ES2898023T3 - Fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos que inhiben tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor LRP1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo que inhibe tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor LRP1, en donde dicho anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L- CDR3.

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos que inhiben tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor LRP1

Campo de la invención:

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-Cath-D humanos y usos de los mismos. Más particularmente, la invención se refiere a fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos que inhiben tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor LRP1 (proteína 1 relacionada con el receptor de LDL).

Antecedentes de la invención:

El cáncer de mama es una de las principales causas de muerte de mujeres en el mundo desarrollado [1]. Los cánceres de mama triple negativos de alta incidencia (ER- y PR-, HER2-no amplificado) presentan tratamientos insatisfactorios. Además, los cánceres de mama ER+ también se han vuelto resistentes a la terapia hormonal. Por tanto, se necesitan con urgencia nuevos tratamientos para el cáncer de mama. Se ha reconocido que la progresión tumoral es el producto de la evolución de la interferencia entre células tumorales y el tejido de soporte circundante, conocido como estroma tumoral [2]. Las células cancerosas interactúan de forma dinámica con varios tipos de células normales dentro de la matriz extracelular, tales como fibroblastos, células inmunitarias infiltrantes, células endoteliales y adipocitos. Las células estromales y tumorales intercambian enzimas, factores de crecimiento y citoquinas que modifican la matriz extracelular local, estimulan la migración y la invasión y promueven la proliferación y supervivencia de las células estromales y tumorales. En la última década, se ha hecho cada vez más evidente que las células tumorales crean un microambiente pericelular donde moléculas tales como metaloproteinasas, serina proteasas, catepsinas de cisteína y aspártica interactúan para formar una red proteolítica pro-tumorigénica [3]. Las proteasas extracelulares son, por tanto, objetivos primarios para el descubrimiento de fármacos debido a su expresión diferencial en el cáncer [4-6]

La proteasa aspártica lisosomal catepsina D (Cath-D) es una de las endoproteinasas lisosomales más abundantes implicadas en el catabolismo de proteínas. La Cath-D humana es sintetizada como un precursor de 52 kDa que se convierte en un compuesto intermedio activo de cadena simple de 48 kDa dentro de los endosomas, y luego en la proteasa madura completamente activa, que consiste en una cadena pesada de 34 kDa y una cadena ligera de 14 kDa, en los lisosomas. El sitio catalítico de la Cath-D tiene dos restos aspartato críticos (aminoácidos 33 y 231). La Cath-D requiere un pH ácido para ser proteolíticamente activa. La Cath-D es sobreproducida y secretada masivamente por muchos tumores sólidos: cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, glioma maligno [7]. La Cath-D es un marcador independiente bien establecido de pronóstico malo para el cáncer de mama asociado con metástasis [8, 9]. Varios grupos han mostrado que la Cath-D afecta al comportamiento tanto de las células de cáncer como estromales. La inhibición de la expresión de la Cath-D en las células de cáncer de mama (BCC) disminuye el crecimiento tumoral y la metástasis [10, 11]. El ADNc de la pro-Cath-D humana transfectado en células cancerosas promueve la proliferación de células cancerosas, el crecimiento tumoral y la angiogénesis, y la metástasis [12-15]. Los fibroblastos Cath-D-AMEF transfectados con ADNc de pro-Cath-D humana producen más desarrollo en matrices tridimensionales [16]. Los autores de la invención y otros han mostrado que la sobreproducción de Cath-D por las células de cáncer de mama conduce a la hipersecreción autocrina específica de la pro-Cath-D de 52 kDa en el entorno extracelular [17, 18]. La Pro-Cath-D también es secretada por macrófagos que infiltran tumores inflamatorios y por células endoteliales en respuesta a citoquinas inflamatorias [19, 20]. La pro-Cath-D humana secretada estimula la proliferación de BCC [17, 18], desarrollo de fibroblastos [16] y crecimiento de células endoteliales [21]. La pro-Cath-D de 52 kDa purificada experimenta una autoactivación dependiente de ácido in vitro, para formar una pseudo-Cath-D de 51 kDa catalíticamente activa, que retiene 18 restos (27-44) del prosegmento [22]. Dado que el microambiente extracelular de los tumores hipóxicos e inflamatorios es ácido debido a la producción de un exceso de ácidos celulares [23-25], la pro-cath-D de 52 kDa secretada puede autoactivarse localmente en pseudo-Cath-D de 51 kDa proteolíticamente activa. Al pH bajo (6.8-5.5) que se encuentra en los tumores, la Cath-D secretada por las BCC degrada la cistatina C, uno de los inhibidores extracelulares más potentes de las catepsinas de cisteína [26]. Esto, a su vez, mejora la actividad proteolítica de la catepsina de cisteína, revelando un nuevo vínculo en la red de proteasas [27]. Además, la Cath-D secretada también afecta a las BCC y las células estromales del microambiente tumoral independientemente de su actividad catalítica [13, 16]. El grupo de Vetvicka describió que la actividad del factor de crecimiento mitógeno autocrino Cath-D en BCC es mediada por su péptido de activación localizado en un tramo de nueve aminoácidos (aa 36-44) dentro del propéptido de Cath-D que interactúa con un receptor de superficie celular desconocido [28]. La Cath-D secretada también promueve el crecimiento de fibroblastos mamarios a través de la unión al receptor l RP1 (proteína 1 relacionada con el receptor de LDL) [29, 30]. En conjunto, estos hallazgos proporcionan buenas evidencias del papel oncogénico de la pro-Cath-D secretada por mecanismos moleculares tanto proteolíticos como no proteolíticos. Además, se han detectado autoanticuerpos anti-Cath-D [31] en las primeras etapas de los cánceres de mama, melanoma, ovario y pulmón [32-35], lo que indica que la Cath-D puede considerarse como un antígeno asociado a tumores (TAA).

Dirigirse a la Cath-D liberada en el microambiente del tumor requerirá el uso de inhibidores de su actividad catalítica, pero también el desarrollo de nuevas herramientas que inhiban sus funciones de interacción. La administración basada en anticuerpos de agentes terapéuticos al sitio del tumor es un campo emergente de la investigación moderna contra el cáncer, que promete concentrar moléculas bioactivas sobre lesiones neoplásicas sin afectar a los tejidos normales. Originalmente, los anticuerpos monoclonales específicos para antígenos de membrana en las células cancerosas se han utilizado para aplicaciones dirigidas a tumores. Los objetivos alternativos, tales como el direccionamiento de proteasas basado en anticuerpos, que son hipersecretadas en el microambiente del tumor, representan una vía atractiva adicional para las aplicaciones de fármaco-administración [36]. El documento EP2045266 muestra que la catepsina D se une a LRP1 y que la inhibición de esta unión conduce a la inhibición del crecimiento invasivo de fibroblastos.

Se requieren nuevos tratamientos para los cánceres de mama triple negativos (ER- y PR-, HER2-no amplificado) y resistentes a hormonas. La proteasa aspártica catepsina D (Cath-D), un marcador independiente de mal pronóstico en el cáncer de mama, es sobreexpresada e hipersecretada dentro del microambiente del tumor de mama. La cath-D secretada puede afectar al microambiente del tumor de mama al degradar la cistatina C, el inhibidor de catepsina de cisteína más potente, y al desencadenar el crecimiento de fibroblastos mamarios a través de la proteína 1 relacionada con el receptor de LDL, LRP1. Dirigirse a la Cath-D secretada en el cáncer de mama requiere, por tanto, el uso de inhibidores de su actividad catalítica y de sus funciones de interacción.

Sumario de la invención:

La invención se dirige a un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo que inhibe tanto la actividad catalítica de la Cath-D como su unión al receptor LRP1, en donde dicho anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3.

La descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 11 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 12 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 15 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 16 en la región L-CDR3.

La descripción se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo según la invención para su uso como fármaco.

La descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-Cath-D humano aislado o un fragmento del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer de mama.

Descripción detallada de la invención:

Los autores de la invención describieron el aislamiento y caracterización de fragmentos scFv de anticuerpos monoclonales humanos específicos para Cath-D por presentación en fagos. Los scFv de unión a Cath-D se cribaron funcionalmente según su capacidad para inhibir tanto la actividad proteolítica de Cath-D como su unión al receptor fibroblástico LRP1. Dos scFv clonados bajo IgG1, formato A (IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D) inhibieron las células de cáncer de mama triple negativo y ER+, la curación de heridas, formación de colonias y crecimiento tridimensional en Matrigel. Las IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D redujeron significativamente el crecimiento tumoral de células de cáncer de mama MDA-MB-231 triple negativo en ratones atímicos. Estos hallazgos sugieren fuertemente que el direccionamiento basado en anticuerpos de Cath-D dentro del microambiente del tumor de mama puede tener eficacia terapéutica para el tratamiento del cáncer de mama.

Definiciones:

A lo largo de la memoria descriptiva, se emplean varios términos y se definen en los siguientes párrafos.

El término "Cath-D" tiene su significado general en la técnica y se refiere a la proteasa aspártica lisosomal catepsina-D. La Cath-D es sintetizada como el precursor de 52 kDa, catalíticamente inactivo, llamado pro-Cath-D. Está presente en los endosomas como un compuesto intermedio monocatenario activo de 48 kDa que posteriormente se convierte en los lisosomas en la proteasa madura completamente activa, compuesta por una cadena pesada de 34 kDa y una cadena ligera de 14 kDa. La proteína pro-cath-D de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en Genbank, número de acceso NP_001900.

La expresión "anticuerpo anti-Cath-D" se refiere a un anticuerpo dirigido contra la Cath-D.

Según la invención, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado y se utilizarán igualmente en la invención. El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Así pues, el término anticuerpo abarca no solo moléculas de anticuerpos completas, sino también fragmentos de anticuerpos, así como variantes (incluidos derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Hay dos tipos de cadenas ligeras, lambda (l) y kappa (k). Hay cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG (que abarcan distintas subclases tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH). Las regiones variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de la unión y la especificidad del antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión del complemento y unión a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están formados por restos que son principalmente de las regiones determinantes de la complementariedad o hipervariables (CDR). Ocasionalmente, los restos de las regiones armazón (FR) o no hipervariables influyen en la estructura general del dominio y, por tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de unión al antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Las regiones armazón (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre CDR.

Como se usa en el presente documento, el término "Fab" denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y actividad de unión al antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos por tratamiento de la IgG con una proteasa, la papaína, se unen entre sí mediante un enlace disulfuro.

