ES2865196T3 - Anticuerpos anti-HER3 humana alostéricos de neuregulina - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-HER3 humana alostérico no competitivo con la neuregulina que comprende: una cadena pesada en donde el dominio variable comprende: - una H-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, - una H-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 3, y - una H-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende: - una L-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 6, - una L-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 7, y - una L-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8, y - que se une específicamente a HER3 con sustancialmente la misma afinidad que un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-HER3 humana alostéricos de neuregulina

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-HER3 humana alostéricos no competitivos con la neuregulina (NRG) y a usos de los mismos en métodos de diagnóstico y terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano ErbB/HER de tirosina cinasas receptoras (RTK) incluye cuatro miembros: EGFR (ErbB1/HER1), HER2 (c-Neu, HER2), HER3 (HER3) y HER4 (HER4). Los receptores HER comprenden un dominio glucosilado extracelular que consiste en cuatro dominios estructurales, marcados 1 a 4, seguido por un dominio transmembranario y una parte del extremo C intracelular que contiene un dominio cinasa para su acoplamiento con las vías de señalización. Excepto HER3, la región intracelular contiene una actividad de tirosina cinasas. La señalización está mediada por dimerización de receptor inducida por ligando y la posterior fosforilación que conduce a la activación de las vías de señalización citoplásmica. HER2 no tiene ligando específico debido a que está naturalmente en una conformación "activa". Los otros receptores HER existen como monómeros inactivos con las moléculas plegadas de tal forma que se prevenga la dimerización. La unión de ligando a los dominios 1 y 3 induce cambios conformacionales importantes que exponen por último lugar el bucle de dimerización en el dominio 2 del receptor. Esta exposición del bucle de dimerización permite la dimerización del receptor.

El receptor HER3, que se describió por primera vez en 1990, es el único receptor miembro de la familia de HER que carece de la actividad de cinasa intrínseca y la señalización aguas abajo se logra mediante heterodimerización. Así, el receptor HER3, como monómero, se denomina "no propio" y no puede formar homodímeros. La unión del ligando neuregulina (NRG) al receptor HER3 provoca la heterodimerización de HER3 con los otros receptores de la familia de HER (preferentemente HER2). Dentro del heterodímero, el dominio de cinasa de HER3 actúa de activador alostérico de su componente de la familia de HER.

HER3 participa en la tumorigénesis de diversos cánceres que incluyen cáncer de mama y de ovario (Lee-Hoeflich ST, Cancer Res. 2008; McIntyre E, Breast Cancer Res Treat. 2010; Tanner B, J Clin Oncol. 2006). La expresión de HER3 se correlaciona con la progresión tumoral y la reducida supervivencia del paciente en melanoma maligno y metástasis, y está asociada con disminución de la supervivencia en cáncer de ovario. Y, lo que es más importante, en cáncer de mama, los tumores con baja expresión de HER2, que no cumplen los requisitos para el tratamiento con herceptin, frecuentemente se "programan" para expresar fuertemente HER3 (Smith et al. Br. J. Cancer 2004), y los tumores HER2+++, que se vuelven resistentes a herceptin después del tratamiento prolongado, se "reprograman" para expresar fuertemente HER3 (Narayan, Cancer Res. 2009). La resistencia a cetuximab también se asoció a la expresión en exceso de HER3 en cáncer de pulmón (Wheeler, Oncogene 2008) y carcinomas colorrectales (Lu Cancer Res 2007), junto con desregulación de la internalización/degradación de EGFR. Recientemente, la expresión en exceso de HER3 se asoció significativamente a peor supervivencia sin metástasis en carcinoma colorrectal (Ho-Pun-Cheung, Int J Cancer 2010). Así, la expresión en exceso de HER3 y la señalización compensatoria mediante la activación de la vía PI3K/AKT participan en el desarrollo de resistencia al tratamiento con terapias dirigidas a HER (anticuerpos y TKI) (Wheeeler 2008, Lu 2007, Narayan, 2009, Sergina, 2007), pero también al tratamiento con terapias dirigidas a IGFR (Desbois-Mouthon, Clin Cancer Res 2009) y con agentes quimioterapéuticos (Kruser, Exp Cell Res 2010).

Todos estos resultados sugieren que los agentes dirigidos a HER3, y en particular los anticuerpos, podrían ayudar en el entendimiento adicional de la función de la señalización de HER3 en cánceres y usarse especialmente como inmunoterapéuticos eficientes.

Actualmente, no se comercializa ningún anticuerpo anti-HER3 terapéutico, aunque la bibliografía científica enfatiza fuertemente el interés de elegir como diana HER3 en la oncología terapéutica. Dos anticuerpos humanos están actualmente en desarrollo por Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis (anticuerpo MM-121; documento de patente PCT WO2008/100624) y U3 PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen (U3-1287 o AMG-888; documento de patente PCT WO2007/077028). El anticuerpo MM-121 participa en un ensayo clínico de fase I en CPCNP y en un ensayo de fase I/II en cáncer de mama ER+ PR+ HER2-. El anticuerpo U3-1287 está en fase I en CPCNP en asociación con erlotinib. Un anticuerpo biespecífico contra EGFR/HER3 MEHD7945A (Genentech; documento de patente PCT WO2010/108127) está todavía en investigación y desarrollo. Un anticuerpo biespecífico contra HER2/HER3 MM-111 (Merrimack Pharmaceuticals; documentos de patente PCT WO2005/117973, WO2006/091209) participa en los ensayos clínicos de fase I/II, solo o en combinación con trastuzumab o lapatinib, en cáncer de mama amplificado por HER2.

Todos los anticuerpos anteriormente mencionados bloquean el sitio de unión a heregulina del receptor HER3, reduciendo así estas terapias con anticuerpo para los tumores adictos a los ligandos. El elegir HER3 con anticuerpos que se dirigen al sitio de unión a heregulina de HER3 debe hacer posible evitar la resistencia a terapias dirigidas o quimioterapia en cáncer de mama amplificado por HER2 resistente, para ampliar el campo de aplicación de las terapias dirigidas a cáncer de mama HER2bajo, que actualmente no cumplen los requisitos para dicho tratamiento, o para tratar cánceres de mama triple negativo, que expresan HER3 y para los que aún no está disponible terapia dirigida.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN:

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-HER3 humana alostéricos no competitivos con la neuregulina (NRG) y a usos de los mismos en métodos de diagnóstico y terapéuticos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN:

Los inventores han caracterizado un anticuerpo murino anti-HER3 humana, denominado 9F7-F11, que tiene especificidad única por células HER3-positivas en presencia del ligando neuregulina. Los inventores han mostrado, en particular, que la afinidad por 9F7-F11/HER3 no se inhibe cuando está presente la neuregulina (el anticuerpo 9F7-F11 no es competitivo con la neuregulina), sino que además la afinidad por 9F7-F11/HER3 aumenta alostéricamente cuando la neuregulina está presente en el entorno de células HER3-positivas (9F7-F11 es un anticuerpo anti-HER3 alostérico). El anticuerpo 9F7-F11 alostérico no competitivo con NRG inhibe las vías MAPK, AKT y p53, bloquea el ciclo celular en la fase G1, inhibe la proliferación celular y restaura la apoptosis de células tumorales. Este anticuerpo 9F7-F11 único reduce el crecimiento tumoral de cánceres pancreáticos adictos a NRG, y cánceres de mama amplificados por HER2 o triple negativos, y es más eficiente en combinación con el anticuerpo específico contra HER2 pertuzumab que la combinación de HER2 trastuzumab/pertuzumab o anticuerpos contra HER2 usados solos.

Lazrek et al. describen que el Ab H4B-121 completamente humano y los Abs 16D3-C1 y 9F7-F11 monoclonales de ratón inhibieron el crecimiento tumoral en ratones sin pelo xenoinjertados con células epidermoides, pancreáticas o de cáncer de mama triple negativo.

El anticuerpo 9F7-F11 terapéutico tendría más utilidad clínica en un amplio espectro de tumores que un anticuerpo competitivo con ligando o un anticuerpo no competitivo con ligando que carece de efecto alostérico, que se dirigió a mecanismos más restringidos de activación de HER3. Debido a su efecto alostérico, el anticuerpo 9F7-F11 no competitivo con NRG sería más eficiente en los tumores dependientes de ligando que otros anticuerpos, cuando la neuregulina es secretada por los tumores (secreción autocrina) o por el microentorno (secreción paracrina). Debido a su efecto alostérico, el anticuerpo 9F7-F11 sería más eficiente cuando la resistencia, mediada por la regulación por incremento de neuregulina, ocurre (es decir, resistencia a cetuximab en carcinoma colorrectal). Debido a su efecto alostérico, la unión a 9F7-F11 se podría mejorar cuando los receptores se heterodimerizan después de la activación por ligandos. Tomados conjuntamente, el anticuerpo anti-HER3 humano alostérico no competitivo con NRG 9F7-F11 se puede usar para tratar condiciones donde los anticuerpos terapéuticos son clínicamente ineficaces.

