KR20230169936A - Garp 단백질 항체 및 이의 적용 - Google Patents

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Abstract

GARP 단백질 항체, 및 GARP 단백질 항체를 포함하거나 발현하는 세포가 제공된다. GARP 단백질 항체는 약 1.0E-12 이하의 KD 값으로 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 결합한다. 또한, GARP 단백질 항체와 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 약제학적 조합물 및 이의 용도가 제공된다.

Description

GARP 단백질 항체 및 이의 적용
본 출원은 생물의학 분야에 관한 것으로, 특히 GARP 단백질 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
조절 T 세포(Treg)는 자가면역 질병 및 종양형성(tumorigenesis)과 밀접한 관련이 있으며, 이의 비정상적인 활성은 자가면역 질병 또는 종양형성을 유발할 수 있다. 면역학 분야의 현재 연구 주요 대상인 Treg 세포는 낮은 면역 반응과 면역 억제라는 두 가지 특성을 가지고 있으며 "활성" 모드에서 면역계를 억제하여 음성 면역 조절 역할을 한다. 작용원과 기전에 따라, Treg는 자연 발생 CD4+CD25+Treg(자연 조절 T 세포, nTreg)와 유도된 적응 조절 T 세포(aTreg 또는 iTreg)로 분류할 수 있다.
80kDa 유형 I 막 당단백질로서, GARP(인간 당단백질 A 반복 우성) 단백질은 거핵구, 혈소판 및 활성화된 조절 T 세포(Treg 세포)에서 발현되며, 류신이 다존재하는 반복-포함 단백질 패밀리에 속한다. TGF-β는 GARP, 인테그린, 프로테아제 또는 기타 기질에 의해 활성화될 수 있는 비활성 상태의 비활성 결합 단백질 LAP와 케이지(cage) 구조를 형성하여 활성 TGF-β를 형성하며, 이는 자가분비 또는 주변분비를 통해 수용체에 결합하여 세포 신호전달을 활성화한다. TGF-β 신호전달은 주로 체크포인트 차단 요법에 대한 종양 저항성(tumor resistance) 발달에 관여하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역 억제 세포와 면역 억제 인자는 종양 미세 환경에서 TGF-β에 의해 증가한다.
면역억제성 사이토카인으로서 TGF-β는 다양한 기전을 통해 광범위하게 면역 반응을 억제할 수 있다. TGF-β는 중요한 항종양 효과를 제공하는 Th1, Th2 세포 및 세포독성 T 림프구(CTL)의 분화 및 기능을 감소시킨다. TGF-β는 또한 조절 T(Treg) 세포의 수 및 기능을 조절하여 면역 관용과 종양 회피를 강화한다. 또한, TGF-β는 세포 증식을 억제하거나 자극하여 면역 세포의 운명을 조절함으로써 흉선 및 말초 T 세포의 발달에 영향을 미친다.
현재 모든 TGF-β 이소형은 대부분의 임상 항체에 의해 중화되어 안전성 문제가 크다. GARP-TGF-β1 복합체를 표적화하는 요법은 Treg에서 활성 TGF-β1의 방출을 억제하여 PD-1/PD-L1의 항종양 활성을 증가시킬 수 있다. 현재 모든 TGF-β 이소형을 광범위하게 차단하는 것보다 부작용이 더 적고 안전성이 더 높으며 종양 미세 환경에 대한 부작용이 더 적은 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 신규한 항체가 절실히 필요하다.
본 출원은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 단리된 항원-결합 단백질(isolated antigen-binding protein)을 제공한다: 1) KD 값이 약 1.0E-12 이하인 옥텟 분석(Octet assay)에서 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 대한 결합 특성; 2) 인간 GARP만을 발현하는 세포 또는 인간 TGF-β1만을 발현하는 세포에 대한 비결합 특성; 3) Treg 세포에서 SMAD2 인산화의 억제 특성; 4) 인간 GARP/인간 TGF-β1을 발현하는 HEK293T 세포로부터 TGF-β1의 방출의 억제 특성; 5) 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인터루킨-2 (IL-2) 및 인터페론-γ (IFN-γ)의 방출의 억제로부터의 Treg 세포의 방지 특성; 및 6) 인간 PBMC 이식된 마우스 GvHD 모델에서 인간 PBMC에 의해 유도되는 GvHD에 대한 Treg 세포의 억제 효과의 차단 특성. 일 양상에서, 본 출원은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 항원-결합 단백질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 H-FR1을 포함하고, 여기서 H-FR1의 C 말단은 HCDR1의 N 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR1은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 5 및 서열번호 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 H-FR2를 포함하고, 여기서 H-FR2는 HCDR1과 HCDR2 사이에 위치하고, H-FR2는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 6 및 서열번호 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 H-FR3을 포함하고, 여기서 H-FR3은 HCDR2와 HCDR3 사이에 위치하고, H-FR3은 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 7 및 서열번호 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 H-FR4를 포함하고, 여기서 H-FR4의 N 말단은 HCDR3의 C 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR4는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 8 및 서열번호 25 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR1, 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 및 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 5 및 서열번호 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR1, 서열번호 6 및 서열번호 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR2, 서열번호 7 및 서열번호 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 및 서열번호 8 및 서열번호 25 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4는
a) H-FR1: 서열번호 5, H-FR2: 서열번호 6, H-FR3: 서열번호 7, 및 H-FR4: 서열번호 8;
b) H-FR1: 서열번호 22, H-FR2: 서열번호 23, H-FR3: 서열번호 24, 및 H-FR4: 서열번호 25
로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 VH는 서열번호 1 및 서열번호 21 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 11 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 10 및 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 10 및 서열번호 27 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 11 및 서열번호 28 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질에서 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은
a) LCDR1: 서열번호 10, LCDR2: 서열번호 11, 및 LCDR3: 서열번호 12;
b) LCDR1: 서열번호 27, LCDR2: 서열번호 28, 및 LCDR3: 서열번호 12
로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 L-FR1을 포함하고, 여기서 L-FR1의 C 말단은 LCDR1의 N 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR1은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 13 및 서열번호 29 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 L-FR2를 포함하고, 여기서 L-FR2는 LCDR1과 LCDR2 사이에 위치하고, L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 L-FR3을 포함하고, 여기서 L-FR3은 LCDR2와 LCDR3 사이에 위치하고, L-FR3은 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 15 및 서열번호 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 L-FR4를 포함하고, 여기서 L-FR4의 N 말단은 LCDR3의 C 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR4는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 16 및 서열번호 31 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR2, 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR3, 및 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 13 및 서열번호 29 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산을 포함하는 L-FR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR2, 서열번호 15 및 서열번호 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR3, 및 서열번호 16 및 서열번호 31 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, H-FR3, 및 L-FR4는
a) L-FR1: 서열번호 13, L-FR2: 서열번호 14, L-FR3: 서열번호 15, 및 H-FR4: 서열번호 16;
b) L-FR1: 서열번호 29, L-FR2: 서열번호 14, L-FR3: 서열번호 30, 및 H-FR4: 서열번호 31
로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 VL은 서열번호 9 및 서열번호 26 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 IgG-유래된 불변 영역 또는 IgY-유래된 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4-유래된 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질 중쇄 불변 영역은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 경쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 항체 경쇄 불변 영역은 Igκ-유래된 불변 영역 또는 Igλ-유래된 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질 경쇄 불변 영역은 인간 Igκ-유래된 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질 경쇄 불변 영역은 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 19 및 서열번호 32 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 HC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 20 및 서열번호 33 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 LC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 19 및 서열번호 32 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열번호 20 및 서열번호 33 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질의 HC 및 LC는
a) HC: 서열번호 19 및 LC: 서열번호 20;
b) HC: 서열번호 32 및 LC: 서열번호 33
으로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv, 디-scFv, VHH 및/또는 dAb를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 사슬 항체(single chain antibody), 뮤린 항체(murine antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 및 완전 인간 항체(fully human antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 또한 약제학적으로 허용 가능한 치료제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료제는 세포독성제 및 세포증식억제제의 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질, 또는 폴리펩타이드를 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 단리된 항원-결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 애주번트(adjuvant) 및/또는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질 및 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1의 상호작용을 억제하는 물질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1 차단제(blocking agent), PD-1 길항제(antagonist), PD-L1 길항제, PD-1 억제제, 및 PD-L1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조합물(pharmaceutical combination)은 약제학적 조성물일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 약제학적 조합물을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양(solid tumor)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종(melanoma), 유방 종양(breast tumor), 및/또는 폐 종양(lung tumor)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제학적 조합물 및/또는 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제(medicament)의 제조에서의, 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서의, 약제학적 조합물 및/또는 키트의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 유효량의 단리된 항원-결합 단백질, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 약제학적 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함한다.
본 출원의 다른 양상 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 본 출원의 예시적인 실시형태만이 다음의 상세한 설명에서 도시되고 기재된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 출원의 내용에 의해 당업자는 본 출원이 속하는 본 출원의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시형태에 대한 변형을 할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 도면 및 설명은 필수적으로 예시적인 것으로 고려되어야 하며 제한적인 것으로 고려되어서는 안 된다.
본 출원이 관련된 본 출원의 구체적인 특징은 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같다. 본 출원이 관련된 본 출원의 특징 및 이점은 이하에서 상세히 기재하는 실시형태 및 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 것이다. 도면에 대한 간략한 설명은 다음과 같다:
도 1a 내지 도 1d는 본 명세서에 기재된 항원-결합 단백질의 항원-결합 활성을 나타내고;
도 2는 본 출원의 예시적인 뮤린 항체 8H2D7B3을 사용한 차단 실험의 결과를 나타내고;
도 3a 및 도 3b는 Treg 세포에서 SMAD2 인산화에 대한 본 출원의 예시적인 뮤린 항체 8H2D7B3의 효과를 나타내고;
도 4는 Treg 세포에서 SMAD2 인산화에 대한 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 효과를 나타내고;
도 5는 HEK293T 세포로부터 TGF-β1의 방출에 대한 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 효과를 나타내고;
도 6a 및 도 6b는 PBMC로부터의 IL-2 및 IFN-γ의 방출에 대한 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 효과를 나타내고;
도 7a는 인간화 FcRn 마우스 모델에서 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 약동학(PK) 특징을 나타내고;
도 7b는 인간화 FcRn 마우스 모델에서 본 명세서에 기재된 MHG8 항체의 약동학(PK) 특징을 나타내고;
도 8a 및 도 8b는 마우스 GvHD 모델에서 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 연구 결과를 나타내고;
도 9는 마우스 흑색종 모델에서 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 약력학적 시험 결과를 나타내고;
도 10은 마우스 유방암 모델에서 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 약력학적 시험 결과를 나타내고;
도 11은 마우스 폐 편평 세포 암종 모델에서 본 출원의 예시적인 JYB1907hz18 항체의 약력학적 시험 결과를 나타낸다.
본 출원의 발명의 실시형태는 특정한 예에 의해 기재된다. 본 출원의 다른 이점 및 효과는 본 명세서의 개시내용으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
용어의 정의
본 출원에서 "단리된"이라는 용어는 일반적으로 자연 상태로부터 인위적인 수단에 의해 얻어진 산물을 지칭한다. "단리된" 물질 또는 구성요소가 자연에서 발생하는 경우, 자연 환경에서 변이되거나 물질이 자연 환경에서 단리되거나 두 경우 모두일 수 있다. 예를 들어, 단리되지 않은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 살아있는 동물에서 자연적으로 발생하며, 자연 상태로부터 고순도로 단리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 단리될 것이다. "단리된"이라는 용어는 인공 또는 합성 물질의 혼합물이나 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순한 물질의 존재를 배제하지 않는다.
