TW202128754A

TW202128754A - 抗癌胚抗原相關細胞黏附分子（ｃｅａｃａｍ）抗體及其用途

Info

Publication number: TW202128754A
Application number: TW109133255A
Authority: TW
Inventors: 溫德爾布萊克威爾; 道格拉斯多爾菲; 卡桑德拉洛文史坦; 拉魯卡維羅納
Original assignee: 美商健生生物科技公司
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2021-08-01
Also published as: US11760801B2; JP2022550067A; AR120093A1; CN114746119A; EP4034160A1; WO2021059075A1; US20210095024A1

Abstract

本文提供之揭露係關於單特異性抗體及多特異性抗體，其結合CEACAM1及視情況CEACAM5及/或CEACAM6；及生產及使用所述抗體之方法。

Description

抗癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM)抗體及其用途

相關申請案之交互參照

本申請案主張2019年9月27日申請之美國臨時申請案序號62/907,224之優先權。前述申請案之揭露全文以引用方式併入本文中。

電子提交序列表之參照

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式序列表經由EFS-Web電子提交，檔案名稱為「JBI6156WOPCT1_sequence_listing.txt」，創建日期為2020年8月29日，且檔案大小為62kb。經由EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。

本文提供之揭露係關於對CEACAM1及(視情況)CEACAM5及/或CEACAM6具特異性的抗體、及生產及使用所述抗體之方法。

免疫系統控制感染或腫瘤之能力經常遭經設計以保持免疫系統受控的宿主機制破壞。此等免疫檢查點即使在適當情況下也可預防免疫活化。由於許多免疫檢查點經演化以保護健康組織及細胞，病原體及腫瘤經調適而能夠使用此等機制發揮其優勢。阻斷此等免疫檢查點在腫瘤治療上已成為成功策略，並促進了對可幫助腫瘤避免免疫控制之免疫控制機制的更深入了解。

靶向CTLA-4及PD-1的治療劑利用了此點，其係藉由阻斷負責誘導腫瘤細胞死亡的T細胞上受體。表現PD-1及CTLA-4的配體之腫瘤無法再抑制此等T細胞的免疫反應，然後藉由免疫反應清除。此新穎免疫檢查點抑制機制已導致顯著改善疾病結果，但僅在相對小部分的患者中起作用。

CEACAM家族係Ig超家族中之高度保留醣蛋白，其破壞免疫細胞之活化。正則(canonical)家族成員CEACAM1在多種癌症類型中過度表現，並於免疫活化後經T細胞上調¹²。破壞CEACAM1傳訊可增加T細胞之活性，將其釋放以殺滅腫瘤目標。CEACAM家族成員數顯示，其係免疫抑制的演化保守性機制，對如PD-1或CTLA-4之某物具有較廣泛的影響。為此，靶向CEACAM可比其他免疫檢查點更為所欲的。

CEACAM1可藉由其本身以及CEACAM家族之其他成員(諸如CEACAM5、CEACAM6、及CEACAM8)連接。目前僅靶向CEACAM1之技術僅可預防由過度表現CEACAM1之腫瘤所致的T細胞破壞，但較不會適當地露出表現其他CEACAM家族成員的腫瘤，可能導致較無效力的免疫抑制阻斷，且最終導致較無效的癌症療法。

因此，需要開發靶向數種CEACAM家族成員的額外治療劑。

本發明提供結合至CEACAM1、及/或CEACAM5、及/或CEACAM6之抗體，藉此改善T細胞介導之腫瘤生長控制。本發明之抗體結合感染細胞或腫瘤目標細胞(其等會以其他方式避免藉由宿主免疫監控進行的清除)。此等抗體亦結合免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞、或巨噬細胞(其等在腫瘤或感染細胞存在下活化)。此類結合預防CEACAM表現性目標使此類免疫細胞去活化。

由於多種CEACAM家族成員可以順式或反式連接並向下調節免疫反應，本發明之抗體結合並阻斷多種CEACAM家族成員。由於CEACAM家族之演化產生了用於免疫控制的冗餘但在基因上及機械上類似的分子，功能性治療劑必須與此等多種分子交叉反應。相較於結合單一 CEACAM家族成員的目前技術，此多特異性方法可導致更有效力的免疫抑制阻斷及更廣泛的功能性範圍。

在一個實施例中，本發明係關於一種經單離之抗CEACAM(癌胚抗原相關細胞黏附分子(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule))抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：7、8、9、10、11、及12之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：79之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：80之輕鏈可變區(VL)。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：13、14、15、16、17、及18之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：81之VH及SEQ ID NO：82之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：19、20、21、22、23、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項5之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：83之VH及SEQ ID NO：84之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：25、26、27、28、29、及30之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項7之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：85之VH及SEQ ID NO：86之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：31、32、33、34、35、及36之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項9之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：37、38、39、40、41、及42之HCDR1、 HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項11之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：43、44、45、46、47、及48之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項13之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之VH及SEQ ID NO：92之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：49、50、51、52、53、及54之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項15之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之VH及SEQ ID NO：94之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：55、56、57、58、59、及60之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項17之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：95之VH及SEQ ID NO：96之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：61、62、63、64、65、及66之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項19之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：97之VH及SEQ ID NO：98之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：67、68、69、70、71、及72之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項21之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：99之VH及SEQ ID NO：100之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：73、74、75、76、77、及78之HCDR1、 HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在另一實施例中，請求項23之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：101之VH及SEQ ID NO：102之VL。

在另一實施例中，本發明係關於一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合至CEACAM1、及視情況CEACAM5或CEACAM6，該參考抗體包含：

SEQ ID NO：79之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：80之輕鏈可變區(VL)；或

SEQ ID NO：81之VH及SEQ ID NO：82之VL；

SEQ ID NO：83之VH及SEQ ID NO：84之VL；

SEQ ID NO：85之VH及SEQ ID NO：86之VL；

SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；

SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL；

SEQ ID NO：91之VH及SEQ ID NO：92之VL；

SEQ ID NO：93之VH及SEQ ID NO：94之VL；

SEQ ID NO：95之VH及SEQ ID NO：96之VL；

SEQ ID NO：97之VH及SEQ ID NO：98之VL；

SEQ ID NO：99之VH及SEQ ID NO：100之VL；或

SEQ ID NO：101之VH及SEQ ID NO：102之VL。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體係多特異性抗體。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體係雙特異性抗體。

在另一實施例中，一種醫藥組成物包含該抗CEACAM抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。

在另一實施例中，經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段係接合至一或多個異源分子。

在另一實施例中，本發明係關於一種經單離之多核苷酸，其編碼該抗CEACAM抗體或該抗原結合片段。

在另一實施例中，本發明係關於一種經單離之多核苷酸，其編碼該抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，且包含編碼選自由SEQ ID NO：79至102所組成之群組的序列之多核苷酸序列。

在另一實施例中，本發明係關於一種載體，其包含該多核苷酸，該多核苷酸包含編碼選自由SEQ ID NO：79至102所組成之群組的序列之多核苷酸序列。在另一實施例中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含該載體。

在另一實施例中，本發明係關於一種生產該抗CEACAM抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養該宿主細胞；及回收由該宿主細胞生產之該抗體。

在另一實施例中，本發明係關於一種治療有需要對象的CEACAM陽性癌症之方法，其包含向該對象投予治療有效量的本發明之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段、或本發明之醫藥組成物，以治療該CEACAM陽性癌症。在另一實施例中，該方法其中抗CEACAM抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予。在另一實施例中，該方法係當第二治療劑係手術、化療、雄性激素剝奪療法、或輻射、或其任何組合時。