En conclusión, los anticuerpos de la invención proporcionan las siguientes ventajas con respecto a los anticuerpos anti-HER3 descritos en el estado de la técnica:

- son anticuerpos alostéricos

- son no competitivos con la neuregulina

- proporcionan un espectro de acción más amplio (tanto cánceres independientes de ligando como dependientes de ligando)

- son más eficientes en los tumores autocrinos o paracrinos dependientes de ligando (debido a su efecto alostérico)

- son más eficientes cuando ocurre la resistencia, mediada por regulación por incremento de ligandos de HER3 (por ejemplo: resistencia a anticuerpos o TKI, a quimioterapia, a antihormona)

- se pueden usar para tratar afecciones donde los anticuerpos terapéuticos existentes son clínicamente ineficaces, tales como para cáncer de mama triple negativo, cáncer pancreático, otros nichos (por ejemplo: carcinoma de células renales)

Definiciones:

El término "neuregulina" tiene su significado general en la técnica y se usa frecuentemente indistintamente con el término ''heregulina''. La familia de la heregulina incluye heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); la patente de EE. UU. N25.641.869; y Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); factores de diferenciación de neu (NDF), factores de crecimiento de la glía (GGF); actividad inductora de receptores de acetilcolina (ARIA); y factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Para una revisión, véase Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) y Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995); Falls y D. (2003). "Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies". Experimental Cell Research 284 (1): 14-30.

El término "HER3" se refiere al receptor HER3 humana como se describe en Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909 (1990); véase, por lo tanto, Kani et al., Biochemistry 44: 15842-857 (2005), Cho y Leahy, Science 297: 1330- 1333 (2002)). HeR3 ^{también se conoce como "HER3".}

El término "anticuerpo anti-HER3 humana" se refiere a un anticuerpo dirigido contra HER3 humana.

Según la presente invención, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado, y se usarán igualmente en la presente invención. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Como tal, el término anticuerpo engloba no solo moléculas de anticuerpo completo, sino también fragmentos de anticuerpos, así como variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada es une a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadenas pesadas que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados conjuntamente CH). Las regiones variables de tanto las cadenas ligeras (VL) como pesadas (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de unión al antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren importantes propiedades biológicas, tales como asociación de cadenas de anticuerpo, secreción, movilidad transplacentaria, unión al complemento y unión a receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte del extremo N del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación de anticuerpos y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están constituidos por restos que son principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Ocasionalmente, los restos de regiones no hipervariables o estructurales (FR) influyen en la estructura del dominio global y, por lo tanto, el sitio de combinación. Las regiones determinantes de la complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión a la inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de unión al antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden la CDR expuesta de cada una de una región V de la cadena pesada y ligera. Las regiones estructurales (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos intercaladas entre CDR.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado del anticuerpo 9F7-F11, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.

Según la invención, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene región estructural variable y regiones constantes de un anticuerpo humano, pero retiene las CDR del anticuerpo 9F7-F11.

El término "Fab" indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado de extremo N de la cadena H y toda la cadena L, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papaína, se unen juntos mediante un enlace disulfuro.

El término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión al antígeno, que es ligeramente más grande que el Fab unido por un enlace disulfuro de la región bisagra, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, pepsina.

El término "Fab'" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.

Un polipéptido Fv de una sola cadena ("scFv") es un heterodímero VH::VL covalentemente unido que se expresa normalmente de una fusión de genes que incluye VH y VL que codifica genes unidos por un conector que codifica péptidos. "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos divalentes y multivalentes de los anticuerpos pueden formarse o espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o se pueden generar acoplando scFv monovalentes por un conector peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH-VL). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno.

Por "purificado" y "aislado" se indica, cuando se refiere a un anticuerpo según la invención o a una secuencia de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado", como se usa en el presente documento, significa que están presentes preferentemente al menos 75 % en peso, más preferentemente al menos 85 % en peso, más preferentemente aún al menos 95 % en peso, y lo más preferentemente al menos 98 % en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula "aislada" de ácido nucleico que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácidos nucleicos que no codifican el polipéptido; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente las características básicas de la composición.

Anticuerpos de la invención:

El presente texto describe aislar anticuerpos anti-HER3 alostéricos no competitivos con la neuregulina (NRG) o fragmentos de los mismos. En particular, los inventores han producido un hibridoma productor de anticuerpo anti-HER3 murino (9F7-F11). Los inventores han clonado y caracterizado el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de dicho mAb 9F7-F11, y así han determinado el dominio de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo como se describe en la Tabla 1:

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de VH, VL y CDR de mAb 9F7-F11

El texto describe un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por HER3, que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3.

El texto también describe un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por HER3, que comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3.

El anticuerpo monoclonal puede comprender una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3.

La presente invención se refiere, por consiguiente, a un anticuerpo anti-HER3 humana alostérico no competitivo con la neuregulina que comprende:

una cadena pesada en donde el dominio variable comprende:

- una H-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, - una H-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 3,y - una H-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende:

- una L-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 6,

- una L-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 7, y

- una L-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8, y

- que se une específicamente a HER3 con sustancialmente la misma afinidad que un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

En particular, la invención proporciona un anticuerpo anti-HER3 monoclonal que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3.

En una realización particular, la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y/o la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

En otra realización, el anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo quimérico, preferentemente un anticuerpo quimérico de ratón/ humano. En particular, dicho anticuerpo quimérico de ratón/humano puede comprender los dominios variables del anticuerpo 9F7-F11 como se ha definido anteriormente.

En otra realización, el anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo humanizado. En particular, en dicho anticuerpo humanizado, el dominio variable comprende regiones estructurales aceptoras humanas y opcionalmente dominio constante humano, si está presente, y CDR humanas no donantes, tales como CDR de ratón como se ha definido anteriormente.

El texto describe además fragmentos anti-HER3 dirigidos contra HER3 de dichos anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

En particular, la presente invención se refiere a un fragmento de un anticuerpo según la invención seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

En otro aspecto, el texto describe un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Métodos de producción de los anticuerpos de la invención:

Los anticuerpos anti-HER3 humana de la invención se pueden producir por cualquier técnica conocida en la técnica, tales como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, tanto sola como en combinación.

Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos, por técnicas convencionales para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando métodos en fase sólida bien conocidos, preferentemente usando un aparato de síntesis de péptidos comercialmente disponible (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos de la invención se pueden sintetizar por técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden obtener como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedadores eucariotas o procariotas adecuados que expresarán los anticuerpos deseados, de los que se pueden aislar después usando técnicas bien conocidas.

Por consiguiente, un objeto adicional de la invención se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un anticuerpo según la invención o un fragmento del mismo según la invención.

En una realización particular, la invención se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo monoclonal según la invención. En particular, la secuencia de ácidos ^{nucleicos puede ser SEQ ID NO: 9 o} SeQ ^{ID NO: 10.}

En una realización particular, el texto describe una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio VH del anticuerpo obtenible del hibridoma 9F7-F11 o el dominio VL del anticuerpo obtenible del hibridoma 9F7-F11.

En una realización particular, el texto describe una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 9.

En una realización particular, el texto describe una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 10.

Tabla 2: Ácidos nucleicos de los dominios VH y VL del mAb 9F7-F11 de la invención

Normalmente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o de ARN, que se pueden incluir en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o vector viral.

Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo por el que una secuencia de ADN o de ARN (por ejemplo, un gen extraño) se puede introducir en una célula hospedadora, de manera que transformen el hospedador y promuevan la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.

Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para provocar o dirigir la expresión de dicho anticuerpo tras la administración a un sujeto. Los ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para la célula de animal incluyen promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor LTR y potenciador del virus de la leucemia murina de Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason 10 et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena H de la inmunoglobulina y similares.

Se puede usar cualquier vector de expresión para la célula de animal, mientras que un gen que codifica la región C del anticuerpo humano se pueda insertar y expresar. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) y similares. Otros ejemplos de plásmidos incluyen los plásmidos de replicación que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integrativos, tales como, por ejemplo, pUC, pcDNAc, pBR y similares. Otros ejemplos de vector viral incluyen adenoviral, retroviral, virus del herpes y vectores de AAV. Dichos virus recombinantes se pueden producir por técnicas conocidas en la técnica, tales como transfectando células de encapsidación o por transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Los ejemplos típicos de células de encapsidación de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes defectuosos en la replicación se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos de patente WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.

El presente texto describe además una célula hospedadora que se ha transfectado, infectado o transformado por un ácido nucleico y/o un vector según la invención.

Por consiguiente, un objeto adicional de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención.

El término "transformación" significa la introducción de una secuencia de gen, de ADN o de ARN "exógeno" (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula hospedadora, de manera que la célula hospedadora exprese el gen o la secuencia introducida para producir una sustancia deseada, normalmente una proteína o enzima codificada por el gen o la secuencia introducida. Una célula hospedadora que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha "transformado".

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para producir un anticuerpo de la invención en un sistema de expresión adecuado. El término "sistema de expresión" significa una célula hospedadora y vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por ADN exógeno llevado por el vector e introducido en la célula hospedadora.

Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospedadoras de E. coli y vectores plasmídicos, células hospedadoras de insecto y vectores de baculovirus, y células hospedadoras de mamífero y vectores. Otros ejemplos de células hospedadoras incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras de Kluyveromyces o Sacaromyces, estirpes celulares de mamífero (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos celulares de mamífero primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), célula CHO en la que un gen dihidrofolato reductasa (denominado en lo sucesivo "gen DHFR") es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, denominado en lo sucesivo "célula YB2/0") y similares.

El presente texto también describe un método de producción de una célula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo según la invención, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedadora recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Dichas células hospedadoras recombinantes se pueden usar para la producción de anticuerpos de la invención.

En otra realización particular, el método comprende las etapas de:

(i) cultivar el hibridoma 9F7-F11 en condiciones adecuadas para permitir la expresión del anticuerpo 16D3-C1; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En una realización particular, el anticuerpo quimérico humano de la presente invención se puede producir obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH como se describe previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano insertándolo en un vector de expresión para la célula de animal que tiene genes que codifican CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula de animal.