본 출원에서 용어 "항원-결합 단백질"은 일반적으로 특정 항원을 특이적으로 인식 및/또는 중화시킬 수 있는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 본 출원에서 "항원-결합 단백질"이라는 용어는 "항체" 또는 "항원-결합 단편"을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 디술파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린을 포함할 수 있고, 이의 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 뮤린 항체, 인간 항체 (완전 인간 항체), 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체 (예를 들어, scFv), 및 항원에 결합하는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', 및 (Fab)2 단편)을 포함하여 단일클론 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 또한 원핵 세포에서 발현되는 항체, 비-글리코실화 항체, 및 본 명세서에 기재된 임의의 항원-결합 항체 단편 및 이의 유도체와 같은 항체의 모든 재조합 형태를 포함할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 구별될 수 있으며 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재해 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있으며, 이는 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원(예를 들어, 인간 GARP)과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 통상적 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. CDR의 정확한 경계는 계마다 다르게 정의되었다. 카밧(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))])에 의해 기재된 체계는 항원-결합 단편의 임의의 가변 영역에 적용 가능한 명확한 잔기 넘버링 체계를 제공할 뿐만 아니라 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이러한 CDR은 카밧 CDR로 지칭될 수 있다. 초티아 및 동료들(문헌[Chothia and Lesk, J.Mol). Biol.196: 901-917(1987) 및 Chothia et al., Nature 342: 877-883(1989)])은 카밧 CDR 내의 특정 하위 부분이 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성에도 불구하고 펩타이드의 백본에서 거의 동일한 입체형태를 채택함을 발견했다. 이러한 하위 부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로 지정되며, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 카밧 CDR과 중첩되는 경계를 갖는 초티아 CDR로 지칭될 수 있다. CDR을 정의하고 카밧 CDR과 중첩하는 다른 경계는 Padlan(문헌[FASEB J.9: 133-139 (1995)]) 및 MacCallum(문헌[J Mol Biol 262(5): 732-45(1996)])에 의해 기재되었다. 또한, 다른 CDR 경계 정의는 위의 체계 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 크게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험 결과에 비추어 단축되거나 길어질 수 있지만 여전히 카밧 CDR과 중복된다. 본 출원에서, 초티아 넘버링 시스템이 사용된다.
본 출원에서 용어 "항원-결합 단편"은 일반적으로 항원에 특이적으로 결합하는 기능을 하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 항체의 전장 단편에 의해 달성될 수 있다. 항체의 항원-결합 기능은 또한 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2의 단편을 포함하는 중쇄, 또는 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2의 단편을 포함하는 경쇄에 의해 달성될 수 있다: (1) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성된 1가 단편; (2) 힌지 영역에서 디술파이드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (3) VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; (4) 항체 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (5) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546]); (6) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (7) 임의로 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합. 예를 들어, VL과 VH의 쌍으로 형성된 1가 단일 사슬 분자 Fv(scFv)도 포함될 수 있다(문헌[Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. 85: 5879-5883] 참조). 예를 들어, 항체 경쇄가 없고 오직 중쇄 가변 영역만이 있는 항체 VHH 클래스도 포함될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kang Xiaozhen et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(12): 1974-1984] 참조). "항원-결합 부분"은 또한 (1) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 결합 도메인 폴리펩타이드; (2) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역; 및 (3) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "단일클론 항체"는 일반적으로 실질적으로 상동성인 항체 집단을 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 예를 들어, 단일클론 항체는 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 생성될 수 있거나, 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 유도될 수 있다.
본 출원에서 용어 "키메라 항체"는 일반적으로 각각의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열의 일부가 특정 종으로부터의 항체의 상응하는 아미노산 서열과 상동성이거나 특정 부류에 속하며, 사슬의 나머지 절편은 다른 종의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 지칭한다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 한 동물 종(예를 들어, 마우스, 랫트 등)의 항체 가변 영역에서 유래하며, 불변 부분은 다른 종(예를 들어, 인간)의 항체 서열과 상동성이다. 예를 들어, 키메라 항체를 얻기 위해 비인간 유래 B 세포 또는 하이브리도마 세포를 사용하여 가변 영역을 생성할 수 있으며, 이와 조합된 불변 영역은 인간 유래이다. 가변영역은 제조가 용이하고 조합되는 불변영역의 유래에 따라 특이성이 영향을 받지 않는다는 장점이 있다. 또한, 키메라 항체의 불변영역은 인간으로부터 유래할 수 있기 때문에 키메라 항체는 비인간 유래의 불변 영역을 갖는 항체를 사용하는 것보다 주입시 면역 반응을 유발할 가능성이 적다.
본 출원에서 용어 "인간화 항체"는 일반적으로 비-인간 면역글로불린으로부터의 더 적은 수의 서열을 포함하고, 이로써 인간에게 도입될 때 이종 항체의 면역원성을 감소시키면서 항체의 완전한 항원-결합 친화도 및 특이성을 유지하는 키메라 항체를 지칭한다. 예를 들어, 비인간 결합 도메인은 기술 수단, 예컨대 "재형성"(문헌[Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271]), "초키메라화(hyperchimerization)"(문헌[Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154]), 및 "베니어링(veneering)"(문헌[Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies." In: Metcalf B W, Dalton B J, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312]), 및 재표면화 (US5639641)를 포함하여 CDR 이식(문헌[Jones et al., Nature 321:522(1986)]) 및 이의 변이체를 사용하여 인간화될 수 있다. 힌지 및 불변 영역 도메인과 같은 다른 영역도 비인간 공급원에서 유래된 경우 인간화될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "뮤린 항체"는 일반적으로 가변 영역 프레임워크 및 CDR 영역이 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 또한, 항체가 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 경우. 본 출원의 뮤린 항체는 시험관내 무작위 또는 점 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이와 같은 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, "뮤린 항체"라는 용어는 마우스의 프레임워크 서열에 삽입된 다른 포유류 종의 CDR 서열을 갖는 항체를 포함하지 않는다.
본 출원에서, 용어 "GARP 단백질" 또는 "GARP 항원"은 상호 혼용되며 GARP의 임의의 변이체 및 상동체를 포함한다. GARP는 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 GARP 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현된다. 본 출원에서, GARP는 UniProt/Swiss-Prot에서 수탁 번호가 Q14392인 인간 GARP일 수 있다. 본 출원에서 GARP는 면역 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 이는 조절 T 세포(Treg)의 표면에서 발현될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "TGF-β1" 및 "TGF β1"은 상호 혼용되며 일반적으로 세포 성장 조절 및 분화와 관련이 있다. 본 출원에서, TGF-β1은 TGF-β의 이소형이다. 본 출원에서 "TGF-β1"은 TGF-β1 유전자가 형질감염된 세포 또는 세포에서 자연적으로 발현되는 TGF-β1의 임의의 변이체 및 상동체를 포함할 수 있다. 본 출원에서 "TGF-β1"은 UniProt/Swiss-Prot에서 수탁번호가 P01137인 인간 TGF-β1일 수 있다. 본 출원에서 "TGF-β1"은 GARP에 의해 활성화될 수 있고 CD8+T 세포 상의 TGF β 수용체에 결합하여 종양 세포 상에서 CD8+T 세포의 사멸 기능을 억제한다.
본 명세서에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오타이드에 더하여, 본 출원은 또한 이의 기능적 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편을 포함할 수 있다.
용어 "기능적 변이체"는 자연 발생 서열 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되고 자연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지칭한다. 본 출원과 관련하여, 임의의 소정의 서열의 변이체는 아미노산 잔기든 뉴클레오타이드 잔기든 특정 잔기 서열이 변형되어 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 적어도 하나의 내인성 기능을 실질적으로 유지하는 서열을 지칭한다. 변이체 서열은 원래의 기능적 활성이 유지되는 한 자연 발생 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기 및/또는 뉴클레오타이드 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 치환 및/또는 변이에 의해 얻어질 수 있다.
본 출원에서, 용어 "유도체"는 일반적으로 생성된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지하는 한, 서열로부터/상에 하나(또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 및/또는 추가를 포함하는 본 출원의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 출원에서 용어 "유사체"는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 모방체, 즉 모방체가 모방하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 화학적 화합물을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
일반적으로, 변형된 서열이 적절한 활성 또는 기능을 실질적으로 유지하는 한 아미노산 치환, 예를 들어 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개 이상)의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 자연적으로 발생하지 않는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 출원에서 "상동체"라는 용어는 일반적으로 자연 발생 서열과 특정 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "상동성"은 서열 "동일성"과 동일할 수 있다. 상동성 서열은 대상 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로, 상동체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 양상에서 고려되거나 서열 동일성 양상에서 표현될 수 있다. 본 출원에서, 언급된 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 서열번호 중 어느 하나에서 동일성 퍼센트를 갖는 서열은 언급된 서열번호의 전체 길이에 걸쳐 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 지칭한다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용하여 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 서열 정렬을 수행할 수 있다. 당업자는 비교되는 전체 길이의 서열에 걸쳐 최적의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 균등한 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 나타낼 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산과 글루탐산이 포함되고; 양전하를 띤 아미노산에는 라이신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 포함하는 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신이 포함된다.
본 출원에서 용어 "종양"은 일반적으로 다양한 발암 인자의 작용 하에 국소 조직 세포의 증식에 의해 형성된 신생물을 지칭한다. 예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 용어 "GARP의 단백질 발현과 관련된 종양"은 일반적으로 GARP 발현이 질병 진행을 유도하거나 면역 감시를 회피하는 종양을 지칭한다. GARP의 단백질 발현과 관련된 종양은 GARP 양성 종양일 수 있다. GARP 양성 종양에서 종양 세포 표면의 GAPR 단백질 발현량은 정상 세포보다 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상 더 높다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암(metastatic colon cancer)일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종(advanced renal cell carcinoma)일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
본 출원에서 용어 "흑색종"은 일반적으로 멜라닌 세포 유래의 고도로 악성인 종양을 지칭한다. 본 출원에서 흑색종은 점막 및 내장뿐만 아니라 피부에서도 발생할 수 있다.
본 출원에서 용어 "면역접합체"는 일반적으로 단리된 항원-결합 단백질에 다른 제제(agent)(예를 들어, 화학요법제, 방사성 원소, 세포증식억제제 및 세포독성제)가 접합되어(예를 들어, 연결 분자의 공유 결합을 통해) 형성된 접합체를 지칭하며, 상기 접합체는 표적 세포 상에서 항원에 대한 단리된 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 다른 제제를 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)에 전달할 수 있다. 그런 다음 면역접합체는 이러한 내재화가 진행되고 결국 표적 세포의 내부(예를 들어, 리소좀과 같은 소포 속으로)로 유입되고, 이 시점에서 면역접합체의 링커 분자가 절단되어 다른 제제를 방출함으로써 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 항원은 표적 세포에 의해 분비되어 표적 세포 외부 공간에 위치할 수도 있다.
본 출원에서 용어 "약제학적으로 허용 가능한 치료제"는 일반적으로 종양 및/또는 종양 세포의 증식을 억제할 수 있는 제제를 지칭한다. 본 출원에서 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제일 수 있다. 예를 들어, 치료제는 유사분열 억제제, 키나제 억제제, 알킬화제, 대사길항제, 인터칼레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 항생존제 및 생물학적 반응 조절제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서 용어 "대상체"는 일반적으로 다음에 제한되는 것은 아니나, 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 염소, 토끼, 마우스, 랫트 또는 원숭이를 포함하는 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자"는 일반적으로 자연 환경으로부터 단리되거나 인위적으로 합성된 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 단리된 형태를 지칭한다.
본 출원에서 "벡터"라는 용어는 일반적으로 적합한 숙주에서 자기 복제가 가능한 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 삽입된 핵산 분자를 세포 내로 및/또는 세포 사이에 전달할 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA를 세포에 1차적으로 삽입하는 벡터, DNA 또는 RNA를 1차적으로 복제하는 벡터, DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 1차적으로 발현하는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 적절한 세포에 도입될 때 폴리펩타이드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일반적으로 벡터는 벡터를 포함하는 적절한 세포를 배양하여 적절한 발현 산물을 생성할 수 있다. 본 출원에서 벡터는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "세포"는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 포함할 수 있거나 이미 포함할 수 있거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 항원-결합 단백질을 발현할 수 있는 개별 세포, 세포주 또는 세포 배양물을 지칭한다. 세포는 단일 세포의 자손을 포함할 수 있다. 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 자손 세포는 원래 모세포와 형태 또는 게놈이 반드시 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 항원-결합 단백질을 발현할 수 있다. 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터로 시험관내에서 세포를 형질감염시킴으로써 획득될 수 있다. 세포는 원핵 세포(예를 들어, E. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모 세포, COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포일 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 대식세포, NKT 세포, 단핵구, 수지상 세포, 과립구, 림프구, 백혈구 및/또는 말초 혈액 단핵 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포일 수 있다.
본 출원에서 용어 "치료"는 일반적으로 다음을 지칭한다: (i) 질병, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 진단되지 않은 환자의 질병, 장애 및/또는 병태의 발병 예방; (ii) 질병, 장애 또는 병태의 억제, 즉 진행 억제; 및 (iii) 질병, 장애 또는 병태의 차도, 즉 질병, 장애 및/또는 병태 및/또는 질병, 장애 및/또는 병태와 관련된 증상의 퇴행의 유발.
