ES2856701T3 - Letalidad sintética y tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de identificación de un sujeto, apto para el tratamiento con un inhibidor de la isozima N- miristoiltransferasa 1 (NMT1), comprendiendo dicho procedimiento: realizar un análisis en una muestra procesada obtenida de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer para determinar si la muestra de dicho sujeto expresa NMT2; en el que el tratamiento con dicho inhibidor de NMT1 está indicado cuando la cantidad de proteína NMT2 o de ácido nucleico en dicha muestra está ausente o es baja en comparación con un control, o cuando dicho cáncer es deficiente en NMT2; en el que dicho cáncer es leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, cáncer de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago; y en el que dicha muestra ha sido procesada por un tratamiento que comprende tratar dicha muestra con alquinil- miristato y destiobiotina azido-PEG biotina y dicho análisis comprende realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo que se une a la proteína miristoilada, o proteínas miristoiladas marcadas con azido-biotina, dentro de la muestra para formar un complejo entre el anticuerpo y la proteína miristoilada presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un perfil de miristoilación indicativo de dicho complejo.

Description

DESCRIPCIÓN
Letalidad sintética y tratamiento del cáncer
Campo de la invención
El campo de la invención se refiere, en general, a compuestos, composiciones y procedimientos para el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una de las principales causas de muerte en Canadá. La Sociedad Canadiense del Cáncer estima que habrá aproximadamente 170000 nuevos casos de cáncer en 2011 y aproximadamente 75000 muertes como resultado del cáncer.
Un enfoque emergente para el tratamiento del cáncer está relacionado con el concepto de letalidad sintética. Dos genes (o dos productos génicos) son letales sintéticamente si la mutación de uno solo es compatible con la viabilidad, pero la mutación de ambos conduce a la muerte. Dicho de otra manera, la "letalidad sintética" describe situaciones en las que una mutación y un fármaco (por ejemplo) juntos provocan la muerte de una célula cancerosa; no provocando la mutación ni el fármaco la muerte celular. El direccionamiento a un gen (o producto génico) que es letal sintéticamente para una mutación relevante para el cáncer debería destruir solo las células cancerosas y no las células normales. La letalidad sintética proporciona, por lo tanto, un marco para el desarrollo de agentes antineoplásicos específicos.
El enfoque de la letalidad sintética para el tratamiento del cáncer es de reciente aparición, aún no es un enfoque rutinario debido en gran parte a la ausencia de identificación de genes (y productos génicos) letales sintéticos.
La W-miristoilación de proteínas es una modificación en la que el miristato (un ácido graso saturado de 14 carbonos) se une covalentemente a la glicina NH2 terminal de diversas proteínas celulares, víricas y oncoproteínas (p. ej., tirosina cinasas oncogénicas relacionadas con Src, subunidades alfa G heterotriméricas, etc.).
Las proteínas miristoiladas celulares tienen diversas funciones biológicas en la transducción de señales y oncogénesis. Es necesaria la modificación de proteínas por miristoilación para el direccionamiento subcelular, la conformación de proteínas y la actividad biológica de muchas proteínas importantes en células eucariotas, incluyendo las necesarias para la transducción de señales y funciones reguladoras importantes en el crecimiento celular. Las tirosina cinasas de la familia Src (protooncogenes) se encuentran entre las proteínas miristoiladas más estudiadas.
La miristoilación de proteínas es catalizada por W-miristoiltransferasa (NMT). La NMT es responsable de esta actividad en células eucariotas y actúa modificando su sustrato polipeptídico después de la eliminación del resto de metionina iniciador por la metionil aminopeptidasa. Esta modificación se produce principalmente como un proceso cotraduccional, aunque también se puede producir miristoilación postraduccionalmente después de la escisión proteolítica de proteínas, normalmente durante la apoptosis. Se han clonado dos isoenzimas de las enzimas NMT de mamíferos y se denominan NMT1 y NMT2. Las NMT desempeñan una función a favor de la supervivencia en las células. Las dos NMT están presentes en todas las células normales. Se desvelan compuestos y procedimientos para tratar cánceres que son deficientes en NMT2 en el documento WO 2013/013302. De manera similar, el documento WO 2008/076965, Bhandarkar y col. (2008, Clinical Cancer Research) y Kay y col. (Tris (Dibenzylideneacetone) Dipalladium a Small Molecule Palladium Complex Is Effective in the Induction of Apoptosis for B-Chronic Lymphocytic Leukemia B-Cells) desvelan complejos de paladio que pueden inhibir la actividad NMT in vitro y crecimiento del cáncer in vivo. El documento WO 2006/086043 desvela procedimientos para la clasificación de riesgos y la predicción de resultados en la leucemia linfoblástica aguda que implican un clasificador de expresión de 26 genes.
Sigue existiendo la necesidad de compuestos, una composición y un procedimiento para el tratamiento del cáncer. Esta información de antecedentes se proporciona con el fin de dar a conocer información que el solicitante cree que es de posible relevancia para la presente invención. No se pretende necesariamente, ni debería interpretarse, la admisión de que cualquiera de la información anterior constituye técnica anterior contra la presente invención.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un inhibidor de NMT1, comprendiendo dicho procedimiento: realizar un análisis en una muestra procesada obtenida de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer para determinar si la muestra de dicho sujeto expresa NMT2; en el que el tratamiento con dicho inhibidor de NMT1 está indicado cuando la cantidad de proteína o ácido nucleico de NMT2 en dicha muestra está ausente o es baja en comparación con un control, o cuando dicho cáncer es deficiente en NMT2, en el que dicho cáncer es leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, cáncer de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago, en el que dicha muestra ha sido procesada por un tratamiento que comprende tratar dicha muestra con alquinil-miristato y destiobiotina azido-PEG biotina y dicho análisis comprende realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo que se une a la proteína miristoilada, o proteínas miristoiladas marcadas con azido-biotina, dentro de la muestra para formar un complejo entre el anticuerpo y la proteína miristoilada presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un perfil de miristoilación indicativo de dicho complejo.
En el presente documento se desvelan compuestos y composiciones para el tratamiento de un sujeto con cáncer. También se desvela en el presente documento un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, que comprende: administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT.
Según la presente divulgación, el inhibidor de NMT puede comprender un inhibidor de NMT1 y el inhibidor de NMT1 puede comprender una molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento peptídico, un ácido nucleico o combinaciones de los mismos. La molécula pequeña puede comprender Tris-DBA, HMA o DDD85646, DDD86481, o un derivado de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El ácido nucleico puede comprender una molécula de ARNbc, una molécula de ARNi, una molécula de miARN, una ribozima, una molécula de ARNhc o una molécula de ARNip. El cáncer puede ser linfoma, linfoma de linfocitos B, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de células del manto, LLC-B/LLP, inmunocitoma/de Waldenstrom, linfoma de linfocitos B de tipo MALT/monocitoide, linfoma de Burkitt, un linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, linfoma de Burkitt, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma no microcítico de pulmón, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago. El sujeto puede ser un sujeto humano.
También se desvela en el presente documento un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer, que comprende: solicitar una prueba que proporcione los resultados de un análisis para determinar si una muestra del sujeto expresa NMT2 y administrar un inhibidor de NMT1 al sujeto si la muestra es deficiente en NMT2.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo contra NMT2 para formar un complejo entre el anticuerpo y la proteína NMT2 presente en la muestra procesada, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo; en el que la administración de un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto se indica cuando la cantidad de proteína NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto que tiene cáncer o que se sospecha que tiene cáncer; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo contra la proteína NMT2 para formar un complejo entre el anticuerpo y la proteína NMT2 presente en la muestra procesada, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo; y administrar un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto cuando la cantidad de proteína NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control. El análisis para determinar si dicha muestra del sujeto expresa NMT2, puede comprender realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo contra NMT2 para formar un complejo entre el anticuerpo y la NMT2 presente en la muestra procesada, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto que tiene cáncer o que se sospecha que tiene cáncer; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un marcador detectable que se une al ácido nucleico de NMT2 para formar un complejo entre el marcador detectable y el ácido nucleico de NMT2 presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo; en el que la administración de un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto se indica cuando la cantidad de ácido nucleico de NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto que tiene cáncer o que se sospecha que tiene cáncer; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un marcador detectable que se une al ácido nucleico de NMT2 para formar un complejo entre el marcador detectable y el ácido nucleico de NMT2 presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo; y administrar un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto cuando la cantidad de ácido nucleico de NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control. El análisis para determinar si dicha muestra del sujeto expresa NMT2, puede comprender realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un marcador detectable que se une al ácido nucleico de NMT2 para formar un complejo entre el marcador detectable y el ácido nucleico de NMT2 presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo. El ensayo de unión puede comprender un ensayo de hibridación que utiliza sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable. El ensayo de hibridación puede ser cuantitativo o semicuantitativo. El ensayo de hibridación puede ser RT-PCR, hibridación in situ, ensayo de protección de ARN ("RPA"), micromatriz de ADNc y oligonucleótidos, análisis de diferencias de representación ("RDA"), presentación diferencial, análisis de secuencias EST, análisis en serie de la expresión génica ("SAGE") y amplificación mediada por ligamiento múltiple con Luminex FlexMAP ("LMF").
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto que tiene cáncer o que se sospecha que tiene cáncer; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo que se une a la proteína miristoilada o proteínas miristoiladas marcadas con azido-biotina, dentro de la muestra para formar un complejo entre el marcador detectable y la proteína miristoilada presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un perfil de miristoilación indicativo de dicho complejo; y administrar un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto cuando dicho perfil de miristoilación indica que dicho cáncer es deficiente en NMT2, opcionalmente en comparación con un control.
El procesamiento puede comprender tratar dicha muestra con alquinil-miristato y destiobiotina azido-PEG biotina. También se desvela en el presente documento el uso de un inhibidor de NMT1 para tratar a un sujeto con cáncer, o que se sospecha que tiene cáncer, en el que dicho uso de dicho inhibidor de NMT1 está indicado cuando un perfil de miristoilación de una muestra de dicho sujeto indica que dicho cáncer es deficiente en NMT2, opcionalmente en comparación con un control, en el que la realización de un ensayo de unión comprende poner en contacto una muestra procesada con un anticuerpo que se une a la proteína miristoilada o proteínas miristoiladas marcadas con azido-biotina, dentro de la muestra para formar un complejo entre el marcador detectable y la proteína miristoilada presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un perfil de miristoilación indicativo de dicho complejo
El procesamiento puede comprender tratar dicha muestra con alquinil-miristato y destiobiotina azido-PEG biotina. En un aspecto específico del procedimiento de la invención, el ensayo de unión comprende clasificación de células activadas por fluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunohistoquímica cuantitativa, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de Forster, complementación de fluorescencia biomolecular, espectrometría de masas, ensayo de inmunotransferencia o ensayo de coinmunoprecipitación.
En un aspecto específico, la instrumentación que tiene un detector configurado para detectar el complejo formado entre dicho anticuerpo y dicha proteína miristoilada en dicha muestra se usa para determinar una cantidad de complejo en dicha muestra.
En un aspecto específico, dicha instrumentación es un espectrofotómetro, espectrofluorómetro, dispositivo óptico o dispositivo electroquímico.
En un aspecto específico, en el que dicho sujeto es humano.
También se desvela en el presente documento un equipo para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un inhibidor de NMT1, que comprende: un anticuerpo contra NMT2; instrucciones para identificar al sujeto según el procedimiento del presente documento.
El equipo puede comprender además un control.
También se desvela en el presente documento un equipo para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un inhibidor de NMT1, que comprende: un ácido nucleico para unirse a NMT2; instrucciones para identificar al sujeto según los procedimientos desvelados en el presente documento.
El equipo puede comprender además un control.
El ácido nucleico puede ser ARN o ADN.
También se desvela en el presente documento un equipo para identificar a un sujeto adecuado para el tratamiento con un inhibidor de NMT1, que comprende: NeutrAvidinTM-HRP; e instrucciones para identificar a dicho sujeto según los procedimientos desvelados en el presente documento.
El equipo puede comprender además un control.
El equipo puede comprender además alquinil-miristato o destiobiotina azido-PEG biotina.
Breve descripción de los dibujos
Se describirán ahora realizaciones de la presente invención, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
la figura 1 representa el análisis de inmunotransferencia de la expresión de NMT1 y NMT2 en un tipo de linfocitos B normales (L0) y diversos linfomas de linfocitos B y leucemias de linfocitos T;
la figura 2 es un gráfico que ilustra la sensibilidad de diversas células normales y diversos linfomas de linfocitos B y leucemias de linfocitos T a los inhibidores de NMT tris-dibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA);
la figura 3 es un gráfico de barras que ilustra la inhibición de N-miristoiltransferasa (NMT) por trisdibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA); y
la figura 4 son inmunotransferencias que representan líneas celulares de linfoma exploradas con anticuerpos contra NMT1 y NMT2.
La figura 5 es un gráfico lineal que muestra la sensibilidad de los inhibidores de NMT en una línea celular de linfoma de Burkitt en comparación con una línea celular linfocítica B normal inmortalizada;
la figura 6 representa los resultados de la transfección de células de linfoma de Ramos B con pcDNA3.1-V5-NMT2 que muestra un aumento de la supervivencia a TrisDBA (5 ug/ml) 2,5 veces frente a las células de control transfectadas con vector plasmídico vacío (Panel A) que muestra la viabilidad celular y (Panel B) una inmunotransferencia;
la figura 7 representa diferencias en los niveles de proteína NMT2 presentes en diversas líneas celulares linfocíticas y tumores de linfoma sólido;
la figura 8A y B representa las diferencias en los niveles de proteína NMT2 presentes en diversos tumores de linfoma sólido analizados mediante inmunohistoquímica: tinción inmunohistoquímica de NMT de ganglios linfáticos normales, linfoma de Burkitt (LB) y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), en el panel C, el log2 (NMT de intensidad de fluorescencia de micromatriz) para NMT1 y NMT2 se representa para todas las líneas celulares de la base de datos CCLE, en el panel D, el log2 (NMT de intensidad de fluorescencia de micromatriz) para NMT1 y NMT2 se representa para las 100 líneas celulares de la base de datos CCLE con el nivel de expresión de NMT2 más bajo, (panel E) la expresión de NMT2 en Burkitt, el linfoma difuso de linfocitos B grandes y folicular se analizó mediante inmunohistoquímica y la tinción con peroxidasa se cuantificó utilizando Image J. El contenido normal de ganglios linfáticos en NMT2 es 0,392 /- 0,3 (unidad relativa, datos no mostrados);
la figura 9 muestra la viabilidad residual de diversas líneas celulares linfocíticas B tratadas con DDD85646 (panel A), DDD86481 (panel B) y DDD73226 (panel C) durante 72 horas, el panel D representa la confirmación de la inhibición de la miristoilación por DDD86481 en linfocitos IM9 (i) y BL2 (ii), el panel E representa la dosis mínima de DDD86481 necesaria para inhibir la miristoilación en líneas celulares IM-9, BL2 y Ramos;
la figura 10 (panel A) representa la sensibilidad de diversos linfocitos B L0 normales inmortalizados, células de linfoma B malignas (Ramos y BL2) y leucemia de linfocitos T (CEM) al inhibidor de NMT TrisDBA durante 24 horas, (panel B) representa que la transfección de células de linfoma B de Ramos con pcDNA3.1-V5-NMT2 incrementó la supervivencia a TrisDBA (5 ug/ml) 2,5 veces frente a células de control transfectadas con el vector plasmídico vacío.
La figura 11 muestra los niveles de expresión de NMT en la base de datos de la enciclopedia de 967 líneas celulares cancerosas (CCLE) (panel A), la expresión de NMT2 en cánceres seleccionados usando un diagrama de caja y bigotes (panel B), se enumeran las 50 líneas celulares de CCLE con la menor expresión de NMT2 y se clasifican según el tipo de cáncer;
la figura 12 representa que las NMT se escinden durante la apoptosis pero permanecen activas;
la figura 13 representa la purificación de hNMT1 y hNMT2 marcados con GST e His6 recombinantes;
la figura 14 representa la comparación de las actividades enzimáticas entre His6-NMT1 de longitud completa recombinante purificada y ct-His6-NMT1 "truncada por caspasa" recombinante;
la figura 15 representa la comparación de la CE50 y la CI50 de diversos inhibidores de NMT y diferentes líneas celulares;
la figura 16 representa la inducción de apoptosis por DDD86481;
la figura 17 muestra (panel A) una inmunotransferencia con las líneas celulares linfoides indicadas exploradas para determinar la presencia de NMT2 y (panel B) el nivel de expresión de ARNm de NMT2 mostrado como log2 (intensidad de fluorescencia de micromatriz NMT2) para las líneas celulares indicadas de los datos de CCLE; la figura 18 representa el uso de una sonda de destiobiotina-PEG-azida para extraer proteínas u>-alquinilmiristoiladas postraduccionalmente en linfocitos T Jurkat leucémicos usando perlas de estreptavidina-sepharose; la figura 19 representa el uso a mayor escala de una sonda de destiobiotina-PEG-azida para extraer proteínas u>-alquinil-miristoiladas postraduccionalmente en linfocitos T Jurkat leucémicos usando perlas magnéticas de estreptavidina;
la figura 20 representa perfiles de miristoilación de linfocitos B inmortalizados "normales" (IM9) y células BL (BL2 y Ramos) marcadas con alquinil-miristato;
la figura 21 representa gráficos de citotoxicidad dependientes del tiempo y de la dosis a partir de la combinación de DDD86481 y doxorrubixina;
la figura 22 muestra la inmunotransferencia realizada con células incubadas con DMSO, estaurosporina, a FAS o vehículo solo;
la figura 23 representa que esa NMT2 truncada por caspasa es 3-4 veces más activa que la NMT2 de longitud completa;
la figura 24 representa inmunotransferencias de linfocitos B "normales" (IM9) y células BL malignas (Ramos, BL2) tratadas con SAHA 1 pM (inhibidor de HDAC de clase I/II) durante 24 h;
la figura 25 representa que los niveles de proteína NMT2 se reducen en diversas líneas celulares de LB;
la figura 26 describe que la degradación proteasómica no es la causa del agotamiento de NMT2 en las células BL;
la figura 27 representa que la NMT1 es escindida por caspasa-8, pero no NMT2;
la figura 28 representa que tanto NMT1 como NMT2 fueron escindidas por caspasa-3;
la figura 29 representa sitios de escisión por caspasa de NMT1 y NMT2 identificados por la degradación de Edman mostrados en negrita y la caja de lisina (K) con carga positiva está resaltada en las secuencias de aminoácidos de NMT1 y NMT2 (aminoácidos 1 a 80);
la figura 30 representa la confirmación de los sitios de escisión de NMT mediante mutagénesis dirigida;
la figura 31 representa sitios de escisión por caspasa de NMT1 y NMT2 identificados por la degradación de Edman mostrados en negrita y la caja de lisina (K) con carga positiva está resaltada en las secuencias de aminoácidos de NMT1 y NMT2 (aminoácidos 1 a 80);
la figura 32 representa cambios en los niveles de NMT a medida que las células experimentan apoptosis;
la figura 33 representa la actividad NMT inicial en los lisados de células COS7 transfectadas transitoriamente; la figura 34 representa la actividad NMT inicial en los lisados de células COS7 transfectadas transitoriamente. La figura 35 representa la actividad NMT en células COS7 que expresan de forma transitoria V5-NMT1 y V5-NMT2 incubadas con estaurosporina (2,5 pM) y cicloheximida (5 pg/ml);
la figura 36 representa la purificación de hNMT1 marcada con hexahistidina (His) recombinante de longitud completa y escindida por caspasa;
la figura 37 representa la purificación de hNMT2 marcada con hexahistidina (His) recombinante de longitud completa y escindida por caspasa;
la figura 38 representa la actividad NMT de hexahistidina (His)-NMT purificadas de longitud completa y escindidas por caspasa, ensayadas usando un ensayo de miristoilación de péptidos;
la figura 39 representa el fraccionamiento subcelular de NMT endógenas en células HeLa durante la apoptosis; la figura 40 representa la cuantificación de la cantidad de NMT en diferentes fracciones después del fraccionamiento subcelular de NMT endógenas en células HeLa durante la apoptosis; y
la figura 41 representa el fraccionamiento subcelular de células HeLa que experimentan apoptosis marcadas con alquinil-miristato; y
la figura 42 representa el efecto del ácido 2-hidroximirístico (HMA) sobre la inducción de la apoptosis. Se trataron linfocitos T Jurkat con o sin HMA (1 mM) y se indujo la apoptosis con anti-Fas (150ng/ml) y cicloheximida (5 pg/ml).