在另一實施例中，本發明係關於一種套組，其包含本發明之抗體。

圖1繪示代表性流動式細胞測量術圖；黑線顯示在經抗CD3活化T細胞上的CEACAM1表現，灰線顯示在活化之前的靜止T細胞上的基線CEACAM表現。

圖2繪示CEACAM抗體與重組CEACAM 1的結合。

圖3繪示代表性流動式細胞測量術圖；黑線顯示經轉染以過度表現CEACAM1之HEK293T細胞，灰線顯示未表現CEACAM1之親本HEK293T細胞。

圖4繪示藉由流動式細胞測量術得到的抗CEACAM1抗體與過度表現CEACAM1之HEK293T細胞的結合曲線

圖5a繪示藉由ELISA得到的抗CEACAM1抗體與固定化重組CEACAM5之結合。

圖5b繪示藉由ELISA得到的抗CEACAM1抗體與固定化重組CEACAM6之結合。

圖6a繪示代表性流動式細胞測量術圖；黑線顯示過度表現CEACAM5之HEK293T細胞，灰線顯示未表現CEACAM5之細胞。

圖6b繪示代表性流動式細胞測量術圖；黑線顯示過度表現CEACAM6之HEK293T細胞，灰線顯示未表現CEACAM6之親本HEK293T細胞。

圖7a繪示抗CEACAM1抗體與CEACAM5過度表現性HEK293T細胞之結合。

圖7b繪示抗CEACAM1抗體與CEACAM6過度表現性HEK293T細胞之結合。

圖8繪示經抗CD3抗體(深灰色)、或抗CD3抗體與抗CEACAM抗體CCMB18之組合(黑色)、或抗CD3抗體與抗CEACAM抗體CCMB61(淺灰色)之組合刺激後，PD-1陽性T細胞(CD4+或CD8+)的百分比。

圖9繪示經抗CD3抗體(深灰色)、或抗CD3抗體與抗CEACAM抗體CCMB18之組合(黑色)、或抗CD3抗體與抗CEACAM抗體CCMB61(淺灰色)之組合刺激後，Cell Trace Violet陰性T細胞(CD4+或CD8+)的百分比。

圖10a繪示在抗CEACAM結合抗體(CCMB18或CCMB61)存在或不存在下，自用抗CD3抗體刺激之T細胞的干擾素(IFN)γ分泌。

圖10b繪示在抗CEACAM結合抗體(CCMB18或CCMB61)存在或不存在下，自用抗CD3抗體刺激之T細胞的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α分泌。

所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。

所揭示之標的藉由參考以下實施方式結合附圖(其形成本揭露的一部分)可以更容易地理解。應當理解的是，所揭示之標的不限於本文中所描述及/或顯示者，且本文中使用之用語目的是僅以舉實例之方式描述具體實施例且不意欲限制所請求之標的。

除非另有具體說明，否則任何有關可能機制或作用模式或改善理由之描述係僅用以說明，且所揭示之標的不受限於任何此類建議機制或作用模式或改善理由之正確性或不正確性。

當表示為一個值範圍時，另一個實施例包括從一個具體值及/或到另一個具體值。此外，提及以範圍說明的值時包括該範圍內的每個值。所有範圍均含端點且可經組合。當數值係以近似值表示時，藉由使用先行詞「約(about)」，將可明瞭特定數值形成另一實施例。提及一具體數值時包括至少該具體值，除非上下文另有明確說明。

應當理解的是，為了清楚起見，在本文中於不同實施例的內文中描述的所揭示之標的之某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反地，為了簡潔起見，於單一實施例的內文中描述的所揭示之標的之各種特徵亦可單獨或以任何次組合提供。

定義

當用於本文時，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數。

各種關於實施方式之態樣的用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些用語係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指示。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。

用語「約(about)」當用以指涉數值範圍時，截值(cutoff)或特定數值係用以指示所載明之數值可與該列舉數值有多達10%之差異。因此，用語「約(about)」係用以涵蓋自特定值±10%或更少之變異、±5%或更少之變異、±1%或更少之變異、±0.5%或更少之變異、或±0.1%或更少之變異。

「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體(包括鼠類、人類、人源化(humanized)、及嵌合單株抗體)、抗原結合片段、多特異性抗體(諸如雙特異性、三特異性、四特異性等)、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾構形。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(heavy chain,HC)及兩條輕鏈(light chain,LC)以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH區及VL區可進一步細分成散佈於架構區(FR)中的多個高度變異區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段組成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。

「互補決定區(complementarity determining region,CDR)」係結合抗原之抗體區。CDR可使用各種描繪來定義，諸如Kabat(Wu et al.(1970)J Exp Med 132：211-50)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia et al.(1987)J Mol Biol 196：901-17)、IMGT(Lefranc et al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77)、及AbM(Martin and Thornton(1996)J Bmol Biol 263：800-15)。描述各種描繪與可變區編號之間的對應性(參見，例如Lefranc et al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77；Honegger and Pluckthun,(2001)J Mol Biol 309：657-70；國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫；網路資源，http：//www_imgt_org)。可用程式(諸如UCL Business PLC之abYsis)可用於描繪CDR。本文中所使用之用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中的任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明。

免疫球蛋白可分派為下列五大類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，視重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列而定。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可分派為兩種截然不同類型(即kappa(κ)及lambda(λ))之一者，視其等恆定域的胺基酸序列而定。

「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指結合抗原之免疫球蛋白分子之一部分。抗原結合片段可為合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域、由模擬抗體之CDR(諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、以及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3)的胺基酸殘基所組成之最小識別單元。VH域及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH域及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙鏈抗體(diabody)；例如描述於下列中者：國際專利申請案公開號WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804及WO1992/01047。

抗體可變區係由被三個「抗原結合部位(antigen binding site)」中斷的「架構(framework)」區所組成。抗原結合部位係使用各種用語定義：(i)互補決定區(CDR)(三個在VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且三個在VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3))係基於序列變異性(Wu and Kabat,J Exp Med 132：211-50,1970；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)「高度變異區(hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」(三個在VH(H1、H2、H3)，且三個在VL(L1、L2、L3))係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異之抗體可變域中的區域(Chothia and Lesk,Mol Biol 196：901-17,1987)。其他用語包括「IMGT-CDR」(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003)及「特異性決定殘基用途(Specificity Determining Residue Usage, SDRU)」(Almagro,Mol Recognit 17：132-43,2004)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫(http：//www_imgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003。

「抗體片段(Antibody fragment)」係指免疫球蛋白分子的一個部分，其保留重鏈及/或輕鏈抗原結合部位，諸如重鏈互補決定區(HCDR)1、2及3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、2及3、重鏈可變區(VH)、或輕鏈可變區(VL)。抗體片段包括廣為人知的Fab、F(ab')2、Fd及Fv片段以及包括由一個VH域所組成的域抗體(dAb)。VH域及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域進行分子內配對，或者在VH域及VL域係由分開之單鏈抗體建構體表現之情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙鏈抗體；其係例如描述於下列中：國際專利公開號WO1998/44001、國際專利公開號WO1988/01649；國際專利公開號WO1994/13804；國際專利公開號WO1992/01047。

「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體，亦即，除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的，該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可具有異源醣基化。單株抗體可係單特異性或多特異性的(諸如雙特異性的)、單價、二價、或多價的。

「嵌合抗體(chimeric antibody)」係具有衍生自不同動物物種之不同部分的分子，諸如具有衍生自鼠類mAb之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的分子。具有實質上來自人類抗體(稱為受體抗體)之可變區架構殘基及實質上來自小鼠抗體(稱為供體抗體)之互補決定區的抗體亦稱為人源化抗體。嵌合抗體主要係用以降低應用時的免疫原性(immunogenicity)並增加生產率，例如，鼠類mAb自融合瘤具有較高產率，但在人類中會產生較高的免疫原性，因而使用人類/鼠類嵌合mAb。嵌合抗體及其生產方法在所屬技術領域中係已知的(例如，PCT專利申請案WO 86/01533、WO 97/02671、及WO 90/07861、及美國專利第5,693,762號、第5,693,761號、及第5,225,539號)。此外，可執行CDR移植以改變抗體分子的某些性質，包括親和力或特異性。CDR移植之非限制性實例係揭示於美國專利第5,225,539號中。