Como se usa en el presente documento, el término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100000 y una actividad de unión al antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos por tratamiento de IgG con una proteasa, la pepsina.

Como se usa en el presente documento, el término "Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y actividad de unión al antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.

Como se usa en el presente documento, la expresión polipéptido "Fv monocatenario" (scFv) es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que normalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL unidos por un conector que codifica péptidos.

Como se usa en el presente documento, el término "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes o pueden generarse acoplando scFv monovalentes mediante un conector peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.

Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que bloquea o reduce al menos una actividad de un polipéptido que comprende el epítopo al que se une específicamente el anticuerpo. Un anticuerpo neutralizante reduce la actividad biológica de la catepsina D en ensayos en células y/o in vivo. Normalmente, un fragmento de anticuerpo neutralizante anti-Cath-D bloquea la unión de la Cath-D a LRP1 (lo cual puede evaluarse por ensayos de reducción de GST) y/o también inhibe la actividad catalítica de la Cath-D madura (lo cual puede evaluarse mediante un ensayo de actividad catalítica basado en la reacción de escisión por Cath-D de un sustrato fluorogénico tal como M2295 (sustrato peptídico fluorogénico para pseudo-Cath-D) o M0938 (sustrato peptídico fluorogénico para Cath-D madura) como se describe a continuación.

El término "LRP1" tiene su significado general en la técnica (Strickland y Ranganathan, 2003; Lillis et al., 2005) y se refiere a la proteína 1 relacionada con el receptor de LDL. LRP1 se compone de una cadena a extracelular de 515 kDa y una cadena p de 85 kDa generadas por escisión proteolítica de un polipéptido precursor de 600 kDa en un compartimento trans-Golgi. En realidad, la cadena a de LRP1 y la cadena p de LRpI proceden de un único transcrito. A modo de ejemplo, la longitud completa del precursor humano no procesado de LRP1 corresponde al número de acceso de SwissProt Q07954.

Por "purificado" y "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un anticuerpo según la invención, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado" como se usa en el presente documento preferiblemente significa que están presentes al menos 75% en peso, más preferiblemente al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en peso, y lo más preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas de el mismo tipo.

Se describen anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-Cath-D aislados o fragmentos de los mismos.

En un primer aspecto, la descripción se refiere por tanto a un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo que inhibe tanto la actividad catalítica de la Cath-D como su unión al receptor LRP1.

Dicho anticuerpo se une específicamente al péptido de SEQ ID NO: 17 derivado de Cath-D de 34 kDa (péptido que abarca los aminoácidos 128-134 de Cath-D) de la siguiente manera: 128AAKFDG134.

Dicho anticuerpo se une específicamente al péptido de SEQ ID NO: 18 derivado de Cath-D de 34 kDa (péptido que abarca los aminoácidos 172-179 de Cath-D) de la siguiente manera: 172DPDAQPGG179.

Dicho anticuerpo se une específicamente al péptido de SEQ ID NO: 19 derivado de Cath-D de 34 kDa (péptido que abarca los aminoácidos 293-302 de Cath-D) de la siguiente manera: 293KVSQAGKTLC302.

Dicho anticuerpo se une específicamente al péptido de SEQ ID NO: 20 derivado de Cath-D de 34 kDa (péptido que abarca los aminoácidos 220-228 de Cath-D) de la siguiente manera: 220TLCKEGCEA228.

En particular, los autores de la invención han aislado por presentación en fagos de anticuerpos dos fragmentos de anticuerpo variables monocatenarios anti-Cath-D (scFv) completamente humanos, seleccionados en pseudo-cath D humana de 51 kDa y Cath-D celular madura humana (34 14 kDa), denominados E2 y F1.

Los autores de la invención han clonado y caracterizado el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de dicho scFv E2 y, por tanto, han determinado el dominio de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo como se describe en la Tabla 1:

Por tanto, la invención se refiere a un anticuerpo que tiene especificidad por la Cath-D, que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende las CDR que tienen las secuencias SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3 y que comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las CDR que tienen las secuencias SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3. El anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3.

En particular, la invención proporciona un anticuerpo anti-Cath-D que comprende:

- una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-c Dr 3; y

- una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3.

En una realización particular, la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos indicada como SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos indicada como SEQ ID NO: 5.

Los autores de la invención también han clonado y caracterizado el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de dicho scFv F1, y así han determinado el dominio de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo como se describe en la Tabla 2:

También se describe un anticuerpo que tiene especificidad por la Cath-D, que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10 para H-CDR1, SEQ ID NO: 11 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 12 para H-CDR3.

También se describe un anticuerpo que tiene especificidad por la Cath-D, que comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 para L-CDR1, SEQ ID NO: 15 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 16 para L-CDR3.

También se describe un anticuerpo que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10 para H-CDR1, SEQ ID NO: 11 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 12 para H-CDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 para L-CDR1, SEQ ID NO: 15 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 16 para L-CDR3.

En particular, se describe un anticuerpo anti-Cath-D que comprende:

- una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 11 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 12 en la región H-CDR3; y

- una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 15 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 16 en la región L-CDR3.

La región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos indicada como SEQ ID NO: 9 y/o la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos indicada como SEQ ID NO: 13 La invención proporciona además fragmentos de dichos anticuerpos dirigidos contra Cath-D que incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

Cabe señalar también que los anticuerpos F1 y E2 reaccionan de forma cruzada con la Cath-D murina, lo cual es de interés para la evaluación preclínica y los estudios toxicológicos.

Cabe señalar además que los anticuerpos E2 y F1 (p. ej., con el isotipo IgG1) se unen específicamente a la catepsina D y no se unen a otras proteasas aspárticas (p. ej., catepsina E, pepsinógeno A y pepsinógeno C).

Ensayos de unión competitiva:

El agrupamiento de epítopos se puede usar para identificar anticuerpos que caen dentro del alcance de la invención reivindicada. El agrupamiento de epítopos se refiere al uso de ensayos de unión competitiva para identificar pares de anticuerpos que son, o no son, capaces de unirse a la Cath-D simultáneamente, identificando así pares de anticuerpos que se unen al mismo epítopo o epítopos que se superponen en Cath-D. Los experimentos de agrupamiento de epítopos proporcionan evidencia de que están presentes epítopos antigénicamente distintos. La competencia por la unión se puede evaluar para cualquier par de anticuerpos o fragmentos. Por ejemplo, usando los reactivos de detección apropiados, la especificidad de unión de anticuerpos o fragmentos de unión de cualquier fuente se puede comparar con la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento. El agrupamiento de epítopos se puede realizar con "anticuerpos aislados" o con líquidos sobrenadantes de cultivos celulares. Con frecuencia, el agrupamiento se realiza con líquidos sobrenadantes clonales de la primera ronda para guiar la elección de los clones que se desarrollarán más. Los anticuerpos a comparar deben ser dominios de unión al antígeno sustancialmente homogéneos. En el caso de anticuerpos "biespecíficos" o "bifuncionales", la especificidad de unión de los dos sitios de unión diferentes necesita ser evaluada o agrupada de forma independiente.

Los anticuerpos de la invención pueden ensayarse para determinar la unión específica por cualquier método conocido en la técnica. Se pueden usar muchos formatos de ensayo de unión competitiva diferentes para el agrupamiento de epítopos. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos que utilizan técnicas tales como transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de precipitinas, ensayos de precipitinas de difusión en gel, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de fijación del complemento. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., Eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & sons, Inc., Nueva York). Por ejemplo, BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) es uno de una variedad de formatos de ensayo de resonancia de plasmón de superficie que se utilizan de forma rutinaria para paneles de agrupamiento de epítopos de anticuerpos monoclonales. Además, se pueden llevar a cabo ensayos de bloqueo cruzado de rutina, tales como los descritos en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane, 1988

Métodos de producción de anticuerpos de la invención:

Los anticuerpos anti-Cath-D de la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida en la materia, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.

Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos, mediante técnicas convencionales para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando un método en fase sólida bien conocido, preferiblemente usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden sintetizarse mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedantes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán los anticuerpos deseados, de los cuales se pueden aislar más tarde usando técnicas bien conocidas.

Como se usa en el presente documento, los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen extraño) en una célula hospedante, para así transformar el hospedante y promover la expresión (p. ej., transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

Por tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.

Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para producir o dirigir la expresión de dicho anticuerpo tras la administración a un sujeto. Ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para células animales incluyen promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor de LTR y potenciador del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason 10 et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena H de inmunoglobulina y similares.

Puede usarse cualquier vector de expresión para células animales, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifique la región C del anticuerpo humano. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) y similares.

Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integradores, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR y similares.

Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, herpesvirus y AAV. Dichos virus recombinantes pueden producirse mediante técnicas conocidas en la materia, tales como transfectando células de empaquetamiento o por transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Los ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para producir tales virus recombinantes de replicación defectuosa, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5882877, US 6013516, US 4861 719, US 5278056 y WO 94/19478.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedante que ha sido transfectada, infectada o transformada por un ácido nucleico y/o un vector según la invención.

El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "extraño" (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula hospedante, de modo que la célula hospedante expresará el gen o secuencia introducida para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducidos. Una célula hospedante que recibe y expresa el ADN o ARN introducido se ha "transformado".

Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse para producir un anticuerpo de la invención en un sistema de expresión adecuado. La frase "sistema de expresión" significa una célula hospedante y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej. para la expresión de una proteína codificada por el ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula hospedante.

Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospedantes de E. coli y vectores plasmídicos, células hospedantes de insectos y vectores de baculovirus, y células hospedantes y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células hospedante incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamíferos (p. ej., células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamíferos primarios o establecidos p. ej., producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen células SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), célula Ch O en la que un gen de dihidrofolato reductasa ("gen DHFR") es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, en lo sucesivo denominada "célula YB2/0"), y similares.

La invención también se refiere a un método para producir una célula hospedante recombinante que expresa un anticuerpo según la invención, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se describe anteriormente en una célula hospedante competente, (ii) cultivo in vitro o ex vivo de la célula hospedante recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Tales células hospedantes recombinantes pueden usarse para la producción de anticuerpos de la invención.

Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la invención y en las secuencias de ADN que los codifican, y aún así obtener una molécula funcional que codifica un anticuerpo con características deseables.

Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína en general se comprende en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga, estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esa(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante el barajado de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o restos armazón es descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene, 169:147 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154 (7):3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992).

