CN103826623A - 合成致死与癌症的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于治疗癌症的化合物、组合物和方法。还描述了用于鉴别患有适合用本文描述的化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法和用途。在本发明的一个方面，提供了治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的方法，包括：向所述受试者施用NMT抑制剂。

Description

合成致死与癌症的治疗
相关申请
本申请要求2011年7月22日提交的美国专利申请第61/510,686号的优先权，其全部内容通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明的领域总体涉及用于癌症治疗的化合物、组合物和方法。
背景技术
在加拿大，癌症是死亡的首要原因。加拿大癌症协会估计2011年将有约170000个癌症新案例，并且将有约75000人由于癌症死亡。
一种用于癌症治疗的新兴方法涉及合成致死的概念。两个基因（或者两个基因产物）如果任何一个单独突变不影响生存但是两者的突变导致死亡，那么为合成致死。换句话说，“合成致死”描述突变和药物（例如）一起引起癌细胞死亡的状况——所述突变或者所述药物均不导致细胞死亡。将合成致死基因（或基因产物）靶向癌症相关的突变应该仅仅杀死癌细胞并使正常细胞幸免。合成致死因此提供了抗癌特异剂的开发框架。
合成致死以治疗癌症的方法正在形成，但还不是常规方法，主要归因于对合成致死基因（和基因产物）缺乏识别。
蛋白的N-豆蔻酰化为其中豆蔻酸（14碳饱和脂肪酸）共价连接于各种各样的细胞、病毒和致癌蛋白（例如，致癌的Src相关的酪氨酸激酶、异源三聚体的Gα亚基等）的NH2末端甘氨酸的修饰。
细胞豆蔻酰化蛋白在信号传导和肿瘤形成中具有不同的生物学功能。通过豆蔻酰化修饰蛋白对于真核细胞中许多重要蛋白（包括对于细胞生长中重要的信号传导和调节功能所必需的那些）的亚细胞靶向、蛋白构象和生物学活性是必须的。Src家族（原癌基因）的酪氨酸激酶为其中最广泛研究的豆蔻酰化蛋白。
蛋白的豆蔻酰化由N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）催化。在真核细胞中NMT负责此活性，并且在通过甲硫氨酰氨基肽酶去除起始甲硫氨酸残基后通过修饰其多肽底物而起作用。这种修饰主要作为共翻译过程而发生，尽管豆蔻酰化也可在蛋白水解切割后翻译后发生，通常在凋亡期间。已经克隆了哺乳动物NMT酶的两种同工酶，并命名为NMT1和NMT2。NMT在细胞中起促生存的作用。所述两种NMT存在于所有正常细胞中。
仍然存在对用于癌症治疗的化合物、组合物和方法的需要。
提供该背景技术信息是为了展示申请人认为的可能与本发明相关的信息。并非预期承认，也不应当解释为前面的任何信息构成对抗本发明的现有技术。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了用于治疗患有癌症的受试者的化合物和组合物。还提供了用于鉴别患有适合于用本文所述化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法。
根据本发明的一个方面，提供了治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的方法，包括：向所述受试者施用NMT抑制剂。在具体的实施例中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。在一方面的实施例中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的实施例中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或者核酸。
在具体的方面，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646或它们的衍生物。在具体的方面，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
在本发明的另一个方面，所述方法进一步包括施用化学治疗剂。在具体的实施例中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
在本发明的另一个方面，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，包括：测量来自所述受试者的样品以确定所述样品是否为NMT2缺陷；以及当所述样品为NMT2缺陷时向所述受试者施用NMT抑制剂。在具体实施例中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。在具体的方面，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的方面，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或者核酸。
在具体的方面，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。在具体的方面，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
在本发明的另一个方面，所述方法进一步包括施用化学治疗剂。在具体的实施例中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
在另一个方面，所述样品的测量使用定量的荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量的免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定进行。
在本发明的另一个方面，提供了用于在关于治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者中治疗癌症的试剂盒，其包括：NMT抑制剂；以及使用其的说明书。在一个实施例中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。在具体的方面，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的方面，所述B细胞淋巴瘤为为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
在具体的方面，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。在具体的方面，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
在本发明的另一个方面，所述方法进一步包括施用化学治疗剂。在具体的实施例中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
在本发明的另一个方面，提供了NMT抑制剂用于治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的用途。在具体的实施例中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。在具体的方面，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的方面，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的实施例中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或者核酸。