「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。

「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此類例示性系統係展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠)。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因座之系統之間的差異、引入體細胞突變、或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體(human antibody)」可含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如在Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296：57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如在Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利公開號WO2009/085462中所述。

「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合二種不同抗原或相同抗原內兩個不同表位的抗體。雙特異性抗體可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。

「多特異性(multispecific)」係指特異性結合二或更多種不同抗原或相同抗原內二或更多個不同表位之抗體。多特異性抗體可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物)，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共享的表位。

「表位(epitope)」係指與抗體特異性結合的抗原部分。表位一般由分子部分(諸如胺基酸或多醣側鏈)之化學活性(諸如極性、非極性或疏水性)表面分群(grouping)所組成，並且可具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。表位可包含形成構形空間單元之鄰接(contiguous)及/或不鄰接(discontiguous)胺基酸。關於不鄰接表位，來自抗原線性序列之相異部分的胺基酸會透過蛋白質分子的摺疊而在3維空間中緊密靠近。

「有效量(effective amount)」係指有效達到所欲結果所需之劑量及時間的量。有效量可依各因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、及抗體在個體中誘發所欲反應之能力。有效量亦係其中有益效應超過藥劑的任何毒性或有害效應之量。

「經單離之細胞或組織樣本(isolated cell or tissue sample)」係自對象或個體之組織獲得的細胞集合。細胞或組織樣本的來源可係如來自新鮮、冷凍及/或保存器官、組織樣本、活檢、及/或吸出物之實體組織；血液或任何血液成分，諸如血漿；體液，諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液、或組織間隙液；對象妊娠或發育之任何時間的細胞。細胞或組織樣本亦可係初代或培養細胞或細胞系。視情況，組織樣本或組織片段係獲自疾病組織/器官。組織樣本可含有本質上不與該組織自然混合之化合物，諸如保存劑、抗凝血劑、緩衝劑、固定劑、營養劑、抗生素、或類似者。

「經單離(isolated)」係指已自生產出該分子的系統(諸如重組細胞)的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群(諸如合成多核苷酸或蛋白質，諸如抗體)、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物的抗體，且涵蓋經單離成更高純度的抗體，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純度。

「重組(recombinant)」係指當來自不同來源的區段經連接以生產重組DNA、抗體、或蛋白質時，藉由重組手段來製備、表現、建立、或單離的DNA、抗體、及其他蛋白質。

如本文中所使用，「特異性結合(specifically bind)」抗原目標、或對抗原目標具有「抗原特異性(antigen specific)」、或對抗原目標「具特異性(specific for)」、或與抗原具有「免疫反應性(immunoreactive)」的抗體係指本發明之抗體或多肽結合劑，其結合抗原的親和力大於結合具類似序列之其他抗原的親和力。在一個態樣中，本發明之多肽結合劑、或其片段、變體、或衍生物將以較大的親和力結合至人類抗原，此係相較於其對於其他(即，非人類)物種之類似抗原的結合親和力，但辨識並結合目標之異種同源物的多肽結合劑係在本發明之範疇內。

「對象(subject)」係指人類及非人類動物，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、小鼠、兔、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、及爬蟲類。在所述標的之許多實施例中，對象係人類。

「治療(treating/treatment)」係指任何成功地或有成功跡象地減輕或改善傷害、病變、或病況，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減少、緩解、或消退、或使病況對於患者而言更可忍受、減慢退化或衰退速率、使退化終點較不耗弱、改善對象之身體或心理健康、或延長存活時間。治療可藉由客觀或主觀參數評估，參數包括身體檢查、神經檢查、或精神狀況評估的結果。

「變體(variant)」係指因一或多個修改(例如一或多個取代、***、或缺失)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

「載體(vector)」係指在生物系統內能夠被複製或者可在此等系統之間移動的多核苷酸。載體多核苷酸一般含有元件，諸如複製起點、多腺苷酸化信號或選擇標記，彼等發揮作用以促進這些多核苷酸在利用能夠複製載體的生物組分之生物系統(諸如細胞、病毒、動物、植物、及重構生物系統)中的複製或維持。載體多核苷酸可為DNA或RNA分子或其等之混成物、單股或雙股。

「表現載體(expression vector)」係指可在生物系統或重構生物系統中用以指引多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列所編碼。

「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含藉由糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學共價連接之核苷酸鏈的合成分子。cDNA係例示性合成多核苷酸。

「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」係指包含至少二個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。

「CEACAM1」(癌胚抗原相關細胞黏附分子1)係指CEACAM1基因的蛋白質產物，例如NP-001020083.1、NP-001703.2。全長人類CEACAM1之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：1。CEACAM1之胞外域係顯示於SEQ ID NO：2，並涵蓋全長CEACAM1之殘基35至428。在人類中，11種不同CEACAM1剪接變體係已知的。在胞外免疫球蛋白樣域數、或膜錨定、及/或其胞質尾的長度方面，個別CEACAM1異構體有所不同。所有變體(包括此等剪接變體)係包括於用語「CEACAM1」內。

SEQ ID NO：1(全長人類CEACAM1)：

SEQ ID NO：2(人類CEACAM1之胞外域)：

「抗CEACAM1抗體(anti-CEACAM1 antibody)」、「辨識CEACAM1的抗體(an antibody which recognizes CEACAM1)」、「針對CEACAM1的抗體(an antibody against CEACAM1)」、或「CEACAM1的抗體(an antibody to CEACAM1)」係以足夠親和力及特異性結合至CEACAM1蛋白的抗體。一般而言，根據本教示之抗體能夠以約10^-8或10^-9M或更高之最低親和力結合CEACAM1。

「CEACAM5」(癌胚抗原相關細胞黏附分子5)係指CEACAM5基因的蛋白質產物。全長人類CEACAM5之胺基酸序列係顯示於 SEQ ID NO：3。至今人類中已描述了藉由選擇性剪接生產的兩種異構體。所有異構體(包括此等剪接變體)係包括於用語「CEACAM5」內。

SEQ ID NO：3(全長人類CEACAM5)：

「CEACAM6」(癌胚抗原相關細胞黏附分子6)係指CEACAM6基因的蛋白質產物。全長人類CEACAM6之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：4。

SEQ ID NO：4(全長人類CEACAM6)：

「抗CEACAM抗體」係一種可結合至至少CEACAM1、CEACAM5、及CEACAM6蛋白、及視情況任何其他CEACAM家族蛋白的抗體。

「CD3」係指一種抗原，其係表現於T細胞上作為多分子T細胞受體(T cell receptor,TCR)複合物之一部分，且其係由自兩個或四個受體鏈締合形成之同二聚體或異二聚體組成：CD3ε、CD3δ、CD3ζ、及CD3γ。人類CD3ε包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列。本文中所有對蛋白質、多肽、及蛋白質片段的指稱意欲指各別蛋白質、多肽、或蛋白質片段的人類版本，除非明確指定為來自非人類物種。因此，「CD3」意指人類CD3，除非指定為來自非人類物種，例如「小鼠CD3」、「猴CD3」等。

SEQ ID NO：5(人類CD3ε)：

「雙特異性抗CEACAM1/抗CD3抗體(bispecific anti-CEACAM1/anti-CD3 antibody)」、CEACAM1/CD3抗體、CEACAM1xCD3抗體、及類似者係指結合CEACAM1及CD3的抗體。

「雙特異性抗CEACAM/抗CD3抗體(bispecific anti-CEACAM/anti-CD3 antibody)」、CEACAM/CD3抗體、CEACAMxCD3抗體、及類似者係指可結合CD3及至少CEACAM1、CEACAM5、及CEACAM6蛋白、及視情況任何其他CEACAM家族蛋白的抗體。

「與...組合(in combination with)」意指將二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，其係同時以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。

