JP6893765B2 - 人以外の陸上動物用のウイルス感染症に対する抗体誘導剤とその補助剤 - Google Patents
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Description
そこで、安全で、しかも低コストでウイルスの感染を防御する方法の開発が望まれているが、これまでこの問題に直接的に応えた感染予防法は提案されていない。
ウイルスの感染予防法として、従来の獲得免疫を引き起こすワクチンの他に、自然免疫(先天性免疫:innate immunity)を増強させる方法が考えられるが、人以外の陸上動物に対する有効な方法は未だ開発されていない。
したがって、緊急時にもワクチンを有効とするためのアジュバント、及び経鼻投与可能なワクチンとアジュバントの組合せが待望されている。
従来、ワクチンに対してアジュバント作用を有する物質は種々提案されており、例えばイノシン酸とシチジル酸からなるポリヌクレオチドコポリマーであるPoly(I:C)の優れたアジュバント作用が報告されている(非特許文献1)。
しかし、動物感染症に対して緊急時に有効で経鼻投与可能な、ウイルス由来の不活性抗原とアジュバントからなる分泌型IgA及び/又はIgG抗体誘導剤は未だ存在しない。
そして、ウイルス由来の不活化抗原とアジュバントの経鼻投与(鼻粘膜接種)について検討し、凍結乾燥して粉末状としたウイルス由来の不活化抗原とアジュバントを経鼻投与(鼻粘膜接種)することにより、効果的に鼻粘膜上での分泌型IgA抗体分泌と、血清中におけるIgAやIgG抗体応答が得られ、更に、PRRSを始めとする各種ウイルスに対する発症予防効果、感染防御効果、及び交叉防御効果が認められることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、上記課題は、次の1)〜2)の発明によって解決される。
1) アジュバントを凍結乾燥して粉末状とした、人以外の陸上動物のウイルス感染症に対する分泌型IgA及び/又はIgG抗体誘導剤の補助剤。
2) 凍結乾燥して粉末状としたウイルス由来の不活化抗原と1)記載の補助剤とからなる、人以外の陸上動物のウイルス感染症に対する分泌型IgA及び/又はIgG抗体誘導剤。
更に本発明の抗体誘導剤は、経鼻投与することにより、従来なしえなかった交叉防御効果を奏する。交叉防御とはPRRSやインフルエンザのように抗原や遺伝子に多形、亜系などのサブタイプ(Subtype)のあるものに対し、一つのワクチンで感染防御を行うものである。PRRSウイルスもサブタイプが多く見られ、ワクチンの防御効果が得られない原因となっている。
一般に、分泌型IgA及び/又はIgG抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面の感染防御に役立っている病原菌特異的抗体であって、唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多く見られ、また血清中にも存在する。
これに対し、本発明の抗体誘導剤によって産生される抗体は分泌型IgA及び非特異的又は特異的抗体であるから、交叉防御作用も有する。
本発明の抗体誘導剤は経鼻投与するものであるため、皮下や筋肉内投与ワクチンにおけるアナフィラキシーショックなどが起こることは無く、非常に安全なものである。
インフルエンザワクチンなどの液体タイプのワクチンは4℃で保存するが、バイアル瓶やアンプル及び保管用冷蔵庫が必要である上に、保存期間が短く(通常、3年程度保存できれば十分とされている)、防腐剤を必要とするなど安定に保存するのに手間がかかる。また、従来のアジュバントの保存期間は、通常、4℃で4〜6ヶ月程度である。
これに対し、本発明の抗体誘導剤や補助剤は、凍結乾燥して粉末状とすることにより、錠剤(タブレット)などの形態で簡便かつ安価に保存可能であり、かつ、従来よりも大幅に長期間、安定に保存することができる。
更に、本発明の抗体誘導剤は、短期間に粉末からタブレットを大量生産することが可能であるから、感染症が急激に広がり、例えばパンデミックのような状態になって、緊急に大量のワクチンが必要になったような場合にも十分対応可能であり、従来のワクチンよりも遥かに実効性に優れた非常に画期的なものである。
なお、凍結乾燥の方法は特に限定されず、周知の手段の中から適宜選択すればよい。
Poly(I:C)誘導体は、細胞内に存在するToll様レセプター(Toll−like receptor:TLR)のリガンドである2本鎖RNAであり、自然免疫系を刺激するTLRのリガンドとして、病原菌やウイルス等の微生物の攻撃に対する防御免疫獲得能を発揮する。