在具体的实施例中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。在具体的方面，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
在本发明的另一个方面，所述方法进一步包括施用化学治疗剂。在具体的实施例中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
在本发明的另一个方面，提供了NMT抑制剂用于制备治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的药物的用途。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。在具体的方面，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的方面，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
在具体的方面，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。在具体的方面，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
在本发明的另一个方面，所述方法进一步包括施用化学治疗剂。在具体的实施例中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
在本发明的另一个方面，提供了NMT2作为受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的标志物的用途。
在本发明的另一个方面，提供了蛋白豆蔻酰化作为受试者中诊断、预后、分级或监测癌症中的一种或多种的标志物的用途。
在本发明的另一个方面，提供了蛋白酰化作为受试者中诊断、预后、分级或监测癌症中的一种或多种的标志物的用途。
在具体的方面，所述癌症为淋巴瘤。
在具体的方面，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在具体的方面，所述标志物使用选自免疫测定或核酸检测，或蛋白活性的测定进行测量。
附图说明
现在将参考附图仅以示例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1描绘了对一种类型的正常B细胞(L0)和不同B细胞淋巴瘤和T细胞白血病中NMT1和NMT2表达的免疫印迹分析；
图2为图示说明不同正常细胞和不同B细胞淋巴瘤和T细胞白血病对NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）的敏感性的曲线图；
图3为图示说明通过三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）抑制N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）的柱状图；以及
图4为描绘用抗NMT1和NMT2的抗体探测淋巴瘤细胞系的免疫印迹。
图5为显示与永生化的正常B淋巴细胞系相比，NMT抑制剂对Burkitt淋巴瘤细胞系的敏感性的线形图；以及
图6描绘了用pcDNA3.1-V5-NMT2转染拉莫斯B淋巴瘤细胞的结果，显示为相对于用空质粒载体转染的对照细胞2.5倍的增加的对TrisDBA(5ug/ml)的存活率，（图组A）显示细胞存活率而（图组B）显示免疫印迹。
在下面的详细描述中，粗体样式的数字用于标识相对于描绘本发明各种实施方案的附图所描述和提及的组成部件。应该注意的是，在描述本发明的各种实施方案中，相同的参考标号已被用于标识相同或相似的元件。而且，为了简便起见，部件已从所述附图的一些图中删掉。
具体描述
如将在下文更详细描述的，有本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的化合物、组合物和方法。也有本文所述的用于鉴别患有适合于用本文所述化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法。也有本文所述的用于鉴别患有癌症的受试者的方法。
本申请提供用于治疗NMT缺陷癌症的方法和组合物。NMT缺陷癌症包括NMT2或NMT1缺陷癌症。在具体的实施例中，所述NMT缺陷癌症为NMT2缺陷癌症。
如本文使用的，术语“癌症”指的是由细胞的不正常的、不受控制的生长引起的各种各样的病况。能够引起癌症的细胞（被称为“癌细胞”）具备表征性能诸如不受控制的增殖、永生化、转移潜能、快速的生长和增殖速率和/或某些典型的形态特征。癌细胞可以肿瘤的形式，但这样的细胞也可在受试者中单独存在，或可为非致瘤性癌细胞。癌症可以许多方式中的任一种进行检测，包括但不限于检测一种或多种肿瘤的存在（例如通过临床或放射学手段）、检查肿瘤中的或来自另一种生物样品（例如来自组织活检）的细胞、测量指示癌症的血液标志物以及检测指示癌症的基因型。然而，一种或多种上文检测方法中的阴性结果不一定表明癌症的不存在，例如，已经显示对癌症治疗的完全响应的患者可仍然具有癌症，如由后来的复发所证明的。
在本公开的具体实施例中，所述癌症为淋巴瘤。
如本文使用的术语“淋巴瘤”指的是B或T细胞在淋巴***中的恶性生长。“淋巴瘤”包括许多类型的恶性生长，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。如本文使用的术语“非霍奇金氏淋巴瘤”是指不是霍奇金氏淋巴瘤（其由例如癌区域衷Reed-Sternberg细胞的存在所表征）的、B或T细胞在淋巴***中的恶性生长。非霍奇金氏淋巴瘤包含超过29个类型的淋巴瘤，它们之间的区别基于癌细胞的类型。
在本公开的更具体的实施例中，所述癌症为B-淋巴瘤。
因此，在一个实施方案中，本公开的化合物、组合物和方法适合于治疗患有B细胞淋巴瘤的受试者。
B细胞淋巴瘤的实例包括但不限于，例如，滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症和MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤。同样预期儿科淋巴瘤诸如Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、前体B-LBL、前体T-LBL和间变性大细胞淋巴瘤的治疗。
如本文使用的，术语“受试者”指的是动物，并且可包括例如家养动物诸如猫、犬等，牲畜（例如牛、马、猪、绵羊、山羊等），实验性动物（例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等），哺乳动物，非人哺乳动物，灵长类，非人灵长类，啮齿动物，鸟类，爬行动物，两栖动物，鱼类和其它任何动物。在具体的实施例中，所述受试者为人类。
如本文使用的术语“治疗（treatment）”或“治疗（treat）”，指的是获得有益的或所期望的结果，包括临床结果。有益的或所期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况、减轻疾病的程度、稳定（即不恶化）疾病的状态、预防疾病的扩散、延迟或减慢疾病进行、改善或缓和疾病状态、减少疾病的复发以及缓解（部分或全部），无论是可检测的还是不可检测的。“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”也可意指与不接受治疗时的预期存活期相比延长的存活。如本文使用的“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”还包括预防性治疗。例如，患有早期癌症例如早期淋巴瘤的受试者可被治疗以预防进行，或者可选地缓解中的受试者可用本文描述的化合物或组合物治疗以预防复发。
