ES2875550T3 - Anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente el antígeno DLA-DR de canino y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente al antígeno DLA-DR de canino y que interactúa con linfoma de canino y células de leucemia que tienen: A) cadena pesada de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 1-3, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 7 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 9-11, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 15 o B) cadena pesada de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 4-6, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 8 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 12-14, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 16.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente el antígeno DLA-DR de canino y sus usos

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales, que reconocen específicamente el antígeno DLA-DR de canino y su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de leucemias y linfomas, especialmente de caninos.

Las enfermedades linfoides (leucemia, linfoma) en perros representan aproximadamente el 30 % de todos los tipos de cáncer diagnosticados en esta especie animal. Los más comunes son los linfomas no Hodgkin de células B, equivalentes a los linfomas no Hodgkin de humanos (NHL), que representan aproximadamente el 20 % de todos los tumores de caninos y aproximadamente el 85 % de los tumores linfoides. La incidencia de linfomas en la población de canino es mayor que en los humanos. Los perros de diferentes razas y edades se ven afectados, pero el grupo más grande de pacientes son perros de aproximadamente 10 años.

Se utilizan regímenes de tratamiento tradicionales para linfomas de humanos, basados en fármacos citostáticos clásicos (doxorrubicina, vincristina, prednisolona, etopósido) administrados solos o en combinación. Una desventaja de dicha terapia es la pequeña especificidad con grandes efectos indeseables. Una terapia más completa ofrece una recuperación más rápida y un tiempo de supervivencia más prolongado, pero este procedimiento es más costoso y más tóxico. A su vez, la quimioterapia con un solo fármaco es más barata pero menos eficaz. A pesar de la remisión inicial de la enfermedad, la quimioterapia convencional produce resistencias y recaídas. Un problema grave es el coste económico que debe asumir el dueño del perro. Por el momento no existen otros métodos de tratamiento efectivos que al mismo tiempo sean leves y asequibles. Debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas, los perros se han convertido en un modelo de investigación útil en el desarrollo de fármacos y tratamientos para humanos. También los cánceres de origen natural en perros muestran una serie de características comunes.

Los anticuerpos monoclonales humanizados que reconocen el antígeno CD20 sobre las células B linfoides (Rituximab, Ofatumumab) o el antígeno CD33 sobre las células mieloides (Gemtuzumab), las células B y T (CD52) (Alemtuzumab) se utilizan para tratar linfomas y leucemias de humanos. La desventaja de estos anticuerpos es que afectan a las células linfoides normales, pero el proceso natural de renovación de las células B circulantes de la médula ósea previene las deficiencias inmunitarias permanentes asociadas con la eliminación de estas células por la inmunoterapia anti-CD20. Los intentos de utilizar Rituximab en perros no tuvieron éxito debido a la falta de reactividad cruzada con el CD20 de canino. Rue S.M. et al. obtuvieron nuevos anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente el CD20 de canino y los probaron en el contexto del tratamiento del linfoma de canino de células B (Sarah M. Rue, Brendan P. Eckelman, Jem A. Efe, Kristin Bloink, Quinn L. Deveraux, David Lowery, Marc Nasoff, Veterinary Immunology and Immunopathology 164 (2015) 148-159).

Además de los antígenos CD20 y CD33, el antígeno HLA-DR, que pertenece al principal complejo de histocompatibilidad MHC II, se considera un objetivo para la terapia contra el cáncer. Su expresión aumenta significativamente en leucemias y linfomas de células B y en varias enfermedades autoinmunitarias, que incluyen artritis reumatoide (Malone DG, Wahl SM, Tsokos M, Cattell H, Decker JL, Wilder RL., J Clin Invest. 1984 Oct;74(4):1173-85) y esclerosis múltiple (Olerup O, Fredrikson S, Olsson T, Kam-Hansen S. Lancet, 1987 Aug 8;2(8554):327).

Actualmente, se están realizando ensayos clínicos en humanos para anticuerpos humanizados contra la subunidad alfa de HLA-DR de humano (hL243) (Goldenberg et al., Patente de EE.UU. 8992917B2). Dicho documento muestra la inducción de apoptosis en células de linfoma de perro utilizando hL243.