Como dominio CH de un anticuerpo quimérico humano puede ser cualquier región que pertenezca a una inmunoglobulina humana, pero las de clase IgG son adecuadas y también se pueden usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase de IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Por lo tanto, como CL de un anticuerpo quimérico humano puede ser cualquier región que pertenezca a una Ig, y se pueden usar las de clase kappa o clase lambda.

Los métodos de producción de anticuerpos quiméricos implican ADN recombinante convencional y las técnicas de transfección de genes se conocen bien en la técnica (véase Morrison SL. et al. (1984) y los documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).

El anticuerpo humanizado de la presente invención se puede producir obteniendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican dominios CDR, como se describe previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo humanizado insertándolo en un vector de expresión para la célula de animal que tiene genes que codifican (i) una región constante de la cadena pesada idéntica a la de un anticuerpo humano y (ii) una región constante de la cadena ligera idéntica a la de un anticuerpo humano, y que expresa los genes introduciendo el vector de expresión en una célula de animal.

El vector de expresión de anticuerpo humanizado puede ser o de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo existe en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células de animales, y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L de anticuerpo en células de animales, se prefiere el vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem (Shitara K et al. 1994). Los ejemplos de vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento de patente WO 97/10354), pEE18 y similares.

Se conocen bien en la técnica los métodos de producción de anticuerpos humanizados basados en ADN recombinante convencional y técnicas de transfección génica (véase, por ejemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al.

1985). Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de Cd R (documento de patente EP 239.400; publicación PCT WO91/09967; patentes de EE. UU. N° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), inactivación o acondicionamiento superficial (documentos de patente EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)) y barajado de cadenas (patente de EE. UU. N° 5.565.332). También se conoce la tecnología de ADN recombinante general para la preparación de dichos anticuerpos (véase la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

El Fab de la presente invención se puede obtener tratando un anticuerpo que en concreto reacciona con HER3 humana con una proteasa, la papaína. Por lo tanto, el Fab se puede producir insertando el ADN que codifica el Fab del anticuerpo en un vector para el sistema de expresión procariota, o para el sistema de expresión eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (según convenga) para expresar el Fab.

El F(ab')2 de la presente invención se puede obtener tratando un anticuerpo que en concreto reacciona con HER3 humana con una proteasa, la pepsina. Por lo tanto, el F(ab')2 se puede producir uniendo el Fab' descrito a continuación por un enlace tioéter o un enlace disulfuro.

El Fab' de la presente invención se puede obtener tratando F(ab')2 que en concreto reacciona con HER3 humana con un agente reductor, el ditiotreitol. Por lo tanto, el Fab' se puede producir insertando el ADN que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresión para procariota, o un vector de expresión para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (según convenga) para realizar su expresión.

El scFv de la presente invención se puede producir obteniendo ADNc que codifica los dominios VH y VL como se describe previamente, construyendo ADN que codifica scFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariota, o un vector de expresión para eucariota, y luego introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota (según convenga) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, se puede usar una tecnología bien conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un fragmento scFv donante, e injertarlas en una región estructural humana del fragmento scFv de estructura tridimensional conocida (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO98/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).

Se contemplan modificación (modificaciones) de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede desear mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se conoce que cuando un anticuerpo humanizado se produce simplemente injertando solo CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión del antígeno se reduce en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en CDR sino también en FR, están directamente o indirectamente asociados a la actividad de unión al antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos restos de aminoácidos con diferentes restos de aminoácidos derivados de FR de VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión. Para resolver el problema, en anticuerpos injertados con CDR humanas, se tienen que hacer intentos para identificar, entre secuencias de aminoácidos de FR de Vh y VL de anticuerpos humanos, un resto de aminoácido que está directamente asociado a la unión al anticuerpo, o que interactúa con un resto de aminoácido de CDR, o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociado con la unión al antígeno. La reducida actividad de unión al antígeno se podría aumentar reemplazando los aminoácidos identificados con restos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano.

Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, y todavía obtener una molécula funcional que codifica un anticuerpo con características deseables.

En la preparación de los cambios en las secuencias de aminoácidos, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos en conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende, en general, en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobia y características de carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

El presente texto también describe variantes conservativas de la función de los anticuerpos de la presente invención.

Las "variantes conservativas de la función" son aquellas en las que se ha cambiado un resto de aminoácido dado en una proteína o enzima sin alterar la conformación y la función global del polipéptido, que incluyen, pero no se limitan a, sustitución de un aminoácido con uno que tiene propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial del enlace de hidrógeno, ácido, básico, hidrófobo, aromático y similares). Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados se pueden diferenciar en una proteína de manera que el porcentaje de similitud de secuencias de proteína o de aminoácidos entre cualesquiera dos proteínas de función similar pueda variar y pueda ser, por ejemplo, desde el 70 % hasta el 99 % como se determina según un esquema de alineamiento, tal como por el método de clústeres, en donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una "variante conservativa de la función" también incluye un polipéptido que tiene al menos 60 % de identidad de aminoácidos como se ha determinado por los algoritmos BLAST o FASTA, preferentemente al menos 75 %, más preferentemente al menos 85 %, todavía preferentemente al menos 90 %, e incluso más preferentemente al menos 95 %, y que tiene las mismas propiedades o funciones o sustancialmente similares a la proteína nativa u original con la que se compara.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más del 80 %, preferentemente más del 85 %, preferentemente más del 90 %, de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente el 90 %, preferentemente más del 95 %, son similares (funcionalmente idénticas) a lo largo de la longitud completa de la secuencia más corta. Preferentemente, se identifican secuencias similares u homólogas por alineamiento usando, por ejemplo, el programa compilado GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, versión 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias, tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, se pueden sustituir ciertos aminoácidos con otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida de actividad apreciable. Puesto que la capacidad y la naturaleza interactiva de una proteína definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteínas, y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, mientras que, sin embargo, se obtiene una proteína con propiedades similares. Así, se contempla que se pueden hacer diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos anticuerpos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.

Se conoce en la técnica que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o puntuación similar y aún dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía se obtiene una proteína de función biológicamente equivalente.

Como se explica resumidamente anteriormente, por lo tanto, las sustituciones de aminoácidos se basan, en general, en la similitud relativa de los sustituyentes de aminoácidos de la cadena lateral, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Se conocen bien por los expertos en la técnica las sustituciones a modo de ejemplo que consideran diversas de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Por consiguiente, el presente texto también describe un anticuerpo que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende:

- una H-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, - una H-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 3,

- una H-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4,

- una L-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 6,

- una L-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 7,

- una L-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8, y

- que se une específicamente a HER3 con sustancialmente la misma afinidad que un anticuerpo que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3, y más preferentemente con sustancialmente la misma afinidad que el anticuerpo murino anti-HER39F7-F11.

Dichos anticuerpos se pueden ensayar para la unión específica por cualquier método conocido en la técnica. Se pueden usar muchos formatos de ensayos de unión competitiva diferentes para el agrupamiento de epítopes. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivo usando técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA, "inmunoensayos de sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de precipitina, ensayos de precipitina por difusión en gel, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de fijación del complemento. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New York). Por ejemplo, BIACORE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) es uno de una variedad de formatos de ensayo de resonancia de plasmones superficiales que son rutinariamente usados para paneles de agrupación de epítopes de anticuerpos monoclonales. Además, se pueden realizar ensayos de bloqueo cruzado rutinarios, tales como los descritos en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988.

Los anticuerpos manipulados de la invención incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones a los restos de la región estructural dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones de la región estructural se hacen para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "retromutar" uno o más restos de la región estructural a la secuencia de estirpe germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener restos de la región estructural que se diferencian de la secuencia de estirpe germinal de la que se deriva el anticuerpo. Dichos restos se pueden identificar comparando las secuencias de la región estructural del anticuerpo con las secuencias de estirpe germinal de las que deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región estructural a su configuración de estirpe germinal, las mutaciones somáticas pueden ser "retromutadas" a la secuencia de estirpe germinal, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. Dichos anticuerpos "retromutados" también pretenden estar englobados por la invención. Otro tipo de modificación de la región estructural implica mutar uno o más restos dentro de la región estructural, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para retirar epítopes de linfocitos T para así reducir la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la publicación de patente de EE. UU. N° 20030153043 por Carr et al.

Además o alternativo a las modificaciones hechas dentro de la región estructural o regiones CDR, los anticuerpos de la invención se pueden manipular para incluir modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede ser químicamente modificado (por ejemplo, se pueden fijar uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificado para alterar su glucosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de restos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de forma que se altere el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, aumente o disminuya. Este enfoque se describe aún más en la patente de EE. UU. N° 5.677.425 por Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para reducir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácido en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra de Fc de forma que el anticuerpo tenga unión alterada con la proteína A estafilocócica (SpA) alterada con respecto a la unión a SpA del dominio de bisagra de Fc. Este enfoque se describe con más detalle en la patente de EE. UU. N° 6.165.745 por Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de EE. UU. N° 6.277.375 por Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para contener un epítope de unión a receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de EE. UU. N° 5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al.

En aún otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un resto de aminoácido con un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o más aminoácidos con un resto de aminoácido diferente de forma que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se ^{describe con más detalle en las patentes de EE.} Uu. ^{N° 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter et al.}

En otra realización, se pueden sustituir uno o más aminoácidos seleccionados de restos de aminoácidos con un resto de aminoácido diferente de forma que el anticuerpo tenga unión alterada a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o suprimida. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE. UU. N° 6.194.551 por Idusogie et al.

En otra realización, se alteran uno o más restos de aminoácidos para así alterar la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe aún más en la publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fc modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe aún más en la publicación PCT WO 00/42072 por Presta. Además, los sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRIl, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591 -6604, documento de patente WO2010106180).