본 출원에서, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호 혼용되며 일반적으로 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이들 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이들 변형은 다음을 포함할 수 있다: 디술파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작(예를 들어, 표지 성분에 대한 결합). 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱 뿐만 아니라 D 및 L 광학 이성질체 뿐만 아니라 글리신을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
본 출원에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 혼용되며 일반적으로 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 확인되거나 확인되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 결찰 분석에 의해 정의된 복수의 유전자좌위(하나의 유전자좌위), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 수송 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조의 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 수행될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 표지된 성분에 대한 접합에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "KD"(동일하게, "KD" 또는 "KD")는 일반적으로 "친화도 상수" 또는 "평형 해리 상수"를 지칭하며, 적정 측정에서 평형 상태에서 얻어지는 값 또는, 해리 속도 상수(kd)를 결합 속도 상수(ka)로 나눈 값을 지칭한다. 항원(예를 들어, GARP 단백질)에 대한 결합 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질)의 결합 친화도는 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 해리 상수(KD)를 사용하여 표시된다. 결합 및 해리 속도 상수를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형광 기반 기술을 사용하면 높은 감도와 생리학적 완충액에서 평형 상태의 샘플을 검사할 수 있는 기능을 제공한다. 예를 들어, KD 값은 Octet 분석에 의해 결정될 수 있고, BIAcore(Biomolecular Interaction Analysis)와 같은 다른 실험 접근법 및 기기가 사용될 수 있다(예를 들어, BIAcoreInternationalAB, aGEHealthcarecompany, Uppsala, Sweden에서 입수 가능한 기기). 대안적으로, KD 값은 SapidyneInstruments(Boise, Idaho)에서 입수할 수 있는 KinExA(동적 배제 분석(KineticExclusionAssay))를 사용하거나 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기를 사용하여 결정할 수 있다.
본 출원에서 용어 "및/또는"은 대안 중 어느 하나 또는 대안 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 "~를 포함하는" 또는 "~를 함유하는"이라는 용어는 일반적으로 명시적으로 특정된 특징을 포함하는 것을 지칭하지만, 다른 요소를 배제하는 것은 아니다. 특정 경우에는 "~를 포함하는" 또는 "~를 함유하다"는 특정 요소만을 포함하는 것을 또한 포함한다.
본 출원에서 용어 "약"은 일반적으로 특정 값의 0.5% 내지 10% 초과 또는 미만의 범위, 예를 들어 특정 값의 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10% 초과 또는 미만의 범위를 지칭한다.
본 출원에서 용어 "~를 포함하는"은 일반적으로 포함하다, 요약하다, 포괄하다 또는 확보하다를 지칭한다. 특정 경우에는 "~가 존재하다", "~로 이루어지다"의 의미도 표시된다.
발명의 상세한 설명
본 출원에 기재된 단리된 항원-결합 단백질
일 양상에서, 본 출원은 약 1.0E-12M 이하의 K D 값으로 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 결합할 수 있는 단리된 항원-결합 단백질을 제공한다(예를 들어, K D 는 약 1.0E-12M 이하, 약 0.9E-12M 이하, 약 0.8E-12M 이하, 약 0.7E-12M 이하, 약 0.6E-12M 이하, 0.5E-12M 이하, 0.4E-12M 이하, 0.3E-12M 이하, 0.2E-12M 이하, 또는 0.1E-12M 이하임).
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 대한 결합에 대해 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 적어도 1, 2 또는 3개를 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 VH를 포함할 수 있는 기준 항체와 경쟁할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 기준 항체의 VH는 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKAS (서열번호 46), (상기 식에서, X1은 Q 또는 V일 수 있고, X2는 L 또는 V일 수 있고, X3은 K 또는 V일 수 있고, X4는 K 또는 R일 수 있고, X5는 A 또는 S일 수 있고, X6은 L 또는 V일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 5 또는 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR2는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
WMYWVX1QX2PX3QGLEWIGSI (서열번호 47), (상기 식에서, X1은 K 또는 R일 수 있고, X2는 A 또는 R일 수 있고, X3은 G 또는 I일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR2는 서열번호 6 또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR3은 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
THYNQKFX1X2RX3TVTVDKSX4RIVYMX5LSSLX6SEDX7AVYFCAR (서열번호 48), (상기 식에서, X1은 Q 또는 K일 수 있고, X2는 D 또는 G일 수 있고, X3은 A 또는 V일 수 있고, X4는 S 또는 T일 수 있고, X5는 E 또는 Q일 수 있고, X6은 R 또는 T일 수 있고, X7은 S 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR3은 서열번호 7 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR4는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
WGX1GTX2VTVSS (서열번호 49), (상기 식에서, X1은 Q 또는 T일 수 있고 X2는 M 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR4는 서열번호 8 또는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 5 또는 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6 또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8 또는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 H-FR1은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 서열번호 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKASGYTLSNYWMYWVX7QX8PX9QGLEWIGSIAPSDSETHYNQKFX10X11RX12TVTVDKSX13RIVYMX14LSSLX15SEDX16AVYFCARGGFGYGSSHWYFDVWGX17GTX18VTVSS (서열번호 50), (상기 식에서, X1은 Q 또는 V일 수 있고, X2는 L 또는 V일 수 있고, X3은 K 또는 V일 수 있고, X4는 K 또는 R일 수 있고, X5는 A 또는 S일 수 있고, X6은 L 또는 V일 수 있고, X7은 K 또는 R일 수 있고, X8은 A 또는 R일 수 있고, X9는 G 또는 I일 수 있고, X10은 Q 또는 K일 수 있고, X11은 D 또는 G일 수 있고, X12는 A 또는 V일 수 있고, X13은 S 또는 T일 수 있고, X14는 E 또는 Q일 수 있고, X15는 R 또는 T일 수 있고, X16은 S 또는 T일 수 있고, X17은 Q 또는 T일 수 있고, X18은 M 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1 및 서열번호 21 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 IgG-유래된 불변 영역 또는 IgY-유래된 불변 영역을 포함할 수 있는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 기준 항체의 중쇄 불변 영역은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 VL을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 HCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 LCDR2는 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GATSLEX1 (서열번호 45), (상기 식에서, X1은 S 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 LCDR2는 서열번호 11 또는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 LCDR1은 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
X1ASDHINKWLA (서열번호 44), (상기 식에서, X1은 K 또는 R일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 LCDR1은 서열번호 10 또는 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 LCDR1은 서열번호 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고: 10; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 기준 항체의 LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 기준 항체의 VL은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
DIQMTQSX1X2X3LSX4SX5GX6RVTITC (서열번호 52), (상기 식에서, X1은 P 또는 S일 수 있고, X2는 A 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 Y일 수 있고, X4는 A 또는 V일 수 있고, X5는 L 또는 V일 수 있고, X6은 D 또는 G일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 13 또는 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR3은 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GX1PSRFSGSGSGKDYTLX2IX3X4LQX5X6DX7ATYYC (서열번호 53), (상기 식에서, X1은 I 또는 V일 수 있고, X2는 T 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 S일 수 있고, X4는 G 또는 S일 수 있고, X5는 P 또는 T일 수 있고, X6은 D 또는 E일 수 있고, X7은 F 또는 V일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR3은 서열번호 15 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR4는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FGX1GTKLEIK (서열번호 54), (상기 식에서, X1은 G 또는 Q일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR4는 서열번호 16 또는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 13 또는 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16 또는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체8H2D7B3으로서 동일한 L-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체의 L-FR1은 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 L-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
DIQMTQSX1X2X3LSX4SX5GX6RVTITCX7ASDHINKWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLEX8GX9PSRFSGSGSGKDYTLX10IX11X12LQX13X14DX15ATYYCQQYWTTPYTFGX16GTKLEIK (서열번호 51), (상기 식에서, X1은 P 또는 S일 수 있고, X2는 A 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 Y일 수 있고, X4는 A 또는 V일 수 있고, X5는 L 또는 V일 수 있고, X6은 D 또는 G일 수 있고, X7은 K 또는 R일 수 있고, X8은 S 또는 T일 수 있고, X9는 I 또는 V일 수 있고, X10은 T 또는 S일 수 있고, X11은 T 또는 S일 수 있고, X12는 G 또는 S일 수 있고, X13은 P 또는 T일 수 있고, X14는 D 또는 E일 수 있고, X15는 F 또는 V일 수 있고, X16은 G 또는 Q일 수 있음).
본 출원에서, 기준 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9 및 서열번호 26 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, Igκ-유래된 불변 영역 또는 Igλ-유래된 불변 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 기준 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원에서, 기준 항체는 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항원-결합 단편 8H2D7B3 또는 항원-결합 단편 8H2D7B3으로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 기준 항체의 중쇄는 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄는 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항원-결합 단편 JYB1907hz0 또는 항원-결합 단편 JYB1907hz0으로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 기준 항체의 중쇄는 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄는 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항원-결합 단편 JYB1907hz18 또는 항원-결합 단편 JYB1907hz18로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 기준 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 중쇄는 서열번호 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체의 경쇄는 서열번호 33에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 항체는 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질은 종양을 완화시키거나 치료할 수 있으며, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, GARP의 발현과 관련된 종양이 포함될 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방암 및/또는 폐 편평 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종일 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 적어도 하나, 적어도 2개 또는 적어도 3개를 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 VH를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질의 HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VH는 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKAS (서열번호 46), (상기 식에서, X1은 Q 또는 V일 수 있고, X2는 L 또는 V일 수 있고, X3은 K 또는 V일 수 있고, X4는 K 또는 R일 수 있고, X5는 A 또는 S일 수 있고, X6은 L 또는 V일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 5 또는 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
WMYWVX1QX2PX3QGLEWIGSI (서열번호 47), (상기 식에서, X1은 K 또는 R일 수 있고, X2는 A 또는 R일 수 있고, X3은 G 또는 I일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 6 또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
THYNQKFX1X2RX3TVTVDKSX4RIVYMX5LSSLX6SEDX7AVYFCAR (서열번호 48), (상기 식에서, X1은 Q 또는 K일 수 있고, X2는 D 또는 G일 수 있고, X3은 A 또는 V일 수 있고, X4는 S 또는 T일 수 있고, X5은 E 또는 Q일 수 있고, X6은 R 또는 T일 수 있고, X7은 S 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 7 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
WGX1GTX2VTVSS (서열번호 49), X1은 Q 또는 T일 수 있고, X2는 M 또는 T일 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 8 또는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 5 또는 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 6 또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 7 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 8 또는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 H-FR1은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR2는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR3은 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 H-FR4는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKASGYTLSNYWMYWVX7QX8PX9QGLEWIGSIAPSDSETHYNQKFX10X11RX12TVTVDKSX13RIVYMX14LSSLX15SEDX16AVYFCARGGFGYGSSHWYFDVWGX17GTX18VTVSS (서열번호 50), (상기 식에서, X1은 Q 또는 V일 수 있고, X2는 L 또는 V일 수 있고, X3은 K 또는 V일 수 있고, X4는 K 또는 R일 수 있고, X5는 A 또는 S일 수 있고, X6은 L 또는 V일 수 있고, X7은 K 또는 R일 수 있고, X8은 A 또는 R일 수 있고, X9는 G 또는 I일 수 있고, X10은 Q 또는 K일 수 있고, X11은 D 또는 G일 수 있고, X12는 A 또는 V일 수 있고, X13은 S 또는 T일 수 있고, X14는 E 또는 Q일 수 있고, X15는 R 또는 T일 수 있고, X16은 S 또는 T일 수 있고, X17은 Q 또는 T일 수 있고, X18은 M 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질 중쇄 가변 영역은 서열번호 1 또는 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 IgG-유래된 불변 영역 또는 IgY-유래된 불변 영역을 포함할 수 있는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 IgG1-유래된 또는 IgG4-유래된 불변 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질 경쇄 불변 영역은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 VL을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 LCDR2는 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GATSLEX1 (서열번호 45), (상기 식에서, X1은 S 또는 T일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 LCDR2는 서열번호 11 또는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 LCDR1은 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
X1ASDHINKWLA (서열번호 44), (상기 식에서, X1은 K 또는 R일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 LCDR1은 서열번호 10 또는 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VL은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
DIQMTQSX1X2X3LSX4SX5GX6RVTITC (서열번호 52), (상기 식에서, X1은 P 또는 S일 수 있고, X2는 A 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 Y일 수 있고, X4는 A 또는 V일 수 있고, X5는 L 또는 V일 수 있고, X6은 D 또는 G일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 13 또는 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GX1PSRFSGSGSGKDYTLX2IX3X4LQX5X6DX7ATYYC (서열번호 53), (상기 식에서, X1은 I 또는 V일 수 있고, X2는 T 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 S일 수 있고, X4는 G 또는 S일 수 있고, X5는 P 또는 T일 수 있고, X6은 D 또는 E일 수 있고, X7은 F 또는 V일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 15 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FGX1GTKLEIK (서열번호 54), (상기 식에서, X1은 G 또는 Q일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 16 또는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 13 또는 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 15 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 16 또는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 L-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단백질의 L-FR1은 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 항원-결합 단백질의 L-FR4는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 L-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
DIQMTQSX1X2X3LSX4SX5GX6RVTITCX7ASDHINKWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLEX8GX9PSRFSGSGSGKDYTLX10IX11X12LQX13X14DX15ATYYCQQYWTTPYTFGX16GTKLEIK (서열번호 51), (상기 식에서, X1은 P 또는 S일 수 있고, X2는 A 또는 S일 수 있고, X3은 T 또는 Y일 수 있고, X4는 A 또는 V일 수 있고, X5는 L 또는 V일 수 있고, X6은 D 또는 G일 수 있고, X7은 K 또는 R일 수 있고, X8은 S 또는 T일 수 있고, X9는 I 또는 V일 수 있고, X10은 T 또는 S일 수 있고, X11은 T 또는 S일 수 있고, X12는 G 또는 S일 수 있고, X13은 P 또는 T일 수 있고, X14는 D 또는 E일 수 있고, X15는 F 또는 V일 수 있고, X16은 G 또는 Q일 수 있음).