本文显示，B细胞淋巴瘤细胞表达NMT1，但不表达NMT2。这与测试的表达NMT1和NMT2两者的白血病和其它细胞相反。（如图1和图4所示）
本文进一步显示，B淋巴瘤细胞对于通过NMT抑制剂抑制细胞生活力敏感。
在一个实施例中，所述NMT抑制剂为三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）（图2）。
在其它实施例中，所述NMT抑制剂2-羟基肉豆蔻酸（HMA）被用于抑制B淋巴瘤细胞。
在另一个实施例中，T.brucie NMT的吡唑磺胺抑制剂[J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728-723)](DDD85646)被用于抑制B淋巴瘤细胞（图5）。
在具体的实施例中，患有B淋巴瘤的受试者的治疗包括向所述受试者施用NMT抑制剂。
NMT抑制剂化合物或衍生物可在本发明中用于治疗NMT2缺陷癌症。
如本文使用的术语“缺陷”广泛地指例如NMT合成、水平、活性或功能的抑制、减少或消除（相对于野生型或对照样品），以及NMT蛋白（例如NMT1或NMT2）的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的抑制。该术语也指可调节NMT的合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节通路。该术语也包括由与其它分子结合和复合物形成造成的抑制、减少或消除。因此，术语“NMT缺陷”指的是其导致蛋白功能或蛋白通路功能的抑制、减少或消除。然而，该术语并不意味着这些功能的每一个必须同时被抑制。
在一些实施例中，癌症可通过测定NMT基因中突变的存在而被鉴别为NMT缺陷。这样的核酸检测和扩增的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，有待扩增的所述核酸可来自生物样品。多种提取方法（诸如苯酚和氯仿提取）适合于分离DNA或RNA。从样品中提取的核酸可使用本领域中众所周知的核酸扩增技术进行扩增。非限制性的实例包括链反应（PCR）、逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）、巢式PCR、连接酶链反应、可扩增的RNA报告子、Q-β复制、基于转录的扩增、自返式DNA扩增（boomerang DNA amplification）、链置换激活、循环探针技术、等温的基于核酸序列的扩增（NASBA）或者其它序列复制测定，或者也可使用信号扩增测定。
扩增方法在本领域中是众所周知的。一些方法利用RNA向cDNA的反转录。
在一个实施例中，使用PCR扩增感兴趣的靶序列，例如NMT2序列。
核酸可在检测前扩增或者可在扩增步骤期间直接检测，例如“实时的”方法。在一些实施方案中，使用标记引物扩增所述靶序列以便可检测地标记所产生的扩增子。在一些实施方案中，所述引物被荧光标记。在一些实施方案中，扩增所述靶序列并通过电泳检测所产生的扩增子。
基因表达的水平可通过评估样品中NMT2mRNA的量来确定。测量样品中mRNA的方法在本领域是已知的。为了测量mRNA水平，可裂解所述样品中的细胞并且所述裂解液中的或者从裂解液中纯化或半纯化的RNA中的mRNA水平可通过本领域技术人员所熟悉的任何一种方法测量。这样的方法包括但不限于使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定，例如RNA印迹法，或者使用合适的寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR法。可选地，定量或半定量的原位杂交测定可使用例如组织切片或者未裂解的细胞悬浮液和可检测标记的例如荧光或酶标记的DNA或RNA探针进行。用于定量mRNA的额外的方法包括RNA保护测定（“RPA”）、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析（“RDA”）、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析（“SAGE”）和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增("LMF")。
扩增也可使用“实时的”方法进行监测。实时PCR允许对核酸靶标的检测和定量。通常，这种定量PCR的方法利用荧光染料，其可为双链特异的染料，诸如SYBR Green.RTM.I。可选地，其它荧光染料例如FAM或HEX可结合到寡核苷酸探针或引物。能够进行实时PCR的各种仪器在本领域中是已知的。在PCR的每个循环产生的荧光信号与PCR产物的量成正比。荧光对循环数的曲线图（plot）用于描述扩增的动力学，并且荧光阈值水平用于定义与初始模板浓度有关的分数（fractional）循环数。当进行扩增并在热循环期间在能够读出荧光的仪器上进行检测时，可使用熔点分析将预期的PCR产物从非特异PCR产物中区分开。通过测量荧光的变化同时逐渐增加扩增和信号产生之后的反应温度，有可能测定预期产物的（ΔCt）和非特异产物的ΔCt。
所述方法可包括在样品中扩增多个核酸，也称为“多重检测”或“多重化（multiplexing）”。如本文使用的，术语“多重PCR”是指涉及为了检测和定量多个核酸（包括来自一种或多种靶基因标志物的核酸）而向所述反应加入多于一套的PCR引物的PCR。此外，用内部对照例如18s rRNA、GADPH或β-actin的多重化提供了无需反应的用于PCR的对照。
在一些实施例中，癌症可通过测定NMT基因的表观失活或蛋白功能的丧失而被鉴别为NMT缺陷。
在一些实施例中，癌症可通过测定来自受试者的细胞样品中的NMT（包括NMT1或NMT2）的活性而被鉴别为NMT缺陷。活性可相对于对照，例如在癌细胞缺乏的情况下，相对于非癌性细胞进行测定，优选来自相同组织。因此，NMT缺陷的癌症可具有降低的或消除的NMT活性和/或表达。NMT的活性可使用本领域中所熟知的技术进行测定。在这些实施例中，NMT缺陷的癌症具有降低的或消除的活性。
在一些实施例中，癌症可通过测定NMT蛋白的量、浓度和/或水平而被鉴别为NMT缺陷。
在一些实施例中，癌症可通过测定来自患癌或者疑似患癌受试者的生物样品中的豆蔻酰化蛋白的量而被鉴别为NMT缺陷。在本实施例中,豆蔻酰化蛋白的存在、不存在或量可例如用使用合适的脂肪酸类似物的点击化学测定。本文在材料和方法中描述了非限制性的方法。测定豆蔻酰化蛋白的存在、不存在或量的替代性方法将为本领域技术人员所已知。样品中有减少量的豆蔻酰化蛋白（可选地相对于参照）的样品指示NMT缺陷样品，或者NMT缺陷癌症。
在一些实施例中，癌症可通过测定来自患癌或疑似患癌的受试者的生物样品中的蛋白酰化的量的量而被鉴定为NMT缺陷。在本实施例中，蛋白酰化的存在、不存在或量可被测定。这样的方法将为本领域技术人员所已知。样品中有减少量的蛋白酰化（可选地相对于参照）的样品指示NMT缺陷样品，或者NMT缺陷癌症。
在一些实施例中，癌症可通过测定一种或多种序列变异诸如可包括相对于野生型核苷酸序列的一种或多种核苷酸的缺失、***或取代的突变和多态性的存在而被鉴别为NMT缺陷。所述一种或多种变异可在核酸序列的编码或非编码区中并且可减少或消除NMT的表达或功能。因此，变体核酸可编码具有减小的或消除的活性的变体多肽，或者可编码例如因调节元件的改变的活性在细胞内很少或没有表达的野生型多肽。
多种方法可用于在从受试者获得的样品中测定特定核酸序列的存在或不存在。
在一些实施例中，癌症可通过评估所述NMT通路的组成部分的NMT的正的或负的调节子的表达或活性水平而被鉴别为NMT缺陷。表达水平例如可通过免疫测定（诸如免疫印迹和ELISA）以及核酸检测方法（诸如RT-PCR、nanostring技术、RNA测序、核酸杂交或者核型分析）进行测定。
在一些实施例中，癌症可通过测定来自所述个体的细胞样品中的一个或多个变异例如NMT的多态性或突变的存在而被鉴别为NMT缺陷。
