 2,5 % y manitol al 2,5 % mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1.
Las muestras descritas en el Ejemplo 1 representan los porcentajes indicados de escualeno (de 2 % a 10 % v/v de escualeno como se indica), DMPC al 0,4 % p/v, poloxámero 188 al 0,02 % p/v, glicerol al 0,5 % p/v, y fosfato de amonio 5 mM que contenía glicerol al 0,5 % p/v o se formularon sin glicerol más o menos el 2 % v/v de Tris como agente de tonicidad adicional. Los datos de la Figura 25A demuestran que las formulaciones de emulsión con una concentración creciente de escualeno (2-10 % v/v) y sin glicerol al 0,5 % (etiquetado como Sin glicerol) formaron tortas elegantes al liofilizarse sin que se encogieran ni se decoloraran, incluso después de 30 días a 50 °C en comparación con las formulaciones que contienen glicerol al 0,5 % v/v (etiquetadas como Con glicerol) que forman tortas que están ligeramente encogidas y deprimidas tanto inmediatamente después de la liofilización (tiempo 0 días) como 30 días después del almacenamiento a 50 °C. La comparación de la reconstitución de la torta para la formación de crema de la formulación no demostró diferencias apreciables.
Las Figura 25B y Figura 25C demuestran que no hay una diferencia apreciable en el tamaño de partículas para el tamaño de partículas (Z-Prom nm) y la polidispersidad (PDI) (respectivamente) para cualquiera de las formulaciones después del almacenamiento a 50 °C durante 30 días para cualquiera de las formulaciones. La Figura 25D proporciona evidencia de que la presencia de glicerol al 0,5 % v/v afecta la estabilidad del adyuvante GLA en la formulación. Ninguna de las formulaciones de emulsión preparadas con un contenido de aceite biodegradable en aumento (25-10 %) muestra ninguna pérdida en la concentración de GLA al comparar la concentración inicial (tiempo cero representado por un 0 en la barra) en comparación con las muestras reconstituidas después del almacenamiento de los viales liofilizados en 50 °C durante treinta días (representado por un 1 en la barra). Las emulsiones liofilizadas en presencia de glicerol demuestran una pérdida del 30-40 % de GLA.
En función de estos datos, es probable que las formulaciones de vacunas puedan liofilizarse para resistir una temperatura de 50 °C que produciría tortas más elegantes y, por lo tanto, como reconocería un experto en la técnica, produciría una mayor termoestabilidad.
Ejemplo 5: Desarrollo y caracterización de cuatro formulaciones de emulsión de vacunas liofilizadas y estabilidad en sistemas de excipiente único y múltiple con estabilidad térmica mejorada y sin pérdida de adyuvante a temperaturas más altas
Se evaluó la capacidad de cuatro formulaciones de liofilización para termoproteger la emulsión de GLA-SE descrita en la presente descripción con todas las formulaciones que carecen de glicerol como un agente tónico. Las formulaciones desarrolladas y evaluadas fueron trehalosa al 5 % sola (sin glicerol) (Figura 26A), trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v (Figura 26B), trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v) (Figura 26C), y trehalosa al 10 % p/v (Figura 26D) y se evaluaron para la formación y el aspecto de la torta y la formación de crema después de la reconstitución un tiempo 0 (inmediatamente después de la liofilización), una semana (1 sm), 2 semanas (2 sm), 1 mes (1 ms) y 3 meses (3 ms) después de la liofilización para las muestras almacenadas el tiempo indicado a 4 °C, 25 °C, 37 °C y 50 °C como se indica. La comparación de los datos indica que todas las muestras formaron tortas blancas agradables con trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v (Figura 26B), trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v (Figura 26C) que forman las tortas más elegantes a todas las temperaturas de almacenamiento. Las elegantes tortas formadas por trehalosa al 5 % p/v, manitol al 0,1 % p/v (Figura 26B), trehalosa al 2,5 % p/v, manitol al 2,5 % p/v (Figura 26C) demuestran una estructura elegante como se conoce en la técnica. Por tanto, la eliminación del glicerol como un agente tónico de las emulsiones de GLA-SE liofilizadas produce una estructura de torta más elegante que mantiene su integridad estructural en un intervalo de temperaturas de 4 °C, 25 °C, 37 °C y 50 °C cuando se almacena durante una semana (1 sm), 2 semanas (2 sm), 1 mes (1 ms) y 3 meses (3 ms) (Figura 26A-D),
Todas las formulaciones liofilizadas se almacenaron a 4 °C, 25 °C, 37 °C y 50 °C durante una semana (1 sm), 2 semanas (2 sm), 1 mes (1 ms) y 3 meses (3 ms) como se indica. Las muestras se retiraron del almacenamiento, se reconstituyeron y se compararon en cuanto al tamaño de partículas (Z-Prom nm), la polidispersidad (PDI), el pH y el contenido de GLA después de la reconstitución como se representa en la Figura 27-31.