En la descripción detallada a continuación, los números en negrita sirven para identificar las partes constituyentes que se describen y mencionan en relación con los dibujos que representan diversas realizaciones de la invención. Cabe señalar que al describir diversas realizaciones de la presente invención, se han utilizado los mismos números de referencia para identificar los mismos elementos similares. Por otra parte, para mayor simplicidad, se han omitido partes de algunas figuras de los dibujos.
Descripción detallada
Como se describirá con más detalle a continuación, se describen en el presente documento compuestos, composición y procedimientos para el tratamiento de un sujeto con cáncer. La presente invención se refiere a procedimientos para identificar sujetos con cáncer que son adecuados para el tratamiento con los compuestos, la composición y procedimientos que se describen en el presente documento. También se describen en el presente documento procedimientos para identificar sujetos con cáncer.
La presente solicitud desvela procedimientos y composiciones para el tratamiento de cánceres deficientes en NMT en un sujeto. Los cánceres deficientes en NMT incluyen cánceres deficientes en NMT2 o NMT1. El cáncer deficiente en NMT puede ser un cáncer deficiente en NMT2.
El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a diversas afecciones provocadas por el crecimiento anómalo, incontrolado, de células. Células capaces de provocar cáncer, denominadas "células cancerosas", poseen propiedades características tales como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, velocidad rápida de crecimiento y proliferación y/o determinadas características morfológicas habituales. Las células cancerosas pueden estar en forma de tumor, pero dichas células también pueden existir solas dentro de un sujeto o pueden ser una célula cancerosa no tumorigénica. Un cáncer se puede detectar de cualquiera de varias formas, incluyendo, pero sin limitación, detectando la presencia de un tumor o tumores (p. ej., por medios clínicos o radiológicos), examinando células dentro de un tumor o de otra muestra biológica (p. ej., de una biopsia tisular), midiendo marcadores sanguíneos indicativos de cáncer y detectando un genotipo indicativo de cáncer. Sin embargo, un resultado negativo en uno o más de los procedimientos de detección anteriores no indica necesariamente la ausencia de cáncer, p. ej., un paciente que ha presentado una respuesta completa a un tratamiento contra el cáncer aún puede tener cáncer, como lo demuestra una recaída posterior.
En el procedimiento de la presente invención, el cáncer es leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, linfoma de Burkitt, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma no microcítico de pulmón, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio o carcinoma escamoso de esófago.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal y puede incluir, por ejemplo, animales domesticados, tales como gatos, perros, etc., ganado (p. ej., vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (p. ej., ratón, conejo, rata, cobaya, etc.), mamíferos, mamíferos no humanos, primates, primates no humanos, roedores, aves, reptiles, anfibios, peces y cualquier otro animal. En un ejemplo específico, el sujeto es un ser humano.
El término "tratamiento" o "tratar" como se usa en el presente documento, se refiere a la obtención de resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero sin limitación, un alivio o una mejora de uno o más síntomas o afecciones, una disminución del alcance de la enfermedad, un cuadro clínico estabilizado (es decir, sin empeoramiento), una prevención de la transmisión de la enfermedad, un retardo o una ralentización de la evolución de la enfermedad, una mejora o un alivio de la patología, una disminución de la recurrencia de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratar" y "tratamiento" también pueden significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. "Tratar" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, también incluyen tratamiento profiláctico. Por ejemplo, un sujeto con cáncer temprano, por ejemplo, un linfoma en etapa temprana, puede tratarse para prevenir la progresión o, como alternativa, un sujeto en remisión puede tratarse con un compuesto o una composición descritos en el presente documento para prevenir la recurrencia.
En el presente documento se muestra que las células de linfoma de linfocitos B expresan NMT1, pero no NMT2. Esto contrasta con las células leucémicas y otras células probadas que expresan tanto NMT1 como NMT2. (Como se muestra en las figuras 1 y 4)
Se muestra además en el presente documento que las células de linfoma B son sensibles a la inhibición de la viabilidad celular por inhibidores de NMT.
En un ejemplo, el inhibidor de NMT es tris-dibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA) (figura 2)
En otros ejemplos, el inhibidor de NMT 2-hidroximiristae (HMA) se usa para inhibir células de linfoma B.
En otro ejemplo más, el inhibidor de pirazol sulfonamida de T. brucie NMT [J.A. Frearson y col. (2010) Nature. 464.
728-723)] (d Dd85646) se usa para inhibir las células del linfoma B. (Figura 5).
En otro ejemplo, el inhibidor es DDD86481.
En el presente documento se desvela el uso de compuestos o derivados inhibidores de NMT para el tratamiento del cáncer deficiente en NMT2.
El término "deficiente" como se usa en el presente documento se refiere en general a la inhibición, reducción o eliminación de (en comparación con las muestras de tipo silvestre o de control), por ejemplo, síntesis, niveles, actividad o función de NMT, así como la inhibición de la inducción o estimulación de la síntesis, niveles, actividad o función de la proteína de NMT (por ejemplo, NMT1 o NMT2). El término también se refiere a cualquier ruta metabólica o reguladora, que pueda regular la síntesis, niveles, actividad o función de NMT. El término incluye también incluye la inhibición, reducción o eliminación resultante de la unión con otras moléculas y formación de complejos. Por lo tanto, la expresión "deficiente en NMT" se refiere a lo que da lugar a la inhibición, reducción o eliminación de la función proteica o la función de la ruta proteica. Sin embargo, la expresión no implica que todas y cada una de estas funciones deban inhibirse al mismo tiempo.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando la presencia de una mutación en un gen de NMT. Dichos procedimientos de detección y amplificación de ácido nucleico son bien conocidos por el experto en la materia.
Por ejemplo, el ácido nucleico para amplificar puede ser de una muestra biológica. Diversos procedimientos (tales como la extracción con fenol y cloroformo) de extracción son adecuados para aislar el ADN o el ARN. El ácido nucleico extraído de una muestra se puede amplificar usando técnicas de amplificación de ácido nucleico bien conocidas en este campo. Los ejemplos no limitantes incluyen reacción en cadena (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR anidada, reacción en cadena de la ligasa, indicadores de ARN amplificables, replicación Q-beta, amplificación basada en la transcripción, amplificación de ADN bumerán, activación de desplazamiento de hebra, tecnología de sonda de ciclado, amplificación isotérmica basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) o también pueden usarse otros ensayos de replicación de secuencias o ensayos de amplificación de señales.
Se conocen bien en la técnica procedimientos de amplificación. Algunos procedimientos emplean la transcripción inversa de ARN a ADNc.
Se puede utilizar PCR para amplificar una secuencia diana de interés, p. ej., una secuencia de NMT2.
Los ácidos nucleicos se pueden amplificar antes de la detección o pueden detectarse directamente durante una etapa de amplificación, p. ej., procedimientos "en tiempo real". La secuencia diana se puede amplificar usando un cebador marcado de modo que el amplicón resultante se marque de forma detectable. El cebador se puede marcar con fluorescencia. La secuencia diana se puede amplificar y el amplicón resultante se detecta mediante electroforesis.
El nivel de expresión génica se puede determinar evaluando la cantidad de ARNm de NMT2 en una muestra. Se conocen en la técnica procedimientos de medición del ARNm en muestras. Para medir los niveles de ARNm, las células de las muestras se pueden lisar y los niveles de ARNm en los lisados o en ARN purificado o semipurificado a partir de lisados pueden medirse mediante cualquiera de diversos procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, ensayos de hibridación que utilizan sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable, p. ej., transferencia de Northern o metodologías de RT-PCR cuantitativas o semicuantitativas utilizando cebadores oligonucleotídicos adecuados. Como alternativa, se pueden llevar a cabo ensayos de hibridación in situ cuantitativos o semicuantitativos utilizando, por ejemplo, secciones tisulares o suspensiones celulares sin lisar, y sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable, p. ej., marcadas con fluorescencia o con enzimas. Los procedimientos adicionales para cuantificar el ARNm incluyen el ensayo de protección del ARN ("RPA"), micromatrices de ADNc y oligonucleótidos, análisis de diferencias de representación ("RDA"), presentación diferencial, análisis de secuencias EST, análisis en serie de la expresión génica ("SAGE") y amplificación mediada por ligamiento múltiple con Luminex FlexMAP ("LMF").
La amplificación también se puede supervisar usando procedimientos "en tiempo real". La PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación de un ácido nucleico diana. Normalmente, este enfoque de la PCR cuantitativa utiliza un colorante fluorescente, que puede ser un colorante específico de doble cadena, tal como SYBR Green.RTM. I. Como alternativa, otros colorantes fluorescentes, p. ej., FAM o HEX, pueden conjugarse con una sonda oligonucleotídica o un cebador. Se conocen en la técnica diversos instrumentos capaces de realizar PCR en tiempo real. La señal fluorescente generada en cada ciclo de PCR es proporcional a la cantidad de producto de PCR. Se usa un gráfico de fluorescencia frente al número de ciclos para describir la cinética de amplificación y se usa un nivel de umbral de fluorescencia para definir un número de ciclo fraccional relacionado con la concentración inicial del molde. Cuando se realiza y detecta la amplificación en un instrumento capaz de leer la fluorescencia durante el termociclado, el producto de PCR previsto de los productos de PCR inespecíficos se puede diferenciar mediante análisis de fusión. Midiendo el cambio en la fluorescencia mientras se aumenta gradualmente la temperatura de la reacción después de la amplificación y generación de la señal, puede ser posible determinar el (Act) del producto o los productos previstos, así como el del producto inespecífico.
Los procedimientos desvelados en el presente documento pueden incluir amplificar múltiples ácidos nucleicos en una muestra, también conocido como "detección múltiple" o "multiplexación". Como se usa en el presente documento, la expresión "PCR múltiple" se refiere a PCR, que implica añadir más de un conjunto de cebadores de PCR a la reacción para detectar y cuantificar múltiples ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos de uno o más marcadores de genes diana. Asimismo, la multiplexación con control interno, p. ej., ARNr 18s, GADPH o .beta.-actina) proporciona un control para la PCR sin reacción.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando la inactivación epigenética de un gen de NMT. Se puede identificar un cáncer como deficiente en NMT determinando la actividad de NMT (incluyendo NMT1 o NMT2) en una muestra de células de un sujeto. La actividad se puede determinar en relación con un control, por ejemplo, en el caso de defectos en las células cancerosas, en relación con las células no cancerosas, preferentemente del mismo tejido. Por tanto, un cáncer deficiente en NMT puede tener actividad y/o expresión de NMT reducida o eliminada. La actividad de NMT puede determinarse usando técnicas bien conocidas en este campo y/o como se describe en el presente documento. En estos ejemplos, un cáncer deficiente en NMT tiene actividad reducida o eliminada.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT (p. ej., NMT1, NMT2 o ambas) determinando la cantidad, concentración y/o niveles de proteína o proteínas NMT.
En el procedimiento de la presente invención, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando la cantidad de proteínas miristoiladas en una muestra biológica de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer. La presencia, ausencia o cantidad de proteína miristoilada se puede determinar, por ejemplo, utilizando química clic utilizando análogos de ácidos grasos adecuados. En el presente documento se describen procedimientos no limitantes. El experto en la materia conocerá procedimientos alternativos para determinar la presencia, ausencia o cantidad de proteínas miristoiladas. Una muestra que tiene una cantidad reducida de proteína miristoilada en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT. En algunos ejemplos, una muestra que tiene una cantidad reducida de proteína miristoilada en una muestra es indicativa de una muestra deficiente en NMT2 o un cáncer deficiente en NMT2. Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando la cantidad de acilación de proteínas en una muestra biológica de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer. Se puede determinar la presencia, ausencia o cantidad de acilación de proteínas. Dichos procedimientos serían conocidos por el experto en la materia. Una muestra que tiene una cantidad reducida de acilación de proteínas en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT. Una muestra que tiene una cantidad reducida de acilación de proteínas en una muestra es indicativa de una muestra deficiente en NMT2 o un cáncer deficiente en NMT2.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando la presencia de una o más variaciones de secuencia tales como mutaciones y los polimorfismos pueden incluir una supresión, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, en relación con la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre. La o las variaciones pueden estar en una región codificante o no codificante de la secuencia de ácido nucleico y pueden reducir o anular la expresión o función de NMT. Por tanto, el ácido nucleico variante puede codificar un polipéptido variante que tiene actividad reducida o anulada o puede codificar un polipéptido de tipo silvestre que tiene poca o ninguna expresión dentro de la célula, por ejemplo, a través de la actividad alterada de un elemento regulador.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT determinando el gen o genes que efectúan o regulan negativamente la expresión de NMT.
Pueden usarse diversos procedimientos para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico en particular en una muestra obtenida de un sujeto.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT evaluando el nivel de expresión o actividad de un regulador positivo o negativo de NMT de un componente de la ruta de NMT. Se pueden determinar los niveles de expresión, por ejemplo, mediante inmunoensayos, tales como inmunotransferencias y ELISA, y procedimientos de detección de ácido nucleico, tales como RT-PCR, tecnología nanostring, RNA-seq, hibridación de ácidos nucleicos o análisis cariotípico.
Un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT1 y/o NMT2 determinando la presencia en una muestra de células del individuo de una o más variaciones, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones en NMT1 y/o NMT2.
Las mutaciones y polimorfismos asociados con el cáncer también pueden detectarse en el nivel de proteínas detectando la presencia de un polipéptido variante (es decir, un mutante o una variante alélica).
En el presente documento se desvela un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, en el que dicho cáncer comprende células cancerosas que son deficientes en NMT2, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT y/o un inhibidor de NMT1.
El término "inhibir" o "inhibidor" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier procedimiento o técnica que inhiba la síntesis, niveles, actividad o función de proteínas, así como procedimientos para inhibir la inducción o estimulación de la síntesis, niveles, actividad o función de la proteína de interés, por ejemplo NMT2. El término también se refiere a cualquier ruta metabólica o reguladora, que pueda regular la síntesis, niveles, actividad o función de la proteína de interés. El término incluye la unión con otras moléculas y la formación de complejos. Por lo tanto, el término "inhibidor" se refiere a cualquier agente o compuesto, cuya aplicación dé lugar a la inhibición de la función de la proteína o la función de la ruta de la proteína. Sin embargo, el término no implica que todas y cada una de estas funciones deban inhibirse al mismo tiempo.
En el presente documento se desvela también un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, en el que dicho cáncer comprende células cancerosas deficientes en NMT1, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT y/o un inhibidor de NMT2.
Los procedimientos de tratamiento desvelados en el presente documento pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en el presente documento y opcionalmente consisten en una única administración o aplicación, o, como alternativa, comprenden una serie de administraciones o aplicaciones. El compuesto puede ser un inhibidor de NMT, un inhibidor de NMT1 y/o un inhibidor de NMT2.
El inhibidor de NMT puede ser Tris-DBA, HMA, DDD85646, DDD86481 o derivados de los mismos.
Los compuestos y/o composiciones se pueden proporcionar en una cantidad de efecto farmacéutico adecuada para la administración a un sujeto.
La expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que induzca la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que está buscando un investigador o un médico. Esta cantidad puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz.
Los compuestos y composiciones se proporcionan en una forma farmacéuticamente aceptable.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento incluye compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación (tales como dosis unitarias) que son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, excipiente, etc. también es "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación.
La dosis real administrada, y la velocidad y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, p. ej., las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generales y otros médicos y normalmente tiene en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de suministro, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos.
Un compuesto o una composición puede administrarse solo o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o secuencial, dependiendo de la afección que se trate.
Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica farmacéutica. Dichos procedimientos incluyen la etapa de asociar el compuesto activo con un vehículo, que puede constituir uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el compuesto activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto.
Los compuestos y composiciones pueden administrarse a un sujeto mediante cualquier vía de administración conveniente, ya sea sistémicamente/periféricamente o en el sitio de la acción deseada, incluyendo, pero sin limitación, oral (p. ej., por ingestión); tópica (incluyendo, p. ej., transdérmica, intranasal, ocular, bucal y sublingual); pulmonar (p. ej., por inhalación o terapia de insuflación utilizando, p. ej., un aerosol, p. ej., a través de la boca o la nariz); rectal; vaginal; parenteral, por ejemplo, mediante inyección, incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoideo e intraesternal; por implantación de un depósito/por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral (p. ej., por ingestión) pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos, conteniendo cada una cantidad predeterminada del compuesto activo; como polvo o gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite; como embolada; como un electuario; o como una pasta.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral (p. ej., mediante inyección, incluyendo cutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), incluyen soluciones isotónicas acuosas y no acuosas, sin pirógenos, inyectables estériles que pueden contener antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizantes, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto a componentes sanguíneos o uno o más órganos. Los ejemplos de vehículos isotónicos adecuados para su uso en dichas formulaciones incluyen inyección de cloruro de sodio, solución de Ringer o inyección de lactato de Ringer.
Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o de múltiples dosis sellados, por ejemplo, ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado criodesecado (liofilizado) que requiere únicamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. Las formulaciones pueden estar en forma de liposomas u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto activo a componentes sanguíneos o uno o más órganos.
Pueden utilizarse composiciones que comprenden compuestos desvelados en el presente documento en los procedimientos descritos en el presente documento en combinación con regímenes quimioterapéuticos convencionales o junto con radioterapia.
En el caso de linfoma en un paciente, los tratamientos conocidos dependen del sujeto que se trata, el tipo de enfermedad y su etapa. El experto en la materia conoce modalidades de tratamiento existentes para el linfoma. Por consiguiente, se pueden utilizar tratamientos conocidos junto con los inhibidores de NMT desvelados en el presente documento.
Las combinaciones farmacológicas habituales para su uso en el tratamiento de linfomas incluyen, pero sin limitación, CHOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona), GAP-BOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (es decir, metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), ProMACE-MOPP (es decir, prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina con MOPP convencional), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Para el linfoma no hodgkiniano agresivo recidivante, se pueden utilizan las siguientes combinaciones farmacológicas de quimioterapia con los compuestos y composiciones descritos en el presente documento: IMVP-16 (es decir, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (es decir, dexametasona, - 16 dosis altas de citarabina y cisplatino), ESHAP (es decir, etopósido, metilprednisona, dosis alta de citarabina y cisplatino), CEFF(B) (es decir, ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (es decir, lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona).
El tratamiento para la quimioterapia de rescate utilizada para determinados linfomas, tal como para enfermedad de Hodgkin resistente, recidivante, incluyen, pero sin limitación, VABCD (es decir, vinblastina, doxorrubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina), ABDIC (es decir, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina y prednisona), CBVD (es decir, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (es decir, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona), CEP (es decir, lomustina, etopósido y prednimustina), EVA (es decir, etopósido, vinblastina y doxorrubicina), MOPLACE (es decir, ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citaravina y vincristina), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MINE (es decir, mitocuazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido), MTX-CHOP (es decir, metotrexato y CHOP), CEM (es decir, lomustina, etopósido y metotrexato), CEVD (es decir, lomustina, etopósido, vindesina y dexametasona), CAVP (es decir, lomustina, melfalán, etopósido y prednisona), EVAP (es decir, etopósido, vinblastina, citarabina y cisplatino) y EPOCH (es decir, etopósido, vincristina, ; doxorrubicina, ciclofosfamida y prednisona).
Se apreciará que pueden utilizarse procedimientos alternativos para inhibir NMT1 o NMT2 en una estrategia letal sintética para el tratamiento del cáncer y, en particular, el tratamiento del linfoma de linfocitos B. Por ejemplo, la expresión de NMT1 o NMT2 puede inhibirse utilizando tecnología antisentido o de ARNi. El experto en la materia conoce el uso de estos enfoques para regular negativamente la expresión génica y/o la actividad proteica.
También se desvela en el presente documento un procedimiento para determinar el beneficio del tratamiento con inhibidor de NMT2 y/o inhibidor de NMT1 de un paciente.
Un procedimiento como se desvela en el presente documento puede comprender determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o que se sospecha que tiene cáncer, para determinar la presencia o ausencia, o cantidad o concentración, de NMT1 y/o NMT2.
El procedimiento de la presente invención comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o que se sospecha que tiene cáncer, para determinar la presencia o ausencia, o cantidad o concentración, de proteínas miristoiladas.
Un procedimiento como se desvela en el presente documento comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o que se sospecha que tiene cáncer, para determinar la presencia o ausencia, o cantidad de concentración de proteínas aciladas.