En otra realización adicional, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación).

La glucosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de hidrato de carbono se pueden llevar a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región estructural de la región variable para así eliminar la glucosilación en ese sitio. Dicha aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE. UU. N° 5.714.350 y 6.350.861 por Co et al.

Además o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tiene un tipo de glucosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tiene cantidades reducidas de o restos no fucosilo o un anticuerpo que tiene elevadas estructuras de GlcNac bisecantes. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterada aumentan la capacidad de los anticuerpos ADCC. Dichas modificaciones de hidrato de carbono se pueden llevar a cabo, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar los anticuerpos recombinantes de la invención para así producir un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento de patente EP 1.176.195 por Hang et al. describe una estirpe celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de forma que el anticuerpo expresado en dicha estirpe celular presente hipofucosilación o falta de restos fucosilo. Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos de la invención se pueden producir por expresión recombinante en una estirpe celular que presenta un patrón de hipofucosilación o no fucosilación, por ejemplo, una estirpe celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica fucosiltransferasa. La publicación PCT WO 03/035835 por Presta describe una estirpe celular de CHO de variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a hidratos de carbono asociados a Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe estirpes celulares manipuladas para expresar glucosil transferasas modificadoras de glucoproteína (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de forma que los anticuerpos expresados en las estirpes celulares manipuladas presenten elevadas estructuras de GlcNac bisecantes que dan como resultado una elevada actividad de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech.

17:176-180). Eureka Therapeutics describe además células de mamífero CHO genéticamente manipuladas capaces de producir anticuerpos con patrón de glucosilación de mamífero alterado que carece de restos fucosilo (http://www.eurekainc.com/aSboutus/companyoverview.html). Alternativamente, los anticuerpos de la invención se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos manipulados para el patrón de glucosilación de tipo mamífero y capaces de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patrón de glucosilación (véase, por ejemplo, el documento de patente EP1297172B1).

Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado reactivo de éster o de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo por una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende englobar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi o ariloxi (C1 - C10)-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos de pegilación de proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente EP 0154316 por Nishimura et al. y EP 0401 384 por Ishikawa et al.

Otra modificación de los anticuerpos que se contempla por la invención es un conjugado o una fusión de proteína de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención con proteína sérica, tal como albúmina de suero humano o un fragmento de la misma, para aumentar la semivida de la molécula resultante. Dicho enfoque se describe, por ejemplo, en el documento de patente EP0322094 por Ballance et al.

Otra posibilidad es una fusión de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención con proteínas capaces de unirse a proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano para aumentar la semivida de la molécula resultante. Dicho enfoque se describe, por ejemplo, en el documento de patente EP 0486 525 por Nygren et al.

Inmunoconjugados:

Un anticuerpo de la invención se puede conjugar con una marca detectable para formar un inmunoconjugado anti-HER3. Las marcas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca enzimática, una marca bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos de preparación y detección de dichos inmunoconjugados detectablemente marcados son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica, y se describen más abajo en más detalle.

La marca detectable puede ser un radioisótopo que se detecta por autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles con el fin de la presente invención son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C.

Los inmunoconjugados anti-HER3 también se pueden marcar con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo fluorescentemente marcado se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcado fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-HER3 se pueden marcar detectablemente acoplando un anticuerpo con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcados con quimioluminescia incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

Similarmente, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar los inmunoconjugados anti-HER3 de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcado incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-HER3 se pueden marcar detectablemente uniendo un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana con una enzima. Cuando el conjugado anti-HER3-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto de enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar detectablemente inmunoconjugados poliespecíficos incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la técnica conocerán otras marcas adecuadas que se pueden emplear según la presente invención. La unión de restos marcadores a anticuerpos monoclonales anti-HER3 humana se puede llevar a cabo usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990; y Coligan, arriba.

Además, la conveniencia y la versatilidad de la detección de inmunoquímicos se pueden potenciar usando anticuerpos monoclonales anti-HER3 humana que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina (véanse, por ejemplo, Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods In Molecular Biology (vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).)

Los métodos de realización de inmunoensayos están bien establecidos (véase, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)).

En otro aspecto, el presente texto describe un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana-fármaco. Un "conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana-fármaco" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana según la invención conjugado con un agente terapéutico. Dichos conjugados de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana-fármaco producen efectos clínicamente beneficiosos sobre las células que expresan HER3 cuando se administran a un sujeto, tal como, por ejemplo, un sujeto con un cáncer que expresa HER3, normalmente cuando se administran solos, pero también en combinación con otros agentes terapéuticos.

En realizaciones típicas, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana se conjuga con un agente citotóxico, de forma que el conjugado de anticuerpo-fármaco resultante ejerza un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa HER3 (por ejemplo, una célula cancerosa que expresa HER3) cuando se absorbe o es internalizado por la célula. Los restos particularmente adecuados para la conjugación con anticuerpos son agentes quimioterapéuticos, enzimas convertidoras de profármacos, isótopos o compuestos radiactivos, o toxinas. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico o una toxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida, tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica).

Las clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, agentes anti-tubulina, auristatinas, ligandos de unión al surco menor de ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino tri-nuclear y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores a la quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos formadores de poros, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores a la radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares.

Los agentes citotóxicos individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfano, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982), clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antiguamente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, un estrógeno, 5-fluorodesoxiuridina, fosfato de etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbazina, estreptozotocina, tenopósido (VM-26), 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

Los agentes citotóxicos particularmente adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), ligandos de unión al surco menor de ADN (por ejemplo, enediínas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de la vinca, CC-1065, SN-38 (7-etil-10-hidroxi-camptotecina), topotecán, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, hidroxicamptotecina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina y mitoxantrona.

En ciertas realizaciones, un agente citotóxico es un quimioterapéutico convencional, tal como, por ejemplo, doxorubicina, paclitaxel, melfalán, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido. Además, agentes potentes tales como análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina se pueden unir a un anticuerpo que expresa anti-HER3.

En variaciones específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina-10) o un derivado de la misma. Normalmente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, se pueden hacer reaccionar auristatina E con ácido para-acetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina típicos incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproína-fenilalanina-p-fenilendiamina), MMAF (dovalina-valinadolaisoleucina-dolaproína-fenilalanina) y MAE (monometil auristatina E). La síntesis y la estructura de la auristatina E y sus derivados se describen en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20030083263; las publicaciones de patente internacional N2 WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y las patentes de EE. UU. N26.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.

En otras variaciones, el agente citotóxico es un ligando de unión al surco menor de ADN (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 6.130.237). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el ligando de unión al surco menor es un compuesto de CBI. En otras realizaciones, el ligando de unión al surco menor es una enediína (por ejemplo, caliqueamicina).

En ciertas realizaciones, un conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un agente anti-tubulina. Los ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, por ejemplo, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina) y dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Otros agentes anti-tubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcemida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un maitansinoide, otros grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992).

En otras realizaciones, el agente citotóxico es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (por ejemplo, azotioprina o micofenolato mofetilo), un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (por ejemplo, metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinósido, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscarnet o trifluridina.

En otras realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana se conjuga con una enzima convertidora de profármacos. La enzima convertidora de profármacos se puede fusionar recombinantemente con el anticuerpo o conjugar químicamente con el mismo usando métodos conocidos. Las enzimas convertidoras de profármaco a modo de ejemplo son carboxipeptidasa G2, p-glucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, pglucosidasa, nitrorreductasa y carboxipeptidasa A.

Las técnicas para conjugar los agentes terapéuticos con proteínas, y en particular con anticuerpos, son bien conocidas (véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery'', en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2a ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Véase, por lo tanto, por ejemplo, la publicación PCT WO 89/12624).

Usos diagnósticos:

El presente texto también describe un anticuerpo anti-HER3 humana de la invención para diagnosticar y/o monitorizar una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de HER3. Las enfermedades de cáncer asociadas a la expresión de HER3 incluyen normalmente, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer pancreático, tumores de células de la glía, tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En una realización particular, un cáncer diagnosticado usando los métodos del presente texto es cáncer de mama o cáncer de ovario. En una realización particular, los anticuerpos de la invención son útiles para diagnosticar cáncer de mama y de ovario.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo según la invención para su uso como un fármaco.

Un objeto adicional de la invención es un anticuerpo según la invención o un fragmento del mismo según la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa HER3 en un sujeto.

Otro objeto de la invención es un anticuerpo según la invención o un fragmento del mismo según la invención para su uso en el diagnóstico de cáncer.

En una realización particular, los anticuerpos de la invención se pueden marcar con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otra marca conocida en la técnica como se describió anteriormente. Por ejemplo, se puede marcar un anticuerpo de la invención con una molécula radiactiva por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radiactivas incluyen, pero no se limitan a, átomo radiactivo para estudios escintigráficos, tales como 1123, 1124, In111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invención también se pueden marcar con una etiqueta de espín para la obtención de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por resonancia magnética, irm), tal como yodo-123, yodo-131, indio-III, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Tras la administración del anticuerpo, se detecta la distribución del anticuerpo dentro del paciente. Los métodos de detección de la distribución de cualquier marca específica se conocen por los expertos en la técnica y se puede usar cualquier método apropiado. Algunos ejemplos no limitantes incluyen tomografía computerizada (TC), tomografía por emisión de positrones (TEP), imagen por resonancia magnética (IRM), fluorescencia, quimioluminiscencia y sonografía.

Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para la estadificación de enfermedades de cáncer asociadas a la expresión de HER3 (por ejemplo, en radioimagen). Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para la estadificación de un cáncer de mama o de ovario. Se pueden usar solos o en combinación con otros marcadores de cáncer de mama o de ovario, que incluyen, pero no se limitan a, HER2, CA1 25, HE4 y mesotelina.

Normalmente, dicho métodos de diagnóstico implican el uso de una muestra biológica obtenida del paciente. Como se usa en el presente documento, el término "muestra biológica" engloba una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y se pueden usar en un ensayo de diagnóstico o de monitorización. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras sólidas de tejido, tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido, o células derivadas de las mismas, y la progenie de las mismas. Por ejemplo, las muestras biológicas incluyen células obtenidas de una muestra de tejido recogida de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de HER3, y en una realización particular de mama u ovario. Por lo tanto, las muestras biológicas engloban muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes de células, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico y muestras de tejido.

En una realización particular, el presente texto describe un método de diagnóstico de una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de HER3 en un sujeto detectando HER3 sobre células del sujeto usando el anticuerpo de la invención. En particular, dicho método de diagnóstico puede comprender las etapas que consisten en:

(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que es probable que sufra una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de HER3 con un anticuerpo según la invención en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con células de la muestra biológica que expresan HER3;

(b) detectar y/o cuantificar dichos complejos, por lo que la detección de dichos complejos es indicativa de una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de HER3.

Para monitorizar la enfermedad de cáncer, el método de diagnóstico se puede repetir en diferentes intervalos de tiempo, para determinar si la unión del anticuerpo a las muestras aumenta o disminuye, por lo que se determina si la enfermedad de cáncer empeora o remite.

Usos terapéuticos:

Los anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados de la invención pueden ser útiles para tratar cualquier cáncer que expresa HER3. Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación con cualquier agente adecuado.

Los ejemplos de cáncer que expresa HER3 incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer pancreático, tumores de células de la glía, tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En una realización particular, un cáncer tratado usando los métodos del presente texto es cáncer de mama o cáncer de ovario.

Así, un objeto del texto se refiere a un método de tratamiento de un cáncer asociado a la expresión de HER3 que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o inmunoconjugado de la invención.

En alguna realización, los anticuerpos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de cánceres independientes de ligando (es decir, NRG) y cánceres dependientes de ligando.

En alguna realización, los anticuerpos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de tumores dependientes de ligando autocrinos o paracrinos (debido a su efecto alostérico).

En alguna realización, los anticuerpos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de cánceres que son resistentes al tratamiento con anticuerpos, inhibidores de tirosina cinasas (TKI), agentes quimioterapéuticos o agentes antihormonales.

En alguna realización, los anticuerpos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de cánceres seleccionados del grupo que consiste en cáncer de mama triple negativo, cáncer pancreático y carcinomas de células renales.

En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", como se usan en el presente documento, significa remitir, aliviar, inhibir el empeoramiento de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección.

Según la invención, el término "paciente" o "paciente en necesidad del mismo" está previsto para un mamífero humano o no humano afectado o que probablemente se va a afectar con cáncer asociado a la expresión de cáncer de HER3 humana asociado a la expresión de HER3 humana.

Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo de la invención se indica una cantidad suficiente del anticuerpo para tratar dicho cáncer, a una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los anticuerpos y las composiciones de la presente invención se decidirá por el médico adjunto dentro del alcance del criterio médico sensato. El nivel específico de dosis terapéuticamente eficaz para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que está tratándose y la intensidad del trastorno; la actividad del anticuerpo específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la velocidad de eliminación del anticuerpo específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidentes con el anticuerpo específico empleado; y factores similares bien conocidos en las artes médicas. Por ejemplo, se conoce bien dentro de la experiencia de la técnica empezar las dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

En ciertas realizaciones, se usa un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco en combinación con un segundo agente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Cuando se usa para tratar cáncer, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se puede usar en combinación con tratamientos para el cáncer convencionales, tales como, por ejemplo, cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia de combinación del cáncer con un anticuerpo anti-HER3 o conjugado de anticuerpo-fármaco según la presente invención incluyen agentes antiangiogénicos. En algunos aspectos, un anticuerpo o conjugado de anticuerpofármaco según la presente invención se administra conjuntamente con una citocina (por ejemplo, una citocina que estimula una respuesta inmunitaria contra un tumor.

En algunos otros aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para terapia de combinación incluyen un antagonista de ciertos factores que participan en el crecimiento tumoral tales como, por ejemplo, EGFR, HER2 o HER4.

En una realización particular, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se usa en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humana, tal como trastuzumab o pertuzumab.

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento se usa en combinación con un inhibidor de tirosina cinasas (TKI). BAY 43-9006 (sorafenib, Nexavar®) y SU11248 (sunitinib, Sutent®) son dos de dichos TKI que han sido autorizados. Otros TKI incluyen, pero no se limitan a: mesilato de imatinib (Gleevec®, Novartis); gefitinib (Iressa®, AstraZeneca); clorhidrato de erlotinib (Tarceva®, Genentech); vandetanib (Zactima®, AstraZeneca), tipifarnib (Zarnestra®, Janssen-Cilag); dasatinib (Sprycel®, Bristol Myers Squibb); lonafarnib (Sarasar®, Schering Plough); succinato de vatalanib (Novartis, Schering AG); lapatinib (Tykerb®, GlaxoSmithKline); nilotinib (Novartis); lestaurtinib (Cephalon); clorhidrato de pazopanib (GlaxoSmithKline); axitinib (Pfizer); diclorhidrato de canertinib (Pfizer); pelitinib (National Cancer Institute, Wyeth); tandutinib (Millennium); bosutinib (Wyeth); semaxanib (Sugen, Taiho); AZD-2171 (AstraZeneca); VX-680 (Merck, Vertex); EXEL-0999 (Exelixis); ARRY-142886 (Array BioPharma, AstraZeneca); PD-0325901 (Pfizer); AMG-706 (Amgen); BIBF-1120 (Boehringer Ingelheim); SU-6668 (Taiho); CP-547632 (OSI); (AEE-788 (Novartis); BMS-^{582664 (Bristol-Myers Squibb); JNK-401 (Celgene); R-788 (Rigel);} AzD-1152 ^{HQPA (AstraZeneca); NM-3 (Genzyme} Oncology); CP-868596 (Pfizer); BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb); PTC-299 (PTC Therapeutics); ABT-869 (Abbott); EXEL-2880 (Exelixis); AG-024322 (Pfizer); XL-820 (Exelixis); OSI-930 (OSI); XL-184 (Exelixis); KRN-951 (Kirin Brewery); CP-724714 (OSI); E-7080 (Eisai); HKI-272 (Wyeth); CHIR-258 (Chiron); ZK-304709 (Schering AG); EXEL-7647 (Exelixis); BAY-57-9352 (Bayer); BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim); AV-412 (AVEO); YN-968D1 (Advenchen Laboratories); midostaurina (Novartis); perifosina (Eterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute); AG-024322 (Pfizer); AZD-1152 (AstraZeneca); ON-01910Na (Onconova); y AZD-0530 (AstraZeneca).

Composiciones farmacéuticas:

Para su administración, el anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco se formula como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humana o conjugado de anticuerpo-fármaco se puede formular según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que la molécula terapéutica se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995).) Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para prevenir la pérdida de proteína sobre las superficies del vial, etc.

Por consiguiente, un objeto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención o un fragmento del mismo según la invención.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y la pauta dependen naturalmente de la afección que se va a tratar, la intensidad de las enfermedades, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular, y similares.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato de monosodio o de disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de disoluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administración se pueden adaptar en función de diversos parámetros, y en particular en función del modo de administración usado, de la patología relevante o alternativamente de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar las composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser líquida hasta el punto de que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Se puede formular un anticuerpo de la invención en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, de amonio, cálcico o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede provocar por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración de la misma.

También se contempla la preparación de disoluciones más concentradas, o altamente concentradas, para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado la penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos a un área tumoral pequeña.

Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de administración y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Para administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe ser adecuadamente tamponada, si fuera necesario, y el diluyente líquido se vuelve primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que se pueden emplear serán conocidos por los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación. Por ejemplo, se podría disolver una dosis en 1 mL de disolución isotónica de NaCl y o añadir a 1000 mL de líquido de hipodermoclisis o inyectar en el sitio de inyección propuesto (véase por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Ocurrirá necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto que está tratándose. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invención se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica para que comprenda aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramo, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis más o menos. También se pueden administrar dosis múltiples.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración por vía oral; cápsulas de liberación con el tiempo; y cualquier otra forma actualmente usada.

En ciertas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de anticuerpos en células hospedadoras. Los expertos en la técnica conocen la formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas.

Las nanocápsulas pueden atrapar, en general, compuestos en una forma estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaño alrededor de 0,1 pm) se diseñan, en general, usando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Las nanopartículas biodegradables de poli(cianoacrilato de alquilo) que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención, y dichas partículas pueden ser fácilmente preparadas.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntrica multilaminar (también denominadas vesículas multilaminares (VML)). Las VML tienen, en general, diámetros de desde 25 nm hasta 4 pm. La sonicación de VML da como resultado la formación de vesículas unilaminares pequeñas (VUP) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Á, que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Kits:

Finalmente, el texto también describe kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invención. Los kits que contienen los anticuerpos de la invención encuentran uso en la detección de la expresión de HER3, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Los kits pueden contener un anticuerpo acoplado a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de cultivo de tejido o perlas (por ejemplo, perlas Sepharose). Se pueden proporcionar kits que contienen anticuerpos para la detección y la cuantificación de HER3 in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo útil para la detección se puede proporcionar con una marca, tal como una marca fluorescente o radiomarca.