「CEACAM陽性癌症(CEACAM positive cancer)」係指展示可測量CEACAM1、及/或CEACAM5、及/或CEACAM6、及/或任何其他CEACAM家族蛋白水平之癌組織或癌細胞。可使用熟知的檢定法，使用例如ELISA、免疫螢光、流動式細胞測量術、或放射免疫檢定來在活的或裂解的細胞上測量蛋白質水平。在一個實施例中，CEACAM陽性癌症係指展示可測量CEACAM1水平之癌組織或癌細胞。在另一實施例中，CEACAM陽性癌症係指展示可測量CEACAM5水平之癌組織或癌細胞。在另一實施例中，CEACAM陽性癌症係指展示可測量CEACAM6水平之癌組織或癌細胞。

「癌細胞(cancer cell)」或「腫瘤細胞(tumor cell)」係指在體內、離體、或在組織培養物中具有自發或誘導的表型改變的癌性(cancerous)、癌前(pre-cancerous)、或轉化細胞。這些變化不一定涉及新遺傳物質的攝取。儘管轉化可能來自轉化病毒的感染及新基因體核酸的摻入或外源核酸的攝取，其亦可自發地發生或在暴露於致癌物後發生，從而突變內源基因。轉化/癌症的例子如下：在體外、體內、及離體的形態改變、細胞永生化、異常的生長控制、病灶形成、增生、惡性疾病、腫瘤特異性標記水平的調節、侵襲性、在合適的動物宿主(諸如裸鼠)中的腫瘤生長、及類似者(Freshney,Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))。

「治療(treat/treatment)」係指治療性處理及疾病預防性或防治性措施兩者，其中目標係預防或減緩(減輕)非所欲的生理變化或病症。有益或所欲之臨床成果包括緩解症狀、減小疾病程度、使疾病進入穩定化(即不惡化)狀態、延緩或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、及緩解(無論部分或完全)，無論可偵測或不可偵測。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象之預期存活而延長存活。該等有治療需要的包括該等已具有狀況或病症的，以及該等易患有狀況或病症的，或者該等要防治狀況或病症的。

抗體產生

嵌合抗體及人源化抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體係描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或諸如猴之非人類靈長類的可變區)及人類恆定區。在一進一步實例中，嵌合抗體係一種「類別轉換(class switched)」抗體，其中類別或子類別已自親本抗體者轉變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體係人源化抗體。一般而言，非人類抗體經人源化以降低對於人類的免疫原性，同時保留親本非人類抗體的特異性及親和力。通常而言，人源化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)係衍生自非人類抗體，且FR(或其部分)係衍生自人類抗體序列。人源化抗體亦會視情況包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生出HVR殘基的抗體)之對應殘基取代，以例如回復或改善抗體特異性或親和力。

人源化抗體及其製造方法係綜述於例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann et al.,Nature 332：323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號、及第7,087,409號；Kashmiri et al.,Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(specificity determining region,SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重塑(resurfacing)」)；Dall'Acqua et al.,Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組(FR shuffling)」)；及Osbourn et al.,Methods 36：61-68(2005)and Klimka et al.,Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述用於FR改組的「導引選擇」方法)。

可用於人源化的人類架構區包括但不限於：使用「最適(best-fit)」方法選擇之架構區(參見例如Sims et al.J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定子群的人類抗體之共有序列的架構區(參見例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta et al.J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)架構區或人類生殖系架構區(參見例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR庫之架構區(參見例如Baca et al., J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok et al.,J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

人類抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體係人類抗體。人類抗體可使用所屬技術領域中已知的各種技術生產。人類抗體係大致上描述於van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。

人類抗體可藉由向基因轉殖動物投予免疫原(immunogen)來製備，該基因轉殖動物已經修飾，以回應於抗原挑戰而生產完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此類動物一般含有全部或一部分的人類免疫球蛋白基因座，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機地整合至動物的染色體中。在此類基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已去活化。關於用於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其描述XENOMOUSE^TM技術；美國專利第5,770,429號，其描述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其描述K-M MOUSE®技術、及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其描述VELOCIMOUSE®技術)。來自由此類動物產生之完整抗體的人類可變區可經進一步修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合。

人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製成。用於生產人類單株抗體的人類骨髓瘤細胞系及小鼠-人類異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系已經過描述。(參見例如KozborJ.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。額外方法包括下列中所描述者：例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞系生產單株人類IgM抗體)、及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(Trioma技術)亦描述於Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)、及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)。

亦可藉由將自人類衍生噬菌體展示庫選擇的Fv殖株可變域序列單離來產生人類抗體。接著，可將此類可變域序列與所欲的人類恆定域組合。用於自抗體庫選擇人類抗體的技術係描述於下。

庫衍生抗體

本發明之抗體可藉由針對具有所欲(多種)活性之抗體篩選組合庫來單離。例如，用於產生噬菌體展示庫及篩選此類庫(針對具有所欲結合特徵的抗體)之各種方法係所屬技術領域中已知的。此類方法係綜述於例如Hoogenboom等人於Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)，且進一步描述於例如McCafferty et al.,Nature 348：552-554；Clackson et al.,Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury於Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。

在某些噬菌體展示方法中，VH及VL基因的貯庫係藉由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)進行分開選殖，並於噬菌體庫中隨機地重組，接著可針對抗原結合噬菌體篩選該等噬菌體庫，如描述於Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)。噬菌體一般以單鏈Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自免疫化來源之庫提供對免疫原具有高親和力的抗體，而不需要建構融合瘤。替代地，天然貯庫(naive repertoire)可經選殖(例如，自人類)，以提供廣泛範圍的非自身抗原及自身抗原之單一種抗體來源而未進行任何免疫化，如Griffiths et al.,EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可以合成方式製造天然庫，其藉由自幹細胞選殖未重排V基因區段，並使用含有隨機序列之PCR引子，以編碼高度可變CDR3區，並達成體外重排，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號、及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。

在本文中將自人類抗體庫單離的抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。

多特異性抗體

在某些實施例中，本文提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係具有針對至少兩個不同部位之結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對CEACAM1，且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對CEACAM5，且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對CEACAM6，且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至CEACAM1、或CEACAM5、或CEACAM6之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現CEACAM1、或CEACAM5、或CEACAM6之細胞。可將雙特異性抗體製備為全長抗體或抗體片段。

抗體變體

在某些實施例中，設想了本文提供之抗體之胺基酸序列變體。例如，可為所欲的是改善抗體的結合親和力及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中、或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內的殘基發生缺失、及/或***、及/或取代。可進行缺失、***、及取代的任何組合以達到最終建構體，前提是最終建構體具有所欲特徵，例如抗原結合。

在某些實施例中，本文提供之抗體經改變以增加或降低抗體醣基化的程度。抗體的醣基化部位添加或缺失可藉由改變胺基酸序列方便地達成，以建立或移除一或多個醣基化部位。

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體的Fc區中，藉此產生Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc區)，該人類Fc區序列包含在一或多個胺基酸位置處之胺基酸修飾(例如取代)。

在某些實施例中，本發明設想一種抗體變體，其具有一些但非所有效應功能，使其成為其中抗體在體內的半衰期係重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)係不必要或有害之應用的所欲候選者。可進行體外及/或體內細胞毒性檢定，以確認CDC及/或ADCC活性之降低/去除。例如，可進行Fc受體(FcR)結合檢定，以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIII。造血細胞上的FcR表現係彙總於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁的表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性的體外檢定之非限制性實例係描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。替代地，可採用非放射性檢定方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI^TM非放射性細胞毒性檢定(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega,Madison,Wis.)。可用於此類檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及自然殺手(natural killer,NK)細胞。替代地或額外地，可在體內評估所關注分子的ADCC活性，例如在動物模型中，該動物模型諸如揭示於Clynes et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中者。亦可進行C1q結合檢定，以確認抗體無法結合C1q，且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可執行CDC檢定(參見例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S,and M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用所屬技術領域中已知的方法，執行FcRn結合及體內清除/半衰期判定(參見例如Petkova,S.B.et al.,Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

效應功能降低的抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327、及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297、及327中之二或更多處具有取代的Fc突變體，其包括殘基265及297經取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

描述某些改善或減弱與FcR之結合的抗體變體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312、及Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。)