La Figura 27 representa la comparación de la emulsión preliofilizada antes de la adición de los componentes de liofilización (etiquetados en las barras como Preliof), la formulación de GLA-SE antes de la liofilización (etiquetada en las barras como Lio) y posterior a la liofilización después de la reconstitución (etiquetado como 0) para cada formulación. La comparación inicial de las formulaciones no demostró diferencias apreciables entre las formulaciones de liofilización con cada formulación y que tenían las características de emulsión reconstituida apropiadas, que incluyen un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de aproximadamente 200 nm, falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad, pH fisiológico y ninguna pérdida apreciable de GLA.
La Figura 28 representan las diversas formulaciones de liofilización de un solo vial almacenadas a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (barra 3) y 50 °C (barra 4) durante una semana (1 sm). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). Los datos de la Figura 28A demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm (Figura 28A), falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad (Figura 28B) y pH fisiológico (Figura 28C). Es de destacar que mientras que el tamaño de partículas promedio para las tortas liofilizadas aumenta a 50 °C para todas las formulaciones en aproximadamente un 40 % en comparación con las otras muestras, el tamaño de partículas todavía estaba dentro del deseado de menos de aproximadamente 200 nm. Es importante destacar que todas las formulaciones probadas que carecen de glicerol no demostraron pérdida de GLA después de una semana de almacenamiento a cualquier temperatura probada.
La Figura 29 representa las diversas formulaciones de liofilización de un solo vial almacenadas a 37 °C (barra 3) y 50 °C (barra 4) durante dos semanas (2 sm). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). Los datos de la Figura 29a demuestra que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 37 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm (Figura 28A), falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad (Figura 29B) y pH fisiológico (Figura 29C). Cabe señalar que, si bien el tamaño de partículas promedio para las tortas liofilizadas aumentó después de una semana a 50 °C para todas las formulaciones en aproximadamente un 40 % en comparación con las otras muestras, el tamaño de partículas no pareció cambiar en la segunda semana y todavía estaba dentro del deseado de menos de aproximadamente 200 nm. Es importante destacar que todas las formulaciones probadas que carecen de glicerol no demostraron pérdida de GLA después de una semana de almacenamiento a cualquier temperatura probada.
La Figura 30 representan las diversas formulaciones de liofilización de un solo vial almacenadas a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (barra 3) y 50 °C (barra 4) durante un mes (1 ms). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). Los datos de la Figura 30A demuestran que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas deseado de menos de aproximadamente 200 nm (Figura 30A), falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad (Figura 30B) y pH fisiológico (Figura 30C). Se observa la tendencia hacia el crecimiento del tamaño de partículas promedio para la formulación de trehalosa al 2,5 % y manitol al 2,5 % de 120 a 175 nm, pero el tamaño de partículas promedio está todavía por debajo de 200 nm y la formulación no representa ninguna pérdida de GLA.
La Figura 31 representa las diversas formulaciones de liofilización de un solo vial almacenadas a 4 °C (barra 1), 25 °C (barra 2), 37 °C (barra 3) y 50 °C (barra 4) durante un mes (1 ms). Las muestras se reconstituyeron y se analizaron para determinar el tamaño de partículas (diámetro promedio Z, nm), la polidispersidad (PDI) en función de la agregación, el pH y la concentración de GLA (mg/ml). Los datos de la Figura 31A demuestran que las 4 formulaciones de liofilización cuando se almacenan a temperaturas que varían de 4 °C a 50 °C presentan el tamaño de partículas de tamaño deseado de menos de aproximadamente 200 nm (Figura 31A), una falta de agregados apreciables medidos por polidispersidad. (Figura 31B) y el pH fisiológico (Figura 31C). Los datos de este Ejemplo 5 proporcionan las formulaciones de candidatos principales adicionales para la liofilización de un solo vial de una emulsión de aceite en agua (SE) que comprende un adyuvante (GLA) que, cuando se almacena a temperaturas de hasta 50 °C, durante un mes o más de visualización mejoran la termoestabilidad a 50 °C.
La presente descripción describe una serie de formulaciones para la liofilización de un solo vial de emulsiones de aceite en agua que son adecuadas para la administración de vacunas de antígenos, adyuvantes únicos, adyuvantes múltiples o cualquier combinación de estos que tienen una utilidad particular para disminuir o eliminar la necesidad del almacenamiento en la cadena de frío, que las hacen unas formulaciones mejoradas sobre la técnica.