El término "muestra" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier muestra de un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, un líquido, muestra de células o tejido que comprende células cancerosas, o que se sospecha que contiene células cancerosas, que puede analizarse para determinar los niveles de expresión génica, niveles de proteínas, niveles de actividad enzimática y similares. La muestra puede incluir, por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de médula ósea, una biopsia, una muestra de tejido congelada, una muestra de tejido nuevo, una muestra de células y/o una sección incluida en parafina, material del que se puede extraer ARN en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para permitir la medición de los niveles relativos de ARNm o material del que se pueden extraer polipéptidos en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para permitir la medición de los niveles relativos de polipéptidos.
La determinación, el análisis o la medición de NMT1 o NMT2, o la presencia o ausencia de NMT1 y/o NMT2 pueden correlacionarse con el beneficio del tratamiento del cáncer con inhibidor de NMT1 o inhibidor de NMT2 en el paciente.
La determinación, el análisis o la medición de proteínas miristoiladas, o la presencia o ausencia de proteínas miristoiladas pueden correlacionarse con el beneficio del tratamiento del cáncer con inhibidor de NMT1 o inhibidor de NMT2 en el paciente.
La determinación, el análisis o la medición de proteínas aciladas, o la presencia o ausencia de proteínas miristoiladas pueden correlacionarse con el beneficio del tratamiento del cáncer con inhibidor de NMT1 o inhibidor de NMT2 en el paciente.
Los anticuerpos para su uso en los procedimientos desvelados en el presente documento pueden ser inmunorreactivos o inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente a una proteína de interés, por ejemplo, la proteína NMT1 o NMT2. Se pueden utilizar anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos para NMT1 o NMT2 humanas. Los anticuerpos para NMT1 o NMT2 humanas son preferentemente inmunoespecíficos. El término "anticuerpo" y "anticuerpos" incluye, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales.
Los anticuerpos para su uso en los procedimientos desvelados en el presente documento pueden ser inmunorreactivos o inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente a proteínas tanto NMT1 como NMT2. Se pueden utilizar anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos tanto para NMT1 como para NMT2 humanas. Los anticuerpos para NMT1 o NMT2 humanas son preferentemente inmunoespecíficos. Debido a la diferente masa molecular de NMT1 y NMT2, es posible identificar la presencia o ausencia de ambas proteínas utilizando un solo anticuerpo, utilizando, por ejemplo, SDS-PAGE e inmunotransferencia. El término "anticuerpo" y "anticuerpos" incluye, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales.
La expresión "se une específicamente" se refiere a unión de alta avidez y/o alta afinidad de un anticuerpo a un polipéptido específico, p. ej., un epítopo de NMT1 o NMT2. La unión del anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, en particular, los que pueden estar presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra que, el polipéptido específico de interés. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil, pero detectable. Dicha unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible a partir de la unión de anticuerpo específico al compuesto o polipéptido de interés, p. ej., mediante el uso de controles adecuados, como sabrá el trabajador experto en la materia.
Una muestra que contiene células cancerosas o que se sospecha que contiene células cancerosas se puede obtener de un sujeto con cáncer. El experto en la materia conoce bien la recogida de dicha muestra. La muestra puede ser una muestra de sangre. El experto en la materia también conoce bien procedimientos para obtención de una muestra, el procesamiento y/o almacenamiento de dicha muestra.
La detección, el análisis o la medición de la proteína NMT1 o NMT2 dentro de una muestra puede llevarse a cabo usando inmunohistoquímica. La detección, el análisis o la medición de NMT2 dentro de una muestra puede llevarse a cabo usando inmunohistoquímica. Para el experto en la materia, resultará evidente que otros inmunoensayos, tanto cualitativos como cuantitativos, pueden usarse en la presente invención.
La inmunohistoquímica (IHC) se puede lograr usando cualquier procedimiento o sistema adecuado de inmunohistoquímica. Los ejemplos no limitantes incluyen sistemas automáticos, IHC cuantitativa, IHC semicuantitativa y procedimientos manuales.
El término inmunohistoquímica "cuantitativa" se refiere a un procedimiento automático de exploración y puntuación de muestras que se han sometido a inmunohistoquímica, para identificar y cuantificar la presencia de un biomarcador específico, tal como un antígeno u otra proteína. Por ejemplo, para cuantificar NMT1 y/o NMT2. La puntuación otorgada a la muestra es una representación numérica de la intensidad de la tinción inmunohistoquímica de la muestra y representa la cantidad de biomarcador diana (tal como NMT1 o NMT2) presente en la muestra. Como se usa en el presente documento, la densidad óptica (DO) es una puntuación numérica que representa la intensidad de la tinción, así como el porcentaje de células que se tiñen. Como se usa en el presente documento, la inmunohistoquímica semicuantitativa se refiere a la puntuación de los resultados inmunohistoquímicos por el ojo humano, donde un operador capacitado clasifica los resultados numéricamente (p. ej., como 0 [tinción débil o ausente], 1 o 2 [tinción fuerte]).
Se conocen en la técnica sistemas automáticos de procesamiento, barrido y análisis de muestras adecuados para su uso con inmunohistoquímica y pueden usarse con el procedimiento de la presente invención. Dichos sistemas pueden incluir tinción automática y exploración microscópica, análisis de imágenes computarizado, comparación de secciones en serie (para controlar la variación en la orientación y el tamaño de una muestra), generación de informes digitales y archivado y seguimiento de muestras (tales como portaobjetos en las que se colocan secciones tisulares). Están disponibles en el mercado sistemas de captura de imágenes celulares que combinan microscopios ópticos convencionales con sistemas de procesamiento de imágenes digitales para realizar análisis cuantitativos en células y tejidos, incluyendo muestras inmunoteñidas.
En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que una muestra de paciente tiene una tinción tumoral de NMT2 baja (p. ej., débil o ausente), el paciente se considera un buen candidato para el tratamiento con inhibidores de NMT1. En otro ejemplo específico, un paciente que se determina que tiene una tinción tumoral alta (p. ej., fuerte) de NMT2 se considera un mal candidato para el tratamiento con inhibidor de NMT1.
Se apreciará que el punto de corte para la determinación de IHC negativa frente a positiva es una determinación semicuantitativa y realizada por un patólogo experimentado utilizando procedimientos semicuantitativos y microscopía óptica.
Por ejemplo, la IHC se puede puntuar de cualquiera de las siguientes formas: 1. Cualquier tinción frente a ninguna tinción; 2. Tinción fuerte frente a débil; 3. Ninguna frente a débil frente a fuerte; 4. Una puntuación H comprendida por la fórmula (% ninguna x 0) (% débil x 100); (% moderado x 200) (% fuerte x 300); 5. Programa computarizado de análisis de imágenes para puntuación cuantitativa asistida.
Los puntos de corte se definen inicialmente por la sensibilidad farmacológica variable in vitro. Una vez que los fármacos llegan a las pruebas clínicas, el punto de corte sensible frente a no sensible se refinará y validará adicionalmente.
En un ejemplo, para determinar si hay una tinción tumoral de NMT2 alta (p. ej., fuerte) o baja (p. ej., débil o ausente), la muestra del paciente puede compararse con una o más muestras de control. En un ejemplo, una muestra de control ha tenido un nivel conocido y/o establecido de tinción tumoral de NMT2. En un ejemplo, una muestra de control es una muestra de un paciente que tiene niveles conocidos y/o establecidos de tinción tumoral de NMT2 y/o resultado clínico conocido. En un ejemplo, un control es una línea celular que tiene una cantidad conocida de tinción de NMT2.
El experto conoce las opciones de tratamiento continuo para pacientes que se consideran malos candidatos para el tratamiento con inhibidores de NMT1.
Se apreciará que, en algunas circunstancias, un paciente que responde inicialmente al tratamiento con inhibidores de NTM1 puede recaer. Dicha recaída puede manifestarse de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, reaparición del tumor primario y desarrollo de metástasis. Además, o como alternativa, puede surgir un tumor definido adicional.
En el presente documento se desvela un procedimiento que comprende: a) obtener una muestra de un sujeto con, o que se sospecha que tiene, cáncer; b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo contra NMT2 para formar un complejo entre el anticuerpo y NMT2 presente en la muestra; c) medir el complejo formado para determinar una cantidad o concentración de NMT2 en la muestra; y d) determinar el beneficio del tratamiento con inhibidor de NMT1 de dicho cáncer en dicho sujeto, en el que la determinación del beneficio del tratamiento con inhibidor de NMT1 está determinada por el nivel de NMT2 en dicha muestra.
La administración de un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto se indica cuando la cantidad de NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende: obtener una muestra de un sujeto; procesar dicha muestra; realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo contra NMT2 para formar un complejo entre el anticuerpo y la NMT2 presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un resultado de ensayo indicativo de dicho complejo; y administrar un inhibidor de NMT1 a dicho sujeto cuando la cantidad de NMT2 en dicha muestra es baja o está ausente, opcionalmente en comparación con un control.
La instrumentación que tiene un detector configurado para detectar el complejo formado entre el anticuerpo y NMT2 en dicha muestra puede utilizarse para determinar la cantidad de complejo en la muestra. La instrumentación puede ser un espectrofotómetro, espectrofluorómetro, dispositivo óptico o dispositivo electroquímico. El anticuerpo para NMT2 puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
Otras técnicas que pueden utilizarse en la detección, el análisis o la medición de NMT1 o NMT2 incluyen, pero sin limitación, inmunotransferencia, ELISA, inmunofluorescencia indirecta, tecnología de perlas de multiplexación, inmunoprecipitación y espectrometría de masas de la muestra obtenida del sujeto. En la práctica, cuando se determina que una muestra de un paciente tiene una tinción de NMT2 baja o ausente, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT.
La muestra puede analizarse mediante microscopia óptica mediante examen directo o mediante captura y análisis de imágenes, o mediante microscopia fluorescente usando examen directo mediante captura y análisis de imágenes. Un procedimiento de la divulgación como se desvela en el presente documento puede comprender determinar, analizar o medir cualitativa o cuantitativamente la actividad de NMT1 y/o la actividad de la proteína NMT2 en una muestra biológica de un sujeto con un paciente con cáncer para determinar la presencia o ausencia o cantidad de actividad de NMT1 y/o NMT2. Los usos de sustratos (naturales o sintéticos) de NMT1 o NMT2 se utilizan para identificar una muestra en la que la actividad de NMT1 o NMT2 está presente, ausente o la cantidad de la misma. Cuando se determina que la muestra de un sujeto es deficiente en NMT2, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT1.
Cuando se determina que la muestra de un sujeto tiene niveles de proteína NMT2 bajos o ausentes, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT1.
Cuando se determina que una muestra de un sujeto tiene una actividad de NMT2 baja o ausente, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT1.
Cuando se determina que una muestra de un sujeto tiene una cantidad baja o ausente de proteína miristoilada, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT1.
Cuando se determina que una muestra de un sujeto tiene una cantidad baja o ausente de proteína acilada, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT2.
Un procedimiento como se desvela en el presente documento puede comprender identificar una mutación, supresión, o similares, en el gen de NMT1 o NMT2 en una muestra de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer. En el que, dicha mutación, supresión, o similares, en el gen de NMT1 o NMT2 da lugar a una pérdida de disminución de la actividad de la proteína NMT1 o NMT2 en células cancerosas dentro de dicha muestra. Los expertos en la materia conocen procedimientos para identificar dichas mutaciones, supresiones, o similares, en NMT1 o NMT2, e incluyen, pero sin limitación, RFLP, RT-PCT, análisis de micromatrices y/o cualquier tipo adecuado de secuenciación de ADN. Cuando se determina que una muestra de un paciente tiene una mutación, supresión, o similares, en NMT2 que da lugar a una actividad de la proteína NMT2 baja o ausente, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT.
Un procedimiento como se desvela en el presente documento puede comprender identificar una mutación, supresión, o similares, en el ARNm de NMT1 o NMT2 en una muestra de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer. En el que, dicha mutación, supresión, o similares, en el ARNm de NMT1 o NMT2 da lugar a una pérdida de disminución de la actividad de la proteína NMT1 o NMT2 en células cancerosas dentro de dicha muestra. Los expertos en la materia conocen procedimientos para identificar dichas mutaciones, supresiones, o similares, en ARNm de NMT1 o NMT2, e incluyen, pero sin limitación, transferencia de Northern, RT-PCR, análisis de micromatrices y/o cualquier tipo adecuado de secuenciación de ARNm. Cuando se determina que una muestra de un paciente tiene una mutación, supresión, o similares, en ARNm de NMT2 que da lugar a una actividad de la proteína NMT2 baja o ausente, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT. También se desvela en el presente documento un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que padece cáncer, asociado con un defecto en NMT1 o NMT2, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT. El cáncer puede estar asociado con un defecto en NMT2 y el inhibidor puede ser un inhibidor de NMT1.
También se desvela en el presente documento el uso de un inhibidor de NMT1 para el tratamiento de un cáncer deficiente en NMT2.
También se desvela en el presente documento el uso de un inhibidor de NMT1 para el tratamiento de un cáncer, en el que dicho cáncer es linfoma, linfoma de linfocitos B, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de células del manto, LLC-B/LLP, inmunocitoma/de Waldenstrom, linfoma de linfocitos B de tipo MALT/monocitoide, linfoma de Burkitt, un linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, linfoma de Burkitt, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma no microcítico de pulmón, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio o carcinoma escamoso oroesofágico. El cáncer puede determinarse como un cáncer deficiente en NMT2.
Los ejemplos de inhibidores incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos peptídicos y/o moléculas de ácido nucleico.
Los ejemplos específicos de moléculas pequeñas incluyen Tris-DBA, HMA, DDD85646, DDD86481 y sus derivados. El término "derivados" como se usa en el presente documento incluye, pero sin limitación, sales, complejos de coordinación, ésteres tales como ésteres hidrolizables in vivo, ácidos o bases libres, hidratos, profármacos o lípidos, compañeros de acoplamiento.
Los fragmentos peptídicos se pueden preparar total o parcialmente mediante síntesis química de ese sitio activo de NMT1. Se pueden preparar fragmentos peptídicos según procedimientos convencionales, establecidos, de síntesis de péptidos en fase líquida o sólida, que serán conocidos por los expertos en la materia.
Los inhibidores de ácidos nucleicos, o los complementos de los mismos, inhiben la actividad o función regulando negativamente la producción de polipéptido activo. Esto se puede supervisar utilizando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante cribado utilizando PCR en tiempo real como se describe en los ejemplos.
Los ejemplos de inhibidores de ácido nucleico incluyen tecnología antisentido o de ARNi, cuyo uso es para regular negativamente la expresión génica y está bien establecido en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido pueden diseñarse para hibridar con la secuencia complementaria de ácido nucleico, pre-ARNm o ARNm maduro, interfiriendo con la producción del componente de la ruta de reparación de la escisión de bases de modo que su expresión se reduzca o se prevenga por completo o sustancialmente por completo. Además de dirigirse a la secuencia codificante, se pueden utilizar técnicas antisentido para dirigirse a secuencias de control de un gen, p. ej., en la secuencia flanqueante 5', por lo que los oligonucleótidos antisentido pueden interferir con secuencias de control de la expresión.
Una alternativa al antisentido es usar una copia de todo o parte del gen diana insertado en orientación con sentido, es decir, la misma, como gen diana, para lograr la reducción de la expresión del gen diana mediante cosupresión. Adicionalmente, puede usarse silenciamiento de ARN bicatenario (ARNbc). El silenciamiento mediado por ARNbc es específico de un gen y con frecuencia se denomina interferencia de RNA (ARNi).
Se pueden utilizar ácidos nucleicos que en la transcripción producen una ribozima, capaz de cortar ácido nucleico en un sitio específico y, por lo tanto, también útil para influir en la NMT.
Pueden emplearse moléculas pequeñas de ARN para regular la expresión génica. Estas incluyen la degradación dirigida de ARNm por ARN interferentes pequeños (ARNip), silenciamiento génico postranscripcional (PTG), represión traduccional específica de secuencia regulada por el desarrollo de ARNm por micro-ARN (miARN) y silenciamiento dirigido de genes transcripcionales.
Puede usarse la expresión de una molécula de ARN en horquilla corta (ARNhc) en la célula. Un ARNhc consiste en repeticiones cortas invertidas separadas por una secuencia pequeña de bucle. Una repetición invertida es complementaria del gen diana. En la célula, el ARNhc es procesado por DICER en un ARNip que degrada el ARNm del gen de NMT diana y suprime la expresión. En una realización preferida, el ARNhc se produce de forma endógena (dentro de una célula) mediante transcripción de un vector.
Un defecto en NMT1 o NMT2, es un fenotipo deficiente en NMT1 o NMT2, respectivamente, que puede ser deficiente en un componente de una ruta mediada por NMT1 o NMT2, es decir, la expresión de la actividad de un componente de la ruta puede reducirse o suprimirse en la célula cancerosa en relación con células de control. La célula cancerosa puede ser deficiente en n MT1 o NMT2, es decir, la expresión de la actividad de NMT1 o NMT2 puede reducirse o suprimirse en la célula cancerosa en relación con células de control.
Por consiguiente, en el presente documento se desvela el uso de NMT2 como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o supervisión del cáncer en un sujeto. La NMT2 puede medirse utilizando un ensayo seleccionado de inmunoensayos o detección de ácido nucleico o actividad proteica.
El término "pronóstico" como se usa en el presente documento se refiere a la predicción de la probabilidad de muerte o progresión atribuible al cáncer, incluyendo la recurrencia, diseminación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama.
La expresión "marcador de pronóstico" como se usa en el presente documento se refiere a un marcador que informa acerca del resultado de un paciente en ausencia de terapia sistémica o presagia un resultado diferente al de los pacientes sin el marcador, a pesar de la terapia sistémica empírica (no dirigida al marcador).
La expresión "marcador predictivo" como se usa en el presente documento se refiere a un marcador que predice esa eficacia diferencial (beneficio) de una terapia en particular en función del estado del marcador.
El término "diagnóstico" como se usa en el presente documento, se refiere a la identificación de un estado molecular y/o patológico, enfermedad o afección, tal como la identificación de cáncer de mama u otro tipo de cáncer.
En el presente documento también se desvela el uso de miristoilación de proteínas como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o supervisión del cáncer en un sujeto.
En el presente documento también se desvela el uso de acilación de proteínas como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o supervisión del cáncer en un sujeto.
Los procedimientos de la invención se practican convenientemente proporcionando los compuestos y/o composiciones usados en dicho procedimiento en forma de un equipo. Preferentemente, dicho equipo contiene la composición. Preferentemente, dicho equipo contiene instrucciones para su uso.
Para comprender mejor la invención descrita en el presente documento, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos. Por lo tanto, no deben limitar el ámbito de la presente invención de ninguna manera.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos, se emplearon metodologías convencionales, como apreciaría el trabajador experto en la materia.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Anticuerpos y reactivos.
Tris dibutilbenciniliden acetona paladio (TrisDBA) fue cedido amablemente por el Dr. Arbiser (U. Alabama). El DDD85646 se sintetizó como se ha descrito [J.A. Frearson y col. (2010) Nature. 464. 728-723)] y/o DDD86481 se obtuvo del Dr. David Gray y Paul Wyatt, Universidad de Dundee)
Los anticuerpos de ratón anti-NMT1 (clon 14; 1:1000) y de ratón anti-NMT2 (clon 30; 1:2000) eran de BD Biosciences, San José, CA, Estados Unidos. Se adquirió anticuerpo de conejo anti-NMT1 (policlonal, 1:3000) de Proteintech, Chicago, IL, Estados Unidos. Los anticuerpos de conejo anti-GFP (1: 20000), anti-PARP-1 (1:5000), anti-GAPDH (1:5000) y anti-PAK2 c-terminal (1:2000) eran de Eusera. (www.eusera.com), Edmonton, AB, Canadá. Los anticuerpos de ratón anti-a-tubulina (1:15000) y de conejo anti-V5 (1:10000) se adquirieron de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos. El anticuerpo de ratón anti-His (1:2000) era de Qiagen, Alemania. Los anticuerpos de conejo anti-caspasa-8 escindida (1:1000) y anti-caspasa-3 escindida (1:1000) eran ambos de Cell Signalling, Danvers, MA, Estados Unidos. Los equipos de detección de transferencia de Western de quimioluminiscencia mejorada (ECL) Plus y ECL Prime se adquirieron de GE Healthcare, Pittsburgh, PA, Estados Unidos. A menos que se indique otra cosa, todos los productos químicos utilizados se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos) y eran de la mayor pureza disponible.