La invención se ilustrará aún más por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar de ningún modo como limitantes del alcance de la presente invención.

FIGURAS:

La Figura 1 muestra el efecto alostérico mutuo de mAb 9F7-F11 y NRG para la unión al receptor de HER3 en células. La unión de 9F7-F11 a HER3 aumenta en las células SKBR3 cuando se añaden diversas concentraciones de NRG. A diferencia, el anticuerpo A no se ve afectado por la unión de NRG y el anticuerpo B se bloquea por la unión de NRG (panel A). Inversamente, la unión de NRG a HER3 aumenta en fibroblastos 3T3 transfectados con HER2/HER3 cuando se añaden diversas concentraciones del mAb 9F7-F11, mientras que la IgG irrelevante no afecta la unión de NRG. A diferencia, NRG libre desplaza la NRG marcada para la unión a HER3 (panel B).

La Figura 2 cuantifica la afinidad de 9F7-F11 por el receptor de HER3 con o sin NRG. Se midió un aumento de 6 veces en la afinidad en presencia de NRG (0,47 ± 0,07 nM), con respecto a la afinidad medida en ausencia de NRG (2,33 ± 0,30 nM).

La Figura 3 muestra la inhibición de la fosforilación de receptores de HER2/HER3 y la señalización de PI3 K/Akt y ERK aguas abajo usando el mAb anti-HER39F7-F11 en células BxPC3 de carcinoma pancreático.

Las Figuras 4 muestran los efectos del mAb 9F7-F11 sobre la expresión y la fosforilación de p53/MDM2, como se demuestra por transferencia Western (A) y se cuantifica por Image J (B).

Las Figuras 5 muestran los efectos del mAb 9F7-F11 sobre la expresión de los genes inducibles por p53 p21, ciclina A2, PERP, Puma y Bcl-2, como se demuestra por PCR cuantitativa. La expresión relativa de ARNm se normalizó con respecto a la expresión de GAPDH.

La Figura 6 muestra los efectos del mAb 9F7-F11 sobre la parada del ciclo celular de células BxPC3 de cáncer pancreático.

La Figura 7 muestra los efectos del mAb 9F7-F11 sobre la apoptosis de células BxPC3 de cáncer pancreático (A). La escisión de la caspasa-9, que inicia la apoptosis mitocondrial, se demuestra por transferencia Western de lisados ^{celulares de células BxPC3 tratadas con} 9f7-F1^{1 (B).}

La Figura 8 muestra los efectos del mAb 9F7-F11, solo o en combinación con cetuximab o trastuzumab, sobre la proliferación de células BxPC3 de cáncer pancreático, con respecto a los efectos observados con trastuzumab o cetuximab solos.

La Figura 9 muestra el efecto de ADCC del mAb 9F7-F11 frente a trastuzumab sobre las células MDA-MB-453 diana de cáncer de mama.

La Figura 10 muestra la inhibición de la progresión tumoral por mAb 9F7-F11 en ratones sin pelo xenoinjertados con células MDA-MB-361 amplificadas por HER2/PIK3CA-mut de cáncer de mama.

La Figura 11 muestra la inhibición de la progresión tumoral por mAb 9F7-F11 en ratones sin pelo xenoinjertados con células MDA-MB-468 P7EW-mut/p53-mut de cáncer de mama triple negativo (A). Se calculó la curva de supervivencia de Kaplan-Meier cuando los tumores MDA-MB-468 alcanzaron un volumen de 2000 mm3 (B).

La Figura 12 muestra la progresión tumoral y la supervivencia de ratones sin pelo xenoinjertados con células BxPC3 p53-mut, HER2bajo de cáncer de páncreas adictas a NRG y tratadas con mAb 9F7-F11, usadas solas (9F7) o en combinación con pertuzumab (P 9F7), en comparación con pertuzumab solo (P) o vehículo (Ctrl) (panel A) y la combinación de trastuzumab y pertuzumab (P+T) (panel B).

La Figura 13 muestra la inhibición de la progresión tumoral por mAb 9F7-F11 en ratones sin pelo xenoinjertados con células BxPC3 inactivadas en shHER3 o shLuc (control) de cáncer pancreático (A). Se comprueba el silenciamiento de HER3 por transferencia Western en xenoinjertos recuperados de ratones tratados (B).

EJEMPLO 1: EFECTO ALOSTÉRICO DE 9F7-F11 SOBRE LA UNIÓN A HER3

Se inyectó un ratón Balb/c por vía intraperitoneal con la estirpe celular NIH 3T3 transfectada con HER2/HER3 (aproximadamente 2 x 106 células), previamente estimuladas con neuregulina p1 (NRG), para promover la formación de heterodímeros HER2/HER3. Se fusionaron células del bazo de ratones inmunizados según el protocolo ya descrito (Salhi et al. Biochem. J. 2004) usando el mieloma PX63Ag8.653. Se cultivaron 105 células fusionadas por pocillo en placas con medio HAT para la selección de hibridomas. Después de 12 días después de la fusión, se realizó por ELISA el cribado de sobrenadantes de hibridoma usando la proteína HER3-Fc como antígeno. En el control, se harán simultáneamente cribados con antígenos discriminantes HER2-Fc y el fragmento Fc solo.

Se realizó un experimento de competición por citometría para cuantificar la capacidad de NRG para inhibir la unión del anticuerpo a HER3 en un ensayo basado en células SKBR3. Para este fin, se preincubaron 105 células SKBR3 con diversas concentraciones del ligando de NRG de competición durante 1,5 h sobre hielo. Después de un lavado con PBS-1 % de BSA, se añadió el mAb 9F7-F11 anti-HER3 seleccionado, a una concentración que dio 50 % de la unión máxima, a cada pocillo durante 1 h sobre hielo. En algunos experimentos, se incubaron conjuntamente el ligando NRG y anti-HER39F7-F11 durante 2 h sobre hielo. Entonces se lavaron las células y se incubaron adicionalmente con una dilución 1:60 de anticuerpo secundario conjugado con FITC apropiado (Sigma) durante 45 min sobre hielo, antes del análisis por citometría en un aparato Quanta (Beckman-Coulter). Los experimentos de competición por FACS demostraron que el anticuerpo 9F7-F11 no compitió con NRG, sugiriendo así que este anticuerpo no se unió al sitio de unión a NRG (Fig. 1A). La unión del anticuerpo 9F7-F11 no competitiva con NRG fue incluso potenciada hasta el 160 % cuando se añadió NRG, demostrándose así un efecto alostérico de mAb 9F7-F11 para la unión de HER3. A diferencia, la unión del anticuerpo de control positivo A no se modificó por incubación con NRG, y el anticuerpo de control positivo B mostró una unión dependiente de NRG (Fig. 1A).

Inversamente, se cultivaron 105 fibroblastos 3T3 transfectados con HER3 durante 2 días antes de la inanición, y luego se incubaron con diversas concentraciones del mAb 9F7-F11 en tampón KREBS durante 45 minutos a 4 °C. Se añadió NRG marcada con el colorante d2 criptato durante 45 minutos adicionales. Después del lavado de KREBS, se midió la fluorescencia a 620/670 nm usando un lector de microplacas Pherastar. Como se demuestra en la Fig. 1B, la unión a 9F7-F11 indujo un aumento de la unión de NRG a HER3, pero no IgG irrelevante. Como control, diversas concentraciones de NRG libre desplazaron la unión de NRG marcada al receptor de HER3 (Fig. 1B), demostrándose así un efecto alostérico mutuo entre 9F7-F11 y NRG para la unión a HER3.

EJEMPLO 2: LA ADICIÓN DE NRG INDUCE UN AUMENTO DE 6 VECES DE LA AFINIDAD DE 9F7-F11 POR EL RECEPTOR HER3

Usando la tecnología Tag-Lite desarrollada por CisBio BioAssay, se marcaron 10⁴ células HEK marcadas con HER3 Snap con el donante de criptato de terbio Lumi4, y luego se incubaron conjuntamente con NRG y diversas concentraciones del mAb 9F7-F11 marcado con el aceptor d2. Después de 16 h de incubación, se midió respectivamente la fluorescencia de Lumi4-terbio y d2 a 620 y 665 nm (retraso de 60 gs, integración de 400 gs) tras la excitación a 337 nm en un instrumento Pherastar FS. Como se demuestra en la Fig. 2, se observó un aumento dependiente de la dosis de la unión de 9F7-F11 al receptor HER3 en presencia de NRG, con respecto a la menor unión de HER3 medida sin NRG. Se calculó que el valor de K^d de la unión de 9F7-F11 a HER3 era 0,47 ± 0,07 nM después de la incubación conjunta con NRG, mientras que K^d se midió a 2,33 ± 0,30 nm sin NRG; demostrándose así que la adición de NRG induce alostéricamente un aumento de 6 veces de la afinidad de 9F7-F11 por el receptor de HER3.