与癌症相关的突变和多态性也可通过检测变体（即突变体或等位基因变体）多肽的存在而在蛋白水平进行检测。
在另一个实施例中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌症包括NMT2缺陷的癌细胞，所述方法包括向所述受试者施用NMT抑制剂和/或NMT1抑制剂。
如本文使用的术语“抑制”或“抑制剂”指的是抑制蛋白合成、水平、活性或功能的任何方法或技术，以及抑制感兴趣蛋白例如NMT2的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的方法。该术语也指可调节感兴趣蛋白的合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节通路。该术语包括与其它分子结合和复合物形成。因此，术语“抑制剂”指的是其应用导致对蛋白功能或蛋白通路功能的抑制的任何剂或化合物。然而，该术语并不意味着这些功能的每一个必须同时被抑制。
在另一个实施例中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌症包括NMT1缺陷的癌细胞，所述方法包括向所述受试者施用NMT抑制剂和/或NMT2抑制剂。
在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述化合物并且可选地由单一施用组成，或者可选地包括一系列应用。在具体的实施例中，所述化合物为NMT抑制剂、NMT1抑制剂和/或NMT2抑制剂。
在更具体的实施例中，所述NMT抑制剂为Tris-DBA、HMA、DDD85646或它们的衍生物。
在其他的实施例中，所述化合物和/或组合物以适合于向受试者施用的药学上有效的量提供。
如本文使用的术语“药学上有效的量”是指由研究者或临床医生所探索的将引起组织、全身、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂的量。这个量可为治疗上有效的量。
所述化合物和组合物以药学上可接受的形式提供。
如本文使用的术语“药学上可接受的”包括适合于与受试者的组织接触使用而无过量毒性、刺激、***反应或其它问题或并发症的、与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。从与所述制剂的其它成分相容的意义上说，各个载体、赋形剂等也为“可接受的”。
所施用的实际量，以及施用的速率和时程将取决于被治疗的疾病性质和严重程度。治疗的药方（例如剂量的决定等）在全科医生和其它医生的职责之内，并且通常考虑到有待治疗的病症、个别患者的病况、递送的位置、施用的方法和从业者已知的其他因素。
化合物或组合物可单独施用或与其它治疗同时或相继组合施用，取决于有待治疗的病况。
所述制剂可方便地以单位剂型存在并可由药剂学领域中所熟知的任何方法制备。这样的方法包括使活性化合物与载体结合的步骤，其可构成一个或多个助剂成分。通常，所述制剂通过使所述活性化合物与液体载体或者细碎的固体载体或两者均匀且密切地结合来制备，并且之后如果必要的话使产品成形。
所述化合物和组合物可通过任何方便的施用途径向受试者施用，无论是全身地/***地还是在期望作用的部位，包括但不限于口服施用（例如通过摄食）；局部施用（包括例如经皮、鼻内、眼睛、口腔和舌下）；肺部施用（例如通过使用例如喷雾，例如通过口或鼻子，的吸入或吹入疗法，）；直肠施用；***施用；肠胃外施用，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过储库植入物/例如皮下或肌内。
适合于口服施用（例如，通过摄食）的制剂可以以离散单元诸如胶囊、扁囊剂或片剂存在，每个包含预定量的活性化合物；以粉末或颗粒剂存在；以水性或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或者以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂存在；以推注剂存在；以冲剂存在；或者以糊剂存在。
适合于肠胃外施用（例如，通过注射，包括皮肤、皮下、肌肉内、静脉内和皮内）的制剂，包括水性和非水性等渗的、无热原的、无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和致使所述制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及设计用来将所述化合物靶向血液组分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒***。用于这样的制剂的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或者乳酸盐林格氏溶液。
所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密闭容器（例如安瓶和小瓶）中，并且可在冷冻干燥（冻干）条件储存，仅需要在使用前即时加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。制剂可为设计用来将所述活性化合物靶向血液组分或者一个或多个器官的脂质体或其它微粒***的形式。
包含本文公开的化合物的组合物可与标准化疗方案组合或与放射疗法结合用于本文所述方法中。
在患者为淋巴瘤的情况下，已知治疗取决于所治疗的受试者、疾病的类型和其阶段。对于淋巴瘤的现有治疗模式为本领域技术人员所已知。因此，已知治疗可与本文公开的NMT抑制剂一起使用。
用于治疗淋巴瘤的一般的药物组合包括但不限于CHOP(即，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)，GAP-BOP(即，环磷酰胺、阿霉素、甲基苄肼、博来霉素、长春新碱和强的松)，m-BACOD(即，甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、***和亚叶酸)，ProMACE-MOPP(即，强的松、甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸以及标准MOPP)，ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖孢苷、博来霉素、长春新碱、甲氨蝶呤和亚叶酸)和MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素和亚叶酸)。对于复发性侵袭性非霍奇金淋巴瘤，以下化疗药物组合可与本文所述化合物和组合物一起使用：1MVP-16(即，异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，MIME(即，甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，DHAP(即，***、-16高剂量阿糖孢苷和顺铂)，ESHAP(即，依托泊苷、甲***、高剂量阿糖孢苷和顺铂)，CEFF(B)(即，环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松和博来霉素)和CAMP(即，环己亚硝脲、米托蒽醌、阿糖孢苷和强的松)。
用于某些淋巴瘤诸如用于复发性、耐药性霍奇金氏病的补救性化疗的治疗包括但不限于VABCD（即，长春花碱、阿霉素、达卡巴嗪、环己亚硝脲和博来霉素）、ABDIC（即，阿霉素、博来霉素、达卡巴嗪、环己亚硝脲和强的松）、CBVD（即，环己亚硝脲、博来霉素、长春花碱、***）、PCVP（即，长春花碱、甲基苄肼、环磷酰胺和强的松）、CEP（即，环己亚硝脲、依托泊苷和泼尼莫司汀）、EVA（即，依托泊苷、长春花碱和阿霉素）、MOPLACE（即，环磷酰胺、依托泊苷、强的松、甲氨蝶呤、cytaravine和长春新碱）、MIME（即，甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷）、MINE（即，丙脒腙、异环磷酰胺、长春瑞滨和依托泊苷）、MTX-CHOP（即，甲氨蝶呤和CHOP）、CEM（即，环己亚硝脲、依托泊苷和甲氨蝶呤）、CEVD（即，环己亚硝脲、依托泊苷、长春地辛和***）、CAVP（即，环己亚硝脲、美法仑、依托泊苷和强的松）、EVAP（即，依托泊苷、长春花碱、阿糖孢苷和顺铂）和EPOCH（即，依托泊苷、长春新碱、阿霉素、环磷酰胺和强的松）。