Construcciones de ADN. Fabricación de construcciones de NMT1 y NMT2 marcadas con V5 e His. Se adquirieron vectores de entrada de NMT1 y NMT2 que son compatibles con el sistema de clonación Gateway (Life Technologies, Grand Island, NY, Estados Unidos) de Genecopoeia (Rockville, MD, Estados Unidos). Los genes de NMT1 y NMT2 se incorporaron en el vector de destino pcDNA3.1/nV5 DEST (Life Technologies) utilizando la enzima clonasa LR (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante para generar los plásmidos de NMT marcadas en el extremo N (His-NMT1, His-NMT2, V5-NMT1 y V5-NMT2). Se utilizaron construcciones de NMT marcadas con V5 para la expresión en células de mamífero, mientras que se utilizaron construcciones de His-NMT para la expresión bacteriana. Los productos de clonación se confirmaron mediante secuenciación de ADN (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL, Estados Unidos).
Cultivo celular. El origen de los linfocitos B fue un regalo del Dr. Jim Stone o se obtuvieron de la ATCC. Todos los reactivos del cultivo celular se adquirieron de Invitrogen. Los linfocitos B se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora humidificada y se mantuvieron en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 0,1 mg/ml.
Lisis celular. Las células se lavaron en PBS frío, se lisaron en tampón de SDS-RIPA al 0,1 % [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Igepal CA-630 al 1%, NaDC al 0,5%, MgCh 2 mM e inhibidor de proteasa completo 1x (Roche Diagnostics); pH 8,0] y se agitó durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante de lisados celulares se obtuvo después de una centrifugación a 16000 g durante 15 min a 4 °C.
Inducción de apoptosis. A menos que se indique otra cosa, se indujo apoptosis con estaurosporina 2,5 pM (STS) (Sigma Aldrich, St. Louise, MO, Estados Unidos) y cicloheximida 5 pg/ml (ICN Biochemicals Inc. Aurora, OH, Estados Unidos) para inhibir la traducción de proteínas y mejorar la inducción de la apoptosis.
Incubación con inhibidores de NMT. Tris dibutilbenciniliden acetona paladio (TrisDBA) fue cedido amablemente por el Dr. Arbiser. Las células se incubaron a concentraciones crecientes durante 24 horas con TrisDBA (o DMSO para el control) o durante 24 y 48 horas con DDD85646.
Transfección de linfocitos B. Los linfocitos B se transfectaron utilizando el sistema de transfección Neon® (Life technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante y el protocolo optimizado para la transfección de linfocitos B de Ramos (tensión de pulso 1300 V; amplitud de pulso 20 ms, 2 pulsos y 7,7.106 células/ml) adaptado para puntas de 100 pl. De forma clásica, se extrajeron dos transfecciones para obtener suficientes células vivas para realizar un ensayo de viabilidad.
Ensayo de viabilidad celular. La viabilidad de los linfocitos B y T se midió utilizando el procedimiento de exclusión con azul tripano. Las células se cultivaron en condiciones de confluencia (2 x 106 células/ml máximo) garantizando la apoptosis basal mínima. Después de la incubación con inhibidores de NMT, se incubaron aproximadamente 20000 células (10 pl) con 10 pl de colorante azul tripano TC10™ (Biorad) durante 15 min. La viabilidad celular se cuantificó utilizando el contador celular automático TC10™ (Biorad).
Ensayo de actividad NMT in vitro. El protocolo de ensayo de actividad N-miristoiltransferasa se adaptó de Raju, R. V. y Sharma, R. K. (1999) Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211. [3H] miristoil-CoA se sintetizó de nuevo para cada experimento, como ha descrito previamente Towler, D. y Glaser, L. (1986) Protein fatty acid acylation: enzymatic synthesis of an N-myristoylglycyl peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 2812-2816. En resumen, las células se resuspendieron en tampón de sacarosa 0,25 M (NaH2PO450 mM, pH 7,4) y se sometieron a 2 ciclos de sonicación a nivel 6,0 en un sonicador Branson. La mezcla de reacción está compuesta por 10 |jl de extracto celular (aproximadamente 20 jg de proteínas) incubado en tampón de actividad n Mt (Tris-HCl 0,26 M, EGTA 3,25 mM, EDTA 2,92 mM y 2-mercaptoetanol 29,25 mM, Triton X-100 al 1 %, pH 7,4) y decapéptido miristoilable o no miristoilable correspondiente a la secuencia N-terminal de Bid truncado (0,1 mM disuelto en agua). La reacción se inició mediante la adición de 7,4 j l (“ 10 pMol) de [3H] miristoil-CoA de nueva síntesis (volumen final de la mezcla = 25 jl) y se incubó durante 15 min a 30 °C. La reacción se detiene aplicando puntualmente 15 j l de la mezcla de reacción en un disco de papel de fosfocelulosa P81 (Whatman, Kent, Reino Unido) y se seca durante 30 segundos. Los discos se lavaron (tampón de lavado: tampón de Tris 25 mM, pH 7,4) para eliminar la radioactividad residual ([3H]-miristato y [3H]-miristoil-CoA) mientras que [3H]-miristoil-péptido se retiene en el papel de fosfocelulosa. La radioactividad se cuantificó mediante recuento de centelleo líquido y se convirtió en pMol de péptido miristoilado (Raju, R. V. y Sharma, R. K. (1999) Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211
RT-PCR. La qRT-PCR se realizó con sondas Taqman de NMT1 y NMT2 utilizando una sonda de 18S como control interno. La diferencia en el número de tiempos de ciclo (Act) se calculó restando el tiempo de ciclo (ct) en el que se ve un aumento exponencial de la expresión del control interno de 18S para cada tipo de célula del tiempo de ciclo de NMT, de nuevo en un punto en el que se ve un aumento exponencial de la señal.
Mutación de sitios de escisión de caspasa en V5-NMT mediante mutagénesis dirigida
Los sitios de escisión de caspasa de NMT1 y NMT2 identificados por secuenciación de degradación de Edman (Alphalyse) se mutaron mediante mutagénesis dirigida. Por lo tanto, se utilizaron vectores Gateway V5-NMT1 y V5-NMT2 previamente clonados para mutar los sitios de escisión de caspasa identificados. Por tanto, el resto Asp-72 de V5-NMT1 y Asp-25, Asp-67 y ambos restos Asp-25,67 (doble mutante) de V5-NMT2 se mutaron usando el equipo de mutagénesis dirigida Quickchange® (Agilent Technologies) según las instrucciones del fabricante.
En resumen, se realizó mutagénesis dirigida utilizando de 5 a 50 ng de ADNbc (vector), 5 j l de tampón de reacción 10x, 125 ng de cebadores disueltos en agua sin nucleasas y se llevó hasta un volumen de reacción final de 50 j l con agua sin nucleasas. Se añadieron 2,5 U de ADN polimerasa PfuTurbo (Agilent Technologies) a la mezcla antes de iniciar la reacción, que se realizó durante 18 ciclos en el termociclador Eppendorf Mastercycler 1. Posteriormente, el ADNbc parental se digirió añadiendo 10 U de enzima de restricción Dpn I a cada reacción e incubando durante 1 h a 37 °C. Adicionalmente, los cebadores para la mutagénesis dirigida se diseñaron utilizando el programa PrimerX (http://www.bioinformatics.org/primerx/) (enumerado en la tabla 2.6). Cabe destacar que los restos de aspartato (D) de los sitios de escisión de caspasa se mutaron a restos de glutamato (E) para generar los siguientes vectores; V5-NMT1 (D72E), V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E) y V5-NMT2 (D25,67E). Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación automática de ADN (Eurofins MWG Operon).
Generación de vectores NMT truncados, escindidos por caspasa, marcados con His
Los siguientes NMT truncados, escindidos por caspasa se generaron mediante clonación molecular; His-73NMT1, His-26NMT2 e His-68NMT2. Las secuencias de ADN truncadas se clonaron en el vector pET-19b (Novagen®), que tiene una secuencia de marcador de hexahistidina (His) N terminal.
Se utilizaron vectores Gateway previamente clonados, GFP-NMT1 y GFP-NMT2 como moldes para estas reacciones de PCR. Se realizaron reacciones de PCR utilizando la ADN polimerasa Platinum Pfx® (Life Technologies) y las reacciones de PCR se configuraron según las directrices del fabricante. Cada reacción de PCR se preparó de la siguiente manera; 200 ng de molde de ADN, 5 j l de tampón de amplificación Pfx 10X, 5 j l de solución potenciadora de PCR 10X, MgSO4 1 mM, mezcla de dNTP 0,3 mM, 0,5 jM cada uno de los cebadores directos e inversos (enumerados en la tabla 2.6), 1 U de ADN polimerasa Platinum Pfx® y agua sin nucleasas hasta 50 jl. La reacción se configuró en el termociclador Eppendorf Mastercycler 1 según las directrices proporcionadas en el equipo de ADN polimerasa Platinum Pfx® y las reacciones se realizaron en 30 ciclos.
Inhibición de caspasas
Las células se pretrataron con 10 jM de inhibidores de caspasa establecidos adquiridos de EMD Chemicals, 1 hora antes de la inducción de la apoptosis. Los inhibidores de caspasa utilizados fueron el inhibidor de caspasa general (z-VAD-FMK), caspasa-3 (z-DeVd-FMK), caspasa-8 (z-IETD-FMK), caspasa-9 (z-LEHD-FMK) y control negativo (z-FA-FMK). Las células de control se trataron con DMs O (1:1000).
Tratamiento de células con MG-132
Se sembraron células IM9, KMH2, BL2 y Ramos (3 x 106 células por pocillo en una placa de 6 pocillos) y se trataron con MG-132 10 jM durante 5 horas. Se añadió la misma cantidad de DMSO a las muestras de control. A continuación, las células se lisaron y se sometieron a análisis de SDS-PAGE/transferencia de Western.
Tratamiento de células con ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA)
Se sembraron células IM9, BL2 y Ramos en placas a 3x 106 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con ácido hidroxámico de suberoilanilida 1 pM (SAHA), que es un inhibidor reversible de las histona desacetilasas de clase I y clase II (HDAC), durante 24 horas. Se añadió la misma cantidad de DMSO a las células como control. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de SDS-PAGE/transferencia de Western.
Inducción de apoptosis
Se usaron 150 o 300 ng/ml de anticuerpo de ratón anti-Fas para estimular la apoptosis a través de la ruta extrínseca y se usó estaurosporina (STS) 2,5 pM para estimular la apoptosis a través de la ruta intrínseca. Cuando esté indicado, se usó cicloheximida (5 pg/ml) para inhibir la traducción de proteínas y promover adicionalmente la muerte celular.
Tratamiento de células con el inhibidor de NMT, ácido 2-hidroximirístico (HMA)
El HMA se saponificó y se conjugó con albúmina de suero bovino (BSA) antes de la adición a las células para facilitar su captación celular como se ha descrito anteriormente (Yap y col., 2010). En resumen, Se incubó HMA con un exceso molar del 20 % de hidróxido de potasio (KOH) a 65 °C durante 15 min. Posteriormente, se preparó una solución 20X disolviendo el HMA saponificado con KOH en medio RPMI sin suero que contenía BSA sin ácidos grasos al 20 % a 37 °C, seguido de una incubación adicional de 15 min a 37 °C. Ya que se utilizó miristato de sodio como control, también se incubó en medio RPMI sin suero que contenía BSA sin ácidos grasos al 20% a 37 °C antes de la adición a las células. Posteriormente, se incubaron linfocitos T Jurkat (1 x 107 células) con HMA 1 mM o miristato de sodio 1 mM conjugado con BSA sin ácidos grasos (concentración final en cultivo celular al 1 %) durante 1 h a 37 °C en medio RPMI (sin FBS, complementos o antibióticos). Después de la incubación, se indujo la apoptosis usando anti-Fas (150 ng/ml) o STS (2,5 pM) con cicloheximida (5 pg/ml) o vehículo solo (DMSO). Las muestras se recogieron cada 2 h durante un periodo de 8 h, se lavaron con PBS frío y se lisaron con 0,3 ml de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1 % y se sometieron a 2 ciclos de sonicación durante 15 segundos a una salida de 5,5-6,5 en un Branson Sonifier y se colocaron en hielo durante 2 minutos entre cada ciclo.
Tratamiento de líneas celulares linfocíticas con el inhibidor de NMT, Tris DBA
Se cultivaron 2x106 células (CEM, L0, BL2 y Ramos) en placas de 6 pocillos y se incubaron con cantidades crecientes (0, 1, 2 y 5 pg/ml) de Tris (dibencilidenacetona) dipaladio (Tris DBA) (Bhandarkar y col., 2008). La viabilidad de las células tratadas con Tris DBA se midió con un ensayo de exclusión con azul tripano (Hudson, 1976).
Tratamiento de líneas celulares linfocíticas con los inhibidores de NMT, DDD85646 y DDD73226
Se sembraron 1 x 105 células [KMH2 (linfoma de Hodgkin), IM9 (linfocito B inmortalizado con VEB "normal"), BL2, Ramos] (100 pl/pocillo) en placas de 96 pocillos y se trataron con cantidades crecientes del inhibidor de NMT basado en pirazol sulfonamida DDD85646 [Peso molecular (PM) 495,43] (Frearson y col., 2010) y un análogo basado en pirazol sulfonamida menos potente DDD73228 (PM = 362,5) durante 24, 48 y 72 horas. Los fármacos se disolvieron en DMSO para preparar soluciones de reserva 100X para cada concentración probada, de modo que el volumen final de DMSO en cada pocillo fue del 1 %. La viabilidad de las células tratadas con estos inhibidores se midió con un ensayo de exclusión con azul tripano (Hudson, 1976).
Tratamiento de líneas celulares linfocíticas con el inhibidor de NMT, DDD86481
Se sembraron 1 x 105 células [KMH2 (linfoma de Hodgkin), IM9 (linfocito B inmortalizado con VEB "normal"), BL2, Ramos] (100 pl/pocillo) en placas de 96 pocillos y se trataron con cantidades crecientes de DDD86481 [PM 610,5]. Los fármacos se disolvieron en DMSO para preparar soluciones de reserva 100X para cada concentración probada, de modo que el volumen final de DMSO en cada pocillo fue del 1 %. Se utilizó el ensayo de MTS [(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio)] para medir la citotoxicidad del fármaco (Cory y col., 1991).
Lisis celular
Normalmente, las células se lavaron en PBS frío, se recogieron, se lisaron en tampón de SDS-RIPA al 0,1 % o tampón de SDS-RIPA-HEPES al 0,1 % (cuando las células se marcaron con ácidos grasos alquínicos) que se complementó con inhibidor de proteasa completo 1X. La suspensión celular se agitó durante 15 min a 4°C. A continuación, se centrifugaron los lisados celulares a 16000 g durante 10 min a 4 °C y se recogió el sobrenadante posnuclear. Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando el equipo de ensayo de proteínas de ácido bicinconónico (BCA) PierceTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
Lisis de muestras tisulares de linfoma
Los tejidos del linfoma humano difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) y del linfoma folicular (LF) fueron cedidos amablemente por el Dr. Raymond Lai (Cross Cancer Institute, Alberta, Canadá). Los tejidos tumorales congelados se cortaron en trozos pequeños (~1 mm3) y se mezclaron con SDS-RIPA al 1 % con inhibidor de proteasa completo 1X. Las muestras se homogeneizaron utilizando un homogeneizador pequeño Dounce y a continuación se sometieron a ultrasonidos repetidamente durante 2 min con intervalos de 1 min (en hielo) entre medias con una salida de 6,0 (Branson Sonifier 450) hasta que los tejidos tumorales se disolvieron en el tampón de lisis. A continuación, las muestras se centrifugaron a 16000 g durante 10 min a 4 °C y se recogió el sobrenadante posnuclear para análisis de transferencia de Western.
Transferencia de Western utilizando el explorador Odyssey
Este procedimiento solo se utilizó para la transferencia de caspasa-3 escindida proporcionada, todas las demás transferencias de Western se realizaron utilizando el procedimiento convencional. Después de la electroforesis, los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon en NFM al 5 % en PBS con Tween 20 al 0,1 % (PBS-T) durante 1 hora. El anticuerpo primario (de conejo anti-caspasa-3 escindida; Cell Signaling) también se diluyó a 1:2000 en NFM al 5 % en PBS-T, se añadió a la membrana y se incubó durante 24 h. A continuación, las membranas se sometieron a 6 ciclos de lavado, que duraron 5 min cada uno; 2 lavados en PBS, 2 lavados en PBS-T y finalmente 2 lavados en PBS. El anticuerpo secundario (Alex Fluor 680 de cabra-anti-conejo; Life Technologies) se añadió después de diluir en PBS-T (1:5000) y las transferencias se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1 h y se sometieron al mismo ciclo de lavado 6X con PBS y PBS-T que antes. Las transferencias se exploraron en el sistema de captura imágenes de fluorescencia Odyssey® de LI-COR Inc. a una resolución de exploración de 84 pm (intensidad: 5 a 7) en el canal 700 (para conejo).
Fraccionamiento subcelular
Las células HeLa se cultivaron hasta la confluencia en placas de 150 mm y se indujo su apoptosis con anti-Fas (300 ng/ml) (extrínseco) o STS (intrínseco) durante un periodo de 5 h. A continuación, las células se marcaron metabólicamente con alquino-C14 (descrito en detalle en la sección siguiente) (Yap y col., 2010) y se sometieron a lisis hipotónica.
En resumen, las células se lavaron con tampón PBS frío, se rasparon de las placas utilizando un levantador de células y se recogieron. A continuación, las muestras se centrifugaron a 2000 g durante 5 min, se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 600 pl de tampón hipotónico que provoca que las células se hinchen (tampón de resuspensión de Mg) y se incubaron en hielo durante 20 min. La suspensión celular se transfirió a un homogeneizador Dounce y se homogeneizó con 45 golpes utilizando el mortero ajustado. En consecuencia, se añadieron 400 pl de tampón de homogeneización (HB) 2,5X sin EDTA al homogeneizado y las células se homogeneizaron con 15 golpes en el homogeneizador Dounce utilizando el mortero suelto. El homogeneizado se centrifugó después a 1000 g durante 5 min y se recogió el sobrenadante posnuclear (PNS). A continuación, se guardaron 200 pl de PNS y el resto (~750 pl) se centrifugó a 100000 g durante 45 min en un rotor Beckman TLA 120.2, lo que dio lugar a una fracción citosólica (S100) y un sedimento de membrana ligera (P100).
El sedimento de P100 se lavó una vez con HB 1X y las fracciones de P100 se ajustaron al volumen de la fracción S100 afín utilizando HB 1X. Después de esto, el sobrenadante posnuclear (PNS) resultante, las fracciones citosólicas (S100) y las fracciones de membrana (P100) se ajustaron para contener 1 % de SDS. En consecuencia, el mismo volumen de fracción se sometió a análisis de transferencia de Western y los niveles de proteína se cuantificaron utilizando el programa informático Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Marcaje metabólico de células utilizando ácido u-alquinil mirístico bio-ortogonal y química clic
Marcaje metabólico de células utilizando ácido w-alquinil mirístico
Las células se marcaron con ácido w-alquinil mirístico de 100 a 25 pM 30 min antes de recoger las células y se lisaron en tampón de SDS-RIPA-HEPES al 0,1 %. La proteína (50 - 30 pg) de los lisados celulares resultantes se hizo reaccionar con azido-biotina 100 pM utilizando química clic y se procesó como se ha descrito anteriormente (Yap y col., 2010). En resumen, las células se privaron de ácidos grasos mediante incubación en medios (RPMI o DMEM) que se complementaron con FBS tratado con carbón vegetal revestido con dextrano al 5 % (DCC-FBS) durante 1 h antes del marcaje. A continuación, se disolvió ácido w-alquinil-mirístico en DMSO para generar soluciones de reserva 25 o 100 mM. Normalmente, la captación celular de ácido w-alquinil mirístico normalmente mejoró con la saponificación y conjugación con BSA. Por lo tanto, antes del marcaje, se saponificó ácido w-alquinil mirístico con un exceso molar de hidróxido de potasio del 20 % a 65 °C durante 15 min. A continuación, se añadió medio de cultivo sin suero (precalentado) que contenía BSA sin ácidos grasos al 20 % a 37 °C al ácido w-alquinil mirístico saponificado y se incubó durante 15 min más a 37 °C.