본 출원에서, 항원-결합 단백질 경쇄 가변 영역은 서열번호 9 및 서열번호 26 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, Igκ-유래된 불변 영역 또는 Igκ-유래된 불변 영역을 포함한다.
예를 들어, 항원-결합 단백질 경쇄 불변 영역은 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단편 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항원-결합 단편 8H2D7B3 또는 항원-결합 단편 8H2D7B3으로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질 경쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 중쇄는 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 경쇄는 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 8H2D7B3 또는 항체 8H2D7B3으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항원-결합 단편 JYB1907hz0 또는 항원-결합 단편 JYB1907hz0으로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질 경쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 중쇄는 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 경쇄는 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz0 또는 항체 JYB1907hz0으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, H-FR1은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR2는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR3은 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; H-FR4는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR1은 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR3은 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; L-FR4는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질 중쇄 가변 영역은 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항원-결합 단편 JYB1907hz18 또는 항원-결합 단편 JYB1907hz18로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질 경쇄 가변 영역은 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 중쇄는 서열번호 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질의 경쇄는 서열번호 33에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 항원-결합 단백질은 항체 JYB1907hz18 또는 항체 JYB1907hz18로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 및 면역접합체
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 출원의 단리된 항원-결합 단백질을 포함할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 출원의 단리된 항원-결합 단백질을 포함할 수 있는 하나 이상의 면역접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역접합체는 또한 약제학적으로 허용 가능한 치료제를 포함한다.
본 출원에서 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제일 수 있다. 예를 들어, 치료제는 유사분열 억제제, 키나제 억제제, 알킬화제, 대사길항제, 인터칼레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 항생존제 및 생물학적 반응 조절제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산, 벡터 및 세포
또 다른 양상에서, 본 출원은 또한 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질을 인코딩할 수 있는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자 각각은 전체 항원-결합 단백질 또는 이의 일부(예를 들어, 하나 이상의 HCDR1-3 및 중쇄 가변 영역)를 인코딩할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 분자는 단리될 수 있다. 예를 들어, 이는 하기 방법에 의해 생성 또는 합성될 수 있다: (i) 시험관내 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, (ii) 클론 재조합, (iii) 정제, 예를 들어 분해 및 겔 전기영동 분획화, 또는 (iv) 합성, 예를 들어 화학 합성. 예를 들어, 단리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 핵산 분자일 수 있다.
본 출원에서, 단리된 항원-결합 단백질을 인코딩하는 핵산은 본 명세서에 기재된 단리된 항원-결합 단백질의 핵산 분자를 얻기 위해 다음제 제한되는 것은 아니나, 역전사 PCR 및 PCR을 사용하는 것을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 각 벡터는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적절한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자와 같은 다른 유전자를 포함할 수도 있다. 또한, 벡터는 적절한 숙주에서 코딩 영역의 적절한 발현을 가능하게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수도 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역 등을 조절하는 다른 제어 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 제어 서열은 조절 가능한 요소이다. 발현 제어 서열의 구체적인 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있지만, 통상적으로 TATA 카세트, 캡핑 서열, CAAT 서열 등과 같이 각각 전사 및 번역 개시에 관여하는 5' 비전사 서열 및 5' 및 3' 비번역 서열을 포함한다. 예를 들어, 5' 비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화인자 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 적합한 프로모터는 예를 들어 SP6, T3 및 T7 중합효소에 대한 프로모터, 인간 U6RNA 프로모터, CMV 프로모터 및 이의 인공 혼성체 프로모터(예를 들어, CMV)를 포함할 수 있으며, 프로모터의 일부는 또 다른 세포 단백질(예를 들어, 인간 GAPDH, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제)에 대한 유전자의 프로모터의 일부에 융합될 수 있으며, 이는 추가적인 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산 분자는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
이러한 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 또는 예를 들어 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 환자는 바이러스 벡터로 직접(생체내) 투여될 수 있거나 간접적으로 투여될 수 있는데, 예를 들어 환자는 바이러스로 처리된 세포를 시험관내(생체외)로 투여될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 종래의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 연관 바이러스 방법을 사용하여 삽입된 유전자의 장기간 발현을 위해 유전자를 숙주 게놈에 전달 및 혼입할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 일반적으로 더 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 긴 말단 반복 5' LTR 및 절단된 3' LTR, RRE, rev 반응 요소(cPPT), 중앙 종결 서열(CTS) 및/또는 번역 후 조절 요소(WPRE)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 벡터는 세포내로 도입될 수 있다.
다른 양상에 따르면, 본 출원은 세포를 제공한다. 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 항원-결합 단백질, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역접합체, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 또는 모든 세포는 본 명세서에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 또는 모든 세포는 본 명세서에 기재된 다수(예를 들어, 2개 이상) 또는 다중(예를 들어, 2개 이상) 종류의 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터는 상기 숙주 세포, 예컨대 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포), CHO 세포, NS/0 세포, HEK293T 세포, 293F 세포 또는 HEK293A 세포, 또는 다른 진핵 세포, 예컨대 식물로부터의 세포, 진균 또는 효모 세포 등에 도입될 수 있다. 본 명세서에 기재된 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 전기천공법, 리포펙틴 형질감염, 리포펙타민 형질감염 등에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 효모 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 E. 콜라이 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 포유류 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 면역 세포를 포함할 수 있다.
세포는 면역 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 세포에는 면역 세포가 포함될 수 있다. 예를 들어, 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 대식세포, NKT 세포, 단핵구, 수지상 세포, 과립구, 림프구, 백혈구 및/또는 말초 혈액 단핵 세포를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물 및 약제학적 조합물
또 다른 양상에서, 본 출원은 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 애주번트 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 출원에서 약학적으로 허용 가능한 애주번트는 완충제, 항산화제, 보존제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당류, 킬레이트제, 반대 이온, 금속 착물 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 세포에 부적합한 경우가 아닌 한, 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 출원의 약제학적 조성물에 대해 고려된다. 본 출원에서 약학적으로 허용 가능한 부형제는 약제학적 제제에서 또한 약제학적 필수 성분으로 지칭될 수 있는 주 약제 이외의 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 정제의 결합제, 충전제, 붕해제 및 윤활제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 한약 환약에 알코올, 식초, 약액 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 반고형 제형 연고, 크림의 베이스 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 액상 제형에서 보존제, 항산화제, 향미제, 향료, 가용화 보조제, 유화제, 가용화제, 삼투압 조절제 및 착색제를 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 단리된 항원-결합 단백질 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 출원에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1의 상호작용을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1 차단제, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-1 억제제, 및 PD-L1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, PD-1/PD-L1 차단제는 BMS202 (PD-1/PD-L1 억제제 2), BMS-1 (PD-1/PD-L1 억제제 1), PD-1/PD-L1 억제제 3, BMS-1166 및 BMS-1001로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, PD-1 억제제는 항-PD-1 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, PD-L1 억제제는 PD-L1 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 캄렐리주맙(Camrelizumab), 토리팔리맙(Toripalimab), 신틸리맙(Sintilimab) 및 티슬리주맙(Tislelizumab)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 두발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙, 및 아벨루맙(avelumab)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 HCDR3을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 HCDR2를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 HCDR1을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 LCDR3을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 LCDR2를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 LCDR1을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 VH를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 두발루맙, 아테졸리주맙, 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 VL을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 HCDR3을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함한다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함한다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다. 예를 들어, 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 VH를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 LCDR3을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 LCDR2를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 LCDR1을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 VL을 포함할 수 있고, LCDR3은 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 LCDR1-3을 갖는 항체을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 VL을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항-PD-L1 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 중쇄는 HCDR1-3 및 H-FR1-4를 포함할 수 있고, 경쇄는 LCDR1-3 및 L-FR1-4를 포함할 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR2는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; HCDR3은 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR1은 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR2는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고; LCDR3은 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체의 중쇄는 서열번호 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 중쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체의 경쇄는 서열번호 43에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 또는 아테졸리주맙으로서 동일한 경쇄를 갖는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다.
키트, 용도 및 방법
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조합물을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 및 약제학적 조성물을 제공한다.
예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원에서 키트 및/또는 약제학적 조합은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 사용된다.
예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 약제학적 조합물 및/또는 키트의 용도를 제공한다.
예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 단리된 항원-결합 단백질, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 약제학적 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 GARP의 단백질 발현과 관련된 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 전이성 결장암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 간세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 진행된 신장 세포 암종일 수 있다. 예를 들어, 종양은 비소세포 폐암일 수 있다. 예를 들어, 종양은 흑색종, 유방 종양 및/또는 폐 종양일 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물, 약제학적 조합물 및 방법은 화학요법, 수술, 방사선 및 유전자 요법 등과 같은 다른 유형의 암 요법과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 방법은 면역 반응에 따른 다른 질병 병태, 예컨대 염증, 면역 질병 및 감염성 질병에 사용될 수 있다.
본 출원에서 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 원숭이, 닭, 거위, 고양이, 개, 마우스 및 랫트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 비인간 동물은 가축, 설치류, 영장류, 가축, 가금류 동물 등 인간 이외의 임의의 동물 종을 포함할 수도 있다. 인간은 백인, 아프리카인, 아시아인, 수메르인 또는 기타 인종이거나 다양한 인종의 혼혈일 수 있다. 다른 예로서, 인간은 노인, 성인, 청소년, 소아 또는 유아일 수 있다.
인간에서의 유효량은 실험 동물에서의 유효량으로부터 추산될 수 있다. 예를 들어, Freireich 등은 동물 및 인간에 대한 투여량의 상호관계를 기재하였다(체표면적의 제곱미터당 밀리그램 기준)(문헌[Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 50, 219 (1966)]). 체표면적은 환자의 키와 몸무게에서 대략적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y., 537(1970)]을 참조한다.
특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 하기 실시예는 단지 본 출원의 융합 단백질, 제조 방법, 용도 등을 설명하기 위한 것이며 본 출원의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 재조합 플라스미드의 제조 및 면역세포주 작제(construction)
확립된 분자 생물학적 방법에 따라 인간 GARP(hGARP로 지정됨)의 전장 아미노산 서열(Uniprot#Q14392) 및 인간 Latent TGF-β(hTGF-β1로 지정됨)의 전장 아미노산 서열(Uniprot#P01137)을 코돈 최적화하여 DNA 서열을 합성하고, 이를 벡터 pLVX-IRES.puro 및 pLVX-IRES.G418에 각각 클로닝하고; 작제된 재조합 플라스미드를 렌티바이러스로 패키징한 후 293F 세포에 감염시키고 항생제 저항성에 의해 스크리닝하고; hGARP/hTGF-β1을 과발현하는 293F-hGARP/hTGF-β1 단일클론 재조합 세포주를 단일클론 콜로니를 선택하여 획득하고, 유동 항-인간 GARP 항체(Enzo life science, ALX-804-867FI-0100) 및 항-인간 TGF-β1 항체(R&D Systems, FAB2463A)로 염색하고, 검출을 위해 유세포 분석기에 부가였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 발현도가 높은 293F-hGARP/hTGF-β1 단일클론 재조합 세포주를 발췌하여 면역화하였다. 단일클론 항체의 스크리닝 및 확인을 위한 CHOK1-hGARP/hTGF-β1, 293T-hGARP 및 293T-hTGF-β1 단일클론 재조합 세포 염색제를 준비하기 위해 유사한 방법을 사용했다.