可以理解的是，抑制NMT1或NMT2的替代方法可在用于癌症治疗特别是B细胞淋巴瘤治疗的合成致死策略中使用。例如，NMT1或NMT2的表达可使用反义或RNAi技术抑制。下调基因表达和/或蛋白活性的这些方法的使用对于本领域技术人员来说是已知的。
在本公开内容的另一个实施方案中，提供了用于测定患者的NMT2抑制剂和/或NMT1抑制剂治疗的益处的方法。
在一个实施例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的NMT1和/或NMT2的存在或不存在、或量或浓度。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的豆蔻酰化蛋白的存在或不存在、或量或浓度。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的酰化蛋白的存在或不存在、或量或浓度。
如本文使用的术语“样品”指的是来自受试者的任何样品，包括但不限于包含癌细胞或者疑似含有癌细胞的流体、细胞或组织样品，其可用于基因表达水平、蛋白水平、酶活性水平等的测定。所述样品例如可包括血液样品、分级的血液样品、骨髓样品、活检、冷冻的组织样品、新鲜的组织样本、细胞样品和/或石蜡包埋的切片、RNA可以以允许相对mRNA水平测量的足够的量与足够的质量从中提取的材料或者多肽可以以允许相对多肽水平测量的足够的量与足够的质量从中提取的材料。
NMT1或NMT2、或者NMT1和/或NMT2的存在或不存在的测定、分析或测量可与患者癌症的NMT1抑制剂或NMT2抑制剂治疗的益处相关联。
豆蔻酰化蛋白或者豆蔻酰化蛋白的存在或不存在的测定、分析或测量可与患者癌症的NMT1抑制剂或NMT2抑制剂治疗的益处相关联。
在具体的实施例中，本发明的抗体对于感兴趣的蛋白为免疫反应性或免疫特异性的，并因此特异性地或选择性地结合感兴趣的蛋白，例如蛋白NMT1或NMT2。在一个实施例中，可使用对人NMT1或NMT2为免疫反应性和免疫特异性的抗体。人NMT1或NMT2的抗体优选免疫特异性的。术语“抗体（antibody）”和“抗体（antibodies）”包括但不限于单克隆抗体和多克隆抗体。
在另一个实施例中，本发明的抗体对于NMT1蛋白和NMT2蛋白两者为免疫反应性或免疫特异性的，并因此特异性地和选择性地结合NM1蛋白和NMT2蛋白两者。在该实施例中，可使用对人NMT1蛋白和NMT2蛋白两者为免疫反应性和免疫特异性的抗体。人NMT1和NMT2的抗体优选免疫特异性的。在该实施例中，由于NMT1和NMT2的不同的分子量，因此能够使用例如SDS-PAGE和免疫印迹、使用单个抗体鉴别两种蛋白的存在或不存在。术语“抗体（antibody）”和“抗体（antibodies）”包括但不限于单克隆抗体和多克隆抗体。
术语“特异性结合”指的是抗体对于特异性多肽例如NMT1或NMT2的表位的高亲和力和/或高亲和性结合。与该特异性多肽上的它的表位的抗体结合比相同的抗体与其它任何表位（尤其是可在与感兴趣的特异性多肽相关联的分子中或者与感兴趣的特异性多肽相同的样品中存在的那些）的结合更强。特异性结合感兴趣的多肽的抗体可能能够以弱的但是可检测的水平结合其它多肽。这种弱的结合或者背景结合可容易地从与所述化合物或感兴趣的多肽的抗体结合辨别，例如通过使用适当的参照，如本领域技术人员应当知道的。
在一个实施例中，包含癌性细胞或者疑似包含癌性细胞的样品从患有癌症的受试者获得。这样的样品的收集为本领域技术人员所熟知。在具体的实施例中，所述样品为血液样品。获得样品、加工和/或储存这样的样品的方法也是本领域技术人员所熟知的。
在具体的实施例中，样品中的NMT1或NMT2蛋白的检测、分析或测量使用免疫组化法进行。本领域技术人员应当清楚，其它免疫测定，定性或定量的，均可用于本发明。
可在NMT1或NMT2的检测、分析或测量中使用的其它实例包括但不限于来自获自所述受试者的样品的免疫印迹、ELISA、间接免疫荧光、多重微珠技术、免疫沉淀和质谱法。在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或者缺乏的NMT2染色的实例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症的受试者的生物样品中的NMT1的活性和/或NMT2蛋白的活性，以确定NMT1和/或NMT2活性的存在或不存在或量。在该实施例中，使用NMT1或NMT2的底物（天然的或合成的）被用于鉴别其中NMT1或NMT2活性存在、不存在或其量的样品。
在实践中，在其中受试者样品被测定为NMT2缺陷的实施例中，所述受试者被认为是施用NMT抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或缺乏的NMT2活性的实施例中，所述受试者被认为是施用NMT抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或缺乏量的豆蔻酰化蛋白的实施例中，所述受试者被认为是施用NMT抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中受试者样品被测定为具有低的或缺乏量的酰化蛋白的实施例中，所述受试者被认为是施用NMT抑制剂的良好的候选者。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括在来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品中鉴别NMT1或NMT2基因的突变、缺失等等。其中，所述的NMT1或NMT2基因的突变、缺失等等导致所述样品中的癌细胞中NMT1或NMT2蛋白活性的减少损失。鉴别这样的NMT1或NMT2突变、缺失等等的方法是本领域技术人员所已知的，并且包括但不限于RFLP、RT-PCT、微阵列分析和/或任何合适类型的DNA测序。在实践中，在其中患者样品被测定为具有NMT2中导致低的或缺乏的NMT2蛋白活性的突变、缺失等等的实施例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括在来自患有癌症或疑似患有癌症的受试者的样品中鉴别NMT1或NMT2mRNA的突变、缺失等等。其中，所述的NMT1或NMT2mRNA的突变、缺失等等导致所述样品中的癌细胞中NMT1或NMT2蛋白活性的减少损失。鉴别NMT1或NMT2mRNA中这样的突变、缺失等等的方法是本领域技术人员所已知的，并且包括但不限于RNA印迹法、RT-PCR、微阵列分析和/或任何合适类型的mRNA测序。在实践中，在其中患者样品被测定为具有NMT2mRNA中导致低的或缺乏的NMT2蛋白活性的突变、缺失等等的实施例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在另一个实施例中，本公开内容的方法，提供了用于治疗患有与NMT1或NMT2缺陷有关的癌症的受试者的方法，包括向所述受试者施用NMT的抑制剂。
抑制剂的实例包括但不限于小分子、抗体、肽片段和/或核酸分子。
小分子的具体实例包括Tris-DBA、HMA、DDD85646和它们的衍生物。如本文使用的术语“衍生物”包括但不限于盐类、配合物、酯类诸如体内可水解的酯类、游离酸或碱、水合物、前药或脂类、偶联伴侣（coupling partners）。
肽片段可全部或部分地通过化学合成NMT1的活性位点来制备。肽片段可根据已建立的、标准的液相或固相肽合成方法制备，其为本领域技术人员所已知。