"Variantes de función conservadora" son aquellas en las que un resto de aminoácido dado en una proteína o enzima se ha cambiado sin alterar la conformación y función generales del polipéptido, que incluyen, pero no se limitan al reemplazo de un aminoácido por uno que tiene similares propiedades (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, ácido, básico, hidrófobo, aromático y similares). Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína de modo que el porcentaje de similitud de secuencia de proteína o de aminoácidos entre dos proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, de 70% a 99% según se determina según una esquema de alineación tal como por el Método Cluster, en donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una "variante de función conservadora" también incluye un polipéptido que tiene al menos 60% de identidad de aminoácidos según se determina por los algoritmos BLAST o FASTA, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 85%, aún preferiblemente al menos 90%, e incluso más preferiblemente al menos 95%, y que tiene las mismas o sustancialmente similares propiedades o funciones que la proteína original o parental con la que se compara.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más de 80%, preferiblemente más de 85%, preferiblemente más de 90% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente 90%, preferiblemente más de 95%, son similares (funcionalmente idénticos) a lo largo de toda la longitud de la secuencia más corta. Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineación usando, por ejemplo, el programa Pileup de GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versión 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, obteniendo no obstante una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se puedan realizar diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos anticuerpos, sin una pérdida apreciable de su actividad biológica.

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía se obtiene una proteína biológica funcionalmente equivalente.

Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, por lo tanto, generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones de ejemplo que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Dichos anticuerpos pueden ensayarse para determinar la unión específica por cualquier método conocido en la técnica. Se pueden usar muchos formatos de ensayo de unión competitiva diferentes para el agrupamiento de epítopos. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos que utilizan técnicas tales como la transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de precipitinas, ensayos de precipitinas de difusión en gel, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de fijación del complemento. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., Eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & sons, Inc., Nueva York). Por ejemplo, el BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) es uno de una variedad de formatos de ensayo de resonancia de plasmón de superficie que se utilizan de forma rutinaria para los paneles de agrupamiento de epítopos de anticuerpos monoclonales. Además, se pueden llevar a cabo ensayos de bloqueo cruzado de rutina, como los descritos en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane, 1988.

Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos de armazón dentro de VH y/o VL, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones del armazón se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos del armazón a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener restos del armazón que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Dichos restos se pueden identificar comparando las secuencias de armazón del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región armazón a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén incluidos en la invención. Otro tipo de modificación del armazón implica la mutación de uno o más restos dentro de la región armazón, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de células T y reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se conoce como "desinmunización" y se describe con más detalle en la publicación de patente de EE. u U. N° 20030153043 de Carr et al.

Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro del armazón, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, fijación del complemento, unión del receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (p. ej., pueden unirse uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de restos de cisteína en la región de bisagra se altera, p. ej., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la patente de EE. UU. N° 5677425 de Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio c H2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de manera que el anticuerpo tiene la unión de proteína A estafilocócica (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio bisagra Fc nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la patente de EE. UU. N° 6 165745 de Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de EE. UU. N° 6277375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de recuperación tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de EE. UU. N° 5 869046 y 6121 022 de Presta et al.

En otras realizaciones más, la región Fc se altera reemplazando al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden reemplazar por un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE. UU. N° 5624821 y 5648260, ambas de Winter et al.

En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de restos de aminoácidos pueden reemplazarse por un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga la unión de C1q alterada y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe con más detalle en la patente de EE. UU. N° 6 194551 de ldusogie et al.

En otra realización, se alteran uno o más restos de aminoácidos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han cartografiado los sitios de unión en la IgGI humana para FcyRI, FcyRIl, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604, WO2010106180).

En otra realización más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del armazón de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE. UU. N° 5714350 y 6350861 dey Co et al.

Adicional o alternativamente, puede prepararse un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tenga cantidades reducidas de o no tenga restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedante con maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden usar como células hospedante en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1176195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación o están desprovistos de restos fucosilo. Por tanto, en una realización, los anticuerpos de la invención se pueden producir mediante expresión recombinante en una línea celular que presenta un patrón de hipofucosilación o no fucosilación, por ejemplo, una línea celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica fucosiltransferasa. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos ligados a Asn (297), lo que también da como resultado hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedante (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares diseñadas para expresar glucosil transferasas modificadoras de glicoproteínas (p. ej., beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas presentan un aumento de las estructuras de GlcNac bisectantes, lo que da como resultado un aumento de la actividad ADCC de la anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180). Eureka Therapeutics describe además células de mamífero CHO modificadas genéticamente capaces de producir anticuerpos con patrón de glicosilación de mamífero alterado desprovisto de restos de fucosilo (http://www.eurekainc.com/a&boutus/Companyoverview.html).

Alternativamente, los anticuerpos de la invención se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos modificados para un patrón de glicosilación similar al de los mamíferos y capaces de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patrón de glicosilación (véase por ejemplo el documento EP1297172B1).

Otra modificación de los anticuerpos del presente documento que se contempla en la invención es la pegilación. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi(C1-C10) o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, el documento EP0154316 de Nishimura et al. y EP0401384 de Ishikawa et al.

Otra modificación de los anticuerpos contemplada por la invención es un conjugado o una fusión de proteínas de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención con proteína del suero, tal como la seroalbúmina humana o un fragmento de la misma para aumentar la semivida de la molécula resultante. Tal enfoque se describe, por ejemplo, en Ballance et al. documento EP0322094. Otra posibilidad es una fusión de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención con proteínas capaces de unirse a proteínas séricas, tales como la seroalbúmina humana para aumentar la semivida de la molécula resultante. Tal enfoque se describe, por ejemplo, en Nygren et al., documento EP 0486525.

Inmunoconjugados:

Un anticuerpo de la invención se puede conjugar con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado de anti-Cath-D. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos para preparar y detectar dichos inmunoconjugados marcados de forma detectable son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

El marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son 3H 125I, 131I, 35S y 14C.

Los inmunoconjugados anti-Cath-D también se pueden marcar con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado de modo fluorescente se determina exponiendo el inmunoconjugado a la luz de la longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcaje fluorescentes incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-Cath-D pueden marcarse de forma detectable acoplando un anticuerpo con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscentes incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

De manera similar, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar inmunoconjugados anti-Cath-D de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para marcar incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-Cath-D pueden marcarse de forma detectable uniendo un anticuerpo anti-Cath-D a una enzima. Cuando el conjugado de anti-Cath-D-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto de enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que se pueden emplear según la presente invención. La unión de restos marcadores a anticuerpos monoclonales anti-Cath-D se puede lograr usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto es descrita por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cáncer 46: 1101, 1990; Stein et al., Cáncer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, véase antes.

Además, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica se puede mejorar mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-Cath-D que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina. (Véase, p. ej., Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).)

Los métodos para realizar inmunoensayos están bien establecidos. (Véase, p. ej., Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter y Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch y Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).)

En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de anticuerpo anti-Cath-D-fármaco. Un "conjugado de anticuerpo anti-Cath-D-fármaco", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo anti-Cath-D según la invención conjugado con un agente terapéutico. Tales conjugados de anticuerpo anti-Cath-D-fármaco producen efectos clínicamente beneficiosos sobre las células que expresan Cath-D cuando se administran a un paciente, tal como, por ejemplo, un paciente con un cáncer que expresa Cath-D, típicamente cuando se administran solos pero también en combinación con otros agentes terapéuticos.

En realizaciones típicas, un anticuerpo anti-Cath-D se conjuga con un agente citotóxico, de manera que el conjugado anticuerpo-fármaco resultante ejerce un efecto citotóxico o citostático en una célula que expresa Cath-D (p.ej., una célula cancerosa que expresa Cath-D) cuando es absorbido o internalizado por la célula. Los restos particularmente adecuados para la conjugación con anticuerpos son agentes quimioterapéuticos, enzimas convertidoras de profármacos, isótopos o compuestos radiactivos o toxinas. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Cath-D se puede conjugar con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico o una toxina (p.ej., un agente citostático o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica).

Las clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas, agentes que se unen al surco menor de ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (p. ej., complejos de platino tales como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino tri-nuclear y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos preformadores, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esteroides taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares.

Los agentes citotóxicos individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfán, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li et al., Cancer Res. 42: 999-1004, 1982), clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antes actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrógeno, 5-fluorodesoxiuridina, etopósido fosfato (VP-16), 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbozona, estreptozotocina, tenopósido (VM-26), 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

Los agentes citotóxicos particularmente adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (p. ej., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), agentes que se unen al surco menor de ADN (p. ej., enodiinos y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (p. ej., paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de la vinca, CC-1065, SN-38 (7-etil-10-hidroxi-camptoteína), topotecán, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptoifisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina y mitoxantrona. En determinadas realizaciones, un agente citotóxico es un producto quimioterapéutico convencional tal como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalán, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido.

Además, agentes potentes tales como análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina pueden unirse a un anticuerpo anti-Cath-D.

En variaciones específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina-10) o un derivado del mismo. Normalmente, el derivado de auristatina E es, p.ej., un éster formado entre la auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con ácido para-acetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados típicos de la auristatina incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina-p-fenilendiamina), MMAF (dovalina-valinadolaisoleunina-dolaproína-fenilalanina) y MAE (monometil-auristatina E). La síntesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describen en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20030083263; publicaciones de patentes internacionales N° WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y patentes de EE.UU. N° 6884869; 6323315; 6 239 104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663 149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521 284; 5 504 191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; y 4486414.

En otras variaciones, el agente citotóxico es un agente de unión al surco menor del ADN. (Véase, p. ej., la patente de EE. UU. N° 6 130237). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el agente de unión al surco menor es un compuesto CBI. En otras realizaciones, el agente de unión al surco menor es un enediino (p. ej., caliqueamicina).

En determinadas realizaciones, un conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un agente antitubulina. Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, taxanos (p. ej., Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de vinca (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina) y dolastatinas. (p. ej., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, a Ev B). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxanos (p. ej., epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., Cáncer Res. 52: 127-131, 1992).

En otras realizaciones, el agente citotóxico es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (p. ej., azotioprina o micofenolato de mofetilo), un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (p. ej., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabiósido de citidina, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscarnet o trifluridina.

En otras realizaciones, un anticuerpo anti-Cath-D se conjuga con una enzima convertidora de profármaco. La enzima convertidora de profármacos se puede fusionar de forma recombinante con el anticuerpo o conjugar químicamente con el mismo usando métodos conocidos. Ejemplos de enzimas convertidoras de profármacos son carboxipeptidasa G2, p-glucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, p-glucosidasa, nitroreductasa y carboxipeptidasa A.