실시예 2 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체의 제조
2.1 면역화
Balb/c 및 SJL 마우스를 293F-hGARP/hTGF-β1 단일클론 재조합 세포주 2F4 및 2D3으로 각각 3 내지 4회 면역화하고, 3-5x106 세포/마우스를 2 내지 3주 간격으로 주사하고, 면역화후 혈청으로서 3차 면역화 후 7일째에 혈액을 채혈하였다. 면역화된 혈청의 결합 정도는 유세포 분석에서 CHOK1-hGARP/hTGF-β1과 공세포 CHOK1로 검출하였고, CHOK1-hGARP/hTGF-β1과 공세포 CHOK1에 대한 결합에 대한 평균 형광 강도의 비율을 유세포 분석법에서 계산하여 더 높은 비율의 마우스를 융합에 사용하였다. 융합 3일 전에, 마우스를 3-5x106 세포/마우스에서 293F-hGARP/hTGF-β1 단일클론 재조합 세포주로 부스터 면역화시켰다.
2.2 융합
융합 당일, 마우스를 안락사시킨 후, 마우스를 해부하고, 비장을 가져와 분쇄하여 세포를 수확하고, 1500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포를 5 ml의 적혈구 용해물로 현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 방치하고, 반응을 DMEM+10% FBS로 종결시키고 세포를 계수하였다. 원심분리 후, 세포를 40ml DMEM으로 현탁시켰다. 2 내지 3분 동안 방치한 후, 상청액을 다른 50 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. SP2/0 세포를 채취하여 비장세포와 SP2/0:비장세포=1:5의 비율로 혼합하여 혼합물을 원심분리하고 상청액을 충분히 피펫팅한 후 원심분리 튜브의 뚜껑을 닫고 세포 펠렛을 혼합하고 혼합된 세포를 DMEM으로 2회 세척한 후 통상의 방법에 따라 PEG 융합 또는 전기융합을 실시하고 세포를 DMEM 배지로 세척하고 DMEM+10%FBS+1ХHAT 선택 배지에 재현탁하였다. 융합된 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고 37℃, 75% 습도, 5% CO2 인큐베이터에서 9 내지 10일 동안 배양하였다.
2.3 항체의 스크리닝 및 계대배양, 정제
96-웰 세포 배양 플레이트로부터의 하이브리도마 상청액을 유세포 분석에 의해 CHOK1-hGARP/hTGF-β1 세포에 대한 결합 활성에 대해 분석하였다.
CHOK1-hGARP/hTGF-β1 단일클론 재조합 세포주를 T-75 세포 배양 플라스크에서 90% 컨플루언스(confluence)로 확장시키고, 배양 배지를 완전히 피펫팅하고, 배양물을 PBS 완충액(Invitrogen에서 입수)으로 2회 세척한 다음, 무효소 세포 해리 완충액(Versene 용액, 15040066, Life technology에서 입수)으로 처리하고 세포를 수집하였다. 세포를 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 세포 계수 후, 세포를 PBS 완충액으로 2x106 세포/mL로 희석하고, FACS 완충액(2% FBS 포함 PBS)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리하고 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 수집된 세포를 FACS 완충액으로 3x106 세포/mL로 현탁시켰다. 세포 현탁액을 96 FACS 반응 플레이트에 100 μL/웰로 첨가하고, 96-웰 세포 배양 플레이트로부터의 하이브리도마 상청액을 100 μL/웰로 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 상청액을 따라내고 형광(Alexa 488) 표지된 2차 항체(Invitrogen에서 입수)를 100 μL/웰로 첨가하고 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 원심분리하고 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 고정액 [4% (v/v) 파라포름알데히드]를 100 μL/웰로 현탁하고, 10분 후에 세포를 원심분리하고 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 30 μL의 FACS 완충액으로 현탁하고 결과를 검출하고 유세포 분석기 intellycite plus(Sartorius에서 입수)로 분석했다.
양성 하이브리도마 상청액에 해당하는 세포 클론을 24-웰 세포 배양 플레이트에 옮겨 2 내지 4일 동안 추가 배양하고, 24-웰 세포 배양 플레이트의 하이브리도마 상청액(해당 세포 클론명: 8H2)을 사용하여 CHOK1-hGARP/hTGF-β1 세포에 대한 결합 활성을 분석하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 양성 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에서 발췌하여 CHOK1-hGARP/hTGF-β1에 결합할 수 있는 하이브리도마 단일클론 항체를 분비할 수 있는 안정한 세포주 8H2D7B3를 얻을 때까지 계대배양 및 계대배양 스크리닝을 수행한 다음, 세포주를 통상적인 무혈청 배지에서 배양하여 50ml의 소규모 생성을 수행하고, 통상의 단백질 A 컬럼으로 정제하여 후속 확인을 위해 정제된 단일클론 항체를 얻었다.
2.4 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 결정
5Х107개의 하이브리도마 세포 8H2D7B3를 원심분리에 의해 수집하고 총 RNA를 Trizol 방법으로 추출하였다. 역전사 반응 후 얻은 cDNA를 말단 전이효소에 의해 G-첨가 반응을 수행하고 가변 영역 서열을 포함하는 DNA를 VH, VK 프라이머, 및 폴리C 프라이머로 증폭하고 T-A 클로닝을 수행한 후 시퀀싱 및 항체 서열 분석을 수행하였다.
실시예 3 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체의 확인
3.1 293F 세포, 293F-hGARP 세포, 293F-hTGF-β1 세포 및 293F-hGARP/hTGF-β1 복합체에 대한 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체의 결합 기능의 유세포 분석 확인
세포를 계수하고 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 세포 펠렛을 재현탁하고 1X PBS로 세척한 다음, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 세포 펠렛을 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액으로 재현탁하여 1e6 세포/mL의 밀도로 조정하였다. 세포를 100 μL/웰의 일정한 부피로 1e5 세포/웰의 밀도로 4℃에서 0.5시간 동안 플레이팅하고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 시험할 항체는 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에서 시작 농도 15 μg/mL로 제조한 후 희석 배율 1:5로 총 7개의 구배로 연속 희석한 다음 100 μL/웰의 일정 부피로 첨가하고 대조군으로 0 μg/mL를 첨가하고 희석액을 피펫으로 옮겨 4℃에서 1시간 동안 완전히 혼합한 다음 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 1 x PBS를 200 μL/웰의 일정한 부피로 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하고 완전히 혼합한 다음 300 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 따라내고 단계를 2회 반복했다. 4℃에서 100 μL/웰의 일정 부피로 2차 항체 Alexa 488(당나귀 항-마우스 IgG(H+L), 항목: 2018296, Thermo Fisher)을 1:1000의 비율로 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에 제조하여 혼합물을 1시간 동안 빛으로부터 보호했다. 1X PBS를 200 μL/웰의 일정한 부피로 첨가하고, 세포를 재현탁하고 완전히 혼합하고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 단계를 2회 반복하였다. 세포 펠렛을 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에 재현탁하여 FACS 기기에서 판독했다. 이 소프트웨어를 사용하여 EC50을 매핑하고 계산하였다. 이때, MHG8을 양성 대조군으로 사용하고, 마우스 IgG1(mIgG1)을 이소형 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다: 도 1a는 293F 세포에 대한 시험 항체의 결합을 보여주고, 도 1b는 293F-hGARP 세포에 대한 시험 항체의 결합을 보여주고, 도 1c는 293F-hTGF-β1 세포에 대한 시험 항체의 결합을 보여주고, 도 1d는 293F-hGARP/hTGF-β1 복합체에 대한 시험 항체의 결합을 보여주며, 이는 뮤린 항체 8H2D7B3은 293F-hGARP/hTGF-β1 복합체에만 결합함을 나타낸다.
3.2 293F-hGARP/hTGF-β1 복합체에 대한 MHG8(항-인간 GARP 항체)의 결합 기능을 차단하기 위한 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체의 유세포 분석
세포를 계수하고 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 세포 펠렛을 재현탁하고 1X PBS로 세척한 다음, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 세포 펠렛을 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액으로 재현탁하여 1e6 세포/mL의 밀도로 조정하였다. 세포를 1e5 세포/웰의 밀도로 100 μL/웰의 일정한 부피로 4℃에서 0.5시간 동안 플레이팅하고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. alexa488(항목: 1905151702, 1.39mg/mL)이 포함된 경쟁 항체를 50μL/웰의 일정한 부피로 30μg/mL의 최종 농도로 첨가하고; 시험할 항체를 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에서 시작 농도 30 μg/mL로 제조한 다음 희석 배율 1:5로 총 7개의 구배로 연속 희석한 다음 100 μL/웰의 일정 부피로 첨가하고 0 μg/mL를 대조군으로 첨가하고, 혼합물을 피페팅하여 4℃에서 1시간 동안 완전히 혼합한 다음 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 1 x PBS를 200 μL/웰의 일정한 부피로 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하고 완전히 혼합한 다음 300 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 따라내고 단계를 2회 반복했다. 2차 항체 Alexa 488(당나귀 항-마우스 IgG (h+L), 항목: 2018296, Thermo Fisher)을 1:1000의 비율로 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에 제조한 다음 4℃에서 100 μL/웰의 일정 부피로 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 빛으로부터 보호했다. 1 x PBS를 200 μL/웰의 일정 부피로 첨가하여 세포를 재현탁하고 완전히 혼합한 다음, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 단계를 2회 반복하였다. 세포 펠렛을 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에 재현탁하고 FACS 기기에 부가하여 실험 데이터를 판독하고, 이를 소프트웨어로 맵핑하여 EC50을 계산하였다. 이때, MHG8을 양성 대조군으로 사용하고, 마우스 IgG1(mIgG1)을 이소형 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이, 뮤린 항체 8H2D7B3은 293F-hGARP/hTGF-β1 복합체에 대한 MHG8의 결합을 차단할 수 있었다.
3.3 정제된 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체에 의한 Treg 세포에서의 SMAD2 인산화 억제의 웨스턴 블롯(Western blot) 및 Alpha Elisa 분석(Alpha Elisa assay)
새로운 PBMC 세포를 ALLCELLS에서 입수했으며, 먼저 PBMC 세포를 400g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 1% FBS(Thermo Fisher, 10099-141) 및 50mmol EDTA(Thermo Fisher, 15400054)를 포함하는 1X PBS 배지(Thermo Fisher, 10010049)에 재현탁했다. PBMC를 Treg 추출 키트(Miltenyi, Cat. No.: 130-091-301) 프로토콜에 따라 Treg 세포 추출을 수행하였다. Treg 세포 항체 처리: Treg를 14일 동안 시험관내에서 확장시키고, 세포를 수집 및 계수하고, 1.5x106개의 Treg 세포에 자기 비드를 고갈시켜 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 1 x 106/mL로 1 mL/웰의 일정한 부피로 플레이팅하였다. 시험할 항체를 25 μg/mL의 농도로 24-웰 플레이트에 첨가하였다. 세포를 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 36시간 동안 배양하였다.
Alpha Elisa 분석: 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 50 uL의 용해 완충액을 첨가하여 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1300 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 Alpha Elisa 분석(PerkinElmer, ALSU-PSM2-A500)을 위해 10 uL 상청액을 채취했다.
웨스턴 블롯 분석: 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 용해 완충액 50uL를 첨가하여 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1300rpm에서 5분 동안 원심분리하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 상청액 10uL를 채취했다. 결과는 도 3a 및 도 3b에 나타내었다: 도 3a는 시험할 항체에 의한 Treg 세포에서의 SMAD2 인산화 억제의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내고, 도 3b는 시험할 항체에 의한 Treg 세포에서의 SMAD2 인산화 억제의 Alpha Elisa 분석 신호 값을 나타내며, 이는 뮤린 항체가 양성 대조군 항-TGF-β1 및 MHG8과 유사하고, 둘 모두 Treg 세포에서 SMAD2 인산화 단백질을 억제할 수 있음을 나타낸다.
결합 및 차단과 같은 기능 확인에 의해, 8H2D7B3을 마우스 후보 항체로 선택하고 인간화하였다.
뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체 8H2D7B3의 가변 영역의 서열을 다음과 같이 결정하였다:
>8H2D7B3 VH
QVQLQQSGAELVRPGSSVKLSCKASGYTLSNYWMYWVKQRPIQGLEWIGSIAPSDSETHYNQKFKDRATVTVDKSSRIVYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGFGYGSSHWYFDVWGTGTTVTVSS
>8H2D7B3 VL
DIQMTQSSAYLSVSLGGRVTITCKASDHINKWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGIPSRFSGSGSGKDYTLSITGLQTEDVATYYCQQYWTTPYTFGGGTKLEIK
뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체 8H2D7B3 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 표 3에 나타내었다.