El antígeno HLA-DR se libera de la superficie celular mediante digestión proteolítica y es detectable en suero y otros fluidos corporales. La determinación de la forma soluble (s-HLA-DR) puede ser un marcador de diagnóstico importante para enfermedades linfoproliferativas y autoinmunitarias, y el bloqueo de la interacción de s-HLA-DR con los receptores Tirc7 sobre la superficie de las células T CD4+ puede afectar su activación (Frischer J, Reindl M, Künz B, Berger T, Schmidt S, Milford E, Knosp E, Lassmann H, Utek N.Mult Scler. 2014 Feb 13).

Sarmiento y Valli han descrito un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno T200 (LCA, CD45) que se puede utilizar en inmunohistoquímica para la detección de células tumorales linfoides de canino (Sarmiento UM, Valli V. A canine Lymphocyte Surface Antigen detectable by a Monoclonal antibody (DT200). Can J Vet Res 1987,51, 110­ 116).

Steplewski y colaboradores han descrito varios anticuerpos monoclonales obtenidos contra células de linfoma de canino y que reconocen antígenos de superficie no identificados sobre células linfoides de canino. Estos anticuerpos reaccionaron en diversos grados con células linfoides normales (Z. Steplewski, K. A. Jeglum, C. Rosales, N. Weintraub. Canine lymphoma-associated antigens defined by murine monoclonal antibodies. Cancer Immunol. Immunother. 1987, 24, 197-201; CA1340898 “Monoclonal Antibodies Against Lymphoma-associated Antigens, Hybrid Cell Lines Producing These Antibodies, and Use Therefore”).

El documento EP 0289053A “Monoclonal antibodies against lymphoma-asociated antygenes, hybrid cell line producing these antibodies and use, therefore” by por Z. Steplewski y K.A. Jeglum divulga los anticuerpos monoclonales que se unen a las células de los ganglios linfáticos de canino, sin embargo, no se ha demostrado ninguna evidencia que dichos anticuerpos se unen a DLA-DR. Los autores especulan solo sobre la base del peso molecular de las proteínas inmunoprecipitadas que la diana de estos Mab puede ser una molécula de tipo Ia o DR. Otra publicación de Steplewski y colaboradores (Z. Steplewski, M. Obrocka, M., K. A. Jeglum, C. Rosales. Cytolytic Activity of Murine Anti-dog Lymphoma Monoclonal Antibodies with Canine Effector Cells and Complement. Cellular Immunol. 1988, 115,420-428) describe anticuerpos monoclonales que supuestamente exhiben la capacidad de activar el complemento para lisar las células tumorales. Sin embargo, esta publicación no indica claramente que los propios anticuerpos exhiban actividad ADCC.

El objeto de la invención es proporcionar nuevas sustancias adecuadas para el tratamiento, prevención y diagnóstico de leucemias y linfomas en perros.

Sorprendentemente, el problema descrito anteriormente se resuelve en la presente invención.

El objeto de la invención es un anticuerpo que se une específicamente a DLA-DR de canino y que interactúa con linfoma de canino y células de leucemia que tienen:

A) cadena pesada de anticuerpos que contiene las regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 1-3, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 7 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene las regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 9-11, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 15 o

B) cadena pesada de anticuerpos que contiene las regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 4-6, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 8 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene las regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 12-14, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 16.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de murino-canino quimérico que tiene: cadena pesada de anticuerpos que contiene la región constante de cadena pesada derivada de una inmunoglobulina de canino, especialmente de un anticuerpo de canino, y la cadena ligera de anticuerpos que contiene la región constante de cadena ligera derivada de una inmunoglobulina de canino, especialmente de un anticuerpo de canino. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de estirpes celulares depositadas en DSM bajo los números de acceso DSM ACC3287 y DSM ACC3288.

Un objeto adicional de la invención es un anticuerpo como se definió anteriormente para uso en el tratamiento o la prevención de leucemia, especialmente de canino, o linfoma, especialmente de canino.

Un objeto adicional de la invención es un anticuerpo como se definió anteriormente para uso en el tratamiento o la prevención de leucemia, especialmente de canino, o linfoma, especialmente de canino.