核酸抑制剂或其互补体通过下调活性多肽的产生来抑制活性或功能。这可使用本领域技术人员所熟知的常规方法来监测，例如通过使用如实施例中所述实时PCR的筛选。
核酸抑制剂的实例包括反义或RNAi技术，其下调基因表达的用途在本领域中是得到确认的。可以设计反义寡核苷酸与核酸、前体mRNA（pre-mRNA）或成熟mRNA的互补序列杂交，干扰碱基切除修复途径组分的产生，从而降低或完全或基本完全阻止其表达。除了靶向编码序列，反义技术还可用于靶向基因的控制序列，例如5’旁侧序列，由此所述反义寡核苷酸可以干扰表达控制序列。
反义的可替代的选择是使用有义，也就是说与靶基因相同的方向，***的靶基因的全部或部分的拷贝，以通过共抑制实现靶基因表达的降低。
此外，可使用双链RNA（dsRNA）沉默。dsRNA介导的沉默为基因特异性的，并且常被称为RNA干扰（RNAi）。
在另一个实施例中，使用在转录中产生核酶的核酸，所述核酶能够在特异性位点切割核酸，并因此也可用于影响NMT。
在还有另一个实施例中，可利用小RNA分子调控基因表达。这些包括通过小分子干扰RNA（siRNA）的mRNA的靶向降解、转录后基因沉默（PTG）、通过微小RNA（miRNA）的发育调控的序列特异性转录抑制以及靶向转录基因沉默。
在还有另一个实施例中，可使用细胞中的短发卡RNA分子（shRNA）的表达。shRNA由通过小环序列隔开的短的反向重复序列组成。一个反向重复序列与所述基因靶标互补。在细胞中，所述shRNA通过DICER加工为siRNA，其降解靶基因NMT的mRNA并抑制表达。在优选的实施方案中，所述shRNA通过从载体转录而内源（在细胞内）产生。
NMT1或NMT2的缺陷为NMT1或NMT2缺陷表型，其可为NMT1或NMT2介导的通路的组分的缺陷，即相对于参照细胞，所述通路的组分活性的表达可在癌细胞中降低或消失。在一些实施方案中，所述癌细胞可为NMT1或NMT2缺陷，即相对于参照细胞，NMT1或NMT2在癌细胞中的活性表达可降低或消失。
因此，提供了NMT2作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。在一些实施例中，NMT2使用选自免疫测定或核酸检测或蛋白活性的测定进行所述测量。
还提供了蛋白豆蔻酰化作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。
还提供了蛋白酰化作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。
在一些实施例中，所述癌症为淋巴瘤。在更具体的实施例中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的实施例中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
本发明的方法通过以试剂盒的形式提供在该方法中使用的化合物和/或组合物而方便地实行。这些的试剂盒优选包含所述组合物。这样的试剂盒优选包含使用其的说明书。
为了更好地理解本文所描述的本发明，提出以下实施例。应当理解，这些实施例仅用于说明目的。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在以下实施例中，采用标准的方法，如本领域技术人员可以理解的。
材料和方法
抗体和试剂
三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris dibutylbenzinylidene acetone paladium）（TrisDBA）为Arbiser博士(U.Alabama)所惠赠。DDD85646按[J.A.Frearson etal(2010)Nature.464.728-723)]描述的进行合成并获自David Gray和Paul Wyatt博士（Dundee University）。
小鼠抗NMT1抗体（克隆14;1:1000）和小鼠抗NMT2抗体（克隆30;1:2000）购自BD生物科学公司，圣何塞，CA，USA。兔抗NMT l(多克隆，1:3000)购自Proteintech,Chicago,IL,USA。兔抗GFP抗体（1:20,000）、抗PARP-1抗体（1:5000）、抗GAPDH抗体（1:5000）和抗C末端PAK2抗体（1:2000）来自Eusera(www.eusera.com)，埃德蒙顿，AB，加拿大。小鼠抗α-微管蛋白抗体（1:15,000）和兔抗V5抗体（1:10,000）购自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA。小鼠抗His抗体（1:2000）来自Qiagen，德国。兔抗剪切的半胱天冬酶-8抗体（1:1000）和抗剪切的半胱天冬酶-3抗体（1:1000）均来自Cell Signaling，丹佛斯，MA，USA。增强化学发光（ECL）Plus和ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂盒购自GE医疗，匹兹堡，PA，USA。除非另有说明，所使用的所有化学品均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO,USA)，并且为可获得的最高纯度。
DNA构建体。V5-和His-标记的NMT1和NMT2构建体的工程化。与Gateway克隆***(Life Technologies，格兰德岛，N.Y.，USA)相容的NMT1和NMT2入门载体购自Genecopoeia(罗克维尔市,MD,USA)。根据制造商的说明，使用LR clonase酶(Life Technologies)将所述NMT1和NMT2基因并入目标载体pcDNA3.1/nV5DEST(Life Technologies)以产生N末端标记的NMT质粒(His-NMT1、His-NMT2、V5-NMT1和V5-NMT2)。V5标记的NMT构建体用于哺乳动物细胞表达，而His-NMT构建体用于细菌表达。所述克隆产物通过DNA测序(Eurofins MWG Operon，亨茨维尔，AL，USA)进行证实。
细胞培养。B细胞的来源为Jim Stone博士所惠赠或者获自ATCC。细胞培养的所有试剂均购自Invitrogen。将B细胞在潮湿的培养箱中于37℃和5%CO2下进行培养并在补充10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基中维持。
细胞裂解。将细胞在冷PBS中洗涤，在0.1%SDS-RIPA缓冲液[50mM Tris、150mM NaCl、1%Igepal CA-630、0.5%NaDC、2mM MgCl2和l×完全蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)；pH8.0]中裂解并在4℃震动15min。在4℃、16,000g离心后，获得细胞裂解物上清液。
凋亡的诱导。除非另有提及，为了抑制蛋白翻译并增强凋亡诱导，使用2.5μΜ十字孢碱(STS)(Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,USA)和5μg/mL环己酰亚胺(ICN Biochemicals Inc.奥罗拉,OH,USA)诱导凋亡。
与NMT抑制剂的孵育。三(二亚苄基丙酮)二钯（TrisDBA）为Arbiser博士所惠赠。将细胞以越来越高的浓度与TrisDBA（或者DMSO用于对照）孵育24小时或者与DDD85646孵育24小时和48小时。
B细胞转染。按照制造商的说明以及优化适于100tips的Ramos B细胞转染的方案(脉冲电压1,300V；脉冲宽度20ms，2个脉冲以及7.7.106个细胞/mL)，使用Neon转染***（Life technologies）转染B细胞。经典地，进行两种转染以获得足以进行活性测定的活细胞。