Poly(I:C)は、種々の分子サイズのものを使用できるが、より優れた免疫応答を得るには、その塩基対(bp)が300bp以上のものが好ましい。このような分子サイズのPoly(I:C)は、例えば、東レ株式会社から100〜1000bpのものを容易に入手することができる。
キチンは直鎖型の含窒素多糖高分子であり、エビ、カニ、イカをはじめ、昆虫、貝、キノコに至るまで、極めて多くの生物に含まれている天然の素材である。
β−グルカンは、キノコ類、パン酵母などの細胞壁に含まれる多糖類である。
セラミック化ホッキ貝は、ホッキ貝を焼成して粉末化したものである。
BCGは、結核に対するワクチン(弱毒性生ワクチン)である。
PPDは、精製ツベルクリン(ツベルクリン反応検査に用いられる精製タンパク質誘導物)である。
上記アジュバントのいずれも、経鼻投与における重篤な副作用やショック等の報告はほとんどない。特にアナフィラキシーについての報告はない。また、これらを適切な配合により混合して使用すると、抗体の産生の増強を図ることができ、一層低用量のワクチンにより感染防御効果を上げることができる。
<試験材料及び方法>
PRRS生ワクチン(MA−104細胞培養:JJ―1882株:ベーリンガーインゲルハイム社)を不活化して不活化抗原を得た後、定法により凍結乾燥機で凍結乾燥し粉末状とした。
また、アジュバントのPoly(I:C)〔dsRNA(二重鎖リボ核酸)、アジュバント・インターナショナル社製〕を、定法により凍結乾燥機で凍結乾燥し粉末状とした。
上記凍結乾燥し粉末状とした不活化抗原とアジュバント(補助剤)を、実験動物の体重1kg当たり、0.001mg〜10000mgの用量で精製水に溶解混和し、抗体誘導剤として経鼻投与した。
コントロール(対照)は、生ワクチンのみ、不活化抗原のみ、及び、アジュバントのみである。
感染価はTCID50により測定した。
感染PRRSウイルスとして、市販ワクチン株(2型)と野外分離株(3型)を用い、交叉防御試験を行った。
実験動物は、通常の子ブタ及びPRRSに感受性の高いマイクロミニブタを用いた。
PRRSの中和抗体であるIgA及びIgGについては、経鼻投与1日前、投与2日後、14日後、更にブースター投与後、それぞれの鼻汁、唾液、血液中の抗体産生について測定した。臨床症状は検定を行った。
試験はPoly(I:C)と(3型)を不活化した不活化抗原の混合液(試作抗体誘導剤1)を経鼻噴霧投与する群(T01)、Poly(I:C)と(2型)を不活化した不活化抗原の混合液(試作抗体誘導剤2)を経鼻噴霧投与する群(T02)、及び無投与対照群(陰性対照群:T03)の3群を設定し、各群5頭ずつ、合計15頭を供試した。
試験1では鼻汁、唾液及び血清中の(2型)に対する特異的IgA抗体上昇の確認を行い、試験2では(3型)の攻撃を行い、臨床症状、リアルタイムPCR及び病理所見等から総合的に判断して感染防御効果を確認した。
試験1での特異的IgA測定の結果、無投与群のT03で抗体上昇が認められなかったのに対し、抗体誘導剤投与群(T01及びT02)は、投与後1日で鼻汁及び唾液で特異的IgA抗体の有為な上昇が確認され、血清中では投与後14日で特異的IgG抗体の上昇が確認された。一方、コントロール群は全て、抗体上昇も感染防御効果も見られなかった。
試験2での攻撃試験の結果、臨床症状については、T03で活力の低下、腹式呼吸及び発熱などの症状が確認(p=0.0013)されたのに対し、T01及びT02では症状の異常は確認されなかった。
リアルタイムPCR測定については、T03で攻撃開始後7日をピーク(105Copies/mL)に高い値で推移したのに対し、T01及びT02では試験期間中、検出限界以下であった。
また、(2型)及び(3型)の抗体誘導剤をそれぞれ投与した結果、鼻汁及び唾液で特異的IgA抗体の上昇が、血清中で特異的IgG抗体の上昇が確認され、(2型)の抗体誘導剤2投与群においても(3型)の感染に対して防御が確認された。
以上のことから、不活化抗原を作製したPRRS株と異なる型のPRRSに対してもPoly(I:C)を用いた経鼻噴霧型の抗体誘導剤は、従来よりもきわめて少ない用量で交叉防御が行われ、PRRS発症を完全に抑制することが確認された。
また、それぞれの抗体は1回のブースター(経鼻再投与)により維持されることから、子豚のみならず母豚に対しても交叉感染防御が期待される。
定法により凍結乾燥機で凍結乾燥して粉末状としたウイルス由来の不活化抗原とアジュバント(補助剤)を精製水に溶解混和した後、以下のように抗体誘導剤として経鼻投与しその効果を調べた。
<試験材料及び方法>
1.被験物質