Un objeto adicional de la invención es un hibridoma seleccionado de estirpes celulares depositadas en DSM bajo los números de acceso DSM ACC3287 y DSM ACC3288.

Se divulgan regiones variables de cadena ligera (Vk) y pesada (VH) de dos anticuerpos denominados B5 y E11, que interactúan específicamente con antígenos sobre células de linfoma y leucemia de canino. El anticuerpo B5 contiene CDR de las cadenas Vk y VH cuyas secuencias de aminoácidos y sus correspondientes secuencias de nucleótidos codificantes se divulgan en la Fig. 1 como B5Vk y B5VH, mientras que el anticuerpo E11 contiene CDR de las cadenas Vk y VH cuyas secuencias de aminoácidos y sus secuencias de nucleótidos codificantes correspondientes se divulgan en la Fig. 2 como E11Vk y E11VH.

Los anticuerpos B5 y E11 son producidos por células de hibridoma depositadas en DSM bajo los números de acceso DSM ACC3287 (para el anticuerpo B5) y DSM ACC3288 (para el anticuerpo E11). Sorprendentemente, como resultado de la selección de clones de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la leucemia de células B de canino, se han identificado clones que reconocen específicamente células de células B de canino, células T y leucemias B/T mixtas y linfomas que expresan antígenos MHC de clase II de canino (DLA-DR). Estos anticuerpos interactúan con los linfocitos T y B normales, pero el nivel de expresión de las moléculas reconocidas sobre estas células es mucho más bajo que el de las células de leucemia y linfoma. Los anticuerpos obtenidos se pueden utilizar tanto en el diagnóstico y tratamiento de leucemias y linfomas de canino, como en otras enfermedades en las que aumenta la expresión del antígeno DLA-DR.

Un aspecto de la invención son dos anticuerpos monoclonales de murino B5 y E11, y células de hibridoma que secretan estos anticuerpos, como se define en las reivindicaciones. Ambos anticuerpos tienen el isotipo de cadena pesada IgG2a y reconocen epítopos conformacionales sobre la molécula DLA-DR.

Las secuencias de ADN y aminoácidos de las regiones variables de cada uno de los anticuerpos se muestran en las Figuras 1 y 2. El Ejemplo 1 divulga la secuencia de regiones variables y el Ejemplo 4 demuestra la especificidad del antígeno de los anticuerpos a DLA-DR.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden marcar con tintes fluorescentes, biotina, radionúclidos, compuestos paramagnéticos o enzimas y utilizar para ensayos inmunológicos. El Ejemplo 2 muestra la tinción con anticuerpos conjugados con biotina, mientras que otros tipos de marcado de anticuerpos se pueden obtener fácilmente mediante métodos rutinarios de la técnica anterior.

Los anticuerpos divulgados se pueden utilizar en un ensayo de inmunoenzima ELISA, uno de los cuales se utiliza para recubrir placas de ELISA y el otro se marca con biotina o peroxidasa como agente de detección. El Ejemplo 5 describe un ejemplo de dicho ensayo. Un aspecto adicional son las regiones variables de anticuerpos, que reconocen el antígeno, que se pueden adherir a regiones constantes de cadena pesada (Fc) y ligera de inmunoglobulinas de canino para obtener un anticuerpo de murino-canino quimérico de inmunogenicidad reducida con el propósito de terapia de linfoma de canino. El Ejemplo 7 ilustra el método de construcción de un anticuerpo quimérico de canino de murino basado en secuencias de regiones variables del anticuerpo E11 de ratón (divulgado en la Fig. 2) y regiones constantes de inmunoglobulinas de canino. La Figura 6 muestra el análisis de especificidad de los anticuerpos quiméricos obtenidos mediante citometría de flujo.

Un aspecto adicional son los fragmentos de anticuerpos (Fab) obtenidos por proteólisis enzimática que se pueden conjugar adicionalmente con sustancias citotóxicas y/o citostáticas (por ejemplo, doxorrubicina, betulina, metotrexato) y utilizar en la terapia de leucemias y linfomas (de canino/de humano) o enfermedades autoinmunitarias.