细胞生活力测定。B细胞和T细胞生活力使用台盼蓝排除法进行测量。细胞在保证最小基础凋亡的融合状态（最多2×106个细胞/mL）下生长。在与NMT抑制剂一起孵育后，将大约20000个细胞(10μl)与10μl的TC10TM台盼蓝染料(Biorad)一起孵育15分钟。使用TC10TM自动细胞计数器(Biorad)定量细胞生活力。
体外NMT活性测定。N-肉豆蔻酰基转移酶活性测定程序改自Raju,R.V.,and Sharma,R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:proteinN-myristoyltransferase.Methods Mol Biol116,193-211。如先前由Towler,D.,andGlaser,L.(1986)Protein fatty acid acylation:enzymatic synthesis of anN-myristoylglycyl peptide.Proc Natl Acad Sci U S A83,2812-2816所描述的，为每一次实验新鲜合成[3H]肉豆蔻酰基-CoA。简单地说，将细胞重悬在0.25M的蔗糖缓冲液(50mM NaH2P04,pH7.4)中，并使其在布兰森超声波发生器（BransonSonicator）上经历2个循环6.0级的超声。反应混合物由在NMT活性缓冲液(0.26M Tris-HCl、3.25mM EGTA、2.92mM EDTA和29.25mM2-巯基乙醇、1%Triton X-100,pH7.4)中孵育的10μl细胞提取物(约20μg的蛋白)和与截短的Bid的N末端序列一致的可豆蔻酰化或不可豆蔻酰化的十肽(0.1mM溶于水中)组成。反应通过加入7.4μl（≈10pMol）新鲜合成的[3H]肉豆蔻酰基-CoA（最终的混合物体积=25μl）而起始，并在30℃孵育15min。所述反应通过将15μl反应混合物点在P81磷酸纤维素纸盘(Whatman,Kent,UK)上并干燥30秒而停止。洗涤纸盘（洗涤缓冲液：25mM Tris缓冲液，pH7.4）以去除残余的放射性([3H]-肉豆蔻酸和[3H]-肉豆蔻酰基-CoA)而将[3H]-肉豆蔻酰基-肽留在了所述磷酸纤维素纸上。通过液体闪烁计数定量放射性并将其转换为pMol的肉豆蔻酰化肽(Raju,R.V.,and Sharma,R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:proteinN-myristoyltransferase.Methods Mol Biol116,193-211)。
RT-PCR。使用18S探针作为内部对照，用Taqman NMTl和NMT2探针进行qRT-PCR。循环次数的差异（Δct）通过从NMT循环次数（在再一次看到信号指数增长的点）减去我们看到各种细胞类型的18S内部对照表达呈指数增长的循环次数（ct）来计算。
实施例1
图1描绘了在正常细胞和各种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病中的NMT1和NMT2表达的分析。该图显示了B淋巴瘤细胞系(BL-2,Ramos)中几乎完全不存在的NMT2表达，与正常B细胞(EBV转化的人B淋巴细胞，L0)和人白血病T细胞系(Jurkat,MOLT-4,CEM)相比，所述B淋巴瘤细胞系(BL-2,Ramos)仅表达NMT1。
尽管不希望被理论所束缚，仍认为仅表达一种NMT同工酶的那些细胞，例如显示几乎完全不存在NMT2的Burkitt淋巴瘤细胞，有可能具有改变了的肉豆蔻酰化蛋白概况。
样品中有减少量的肉豆蔻酰化蛋白（可选地相对于对照）的样品指示NMT缺陷样品或者NMT缺陷癌症。这种NMT缺陷的癌症适合于用NMT的抑制剂的治疗。
实施例2
图2为描绘了各种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病对NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）的敏感性。各种B细胞和T细胞与越来越高浓度的Tris DBA孵育24h。使用台盼蓝排除法测量细胞存活率并将对照的细胞存活率调整至100%。通过台盼蓝排除法测量的细胞生存曲线显示，B细胞淋巴瘤对于所述NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）更敏感。
实施例3
图3描绘了通过三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）的N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）的抑制。
NMT活性使用用纯化的重组NMT1和NMT2的肽豆蔻酰化测定进行测定。NMT活性由在磷酸纤维素纸上产生和检测的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算出(改自King et al.1991,Anal Biochem.)。
该图显示，使用纯化的重组NMT酶，三(二亚苄基丙酮)二钯（Tris-DBA）可体外抑制NMT。
实施例4
图4描绘了其中淋巴瘤细胞系用抗NMT1(图组A)和NMT2(图组B)的抗体进行探测的免疫印迹结果。图4的说明对应如下：IM9:B淋巴母细胞；BL2:Burkitt淋巴瘤；CEM:T细胞白血病；Karpas299:T细胞淋巴瘤；Sup-M2:ALCL;UCONN:ALCL(ALCL:间变性大细胞淋巴瘤)；DAUDI:Burkitt淋巴瘤；Ramos:Burkitt淋巴瘤BJAB:Burkitt淋巴瘤；HD-MYZ:霍奇金淋巴瘤；KM-H2:霍奇金淋巴瘤；L428:霍奇金淋巴瘤；Jurkat:T细胞白血病。
实施例5
图5描绘了与永生化的正常B淋巴细胞系（IM9）相比，在不同的浓度，在48小时后，NMT抑制剂对Burkitt淋巴瘤细胞系拉莫斯的效力。
实施例6
在该实施例中，用pcDNA3.1-V5-NMT2转染的拉莫斯B淋巴瘤细胞（其如本文所示，表达NMT1）使得对TrisDBA(5ug/ml)的存活率相对于用空的质粒载体转染的对照细胞增加了2.5倍。在图6中，使用Neon转染***(Invitrogen)，按照对于拉莫斯细胞系所推荐的程序(1,350Volt,30ms)，将20×106个拉莫斯B淋巴瘤细胞用32μg的DNA(pcDNA3.1-V5-空白或pcDNA3.1-V5-NMT2)进行转染。将转染细胞在1200rpm离心5分钟以去除死细胞和细胞碎片。允许上清液中的细胞在完全RPMI中恢复6小时。PBS洗涤后，细胞重悬并在含TrisDBA(5ug/ml)的RPMI中生长24小时，然后使用所述台盼蓝排除法进行计数（图组A）。将细胞裂解并用抗NMT2的抗体以及作为上样对照的GAPDH的抗体进行蛋白免疫印迹（ECL）以证实表达NMT2（图组B）。
实施例7
在该实施例中，使用18S探针作为内部对照，用Taqman NMT1和NMT2探针进行qRT-PCR。循环次数的差异（Δct）通过从NMT循环次数（在再一次看到信号指数增长的点）减去我们看到各种细胞类型的18S内部对照表达呈指数增长的循环次数（ct）计算出。如下文的表1所示，在B淋巴瘤细胞系中NMT2表达与NMT1表达的比值下降（多达60倍）。尽管不希望被理论所束缚，仍认为这些结果可表明，编码NMT2的mRNA的减少可能是由蛋白免疫印迹所评估的NMT2蛋白水平下降的原因。
表1
Figure BDA0000480993460000231
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属技术领域的技术人员的技术水平，并且通过引用以相同的程度并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
本发明进行了这样的描述，很明显本发明可以在许多方面进行改变。这些改变不被视为脱离本发明的精神和范围，并且所有这些本领域技术人员看来显而易见的修改都包含在下列权利要求书的范围之内。