실시예 4 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체의 인간화
4.1 뮤린 항-인간 GARP 단일클론 항체 8H2D7B3에 가장 상동성인 인간 생식계열 항체(데이터 출처: IMGT)를 인간화 설계를 위한 프레임워크로서 서열 정렬에 의해 선택하고(경쇄는 IGKV3D-15*01 또는 IGKV1-5*03, IGKJ2*02 또는 IGKJ4*02로 프레이밍하고, 중쇄는 IGHV3-7*03 또는 IGHV1-46*03, IGHJ3*01로 프레이밍함), 항체의 CDR 영역을 항체 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 초티아 넘버링(문헌[Chothia & Lesk, 1987])에 의해 정의되었고: CDRL1(L24-L34), CDRL2(L50-L56), CDRL3(L89-L97), CDRH1(H26-H32), CDRH2(H52-H56), 및 CDRH3(H95-H97), 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산을 가변영역의 서열 정렬 및 구조 정보에 따라 인간화 돌연변이를 수행하였다.
4.2 생식계열 항체 서열 정보
IGKV3D-15*01:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP
IGKV1-5*03:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS
IGHV3-7*03:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
IGHV1-46*03:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
IGKJ2*02:
CTFGQGTKLEIK
IGKJ4*02:
LTFGGGTKVEIK
IGHJ3*01:
DAFDVWGQGTMVTVSS
4.3 발현 벡터를 설계하고 유전자를 합성한다. 그런 다음 재조합 항체를 포유류 세포에서 발현시키고 정제한다. 인간화 항체 및 키메라 항체의 활성 및 물리화학적 특성을 비교하였고, 생식계열 항체가 이식된 인간화 서열을 프레임워크 CDR로 사용하여 경쇄 및 중쇄를 최적으로 설계한 1 내지 2회의 인간화 최적화를 수행하였다. 생성된 키메라 항체를 JYB1907hz0로 지정하고 인간화 항체를 JYB1907hz18로 지정하였다.
4.4 인간화 항체의 발현 및 정제
설계된 서열을 항체 조작으로 최적화한 후, 전장 JYB1907hz18 경쇄 및 중쇄 단백질 서열을 각각 코돈 최적화하고, 코돈 최적화된 DNA 절편(Genscript)을 합성하고, 합성된 유전자 절편을 발현 벡터 pcDNA3.4(Life Technologies)에 클로닝하였다. 발현 플라스미드 증폭 및 플라스미드 추출 후, ExpiCHO 세포(ThermoFisher Scientific, A29133)를 2개의 플라스미드로 공동 형질감염시키고 공급업체의 ExpiCHO 발현 시스템 방법에 따라 일시적인 항체 발현을 수행했다. 대략적인 절차는 다음과 같다: ExpiCHO 세포를 36.5℃ 및 8% 이산화탄소 농도에서 총 배양 부피 25ml 배양 배지에서 6x106/mL의 밀도로 배양했다. 10 μg의 항체 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드를 각각 ExpiFectamine 형질감염 시약을 사용하여 세포로 옮기고; 형질감염 1일 후, 배양된 세포에 ExpiCHO 인핸서 150μL와 ExpiCHO 애주번트 4mL를 각각 첨가하여 9일 동안 배양하였다. 3500 rpm 및 4℃에서 원심분리하여 상청액을 얻었다. AmMag™ 단백질 A 자기 비드(Genscript, L00695) 및 항체 발현 상청액을 혼합하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하고, 상청액을 따라내고; 적당량의 용출 완충액 단백질 G 또는 A Sefinose™Elution 완충액(Sangon, C600481)를 첨가하고, 혼합물을 완전히 혼합한 다음, 5분 동안 정적 인큐베이션을 위해 시험관 랙에 배치하고; 자기 비드를 인큐베이션하는 동안 2 내지 3회 재현탁하고 용출을 2회 반복하였다. 추후 사용을 위해 용출 후 용출액을 중화용액 1M Tris-HCl, pH7.5(Sangon, B548124) 적당량으로 즉시 중화하였다.
4.5 정제된 인간화 항체의 친화도 분석
4.5.1 JYB1907hz18 및 hGARP/hTGF-β1 복합체(Kactus Biosystems, Cat. No.: GAR-HM4TG)의 친화도를 Octet RED96e(Fortebio)로 측정하고, 1907Hz18 및 hGARP/hTGF-β1 복합체 둘 모두 1ХPBST (1ХPBS: Sangon Biotech, B548117-0500; 0.02% Tween 20: Sigma, P1379)로 희석하고, hGARP/hTGF-β1 복합체를 100 nM의 시작 농도에서 3배 구배로 희석하고, JYB1907hz18을 33.3 nM의 농도로 사용하였다.
4.5.2 검출을 위한 부가 샘플(Octet Data Acquisition 11.1.0.11): 먼저, 샘플을 200 μL/웰의 시스템에서 96-웰 플레이트(Greiner bio-one, 655209)에 첨가하였다. 그런 다음 소프트웨어 매개변수를 설정하고 플레이트 온도를 30℃로 설정했으며 표준 운동 신호가 수집되는 주파수는 5.0HZ였다. 다음으로, AHC 센서(Fortbio, Cat. No.: 18-0015)를 1xPBST로 10분 동안 미리 적신 다음 샘플을 검출을 위해 기기에 부가했다. 각 주기에는 다음 단계가 포함된다. 1) 샘플을 완충액에 60초 동안 침지하는 단계; 2) 항원(hGARP/hTGF-β1 복합체)이 센서에 비특이적으로 결합하는지를 검출하는 단계; 3) pH 1.7의 1.0mM 글리신 용액에서 재생하는 단계; 4) 60초 동안 완충액에 침지하는 단계; 5) 항체(JYB1907hz18)를 25초 동안 센서에 고정화하는 단계; 6) 센서를 완충액에 180초 동안 침지하는 단계; 7) 항원(hGARP/hTGF-β1 복합체)을 항체(JYB1907hz18)에 180초 동안 결합시키는 단계; 8) 항원(hGARP/hTGF-β1 복합체)을 항체(JYB1907hz18)로 10분 동안 해리시키는 단계; 9) 센서를 재생하는 단계.
4.5.3 데이터 분석
항체의 평형 해리 상수(KD)를 Fortebio의 Data Analysis 12.0 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모드에서 항원(hGARP/hTGF-β1 복합체)-항체(JYB1907hz18)의 결합 속도(Ka) 및 해리 속도(Kd)를 측정하여 계산하였다. 결과는 표 4에 나타낸 바와 같이, JYB1907hz18은 양성 대조군 항체 MHG8보다 더 큰 친화도로 hGARP/hTGF-β1에 결합하였다.
실시예 5 Treg 세포에서 JYB1907hz18에 의한 SMAD2 인산화 억제
새로운 PBMC 세포를 ALLCELLS에서 입수했으며, 먼저 PBMC 세포를 400g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 1% FBS(Thermo Fisher, 10099-141) 및 50mmol EDTA(Thermo Fisher, 15400054)를 포함하는 1X PBS 배지(Thermo Fisher, 10010049)에 재현탁했다. PBMC를 Treg 추출 키트(Miltenyi, Cat. No.: 130-091-301) 프로토콜에 따라 Treg 세포 추출에 적용하였다. Treg 세포 항체 처리: Treg를 14일 동안 시험관내에서 확장시키고, 세포를 수집 및 계수하고, 1.5x106개의 Treg 세포에 자기 비드를 고갈시켜 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 웰당 1mL의 일정한 부피를 위해 웰당 1x106/mL로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 시험할 항체를 25 μg/mL의 농도로 24-웰 플레이트에 첨가하였다. 세포를 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 36시간 동안 배양하였다. 여기서, 항-TGF-β1 및 MHG8을 양성 대조군으로 사용하였고, 인간 IgG4를 이소형 대조군으로 사용하였다.
Alpha Elisa 분석: 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 50 uL의 용해 완충액을 용해를 위해 30분 동안 첨가하였다. 용해물을 1300 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 Alpha Elisa 분석(PerkinElmer, ALSU-PSM2-A500)을 위해 10 uL 상청액을 채취하였다.
JYB1907hz18은 전술한 방법에 의해 평가된 바와 같이 Treg 세포에서 SMAD2 인산화를 억제하였고, 그 결과는 도 4에 도시되어 있다.
실시예 6 JYB1907hz18에 의한 TGFβ1 방출 억제의 분석 연구
293T-hGARP/hTGF-β1 세포를 Shanghai ChemPartner Co., Ltd.에서 제조하였고, LN229 세포를 Nanjing Cobai(Cat. No.: CBP60302)에서 입수하였다. 두 종류의 세포를 70%의 밀도로 성장시켰을 때, 각각 트립신(Thermo, 25200056)으로 분해하였고, 10% FBS(Thermo Fisher, 10099-141) 및 1x Pen Strep(Thermo Fisher, 15140-122)이 포함된 새로운 DMEM(Thermo Fisher, 11965092)을 첨가하여 각각의 세포를 재현탁하고, 웰당 3Х106개의 세포(50 μL/웰)를 96-웰 플레이트(Corning, 3599)에 순차적으로 첨가하였다. 구배 방식으로 희석된 50 μL의 JYB1907hz18(최종 웰에 대한 항체 농도 0을 포함하여 총 10개의 구배에서 10 μg/mL의 최종 농도로부터 2배 연속 희석)을 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 원심분리하고 상청액을 채취하여 TGF-β1 ELISA 키트(Biolegend, Cat. No.: 580709)로 TGF-β1 분석을 수행하였다. 여기서, MHG8을 양성 대조군으로 사용하였고, 인간 IgG4를 이소형 대조군으로 사용하였다.
JYB1907hz18은 상기 기재된 방법에 의해 평가된 바와 같이 293T 세포로부터 TGF-β1의 방출을 억제하였고, 그 결과는 도 5에 도시되어 있다.
실시예 7 Treg가 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 IL-2 및 IFNγ의 방출을 억제하는 것을 방지하는 JYB1907hz18
새로운 PBMC 세포를 TPCS에서 입수하고, 먼저 PBMC 세포를 400g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 1% FBS(ThermoFisher, 10099-141) 및 50mmol EDTA(ThermoFisher, 15400054)를 포함하는 1x PBS 배지(ThermoFisher, 10010049)에 재현탁했다. 소수의 PBMC를 후속 실험을 위해 피펫팅하고, 나머지 PBMC를 Treg Extraction Kit(Miltenyi, Cat. No.: 130-091-301) 프로토콜에 따라 Treg 세포 추출에 적용하였다. 추출된 Treg 세포와 PBMC 세포를 계수하여 5e5/mL의 농도로 조정하였고, PBMC 그룹에는 50 μL의 PBMC, 1% HBS(TPCS, A515) 및 1x Pen Strep(ThermoFisher, 15140-122)을 포함하는 48 μL의 TexMACS™ Medium 배지(Miltenyi Biotec, 170-076-309) 및 2 μL의 CD3/CD28 항체 자기 비드(Miltenyi Biotec, 130-095-345)를 보충하였다. PBMC+Treg 세포 그룹에 PBMC 50μL, 1% HBS(TPCS, A515) 및 1X Pen Strep(ThermoFisher, 15140-122)이 포함된 TexMACS™ Medium 배지(Miltenyi Biotec, 170-076-309) 46μL, CD3/CD28 항체 자기 비드(Miltenyi Biotec, 130-095-345)로 보충하였다. 시험할 항체인 JYB1907hz18을 최종 농도 25μg/ml에서 50μL/웰의 일정 부피로 첨가했다. 혼합물을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 원심분리하고, 상청액을 채취하여 IL-2 ELISA 및 IFN-γ ELISA 키트를 사용하여 IL-2(R&D, VAL110) 및 IFN-γ(R&D, DIF50C)에 대해 분석하였다. 여기서, MHG8을 양성 대조군으로 사용하였다.
JYB1907hz18은 상기 기재된 방법에 의해 평가된 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 방출을 억제하였고, 그 결과는 도 6a 및 도 6b에 나타내었다: 도 6a는 시험될 항체가 Treg가 PBMC로부터 인터루킨-2(IL-2)의 방출을 억제하는 것을 방지함을 나타내고; 도 6b는 시험할 항체가 Treg가 PBMC로부터 인터페론-γ(IFN-γ)의 방출을 억제하는 것을 방지한다는 것을 보여준다.