Los anticuerpos monoclonales B5 y E11 divulgados en esta solicitud son los únicos anticuerpos que no se basan en la reactividad cruzada entre moléculas DLA-DR y HLA-DR, sino que se producen al inmunizar ratones con antígenos de canino, lo que garantiza una afinidad óptima por el antígeno diana. El Ejemplo 2 demuestra que el nivel de fluorescencia obtenido después de unir la misma cantidad de anticuerpos B5 y E11 a los antígenos DLA-DR presentes sobre las estirpes derivadas de perros es significativamente mayor que sobre las estirpes de humano que expresan el antígeno HLA-DR, lo que indica una afinidad óptima por DLA-Dr .

El isotipo de la cadena pesada de IgG2a de ambos anticuerpos, debido a la unión óptima de los componentes del complemento y los receptores Fc sobre las células inmunitarias, permite efectos citotóxicos dependientes de anticuerpos. También existen los únicos anticuerpos de murino anti-DLADR disponibles con isotipo IgG2a. El ejemplo 6 ilustra el nivel de citotoxicidad en un ensayo in vitro con complemento de conejo e indica que ambos anticuerpos exhiben actividad en este ensayo.

El potencial de diagnóstico en linfomas de canino y leucemias de células B y células B/T mixtas para el uso combinado de anticuerpos B5 y E11 supera el 94 % y es significativamente mayor que para otros anticuerpos disponibles. El Ejemplo 3 indica que el uso de anticuerpos B5 y E11 permite un diagnóstico específico de más del 94 % de neoplasias de células B o B/T mixtas en ganglios linfáticos utilizando biopsia por aspiración con aguja fina (que es actualmente el estándar aceptado de procedimiento de diagnóstico). Sin embargo, se ha demostrado que las biopsias de los ganglios linfáticos agrandados de perros que no padecen linfoma o leucemia de tipo B o de perros con enfermedad de Lyme no producen una reacción positiva con los anticuerpos B5 y E11.

Los MAb B5 y E11 reconocen formas solubles de antígenos DLA-DR en el ELISA, que no es característico de todos los anticuerpos que reaccionan con moléculas HLA-DR asociadas a la membrana celular. El ejemplo 5 confirma el potencial de los anticuerpos B5 y E11 para unirse a antígenos DLA-DR presentes en fluidos corporales o lisados de células tumorales.

Ejemplo 1. Generación de hibridoma y secuenciación de ADN de genes que codifican regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos secretados, que interactúan específicamente con células de linfoma de células B de canino.

Se utilizó un procedimiento estándar, comúnmente descrito de inmunización de ratones y fusión de esplenocitos para generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales. Brevemente, se suspendieron 6 x 106 células de linfoma de células B de canino (CLB70) en 300 microlitros de solución salina y se emulsionaron en 300 microlitros de adyuvante de Freund incompleto. Dicho antígeno preparado se administró en tres inyecciones intraperitoneales de 200 microlitros/inyección a ratones CD-1 a intervalos de dos semanas. Cuatro días después de la última inyección, los esplenocitos de los ratones inmunizados se fusionaron en presencia de polietilenglicol (PEG 1500) con la estirpe de mieloma SP2.0 y se cultivaron en presencia de medio de selección que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina a 37 °C en atmósfera que contiene 5 % de CO². Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma (500 clones) se cribaron para determinar la reactividad con células CLB70 utilizando citometría de flujo.

En el agrupamiento de hibridomas analizados, inesperadamente, se identificaron dos estirpes que producían anticuerpos monoclonales con una afinidad muy alta para los linfomas de células B de canino (CLB70). Estos anticuerpos se denominaron B5 y E11, y los hibridomas que los producen, IITD PAN B5 e IITD PAN E11, respectivamente. Estos hibridomas se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest en el DSMZ (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) con los siguientes números de acceso: DSM ACC3287 (estirpe IITD PAN B5) y DSM ACC3288 (estirpe IITD PAN E11).