在某些實施例中，抗體變體包含具有改善ADCC的一或多個胺基酸取代之Fc區，例如在Fc區之位置298、333、及/或334(EU殘基編號)處的取代。

在一些實施例中，在Fc區中進行改變，其導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity,CDC)改變(即，改善或減弱)，如例如描述於美國專利第6,194,551號、WO 99/51642、及Idusogie et al.J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

增加半衰期且改善與新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor,FcRn)(負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.117：587(1976)及Kim et al.,J.Immunol.24：249(1994))的結合之抗體係描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。該等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改善Fc區與FcRn的結合。此類Fc變體包括在下列Fc區殘基中之一或多處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。

在某些實施例中，可為所欲的是建立半胱胺酸工程改造抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代之殘基發生於抗體之可接觸部位處。藉由以半胱胺酸取代該等殘基，反應性硫醇基團藉此定位於抗體之可接觸部位處，並可用於將抗體接合至其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分，以建立免疫接合物，如本文中進一步描述。在某些實施例中，下列殘基中任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。如例如美國專利第7,521,541號中所述，可產生半胱胺酸工程改造抗體。

重組方法及組成物

例如如美國專利第4,816,567號中所述，可使用重組方法及組成物生產抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗CD122抗體的經單離核酸。此類核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH的胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一進一步實施例中，提供一或多種載體(例如表現載體)，其包含此類核酸。在一進一步實施例中，提供一種宿主細胞，其包含此類核酸。在一個此類實施例中，宿主細胞包含下列(例如，已經下列轉化)：(1)載體，其包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸；或(2)第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列的核酸，該第二載體包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製造抗CD122抗體之方法，其中該方法包含：在適用於該抗體表現的條件下，培養包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞(如上文所提供)；及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

就抗CD122抗體的重組生產而言，例如如上所述之編碼抗體的核酸經單離並***一或多種載體，以用於進一步選殖及/或表現於宿主細胞中。可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)，以將此類核酸容易地單離並定序。

用於編碼抗體之載體之選殖或表現的合適宿主細胞包括本文所述之原核細胞或真核細胞。例如，抗體可在細菌中生產，特別是當不需要醣基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽於細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號、及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254，其描述抗體片段於大腸桿菌中之表現。)在表現之後，可將抗體自細菌細胞漿(bacterial cell paste)單離於可溶性部分中，且可進一步純化。

除了原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母菌之真核微生物係編碼抗體之載體的合適選殖或表現宿主，包括真菌及酵母菌株，其醣基化路徑已經「人源化」，導致生產具有部分或完全人類醣基化型態的抗體。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)、及Li et al.,Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

用於醣基化抗體表現之合適宿主細胞亦衍生自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出許多可與昆蟲細胞配合使用的桿狀病毒(baculoviral)株，特別是用於秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染。

亦可利用植物細胞培養物作為宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號、及第6,417,429號(描述用於在基因轉殖植物中生產抗體的PLANTIBODIES^TM技術)。

亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，經調適以在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系可係有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系之其他實例係藉由SV40(COS-7)轉化的猴腎CV1系；人類胚胎腎系(293或293細胞，如描述於例如Graham et al.,J.Gen Virol.36：59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽托利細胞(sertoli cell)(TM4細胞，如描述於例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如描述於例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，諸如Y0、NS0、及Sp2/0。關於適用於抗體生產之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.),pp.255-268(2003)。

抗體修飾

本發明之抗體可經受所屬技術領域中已知的一或多種修飾，其可用於操控肽的儲存穩定性、藥物動力學、及/或生物活性之任何態樣，諸如例如效力、選擇性、及藥物交互作用。肽可經受的化學修飾包括但不限於下列中之一或多者與肽的接合：聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(dextran)、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylated polyol)(例如甘油)及聚乙烯醇、多聚乙醯神經胺酸(colominic acid)或其他基於碳水化合物之聚合物、胺基酸之聚合物、及生物素衍生物。在Cys殘基處之蛋白質之PEG接合係揭示於例如Goodson,R.J.& Katre,N.V.(1990)Bio/Technology 8,343及Kogan,T.P.(1992)Synthetic Comm.22,2417。

其他有用的修飾包括但不限於醯化，其使用諸如例如美國專利第6,251,856號及WO 00/55119中所述之方法及組成物。

治療性投予

本發明之抗體可個別投予或與其他藥理上活性劑組合投予。將了解的是，此類組合療法涵蓋不同治療方案，其包括但不限於以單一劑型或以不同的個別劑型來將多種藥劑一起投予。若藥劑以不同劑型存在，則投予可同時或近乎同時進行，或可遵循涵蓋不同藥劑投予的任何預定方案。

例如，當用於治療癌症時，本發明之抗體可在具有一或多種藥劑(包括免疫治療劑)的組合治療方案中進行有利投予。

投予方法

本發明之抗體可以醫藥組成物投予，該等醫藥組成物包含所屬技術領域中已知的標準載劑，該等標準載劑係用於遞送蛋白質及肽；並藉由基因療法投予。較佳的是，醫藥組成物包括(於混合物中)：醫藥上(即生理上)可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑，以及靶向CEACAM1、或CEACAM5、或CEACAM6的分子中之一或多者(作為活性成分)。在一個實施例中，CEACAM1靶向分子係特異性結合至CEACAM1之抗體。在一個實施例中，CEACAM5靶向分子係特異性結合至CEACAM5之抗體。在一個實施例中，CEACAM6靶向分子係特異性結合至CEACAM6之抗體。含有肽作為活性成分之醫藥組成物的製備係所屬技術領域中所充分了解。一般而言，將此類組成物製備成為注射劑(液體溶液或懸浮液)，然而，亦可製備適用於注射前液體中溶液或懸浮液之固體形式。亦可將製劑乳化。活性治療成分通常與醫藥上(即生理上)可接受且與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑係例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、或類似物、及其組合。此外，所欲時，組成物可含有少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑，其增強活性成分之有效性。

CEACAM靶向分子可以經中和的生理上可接受之鹽形式，經調配於醫藥組成物中。在一個實施例中，CEACAM靶向分子係特異性結合至CEACAM之抗體。合適的鹽包括酸加成鹽(亦即，以肽分子之游離胺基形成)，且其係以無機酸形成，該等無機酸諸如例如鹽酸或磷酸，或以有機酸形成，該等有機酸諸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸、及類似者。由游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼(諸如例如鈉、鉀、銨、鈣、或氫氧化鐵)、以及有機鹼(諸如異丙胺、三甲胺、2-二乙基胺基醇、組胺酸、普羅卡因(procaine)、及類似者)。

醫藥組成物可藉由口服或腸胃外途徑來全身投予。非限制性腸胃外投予途徑包括皮下、肌內、腹膜腔內、靜脈內、經皮、吸入、鼻內、動脈內、鞘內、腸道、舌下、或直腸。由於胺基酸序列的不穩定本質，腸胃外投予係較佳的。較佳的投予模式包括用於鼻腔或支氣管吸收之氣霧劑；用於靜脈內、肌內、胸骨內、或皮下注射之懸浮液；及用於口服投予之化合物。

例如，靜脈內投予可藉由注射單位劑量來執行。當用以指涉本發明之醫藥組成物時，用語「單位劑量(unit dose)」係指適合作為用於人類之單元式劑量的實體上分開單位(physically discrete unit)，各單位含有預定量的活性材料，該預定量的活性材料係經計算以與所需稀釋劑聯合產生所欲的治療效果；亦即，用於稀釋濃縮或純物質(液體或固體)的液體，使該物質為正確(稀釋)的使用濃度。針對注射劑投予，組成物係處於無菌溶液或懸浮液，或者可乳化於醫藥上及生理上可接受之水性或油性媒劑(其可含有防腐劑、穩定劑、及用於使溶液或懸浮液與接受者之體液(即血液)等張的材料)。