Secuencias
Polipéptido de fusión ID93 con cola de His opcional (SEQ ID NO: 1)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTA
SDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWA
GTHL AN GSMSE VMM SEIAGLPIPPIIH Y GAIA Y AP S GAS GK AWHQRTP ARAEQ V ALEKC
GDKTCK VV SRF TRCGA Y A YN GSK Y QGGT GLTRR A AEDD A VNRLEGGRIVNW ACNEL
MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDT
MTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSAR
IFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASP
YVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLG
QNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLA
S GNLGS GN V GV GNIGNDNIGN ANIGF GNRGD ANIGIGNIGDRNLGIGNT GNWNIGIGIT G
NGQIGF GKP ANPD VLVV GNGGPGVT ALVMGGTD SLLPLPNIPLLE Y AARFITP VHPGYT
ATFLETP S QFFPFTGLN SLT YD V S VAQGVTNLHT AIM AQLAAGNEVVVF GTSQ S ATIATF
EMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTV
DYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTY
ILLP S QDLPLL VPLRAIPLLGNPL ADLIQPDLRVL VELGYDRT AHQD VP SPF GLFPD VD W
AEVAADLQQGAVQGYNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
Polipéptido de fusión ID93 (SEQ ID NO: 2)
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLG
RNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGL
PIPPIfflYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYN
GSK Y QGGT GLTRRAAEDD A VNRLEGGRIVNW ACNELMT SRFMTDPHAMRDM AGRFE
VHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVR
DGLVRD ANNYEQQEQ ASQQILS S VDESfF AVLPPEVN S ARIF AGAGLGPMLAAAS AWDG
LAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQ
ARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQ
DVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNI
GN ANIGF GNRGD ANIGIGNIGDRNLGIGNT GNWNIGIGIT GN GQIGF GKP ANPD VLVV GN
GGPGVT ALVMGGTD SLLPLPNIPLLE Y AARFITP VHPGYT ATFLETP S QFFPF T GLN SLT Y
D V S VAQGVTNLHT AIMAQL AAGNE VVVF GT SQ S ATIATFEMRYLQ SLP AHLRPGLDEL
SFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLN
VFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVYQPYSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLL
GNPL ADLIQPDLRVL VELGYDRT AHQD VP SPF GLFPD VDW AE V AADLQQGA VQGVND
AL S GLGLPPP W QP ALPRLF S T
Polipéptido de fusión ID83 con cola de His opcional (SEQ ID NO: 3)
MGS SHHHHHHS S GLVPRGSHMGTHL AN GSMSE VMM SEIAGLPIPPIIH Y GAIA Y AP S GA
SGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAA
EDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMW
ASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQ
ASQQILSSYDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVT
TGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATV
SPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVA
TQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIG
NIGDRNLGIGNT GNWNIGIGIT GN GQIGF GKP ANPD VL V V GN GGPGVT AL VMGGTD SLL
PLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMA
QL AAGNE VVVF GT SQ S ATIATFEMRYLQ SLP AHLRPGLDELSFTLT GNPNRPDGGILTRF
GFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLI
ALPPDL AS GV V QP VS SPD VLTT YILLP S QDLPLL VPLR AIPLLGNPL ADLIQPDLRVL VEL
GYDRT AHQD VP SPF GLFPD VD W AE V A ADLQQ GA V Q GVND ALS GLGLPPP W QP ALPRL
FST
Polipéptido de fusión ID83 (SEQ ID NO: 4)
HLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIfflYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGD
KT CK Y Y SRFTRCGA Y A YN GSK Y QGGT GLTRRAAEDD A VNRLEGGRIVNW ACNELMT S
RFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMT
QMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIF
AGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPY
VGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQ
NAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLAS
GNLGSGNVGV GNIGNDNIGNANIGF GNRGD ANIGIGNIGDRNLGIGNT GNWNIGIGIT GN
GQIGF GKP ANPD YLYVGNGGPGYT AL VMGGTD SLLPLPNIPLLEY AARFITP VHPGYT A
TFLETPSQFFPFTGLNSLT YD YS YAQGVTNLHT AIM AQL A AGNEV VVFGT SQ S ATIATFE
MRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTV
DYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTY
ILLP S QDLPLL VPLRAIPLLGNPL ADLIQPDLRVL VELGYDRT AHQD VP SPF GLFPD VDW
AEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
Rv1813 (SEQ ID NO: 5)
MITNLRRRTAMAAAGLGAALGLGILLVPTVDAHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIfflYG
AIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGG
T GLTRRAAEDD A VNRLEGGRIVNW ACN
Rv3620 (SEQ ID NO: 6)
MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDT
MTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS
Rv2608 (SEQ ID NO: 7)
MNF AVLPPEVN S ARIF AGAGLGPML AAAS AWDGLAEELH AAAGSF AS VTT GLAGD AW
HGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAAN
RTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEG
LQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGI
GNT GNWNIGIGIT GN GQIGF GKP ANPD VL V V GN GGPGVT AL VMGGTD SLLPLPNIPLLE
Y AARFITP VHPGYT ATFLETP S QFFPF T GLN SLTYD V S Y AQGYTNLHT AIM AQL A AGNE
VVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLG
FTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLAS
GV V QP VS SPD VLTT YILLP S QDLPLL VPLR AIPLLGNPL ADLIQPDLR VL VELGYDRT AH
QD VP SPF GLFPD VD W AEVAADLQ QGAVQGVNDAL S GLGLPPP W QP ALPRLF
Rv3619 (SEQ ID NO: 8)
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDYLTASDFWGGAGSAACQGFITQLG
RNF Q VIYEQ ANAHGQK VQ AAGNNMAQTD S AVGS S W A

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de vacuna liofilizada termoestable que comprende un aceite metabolizable, 1,2-dimiristoilsn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), y un excipiente formador de torta, en donde la composición está en la forma de una torta, en donde el aceite metabolizable es escualeno, y en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, o trehalosa, y
en donde la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua y la formulación de emulsión de aceite en agua no comprende glicerol; y
en donde la composición comprende además un adyuvante, en donde el adyuvante es un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA).