Se aislaron ARNm de hibridomas seleccionados que producían los anticuerpos de interés, que, tras la transcripción en ADNc utilizando métodos estándar de biología molecular, se amplificaron con cebadores oligonucleotídicos de secuencias complementarias a las regiones:

Vk (5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTATACA)

y V^h (5'-AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG) y

C^h 5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC

y Ck 5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG

de inmunoglobulina de murino. Los fragmentos de ADNc obtenidos se clonaron y secuenciaron utilizando el método Sanger. Las Figs. 1 y 2 muestran secuencias de ADN que codifican las regiones variables VH de cadena pesada y Vk de cadena ligera de la inmunoglobulina B5 y E11. La nomenclatura de Kabat se utilizó en el posicionamiento de los aminoácidos correspondientes a las regiones variables de las inmunoglobulinas. Las regiones hipervariables en la secuencia de aminoácidos se indican en negrita y las CDR-1, -2, -3 se describieron de acuerdo con lo anterior.

Ejemplo 2. Análisis de reactividad de anticuerpos B5 y E11 con antígenos de superficie presentes sobre estirpes celulares de canino y de humano seleccionadas mediante citofluorimetría de flujo.

Se incubaron anticuerpos B5 y E11 biotinilados o anticuerpo de control anti-DNP de ratón biotinilado en una cantidad de 1.5 microgramos por 100 microlitros de solución salina tamponada (PBS) suplementada con suero bovino fetal (FBS) al 2 % con suspensiones de 105 células indicadas en la Fig. 3 sobre hielo durante 30 minutos. Después de lavar los anticuerpos no unidos con PBS FBS al 2 %, las células se incubaron en 100 microlitros por muestra con un conjugado fluorescente de estreptavidina con ficoeritrina (Streptavidin PE, eBioscience) diluido 1:1000. La citofluorimetría se realizó utilizando el dispositivo BD Calibur. Los resultados se muestran como histogramas (relleno gris) que se refieren a la fluorescencia de las células teñidas con el anticuerpo de control (sin relleno). Estos análisis han mostrado que los antígenos reconocidos por los anticuerpos B5 y E11 están presentes sobre la superficie de las estirpes de canino (CLBL1 y CLB70) y de humano (Raji) de linfomas de células B, que han documentado en otras publicaciones, la expresión de los antígenos DRB de haplotipo MHC II; sin embargo, los antígenos están ausentes sobre las estirpes de células T de canino (GL-1) y de humano (Jurkat) y en la estirpe de mastocitomas de canino (NL-1). La estirpe de canino GL-1 con marcadores de linfocitos B y T, pero que carece de antígenos MHC de clase II, interactúa pobremente con el anticuerpo B5 y no interactúa en absoluto con E11.

Ejemplo 3. Análisis de reactividad de anticuerpos B5 y E11 con muestras de sangre y biopsias de ganglios linfáticos de perros.

Las suspensiones obtenidas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Tabla 1) o de biopsias de ganglios linfáticos (Tabla 2) de perros con linfomas diagnosticados o agrandados como resultado de una infección confirmada por Borrelia burgdorferi se tiñeron como en el Ejemplo 2 y sometieron a citofluorimetría FACS. El porcentaje de PBMC con reactividad de mAb B5 y E11 fue el más alto para los casos de linfoma de células B y se analizaron tres de tres para mAb B5 y dos de tres para mAb E1, respectivamente (Tabla 1). Sin embargo, no se informó reactividad de ninguno de los anticuerpos para muestras de perros sanos, perros infectados con Borrelia burgdorferi o diagnosticados con linfomas de células T. El porcentaje de células de los ganglios linfáticos con fluorescencia específica, por encima de la fluorescencia de control de isotipo (> 15 % de células positivas), se resume en la Tabla 2, por separado para cada perro. Para 13 pacientes con linfomas de células B confirmados, 11 (84.6 %) y 12 (92.3 %) mostraron reactividad con anticuerpos B5 y E11, respectivamente. Entre los perros con linfomas de células T, estos valores fueron respectivamente 1 en 5 con mAb B5 (20 %) y 0 en 5 con mAb E11. Para 5 linfomas analizados de fenotipo de células B/T mixto, 5 (100 %) fueron positivos para mAb B5 y 4 (80 %) para mAb E11. La Tabla 3 evalúa el nivel de expresión de antígenos reconocidos por mAb B5 y E11. Se demostró que la intensidad de fluorescencia media (MFI) más alta de 539 y 294 se mostró mediante linfomas de células B/T mixtos y células B teñidas con anticuerpo B5, respectivamente. Para el anticuerpo E11, estos valores fueron respectivamente 308 y 162. El MFI para linfomas de células T fue 23 y 15 para anticuerpos B5 y E11, respectivamente. Los valores de MFI para PBMC de perros sanos o pacientes con enfermedad de Lyme no excedieron 10.5.