EJEMPLO 3: EL ANTICUERPO ANTI-HER3 9F7-F11 ALOSTÉRICO NO COMPETITIVO CON NRG INHIBE LA FOSFORILACIÓN DE HER2 Y HER3, JUNTO CON EL BLOQUEO DE LA FOSFORILACIÓN DE ERK1/2 Y AKT

Se añadieron quinientas mil células BxPC3 de tumor pancreático a cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos durante 24 h a 37 °C. Después de la privación de suero durante 16 h en un medio completo RPMI con 1 % de FCS y lavado adicional, las células se preincubaron con una concentración e 50 gg/mL de de anticuerpo 9F7-F11, o anticuerpo de control negativo, durante 15 minutos o 1 h a 37 °C, antes del lavado y la posterior estimulación o no con una dilución de 100 ng/mL de NRG. Entonces se lavaron las células, se rasparon y se lisaron con tampón que contenía Tris-HCl 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl²1,5 mM, EDTA 1 mM, 1 % de Triton, 10 % de glicerol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, fluoruro de sodio 100 mM, ortovanadato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich) y un comprimido de mezcla de inhibidor de la proteasa completa (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Después de un tiempo de incubación de 30 min, las muestras se purificaron de la fracción insoluble por centrifugación y se determinaron las concentraciones de proteína en lisados celulares por ensayo de Bradford. Estos lisados de proteína se mezclaron directamente con tampón de Laemmli (1 -20 gg de proteínas totales dependiendo de la diana y estirpes celulares) y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. Después de la electroforesis en 7 % de SDS-PAGE en condiciones reductoras, las proteínas se transfirieron a membranas de poli(d ifluoruro de vinilideno) (Millipore) que luego se saturaron en tampón TNT (Tris 25 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 0,1 %) que contenía 5 % de leche desnatada en polvo durante 1 h a 25 °C. Los anticuerpos primarios, dirigidos a receptores de cinasa o cinasas de señalización, y sus formas fosforiladas, se incubaron en tampón TNT-5 % de BSA durante 18 h a 4 °C. Después de cinco lavados en tampón TNT, se añadieron anticuerpos policlonales de conejo, cabra o ratón conjugados con peroxidasa (Sigma-Aldrich) según conviniera en tampón TNT que contenía 5 % de leche desnatada en polvo durante 1 h a 25 °C. Después de cinco lavados en tampón TNT, las transferencias se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente (Western lightning Plus-ECL, Perkin Elmer).

Sorprendentemente, el anticuerpo 9F7-F11 bloqueó la fosforilación inducida por ligando en Y1289-HER3 y Y1242-HER2 (Fig. 3). Concomitantemente, el anticuerpo 9F7-F11 no competitivo alostérico indujo la inhibición de la fosforilación de Akt en Ser473, y la fosforilación de ERK1/2 en Thr202/204.

EJEMPLO 4: EL ANTICUERPO ANTI-HER3 9F7-F11 ALOSTÉRICO NO COMPETITIVO CON NRG INHIBE LA EXPRESIÓN Y LA FOSFORILACIÓN DE MDM2, JUNTO CON LA MODULACIÓN DE LA VÍA DE P53

Similarmente, como se ha descrito anteriormente, se añadieron células tumorales BxPC3 a cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos durante 24 h a 37 °C. Después de la privación de suero durante 16 h en a medio completo RPMI con 1 % de FCS y lavado adicional, las células se preincubaron con una concentración de 50 gg/mL de anticuerpo 9F7-F11, o anticuerpo de control negativo, durante 24 h o 72 h a 37 °C, antes del lavado y la posterior estimulación o no con una dilución de 100 ng/mL de NRG. Las células se lisaron posteriormente para SDS-PAGE y transferencia Western, o se sometieron a extracción de ARN, transcripción inversa y PCR cuantitativa usando cebadores apropiados. Como se demuestra en la Fig. 4 por transferencia Western, el tratamiento con 9F7-F11 inhibió la expresión y fosforilación de MDM2, y aumentó la expresión de p53. En correlación, el tratamiento con 9F7-F11 aumentó la expresión génica inducible por p53, tal como p21, que participa en el bloqueo del ciclo celular y la proliferación, y Puma y PERP, que reguló positivamente la apoptosis, como se demuestra por Q-PCR (Fig. 5). A diferencia, se redujeron la expresión génica de ciclina A2 y Bcl2, que promueve la proliferación e inhibe la apoptosis, respectivamente, tras el tratamiento con el anticuerpo 9F7-F11 alostérico no competitivo con NRG (Fig. 5).

EJE MPLO 5: EL ANTICUERPO ANTI-HER39F7-F11 ALOSTÉRICO NO COMPETITIVO CON NRG BLOQUEA EL CICLO CELULAR EN LA FASE G1, INHIBE LA PROLIFERACIÓN Y RESTAURA LA APOPTOSIS

Se evaluó el efecto del Ab 9F7-F11 específico da HER3 sobre el ciclo celular usando tinción con yoduro de propidio. Brevemente, se cultivaron 300.000 células tumorales BxPC3/pocillo en placas de microtitulación de 6 pocillos durante 24 h, y luego se privaron de suero y se sincronizaron en medio RPMI sin FCS durante otras 24 h, antes de la incubación conjunta con 100 pg/mL del Ab anti-HER3 9F7-F11 y 100 ng/mL de NRG. Se tiñeron 24 h después las células permeabilizadas con yoduro de propidio antes del análisis de citometría de flujo. Para los ensayos de proliferación y apoptosis, se sembraron 50.000 células BxPC3/pocillo un día antes de la privación (en RPMI-1 % de FCS). Entonces se añadieron Ab 9F7-F11 específico de HER3 y NRG durante 120 h. Se midió la proliferación celular incorporando 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) conjugada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) durante las últimas 30 h de cultivo. Se evaluó la apoptosis celular por incubación con anexina V conjugada con fluorescencia y 7-aminoactinomicina D (7-AAD; Beckman-Coulter). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para el análisis de caspasa-9, se trataron células BxPC3 y se lisaron como se ha descrito anteriormente. Tras la SDS-PAGE y transferencia Western de los lisados celulares, se probó la activación de capasa-9 mediante la escisión de la pro-enzima usando anticuerpo apropiado. Como se indica en la Fig. 6, el tratamiento de 24 h del Ab 9F7-F11 alostérico bloqueó el ciclo celular en la fase G1, con un aumento de células G1 desde el 36-38 % para las células sin tratar o tratadas con Ab de control hasta el 62 % para las células BxPC3 tratadas con 9F7-F11. El tratamiento con 9F7-F11 redujo concomitantemente el porcentaje de células BxPC3 en la fase S y G2/m (Fig. 6). El tratamiento de células BxPC3 con el mAb 9F7-F11 aumentó la apoptosis temprana (18 %) y tardía (12 %), en comparación con las células sin tratar y tratadas con el Ab de control (Fig. 7A), con escisión concomitante de pro-caspasa-9, que inicia la apoptosis mitocondrial (Fig. 7B). Finalmente, se inhibió la proliferación celular de BxPC3 tras el tratamiento de 120 h con el Ab 9F7-F11. No se observó efecto específico sobre la proliferación celular con trastuzumab anti-HER2 solo en células BxPC3 HER2bajo mientras que cetuximab anti-EGFR fue menos eficiente que el Ab anti-HER3 9F7-F11 (Fig. 8). A diferencia, la combinación del mAb 9F7-F11 y trastuzumab fue más eficiente en inhibir la proliferación celular que la combinación 9F7-F11/cetuximab, que sugiere un posible efecto sinérgico de la combinación de trastuzumab/9F7-F11 frente al efecto aditivo de la combinación de cetuximab/9F7-F11 sobre células tumorales HER2bajo. Tomados conjuntamente, estos resultados demostraron que el anticuerpo anti-HER3 9F7-F11 alostérico no competitivo con NRG bloquea el ciclo celular en la fase G1, restaura la apoptosis mitocondrial temprana y tardía mediante la escisión de pro-capasa-9 e inhibe la proliferación de células tumorales. En este caso, la combinación del mAb 9F7-F11 con los Ab anti-HER2 podría ser de gran interés en tumores HER2bajo.

EJEMPLO 6: EL ANTICUERPO ANTI-HER3 9F7-F11 ALOSTÉRICO NO COMPETITIVO CON NRG INDUCE LA CITOTOXICIDAD CELULAR DEPENDIENTE DE ANTICUERPO DE CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA

Se sembraron células diana de tumor MDA-MB-453, derivadas de un cáncer de mama triple negativo de tipo basal, en 20.000 células/pocillo de microplaca de 96 pocillos de fondo plano un día antes del ensayo de ADCC. La estirpe celular MDA-MB-453 expresa aproximadamente 180.000 receptores HER2 y 21.000 HER3, mientras que no se observa expresión de EGFR. Después de lavar en medio de cultivo, se añadió el mAb 9F7-F11 a 10 pg/mL durante 30 minutos, antes de la adición de células efectoras derivadas de células mononucleares periféricas (CMSP). Se prepararon CMSP por centrifugación en gradiente de densidad de muestras de sangre de donantes sanos obtenidas en el "Etablissement Frangais du Sang". Se incubaron células efectoras/diana (E/D) en una relación 15/1 de E/D durante 24 h en una estufa de incubación humidificada de células. Se evaluó la destrucción de células diana MDA-MB-453 midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células dañadas usando el kit de detección de la citotoxicidad (LDH Dectection kit; Promega G-1780) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se transfirieron cuidadosamente 50 pL de sobrenadante de células a una microplaca de 96 pocillos de fondo plano nueva, y se añadió la mezcla de reacción de LDH (50 pL/pocillo) del kit a cada pocillo. Después de 30 min de incubación a 37 °C, se añadieron 50 pL de disolución de parada (disponible en el kit) y se midió la densidad óptica a 490 nm. Se establecieron los siguientes controles para cada experimento: CMSP solas, células diana MDA-MB-453 solas (liberación espontánea de LDH), células diana con CMSP (liberación espontánea dependiente de anticuerpo), células diana con tampón de lisis (liberación máxima de LDH), CMSP con Ab, células diana con Ab. Se determinó el porcentaje de lisis específica de cada muestra usando la siguiente fórmula: porcentaje de lisis específica = (valor de muestra -liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)*100. Como se muestra en la Fig. 9, Ab 9F7-F11 indujo un 5 a 10 % de lisis de células específicas de células MDA-MB-453 de cáncer de mama usando CMSP de donantes sanos 1 y 2. En el mismo experimento, el trastuzumab de control positivo indujo aproximadamente el 40 % de lisis, debido al hecho de que MDA-MB-453 expresan diez veces más receptores HER2 que receptores HER3.