Las técnicas para conjugar agentes terapéuticos con proteínas, y en particular con anticuerpos, son bien conocidas. (Véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. Eds., Marcel Deiker, Inc., 2a ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. Eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. Eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58. Véase también, p. ej., la publicación PCT WO 89/12624).

Usos diagnósticos:

El anticuerpo anti-Cath-D de la invención puede usarse para diagnosticar y/o controlar una enfermedad cancerosa y otras enfermedades en las que los niveles de CathD se modifican (aumentan o disminuyen).

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención pueden marcarse con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede marcarse con una molécula radiactiva mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radiactivas incluyen, pero no se limitan a un átomo radiactivo para estudios centellográficos tales como I123, I124, In 111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invención también se pueden marcar con un marcador de espín para imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imágenes de resonancia magnética, MRI), tales como yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono -13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Después de la administración del anticuerpo, se detecta la distribución del anticuerpo dentro del paciente. Los expertos en la técnica conocen métodos para detectar la distribución de cualquier marcador específico y se puede utilizar cualquier método apropiado. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, tomografía computarizada (CT), tomografía por emisión de positrones (PET), imágenes por resonancia magnética (MRI), fluorescencia, quimioluminiscencia y ecografía.

Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para diagnosticar y estadificar enfermedades de cáncer asociadas con la sobreexpresión de Cath-D. Las enfermedades de cáncer asociadas con la sobreexpresión de Cath-D incluyen típicamente, pero no se limitan a cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, glioma maligno.

Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para diagnosticar enfermedades distintas de los cánceres para los que aumenta la expresión de Cath-D, tal como la enfermedad de Alzheimer.

Normalmente, dichos métodos de diagnóstico implican el uso de una muestra biológica obtenida del paciente. Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y se pueden usar en un ensayo de diagnóstico o seguimiento. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. Por ejemplo, las muestras biológicas incluyen células obtenidas de una muestra de tejido recogida de un individuo sospechoso de tener una enfermedad de cáncer asociada con la sobreexpresión de Cath-D, y en una realización preferida de cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, glioma maligno. Por lo tanto, las muestras biológicas abarcan muestras clínicas, células en cultivo, líquidos sobrenadantes de células, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico y muestras de tejido.

Usos terapéuticos:

Los anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados de la invención pueden ser útiles para tratar cualquier enfermedad asociada con la sobreexpresión de Cath-D, preferentemente cánceres. Los anticuerpos de la invención pueden usarse solos o en combinación con cualquier agente adecuado.

Puede usarse un anticuerpo anti-Cath-D de la invención como tratamiento de enfermedades hiperproliferativas asociadas con la sobreexpresión de Cath-D.

Ejemplos de tales enfermedades asociadas con la sobreexpresión de Cath-D incluyen cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, glioma maligno.

En una realización particular, el cáncer de mama es un cáncer de mama hormonorresistente con receptor de estrógeno positivo (ER+) o un cáncer de mama triple negativo (ER- y PR-, HER2-no amplificado).

En cada una de las realizaciones de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-Cath-D o el conjugado anticuerpo anti-Cath-D-fármaco se administra de una manera consistente con las metodologías convencionales asociadas con la atención integral de la enfermedad o trastorno para el que se busca tratamiento. Según la descripción en el presente documento, se administra una cantidad eficaz del anticuerpo o del conjugado anticuerpo-fármaco a un paciente que necesita dicho tratamiento durante un tiempo y en condiciones suficientes para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno.

Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad asociada con la sobreexpresión de Cath-D que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o inmunoconjugado de la invención. En este contexto, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en este documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o afección a la que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección. Según la invención, el término "paciente" o "paciente que lo necesita" está destinado a un ser humano afectado o que pueda estar afectado por una enfermedad asociada con la sobreexpresión de Cath-D.

Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo de la invención se entiende una cantidad suficiente del anticuerpo para tratar dicha enfermedad asociada con la sobreexpresión de Cath-D, tal como un cáncer (p. ej., cáncer de mama), con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante decidirá el uso diario total de los anticuerpos y las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del anticuerpo específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración, vía de administración y velocidad de excreción del anticuerpo específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el anticuerpo específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido dentro de la experiencia en la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado.

En determinadas realizaciones, se usa un anticuerpo anti-Cath-D o conjugado anticuerpo-fármaco en combinación con un segundo agente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Cuando se usa para tratar el cáncer, se puede usar un anticuerpo anti-Cath-D o un conjugado anticuerpo-fármaco de la invención en combinación con terapias convencionales contra el cáncer tales como, p. ej., cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-Cath-D humano aislado o un fragmento del mismo para su uso en un método para tratar el cáncer de mama.

La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer de mama que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-Cath-D humano aislado o un fragmento del mismo.

Composiciones farmacéuticas:

Para la administración, el anticuerpo anti-Cath-D o el conjugado de anticuerpo-fármaco se formula como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Cath-D o conjugado de anticuerpo-fármaco se puede formular según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, de modo que la molécula terapéutica se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, p. ej., Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995)) Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para evitar la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y la posología dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, peso y sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación apta para ser inyectada. Éstas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros y, en particular, en función del modo de administración utilizado, de la patología relevante o alternativamente de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la invención se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes citados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los citados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

También se contempla la preparación de soluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé que el uso de DMSO como disolvente de como resultado una penetración extremadamente rápida, liberando altas concentraciones de los agentes activos en un área del tumor pequeña.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invención se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica para comprender aproximadamente de 0.0001 a 1.0 miligramos, o aproximadamente de 0.001 a 0.1 miligramos, o aproximadamente de 0.1 a 1.0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis aproximadamente o similar. También se pueden administrar dosis múltiples.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación sostenida; y cualquier otra forma utilizada actualmente.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de anticuerpos en las células hospedantes. Los expertos en la técnica conocen la formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas.

Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0.1 pm) se diseñan generalmente utilizando polímeros que pueden degradarse in vivo. Las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos están contempladas para su uso en la presente invención, y tales partículas se pueden preparar fácilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Kits:

Finalmente, la descripción también proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención encuentran uso para detectar la expresión de Cath-D (aumento o disminución), o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos IgG1 E2 y F1 reconocen la catepsina D celular por inmunofluorescencia. Los kits de la invención pueden contener un anticuerpo acoplado a un soporte sólido, p. ej., una placa de cultivo de tejidos o perlas (p. ej., perlas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen anticuerpos para la detección y cuantificación de Cath-D in vitro, p.ej. en un ELISA. Tal anticuerpo útil para la detección puede proporcionarse con un marcador tal como un marcador fluorescente o radiactivo.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

Figuras:

Figura 1: Generación y caracterización de scFv anti-Cath-D.

(A) Selección de scFv anti-Cath-D monoclonal por ELISA. Se presenta el ELISA realizado en líquidos sobrenadantes de cultivo bacteriano de los mejores clones de scFv (8 en 400 clones cribados) contra Cath-D pro, pseudo y madura humana. La unión de scFv a Cath-D se detectó con anticuerpo anti-Myc marcado con HRP. b Sa , antígeno negativo; IR (irrelevante): scFv negativo del cribado. Se aislaron ScFv (F6, H7, f 1, E12, E2) con antígeno Cath-D maduro y scFv (D7, B1 y H2) con antígeno pseudo-Cath-D.

(B) Unión de scFv anti-Cath-D a Cath-D humana de BCC MDA-MB-231. La unión de scFv anti-Cath-D se ensayó por ELISA en pro-cath-D humana secretada, pseudo-cath-D autoactivada y Cath-D humana celular de BCC MDA-MB-231 usando anti-His conjugado con HRP. BSA, antígeno negativo; IR, scFv negativo.

(C) Unión de IgG1 F1 y E2 a pro-Cath-D y pseudo-Cath-D de BCC MDA-MB-231. El ELISA tipo sándwich se realizó a pH 7 en medio acondicionado de BCC MDA-MB-231 (CM; 7 días en presencia de FCS; acidificado o no) añadido al anticuerpo monoclonal de ratón anti-pro-Cath-D M2E8 prerrecubierto en presencia de concentraciones crecientes de IgG1 F1 (panel superior) o IgG1 E2 (panel inferior). La unión de IgG1 F1 e IgG1 E2 a pro-Cath-D se reveló con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP. Se muestran los valores de CE⁵⁰.

Figura 2: Caracterización de IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D humanas en BCC ER⁺.

(A) Unión de scFv anti-Cath-D a Cath-D humana de BCC MCF-7. La unión de scFv anti-Cath-D se ensayó por ELISA en pro-cath-D humana secretada, pseudo-cath-D autoactivada y Cath-D humana celular de BCC MCF-7 usando anti-His conjugado con HRP. BSA, antígeno negativo; IR, scFv negativo.

(B) Unión de IgG1 F1 y E2 a pro-Cath-D y pseudo-Cath-D de BCC MCF-7. El ELISA tipo sándwich se realizó a pH 7 en medio acondicionado (CM; 7 días en presencia de FCS;; acidificado o no) de BCC MCF-7 añadido al anticuerpo monoclonal de ratón anti-pro-Cath-D M2E8 prerrecubierto en presencia de concentraciones crecientes de IgG1 F1 (panel izquierdo) o IgG1 E2 (panel derecho). La unión de IgG1 F1 e IgG1 E2 a pro-Cath-D se reveló con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP. Se presentan los valores de CE⁵⁰.

Figura 3: Efectos inhibidores de scFv anti-Cath-D sobre la actividad proteolítica de pseudo-Cath-D. Se presenta un resumen de Ki ± SD (n = 3).

Figura 4: Efectos inhibidores de scFv sobre la actividad proteolítica de Cath-D madura. Se presenta un resumen de Ki ± SD (n = 3).

Figura 5: Cinética de Michaelis-Menten de pseudo-Cath-D y Cath-D madura con sustratos M0938 y M2295. Los valores de mejor ajuste de pseudo-Cath-D (A) y Cath-D madura (B) según la ecuación de Michaelis-Menten son Vmáx = 531 ± 28 UFA/min; Km = 0.9 ± 0.1 |jM y Vmáx = 374 ± 22 UFA/min; Km = 8.4 ± 1.2 |jM, respectivamente.