Ejemplo 4. Identificación de antígenos reconocidos por anticuerpos B5 y E11.

Basándose en la secuenciación de proteínas inmunoprecipitadas de lisados de la estirpe CLBL1 mediante espectrometría de masas, se preseleccionaron provisionalmente dímeros de antígeno de clase II de histocompatibilidad, DLA-DR, como unidos específicamente por anticuerpos B5 y E11. Para confirmar esta identificación, se transfectó la línea de carcinoma fetal de humano (HEK293) con construcciones génicas que codifican cadenas de antígenos de histocompatibilidad DLA-DRa y DLA-DRp de canino en el vector de expresión pcDNA3 o en el vector de expresión vacío de control. Brevemente, se incubaron 3 |jg de ADN plasmídico purificado con el reactivo Metafecten Pro (Biontex) de acuerdo con el protocolo del fabricante y luego se introdujo la mezcla de ADN/Metafecten Pro en 2 x 105 células HEK293 cultivadas en una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio OptiMEM. (Life Technologies). 24 horas después de la transfección, las células se analizaron con citofluorimetría FACS utilizando anticuerpos B5 y E11 como se describe en el Ejemplo 2. La Fig. 4a muestra un análisis FACS representativo ejemplar de las células después de la transfección. Las células transfectadas con construcciones de control único (pcDNA3) o que codifican cadenas DLA-DRa o DLA-DRp no se tiñeron con conjugados fluorescentes de anticuerpos B5 y E11, mientras que se demostró tinción para ambos anticuerpos en caso de cotransfección de células HEK293 con construcciones codificación de las cadenas DLA-DRa y DLA-DRp.

Utilizando la técnica de inmunotransferencia Western sobre lisados de proteínas de células transfectadas con las construcciones génicas descritas anteriormente, se ha demostrado que los anticuerpos B5 y E11 reconocen el dímero DLA-DRap con un peso molecular de 55 kD, pero no reconocen cadenas DLA-DRa o DLA-DRp (Fig. 4b). Adicionalmente, se demostró la reactividad de ambos anticuerpos en la inmunotransferencia Western con lisados de estirpes de linfoma de células B (CLBL1 y CLB70), pero no con lisados de la estirpe de células B (GL-1) que carecen de antígenos DLA-DR, así como con lisados de células mononucleares de sangre periférica, PBMC, Fig. 4b. Más aún, se ha establecido que los epítopos reconocidos por los anticuerpos B5 y E11 son conformacionales, ya que el tratamiento de lisados de proteínas con solución de urea 6 M o al hervirlos a temperaturas superiores a 70 °C abolió la interacción anticuerpo-antígeno.

Ejemplo 5. ELISA de DLA-DR y s-DLA-DR sobre lisados celulares y fluidos corporales. Se recubrieron placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) con una solución de anticuerpo E11 a 2 jg/ml de PBS a 4 °C durante 12 horas. Después de bloquear la placa con una solución de caseína al 1 % en tampón TBS (Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM) con detergente Tween-20 al 0.05 % durante 1 hora a 37 °C, las placas se incubaron con soluciones de prueba (lisado celular, suero sanguíneo) durante 1 hora a 37 °C, luego se lavó 3 veces con TBS Tween-20 al 0,05 % y se incubó con anticuerpo B5 biotinilado (1.5 jg/ml) durante 1 hora a 37 °C. Después de lavar tres veces, como se describió anteriormente, las placas se incubaron con conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (1:1000, eBioscience) durante 1 hora a 37 °C, seguido por una reacción coloreada al agregar sustrato TMB. La Tabla 4 muestra que los lisados de células que expresan antígenos de histocompatibilidad DLA-DR demuestran una absorbancia ELISA específica aproximadamente 40 veces mayor que las células de control, y que los sueros sanguíneos de perros con linfoma muestran una absorbancia específica dos veces mayor promedio en este ensayo en comparación con los controles. La Fig. 5 muestra los resultados de la prueba ELISA con lisados de biopsias de ganglios linfáticos de perros sanos y pacientes con linfomas de células B, células T y B/T. Más del 85 % de los lisados de perros enfermos dan un resultado positivo.