適合使用的賦形劑係水、磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)、0.15M氯化鈉水溶液、右旋糖、甘油、稀釋乙醇、及類似物、及其混合物。說明性穩定劑係聚乙二醇、蛋白質、醣類、胺基酸、無機酸、及有機酸，其等可單獨使用或作為混合物使用。所使用之投予量或數量以及途徑係基於個別條件判定，並對應於所屬技術領域中具有通常知識者已知之類似類型的應用或適應症的用量。

醫藥組成物係以與劑量配方相容之方式投予，並且以治療有效量投予。欲投予之量取決於待治療之對象，以及該對象免疫系統利用活性成分的能力。欲投予之所需活性成分的精確量取決於執業醫師之判斷，且針對各個體為特定。

製備醫藥配方之進一步指引可見於例如Gilman et al.(eds),1990,Goodman and Gilman's：The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th ed.,Pergamon Press；及Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；Avis et al.(eds),1993,Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Dekker,New York；Lieberman et al.(eds),1990,Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Dekker,New York。

本發明進一步設想組成物，其包含IR促效劑或拮抗劑肽、及生理上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑(如本文所詳述)。

下列實例說明本發明。此等實例不應解讀為限制本發明之範疇。實例係為了說明之目的而包括，且本發明僅受限於申請專利範圍。

實例1.抗CEACAM mAb的產生

1.1使用OmniRats®產生抗CEACAM mAb

OmniRat®含有嵌合人類/大鼠IgH基因座(包含22個人類V_H、所有呈天然構形的人類D及J_H區段，該等區段係連接至大鼠C_H基因座)再加上完整的人類IgL基因座(12個Vκ係連接至Jκ-Cκ，且16個Vλ係連接至Jλ-Cλ)。(參見例如Osborn,et al.(2013)J Immunol 190(4)：1481-1490)。因此，該等大鼠展現減少表現的大鼠免疫球蛋白，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因回應於免疫會經歷類別轉換及體細胞突變，以產生具有完整人類可變區之高親和力嵌合人類/大鼠IgG單株抗體。OmniRat®的製備及使用、及此類大鼠所攜帶的基因體修飾係描述於WO14/093908中。

OmniRat係以融合至10-His標籤的人類CEACAM1(R&D Systems,#2244-CM,SEQ ID NO：6)之胞外域免疫，並每三至四天在尾基、跗關節(hock)、腋窩(axillary)、及耳部用相同抗原進行雙側注射來促進免疫。在48天免疫方案之後，收穫來自大鼠之淋巴結，用以產生融合瘤，並篩選融合瘤上清液(如下所述)。

SEQ ID NO：6

1.2使用噬菌體展示庫產生抗CEACAM mAb

如Shi et al.,J Mol Biol 397：385-96,2010 and WO2009/085462)中所述，自兩組重新的pIX噬菌體展示庫中，使用標準方法來選擇CEACAM1結合Fab。簡而言之，兩組稱為V3.0及V5.0之庫係藉由多樣化(diversifying)人類支架(scaffold)而產生，其中生殖系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01、及IGHV5-51*01係與人類IGHJ-4袖珍基因經由H3環來重組(IGHJ-6袖珍基因亦用於V5.0)，而人類生殖系VLκ基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)、及B3(IGKV4- 1*01)係與IGKJ-1袖珍基因重組以組裝出完整的VH及VL域。在重鏈及輕鏈可變區中，選擇常與蛋白質及肽抗原接觸的H1、H2、L1、L2、及L3環周圍的位置以用於多樣化。限制所選位置處的序列多樣性至出現在各別IGHV或IGLV之IGHV或IGLV生殖系基因家族中的各位置處之殘基。利用V3.0庫中長度為7至14個胺基酸及V5.0庫中長度為6至19個胺基酸的短型至中型合成環，在H3環處產生多樣性。H3處之胺基酸分布係設計為模仿在人類抗體中所觀察到的胺基酸變異。用來產生庫之支架係依據其等之人類VH及VL生殖系基因來源來命名。對V3.0及V5.0組兩者，將三種重鏈庫之各者與四種生殖系輕鏈或生殖系輕鏈庫組合以為各組庫產生12種獨特VH：VL組合，其係用於選擇實驗。

V區選殖。依照製造商的規程，使用RNeasy 96套組(Qiagen)，將來自噬菌體之融合瘤細胞溶解物的總RNA純化。將所得RNA藉由使用DropSense定量，並儲存於-80℃下或用於cDNA合成，該cDNA合成係使用RT-PCR之Invitrogen SuperScript III First-Strand合成系統(Invitrogen)進行。第一股cDNA合成係分別使用黏合至重鏈、κ鏈、及λ鏈之恆定區的基因特異性引子來進行。將包含至多3μg的純化RNA、基因特異性引子、dNTP混合物、反應緩衝液、25mM MgCl₂、DTT、RNaseOUT^TM(40U/μl,Invitrogen)、及SuperScript^TM III RT(200U/μl，Invitrogen目錄號18080-051)的RT-PCR反應混合物，在50℃下培養50分鐘，並在85℃下培養5分鐘。將所得單股cDNA儲存在-20℃下，或直接用於PCR擴增。使用Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen)進行PCR反應。使用最佳化PCR條件，藉由分別黏合至前導序列及重鏈、κ鏈、及λ鏈的恆定區之正向及反向引子來擴增v區片段。將所得PCR片段定序，使所回收v區之胺基酸序列進行密碼子最佳化並選殖進入基於pUnder的表現載體，該表現載體攜帶具有F405L κ突變的IgG2 Sigma恆定區。

Expi293小規模轉染及純化。選殖自免疫活動或噬菌體展示識別的所選抗體，並將其表現為IgG2 Sigma，且經由小的2ml規模來純化。將Expi293^TM細胞(ThermoFisher Scientific)以1.25×10⁵至2.25×10⁵個存活細胞/mL密度接種於Expi293^TM表現培養基中，且在37℃、7% CO₂的條件下培養於125mL至2L搖瓶中。當密度達到對數相生長而為3×10⁶至5×10⁶個存活細胞/mL，且存活率為98%至99%時，使細胞進行次培養。

在轉染當天，判定存活細胞密度及存活率百分比。依照製造商的轉染規程(ThermoFisher公開號MAN0007814)，以3×10⁶個存活細胞/mL的密度轉染細胞。在轉染後第6天，以850xG離心15分鐘來收穫培養物，然後進行純化。使用mAb Select Sure樹脂(GE Healthcare)自澄清上清液純化抗體，並將其透析至PBS中。使用DropSense儀器(Trinean)在濾液上藉由A280測量來判定蛋白質濃度。

實例2.抗CEACAM mAb與CEACAM1的結合表徵

2.1 與重組CEACAM1的結合。針對與重組CEACAM1蛋白的結合來進行ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)，以篩選融合瘤上清液及噬菌體展示衍生抗體。

在4℃下，將盤用50μl的1μg/ml的CEACAM1(#2244-CM,R&D Systems)塗佈整夜。隔天，在16h中，在室溫下將盤用200μl於PBS中的0.4%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma,A9647)阻斷1hr。在Biotek洗盤機上，將盤用300μl於PBS中的0.02% Tween-20洗滌一次。將CEACAM mAb自10μg/ml開始進行1/2 log稀釋至0.0001ug/ml於0.4% BSA或僅PBS中，進行各抗體的接種。將50μl的各稀釋液添加至塗佈盤。將盤在室溫下培養約30min。接著，使用Biotek洗盤機，將盤用300μl於PBS中的0.02% Tween-20洗滌3次。將50ul的1：10,000山羊抗huFc'2-HRP(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-036-098)添加至盤中。將盤在室溫下培養約30min。接著，使用Biotek洗盤機，將盤用300ul的PBS/0.02% Tween-20洗滌3次。添加50μl的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB,Sigma T0440)，允許顯色，接著添加50ul的4N H₂SO₄。使用微量盤讀取機(PerkinElmer)，在450nm下分析盤。將同型對照組(CNTO8939抗體，其對RSV病毒具特異性，具有人類IgG2 sigma主鏈)以濃度10μg/ml，接種於最後3個盤上。使用XY散佈圖來分析450nm下的吸光度(圖2)，在對數轉換之後產生非線性擬合曲線，並計算EC50值，其使用GraphPad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)。就數種抗體而言，由於曲線擬合不佳，無法使用GraphPad Prism來計算EC50；在此等情況下，以可用曲線之中點，進行EC50值的視覺上評估；結合至重組CEACAM1的EC50值係表示於表1中。