Figura 6: Efecto de scFv anti-Cath-D sobre la unión de pro-Cath-D al fragmento GST-LRP1 p. Se cargó pro-Cath-D radiomarcada preincubada con scFv anti-Cath-D o irrelevante en perlas que contenían GST-LRP1 p (307-479) (aminoácidos 307-479 del dominio extracelular de LRP1p). La cuantificación de la relación de pro-Cath-D unida a GST-LRP1p en presencia de scFv en relación con GST-LRP1p total se representa como porcentaje (%) en relación con el scFv irrelevante (IR, scFv negativo del cribado).

Figura 7: Interacción de Cath-D humana con scFv F1 y E2, e IgG1 F1 y E2

(A) ELISA competitivo entre IgG1 y scFv F1 y E2. El ELISA tipo sándwich se realizó con medio acondicionado (CM; 7 días en presencia de FCS) de BCC MDA-MB-231 añadido al anticuerpo anti-pro-Cath-D M2E8 prerrecubierto en presencia de IgG1 F1 o E2 (valor de CE⁵⁰ aproximado; 40 ng/ml; 0.27 nM) y concentraciones crecientes (0.04 - 10 jg/m l) de scFv F1, E2 o IR (scFv negativo del cribado). La unión de IgG1 F1 o IgG1 E2 a pro-Cath-D se reveló con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP.

(B) Epítopo de scFv F1 y E2 en Cath-D madura. Representación esquemática de pro-Cath-D de 52 kDa de Cath-D humana. Se indican las ubicaciones del pro-fragmento de Cath-D de 4 kDa, cadenas maduras ligera de 14 kDa y pesada de 34 kDa. La forma intermedia de 48 kDa corresponde a cadenas de 14 34 kDa no escindidas. Según [72], 1 corresponde al primer aminoácido en Cath-D madura. Se muestran las posiciones de los 2 ácidos aspárticos del sitio catalítico, al igual que las 2 cadenas glicosiladas que llevan motivos m 6p . K, kilodalton.

Figura 8: Efecto de IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D sobre el crecimiento tumoral de MDA-MB-231 y la supervivencia en ratones atímicos.

(A) Crecimiento de xenoinjertos de MDA-MB-231 en ratones tratados con IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D. Células MDA-MB-231 (1.5 10⁶ células) se mezclaron (proporción 1:1) con Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el costado de ratones atímicos. Un día después, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal IgG1 F1 y E2 (15 mg/kg) o NaCl tres veces por semana durante 45 días. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 2000 mm3 y se detuvo la curva de crecimiento del tumor. El crecimiento del tumor se controló dos veces por semana. El volumen del tumor se muestra en mm³ ± EEM (n = 8 para control e IgG F1; n = 7 para IgG E2). **, p <0.01; *, p <0.05; Prueba t de Student.

(B) Curva de Kaplan-Meier. Las diferencias estadísticas se evaluaron usando la prueba de rangos logarítmicos (p <0.05 para IgG F1 e IgG E2).

Figura 9: El efecto de IgG F1 y E2 anti-cath-D sobre el crecimiento de tumor establecido de MDA-MB-231 y la supervivencia en ratones atímicos

(A) Crecimiento de xenoinjertos de MDA-MB-231 en ratones tratados con IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D. Células MDA-MB-231 (1.5 10⁶ células) se mezclaron (proporción 1:1) con Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el costado de ratones atímicos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 50 mm³ , se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal IgG1 F1 (15 mg/kg), IgG E2 (15 mg/kg) o NaCl tres veces por semana durante 32 días. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 2000 mm³ , y se detuvo la curva de crecimiento tumoral. El crecimiento del tumor se controló dos veces por semana. El volumen del tumor se muestra en mm³ ± EEM (n = 8 para control; n = 6 para IgG F1 e IgG E2). ***, p <0.001; **, p <0.01; *, p <0.05; Prueba t de Student.

(B) Curva de Kaplan-Meier. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante la prueba de rangos logarítmicos (p <0.0005 para IgG F1 e IgG E2).

Figura 10: Efecto de IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D sobre el tamaño del tumor MDA-MB-231 y la apariencia macroscópica.

Crecimiento tumoral de xenoinjertos de MDA-MB-231 en ratones tratados con IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D o rituximab de control. Células MDA-MB-231 (1.5 10⁶ células) se mezclaron (proporción 1:1) con Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el costado de ratones atímicos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 50 mm³ , a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal IgG1 F1 (15 mg/kg), IgG E2 (15 mg/kg) o rituximab (IgG de control, 15 mg/kg) tres veces por semana durante 28 días. Los ratones se sacrificaron el día 44 cuando el volumen del tumor de control alcanzó 600 mm³. El crecimiento del tumor se controló dos veces por semana. El volumen del tumor se muestra en mm³ ± EEM (n = 9 para rituximab, IgG F1 e IgG E2). ***, p <0.001; **, p <0.01; Prueba t de Student.

EJEMPLO: El anticuerpo dirigido a la proteasa catepsina D en el microambiente tumoral inhibe el crecimiento del cáncer de mama.

Material y métodos

Materiales: LRP1p (307-479) se generó insertando ADNc amplificado por PCR que codifica LRP1p(307-479) de pYESTrp2-LRP1p (307-479) identificado por un ensayo de doble híbrido en levadura en pGEX-4T-1 previamente digerido por EcoRI [29]. Las construcciones pGEX-4T-1-Cath-D se obtuvieron insertando ADNc amplificado por PCR que codifica cadenas de Cath-D humanas de 52, 48, 34, 14 o 4 kDa en pGEX-4T-1 previamente digerido con EcoRI [29]. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-Cath-D humana M2E8, utilizado para el ELISA tipo sándwich, interactúa solo con pro-Cath-D de 52 kDa, y no con Cath-D de 48 kDa o 34 kDa [46]. Se usaron el anticuerpo monoclonal anti-Cath-D humana (BD Biosciences) que reconoce las formas de Cath-D de 52, 48 y 34 kDa, el anticuerpo anti-Cath-D humana (ABCAM; ab75811) que reconoce la cadena ligera de Cath-D de 14 kDa, y el anticuerpo anti-Cath-D humana que reconoce el pro-dominio de Cath-D de 4 kDa proporcionado amablemente por Pr. M. Fusek (Fundación de Investigación Médica de Oklahoma, Oklahoma City, o K, EE. UU.) [18] para la inmunotransferencia. El anticuerpo policlonal anti-Fc humano de cabra conjugado con HRP (A0170), anti-his monoclonal de ratón-HRP (A7058), Cath-D celular (de hígado humano), D-eritroceramida C81-fosfato (C8355), pepstatina A, BSA y cristal violeta se adquirieron de (Sigma Aldrich). El anticuerpo policlonal anti-cathD de ratón (sc-6486) y el anticuerpo monoclonal anti-c-Myc conjugado con HRP (9E10) se adquirieron de (Santa Cruz Biotechnology), el Rituximab (anticuerpo anti-CD20) de Roche y el anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con HRP (27942101) de (GE Heathcare). El sustrato peptídico fluorogénico para pseudo-Cath-D (M2295: Ac-Glu-Asp (EDANS)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Gly-Lys (DABCYL)-Glu-NH² ) se adquirió de (Sigma Aldrich), y el sustrato peptídico fluorogénico para Cath-D madura (M0938: MCA-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys-DNP-Arg-NH²) de (BACHEM). Se adquirió pro-Cath-D humana recombinante de 52 kDa de (R&D Systems). Matrigel se adquirió en (BD Biosciences).

Líneas celulares y medios condicionados y lisados celulares: Se cultivaron BCC MDA-MB-231, MCF-7 y T47D y MEF (fibroblasto embrionario de ratón) de tipo natural en DMEM con suero de ternero fetal al 10% (FCS, GibcoBRL, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Para producir medio condicionado y lisado celular, las células se cultivaron hasta confluencia de 90% en medio DMEM con FCS al 10%. El medio condicionado (24 h en ausencia de FCS o 7 días en presencia de FCS) se retiró y se centrifugó a 800 x g durante 10 min. Las células se lisaron mediante 5 ciclos de descongelación-congelación en 1 ml de PBS, y el lisado celular se aisló después de centrifugación a 13.000 x g durante 20 min a 4°C.

Transfección estable de shRNA en BCC MDA-MB-231: Se transfectaron BCC MDA-MB-231 con vectores de expresión shRNA1 o shRNA2 anti-Cath-D (Invivogen) usando tecnología Nucleofector (Amaxa biosystems) según las instrucciones del fabricante y se aislaron clones resistentes a blasticidina (10 pg/ml). El clon S1C4 transfectado con shRNAl anti-Cath-D y el clon S2C6 transfectado con shRNA2 anti-Cath-D eran los mejores clones seleccionados para el silenciamiento de Cath-D.

Autoactivación de pro-Cath-D de 52 kDa a pseudo-Cath-D de 51 kDa: Para producir la pseudo-Cath-D de 51 kDa, se autoactivó la pro-Cath-D recombinante de 52 kDa (10 pg) durante 15 min a 37°C en 30 pl de tampón MES 25 mM, [pH 6.5] más 2 pl de tampón de acetato de sodio 1 M [pH 3.5]/NaCl 2 M hasta un pH final de 3.9 y luego se neutralizó a pH 7 con 50 pl de NaH2PO42 N. En otros experimentos, la pseudo-Cath-D de 51 kDa se produjo directamente a partir de la de 52 kDa secretada en el medio condicionado de BCC como se describió anteriormente [71]. Para autoactivar in vitro la pro-Cath-D secretada, el medio de cultivo condicionado en DMEM con FCS al 10% se incubó a 37°C durante 1 hora a un pH ajustado a 3.5 por adición de HCl 1 N y luego se neutralizó a pH 7.4 con NaOH 1 N.