Posteriormente, las células privadas de ácidos grasos se lavaron una vez con PBS caliente y se incubaron en RPMI o DMEM nuevo sin ningún complemento. A continuación, se añadió a las células el volumen adecuado de conjugado de ácido graso-BSA 20X en medio sin suero, para garantizar que la concentración final de BSA fuera del 1 % y el ácido h-alquinil mirístico estuviera a la concentración indicada (25 pM o 100 pM) para cada experimento respectivo. Se utilizaron DMSO o ácidos grasos sin marcar conjugados con BSA como controles para los experimentos realizados. Las células se marcaron con ácido w-alquinil mirístico durante 30 min a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % antes de la recogida. Las células se recogieron en tampón SDS-RIPA-HEPES al 0,1 % que se complementó con inhibidor de proteasa completo 1X (sin EDTA).
Química clic
Después de marcar las células con ácido w-alquinil mirístico, los lisados resultantes se sometieron a química clic con azido-biotina para permitir la detección de las proteínas miristoiladas por ECL como se ha descrito anteriormente (Yap y col., 2010). Normalmente, los lisados celulares (30-50 |jg de proteína) se ajustaron para contener SDS al 1 % y se incubaron con Tris-(benciltriazolilmetil)amina (TBTA) 100 jM, CuSO4 1 mM, Tris-carboxietilfosfina (TCEP) 1 mM y azido-biotina 100 jM a 37 °C durante 30 min en oscuridad, para que se produzca la reacción de clic. A continuación, se añadieron 10 volúmenes de acetona helada para detener la reacción de clic y las proteínas se precipitaron a -20 °C durante una noche. Posteriormente, las proteínas precipitadas con acetona se centrifugaron a 16000 g durante 10 min, se resuspendieron en tampón de muestra de SDS-PAGE 1X con DTT 20 mM. A continuación, las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 min y se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF para análisis de transferencia de Western.
Tratamiento de membranas de PVDF con Tris-HCl neutro o KOH
Se cargaron muestras de proteínas en geles de SDS-PAGE por duplicado para los experimentos en los que se trataron membranas de PVDF con KOH o Tris-HCl neutro. Después de la electroforesis, las membranas de PVDF tratadas con KOH se incubaron en 100 ml de KOH 0,1 N en metanol [KOH 1 N en H2O: metanol 1:9 (v/v)], mientras que la otra se incubó en Tris-HCl 0,1 N pH 7,0 en metanol [Tris-HCl 1 N, pH 7,0:metanol 1:9 (v/v)] a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave. Posteriormente, las membranas tratadas se lavaron exhaustivamente con PBS, se exploraron con estreptavidina-HRP o Neutravidin-HRP y se detectaron con ECL.
Ensayo de actividad NMT radioactiva en células que experimentan apoptosis
La actividad NMT se midió adaptando un protocolo desarrollado por el laboratorio de Sharma (King y Sharma, 1991; Raju y Sharma, 1999). Una solución de reserva de [3H]-miristoil-CoA se preparó nuevamente y se sintetizó como se ha descrito previamente (Towler y Glaser, 1986). Para preparar una solución de reserva de 200 j l de [3H]-miristoil-CoA, se combinaron 97 j l de tampón de generación de miristoil-CoA con 20 □l de ATP 50 mM, 10 □□□l de LiCoA 20 mM, 60 j l de acil-CoA sintetasa de Pseudomonas y 13 j l de ácido [9,10 - 3H]-mirístico. La solución se mezcló suavemente y se incubó a 37 °C durante 30 min.
Para este ensayo, se indujo apoptosis en células COS-7 transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican V5-NMT1 y V5-NMT2 con STS (2,5 jM ) y cicloheximida (5 jg/ml) o no, y se recogieron en los puntos temporales de 0, 1, 2, 4 y 8 h. Las células se sometieron a ultrasonidos utilizando un Branson sonifier 450 y se utilizaron ~20 jg de lisado (lisado en NaH2PO450 mM pH 7,4, tampón de sacarosa 0,25 M) para cada reacción. Para cada reacción de ensayo de NMT, se añadieron 3,85 j l de tampón de ensayo de NmT, 1,25 j l de Triton X-100 al 20% y 2,5 j l (0,1 mM) de decapéptido miristoilable (BID_G: GNRSSHSRlG) o no miristoilable (BID_A: ANRSSHSRLG) (adquirido de Peptide 2.0 Inc.) correspondiente a la secuencia N-terminal de ct-Bid (solución de reserva 1 mM en etanol) a un tubo de microcentrífuga y se mantuvo en hielo antes del inicio de la reacción. Al comienzo de la reacción, se añadieron 7,4 j l (10 pMol) de [3H] miristoil-CoA recién sintetizado a cada tubo de microcentrífuga que contenía la mezcla de ensayo de NMT a intervalos de 15 segundos y se incubaron reacciones de 25 j l durante 15 min a 30 °C. La reacción se terminó aplicando puntualmente 15 j l de la mezcla de reacción sobre un disco de papel de fosfocelulosa P81 (Whatman) a intervalos de 15 segundos y se secó con un secador de pelo durante 30 segundos. A continuación, los discos de papel de fosfocelulosa p81 se transfirieron a la unidad de lavado y se lavaron 3 veces, 30 min cada uno, con tampón de lavado de ensayo de NMT durante un periodo total de 90 min. Posteriormente, la radioactividad restante en la fosfocelulosa (que corresponde al péptido miristoilado) se cuantificó en 5 ml de mezcla de centelleo líquida utilizando un contador de centelleo Beckman Coulter LS6500. La actividad NMT se calculó como fmol/min/jg de proteína.
Uso de un ensayo radioactivo para medir la actividad NMT en NMT marcadas con His purificadas
La actividad NMT de NMT de longitud completa y truncadas marcadas con His se midió usando el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en este ensayo solo se utilizó 1 jg de proteína purificada (el volumen se llevó hasta 10 j l en tampón de ensayo de NMT).
Ensayo de escisión de NMT in vitro
El ensayo de escisión de NMT in vitro se realizó incubando 10 □g de His-NMT1 e His-NMT2 purificados con 1 jg de caspasa-3 u 8 activa humana recombinante en tampón de ensayo de escisión de caspasa en reacciones de 100 j l durante 1 hora a 37 °C. La reacción se terminó con la adición de inhibidor de caspasa general 10 jM z-VAD-FMK y posteriormente se añadió tampón de carga de muestra 5X. Las muestras que habían reaccionado se separaron en un gel de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las bandas se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie y los fragmentos de escisión se escindieron de la membrana y se enviaron para degradación de Edman a Alphalyse en Palo Alto, CA.
Purificación de proteínas de His-NMT recombinantes
Se transformaron células competentes Lemo21(DE3) pLysS (New England Biolabs) con vectores His-NMT1 e His-NMT2 según el protocolo del fabricante. Se prepararon proteínas NMT1 y NMT2 de la siguiente manera: se cultivó un cultivo iniciador de 3 ml en caldo LB (triptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl al 0,5 %, 100 pg/ml de ampicilina y 34 pg/ml de cloranfenicol) durante 4 h a 37 °C, agitando al mismo tiempo a 225 rpm. El cultivo completo se utilizó para inocular un cultivo de 50 ml que se cultivó a 37 °C durante 16 h. A continuación, las células bacterianas se sedimentaron mediante centrifugación a 6000 x g durante 10min a temperatura ambiente. El sedimento bacteriano se resuspendió en 10 ml de LB y se utilizaron 5 ml de la resuspensión para inocular 500 ml de LB que se incubó a 37 °C con agitación vigorosa (225 rpm) hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5-0,6.
A continuación, se indujo la expresión proteica mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM a 30 °C con agitación vigorosa (225 rpm) durante 4 h. La suspensión se centrifugó a 6000 x g a 4 °C durante 20 min y el sedimento bacteriano se congeló durante una noche. Posteriormente, el sedimento bacteriano descongelado se resuspendió en 25 ml de tampón de lisis bacteriano complementado con inhibidor de proteasa completo (CPI) de Roche y se incubó en hielo durante 30 min. A continuación, las muestras se sometieron a ultrasonidos 3 veces durante 1 min con intervalos de 1 min en el medio a una salida de 5,0 (Branson Sonfier 450) y se incubaron a 37 °C durante 30 min antes de la centrifugación a 15000 x g durante 1 h a 4 °C.
Por otra parte, se empaquetaron perlas de agarosa Ni-NTA (resina His-Pure Ni-NTA de Thermo Fisher Scientific) en columnas según las instrucciones del fabricante y se lavaron con tampón de columna tres veces. El sobrenadante transparente obtenido de la centrifugación anterior se cargó después en la columna y se incubó con agitación suave a 4 °C durante 1 h. A continuación, la muestra se eluyó de la columna mediante flujo por gravedad y la columna se lavó dos veces con 5 ml de tampón de lavado (tampón de columna con imidazol 20 mM, pH 8,0). A continuación, se utilizaron 2 x 5 ml de tampón de elución 1 (tampón de columna con imidazol 75 mM, pH 8,0) para eluir las dos primeras fracciones y se utilizaron 2 x 5 ml de tampón de elución 2 (tampón de columna con imidazol 150 mM, pH 8,0) para eluir las siguientes dos fracciones. La última fracción se eluyó con tampón de elución 3 (tampón de columna con imidazol 250 mM, pH 8,0). Finalmente, se añadió glicerol al 20 % a cada una de las fracciones recogidas antes de congelar a -80 °C. Se recogieron muestras de cada etapa del procedimiento de purificación de proteínas, se procesaron en un gel de SDS-PAGE al 12,5 % y se tiñeron con azul de Coomassie para determinar qué fracción o fracciones tenían la mayor concentración de proteína.
Ya que las muestras de las primeras cuatro eluciones tenían la mayor concentración de proteínas, estas se combinaron y dializaron para eliminar cualquier imidazol presente. Por tanto, las muestras agrupadas se cargaron en un tubo de diálisis Spectra/Por 2 (Spectrum Laboratories) con un punto de corte de peso molecular (PCPM) de 12 -14 kDa para eliminar cualquier fragmento de proteína degradado pequeño. A continuación, las muestras de proteína se dializaron en 4 l de tampón de diálisis enfriado durante 2 h a 4 °C con agitación suave, seguido de diálisis durante una noche con el mismo tampón a 4 °C con otros 4 l de tampón enfriado, nuevo. Las muestras de proteína dializadas se concentraron mediante centrifugación en un filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con PCPM 30 kDa (Millipore) a 5000 g, 4 °C hasta que se alcanzaron los volúmenes deseados.
qRT-PCR de líneas celulares de linfoma de linfocitos B
Se aisló ARN de células IM9, KMH2, Ramos y BL2 utilizando reactivo TRIzol® según protocolos del fabricante. A continuación, se utilizó el equipo de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con un esquema de cebador aleatorio de Applied Biosciences para sintetizar ADNc a partir del ARN aislado según las instrucciones del fabricante. Se prepararon reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT PCR) utilizando mezcla maestra universal TaqMan® II y NMT1, NMT2 y 18 sondas Taqman® adquiridas en Life Technologies (Carlsbad, CA) y se prepararon tres repeticiones de cada reacción según las directrices del proveedor. La qRT PCR se realizó utilizando un termociclador Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) y los resultados se analizaron utilizando el programa informático Realplex (Eppendorf).
Ensayo de exclusión de azul tripano
La viabilidad de las células tratadas con Tris DBA, DDD73228 y DDD85646 se midieron incubando células con colorante azul tripano TC10TM (Biorad) (Hudson, 1976), según las instrucciones del fabricante. A continuación, se cuantificó la viabilidad celular utilizando el contador celular automático TC10TM (Biorad).
Ensayo de MTS [(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio)]
La viabilidad de las células tratadas con DDD86481 se midió utilizando el ensayo de proliferación celular no radiactiva CellTiter 96 AQueous (MTS) (Cory y col., 1991) de Promega según las instrucciones del fabricante.
Inmunohistoquímica
Los tumores de linfoma de linfocitos B se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina y se cortaron en un micrótomo al grosor deseado (~5 micrómetros o pm) y se fijaron en un portaobjetos con carga positiva Superfrost® plus (Fisher Scientific). Antes de teñir, los portaobjetos que contenían tejidos tumorales se desparafinaron sumergiéndolos en xileno 3 veces durante 10 minutos cada uno, una serie de lavados en etanol [20 inmersiones en etanol al 100 % (repetir 4 veces), 20 inmersiones en etanol al 80 % y 20 inmersiones en etanol al 50 %] y un lavado final en agua fría corriente durante 10 min.
Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se cargaron en un soporte de portaobjetos y se colocaron en una olla a presión de microondas Nordicware® y se le añadieron 800 ml de tampón de citrato 10 mM pH 6,0. La olla a presión se cerró estrechamente, se colocó en un microondas y se calentó con microondas a temperatura alta durante 20 min. A continuación, los portaobjetos se lavaron en agua corriente fría durante 10 min. Se realizó bloqueo de peroxidasa sumergiendo los portaobjetos en H2O2 al 3 % en metanol durante 10 min y lavando con agua corriente tibia durante 10 min antes de lavar en PBS durante 3 min.
A continuación, se eliminó el exceso de PBS y se dibujó un círculo hidrófobo alrededor de la muestra con una pluma PAP (Sigma-Aldrich). Se diluyeron anticuerpo de conejo anti-NMT1 (Proteintech) o de conejo anti-NMT2 (Origene) con tampón diluyente de anticuerpos Dako (Dako, Agilent Technologies) a una dilución 1:50 y se añadieron con una pipeta Pasteur (~400 □l por portaobjetos) y se incubaron en una cámara de humedad durante una noche a 4 °C. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron en PBS dos veces durante 5 min cada uno y se añadieron ~4 gotas de polímero marcado con DAKO EnVision+System-HRP (anti-conejo) (Dako, Agilent Technologies) a cada portaobjetos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron de nuevo en PBS dos veces durante 5 min cada uno, se añadieron 4 gotas de DAB (diaminobencidina) líquida sustrato cromógeno (preparado según las instrucciones del fabricante; Dako, Agilent Technologies), se desarrollaron durante 5 min y se aclararon con agua fría durante 10 min.
A continuación, los portaobjetos se empaparon en CuSO4 al 1 % durante 5 min, se aclararon brevemente con agua fría corriente, se contratiñeron con hematoxilina durante 60 segundos y se aclararon con agua fría corriente hasta que el agua salió transparente. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en carbonato de litio 3 veces y se aclararon brevemente con agua corriente. A continuación, se deshidrataron los portaobjetos en una serie de etapas; 20 inmersiones en etanol al 50 %, 20 inmersiones en etanol al 80 % y 20 inmersiones en etanol al 100 % (repetir 4 veces) y finalmente en xileno (3 veces durante 10 min cada una). A continuación, se añadieron cubreobjetos a los portaobjetos y se realizó microscopia de las muestras tumorales utilizando un microscopio Nikon eclipse 80i. Las imágenes se crearon utilizando una cámara científica QImaging (Qimaging).
Ejemplo 1
La figura 1 representa el análisis de expresión de NMT1 y NMT2 en células normales y diversos linfomas de linfocitos B y leucemias de linfocitos T. Esta figura muestra la ausencia casi completa de expresión de NMT2 en líneas celulares de linfoma B (BL-2, Ramos), que expresan solo NMT1 en comparación con linfocitos B normales (linfocitos B humanos transformados con VEB, L0) y líneas de linfocitos T leucémicos humanos (Jurkat, MOLT-4, CEM).
Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, es probable que las células que expresan solo una isoenzima NMT, por ejemplo, células de linfoma de Burkitt que muestran la ausencia casi completa de NMT2, tengan perfiles de proteínas miristoiladas alterados.
Una muestra que tiene una cantidad reducida de proteína miristoilada en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT. Dicho cáncer deficiente en NMT es adecuado para su tratamiento con un inhibidor o NMT1.
Ejemplo 2
La figura 2 representa la sensibilidad de diversos linfomas de linfocitos B y leucemias de linfocitos T a los inhibidores de NMT tris-dibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA). Se incubaron diversos linfocitos B y T durante 24 h con una concentración creciente de Tris DBA. La viabilidad celular se midió utilizando el procedimiento de exclusión con azul tripano y se ajustó al 100% para el control. Las curvas de supervivencia celular medidas por exclusión con azul tripano muestran que los linfomas de linfocitos B son más sensibles al inhibidor de NMT tris-dibencilidenacetonadipaladio (Tris-DBA).
Ejemplo 3
La figura 3 representa la inhibición de N-miristoiltransferasa (NMT) por tris-dibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA). La actividad NMT se ensayó utilizando un ensayo de miristoilación de péptidos con NMT1 y NMT2 recombinantes purificadas. La actividad NMT se calculó a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y col. 1991, Anal Biochem.).
Esta figura muestra que el tris-dibencilidenacetona-dipaladio (Tris-DBA) inhibe la NMT in vitro utilizando enzimas NMT recombinantes purificadas.
Ejemplo 4
La figura 4 representa los resultados de inmunotransferencias en las que se exploraron líneas celulares de linterna con anticuerpos contra NMT1 (panel A) y NMT 2 (panel B). La leyenda de la figura 4 corresponde a lo siguiente: IM9: linfoblasto B; BL2: linterna de Burkitt; CEM: leucemia de linfocitos T; Karpas 299: linterna de linfocitos T; Sup-M2: LACG; LACG UCONN (LACG: linterna anaplásico de células grandes); DAUDI: linterna de Burkitt; Ramos: linterna de Burkitt BJAB: linterna de Burkitt; HD-MYZ: linterna de Hodgkin; KM-H2: linterna de Hodgkin; L428: linterna de Hodgkin; Jurkat: leucemia de linfocitos T.
Ejemplo 5
La figura 5 representa la eficacia de los inhibidores de NMT en la línea celular Ramos de linterna de Burkitt en comparación con la línea celular linfocítica B normal inmortalizada (IM9) después de 48 horas, a diferentes concentraciones.
Ejemplo 6
En este ejemplo, la transfección de células de linterna B de Ramos (que, como se muestra en el presente documento, expresan NMT1) con pcDNA3.1-V5-NMT2 aumentó la supervivencia a TrisDBA (5 ug/ml) 2,5 veces frente a células de control transfectadas con el vector plasmídico vacío. En la figura 6, se transfectaron 20X106 células de linfoma B de Ramos con 32 |jg de ADN (pcDNA3.1-V5-vacío o pcDNA3.1-V5-NMT2) utilizando el sistema de transfección Neon (Invitrogen) siguiendo el protocolo recomendado para la línea celular Ramos (1350 voltios, 30 ms). Las células transfectadas se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm para eliminar células muertas y residuos celulares. Se permitió que las células en el sobrenadante se recuperaran durante 6 horas en RPMI completo. Después de un lavado con PBS, las células se resuspendieron y se cultivaron en RPMI que contenía TrisDBA (5 ug/ml) durante 24 horas y después se contaron utilizando el procedimiento de exclusión con azul tripano (panel A). Las células se lisaron y se realizó transferencia de western (ECL) para confirmar la expresión de NMT2 con anticuerpos contra NMT2 y GAPDH para el control de carga (panel B).
Ejemplo 7
En este ejemplo, la qRT-PCR se realizó con sondas Taqman de NMT1 y NMT2 utilizando una sonda de 18S como control interno. La diferencia en el número de tiempos de ciclo (Act) se calculó restando el tiempo de ciclo (ct) en el que se ve un aumento exponencial de la expresión del control interno de 18S para cada tipo de célula del tiempo de ciclo de NMT, de nuevo en un punto en el que se ve un aumento exponencial de la señal. Como se muestra en la tabla 1, a continuación, la relación de expresión de NMT2 con respecto a NMT1 disminuye (hasta 60 veces) en líneas celulares de linfoma B. Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, estos resultados pueden sugerir que una reducción en el ARNm que codifica NMT2 puede ser responsable de la reducción de los niveles de proteína NMT 2 evaluados por transferencia de Western.
Tabla 1 Análisis de la expresión de ARNm de NMT mediante qRT-PCR
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 8
En este ejemplo, en la figura 7, se muestran diferencias en los niveles de proteína NMT2 presentes en diversas líneas celulares linfocíticas y tumores de linfoma sólido. (A) Los niveles de NMT1 y NMT2 se evalúan mediante transferencia de Western en diversos tipos de linfoma sólido humano (linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) y lisados tumorales de linfoma folicular (LF). Las NMT se detectaron mediante transferencia de Western utilizando las mismas concentraciones de anticuerpos para ambos paneles mostrados: de conejo anti-NMT1 (1:2500), monoclonal de ratón anti-NMT2 (1:2500). Se muestra que numerosas muestras tumorales de cada tipo quedan por debajo del promedio del nivel de expresión de NMT2 (0,392 /_ 0,30).