2. La composición de la reivindicación 1, en donde:
(a) el excipiente formador de torta es trehalosa que se encuentra en una concentración de 10 % (p/v) en la formulación de emulsión de aceite en agua;
(b) el excipiente formador de torta es trehalosa que se encuentra en una concentración de 5 % (p/v) en la formulación de emulsión de aceite en agua;
(c) el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, en donde el manitol en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de 0,1 % (p/v) y la trehalosa en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentran en una concentración de 5 % (p/v); o
(d) el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, y en donde el manitol en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de 2,5 % (p/v) y la trehalosa en la formulación de emulsión de aceite en agua se encuentra en una concentración de 2,5 % (p/v).
3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición es termoestable a una temperatura entre 8 °C y 60 °C durante al menos 1 mes.
4. La composición de la reivindicación 3 en donde:
(a) la composición es termoestable durante al menos 3 meses, 6 meses o 12 meses;
(b) la composición es termoestable a 25 °C durante al menos 1 mes;
(c) la composición es termoestable a 37 °C durante al menos 1 mes; o
(d) la composición es termoestable a 50 °C durante al menos 1 mes.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la emulsión de aceite en agua formada tras la reconstitución tiene un tamaño de partículas con un diámetro promedio Z de menos de 200 nm.
6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un antígeno.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde
(a) el antígeno es un polipéptido, un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un patógeno; o (b) la composición se forma por la liofilización de una formulación de emulsión de aceite en agua, y en donde la concentración del antígeno en la emulsión de aceite en agua formada tras la reconstitución no exhibe más del 25 % de degradación de la concentración del antígeno en la formulación de emulsión de aceite en agua antes de la liofilización.
8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el GLA es un GLA sintético.
9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el GLA es un GLA sintético y tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000061_0001
en donde R1, R3 , R5 y R6 son alquilo C11-C20 ; y R2 y R4
Figure imgf000062_0001
son
Figure imgf000062_0002
nte en donde y R6 son alquilo C11 ; y R2 y R4 son alquilo C9.
10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores:
(a) que comprende además un tensioactivo, opcionalmente en donde el tensioactivo es pluronic F68; y/o
(b) que comprende además un antioxidante, opcionalmente en donde el antioxidante es la vitamina E.
11. La composición de la reivindicación 10, en donde el tensioactivo es pluronic F68.
12. Un solo vial que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición se contiene en el vial.
13. Un método para almacenar una composición de vacuna que comprende almacenar la composición de vacuna liofilizada termoestable de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 entre 25 °C y 60 °C durante al menos 1 mes.
14. Un método para generar una composición de vacuna liofilizada termoestable, que comprende la etapa de liofilizar una emulsión de aceite en agua para formar una composición de vacuna liofilizada termoestable, en donde la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización comprende un aceite metabolizable, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y un excipiente formador de torta, en donde el aceite metabolizable es escualeno, en donde el excipiente formador de torta es una combinación de manitol y trehalosa, o trehalosa, en donde la composición de vacuna está en la forma de una torta, en donde la emulsión de aceite en agua antes de la liofilización no comprende glicerol, y en donde la composición comprende además un adyuvante de glucopiranosil lípido (GLA).
15. Una composición de vacuna liofilizada termoestable de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 para su
uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende: (a) reconstituir la composición en una emulsión de aceite en agua; y (b) administrar la emulsión al sujeto, que estimula de este modo una respuesta inmunitaria en el sujeto, en donde la composición comprende además un antígeno.
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