Presentación en fagos de anticuerpos: La biblioteca HuscI utiliza un armazón único optimizado para alto nivel de expresión [37]. La diversidad se restringió a cinco aminoácidos (Y, N, D, G, S) y se introdujeron en las seis CDR en las posiciones correspondientes a los restos que más contribuyen al parátopo [38]. Los antígenos utilizados fueron pseudocath D humana de 51 kDa comercial y Cath-D madura celular humana (34 4 kDa). El antígeno negativo era BSA. La selección de scFv de la biblioteca HUSCI se realizó como se describió anteriormente [37]. La pseudo-Cath-D, Cath-D madura o BSA se aplicaron como recubrimiento en 100 ng/pocillo en PBS (pH 7.4) en placas de 96 pocillos (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4°C. Después del lavado (PBS/Tween al 0.1%), los sitios de unión no específicos se bloquearon con gelatina al 1%/PBST y se aplicaron 1010 fagos scFv/ml a cada pocillo durante 2 h a temperatura ambiente, como se describió anteriormente [37]. El revelado se hizo usando anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP. Para enriquecer la población de scFv policlonal en agentes de unión a Cath-D, este experimento se repitió en cuatro rondas de selección sucesivas. Los scFv policlonales enriquecidos en agentes de unión a Cath-D se transformaron en bacterias BL21 (DE3)/pLysS. Las colonias BL21 (DE3)/pLysS (total 400) se recogieron en las placas de microvaloración de 96 pocillos para producir scFv por autoinducción y se lisaron como se describió anteriormente [37]. La pseudo-Cath-D humana, Cath-D madura o BSA se aplicaron como recubrimiento en 100 ng/pocillo en una placa de 96 pocillos durante la noche a 4°C. Después de lavado (PBS/tween al 0.1%) y bloqueo (gelatina al 1%/PBST), se aplicó lisado bacteriano completo que contenía scFv monoclonal durante 2 h a 4°C. El revelado se hizo utilizando un anticuerpo anti-c-Myc conjugado con HRP.

Secuenciación de genes de anticuerpos ScFv: Se extrajeron ADN de fagémidos bicatenarios del cultivo bacteriano y se expandieron a partir de cada pocillo positivo de las placas de ELISA de fagos monoclonales, y se secuenciaron con cebadores T7 y T7-term (Eurofins Genomics).

Purificación de fragmentos de anticuerpos scFv: Los genes scFv barajados se subclonaron en el vector de expresión PET23NN, lo que da como resultado la adición de un marcador de hexa-histidina en el extremo C-terminal del scFv. El plásmido recombinante pET2NN-scFv se obtuvo y se transformó en E. coli BL21 (DE3)/pLysS (Invitrogen) y se purificó en una columna TALON-cobalto según el protocolo del fabricante. El reconocimiento de scFv purificado para Cath-D se realizó por ELISA como se describió anteriormente y se reveló con anti-His conjugado con HRP.

Clonación y expresión de IgG: Los scFv (F1, E2 y E12) se subclonaron en IgG1 humana, formato A, y se expresaron en la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) y se purificaron en una columna de proteína A HiTrap (GE Healthcare) por Evitria AG.

Ensayos de arrastre (pull-down) por GST: La pre-pro-Cath-D marcada con [35S]-metionina se obtuvo mediante transcripción y traducción utilizando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT T7 (Promega). Se produjeron fragmentos de GST-LRP1p(307-479) en la cepa BL21 de Escherichia coli B usando isopropil-1 -tio-p-D-galactopiranósido (1 mM) durante 3 h a 37°C. Las proteínas de fusión de GST se purificaron en perlas de glutatiónsefarosa (Amersham Biosciences). Para los ensayos de arrastre, se incubaron 20 pl de perlas de glutatión-sefarosa con proteínas de fusión de GST inmovilizadas durante la noche a 4°C con proteínas pre-pro-Cath-D marcadas con [35S]metionina preincubadas con el anticuerpo scFv en 500 pl de tampón PDB (HEPES-KOH 20 mM [pH 7.9], glicerol al 10%, KCl 100 mM, MgCl25 mM, EDTA 0.2 mM, DTT 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.2 mM) que contiene 15 mg/ml de BSA y Tween 20 al 0.1%. Las perlas se lavaron con 500 pl de tampón PDB y las proteínas unidas se resolvieron por SDS-PAGE al 15%, teñidas con azul de Coomassie, y expuestas a película autorradiográfica.

Ensayo de actividad catalítica para la actividad de Cath-D y cinética de estado estacionario: La reacción de escisión en 100 pl se llevó a cabo en tampón de ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico (MES) 0.1 M [pH 6] que contiene D-eritroceramida C81-fosfato (10 pM), Cath-D (5 nM) y M2295 (sustrato de péptido fluorogénico para pseudo-Cath-D) o M0938 (sustrato de péptido fluorogénico para Cath-D madura). Los parámetros cinéticos de pseudo-Cath-D y Cath-D madura (Km) se determinaron con sustrato M2295 o M0938 ensayado en concentraciones que variaban de (0.05 pM a 5 pM) y (0.05 pM a 30 pM), respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo en placas blancas de 96 pocillos con medio faldón (Corning) y la escisión del sustrato se midió en el espectrofluorómetro BMG Labtech Fluostar Omega. La Km se determinó utilizando la ecuación de Michaelis-Menten. Los datos de velocidad se ajustaron a los modelos de cinética de un solo sustrato proporcionados por el módulo de cinética de enzimas del software SigmaPlot 12 (Systat Software Inc., San José, EE. UU.), utilizando análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal. Los datos de velocidad correspondientes a la cinética de hidrólisis de dos péptidos se ajustaron mejor a la ecuación de Michaelis Menten ( V = V^{m áx}*S/Km+[S]). El valor de Ki se calculó reajustando los datos a una ecuación de inhibición de enzimas competitiva (Vi = (Vmáx * [S])/(Km (1+[I]/Ki)+[S])). Para permitir la visualización de la calidad del ajuste, los puntos de datos experimentales se presentan como gráficos junto con las rectas teóricas ajustadas por el software Enzyme Kinetics. Para evaluar el efecto inhibidor de scFv sobre la actividad proteolítica de pseudo-Cath-D, se incubó Cath-D (5 nM) a 37°C (en un volumen final de 100 pl) en tampón MES 0.1 M [pH 6] con D-eritroceramida C81-fosfato (10 pM) y sustrato M2295 en 3 concentraciones alrededor del valor de Km. Para cada concentración de sustrato, se usaron varias concentraciones de scFv para determinar el mecanismo y la inhibición constante (Ki) para pseudo-Cath-D. Se realizaron experimentos similares con Cath-D madura con sustrato M0938.

Resonancia de plasmón de superficie (BIAcore): La unión de IgG1 F1 y E2 humana a varias isoformas de Cath-D (pseudo-Cath-D, Cath-D madura y pro-Cath-D) se midió a 25°C por análisis de resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento T200 ( Ge Healthcare, Uppsala, Suecia). Los experimentos se realizaron en tampón HBS-EP: HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 3 mM, NaCl 150 mM y tensioactivo no iónico P20 al 0.005% (GE Healthcare) a 30 pl/min. Se capturó la IgG1 en la superficie del chip del sensor CM5 utilizando un Fc antihumano (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. Se inyectó Cath-D diluida en tampón HBS-EP en diferentes concentraciones de 0.6 nM a 160 nM sobre celdas de flujo de IgG1 y de control. A las fases de asociación y disociación le siguió una etapa de regeneración con MgCl²2 M. Los sensorgramas se corrigieron restando la señal de la celda de flujo de control. Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de cambio de conformación utilizando el software BIAevaluation versión 4.1.1. Para el análisis del esquema inverso, se inmovilizó covalentemente pseudo-Cath-D mediante acoplamiento de amina en la superficie del chip sensor CM5 a 680 RU. Se inyectó un intervalo de concentraciones (0.5 nM-128 nM) de IgG1 F1 o E2 sobre la pseudo-Cath-D. Los gramos de sensor se ajustaron globalmente mediante un modelo bivalente.

ELISA e inmunoprecipitación: Para el ELISA tipo sándwich, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-pro-Cath-D humana M2E8 en PBS (500 ng/pocillo) [46] se aplicó como recubrimiento en placas de 96 pocillos durante la noche a 4°C. Después de bloquear los sitios no específicos con PBS 1X/tween al 0.1%/BSA al 1%, se aplicó el lisado celular o medio condicionado durante 2 h a 4°C. Después de lavar en PBS/tween al 0.1%, se añadieron diluciones seriadas de IgG1 E2 o F1 anti-cathD durante 2 h a 4°C. El revelado se hizo utilizando anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con HRP. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación en el extracto celular (1 mg) incubado durante la noche a 4°C con 3 pg de anticuerpo monoclonal anti-Cath-D (IgG1 E2 o F1), y luego con 50 pl de proteína G-Sepharose al 10% durante 2 h a 4°C en un agitador. Las perlas de Sepharose se lavaron 3 veces en PBS, se hirvieron durante 5 min en tampón de muestra SDS y se analizaron por SDS-PAGE. En otros experimentos, la inmunoprecipitación se realizó usando proteínas de fusión GST-Cath-D producidas en la cepa BL21 de Escherichia coli B usando isopropil-1-tio-b-D-galactopiranósido (1 mM) durante 3 h a 37°C. Las proteínas resultantes se sometieron a SDS-PAGE al 12% seguido de inmunotransferencia de anti-Cath-D.

Ensayos de crecimiento, clonogénico y cicatrización de heridas: Para los ensayos de crecimiento, se añadieron 50000 BCC MDA-MB-231 insertadas a 4°C en 200 pl de Matrigel (8 mg/ml) en presencia de IgG1 E2 o F1 anti-Cath-D o con IgG1 anti-CD20 irrelevante (100 pg/ml final) a una capa preestablecida de Matrigel (200 pl que contenían estas IgG1 a 100 pg/ml final) en placas de 24 pocillos y se cubrieron con 500 pl de DMEM FCS al 10% que contenía IgG1 a 100 pg/ml final durante 7 días [14]. Para los ensayos clonogénicos, se sembraron 300 BCC MDA-MB-231 en placas de 6 pocillos en DMEM FCS al 10% y se trataron con IgG1 F1 o E2 anti-Cath-D, o con IgG1 anti-CD20 irrelevante cada 48 h. En el ensayo de cicatrización de heridas, se sembraron 100000 células en placas de 24 pocillos y se cultivaron a 37°C en DMEM con FCS al 10%. Después de 24 h, se generó una herida raspando cada monocapa con una punta de pipeta. A continuación, las células se incubaron en DMEM con FCS al 10% con IgG1 F1 o E2 anti-Cath-D o con IgG1 anti-CD20 irrelevante (100 pg/ml final). El cierre de la herida se capturó mediante un microscopio Nikon ECLIPSE TS100 y una cámara Olympus SP-510 UZ.