2.2抗CEACAM mAb與過度表現CEACAM1之細胞的結合。

抗CEACAM mAb與過度表現CEACAM1之HEK293K細胞的結合。

產生過度表現CEACAM1之HEK293T細胞。

使用編碼CEACAM1(SEQ ID NO：1)及GFP標籤(LPP-U0045-Lv105-200,Genecopeoia)的慢病毒載體，來產生過度表現全長CEACAM1之HEK293T(ATCC,Manassas,VA)細胞。將細胞以新鮮培養基洗滌，然後以2×10⁶個細胞/ml懸浮於含有8ug/ml聚凝胺的Opti-MEM(Thermo)中。在12孔組織培養盤中，每孔添加0.5ml的細胞懸浮液(1×10⁶個細胞)。以0.3、1.0、3.0、及5.0單位的感染多重性(multiplicity of infection,MOI)，添加病毒粒子。將盤輕輕混合，然後在室溫下於通風櫃 (hood)中培養20min。在37℃下，將盤以1500g離心90分鐘。將0.5ml新鮮Opti-MEM培養基添加至細胞。將盤在37℃下培養48至72小時。在UV光下檢查細胞呈現的GFP信號。在長滿80至90%時，將細胞轉移至較大的100mm皿或T-75，並將培養基以含有0.5ug/mL嘌呤黴素(puromycin)之選擇培養基取代。在接下來幾天或週，持續監測細胞，並將細胞保存於選擇培養基(補充有0.5μg/mL嘌呤黴素的Opti-MEM)，直到大多數細胞在選擇培養基下存活下來為止。細胞係使用標記抗體針對表現蛋白質來染色，並經製備以用於FACS分析。當達到足夠表現水平時，將穩定細胞冷凍下來，或者針對高/中或低表現性細胞來進行分類。使用0.5μg/ml的嘌呤黴素，來進行1週的選擇。

流動式細胞測量術

使用流動式細胞測量術，來確認CEACAM-1之表面表現。使用流動式細胞測量術時，在室溫下將染色細胞阻斷15min，該FACS染色緩衝液含有人類Fc block(Miltenyi Biotech,1：20)、及LIVE/DEAD^TM Fixable Near-IR Dead Cell Stain套組(Invitrogen,1：500)。接著，在4℃下，於50ul的FACS染色緩衝液/孔中，將細胞用下列抗人類抗體中之一者染色30min：藻紅素(phycoerythrin,PE)接合抗CEACAM-1抗體(R&D Systems，目錄號FAB2244P，1：50)、藻紅素接合小鼠IgG2b同型對照組(Biolegend)、及未標示抗CEACAM-1(對CD66a具特異性)(Millipore，目錄號MABT65，1：50)。以PE抗小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch,1：200)，偵測抗體及小鼠IgG1同型。

然後，使用標準技術，將CEACAM1過度表現性細胞次選殖，並針對CEACAM1陽性細胞之純化族群加以分類(圖3)。接著，使用此等細胞，藉由流動式細胞測量術來產生結合曲線(圖4)。使用山羊抗人類Fc抗體(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-606-098)，來偵測結合至過度表現性細胞之表面的CEACAM抗體。大多數抗體與CEACAM-1表現性HEK293T細胞結合非常良好，且未滴定出(titer out)，其意指未達到無法偵測結合的濃度(表2)。

實例3.抗CEACAM mAb與CEACAM5及CEACAM6的結合表徵

3.1與重組CEACAM5及CEACAM6的結合。根據實例2中所述之規程，使用ELISA來執行純化噬菌體及融合瘤抗體對重組CEACAM5(R&D Systems #4128-CM)及CEACAM6(R&D Systems #3934-CM)之特異性的交叉篩選。針對mAb與CEACAM5結合的結合曲線係顯示於圖5a，而與CEACAM6結合的結合曲線係顯示於圖5b。CEACAM1抗體對CEACAM5及CEACAM6蛋白具有可變的結合，其證實一些交叉反應性(表3)。

3.2與過度表現CEACAM5及CEACAM6之細胞的結合。根據實例2中所述之規程，使用編碼CEACAM5(LPP-G0056-Lv105-100,Genecopeoia)及CEACAM6(LPP-G0304-Lv105-100,Genecopeoia)之慢病毒載體的轉導，來產生過度表現CEACAM5及CEACAM6的HEK293T細胞。根據實例2中所述之程序，使用流動式細胞測量術來確認細胞表面上的CEACAM5或CEACAM6表現(圖6a及圖6b)。使用FACS Aria消除低蛋白質表現者，以將CEACAM-5穩定匯集物分類。針對CEACAM5及CEACAM6細胞系，使用PE接合抗CEACAM-1、5、6(Biolegend目錄號342358，1：50)及PE接合小鼠IgG2b同型對照組(Biolegend)。針對mAb與過度表現CEACAM5之細胞結合的結合曲線係顯示於圖7a，而與過度表現CEACAM6之細胞結合的結合曲線係顯示於圖7b。結果意味著，一些CEACAM1抗體具有顯著的交叉反應性，且與表現CEACAM5或CEACAM6之細胞結合，但其他CEACAM1抗體與此等細胞幾乎無或無結合(表4)。

實例4.抗CEACAM mAb的結構表徵

使用標準技術獲得抗體的cDNA序列及胺基酸轉譯。在判定多肽序列後，使用用於放大表現的標準方法對編碼可變區或全長抗體的一些抗體cDNA進行密碼子最佳化。

表5顯示所選抗CEACAM抗體之重鏈CDR胺基酸序列。

表6顯示所選抗CEACAM抗體之輕鏈CDR胺基酸序列。

表7顯示所選抗CEACAM抗體之VH及VL胺基酸序列。

實例5.藉由抗CEACAM mAb調節T細胞活化及效應功能

評估抗CEACAM抗體調節T細胞活化及效應功能之能力。此係在CEACAM結合抗體存在或不存在下，以對CD3具特異性的抗體(OKT3,Janssen，經工程改造於IgG1主鏈上)活化正常供體T細胞來進行。藉由評估分化、增生、及細胞介素分泌，來評估T細胞之活性。顯示T細胞活化參數之可變調節的代表性樣本，係如下文實例所示。

周邊血液單核細胞(PBMC)刺激。將PBMC解凍或自新鮮血液/leukopack(HemaCare,Northridge,CA)單離，並用RPMI 1640培養基(Thermo)洗滌，該RPMI 1640培養基補充有GlutaMAX^TM及10% FBS(Thermo)。使用CellTrace^TM Violet細胞增生套組(Thermo)，評估PBMC的增生。將PBMC計數，然後以2×10⁶/ml再懸浮。將含有抗CEACAM抗體稀釋液於培養基中或單獨培養基之50ul，添加至96孔圓底盤。將含有抗CD3或培養基之50ul，添加至96孔圓底盤。將細胞以每孔100ul或2×10⁵個細胞接種。在37℃下，將盤培養3天。