EJEMPLO 7: MONOTERAPIA CON 9F7-F11 EN RATONES XENOINJERTADOS CON CÁNCERES DE MAMA MDA-MB-361 AMPLIFICADOS POR HER2 Y MDA-MB-468 TRIPLE NEGATIVO

Se compraron ratones sin pelo BALB/c hembra atímicos de 6 a 8 semanas de edad de Janvier and Charles Rivers Laboratories. Se inyectaron s.c. células MDA-MB-361 amplificadas por HER2/PIK3CA-mut (10x106) de cáncer de mama y células MDA-MB-468 no amplificadas por HER2/PTEN-mut/p53-mut/ER-/PR- (3,5x106) de cáncer de mama triple negativo en el flanco derecho de ratones sin pelo BALB/c atímicos. Ambas expresaron el receptor HER3 a bajo nivel (aproximadamente 10.000 receptores/célula). Todos los experimentos in vivo se hicieron en cumplimiento con las directrices francesas para estudios experimentales en animales (Acuerdo N° B34-172-27).

Se aleatorizaron ratones que tenían tumores en los diferentes grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 100 mm3. Los ratones se trataron por inyecciones i.p. de anticuerpos específicos para HER3 9F7-F11 frente al vehículo (PBS). La cantidad de anticuerpo inyectado fue 300 pg/inyección (15 mg/kg), tres veces a la semana, durante 6 semanas consecutivamente (Q2D-6sem). Se midieron las dimensiones de los tumores dos veces a la semana con un compás calibrador y se calcularon los volúmenes por la fórmula D1xD2xD3/2. Se calculó la progresión tumoral usando la fórmula [(volumen final)-(volumen inicial)]/(volumen inicial). Los resultados también se expresaron por una curva de supervivencia de Kaplan-Meier, usando el tiempo necesario para que el tumor alcanzara un volumen final determinado de 2.000 mm³. Se definió una mediana del retraso como el tiempo al que el 50 % de los ratones tuvieron un tumor que alcanzaba el volumen determinado.

Como se muestra en la Fig. 10, los presentes inventores observaron una reducción significativa del 47 ± 5 % en el crecimiento tumoral de MDA-MB-361 en ratones tratados con 9F7-F11 en el día 55 después de la implantación del tumor (correspondiente a la finalización del tratamiento con anticuerpo; día 40), con respecto al tamaño medio del tumor medido en ratones tratados con vehículo (p<0,001). En la finalización del experimento (97 días), se observó una reducción más pequeña, pero significativa, el 21 ± 2 % en el tamaño del tumor en el grupo tratado con 9F7-F11, probablemente debido a que el tratamiento con 9F7-F11 se detuvo desde los 57 días.

Como se muestra en la Fig. 11A, el volumen medio del tumor fue significativamente más bajo en los ratones tratados con 9F7-F11 xenoinjertados con células MDA-MB-468 (35 % de reducción del volumen en el día 105 después del xenoinjerto tras el tratamiento con 9F7-F11) que en los controles (vehículo). El tratamiento con el Ab 9F7-F11 retrasó significativamente el 50 % de la mediana del tiempo de supervivencia en 20 días en animales xenoinjertados con células MDA-MB-468 (se estabilizó un ratón para el grupo tratado con 9F7-F11 al final del experimento, es decir, 190 días; p<0,05). Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran que el Ab anti-HER3 alostérico no competitivo con NRG 9F7-F11 retrasó el crecimiento tumoral en ratones xenoinjertados con o líneas de cáncer de mama amplificadas por HER2 o triple negativo.

EJEMPLO 8: TERAPIA COMBINADA DE 9F7-F11 CON PERTUZUMAB EN RATONES XENOINJERTADOS CON CÁNCER PANCREÁTICO BXPC3 ADICTO A NRG

Los presentes inventores demostraron previamente que la combinación del anticuerpo terapéutico trastuzumab con otras terapias dirigidas mostró un efecto sinérgico sobre carcinomas pancreáticos con baja expresión de HER2 (Larbouret, 2007, 2010). Los presentes inventores evaluaron ahora una terapia combinada con el Ab anti-HER3 alostérico 9F7-F11 y el Ab anti-HER2 pertuzumab en carcinoma pancreático HER2^bajo. Se inyectaron por vía subcutánea ratones atímicos hembra de seis semanas en el flanco derecho con células BxPC-3 pancreáticas HER2^bajo (4,5x10⁶) que secretaron neuregulina (adictas a NRG). Se aleatorizaron los ratones que tenían tumores a diferentes grupos de tratamiento (al menos 6 animales/grupo) cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm³ y luego se trataron con 2 o 10 mg/kg de pertuzumab, 10 mg/kg de 9F7-F11 o la combinación de pertuzumab más 9F7-F11 (10 mg/kg de cada mAb). Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces a la semana durante 4 semanas (Q3D-4sem). Se calcularon los volúmenes de tumor por la fórmula: D¹ x D² x D³/2. Para la comparación de la supervivencia, los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó un volumen de 1000 mm³.

Ambos anticuerpos solos ralentizaron notablemente el crecimiento tumoral en comparación con el grupo no tratado (p<0,001) y no se observó diferencia significativa entre el Ab anti-HER39F7-F11 y pertuzumab (p=0,6488) (Fig. 12A). El 50 % de la mediana del tiempo de supervivencia se retrasó significativamente en 17 días en ratones tratados con 9F7-F11 y en 23 días en ratones tratados con pertuzumab en comparación con los controles (Fig. 12A). Además, el tratamiento conjunto con 9F7-F11 y pertuzumab inhibió el crecimiento tumoral mucho más que cada anticuerpo solo (pertuzumab frente a 9F7-F11/pertuzumab; p=0,004). Al final del tratamiento de 4 semanas, el volumen del tumor siguió creciendo en ratones tratados con 9F7-F11 o pertuzumab solo, mientras que siguió siendo bastante estable en animales que recibieron la combinación de 9F7-F11/pertuzumab (Fig. 12A). La mediana de la supervivencia fue más larga en animales tratados con la combinación de dos anticuerpos que en los animales de control (aumento de 42 días; p=0,0001) o ratones que recibieron un único anticuerpo (9F7-F11/pertuzumab frente a 9F7-F11 p=0,0013; 9F7-F11/pertuzumab frente a pertuzumab p=0,0355) (Fig. 12A). Finalmente, la combinación del Ab anti-HER3 9F7-F11 y pertuzumab fue notablemente más eficiente que la combinación de pertuzumab/trastuzumab, con un tiempo de supervivencia medio más largo en animales tratados con 9F7-F11/pertuzumab (42 días) que en los animales tratados con pertuzumab/trastuzumab (13 días) (Fig. 12B). Tomados conjuntamente, estos resultados demostraron que la terapia combinada usando el Ab anti-HER3 alostérico no competitivo con NRG 9F7-F11 y anti-HER2 pertuzumab es más eficiente en tumores HER2^bajo que la terapia combinada usando dos anticuerpos específicos de HER2.

EJEMPLO 9: LA INACTIVACIÓN DE HER3 SUPRIME LA EFICIENCIA DE 9F7-F11 IN VIVO EN RATONES XENOINJERTADOS CON CÁNCER PANCREÁTICO BxPC3 ADICTO A NRG

Basándose en el trabajo de Lee-Hoeflich et al. (2008), se eligieron dos oligonucleótidos de horquilla pequeña para inactivar los niveles de ARNm de HER3 descrito en los materiales de apoyo y métodos. El vector de control (shCTRL) pSIREN-shLuc fue amablemente proporcionado por L. Le Cam y se describió previamente (Le Cam et al., 2006). pSIREN-shHER3 y pSIREN-shLuc, que contienen el gen de resistencia de N-acetil transferasa de puromicina, se transfectaron entonces en la estirpe celular de encapsidación anfotrópica AnfoPack-293 (Clontech). Después de 2 días, se recogieron los sobrenadantes que contenían las partículas de virus defectuosas en la replicación y se usaron para infectar células BxPC3. Se empezó la selección con antibiótico (10 pg/mL de puromicina) dos días después.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-HER3 humana alostérico no competitivo con la neuregulina que comprende:

una cadena pesada en donde el dominio variable comprende:

- una H-CDR1 que tiene al menos 90 %

de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, - una H-CDR2 que tiene al menos 90 %

de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 3, y - una H-CDR3 que tiene al menos 90 %

de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende:

- una L-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95

% de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID - una L-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95

% de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID - una L-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95

% de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID - que se une específicamente a HER3 con sustancialmente la misma afinidad que un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y/o la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo quimérico, preferentemente un anticuerpo quimérico de ratón/humano.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado.

6. Un fragmento de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

7. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o un fragmento según la reivindicación 6.

8. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 8 que es SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

10. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9.

11. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9 o un vector según la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento del mismo según la reivindicación 6.

13. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento del mismo según la reivindicación 6 para su uso como un fármaco.

14. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un fragmento del mismo, según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa HER3 en un sujeto.

15. El anticuerpo según cualquiera reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento del mismo según la reivindicación 6 para su uso en el diagnóstico de cáncer.