실시예 8 인간화 FcRn 마우스 모델에서의 약동학(PK) 연구
인간화 FcRn 마우스를 실험 동물로 사용하여, 단회 피하 투여 후, 시험할 두 약제 MHG8 및 JYB1907hz18의 약동학적 지수를 각각 연구하였다. 모든 동물 실험 계획은 IACUC에서 검토하고 승인된 것이다. 체중 23 내지 26g인 6 내지 8주령의 수컷 hFcRn 마우스를 Biocytogen Pharmaceuticals(Beijing) Co., Ltd.에서 입수하여, SPF 등급 동물실에서 사육하고 표준 펠렛 사료를 공급하고 18 내지 24℃의 실온과 40% 내지 50%의 상대 습도에서 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하고 매일 교대 명암 주기(즉, 12시간 교대)에 노출시켰다. 총 12마리의 실험 동물을 무작위로 3개의 그룹으로 나누고 각 그룹에 4마리씩 넣었다. 동물에게 10 mL/kg의 투여량 부피로 10 mg/kg의 단일 투여량을 피하 투여하였다. 약제 투여 전, 약제 투여 2시간, 6시간, 24시간(1일), 2일, 3일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일 후에 채혈하였다. 뺨을 뚫어 EP 튜브에 60 μL/튜브로 전혈을 수집하고 실온에서 30분 동안 방치한 다음 원심분리(2000 g, 4℃, 5분)하여 혈청을 분리하였다. 각 샘플을 10 μL/튜브로 2 부분(검출 튜브 및 백업 튜브)으로 나누어서 -80℃에서 보관하였다.
상이한 시점에서 3가지 약제의 약동학을 간접 ELISA로 분석하였다. 플레이트를 뮤린 항-인간 IgG4 Fc 항원(Abcam, 항목: GR3248093-2, ab99820)으로 2 μg/mL, 100 μL/웰로 밤새 4℃에서 코팅한 다음 세척하고 차단 완충액으로 200 μL/웰로 4℃에서 밤새 차단했다. 혈청 샘플을 37℃에서 1시간 동안 50 μL/웰의 일정한 부피로 첨가했다. 검출 항체, hGARP/hTGF β1-비오틴(0.78 mg/ml, 항목: 030201) + 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Sigma, 항목: SLCB5784)를 37℃에서 0.5시간 동안 100 μ/웰의 일정한 부피로 첨가했다. 발색을 위해 TMB 현상액(KPL, Cat. No.: 52-00-03)을 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)에서 OD450을 판독했다. 표준 곡선에 따라 약제 농도를 얻었고 PK Solver 비구획 데이터 처리를 통해 PK 매개변수를 얻었다.
MHG8 투여 후 반감기(t1/2) = 4.8일, 최대 농도(Cmax)는 50036 ng/ml이고(도 7b에 도시된 바와 같음); JYB1907hz18 투여 후 반감기(t1/2) = 8.82일, 최대 농도(Cmax)는 139437ng/ml이다(도 7a 참조).
실시예 9 JYB1907hz18의 물리화학적 특성 연구
9.1 SEC-HPLC 순도 분석
9.1.1 샘플(JYB1907hz18)을 1 mg/mL로 희석하고 완전히 혼합한 다음 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 샘플 병으로 옮기고 HPLC 샘플 트레이에 넣었다. 크로마토그래피 조건은 표 5에 나타낸 바와 같이 설정하였다.
9.1.2 크로마토그래피 컬럼을 이동상(200mM 인산염 완충액, pH 6.8)으로 평형화하고 분석을 위해 샘플을 주입했다. 크로마토그래피 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다. 각 피크의 피크 면적 백분율을 피크 면적 정규화 방법으로 계산하였다.
9.2 HIC-HPLC 분석
9.2.1 샘플(JYB1907hz18)을 1 mg/ml로 희석하고 상청액을 원심분리하여 분석하였다. 크로마토그래피 조건은 표 6과 같이 설정하였다.
9.2.2 이동상 A(50mM 인산완충액/1M 황산암모늄, pH 7.0) 및 이동상 B(50mM 인산완충액, pH 7.0)를 사용하여 구배 용출을 수행하고, 주요 피크 체류 시간을 기록하였다.
9.3 용융 온도(Tm) 값의 분석
샘플(JYB1907hz18)을 샘플 완충액으로 1 mg/mL로 희석한 다음, Protein Thermal Shift™ Starter 키트의 지침에 따라, 샘플(JYB1907hz18) 용액 13 μL를 PCR 튜브에 첨가하고, 5 μL의 Protein Thermal shift TM 완충액을 첨가하고, 2 μL의 10X 염색 용액을 첨가하여 반응 부피를 20 μL로 만들고, 혼합물을 완전히 혼합하고, 공기 기포를 제거하기 위해 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 샘플 분석을 위해 시험 샘플(JYB1907hz18)을 PCR 기기에 넣고 샘플(JYB1907hz18)의 Tm 값을 기록하였다.
9.4 iCIEF 분석
샘플(JYB1907hz18) 용액을 다음의 완전히 혼합된 시스템에 첨가하였다: 70 μL의 1% 메틸셀룰로스(MC), 80 μL의 5M 우레아, 8 μL의 양쪽성 전해질 Pharmalyte pH 3 내지 10, 2 μL의 pI 마커 5.5, 2 μL의 pI 마커 9.5. 시스템에 적당량의 초순수를 200 μl로 보충하고 혼합물을 충분히 혼합한 후 원심분리하여 상청액을 분석하였다. 분석 후 스펙트럼 통합 처리 및 각 피크의 등전점과 각 피크의 백분율 계산을 위해 결과 파일을 ChromPerfect 소프트웨어에 입력하였다.
JYB1907hz18의 물리화학적 특성 분석 결과를 표 7에 나타내었다.
실시예 10 마우스 GvHD 모델에서 JYB1907hz18 항체에 대한 연구
7 내지 8주령의 암컷 NOG 마우스 40마리를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 입수하고; 저온보존된 PBMC를 Miaotong (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 입수하고; Treg 세포를 새로운 PBMC로부터 추출하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 시험관내에서 확장시켰다. NOG 마우스를 적응시킨 후, 마우스를 3일 전에 부술판 25 mg/kg으로 복강내로 처리하였다. 10마리의 마우스를 무작위로 선택하고 동일한 배치에서 저온 보존된 PBMC를 회수했다. 첫 번째 그룹으로 각 마우스에 3x106개의 PBMC를 정맥내 주사하였다. 회수된 PBMC를 Treg 세포와 혼합하고 나머지 30마리 마우스에 꼬리 정맥을 통해 3x106개의 PBMC 및 3x106개의 Treg 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 다음날 체중에 따라 마우스를 무작위로 그룹 2, 3, 4로 나누었다. 주 2회, 총 12회로 그룹화 후 첫 번째 그룹 마우스에는 Ctrl 이소형을 복강내 주사하고, 두 번째 그룹 마우스에는 Ctrl 이소형을 복강내 주사하고, 세 번째 그룹 마우스에는 MHG8(양성대조군) 20 mg/kg의 투여량을 복강내 주사하고, 네 번째 그룹 마우스에는 JYB1907hz18 20 mg/kg의 투여량을 복강내 주사하였다. 마우스의 체중을 매주 2회 측정하고 GvHD 점수를 부여하고 생존율을 계수하였다. GvHD 점수 기준은 표 8에 나타내었다. 체중의 25% 초과가 손실되었 때 마우스를 안락사시켰다.
42일째 실험 종료 시, 첫 번째 그룹에서 4마리의 마우스가 치사한 것으로 나타났고, 두 번째 그룹에서 3마리의 마우스가 치사하였고, 세 번째 및 네 번째 그룹에서 5마리의 마우스가 생존했다. 두 번째 그룹에서는 Treg 세포를 첨가한 이후 생체내 PBMC의 확장이 억제되었고 GvHD의 발생 시간이 지연되었으며, 세 번째와 네 번째 그룹에서는 MHG8과 JYB1907hz18의 투여로 Treg의 효과가 억제되었으며 GvHD의 점수와 치사율이 첫 번째 그룹보다 더 높았으며 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다: 도 8a는 마우스에서 시험할 항체의 GvHD 점수를 보여주고; 도 8b는 마우스에서 시험할 항체의 생존율을 나타낸다.
실시예 11 인간 흑색종 A375 마우스 종양 모델에서 JYB1907hz18 항체의 약력학 시험
7 내지 8주령의 48마리의 암컷 NOG-DKO 마우스를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 입수하고; 저온보존된 PBMC를 Miaotong (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 입수하고; A375 인간 흑색종 세포를 ATCC에서 입수했다. PBMC를 회수하여 PBMC를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 6E6의 양으로 주입하여 인간화 마우스 모델을 확립하였다. 1주 후, 확장된 배양 A375 세포를 수집하여 매트리겔(matrigel)과 혼합한 후 NOG-DKO 마우스에 2E6 양을 피하 접종하였다. 종양이 100 mm3의 부피로 성장했을 때 마우스를 무작위로 그룹화하여 각 그룹에 8마리씩 넣고 같은 날 투여했다. 그룹 G1에 20mg/kg의 투여량으로 이소형 대조군과 함께 투여하고; 그룹 G2에 MHG8(양성 대조군)을 20mg/kg 투여량으로 투여했고; 그룹 G3에 JYB1907hz18을 20mg/kg 투여량으로 투여했고; 그룹 G4에 틴센트릭(Tencentriq)을 10mg/kg 투여량으로 투여했고; 그룹 G5에 MHG8(20mg/kg 투여량) 및 틴센트릭(10mg/kg 투여량)을 투여하고; 그룹 G6에는 JYB1907hz18(20mg/kg 투여량)과 틴센트릭(10mg/kg 투여량)을 투여했다. 모든 마우스에게 총 8회 투여량을 주당 2회 복강내 투여하였다.
그룹화 후 28일째에, G1의 평균 종양 부피는 1110 ± 104 mm3이고, G2의 평균 종양 부피는 1088 ± 116 mm3이고, G3의 평균 종양 부피는 1000 ± 233 mm3이고, G4의 평균 종양 부피는 834 ± 155 mm3이고, G5의 평균 종양 중량은 611 ± 146 mm3이고, G6의 평균 종양 부피는 471 ± 87 mm3이고, G5 그룹의 종양 억제율은 50%이고, G6 그룹의 종양 억제율은 64%였다. G5 및 G6 그룹 모두 G1 그룹과 유의한 차이가 있었다(G5 대 G1, G6 대 G1), G5 대 G1, P <0.05; G6 대 G1, P <0.001. 다른 그룹에서는 통계적 차이가 없었다. MHG8과 티센트릭(Tecentriq)(항-PD-L1 항체) 및 JYB1907hz18과 티센트릭(항-PD-L1 항체)의 조합은 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 12 인간 유방암 JIMT-1 마우스 종양 모델에서 JYB1907hz18 항체의 약력학 연구
7 내지 8주령의 암컷 NOG-DKO 마우스 24마리를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 입수하고; 저온보존된 PBMC를 Miaotong (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 입수하고 JIMT-1 인간 유방암 세포를 ATCC에서 입수했다. PBMC를 회수하여 PBMC를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 6E6의 양으로 주입하여 인간화 마우스 모델을 확립하였다. 1주 후, 확장된 배양 JIMT-1 세포를 수집하고 매트리겔과 혼합한 후 혼합물을 NOG-DKO 마우스의 등을 통해 피하주사로 3E6 양을 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3일 때 마우스를 무작위로 그룹화하여 각 그룹에 8마리씩 넣고 같은 날 투여했다. 그룹 G1에 20mg/kg의 투여량으로 이소형 대조군과 함께 투여하고; 그룹 G2에 JYB1907hz18을 20mg/kg 투여량으로 투여했고; 그룹 G3에는 티센트릭 10 mg/kg을 투여하였다. 모든 마우스에게 총 8회 투여량을 주 2회 복강내 투여하였다.
그룹화 후 28일째에, G1의 평균 종양 부피는 740 ± 57 mm3이고, G2의 평균 종양 부피는 426 ± 45 mm3이고, G3의 평균 종양 부피는 469 ± 72 mm3이고, G2 그룹의 종양 억제율은 52%이고, G3 그룹의 종양 억제율은 45%였다. G2 및 G3 그룹 모두 G1 그룹과 유의한 차이를 보였다(G2 대 G1, G3 대 G1), G2 대 G1, P <0.001; G3 대 G1, P<0.01. JYB1907hz18 단독 및 티센트릭(항-PD-L1 항체) 단독 모두 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났으며, JYB1907hz18은 티센트릭(항-PD-L1 항체)보다 종양 성장 억제 효과가 더 우수했으며 그 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 13 인간 폐 편평 세포 암종 EBC-1 마우스 종양 모델에서 JYB1907hz18 항체의 약력학 연구
7 내지 8주령의 24마리의 암컷 NOG-DKO 마우스를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 입수하고; 저온보존된 PBMC를 Miaotong (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 입수하고 EBC-1 인간 유방암 세포를 ATCC에서 입수했다. PBMC를 회수하여 PBMC를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 6E6의 양으로 주입하여 인간화 마우스 모델을 확립하였다. 1주 후, 확장된 배양 EBC-1 세포를 수집하여 매트리겔과 혼합한 후 혼합물을 NOG-DKO 마우스의 등을 통해 피하주사로 3E6의 양으로 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3일 때 마우스를 무작위로 그룹화하여 각 그룹에 8마리씩 넣고 같은 날 투여했다. 그룹 G1에 20mg/kg의 투여량으로 이소형 대조군과 함께 투여하고; 그룹 G2에 JYB1907hz18을 20mg/kg 투여량으로 투여했고; 그룹 G3에는 티쎈트릭을 10 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 모든 마우스에게 총 8회 투여량을 주 2회 복강내 투여하였다.