Claims (68)

1.一种治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的方法，包括：向所述受试者施用NMT抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述癌症为淋巴瘤。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者为人类受试者。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括施用化学治疗剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
13.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括：
a.测量来自所述受试者的样品以确定所述样品是否为NMT2缺陷；以及
b.当所述样品为NMT2缺陷时向所述受试者施用NMT抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述癌症为淋巴瘤。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
18.如权利要求14所述的方法，其中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
22.如权利要求13所述的方法，其中，所述受试者为人类受试者。
23.如权利要求13所述的方法，进一步包括施用化学治疗剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
25.如权利要求13所述的方法，其中，所述样品的测量使用定量的荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量的免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定进行。
26.一种在关于治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者中治疗癌症的试剂盒，包括：NMT抑制剂；以及使用其的说明书。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述癌症为淋巴瘤。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
31.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或者核酸。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。
33.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
34.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
35.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述受试者为人类受试者。
36.如权利要求26所述的试剂盒，进一步包括化学治疗剂。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
38.NMT抑制剂用于治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的用途。
39.如权利要求38所述的用途，其中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
40.如权利要求38所述的用途，其中，所述癌症为淋巴瘤。
41.如权利要求40所述的用途，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
42.如权利要求41所述的用途，其中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
43.如权利要求38所述的用途，其中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
44.如权利要求43所述的用途，其中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。
45.如权利要求43所述的用途，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
46.如权利要求43所述的用途，其中，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
47.如权利要求38所述的用途，其中，所述受试者为人类受试者。
48.如权利要求38所述的用途，进一步包括施用化学治疗剂。
49.如权利要求48所述的用途，其中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
50.NMT抑制剂用于制备治疗患有NMT2缺陷癌症的受试者的药物的用途。
51.如权利要求50所述的用途，其中，所述NMT抑制剂为NMT1抑制剂。
52.如权利要求50所述的用途，其中，所述癌症为淋巴瘤。
53.如权利要求52所述的用途，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
54.如权利要求53所述的用途，其中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
55.如权利要求50所述的用途，其中，所述NMT抑制剂为小分子、抗体、肽片段或核酸。
56.如权利要求55所述的用途，其中，所述小分子为Tris-DBA、HMA或DDD85646，或它们的衍生物。
57.如权利要求55所述的用途，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
58.如权利要求55所述的用途，其中，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核糖酶、shRNA分子或siRNA分子。
59.如权利要求50所述的用途，其中，所述受试者为人类受试者。
60.如权利要求50所述的用途，进一步包括施用化学治疗剂。
61.如权利要求60所述的用途，其中，所述化学治疗剂为CHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAP或者EPOCH。
62.NMT2作为受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的标志物的用途。
63.蛋白豆蔻酰化作为受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的标志物的用途。
64.蛋白酰化作为受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的标志物的用途。
65.如权利要求62、63或64所述的用途，其中所述癌症为淋巴瘤。
66.如权利要求64所述的用途，其中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
67.如权利要求66所述的用途，B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
68.如权利要求62所述的用途，其中，所述标志物使用选自免疫测定或核酸检测，或蛋白活性的测定进行测量。
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