Ejemplo 6. Análisis de citotoxicidad dependiente del complemento para anticuerpos B5 y E11 contra linfoma de canino CLBL1.

Se incubaron células de linfoma CLBL-1 de canino (2 x 105) con anticuerpos B5 o E11 a una concentración de 1 jg/100 j l durante 1 hora sobre hielo en medio RPMI sin suero. Después de la centrifugación de las células (300 x g durante 5 minutos) y el lavado de anticuerpos (5 ml de medio RPMI), las células se suspendieron en 1 ml de medio RPMI suplementado con 50 j l de complemento de conejo no tóxico (Sigma). Las células con complemento se incubaron durante 40 minutos en un baño de agua a 37 °C con mezcla periódica de la muestra cada 10 minutos. Después de la incubación, las células se centrifugaron (300 x g durante 5 minutos), se lavaron con PBS FBS al 2 % y se ensayó la viabilidad mediante incubación con yoduro de propidio (50 ng/ml) en un ensayo citofluorimético FACS. Las células muertas y vivas también se contaron en la cámara de Burker utilizando tinción con azul tripán. La Tabla 5 muestra que los anticuerpos B5 y E11, pero no un anticuerpo de control de murino del mismo isotipo que B5 y E11, exhiben un efecto citotóxico dependiente del complemento.

Ejemplo 7. Método de construcción y análisis de especificidad de anticuerpo quimérico de murino-canino (cEll) basado en secuencias que utilizan regiones variables de anticuerpo E11 de murino.

Se aislaron moléculas de ARNm que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera del hibridoma E11 utilizando reactivo Trizol (Thermofisher Scientific). La reacción rápida de la transcripción del ARNm en el ADNc se realizó utilizando la enzima transcriptasa inversa MMLV utilizando cebadores oligonucleotídicos complementarios a las porciones 3' de las regiones variables de cadena pesada Vh 5'-GCGTCTAGAAY CTCCACACACAGGRRCCAGT GGATAGAC o de cadena ligera Vl 5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG de inmunoglobulinas de murino. Los productos de PCR resultantes se clonaron mediante el método TA en el vector pGEM T-easy (Promega) y se secuenciaron.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente al antígeno DLA-DR de canino y que interactúa con linfoma de canino y células de leucemia que tienen:

A) cadena pesada de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 1-3, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 7 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 9-11, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 15 o

B) cadena pesada de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 4-6, especialmente que comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 8 y la cadena ligera de anticuerpos que contiene regiones CDR designadas como SEQ ID Nos. 12-14, especialmente que comprende la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos designada como SEQ ID No. 16.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado por ser un anticuerpo de murino-canino quimérico que tiene: cadena pesada de anticuerpos que contiene la región constante de cadena pesada derivada de una inmunoglobulina de canino, especialmente de un anticuerpo de canino, y la cadena ligera de anticuerpos que contiene la región constante de cadena ligera derivada de una inmunoglobulina de canino, especialmente de un anticuerpo de canino.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado por ser producido por un hibridoma seleccionado de estirpes celulares depositadas en DSM bajo números de acceso DSM ACC3287 y DSM ACC3288.

4. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento o la prevención de leucemia, especialmente de canino, o linfoma, especialmente de canino.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-3 para uso en el diagnóstico de leucemia, especialmente de canino, o linfoma, especialmente de canino.

6. Hibridoma seleccionado de estirpes celulares depositadas en DSM bajo números de acceso DSM ACC3287 y DSM ACC3288.