그룹화 후 24일째에, G1의 평균 종양 부피는 1273 ± 212 mm3이고, G2의 평균 종양 부피는 797 ± 113 mm3이고, G3의 평균 종양 부피는 842 ± 115 mm3이고, G2 그룹의 종양 억제율은 42%이고, G3 그룹의 종양 억제율은 38%였다. 종양 성장 추세 그래프에서 JYB1907hz 단독과 티센트릭(항-PD-L1 항체) 단독 모두 이 암 종에서 종양 성장을 억제하는 성향이 있었고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
Sequence Listing <110> SHANGHAI JEMINCARE PHARMACEUTICAL CO., LTD.; JIANGXI JEMINCARE GROUP CO., LTD. <120> GARP Protein Antibody and Use Thereof <130> 0134-PA-024 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 VH;1907hz0 VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Ala Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Ile Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 HCDR1;1907hz0 HCDR1;JYB1907hz18 HCDR1 <400> 2 Gly Tyr Thr Leu 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<210> 42 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1 antibody heavy chain <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1 antibody light chain <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 LCDR1; 1907Hz0 VL LCDR1; JYB1907hz18 LCDR1 formula <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa = Lys or Arg <400> 44 Xaa Ala Ser Asp His Ile Asn Lys Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 LCDR2; 1907Hz0 VL LCDR2; JYB1907hz18 LCDR2 formula <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 45 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Xaa 1 5 <210> 46 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 H-FR1; 1907Hz0 H-FR1; 1907Hz18 H-FR1 formula <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa = Gln or Val <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa = Lys or Val <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Leu or Val <400> 46 Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 H-FR2; 1907Hz0 H-FR2; 1907Hz18 H-FR2 formula <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = Ala or Arg <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa = Gly or Ile <400> 47 Trp Met Tyr Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Gln Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10 15 Gly Ser Ile <210> 48 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 H-FR3; 1907Hz0 H-FR3; 1907Hz18 H-FR3 formula <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = Lys or Gln <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Asp or Gly <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa = Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa = Glu or Gln <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa = Arg or Thr <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 48 Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa Xaa Arg Xaa Thr Val Thr Val Asp 1 5 10 15 Lys Ser Xaa Arg Ile Val Tyr Met Xaa Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu 20 25 30 Asp Xaa Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 35 40 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 H-FR4; 1907Hz0 H-FR4; 1907Hz18 H-FR4 formula <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa = Gln or Thr <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Met or Thr <400> 49 Trp Gly Xaa Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 VH; 1907Hz0 VH; JYB1907hz18 VH formula <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa = Gln or Val <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa = Lys or Val <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Xaa = Ala or Arg <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Xaa = Gly or Ile <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa = Lys or Gln <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa = Asp or Gly <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa = Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa = Glu or Gln <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> Xaa = Arg or Thr <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> Xaa = Gln or Thr <220> <221> misc_feature <222> (118)..(118) <223> Xaa = Met or Thr <400> 50 Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Ala Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Xaa Xaa Arg Xaa Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Xaa Arg Ile Val Tyr 65 70 75 80 Met Xaa Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Xaa Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 VL; 1907Hz0 VL; JYB1907hz18 VL formula <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = Pro or Ser <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa = Thr or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa = Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa = Asp or Gly <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> Xaa = Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa = Pro or Thr <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> Xaa = Phe or Val <220> <221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> Xaa = Gly or Gln <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Asp His Ile Asn Lys Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Xaa Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Xaa Ile Xaa Xaa Leu Gln Xaa 65 70 75 80 Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 L-FR1; 1907Hz0 L-FR1; 1907Hz18 L-FR1 formula <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = Pro or Ser <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa = Thr or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa = Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa = Asp or Gly <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 L-FR3; 1907Hz0 L-FR3; 1907Hz18 L-FR3 formula <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa = Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa = Pro or Thr <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa = Phe or Val <400> 53 Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Xaa Ile Xaa Xaa Leu Gln Xaa Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8H2D7B3 L-FR4; 1907Hz0 L-FR4; 1907Hz18 L-FR4 formula <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa = Gly or Gln <400> 54 Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (101)

  1. 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 단리된 항원-결합 단백질(isolated antigen-binding protein):
    a) K D 값이 약 1.0E-12 이하인 옥텟 분석(Octet assay)에서 인간 GARP/인간 TGF-β1 복합체에 대한 결합 특성;
    b) 인간 GARP만을 발현하는 세포 또는 인간 TGF-β1만을 발현하는 세포에 대한 비결합 특성;
    c) Treg 세포에서 SMAD2 인산화의 억제 특성;
    d) 인간 GARP/인간 TGF-β1을 발현하는 HEK293T 세포로부터 TGF-β1의 방출의 억제 특성;
    e) 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 IL-2 및 IFN-γ의 방출의 억제로부터의 Treg 세포의 방지 특성; 및
    f) 인간 PBMC 이식된 마우스 GvHD 모델에서 인간 PBMC에 의해 유도되는 GvHD에 대한 Treg 세포의 억제 효과의 차단 특성.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, H-FR1을 포함하고, 여기서 H-FR1의 C 말단은 HCDR1의 N 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR1은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, H-FR1은 서열번호 5 및 서열번호 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, H-FR2를 포함하고, 여기서 H-FR2는 HCDR1과 HCDR2 사이에 위치하고, H-FR2는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, H-FR2는 서열번호 6 및 서열번호 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, H-FR3을 포함하고, 여기서 H-FR3은 HCDR2와 HCDR3 사이에 위치하고, H-FR3은 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, H-FR3은 서열번호 7 및 서열번호 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, H-FR4를 포함하고, 여기서 H-FR4의 N 말단은 HCDR3의 C 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR4는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, H-FR4는 서열번호 8 및 서열번호 25 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR1, 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR2, 서열번호 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 및 서열번호 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR4를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR1, 서열번호 6 및 서열번호 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR2, 서열번호 7 및 서열번호 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 및 서열번호 8 및 서열번호 25 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 H-FR4를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4는
    a) H-FR1: 서열번호 5, H-FR2: 서열번호 6, H-FR3: 서열번호 7, 및 H-FR4: 서열번호 8;
    b) H-FR1: 서열번호 22, H-FR2: 서열번호 23, H-FR3: 서열번호 24, 및 H-FR4: 서열번호 25
    로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, VH는 서열번호 1 및 서열번호 21 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11 및 서열번호 28 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10 및 서열번호 27 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 44에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10 및 서열번호 27 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 11 및 서열번호 28 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은
    a) LCDR1: 서열번호 10, LCDR2: 서열번호 11, 및 LCDR3: 서열번호 12;
    b) LCDR1: 서열번호 27, LCDR2: 서열번호 28, 및 LCDR3: 서열번호 12
    로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, L-FR1을 포함하고, 여기서 L-FR1의 C 말단은 LCDR1의 N 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FRl은 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, L-FR1은 서열번호 13 및 서열번호 29 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, L-FR2를 포함하고, 여기서 L-FR2는 LCDR1과 LCDR2 사이에 위치하고, L-FR2는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, L-FR3을 포함하고, 여기서 L-FR3은 LCDR2와 LCDR3 사이에 위치하고, L-FR3은 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, L-FR3은 서열번호 15 및 서열번호 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, L-FR4를 포함하고, 여기서 L-FR4의 N 말단은 LCDR3의 C 말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR4는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  33. 제32항에 있어서, L-FR4는 서열번호 16 및 서열번호 31 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR2, 서열번호 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR3, 및 서열번호 54에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR4를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 13 및 서열번호 29 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR1, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR2, 서열번호 15 및 서열번호 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR3, 및 서열번호 16 및 서열번호 31 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 L-FR4를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4는
    a) L-FR1: 서열번호 13, L-FR2: 서열번호 14, L-FR3: 서열번호 15, 및 H-FR4: 서열번호 16;
    b) L-FR1: 서열번호 29, L-FR2: 서열번호 14, L-FR3: 서열번호 30, 및 H-FR4: 서열번호 31
    로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9 및 서열번호 26 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, IgG-유래된 불변 영역 또는 IgY-유래된 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4-유래된 불변 영역을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 항체 경쇄 불변 영역은 Igκ-유래된 불변 영역 또는 Igλ-유래된 불변 영역을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 인간 Igκ-유래된 불변 영역을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 19 및 서열번호 32 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 HC를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 20 및 서열번호 33 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 LC를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 19 및 서열번호 32 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열번호 20 및 서열번호 33 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  48. 제47항에 있어서, HC 및 LC는
    a) HC: 서열번호 19 및 LC: 서열번호 20;
    b) HC: 서열번호 32 및 LC: 서열번호 33
    로 이루어진 군 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv, 디-scFv, VHH, 및/또는 dAb를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 항체는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 사슬 항체(single chain antibody), 뮤린 항체(murine antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 및 완전 인간 항체(fully human antibody)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항원-결합 단백질.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질을 포함하는 폴리펩타이드.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질 또는 제52항의 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
  54. 제53항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 치료제를 추가로 포함하는, 면역접합체.
  55. 제54항에 있어서, 치료제는 세포독성제 및 세포증식억제제의 군으로부터 선택되는, 면역접합체.
  56. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질 또는 제52항의 폴리펩타이드를 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산 분자.
  57. 제56항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  58. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질, 제52항의 폴리펩타이드, 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항의 면역접합체, 제56항의 단리된 핵산 분자, 및/또는 제57항의 벡터를 포함하는 세포.
  59. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질 또는 제52항의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질 또는 제52항의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 조건 하에 제58항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질, 제52항의 폴리펩타이드, 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항의 면역접합체, 제56항의 단리된 핵산 분자, 제57항의 벡터, 제58항의 세포, 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 애주번트(adjuvant) 및/또는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물.
  61. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질 및 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함하는 약제학적 조합물.
  62. 제61항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1의 상호작용을 억제하는 물질을 포함하는, 약제학적 조합물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1 차단제(blocking agent), PD-1 길항제(antagonist), PD-L1 길항제, PD-1 억제제, 및 PD-L1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조합물(pharmaceutical combination).
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체를 포함하는, 약제학적 조합물.
  65. 제64항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 약제학적 조합물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하는, 약제학적 조합물.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하는, 약제학적 조합물.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함하는, 약제학적 조합물.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH를 포함하는, 약제학적 조합물.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 약제학적 조합물.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하는, 약제학적 조합물.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는, 약제학적 조합물.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 41에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 약제학적 조합물.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 약제학적 조합물.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 포함하는, 약제학적 조합물.
  76. 제61항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물일 수 있는, 약제학적 조합물.
  77. 제61항 내지 제76항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물을 포함하는 키트(kit).
  78. 제1항 내지 제51항, 제52항, 제53항 내지 제55항, 제56항, 제57항, 제58항, 및/또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 종양(tumor)의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한, 단리된 항원-결합 단백질, 폴리펩타이드, 면역접합체, 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 종양은 고형 종양(solid tumor)을 포함하는, 용도.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 종양은 GARP 단백질의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 용도.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종(melanoma), 유방 종양(breast tumor), 및/또는 폐 종양(lung tumor)을 포함하는, 용도.
  82. 제61항 내지 제76항 및/또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한, 약제학적 조합물 및/또는 키트.
  83. 제82항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는, 용도.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 용도.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함하는, 용도.
  86. 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제(medicament)의 제조에서의, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질, 제52항의 폴리펩타이드, 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항의 면역접합체, 제56항의 단리된 핵산 분자, 제57항의 벡터, 제58항의 세포, 및/또는 제60항의 약제학적 조성물의 용도.
  87. 제86항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는, 용도.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 용도.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함하는, 용도.
  90. 종양의 예방, 경감 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서의, 제61항 내지 제76항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물 및/또는 제77항의 키트의 용도.
  91. 제90항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는, 용도.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 용도.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함하는, 용도.
  94. 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 유효량의 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 항원-결합 단백질, 제52항의 폴리펩타이드, 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항의 면역접합체, 제56항의 단리된 핵산 분자, 제57항의 벡터, 제58항의 세포, 제60항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는, 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 용도.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함하는, 방법.
  98. 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제61항 내지 제76항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 질병 또는 장애는 종양을 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는, 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 종양은 GARP의 발현과 관련된 종양을 포함하는, 방법.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 흑색종, 유방 종양, 및/또는 폐 종양을 포함하는, 방법.





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