Poly(I:C)〔dsRNA(二重鎖リボ核酸):アジュバント・インターナショナル社製〕と、不活化した豚由来PRRSウイルス株からなる抗体誘導剤
A:Poly(I:C)+PRRS野外分離株(3型)不活化株
B:Poly(I:C)+PRRSワクチン株(2型)不活化株
2.供試動物
PRRSに対するELISA抗体価陰性の離乳子豚(3週齢)、雄6頭、雌9頭の合計15頭
3.試験概要
供試動物を導入し、馴化期間を経過した後、上記被験物質A又はBを鼻腔内に噴霧投与する群(T01、T02)、及び、無投与対照群(T03)の3群を設定し、各群に5頭ずつ、合計15頭を割り付けた。
T01、T02では、鼻腔内噴霧で被験物質A又はBを試験設定時と試験開始後28日の2回投与した。試験開始後35日まで、血清、鼻汁及び唾液を経時的に採取し、IgA及びIgGを測定するとともに、血清中の当該ウイルスELISA抗体価を測定した。
4.試験群
試験群の概要を表1に示す。
試験日程の概要を表2に示す。
1)飼育環境
開放系畜舎のスノコ式畜房で馴化期間中は群飼し、群れ分け後は試験群毎に各畜房内に収容した。
2)供試飼料及び飼育管理
抗菌性物質を含有していない子豚試験用標準飼料「SDS No.2」(日本配合飼料社製)を制限給餌し、飲水は自家水道水を給水器で自由摂取させた。
7.検査項目
1)体重測定
導入時から第1回投与後35日まで1週間毎に体重を測定した。
2)一般状態の観察
活力、食欲、糞便性状等の一般状態を毎日観察し、下記表3に示す基準でスコア化して記録した。
第1回被験物質投与時、第1回投与後2日、14日、28日及び35日に、鼻汁及び唾液を可能な限り採取し、それぞれIgAを測定した。
また第1回被験物質投与時、第1回投与後14日及び35日に血清を採取し、IgGを測定した。
4)血清中のPRRS抗体価測定
第1回被験物質投与時、第1回投与後14日、28日及び35日に血清を採取し、RRSエリーザキット「アイデックス ラボラトリーズ社」を用いて、血清中のELISA抗体価を測定した。
1、体重測定
体重測定結果は表4に示すとおりであり、表中の「平均」は5頭の平均体重である。
また、「増体重」は、試験期間中に増加した体重の平均である。
2.一般状態の観察
各群の一般状態の観察結果を表5に示すが、試験期間中、一般状態の異常が認められた個体は全群を通じて確認されなかった。
3.鼻汁及び唾液中のIgA測定及び血清中のIgG測定結果
鼻汁及び唾液中のIgA測定及び血清中のIgG測定結果は表6に示すとおりであり、表中の「AVE」は5頭の平均値である。
鼻汁中の平均IgA(OD値)及び唾液中の平均IgA(OD値)は、統計学的解析の結果、第1回投与時を除く全ての時点で、T01、T02共にT03(無投与対照群)と比較して有意な差が認められた。
血清中の平均IgG(OD値)は、統計学的解析の結果、第1回投与後14日で、T01、T02共にT03(無投与対照群)と比較して有意な差が認められた。
4.血清中のPRRS抗体価測定
血清中のPRRS抗体価測定の結果を表7に示すが、試験期間を通じて全個体で陰性であった。
PRRSフリーの離乳子豚に経鼻噴霧型アジュバント添加PRRSウイルス不活化ワクチンを投与することによる経時的な抗体上昇の推移を、鼻汁及び唾液中のIgA、血清中のIgG及びELISA抗体価により確認した。
その結果、2種類の新規アジュバント(Poly−I:C)添加不活化ワクチンA、B共に、鼻汁及び唾液中のIgAは、投与開始後2日に無投与対照群と比べて有意に高い値を示し、その傾向は第1回投与後35日でも継続した。
血清中のIgGも、鼻汁及び唾液中のIgAと同様に、投与開始後14日には無投与対照群に比べて有意に高い値を示し、その傾向は第1回投与後35日でも継続した。
血清中のPRRS ELISA抗体価は、全群を通じて上昇することは無かった。
今回使用したアジュバント(Poly−I:C)はRNAを人工的に合成したものであって、不活化ウイルスと混合して経鼻噴霧投与すると、体内の免疫機構がウイルスの侵入と勘違いして反応し、短期間の間に強くIgA抗体を誘導し、その後IgGも誘導するものであると言われているが、本試験において鼻汁及び唾液中のIgAが上昇し、その後の血清中のIgGも上昇したことにより、これらのことが実証された。
また、抗体誘導剤投与によると思われる臨床症状の異常などの副作用は認められず、安全性にも問題はないことが確認された。
Claims (1)
- 豚繁殖・呼吸器症候群(PRRS)ウイルス抗原と、Poly(I:C)とを含む、ブタのウイルス感染症に対する分泌型IgA及び/又はIgG抗体の誘導剤であって、経鼻投与される、前記誘導剤。
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