染色及細胞測量分析。在培養之後，將盤離心，並收穫100ul的上清液以用於細胞介素分析。將細胞團塊再懸浮於50ul BD FACS緩衝液(BD Biosciences)中，該BD FACS緩衝液含有Fc block及Live/Dead染料(Life technologies #L34957)。將盤在室溫下培養15min，並用150uL的BD FACS緩衝液洗滌。將細胞團塊再懸浮於50ul的BD FACS緩衝液30min，該BD FACS緩衝液含有包括下列之抗體之混合物：抗PD-1抗體，其與Brilliant Violet(BV)605^TM(Biolegend #329923)接合；抗CD25抗體，其與BV650(BD #563719)接合；抗CD4抗體，其與BV7119(Biolegend #317440)接合；抗CD8抗體，其與BV785(Biolegend #301045)接合；及抗CEACAM1，其與異藻藍蛋白(allophycocyanin)(APC,Biolegend #305312)接合。將細胞用150uL的BD FACS緩衝液洗滌，並於50ul eBioscence FoxP3緩衝液中透化20min。將細胞以150uL eBioscience FoxP3透化/洗滌緩衝液洗滌，然後再懸浮於eBioscience FoxP3透化/洗滌緩衝液(含有根據流動式小組(Flow Panel)的流動式細胞測量術抗體)30min。將細胞以150uL的eBioscience FoxP3透化/洗滌緩衝液洗滌，然後固定於150ul BD cytofix中，並在BD Fortessa流動式細胞測量儀上進行分析。藉由運行Meso Scale Devices人類Th1/Th2組織培養套組(MSD,K15010B)，來分析細胞介素。簡而言之，將來自T細胞培養物之上清液在預塗佈及阻斷的96孔盤上培養1hr，用MSD偵測抗體摻合物偵測1hr，接著洗滌及添加讀取緩衝液。接著，在MSD Sector盤讀取機上讀取該等盤。使用螢光值，以使用來自相同盤的標準曲線，計算細胞介素濃度。

結果證實，CEACAM結合抗體調節了所有三種類型的T細胞活化。首先，在回應於CEACAM1抗體與抗CD3抗體組合之暴露的T細胞上，誘導表面標記表現(圖8)。使用T細胞表面上的PD-1表現，作為T細胞活化之標記(圖8)。相較於僅CD3，CD4及CD8 T細胞兩者在CEACAM結合抗體存在下，皆增加了至多兩倍的PD-1水平(p<0.0001,ANOVA)。其次，T細胞增生之分析因cell trace violet(CTV)的稀釋而證實了***細胞增加(p<0.0001,ANOVA)(圖9)。最後，在CD3刺激存在下，T細胞上的CEACAM連接增加了細胞介素IFNγ(圖10a，p=0.0105，ANOVA)及TNFα(圖10b，p=0.0146，ANOVA)的產生。

實例6.藉由抗CEACAM1抗體調節小鼠模型中T細胞對腫瘤的反應。

抗CEACAM抗體亦可用來證實在人源化小鼠模型中的療效。阻斷T細胞上的CEACAM交互作用，會改善T細胞上發生的活化及功能，且因此可在人源化小鼠模型的腫瘤生長抑制或消退中扮演角色。在對帶有腫瘤的小鼠植入T細胞的同時、之前、或之後投予抗CECAM抗體，可增加該等T細胞控制腫瘤生長的能力，該等腫瘤係來自血液惡性疾病諸如白血病、淋巴瘤、或骨髓瘤；或實體腫瘤諸如黑色素瘤、***癌、或非小細胞肺癌細胞系。

<110> 美商健生生物科技公司(Janssen Biotech,Inc.) 維羅納，拉盧卡．I.(VERONA,Raluca I.) 多夫，道格拉斯．V.(DOLFI,Douglas V.) 布萊克威爾，溫德爾．拉瑪．B(BLACKWELL,Wendell Lamar B) 洛威史汀，卡山卓拉．L.(LOWENSTEIN,Cassandra L.)

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 人工序列

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<223> 融合至10-His標籤的人類CEACAM1之胞外域

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<210> 7

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> LCDR3

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<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB02 VH

<400> 79

<210> 80

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB02 VL

<400> 80

<210> 81

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB03 VH

<400> 81

<210> 82

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB03 VL

<400> 82

<210> 83

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB04 VH

<400> 83

<210> 84

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB04 VL

<400> 84

<210> 85

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB07 VH

<400> 85

<210> 86

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB07 VL

<400> 86

<210> 87

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB09 VH

<400> 87

<210> 88

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB09 VL

<400> 88

<210> 89

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB18 VH

<400> 89

<210> 90

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB18 VL

<400> 90

<210> 91

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB20 VH

<400> 91

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB20 VL

<400> 92

<210> 93

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB23 VH

<400> 93

<210> 94

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB23 VL

<400> 94

<210> 95

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB35 VH

<400> 95

<210> 96

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB35 VL

<400> 96

<210> 97

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB42 VH

<400> 97

<210> 98

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB42 VL

<400> 98

<210> 99

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB61 VH

<400> 99

<210> 100

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB61 VL

<400> 100

<210> 101

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB66 VH

<400> 101

<210> 102

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCMB66 VL

<400> 102

Claims

一種經單離之抗CEACAM(癌胚抗原相關細胞黏附分子)抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：7、8、9、10、11、及12之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項1所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：79之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：80之輕鏈可變區(VL)。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：13、14、15、16、17、及18之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項3所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：81之VH及SEQ ID NO：82之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：19、20、21、22、23、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項5所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：83之VH及SEQ ID NO：84之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：25、26、27、28、29、及30之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項7所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：85之VH及SEQ ID NO：86之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：31、32、33、34、35、及36之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項9所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：37、38、39、40、41、及42之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項11所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：43、44、45、46、47、及48之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項13所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：91之VH及SEQ ID NO：92之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：49、50、51、52、53、及54之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項15所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：93之VH及SEQ ID NO：94之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：55、56、57、58、59、及60之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項17所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：95之VH及SEQ ID NO：96之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：61、62、63、64、65、及66之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項19所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：97之VH及SEQ ID NO：98之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：67、68、69、70、71、及72之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項21所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：99之VH及SEQ ID NO：100之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：73、74、75、76、77、及78之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如請求項23所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：101之VH及SEQ ID NO：102之VL。
一種經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合至CEACAM1、及視情況CEACAM5或CEACAM6，該參考抗體包含：

a)SEQ ID NO：79之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：80之輕鏈可變區(VL)；或

b)SEQ ID NO：81之VH及SEQ ID NO：82之VL；

c)SEQ ID NO：83之VH及SEQ ID NO：84之VL；

d)SEQ ID NO：85之VH及SEQ ID NO：86之VL；

e)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；

f)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL；

g)SEQ ID NO：91之VH及SEQ ID NO：92之VL；

h)SEQ ID NO：93之VH及SEQ ID NO：94之VL；

i)SEQ ID NO：95之VH及SEQ ID NO：96之VL；

j)SEQ ID NO：97之VH及SEQ ID NO：98之VL；

k)SEQ ID NO：99之VH及SEQ ID NO：100之VL；或

l)SEQ ID NO：101之VH及SEQ ID NO：102之VL。
如請求項1至25中任一項所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
如請求項1至26中任一項所述之經單離之抗CEACAM抗體，其中該抗體係多特異性抗體。
如請求項1至27中任一項所述之經單離之抗CEACAM抗體，其中該抗體係雙特異性抗體。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至28中任一項所述之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
如請求項1至29中任一項所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，其係接合至一或多個異源分子。
一種經單離之多核苷酸，其編碼如請求項1至28中任一項所述之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段。
一種經單離之多核苷酸，其編碼該抗CEACAM抗體或其抗原結合片段，且包含編碼選自由SEQ ID NO：79至102所組成之群組的序列之多核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項32所述之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項33所述之載體。
一種生產如請求項1至28中任一項所述之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養如請求項34所述之宿主細胞；及回收由該宿主細胞生產之該抗體。
一種治療有效量之如請求項1至28中任一項所述之經單離之抗CEACAM抗體或其抗原結合片段、或如請求項34所述之醫藥組成物於製造用以治療有需要對象的CEACAM陽性癌症之藥物的用途。
如請求項36所述之用途，其中該抗CEACAM抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予。
如請求項37所述之用途，其中該第二治療劑係手術、化療、雄性激素剝奪療法、或輻射、或其任何組合。
一種套組，其包含如請求項1至28中任一項所述之抗體。