Crecimiento tumoral in vivo: Los experimentos in vivo se realizaron según la normativa francesa y las directrices éticas para estudios experimentales con animales en un establecimiento acreditado (Acuerdo n° C34-172-27). Se implantaron en ratones atímicos hembra BALB/c de seis semanas de edad (Harlan, Le Malourlet, Francia) 1.5 x 106 BCC MDA-MB-231 vía s.c. en cualquier flanco. Las células se prepararon por recolección en la fase logarítmica de crecimiento; se lavaron en PBS y se mezclaron 1:1 con Matrigel. Los ratones se separaron aleatoriamente para los grupos de tratamiento (n = 10) el día de la implantación. Los ratones se trataron con IgG1 F1 (15 mg/kg), IgG1 E2 (15 mg/kg), rituximab (15 mg/kg) o NaCl (3 veces por semana) por vía intraperitoneal. Los tumores se midieron usando un calibre y el volumen se calculó usando la fórmula V = (longitud del tumor ancho del tumor profundidad del tumor)/2.

Resultados

Selección y cribados funcionales de scFv anti-Cath-D por presentación en fagos: Se utilizaron pseudo-Cath-D de 51 kDa recombinante humana con un sitio catalítico abierto y Cath-D madura de 34+14 kDa de hígado purificada humana como inmunógeno para el aislamiento de anticuerpos humanos de la biblioteca de anticuerpos en fagos HuscI [37]. Esta biblioteca utiliza un armazón único optimizado para nivel alto de expresión [37]. La diversidad se restringió a cinco aminoácidos (Y, N, D, G, S) introducidos en las seis CDR en la posición correspondiente a los restos que más contribuyen al parátopo [38]. Se aislaron anticuerpos policlonales en formato scFv que mostraban unión específica por ELISA para pseudo-Cath-D inmovilizada o Cath-D madura y se enriquecieron a partir de la biblioteca mediante 4 rondas de bioselección por pasos [37]. Se seleccionaron 8 scFv monoclonales que se unen tanto a pro-Cath-D, pseudo-Cath-D como a Cath-D madura por ELISA (Figura 1A). Estos scFv monoclonales se purificaron. El análisis de ELISA puso de manifiesto que scFv purificado se unía a pro-Cath-D, pseudo-Cath-D, y Cath-D celulares humanas secretadas de BCC MDA-MB-231 triple negativo (Figura 1B) y BCC m C f -7 ER⁺ (Figura 2A) y reaccionaba de forma cruzada con Cath-D murina de células MEF (80% de identidad entre las dos proteínas maduras). Los 8 scFv se caracterizaron en términos de sus valores de Ki para la inhibición de la actividad proteolítica de pseudo-Cath-D (Figura 3; Figura 5) y de Cath-D madura (Figura 4; Figura 5) a pH 6. Los scFv que inhibían la actividad proteolítica de pseudo-Cath-D y Cath-D madura más potentes eran F1, E2, E12 y H2 (Tabla 3). Los 8 scFv también se cribaron según su capacidad para inhibir la interacción de pro-Cath-D con el receptor fibroblástico LRP1 en el ensayo de arrastre por GST [29] (Figura 6). Todos los scFv excepto H7 inhibían la unión de pro-Cath-D al fragmento GST-LRP1p en (50-79%) (Figura 6; Tabla 3). Basándose en estos dos cribados funcionales, se continuaron los experimentos con scFv F1, E2 y E12 que inhibían tanto la actividad proteolítica de Cath-D a pH 6 como su unión a LRP1 (Tabla 3).

Tabla 3. Se presentan la inhibición de la actividad proteolítica de Cath-D y/o interacción de Cath-D/LRP1 por scFv anti-Cath-D. La constante de inhibición (Ki) para la actividad proteolítica de pseudo-Cath-D y Cath-D madura, y la inhibición de la interacción pro-Cath-D/LRP1p (%) para cada scFv anti-Cath-D.

scFv

B1 F6 E2 F1 H2 H7 D7 E12 Ki ± SD (nM) de pseudo-_{cath-D humana} N.D. 326 ± 80 754 ± 37 212 ± 86 675 ± 18 N.D. N.D. 574 ± 90 Ki ± SD (nM) de cat-D

_{madura humana} 19 ± 6.3 ND 24 ± 7.4 100 ± 29 400 ± 89 100 ± 34 N.D. 2.2 ± 0.8 (%) Inhibición de la

unión de LRP1/cath-D ^{78 52 79 68 79 0 56 50}

Caracterización in vitro de IgG1 anti-Cath-D: Se clonaron scFv anti-Cath-D (F1, E2, E12) como IgG1 humana completa, A, se produjeron en células CHO y se purificaron del medio de cultivo por cromatografía de afinidad (EVITRIA). Las IgG1 F1, E2 y E12 purificadas se analizaron por tinción de Coomassie. La capacidad de unión de IgG1 F1 e IgG1 E2 a Cath-D secretada de BCC MDA-MB-231 se validó mediante ELISA tipo sándwich con CE⁵⁰ de 0.3 nM y 0.4 nM, respectivamente. Por el contrario, scFv E12 perdió su actividad de unión bajo el formato IgG1 en ELISA. Se obtuvo una unión similar de IgG1 F1 y E2 para Cath-D secretada por BCC MCF-7 (Figura 2B). Dado que los tumores presentan pH ácido en su microambiente [23-25], la unión de IgG1 F1 y E2 a Cath-D secretada por BCC MDA-MB-231 se analizó a diferentes pH. La IgG1 F1 y E2 se unieron a Cath-D inmovilizada con afinidades comparables en un intervalo de pH de 7.5 a 5.5. La capacidad de unión de IgG1 F1, E2 y E12 se analizó en Cath-D celular de extractos de células MDA-MB-231 y MCF-7 por inmunoprecipitación. Tanto IgG1 F1 como E2 inmunoprecipitaron Cath-D celular de células MDA-MB-231 y MCF-7, mientras que IgG E12 fue ineficaz. La afinidad de unión de IgG1 F1 y E2 a pseudo-Cath-D, Cath-D madura y pro-Cath-D se cuantificó mediante resonancia de plasmón de superficie. La IgG1 F1 mostró la mejor constante de disociación K^d para todas las isoformas de Cath-D en comparación con la IgG1 E2. La K^d para la pro-Cath-D fue 10 veces menor para la IgG1 tanto F1 como E2. Se obtuvieron K^d similares a pH 6, lo que indica que al pH ácido del microambiente tumoral, IgG1 F1 y E2 todavía se unen a todas las isoformas de Cath-D.

A continuación, se investigó el epítopo de Cath-D de IgG1 F1 y E2. El ELISA competitivo indicó que los epítopos de IgG1 F1 e IgG1 E2 se solapaban (Figura 7A). Usando fragmentos de fusión GST-Cath-D, las IgG1 F1 y E2 inmunoprecipitaron tanto la Cath-D-GST de 52, 48 como de 34 kDa, mientras que el pro-fragmento de Cath-D-GST de 4 kDa y la cadena ligera de 14 kDa de Cath-D-GST no eran reconocidos (Figura 7b ). Por tanto, los epítopos de Cath-D de IgG1 F1 y E2 están ubicados en la cadena pesada de 34 kDa. El modelo de acoplamiento molecular se realizó en una estructura tridimensional de Cath-D madura [39]. Según este modelo, scFv F1 y scFv E2 anti-Cath-D interactúan con la cadena de Cath-D de 34 kDa en la proximidad del sitio catalítico de aspartato 33 y 231, con una CDR de L1 que sobresale que se inserta en el sitio activo de proteinasa. Los epítopos propuestos (¹²⁸AAKFDG¹³⁴ (SEQ ID NO: 17); ¹⁷²DPDAQPGG¹⁷⁹ (SEQ ID NO: 18)) localizados en el Cath-D de 34 kDa están representados en la estructura cristalina de cinta de Cath-D madura a pH neutro [40] y ácido [41]. Se están realizando experimentos de transferencia en mancha para validar estos epítopos.

Efecto de IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D sobre el comportamiento de BCC: Primero se analizó la capacidad de IgG1 F1 y E2 para afectar in vitro a los comportamientos de BCC. La IgG1 F1 y E2 inhibieron significativamente la cicatrización de heridas de BCC MDA-MB-231, redujeron el número y tamaño de clones en el ensayo clonogénico e impidieron el desarrollo tridimensional de BCC MDA-MB-231 insertadas en Matrigel. El silenciamiento de Cath-D mediante un procedimiento de shRNA (clones S1C4 y S2C6), indujo una inhibición de la cicatrización de heridas, formación clonogénica y desarrollo en Matrigel, respaldando el papel clave de esta proteasa en estos procesos. Es importante destacar que IgG1 F1 y E2 no eran eficaces para afectar a la cicatrización de heridas cuando se silenciaba Cath-D en los clones S1C4 y S2C6. Finalmente, se observó un efecto inhibidor significativo de IgG1 F1 y E2 en los ensayos de cicatrización de heridas realizados con BCC MCF-7 y T47D ER⁺ . En conjunto, los datos de los autores de la invención sugieren fuertemente que la capacidad de IgG1 F1 y E2 para reducir la agresividad de las BCC es a través de la neutralización de Cath-D extracelular.

Efecto de anticuerpos anti-Cath-D sobre la evolución del tumor de mama:

En el marco de un experimento, 1 o 2 106 xenoinjertos de BCC MDA-MB-231 mezclados con Matrigel (1:1) y establecidos por vía s.c. en ratones atímicos Balb/c, presentaron un crecimiento tumoral exponencial alcanzando un volumen tumoral de 1000 mm3 en 45 días con absorción de 100% y una homogeneidad adecuada del tamaño del tumor (Figura S8). A continuación, los xenoinjertosde MDA-MB-231 (1.5 106 células mezcladas (1:1) con Matrigel) en ratones atímicos Balb/c se establecieron por vía s.c. y se trataron directamente por vía i.p. con IgG1 F1 y E2 (15 mg/kg, 3 veces por semana) durante 45 días. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 2000 mm3. El tratamiento con IgG F1 y E2 inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Figura 8A) y mejoró la supervivencia global (Figura 8B).

Se observó un efecto inhibidor similar de IgG1 F1 y E2 sobre el crecimiento del tumor MDA-MB-231 (Figura 9A) y mejoró la supervivencia global (Figura 9B) cuando se administraron IgG1 F1 y E2 (15 mg/kg, 3 veces por semana) por vía i.p. durante 32 días en xenoinjertos de tumores MDA-MB-231 establecidos de 50 mm3. Con el fin de descifrar el mecanismo de acción in vivo de IgG1 F1 y E2, el experimento anterior realizado en tumores MDA-MB-231 establecidos de 50 mm3 se repitió y los ratones se sacrificaron el día 44 después de 28 días de tratamiento (Figura 10).