En el panel A, se muestra que las líneas celulares de linfoma de Burkitt BL-2, Daudi, Ramos y BJAB están desprovistas de NMT2.
En el panel B, se muestra que 4 de 5 LDLBG y 1 de 6 lisados de tumores humanos LF tienen una reducción notable en NMT2.
Ejemplo 9
En este ejemplo, en la figura 8, paneles A y B, las diferencias en los niveles de proteína NMT2 presentes en diversos tumores de linfoma sólido se determinaron mediante inmunohistoquímica:
Los tumores de linfoma de linfocitos B se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina y se cortaron en un micrótomo al grosor deseado (~5 micrómetros o pm) y se fijaron en un portaobjetos con carga positiva Superfrost® plus (Fisher Scientific). Antes de teñir, los portaobjetos que contenían tejidos tumorales se desparafinaron sumergiéndolos en xileno 3 veces durante 10 minutos cada uno, una serie de lavados en etanol [20 inmersiones en etanol al 100 % (repetir 4 veces), 20 inmersiones en etanol al 80 % y 20 inmersiones en etanol al 50 %] y un lavado final en agua fría corriente durante 10 min.
Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se cargaron en un soporte de portaobjetos y se colocaron en una olla a presión de microondas Nordicware® y se le añadieron 800 ml de tampón de citrato 10 mM pH 6,0. La olla a presión se cerró estrechamente, se colocó en un microondas y se calentó con microondas a temperatura alta durante 20 min. A continuación, los portaobjetos se lavaron en agua corriente fría durante 10 min. Se realizó bloqueo de peroxidasa sumergiendo los portaobjetos en H2O2 al 3% en metanol durante 10 min y lavando con agua corriente tibia durante 10 min antes de lavar en PBS durante 3 min.
A continuación, se eliminó el exceso de PBS y se dibujó un círculo hidrófobo alrededor de la muestra con una pluma PAP (Sigma-Aldrich). Se diluyeron anticuerpo de conejo anti-NMT1 (Proteintech) o de conejo anti-NMT2 (Origene) con tampón diluyente de anticuerpos Dako (Dako, Agilent Technologies) a una dilución 1:50 y se añadieron con una pipeta Pasteur (~400 pl por portaobjetos) y se incubaron en una cámara de humedad durante una noche a 4 °C. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron en PBS dos veces durante 5 min cada uno y se añadieron ~4 gotas de polímero marcado con DAKO EnVision+System-HRP (anti-conejo) (Dako, Agilent Technologies) a cada portaobjetos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron de nuevo en PBS dos veces durante 5 min cada uno, se añadieron 4 gotas de DAB (diaminobencidina) líquida sustrato cromógeno (preparado según las instrucciones del fabricante; Dako, Agilent Technologies), se desarrollaron durante 5 min y se aclararon con agua fría durante 10 min.
A continuación, los portaobjetos se empaparon en CuSO4 al 1 % durante 5 min, se aclararon brevemente con agua fría corriente, se contratiñeron con hematoxilina durante 60 segundos y se aclararon con agua fría corriente hasta que el agua salió transparente. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en carbonato de litio 3 veces y se aclararon brevemente con agua corriente. A continuación, se deshidrataron los portaobjetos en una serie de etapas; 20 inmersiones en etanol al 50 %, 20 inmersiones en etanol al 80 % y 20 inmersiones en etanol al 100 % (repetir 4 veces) y finalmente en xileno (3 veces durante 10 min cada una). A continuación, se añadieron cubreobjetos a los portaobjetos y se realizó microscopia de las muestras tumorales utilizando un microscopio Nikon eclipse 80i. Las imágenes se crearon utilizando una cámara científica Qlmaging (Qimaging).
tinción inmunohistoquímica de NMT de ganglios linfáticos normales, linfoma de Burkitt (LB) y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG o LLG). A) Tinción de NMT1: Tanto los ganglios linfáticos normales como cada uno de los tres casos independientes de linfoma de Burkitt sin tratar (LB1-3) y LDLBG (LLG1-3) se tiñen de manera uniforme y fuertemente positiva (color del producto de reacción de peroxidasa marrón [mostrado como gris oscuro]) para la proteína NMT1. No se observaron diferencias. El control negativo se obtuvo omitiendo el anticuerpo primario. Fila superior: N1, N2 ganglios linfáticos normales, Neg control negativo. Fila media: tres casos de linfoma de Burkitt (LB1-3). Fila inferior: tres casos de LDLBG (LLG1-3). Tanto los ganglios linfáticos normales como el linfoma muestran tinciones fuertes. B) Tinción de NMT2: Ambos ganglios linfáticos normales se tiñen de manera uniforme y fuertemente positiva (color marrón, mostrado como gris oscuro) para la proteína NMT2. En marcado contraste, cada uno de los tres casos independientes de linfoma de Burkitt sin tratar y LDLBG muestra solo una tinción muy débil para NMT2 (mostrada como azul claro o gris claro). El control negativo se obtuvo omitiendo el anticuerpo primario. Fila superior: N1, N2 ganglio linfático normal, Neg control negativo. Fila media: tres linfomas de Burkitt (LB1-3); Fila inferior: tres LDLBG (LLG1-3).
La figura 8 panel C y panel D demuestra que la expresión de NMT1 no aumenta significativamente en líneas celulares que carecen de expresión de NMT2. En el panel C, el log2 (NMT de intensidad de fluorescencia de micromatriz) para NMT1 y NMT2 se representa para todas las líneas celulares de la base de datos CCLE. En el panel D, el log2 (NMT de intensidad de fluorescencia de micromatriz) para NMT1 y NMT2 se representa para las 100 líneas celulares de la base de datos CCLE con el nivel de expresión de NMT2 más bajo.
La figura 8 panel E representa un ejemplo en el que las determinaciones de NMT2 se cuantificaron usando mediciones de densitometría asistidas por ordenador con microscopio óptico. Visualmente, estos números se relacionan bien con la fuerza de tinción de los linfocitos malignos. Los puntos de corte elegidos fueron tinción fuerte frente a ninguna/débil.
Ejemplo 10
En este ejemplo, en la figura 9, se muestra la viabilidad residual de diversas líneas celulares linfocíticas B tratadas con DDD85646 durante 72 horas (figura 9A). Las curvas de la figura 9A se trazaron según una ecuación de 4 parámetros como se describe en Leatherbarrow, R.J. (2009) GraFit versión 6, Erithacus Software Ltd., Horley, Reino Unido para el análisis de GraFit utilizando la ecuación:
Figure imgf000025_0001
Fondo,
en la que la Amplitud es el valor no inhibido ajustado menos el Fondo, y s es un factor de pendiente. La ecuación supone que y desciende al aumentar x. A y B. Gráficas combinadas (n = 4).
En la figura 9, panel A, se utilizaron concentraciones crecientes de DDD85646 para tratar líneas celulares de LB (BL-2 y Ramos) junto con los controles relevantes [IM9 (linfocito B "normal") y KMH2 (línea celular de LH) que expresa ambas NMT]. Se utilizó un ensayo de azul tripano para medir la citotoxicidad del DDD85646 a las 24, 48 y 72 horas. Aunque se recogieron datos a las 24 h y 48 h (datos no mostrados), el efecto más notable de DDD85646 se observó en el punto temporal de 72 h.
Las tasas de supervivencia se redujeron en las líneas celulares de linfoma B utilizadas (Ramos: DDD85646 CE50 = 0,37 /- 0,05 |j M y BL2: DDD85646 CE50 = 0,43 /- 0,2 |j M) de una manera dependiente de la concentración de DDD85646. Las tasas de supervivencia de las líneas celulares de control, IM-9 (DDD85646 CE50 = 7,08 /-2,32 j M) y KMH2 (DDD85646 Ce50 = 29,6 /- 10,6 j M) fueron mayores. Los datos de CE50 se resumen de la siguiente manera.
Tabla 2
Tipo celular CE50 (pM) NMT1 NMT2 Tipo de célula
B1-2 0,43 /- 0,20 sí No Linfoma de Burkitt
Ramos 0,37 /- 0,05 sí No Linfoma de Burkitt
IM-9 7,08 /- 2,32 sí sí Linfocito B inmortalizado KMH2 29,6 /-10,6 sí sí Linfoma no hodgkiniano DDD85646 presentó una CE50 baja (la concentración que destruye el 50 % de las células cancerosas) en células LB y presentó una CE50 más alta en células HL (KMH2). Por tanto, DDD85646 presentó un alto índice de destrucción selectiva de células cancerosas. Como se usa en el presente documento, se define el índice de destrucción selectiva como la relación de la CE50 de linfocitos B inmortalizados "normales"/CE50 de células malignas. El índice de destrucción selectiva para DDD85646 fue de 16,4 y 19,1 para las células BL-2 y Ramos, respectivamente.
En la figura 9, panel B, se utilizó DDD86481 para tratar células de LB y líneas celulares de control [IM9 (linfocito B "normal") y KMH2 (línea celular de LH) que expresa ambas NMT]. La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo MTS a las 48 h y 72 h, aunque no se observó un cambio significativo en la viabilidad celular a las 48 h (datos no mostrados), se descubrió que la tasa de supervivencia de las líneas celulares de LB probadas disminuyó significativamente en el punto temporal de 72 h (Ramos: DDD86481 CE50 = 42 nM y BL2: DDD86481 CE50 = 58 nM) de una manera dependiente de la concentración de DDD86481. Las tasas de supervivencia de las líneas celulares de control, IM-9 (DDD86481 CE50 = 2,2 j M) y KMH2 (DDD86481 CE50 = 12,6 j M), fueron mayores. El índice de destrucción selectiva calculado para DDD86481 fue de 37,9 y 52,3 para las células BL-2 y Ramos, respectivamente. Los datos de CE50 se resumen de la siguiente manera.
Tabla 3
Tipo celular CE50 (pM) NMT1 NMT2 Tipo de célula
B1-2 0,058 sí No Linfoma de Burkitt
Ramos 0,042 sí No Linfoma de Burkitt
IM-9 2,2 sí sí Linfocito B inmortalizado KMH2 12,6 sí sí Linfoma no hodgkiniano
[00210][00209] La siguiente tabla, que presenta la descripción del tipo celular y las CE50 para DDD85646 y DDD864841, células de linfoma B (Bl-2 y Ramos) que expresan solo una NMT (NMT1) son ~15-72 veces más sensibles a DDD85646 o DDD86481 que los linfocitos B "normales" inmortalizados o las líneas celulares de linfoma no hodgkiniano que expresan ambas NMT.
Tabla 4
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La siguiente tabla proporciona un sumario de los datos de CE50 y CE90 farmacológicas de DDD86481 en líneas celulares de linterna de Burkitt (BL-2 y Ramos) y linfocitos B inmortalizados "normales" (datos calculados a partir de la fig. 9B).
Los índices de selectividad muestran las relaciones de las CE50 y CE90, que indican que DDD86481 destruye preferentemente células cancerosas en un factor >300 veces (ya que la concentración necesaria para destruir la línea de linfocitos B normales es mucho mayor).
Tabla 5
Figure imgf000026_0001
En la figura 9C, se utilizó DDD73226 para tratar líneas celulares de LB (BL-2 y Ramos) junto con los controles relevantes [IM9 (linfocito B "normal") y KMH2 (línea celular de LH) que expresa ambas NMT)]. La citotoxicidad de DDD73226 se midió utilizando un ensayo de exclusión de azul tripano a las 72 h. No se observaron cambios significativos en la viabilidad celular a las 24 y 48 h (datos no mostrados). Asimismo, no hubo cambios significativos en la viabilidad de células IM9, KMH2 y Ramos cuando las células se trataron con DDD73226 a concentraciones tan altas como 100 pM en el punto temporal de 72 h. Hubo, sin embargo, una ligera disminución en la viabilidad celular observada en las células BL2 tratadas con DDD73226100 pM a las 72 h, en comparación con otras células. Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, esto puede deberse a que, además de tener niveles de NMT2 muy disminuidos, BL2 también tiene niveles de NMT1 menores en comparación con Ramos y otras líneas celulares y, por lo tanto, puede ser más susceptible a la acción de inhibidores de NMT incluso menos potentes.
En la figura 9D (paneles i y ii), se presenta un experimento de evolución temporal en el que se marcaron células IM-9 y BL2 con w-alquinil miristato 100 pM durante 1 h después del tratamiento con DDD86481 (0, 1 y 10 pM) durante 0, 1 o 4 h. Las muestras de proteína se hicieron reaccionar con azido-biotina utilizando química clic y se visualizaron mediante transferencia de Western con NeutrAvidin™ -HRP. La acción inhibidora de DDD86481 fue rápida, con una inhibición casi completa de la miristoilación en las células (tanto IM-9 como BL2) tratadas con DDD86481 1 pM después de una hora de tratamiento.
En la figura 9E, se determinó la dosis mínima de DDD86481 necesaria para inhibir la miristoilación en líneas celulares IM-9, BL2 y Ramos. Las células se trataron con DDD86481 a concentraciones de 0, 10, 50, 100, 500 y 1000 nM durante 2h con marcaje celular metabólico con alquinil-miristato en la última hora de tratamiento. DDD86481 inhibió la miristoilación de una manera dependiente de la concentración en todas las líneas celulares probadas. Las líneas celulares BL-2 y Ramos fueron más sensibles a la acción inhibidora de DDD86481, ya que fue evidente una disminución en la incorporación del marcador de miristato de alquino en las proteínas miristoiladas a partir de 50 nM para ambas líneas celulares de LB en comparación con IM-9 en la que la incorporación del marcador de miristato de alquino disminuyó a partir de la concentración de 100 nM.
La tabla 6 muestra una caracterización preclínica preliminar de DDD85646 o DDD86481
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 11
En este ejemplo, en la figura 10, se muestra la sensibilidad de diversos linfocitos B L0 normales inmortalizados (obtenidos del Dr. Riabowol, U. de Calgary), células de linfoma B malignas (Ramos y BL2) y leucemia de linfocitos T (CEM) al inhibidor de NMT TrisDBA durante 24 horas (A) Viabilidad residual de diversas líneas celulares tratadas con TrisDBA durante 24 horas (n = 9) (B) Efecto de TrisDBA sobre la actividad de N-miristoiltransferasa en células COS7 expresando transitoriamente NMT1 o NMT2 incubadas durante 24 h con TrisDBA. In vitro la CI50 para TrisDBA es aproximadamente 2 pM para NMT1 y 5 pM para NMT2. Las líneas celulares de linfoma de Burkitt Ramos y BL-2 son más sensibles al inhibidor de NMT TrisDBA.
Ejemplo 12
En este ejemplo, en la figura 11, Se determinaron los niveles de expresión de NMT en la base de datos de la enciclopedia de 967 líneas celulares de cáncer (CCLE). Panel A) Se consultó la base de datos CCLE para determinar la expresión de NMT1 y NMT2 y se representaron los niveles de NMT respectivos. NMT2 muestra un amplio intervalo de expresión (~3-11) en comparación con NMT1 (~6-9). Panel B) Se representan gráficos de caja y bigotes de líneas celulares cancerosas de varios subtipos de cáncer y se comparan con el gráfico de las 967 líneas celulares cancerosas. Se realizaron pruebas de T de Student que comparan cada grupo con todos los tumores. ** denota valores de P <0,001. Panel C) Se consultó la base de datos CCLE para las 50 líneas celulares que expresaban los niveles más bajos de NMT2 y se muestran en formato de tabla. Las líneas celulares tumorales derivadas de diversos tejidos hematopoyéticos y linfoides representan el 76 % (38 de 50) de las líneas celulares con menor expresión de NMT2 y están destacadas en diversos colores.
Ejemplo 13
En este ejemplo, en la figura 12, las NMT se escinden durante la apoptosis pero permanecen activas. Panel A y B. Los lisados de células Jurkat en las que se ha inducido apoptosis mediada por anti-Fas o estaurosporina se exploraron con anti-NMT1 y anti-NMT2 mediante transferencia de Western y muestran una escisión dependiente del tiempo de ambas enzimas. Se realizó transferencia de Western en las mismas muestras utilizando anticuerpos contra PAK2 y GAPDH. Panel C y D. La incorporación de w-alquinil-miristato en células Jurkat en las que se ha inducido apoptosis mediada por anti-Fas o estaurosporina ilustra un cambio en los perfiles de miristoilación a medida que las células comienzan a morir y sugiere que aunque se escindan las NMT, todavía están activas. Las células Jurkat se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato 25 pM después de la inducción de apoptosis con anti-FAS (100 ng/ml) y cicloheximida (5 pg/ml) (C) o estaurosporina (2,5 pM) y cicloheximida (5 pg/ml) (D). Las muestras de proteína se hicieron reaccionar con azidobiotina utilizando química clic y se visualizaron mediante transferencia de Western con NeutrAvidinTM-HRP. Antes de la evaluación de la incorporación de marcador mediante transferencia de Western, las membranas se incubaron en KOH 0,1 M (B y D). Panel (E) En los distintos tiempos indicados, La actividad NMT se ensayó utilizando decapéptido ct-Bid N-terminal y [3H]-miristoil-CoA. Aunque ambas enzimas NMT se escinden, ambas permanecen catalíticamente activas y solo NMT1 presenta una pérdida significativa de actividad. (F) Reconstitución de la escisión de NMT1 por caspasas-8 y 3 y escisión de NMT2 por caspasa-3 in vitro (gel teñido con Coomassie). Se incubaron His-NMT1 e His-NMT2 purificadas (5 ug de cada una) con caspasa 3 y 8 activa (500 ng de cada una) durante 1 hora a 37 °C. Se añadió un inhibidor de caspasa general (z-VAD-fmk) para detener el avance adicional de la reacción al final de la incubación. Las muestras se hirvieron inmediatamente con tampón de carga de muestra 5x con Beta-Mercaptoetanol y se cargaron en un gel de acrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de PVDF. A continuación, la membrana se tiñó con azul de Coomassie para visualizar las proteínas. Los fragmentos escindidos, que se enviaron para la degradación de Edman están encuadrados y permitieron la identificación de sitios de escisión de caspasa en NMT1 después de D72 y NMT2 después de D25 y D67.
Ejemplo 14
En este ejemplo, en la figura 13, se muestra la purificación de hNMT1 y hNMT2 marcadas con GST y His6 recombinantes. Panel (A) purificación de GST-NMT1 y (B) GST-NMT2 en glutatión agarosa, (C) purificación de His6-NMT1 y (D) His6-NMT2 mediante cromatografía quelante de Ni y cromatografía de intercambio iónico Resource S. En la figura 13, paneles C y D, los carriles son los siguientes. Panel (C) GelA: Purificación de NMT1: 1) marcador todo azul, 2) grupo de columna de Ni-NTA, 3) grupo de filtración de gel, 4) FC de Resource S, 5) fracción 8 (f8), 6) f16, 7) f18, 8) f19, 9) f20, 10) f21, 11) f22, 12) f41, 13) f42, 14) f66, 15) f67. Panel (D) gel B: Purificación de NMT2: 1) marcador todo azul, 2) grupo de columna de Ni-NTA, 3) grupo de filtración de gel, 4) FC de Resource S, 5) fracción 21 (f21), 6) f28, 7) f38, 8) f39, 9) f40, 10) f41, 11) f42, 12) f44.
Ejemplo 15
En este ejemplo, en la figura 14, se muestra la comparación de las actividades enzimáticas entre His6-NMT1 de longitud completa recombinante purificada y ct-His6-NMT1 recombinante "truncada en caspasa". His6-NMT1 de longitud completa (aa 73-496). La actividad NMT se ensayó usando un ensayo de miristoilación de péptidos adaptado de King y col. 1999, Anal Biochem. Experimentos por duplicado.
Ejemplo 16
En este ejemplo, en la figura 15, se muestra la comparación de CE50 y CI50 de diversos inhibidores de NMT y diferentes líneas celulares. El gráfico muestra la correlación entre la potencia bioquímica de 8 inhibidores de NMT en el ensayo enzimático bioquímico (CI50) y su potencia en un ensayo de viabilidad celular de azul de alamar utilizando 7 líneas celulares (CE50). Se realizó análisis de regresión en cada línea celular y proporcionó un valor R2 medio de 0,9 (intervalo de 0,82-0,96). Este alto nivel de correlación entre las diversas Cl50 y CE50 es una prueba sólida de que la actividad de las moléculas en el ensayo de viabilidad celular se debe a su actividad inhibidora en NMT. Obsérvese que 2 pares de moléculas tienen potencias similares en el ensayo bioquímico.
Ejemplo 17
En este ejemplo, en la figura 16, se muestra la inducción por DDD86481 de apoptosis en células de LB.
Se incubaron linfocitos B inmortalizados "normales" (IM9), células KMH2 (linfoma de Hodgkin) y de LB (BL2 y Ramos) con concentraciones crecientes (nM) de DDD86481 y se supervisó la escisión de poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) y caspasa-3 después del punto temporal de 72 h. Se realizó transferencia de Western en lisados celulares para supervisar la escisión de PARP-1 y caspasa-3, así como la presencia de GAPDH como control de carga (geles compuestos). La escisión tanto de PARP-1 como de caspasa-3 se produjeron de manera dependiente de la dosis cuando las líneas celulares de LB se trataron con el inhibidor, lo que indica que estas células experimentan apoptosis. No se observó escisión de PARP-1 o caspasa-3 en las células IM9 "normales" tratadas con el inhibidor. Se observó escisión de PARP-1 en células KMH2 (LH) a concentraciones mayores, aunque fue mínima en comparación con la escisión de PARP-1 observada en las células de LB. Por tanto, se descubrió que las células de LB son más propensas a experimentar apoptosis que los linfocitos B "normales" cuando se tratan con DDD86481.
Ejemplo 18
En este ejemplo, en la figura 17, se proporciona una estimación de un umbral para la pérdida de NMT2 en tumores humanos. En la tabla 7, el nivel de expresión de ARNm de NMT2 se muestra como log2 (intensidad de fluorescencia de micromatriz de NMT2) para las líneas celulares indicadas del conjunto de datos CCLE cuando estén disponibles.
Tabla 7
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En la figura 17, panel A, las líneas de células linfoides indicadas se exploraron para determinar la presencia de NMT2 mediante transferencia de Western. En la figura 17, panel B, en comparación con el panel A y la tabla 7, se demuestra, en un log2 (intensidad de fluorescencia de micromatriz de NMT2) = 5,64 observado en células de Toledo, que no hay NMT2 detectable por transferencia de Western. Aunque el umbral real para la pérdida de expresión de NMT2 podría ser superior a 5,64, se está utilizando, en este ejemplo, este número como umbral para establecer la prevalencia aproximada de la pérdida de NMT2 en la población humana (panel B). Los datos indican que la pérdida de NMT2 no solo es frecuente en linfomas difusos de linfocitos B grandes y de Burkitt, sino también en una gran variedad de tipos tumorales adicionales (véase también la figura 11C para obtener una lista de 50 líneas celulares que expresan la menor cantidad de NMT2 y la tabla para la prevalencia de la pérdida de NMT2 en diversos tipos cancerosos).
Por consiguiente, en el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar los cánceres deficientes en NMT2 adecuados para el tratamiento con uno o más inhibidores de NMT1. En un ejemplo, una muestra de paciente con niveles o concentración de ARNm por debajo de aproximadamente un valor umbral, indica que dicho paciente es un buen candidato para el tratamiento con un inhibidor de NMT1. En algunos ejemplos, un nivel de ARNm por debajo de aproximadamente el umbral se denomina expresión baja. En un ejemplo, una muestra de paciente con niveles o concentración de ARNm por encima de aproximadamente un valor umbral, indica que dicho paciente es un mal candidato para el tratamiento con un inhibidor de NMT1. En algunos ejemplos, un nivel de ARNm por encima de aproximadamente el umbral se denomina expresión alta.
Se apreciará que además de, o en lugar de, el valor umbral establecido con respecto a las células de Toledo, las fuentes alternativas pueden actuar como valores de umbral adecuados. En algún ejemplo, la fuente o el control utilizado para obtener un valor umbral es el mismo tipo celular que el cáncer que se está analizando. En algunos ejemplos, los valores de umbral de control o fuente se almacenan o se encuentran en una base de datos.
Ejemplo 19
En este ejemplo, en la figura 18, se muestra el uso de una sonda de destiobiotina-PEG-azida para extraer proteínas w-alquinil-miristoiladas postraduccionalmente en linfocitos T Jurkat leucémicos utilizando perlas de estreptavidinasepharose.
La destiobiotina (mostrada en I) es un análogo de biotina que se une de forma reversible a la avidina y proteínas de tipo avidina. Los inventores han diseñado y solicitado la síntesis de destiobiotin-PEG-azida (I.) y biotina-PEG-azida
En (B), se cultivaron linfocitos T Jurkat en presencia de w-alquinil-miristato y se indujo su apoptosis mediada por anti-Fas en presencia de cicloheximida. Después de la lisis celular, los lisados se hicieron reaccionar con destiobiotin-PEG-azida utilizando química clic o no, se mezclaron con perlas de neutravidina-sepharose, se lavaron y se eluyeron con biotina 10 mM. El panel B (i) muestra que la proteína destiobiotinilada-miristoilada postraduccionalmente puede extraerse y recuperarse eficazmente de los carriles de perlas de neutravidina 5, 6, 7 y B (iii). En el panel B (ii), se muestra un control en el que se omitió la destiobiotina-PEG-azida de la reacción de clic. En ese caso, muy pocas proteínas se unieron a las perlas de neutravidina y se eluyeron (solo se puede ver una banda tenue a 75 kDa). Estos resultados indican el desarrollo de un procedimiento para permitir un análisis proteómico y evaluar el contenido celular de proteínas miristoiladas co- y post-traduccionalmente o miristoilomas. Ejemplo 20
En este ejemplo, la figura 19 representa el uso a mayor escala de una sonda de destiobiotina-PEG-azida para extraer proteínas (jo-alquinil-miristoiladas postraduccionalmente en linfocitos T Jurkat leucémicos usando perlas magnéticas de estreptavidina. Se indujo la apoptosis de células Jurkat con 2,5 pM de estaurosporina durante 3 h, después se marcaron con miristato 100 pM (C14) (panel A) o alquinil-miristato (Alk C14) (panel B) ambos conjugados con BSA durante 1 h a 37 °C. Las células se recogieron, se lisaron y se hicieron reaccionar con azidodestiobiotina usando química clic. Se unieron proteínas destiobiotina-alquinil-miristoiladas a perlas magnéticas de estreptavidina, se lavaron y se eluyeron con biotina 50 mM con SDS al 2 % a 37 °C durante 15 min. La elución 1 (panel B) contiene la mayoría de las proteínas destiobiotin-miristoiladas, mientras que se encuentran pocas en la elución 1 de las células marcadas con miristato (panel A). Tiempo de exposición: 5 segundos.
Ejemplo 21
En este ejemplo, en la figura 20, se muestran perfiles de miristoilación de linfocitos B inmortalizados "normales" (IM9) y células de LB (BL2 y Ramos) marcadas con alquinil-miristato. Las células se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato 100 pM durante 1 hora antes de su recogida. Las muestras de proteína se hicieron reaccionar con azido-biotina utilizando química clic, se separaron 25 pg de proteína de cada lisado celular mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante transferencia de Western utilizando NeutrAvidinTM-HRP. Las flechas indican proteínas biotiniladas-alquinil-miristoiladas, que están presentes en el linfocito B inmortalizado "normal" IM9, pero no se observaron en células de LB (BL2 y Ramos).
Ejemplo 22
En este ejemplo, en la figura 21, se muestran gráficos de citotoxicidad dependientes del tiempo y de la dosis de la combinación de DDD86481 y doxorrubixina. Las líneas celulares de linfocitos B IM-9 (A) y BL-2 (B) se trataron con concentraciones crecientes de DDD86481 (0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10 y 100 pM) a 0 (azul), 17 (rojo) y 86 nM (verde) de hidroxidoxorrubicina durante 24, 48 o 72 horas (de arriba a abajo). Los ensayos de MTS demuestran la muerte celular inducida por concentraciones de doxorrubicina y DDD86481 que individualmente son mucho menos tóxicas; este efecto es coherente con una interacción sinérgica. Esto se caracteriza por una reducción de 6 veces de las CE50 cuando ambos compuestos se utilizan juntos en comparación con las CE50 para DDD86481 utilizado solo en puntos temporales de 24 y 48 horas.
Ejemplo 23
En este ejemplo, en la tabla 8, a continuación, se proporciona una evaluación de la prevalencia aproximada de la pérdida de n MT2 en múltiples cánceres humanos en Norteamérica. Se estableció un valor de corte mínimo de 5,64 para el log2 (intensidad de fluorescencia de micromatrices) que corresponde a células sin NMT2 (Toledo, véase ejemplo 18) y se descubrió que 114 de 967 líneas celulares quedan por debajo de este umbral (~12 %). Las tasas de incidencia en Norteamérica para cada tipo tumoral, también se muestra el número de pacientes que indican beneficio de una terapia inhibidora de NMT (incidencia X % por debajo del umbral) y la justificación de las necesidades médicas de cánceres seleccionados.
TABLA 8
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(continuación)
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lneas celulares Incidenci Mercado
por debajo del Incidencia a en norteamericano Justificación de la umbral de en Estados aplicable para investigación Ti o de cáncer NMT2 Canadá Unidos tera ias rioritaria
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Ejemplo 24
En este ejemplo, en la figura 22, la inmunotransferencia se realizó con células incubadas con DMSO, estaurosporina, a FAS o vehículo solo. Las inmunotransferencias resultantes se exploraron con anticuerpo anti-NMT1, anticuerpo anti-NMT2, anticuerpo anti-PARP-1 y anticuerpo anti-GAPDH. Estos datos incluyen que la NMT se escinda tras la inducción de apoptosis.
En particular, en este ejemplo, en la figura 22A, se investigó la función o las funciones de las NMT en células vivas y moribundas. Se analizaron linfocitos T Jurkat en los que se ha inducido muerte celular programada con anti-Fas o STS para determinar su contenido en NMT. Los linfocitos T Jurkat se trataron con DMSO, estaurosporina (2,5 o anti-Fas (300 ng/ml) con cicloheximida (5 |jg/ml) y las muestras se recogieron en los puntos temporales de 0, 2, 4, 6 y 8 h. Las células se lisaron y se evaluó la presencia de NMT1, NMT2, PARP-1 y GAPDH mediante transferencia de Western utilizando ECL. El tratamiento de linfocitos T Jurkat con anti-Fas o STS dio lugar a la escisión dependiente del tiempo tanto de NMT1 como de NMT2 (figura 22A). La escisión de NMT1 comenzó 2 h después de la inducción de la muerte celular, mientras que la de NMT2 solo fue detectable después de 4 h de apoptosis.
La escisión de NMT1 que migra a una proteína de 67 kDa aparente (PM predicho = 56,8 kDa) dio lugar a un fragmento de ~46 kDa aparente (fig. 3.1). La escisión de NMT2 que migra como una proteína de 65 kDa aparente (PM predicho = 56,9) produjo un fragmento de ~55 kDa aparente en puntos temporales tempranos, que se convirtió en un fragmento más corto que migraba a ~46 kDa o menos en puntos temporales posteriores (4 y 8 h). Se vio que este fragmento de NMT2 más corto solapaba con una banda de proteína inespecífica. Sin embargo, fue más visible en los lisados de células Jurkat tratados con Fas en las figuras 3.2 (8 h) y 3.4 A (4 h y 8 h). Por tanto, las escisiones de NMT1 y NMT2 dan lugar principalmente e inicialmente a la pérdida de fragmentos de ~11 kDa y ~10kDa, respectivamente. Se desconoce el motivo de las discrepancias entre las migraciones aparentes y los pesos moleculares previstos de las NMT. El momento de escisión de las NMT fue paralelo al del marcador apoptótico PARP-1, lo que sugiere que se debe a la acción de caspasas.
NMT1 es un sustrato de caspasa-3 u 8 y NMT2 es un sustrato de caspasa-3.
En el experimento de la figura 22 panel B, para investigar si las caspasas están implicadas en la escisión de las NMT, se indujo la apoptosis mediada por anti-Fas en linfocitos T Jurkat en presencia o ausencia de inhibidores irreversibles bien caracterizados de caspasas-3, 8 y 9 junto con un inhibidor general de caspasas y se analizó el contenido celular de ambas NMT. Los linfocitos T Jurkat se trataron con inhibidores de caspasa 10 pM durante una hora y después se trataron con anti-Fas (300 ng/ml) y cicloheximida (5 pg/ml) para inducir la apoptosis. Se recogieron muestras en puntos temporales de 0, 4 y 8 h. Las células se lisaron y se evaluó la presencia de NMT1, NMT2 y PARP-1 mediante transferencia de Western utilizando ECL. A continuación, las transferencias se separaron y se volvieron a analizar con anti-tubulina (control de carga) (geles compuestos).
La escisión de NMT1 fue anulada por los inhibidores generales y específicos de caspasa-8, mientras que solo fue bloqueada parcialmente por el inhibidor específico de caspasa-3 (figura 22B), lo que sugiere que NMT1 es un sustrato de caspasas-3 u 8. Por el contrario, la escisión de NMT2 fue inhibida notablemente por todos los inhibidores de caspasa utilizados (figura 22B). Esto sugiere que NMT2 es probablemente un sustrato de la caspasa-3 ya que la inhibición de las caspasas iniciadoras-8 o 9, inhibiría a su vez la escisión y activación de la caspasa-3 efectora. La progresión de la apoptosis inducida por anti-Fas se verificó mediante transferencia de Western con anticuerpo anti-PARP-1 (figura 22B). El alcance de la escisión de PARP-1 fue simultáneo y proporcional a la de NMT1 y NMT2. Ejemplo 25
En este ejemplo, en la figura 23, se muestra que la NMT2 truncada por caspasa es 3-4 veces más activa que la NMT2 de longitud completa. La actividad NMT de hexahistidina (His)-NMT purificadas de longitud completa y escindidas por caspasa se ensayó usando un ensayo de miristoilación de péptidos. La actividad N-miristoiltransferasa se calculó a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y col. 1991, Anal Biochem.). Cada ensayo de NMT se realizó por triplicado. El control utilizado es la elución 5 de la purificación de His-NMT1. La NMT2 truncada por caspasa es 3-4 veces más activa que la NMT2 de longitud completa.
Ejemplo 26
En este ejemplo, en la figura 24, se muestra que la reducción de los niveles de NMT2 en las células de LB implica la acción de histona desacetilasas.
En los experimentos de la figura 24, los inventores buscan evaluar la posible implicación del silenciamiento génico en el locus de NMT2. La acetilación del grupo £-amino de los restos de lisina en las histonas por histona acetilasas (HAT) da lugar a la reducción de la carga positiva de las histonas, que relaja la conformación de la cromatina y permite que la maquinaria de transcripción tenga mejor acceso al a Dn (Barneda-Zahonero, B. y M. Parra. 2012. Histone deacetylases and cancer. Mol Oncol. 6: 579-589.). Por lo tanto, la acetilación de histonas se asocia normalmente con la activación de genes. Por el contrario, la eliminación de los grupos acetilo de las histonas por histonas desacetilasas (HDAC) induce la condensación de la cromatina y da lugar a la represión de la transcripción o el silenciamiento de genes.
Para probar si la reducción en el ARNm NMT2 se debió al silenciamiento de la cromatina, se trataron linfocitos B "normales" (IM9) y células de LB malignas con ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA) (también denominado vorinostat), un inhibidor de histona desacetilasa de clase I y clase II, durante 24 horas y se supervisaron los niveles de NMT1 y NMT2 mediante transferencia de Western. En particular, linfocitos B "normales" (IM9) y células de LB malignas (Ramos, BL2) tratados con SAHA 1 pM (inhibidor de HDAC de clase I/II) durante 24 h. Después se lisaron las células, se sometieron a SDS-PAGE y se realizó transferencia de Western con anticuerpos de NMT1, NMT2, p21/WAF1 y GAPDH.
Los inventores descubrieron que el uso de SAHA aumentó los niveles de NMT2 en las células de LB en la que los niveles de NMT2 normalmente se agotan, mientras que los niveles de NMT1 permanecieron relativamente sin cambios. p21/WAF1, una proteína que se une a e inhibe la actividad de los complejos de cinasa 1 dependiente de ciclina (CDK1) o CDK2, se utilizó como control para verificar la eficacia de SAHA, que se sabe que aumenta la expresión del gen de p21/WAF1 en las células. Todas las células tratadas con SAHA contenían mayores niveles de p21/WAF1. Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, estos datos sugieren que una HDAC de clase I o clase II silencia el gen de NMT2 desacetilando histonas y compactando de este modo el locus de NMT2 en las células de LB.
En un ejemplo, se usa un inhibidor de HDAC para tratar el cáncer deficiente en NTM2.
Ejemplo 27
En este ejemplo, en la figura 25, se muestra que los niveles de proteína NMT2 se reducen en diversas líneas celulares de LB. Se obtuvieron lisados de diversas líneas celulares linfocíticas de investigadores locales y se analizaron para determinar su contenido de NMT. Los resultados demuestran que los niveles de proteína NMT2 se redujeron en todas las líneas celulares de linfoma de Burkitt (BL2, Daudi, Ramos y BJAB) probadas en comparación con las líneas de linfocitos B linfoblásticos inmortalizados, "normales", IM9, L0 y VDS.
Ejemplo 28
En este ejemplo, en la figura 26, se muestra que la degradación proteasómica no es la causa del agotamiento de NMT2 en las células de LB. En estos experimentos, se trataron linfocitos B inmortalizados "normales" (IM9) y células de linfoma B malignas [linfoma de Hodgkin (KMH2) y BL (Ramos, BL2)] con 10 pM de inhibidor proteasómico (MG-132) durante 5 h. Se realizó una transferencia de Western en lisados celulares para supervisar los niveles de NMT1, NMT2, Mcl-1 y GAPDH.
Para investigar si la degradación de NMT2 aumentó como resultado de una mutación desestabilizadora o la presencia de un factor desconocido que podría desestabilizar NMT2 en células cancerosas, los inventores trataron linfocitos normales y malignos con el inhibidor de la degradación proteasómica MG-132 durante 5 h. Los lisados celulares se sometieron a transferencia de Western para analizar la presencia de NMT1, NMT2 y proteína de leucemia de células mieloides-1 (Mcl-1), que se utilizó como control para comprobar la eficacia de MG-132 ya que está sujeta a degradación proteasómica. Los resultados indican que los niveles de NMT2 no aumentaron en las células de LB tras el tratamiento con MG-132, lo que sugiere que no está presente una mutación desestabilizadora o un factor desestabilizador presente en linfocitos malignos que conduce a la degradación de NMT2. El tratamiento de las células con MG-132 conduce a un aumento de los niveles de Mcl-1 en todos los tipos celulares.
Ejemplo 29
En este ejemplo, en la figura 27, se muestra que NMT1 es escindida por caspasa-8, pero no NMT2. Los linfocitos T Jurkat (A) y los linfocitos T Jurkat que expresan un mutante negativo dominante de caspasa-8 (B) se trataron con DMSO o anti-Fas (150 ng/ml) y se recogieron muestras en puntos temporales de 0, 4 y 8 h. Las células se lisaron y se evaluó la presencia de NMT1, PARP-1 y caspasa-8 escindida mediante transferencia de Western utilizando ECL. * denota bandas inespecíficas.
La escisión de NMT1 se investigó en linfocitos T Jurkat de tipo silvestre y linfocitos T Jurkat que expresan un mutante negativo dominante de caspasa-8 (C8DN) (Juo y col., 1998). La expresión de C8DN en linfocitos T Jurkat apoptóticos anuló la escisión de n MT1 en comparación con los niveles observados en linfocitos T Jurkat de tipo silvestre (figs. 27A y B). Se observó una cantidad mínima de escisión de NMT2 en células Jurkat-C8DN después de 8 h de inducción de la apoptosis (fig. 27B). La escisión de PARP-1 y caspasa-8 también se inhibió en linfocitos T Jurkat-C8DN.
Ejemplo 30
En este ejemplo, en la figura 28, tanto NMT1 como NMT2 fueron escindidas por caspasa-3. Se trataron MCF7 (A) y MCF7 que expresaban caspasa 3 (MCF7/caspasa 3) (B) con DMSO o STS (2,5 con cicloheximida (5 pg/ml) y se recogieron muestras en los puntos temporales de 0, 4 y 8 h. Las células se lisaron y se evaluó la presencia de NMT2, PARP-1 y caspasa 3 escindida mediante transferencia de Western utilizando ECL.
Se encontró que ni NMT1 ni NMT2 se escindieron en células MCF-7 apoptóticas en el punto temporal de 8 h (fig.