Es importante destacar que cuando se usaba el anticuerpo de rituximab anti-CD20 humano como control negativo que no reacciona de forma cruzada con el CD20 de ratón, se obtenían efectos inhibidores del crecimiento tumoral comparables en comparación con el NaCl (Figura 10A). La fotografía óptica confirmó las diferencias en el tamaño del tumor entre el grupo de rituximab en comparación con los grupos de IgG1 F1 e IgG E2 anti-Cath-D. Además, los tumores de los grupos tratados con anticuerpos anti-Cath-D daban menos tinción de sangre en comparación con rituximab, lo que sugiere un posible efecto negativo de IgG F1 e IgG E2 sobre la angiogénesis tumoral (datos no mostrados).

DISCUSIÓN:

Este informe muestra la capacidad de dirigirse a y bloquear Cath-D, expresada en niveles elevados en el microambiente de los carcinomas de mama, utilizando IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D humana. In vitro, estos anticuerpos inhibieron in vitro la cicatrización de heridas, la formación clonogénica y el desarrollo tridimensional de BCC, y disminuyeron in vivo el crecimiento tumoral de BCC triple negativo. Vale la pena señalar que Cath-D es un miembro ubicuo clave no redundante de las catepsinas esenciales para el catabolismo de proteínas en los lisosomas y el mantenimiento de la homeostasis celular. Los ratones con inactivación génica de Cath-D mueren poco después del nacimiento con un fenotipo de lipofuscinosis ceroide neuronal (NCL) [42]. Las mutaciones congénitas de Cath-D en seres humanos que conducen a su síntesis reducida o la producción de una proteína enzimáticamente inactiva dan como resultado NCL [43]. Por lo tanto, los anticuerpos humanos que se dirigen preferencialmente a la Cath-D patológica extracelular (frente a la Cath-D intracelular) son fundamentales para eludir los efectos fuera del objetivo en comparación con los inhibidores específicos de moléculas pequeñas permeables a las células.

Los hallazgos de los autores de la invención indican que las IgG1 F1 y E2 anti-Cath-D humanas reconocen específicamente la cadena pesada de 34 kDa de la Cath-D humana. Se ha propuesto que los anticuerpos pueden dirigirse preferentemente a los bucles que sobresalen en el borde de la hendidura de unión al sustrato para interferir con la maquinaria catalítica de las proteasas sin requerir bucles de inserción largos [44]. El acoplamiento molecular de scFv F1 y E2 con estructura tridimensional de cath-D madura sugiere fuertemente que scFv F1 y E2 interaccionan con el mismo elemento que sobresale próximo al sitio catalítico de aspartato de Cath-D. El ELISA competitivo validó que los epítopos de IgG F1 y E2 se superponen. Esto indica una posible inhibición de la hidrólisis del sustrato por una obstrucción del acceso del sustrato al sitio activo o por un mecanismo alostérico. Se requieren más estudios para dilucidar con precisión la comprensión estructural de los mecanismos de inhibición de Cath-D por los dos anticuerpos humanos anti-Cath-D.

Hasta ahora no se había descrito ningún anticuerpo humano que inhibiera tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor fibroblástico LRP1. La estrategia del hibridoma condujo previamente a la generación de anticuerpos de ratón anti-Cath-D monoclonales de alta afinidad. García y colaboradores inmunizaron ratones con pro-Cath-D de 52 kDa purificada a partir de células BCC MCF-7 para generar anticuerpos monoclonales de ratón selectivos para la Cath-D humana [45]. Algunos de estos anticuerpos monoclonales de ratón anti-Cath-D que reconocen la cadena pesada de 34 kDa inhibieron específicamente la actividad proteolítica de Cath-D a pH 4.5, mientras que los que reconocen específicamente el propéptido de Cath-D no lo hicieron [46]. Luego, el grupo de Rochefort desarrolló un ensayo inmunoenzimométrico de dos sitios en fase sólida (IEMA) de pro-Cath-D de 52 kDa y sus formas procesadas (proteínas de 48 kDa y 34 kDa) en citosoles de tejidos de cáncer de mama, utilizando dos de estos anticuerpos monoclonales (M1G8 y D7E3) dirigidos contra diferentes epítopos de la cadena de 34 kDa [47, 48]. Este IEMA de dos sitios permitió la evaluación clínica de Cath-D como un marcador de pronóstico malo en el cáncer de mama asociado con el riesgo de metástasis y una supervivencia más corta [8, 9]. Hasta ahora, el potencial efecto antitumoral de estos anticuerpos de ratón anti-cath-D sigue sin investigarse. Por el contrario, el grupo de Vetvicka desarrolló anticuerpos peptídicos monoclonales de ratón contra el tramo de aminoácidos (aa 27-44) dentro del propéptido de Cath-D que inhibía el crecimiento de tumores de mama humanos en ratones atímicos [49], pero todavía no se ha publicado una validación adicional. Aquí, se usa la tecnología de presentación en fagos de anticuerpos, una metodología conveniente para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos necesarios para aplicaciones en seres humanos [50].

Basándose en trabajos previos de los autores de la invención relacionados con la acción de Cath-D en el cáncer de mama [26, 29], los agentes de unión de Cath-D scFv se seleccionaron mediante dos cribados funcionales rigurosos: su capacidad para inhibir la actividad proteolítica de Cath-D y su unión a su receptor fibroblástico LRP1. Es importante destacar que el formato de anticuerpo scFv humano es adecuado para la incorporación de la especificidad de unión en proteínas terapéuticas [51, 52] y puede reformatearse fácilmente en IgG1 intacta, como se describe aquí. Las inmunoglobulinas intactas son un formato preferible, debido a su larga semivida circulatoria. Por tanto, la mayoría de los anticuerpos terapéuticos en oncología son isotipos de IgG1 humana (p. ej., Herceptina y Cetumximab). La IgG1 también permite la participación de células efectoras inmunitarias mediante la unión de receptores Fc (FcyR) expresados en células NK, macrófagos y leucocitos [53].

Cath-D es sólo una de una serie de proteasas que se han implicado en la remodelación del microambiente tumoral. Las metaloproteinasas de la matriz se han estudiado ampliamente y muchas muestran una regulación por aumento significativa en los tumores [3]. Los inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz que se desarrollaron mostraron resultados preclínicos prometedores, pero finalmente dieron resultados decepcionantes en los ensayos clínicos. Esto se debió, al menos en parte, a las complejidades de sus funciones fisiológicas y fisiopatológicas [54, 55]. En consecuencia, la atención se ha centrado en otras proteasas tales como las catepsinas de cisteína, en particular la Cath-B, que se ha mostrado que está regulada por aumento en una amplia variedad de cánceres [3]. Sin embargo, como resultado de una estrecha homología de la familia, los esfuerzos para desarrollar inhibidores de moléculas pequeñas específicos frente a las catepsinas de cisteína se han visto obstaculizados por la incapacidad de lograr la selectividad [56]. Además, los efectos secundarios y las toxicidades pueden agravarse aún más por la acumulación de estos inhibidores dentro de los lisosomas (particularmente en tejidos ricos en catepsina tales como el hígado) [57]. El uso de anticuerpos monoclonales en la terapia del cáncer sigue ganando importancia debido a la capacidad de estas moléculas para concentrar efectos terapéuticos en las lesiones neoplásicas a la vez que excluye a los órganos normales [58-60]. Aunque originalmente se han utilizado anticuerpos monoclonales específicos para antígenos de membrana en células cancerosas para aplicaciones dirigidas a tumores, objetivos alternativos tales como marcadores de angiogénesis [61], antígenos estromales [62], proteínas intracelulares liberadas en sitios de necrosis [63, 64] y proteasas secretadas anormalmente se están considerando cada vez más. Los anticuerpos inhibidores contra las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y el activador del plasminógeno uroquinasa uPA se obtuvieron con éxito por la tecnología de presentación en fagos [51, 52]. Más recientemente, se propuso como una estrategia terapéutica potencial el direccionamiento mediado por anticuerpos de la cisteína Cath-S liberada en el microambiente del tumor [36, 65-68]. Alternativamente, se describió el direccionamiento del receptor de uPA con anticuerpos humanos antagonistas conjugados con el radioisótopo terapéutico 177Lu en el cáncer de mama agresivo [69].

En este informe, se propone que el direccionamiento basado en anticuerpos de Cath-D, que está regulada por aumento en el sitio del tumor, puede representar una vía atractiva adicional para aplicaciones terapéuticas en el cáncer de mama. Dadas las potenciales desventajas de los inhibidores de moléculas pequeñas, la aplicación de anticuerpos para antagonizar Cath-D puede ofrecer un potencial terapéutico significativo para el tratamiento del cáncer. Este enfoque permite la generación de un compuesto que es tanto específico hacia Cath-D como que tampoco se acumulará en los lisosomas debido a la degradación endosomal. Además, como la cath-D patológica es secretada en el microambiente del tumor, puede ser modificable por los compuestos de anticuerpos, como se muestra en esta investigación. En conclusión, el uso de un anticuerpo que puede antagonizar selectivamente a la Cath-D en el medio tumoral puede ayudar a eludir los problemas de toxicidad que pueden surgir con los inhibidores de moléculas pequeñas. La utilidad clínica de estos hallazgos iniciales con el anticuerpo anti-Cath-D deberá establecerse mediante más investigaciones en modelos preclínicos. Se ha encontrado que dos IgG1 anti-Cath-D humanas reaccionaban de forma cruzada con Cath-D murina, lo que permite realizar más estudios de toxicidad en modelos de ratón singénicos. Dado que Cath-D puede afectar a la quimiorresistencia de las BCC [70], será particularmente importante en un futuro próximo combinar los anticuerpos humanos anti-cath-D con agentes quimioterapéuticos existentes para el cáncer de mama.

REFERENCIAS:

A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo que inhibe tanto la actividad catalítica de Cath-D como su unión al receptor LRP1, en donde dicho anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

4. El anticuerpo según las reivindicaciones 2 o 3, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5.

5. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10 en la región H-CDR1, la SEQ ID NO: 11 en la región H-CDR2 y la SEQ ID NO: 12 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 15 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 16 en la región L-CDR3.

6. El anticuerpo según la reivindicación 5, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 9.

7. El anticuerpo según la reivindicación 5, en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 13.

8. El anticuerpo según las reivindicaciones 6 o 7, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 9 y la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 13.

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Una célula hospedante que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 9 o un vector según la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. El anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar como fármaco.

14. Un anticuerpo monoclonal anti-Cath-D humano aislado o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en un método para tratar el cáncer de mama en un paciente que lo necesite.