28A). Por el contrario, ambas enzimas se escindieron fácilmente en células MCF-7 apoptóticas que expresan de manera estable caspasa-3 (Kagawa y col., 2001) (fig. 28B). La escisión del sustrato de caspasa-3/-7 conocido PARP-1 también se confirmó en ambas líneas celulares MCF-7 cuando se indujo la apoptosis (fig. 27A y B) (Walsh y col., 2008). Por lo tanto, ambas NMT parecen ser sustratos de caspasa-3.
Ejemplo 31
En este ejemplo, en la figura 29, los sitios de escisión por caspasa de NMT1 y NMT2 identificados por la degradación de Edman se mostraron en negrita y la caja de lisina (K) con carga positiva está resaltada en las secuencias de aminoácidos de NMT1 y NMT2 (aminoácidos 1 a 80).
La secuenciación N-terminal reveló que NMT2 se escindió en los sitios tanto D-25 como D-67 (fig. 29). Los sitios de escisión tanto para NMT1 como para NMT2 se ubicaron en el extremo N de las enzimas y no en el dominio catalítico C-terminal, lo que sugiere que las enzimas escindidas aún pueden estar activas durante la apoptosis.
Ejemplo 32
En este ejemplo, en la figura 30, representa la confirmación de los sitios de escisión de NMT mediante mutagénesis dirigida. Las células HeLa que expresan de forma transitoria las construcciones de V5-NMT de tipo silvestre y mutantes se incubaron con STS (2,5 j M). Las células transfectadas con construcciones de V5-NMT1 o V5-NMT2 se lisaron en los puntos temporales de 4 h y 5 h, respectivamente. Se realizó transferencia Western en las muestras utilizando anticuerpos V5 y a-tubulina (control de carga).
Para validar los sitios de escisión de NMT revelados por la secuenciación N-terminal, se construyeron vectores V5-NMT marcados en el extremo N y se utilizó el equipo de mutagénesis dirigida Quickchange® (Stratagene) para crear mutaciones puntuales en los sitios de escisión de NMT. La mutación de D72E introducida por ingeniería genética en V5-NMT1 anuló la escisión por caspasa de V5-NMT1 en células HeLa transfectadas de manera adecuada en las que se ha inducido la apoptosis con STS durante 4 h mientras que los niveles de V5-NMT1 TS disminuyeron gravemente en estas células (fig. 30). Esto confirmó D72 como el sitio de escisión por caspasa en NMT1.
Debido a que la secuenciación N-terminal reveló dos sitios de escisión de caspasa (D25 y D67) para NMT2 (fig. 30), se mutaron los restos tanto D25 como D67 en restos de glutamato (E) de forma independiente [V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E)] y juntos [V5-NMT2 (D25,67E)]. Se observó que la escisión del mutante doble V5-NMT2 (D25,67E) se anuló gravemente en células HeLa apoptóticas transfectadas de forma apropiada mientras que los mutantes individuales [V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E)] tuvieron efectos variables (fig. 30) y el V5-NMT2 de tipo silvestre se escindió principalmente después de 5 h después de la inducción de la apoptosis (fig. 3.8). Al comparar la integridad de los mutantes individuales durante la apoptosis, se observó que V5-NMT2 (D25E) se escindió de forma reproducible ligeramente menos que V5-NMT2 (D67E) (fig. 30), lo que sugiere que D25 podría ser el sitio de escisión primario de NMT2, mientras que D67 puede ser un sitio de escisión secundario.
Ejemplo 33
En este ejemplo, en la figura 31, describe cambios en el perfil de miristoilación a medida que las células experimentan apoptosis. Las células Jurkat se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato 25 j M después de la inducción de la apoptosis con anti-Fas (150 ng/ml) y cicloheximida (5 jg/ml). Las muestras de proteína se hicieron reaccionar con azido-biotina utilizando química clic y se visualizaron mediante transferencia de Western con NeutrAvidinTM-HRP. Antes de la evaluación de la incorporación de marcadores mediante transferencia de Western, las membranas se incubaron en Tris-HCl 0,1 M o KOH 0,1 M.
Se indujo la apoptosis de linfocitos T Jurkat utilizando anti-Fas y se marcaron metabólicamente durante 30 min con ácido (jo-alquinil-mirístico antes de recoger las células en diversos puntos temporales (0, 1, 2, 4 y 8 h). También se añadió cicloheximida a las células para inhibir la traducción de proteínas como parte del estímulo apoptótico, bloqueando de este modo la miristoilación cotraduccional durante la apoptosis. Los lisados celulares se hicieron reaccionar con azido-biotina utilizando química clic y las proteínas biotiniladas-miristoiladas se visualizaron mediante análisis de transferencia de Western utilizando NeutrAvidinTM-HRP, como se ha descrito anteriormente (Yap y col., 2010).
El perfil de miristoilación en el tiempo 0 h se correlacionó con el patrón de miristoilación cotraduccional observado previamente en células no apoptóticas (fig. 31) (Martin y col., 2008; Yap y col., 2010). La exposición deliberadamente baja muestra solo algunas proteínas miristoiladas en los lisados celulares. El tratamiento de las membranas con KOH 0,1 M confirmó que el ácido o-alquinil-mirístico se incorpora a las proteínas mediante un enlace amida resistente los álcalis, ya que el tratamiento con álcalis eliminó el marcador de solo algunas bandas proteicas. Este tratamiento alcalino hidroliza enlaces de tioéster que se encuentran en proteínas palmitoiladas (Armah y Mensa-Wilmot, 1999; Zhao y col., 2000; Vilas y col., 2006). Después de la inducción de apoptosis con anti-Fas y cicloheximida durante 1 h, se redujo la miristoilación cotraduccional, supuestamente a medida que la traducción proteica es inhibida por cicloheximida. Esto fue seguido de un cambio en el contenido celular de proteínas miristoiladas como lo ilustran las principales diferencias en los perfiles de proteínas miristoiladas electroforéticas que comienzan 2 h después de la inducción de la apoptosis y continúan durante la duración del experimento (fig. 31). Ejemplo 34
En este ejemplo, en la figura 32, representa cambios en los niveles de NMT a medida que las células experimentan apoptosis. Las células Jurkat se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato 25 j M después de la inducción de la apoptosis con anti-Fas (150 ng/ml) y cicloheximida (5 jg/ml). Se realizó transferencia de Western en las mismas muestras que en la figura 31 utilizando anticuerpos contra NMT1, NMT2 y GAPDH. (*) denota bandas inespecíficas Estos resultados muestran que aunque las NMT se escinden en diversos grados durante la apoptosis, la actividad de miristoilación parece permanecer en las células hasta 8 h después de la inducción de la apoptosis.
Ejemplo 35
En este ejemplo, en la figura 33, representa la inducción de la apoptosis en células COS7 que expresan de forma transitoria V5-NMT1 y V5-NMT2 con estaurosporina y cicloheximida. La actividad NMT se ensayó utilizando un ensayo de miristoilación de péptidos y se realizó transferencia de Western en la muestra utilizando anticuerpos contra v5 y alfa-tubulina (control de carga).
La figura 34 representa la actividad NMT inicial en los lisados de células COS7 transfectadas transitoriamente. Las células COS7 que expresan de forma transitoria V5-NMT1 y V5-NMT2 se incubaron con STS (2,5 y cicloheximida (5 |jg/ml). La actividad NMT se ensayó utilizando un ensayo de miristoilación de péptidos como se describe en los materiales y procedimientos. La actividad N-miristoiltransferasa se calculó a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y col. 1991, Anal Biochem.). Los niveles de actividad se normalizaron con respecto a la actividad de NMT1 en t = 0 h. NMT1 representa el promedio de tres experimentos independientes realizados por duplicado. NMT2 representa el promedio de cuatro experimentos independientes realizados por duplicado.
La figura 35 representa la actividad NMT en células COS7 que expresan de forma transitoria V5-NMT1 y V5-NMT2 incubadas con estaurosporina (2,5 y cicloheximida (5 jg/ml). La actividad NMT se ensayó utilizando un ensayo de miristoilación de péptidos como se describe en los materiales y procedimientos. La actividad N-miristoiltransferasa se calculó a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y col. 1991, Anal Biochem.). La actividad NMT se normalizó al 100 % en t = 0 h para cada NMT. NMT1 representa el promedio de tres experimentos independientes realizados por duplicado. NMT2 representa el promedio de cuatro experimentos independientes realizados por duplicado. Las diferencias se indican con (*) y muestran la significación estadística (* <p = 0,05, ** <p = 0,005) en comparación con el punto temporal de 0 h para ambas NMT.
Para evaluar si las NMT escindidas todavía eran catalíticamente activos, se midió la actividad enzimática V5-NMT de células transfectadas de forma transitoria que expresan V5-NMT utilizando un ensayo de péptido basado en filtro (King y Sharma, 1991; Raju y Sharma, 1999) durante el inicio de la apoptosis. Se indujo la apoptosis mediada por STS/cicloheximida de células COS-7 transfectadas transitoriamente con V5-NMT1, V5-NMT2 o vector vacío y se utilizaron como fuente de enzima. La actividad NMT se midió en diferentes momentos de apoptosis utilizando [3H]-miristoil-CoA y decapéptidos Bid truncados miristoilables o no miristoilables (G->A) como sustratos (King y Sharma, 1991; Raju y Sharma, 1999). La actividad NMT se calculó a partir de la cantidad de péptido radiomarcado que permaneció unido al papel de fosfocelulosa y se detectó mediante recuento de centelleo.
Aunque las células COS-7 transfectadas expresaron niveles similares de NMT quiméricas (fig. 32), las que expresaban V5-NMT1 mostraron una actividad NMT casi 5 veces mayor que las que expresaron V5-NMT2 a t = 0 h (fig. 34). La cantidad de V5-NMT intactas que se encuentran en lisados celulares disminuyó a lo largo del tiempo de inducción de la apoptosis (fig. 33) y siguió una tendencia similar a la de las NMT endógenas (fig. 32), aunque casi toda la NMT1 sobreexpresada se escindió después de 4h y 8h de apoptosis y toda la NMT2 sobreexpresada después de 8 h (fig. 3.33). Aunque se escinde más del 90 % de V5-NMT1 (fig. 3.33) 4 h después de la inducción apoptótica, la actividad NMT en esas células permaneció relativamente sin cambios hasta 8 h después de iniciarse la muerte celular. Hubo una ligera tendencia hacia el aumento (aunque no significativo) de la actividad catalítica de NMT en t = 2 h y 4 h, en los lisados de células COS-7 que sobreexpresan NMT1 en comparación con la actividad en t = 0 h (fig. 3.35). Esto sugiere que la V5-NMT1 escindida es catalíticamente activa durante la apoptosis cuando se inicia la miristoilación postraduccional. Sin embargo, se observó una disminución significativa de la actividad NMT (20 %, p < 0,05) a las 8 h después de la inducción de la apoptosis en comparación con el punto temporal de 0 h en las células transfectadas con V5-NMT1 (fig. 35).
La actividad NMT de las células que expresan V5-NMT2 no se vio afectada significativamente de 0 a 4 h, hasta que la escisión por caspasa de V5-NMT2 dio lugar a una disminución estadísticamente significativa (p < 0,005) (disminución del 33 % en comparación con la actividad a t = 0 h) en la actividad enzimática después de 8 h de inducción de la apoptosis (fig. 35). Resulta interesante que, aunque los niveles de NMT2 se reducen drásticamente debido a la escisión por caspasa durante la apoptosis (fig. 33), el 66 % de la actividad de NMT2 aún permanece después de 8 h de inducción de la apoptosis (fig. 33), lo que indica que NMT2 también desempeña un papel en la miristoilación postraduccional de proteínas durante la apoptosis.
Ejemplo 36
En este ejemplo, en la figura 36, representa la purificación de hNMT1 marcada con hexahistidina (His) recombinante de longitud completa y escindida por caspasa. Se realizó purificación utilizando cromatografía Ni-NTA (véase materiales y procedimientos). Se visualizaron proteínas purificadas mediante tinción de geles con tinción de gel de azul de Coomassie. (FC: flujo continuo, W: lavar y E: fracciones eluidas
La figura 37 representa la purificación de hNMT2 marcada con hexahistidina (His) recombinante de longitud completa y escindida por caspasa. Se realizó purificación utilizando cromatografía Ni-NTA (véase materiales y procedimientos). Se visualizaron proteínas purificadas mediante tinción de geles con tinción de gel de azul de Coomassie. (FC: flujo continuo, W: lavar y E: fracciones eluidas).
La figura 38 representa la actividad NMT de hexahistidina (His)-NMT purificadas de longitud completa y escindidas por caspasa, ensayadas usando un ensayo de miristoilación de péptidos. La actividad N-miristoiltransferasa se calculó a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y col. 1991, Anal Biochem.). Cada ensayo de NMT se realizó por triplicado. El control utilizado es la elución 5 de la purificación de His-NMT1.
Se generaron vectores de NMT humanos marcados con His de longitud completa (His-NMT1 e His-NMT2) y truncados por caspasa (His-73NMT1, His-26NMT2 e His-68NMT2) y utilizaron estos vectores para la expresión bacteriana y la purificación de proteínas (fig. 36 y 337). Utilizando el ensayo de NMT de péptido basado en filtro (King y Sharma, 1991; Raju y Sharma, 1999), los inventores encontraron que tanto NMT1 como NMT2 de longitud completa y truncada por caspasa eran catalíticamente activos en comparación con el control en una situación in vitro (fig. 37). La escisión de NMT2 parece potenciar su actividad ya que la NMT2 truncada escindida por caspasa parecía tener ~3 veces (His-26NMT2) y ~4 veces (His-68NMT2) más actividad en comparación con NMT2 de longitud completa (fig. 38).
Ejemplo 37
En este ejemplo, en la figura 39 representa el fraccionamiento subcelular de NMT endógenas en células HeLa durante la apoptosis. Las células HeLa se trataron con DMSO, STS (2,5 j M) o anti-Fas (300 ng/ml) con cicloheximida (5 jg/ml) y las muestras se recogieron en el punto temporal de 5 h y se sometieron a fraccionamiento subcelular como se describe en materiales y procedimientos. El mismo volumen de fracciones de P100 y S100 se sometió a transferencia de Western utilizando anticuerpos de NMT1 y NMT2.
La figura 40 representa la cuantificación de la cantidad de NMT en diferentes fracciones después del fraccionamiento subcelular de NMT endógenas en células HeLa durante la apoptosis. Las células HeLa se trataron con DMSO, STS (2,5 j M) o anti-Fas (300 ng/ml) con cicloheximida (5 jg/ml) y las muestras se recogieron en el punto temporal de 5 h y se sometieron a fraccionamiento subcelular (fig. 39). Los niveles de NMT1 (A) y NMT2 (B) de longitud completa (completa) y escindidas entre las fracciones de P100 (P) y S100 (S) se cuantificaron utilizando Imagen J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Los porcentajes mostrados se calcularon como niveles de cada banda sobre el total de las dos fracciones (P100+S100). Los gráficos representan el promedio de tres experimentos independientes, la figura 41 representa el fraccionamiento subcelular de células HeLa que experimentan apoptosis marcadas con alquinil-miristato. Antes del fraccionamiento subcelular (figs. 39 y 40), las células HeLa se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato 25 jM después de la inducción de la apoptosis. Después del fraccionamiento, las muestras de proteína se hicieron reaccionar con azido-biotina utilizando química clic y se visualizaron mediante transferencia de Western con NeutrAvidinTM-HRP. Antes de la evaluación de la incorporación de marcadores mediante transferencia de Western, se incubaron membranas en Tris-HCl neutro 0,1 M (A) o KOH 0,1 M (B).
La escisión por caspasa de muchas proteínas con frecuencia da lugar a un cambio en la ubicación celular (Enari y col., 1998; Zha y col., 2000; Jakobi, 2004; Vilas y col., 2006); por lo tanto, para delinear la ubicación de las NmT escindidas durante la apoptosis, los inventores realizaron experimentos de fraccionamiento subcelular (fig. 39) en células normales y apoptóticas. Se descubrió que NMT1 se ubicaba principalmente en la fracción ribosómica/de membrana en células HeLa sin tratar (63,9% en sedimento) (fig. 40). Hubo un aumento perceptible de NMT1 truncada con caspasa escindida en las fracciones citosólicas de células HeLa en las que se ha inducido apoptosis con STS o anti-Fas junto con cicloheximida (54 % en citosol en células tratadas con anti-Fas y 60 % en citosol en células tratadas con STS) (figs. 39 y 40). Por el contrario, la mayoría de NMT2 (61,7 %) se ubicó en el citosol antes de la inducción de la apoptosis (figs. 39 y 40). Sin embargo, el fragmento de NMT2 escindido por caspasa mayor (~55 kDa) se ubicó principalmente en el sedimento de la membrana (94,7 % en las tratadas con Fas y 80 % en las tratadas con STS) en células apoptóticas (figs. 39 y 40). No se observó la presencia del fragmento más pequeño escindido por NMT2 (~46 kDa) durante los fraccionamientos, posiblemente porque se indujo la apoptosis de las células durante un máximo de 5 h.
Cuando las células se marcaron metabólicamente con alquinil-miristato antes de la inducción de la apoptosis o no y se sometieron a fraccionamiento subcelular, se observó un cambio en el perfil de miristoilación después de la inducción de la apoptosis como se ve en la figura 31 y se descubrió que las proteínas miristoiladas postraduccionalmente se ubicaban principalmente en las membranas (P100) en comparación con el citosol (S100) (fig. 40). Esto sugiere que la adición de un resto de miristoílo a estas proteínas miristoiladas postraduccionalmente parece suficiente para proporcionar un anclaje estable a la membrana.
Ejemplo 38
En este ejemplo, la figura 42 representa el efecto del ácido 2-hidroximirístico (HMA) sobre la inducción de la apoptosis. Se trataron linfocitos T Jurkat con o sin HMA (1 mM) y se indujo la apoptosis con anti-Fas (150 ng/ml) y cicloheximida (5 jg/ml). Las células de control se trataron con DMSO. Se recogieron muestras en puntos temporales de 0, 2, 4, 6 y 8 h. Las células se lisaron y las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y se inmunotransfirieron con anticuerpos contra PARP-1, PAK2, NMT1 y NMT2 (geles compuestos).
La escisión de PARP-1 se produjo 2 h antes en las células tratadas con HMA 1 mM y anti-Fas en comparación con las células tratadas con miristato de sodio 1 mM y anti-Fas. También se observó una tendencia similar en las células expuestas a HMA/STS pero en menor medida que lo que se observó con anti-Fas, en presencia de células HMA/STS que presentaron más escisión de PARP-1 y PAK2 a las 2 h después de la incubación de apoptosis que las células tratadas con STS y miristato de sodio 1 mM (fig. 42). También se observó una estimulación similar de la escisión de NMT1 y NMT2. Esto indica que la inhibición de NMT acelera la inducción de la apoptosis en las células.
Ya que la inhibición de NMT potenció el inicio de la apoptosis, parece que las NMT desempeñan, en general, una función en favor de la supervivencia en las células.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de identificación de un sujeto, apto para el tratamiento con un inhibidor de la isozima N-miristoiltransferasa 1 (NMT1), comprendiendo dicho procedimiento: realizar un análisis en una muestra procesada obtenida de un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer para determinar si la muestra de dicho sujeto expresa NMT2;
en el que el tratamiento con dicho inhibidor de NMT1 está indicado cuando la cantidad de proteína NMT2 o de ácido nucleico en dicha muestra está ausente o es baja en comparación con un control, o cuando dicho cáncer es deficiente en NMT2;
en el que dicho cáncer es leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica en fase blástica, mieloma de células plasmáticas, adenocarcinoma intestinal, carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, carcinoma de células escamosas de esófago, cáncer de hueso, carcinoma ductal de mama, adenocarcinoma difuso de estómago, carcinoma medular de tiroides, carcinoma de células de transición del tracto urinario, mieloma, carcinoma de células claras de ovario, carcinoma de células de transición (cáncer de uréter y vejiga), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma-LLC, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago; y
en el que dicha muestra ha sido procesada por un tratamiento que comprende tratar dicha muestra con alquinilmiristato y destiobiotina azido-PEG biotina y dicho análisis comprende realizar un ensayo de unión que comprende poner en contacto la muestra procesada con un anticuerpo que se une a la proteína miristoilada, o proteínas miristoiladas marcadas con azido-biotina, dentro de la muestra para formar un complejo entre el anticuerpo y la proteína miristoilada presente en la muestra, generando dicho ensayo de unión al menos un perfil de miristoilación indicativo de dicho complejo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sujeto es un ser humano.
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