JPWO2007026960A1 - Ｍｏｃｓ３遺伝子の治療的又は診断的用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＭＯＣＳ３タンパク質の発現阻害物質または活性阻害物質を含有するがん治療剤；そのような治療剤の有効成分として使用し得る化合物のスクリーニング方法；ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体；その抗体などを用いるがん診断剤・がん診断方法などを提供する。
Description
本発明は、がんにおいて特異的に増幅している遺伝子であるＭＯＣＳ３遺伝子、その治療的又は診断的用途などに関する。
悪性腫瘍（がん）の特徴として、増殖・浸潤・転移を経て全身化することによる致死があげられる。外科的な切除または放射線治療のような局所療法では、転移性再発がんに対して十分な対処はできず、全身療法である薬物療法の発展が、今後のがん治療成績の向上に期待されている。
がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、直接がん細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡに作用し、細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用いる場合が多いが、がん細胞以外の、例えば、骨髄細胞、生殖細胞、毛母細胞、消化管上皮細胞など***がさかんな正常細胞に対しても作用し、強い副作用をもたらしていた。一方、近年の分子細胞生物学の進歩により、がん細胞の浸潤・増殖・転移などにかかわるメカニズムが解明され、そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子標的薬の開発が注目されている。代表例として、非小細胞肺がんの治療に効果のある、ＥＧＦＲ（上皮成長因子 受容体）チロシンキナーゼ阻害剤であるイレッサ（一般名：ゲフィチニブ）（ＷＯ９６／３３９８０）、乳がんの治療に効果のある、ＨＥＲ−２（ヒト上皮成長因子受容体２）のヒト化モノクローナル抗体のハーセプチン（一般名：トラスツズマブ）（ＷＯ９４／００１３６）などがあげられる。しかしながら、現状では未だ有効な分子標的薬は少なく、今後更なる各がん種に対する有効な分子標的薬の開発が望まれている。
日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、死亡数は、肺がん、胃がんに次いで３位になっている。年齢別では６０歳代が一番多く、次いで５０歳代、７０歳代の順である。大腸がんの増加の原因には、遺伝的要因、環境的要因などが考えられるが、食生活の西欧化、特に動物性脂肪の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。大腸がんの有効な分子標的薬の開発が待たれている。また、診断に用いられている腫瘍マーカー（ＣＥＡ，ＣＡ１９−９）は、進行大腸がんであっても約半数が陽性を示すのみで、臓器特異性も無く、より高性能な診断薬の開発が望まれている。
がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、直接がん細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡに作用し、細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用いる場合が多いが、がん細胞以外の、例えば、骨髄細胞、生殖細胞、毛母細胞、消化管上皮細胞など***がさかんな正常細胞に対しても作用し、強い副作用をもたらしていた。一方、近年の分子細胞生物学の進歩により、がん細胞の浸潤・増殖・転移などにかかわるメカニズムが解明され、そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子標的薬の開発が注目されている。代表例として、非小細胞肺がんの治療に効果のある、ＥＧＦＲ（上皮成長因子 受容体）チロシンキナーゼ阻害剤であるイレッサ（一般名：ゲフィチニブ）（ＷＯ９６／３３９８０）、乳がんの治療に効果のある、ＨＥＲ−２（ヒト上皮成長因子受容体２）のヒト化モノクローナル抗体のハーセプチン（一般名：トラスツズマブ）（ＷＯ９４／００１３６）などがあげられる。しかしながら、現状では未だ有効な分子標的薬は少なく、今後更なる各がん種に対する有効な分子標的薬の開発が望まれている。
日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、死亡数は、肺がん、胃がんに次いで３位になっている。年齢別では６０歳代が一番多く、次いで５０歳代、７０歳代の順である。大腸がんの増加の原因には、遺伝的要因、環境的要因などが考えられるが、食生活の西欧化、特に動物性脂肪の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。大腸がんの有効な分子標的薬の開発が待たれている。また、診断に用いられている腫瘍マーカー（ＣＥＡ，ＣＡ１９−９）は、進行大腸がんであっても約半数が陽性を示すのみで、臓器特異性も無く、より高性能な診断薬の開発が望まれている。
上記のような状況下で、がんを治療および／または診断するための新たな薬剤または方法が求められている。
特に、がんに対して特異性の高い治療薬および／または診断薬が求められている。
上記のような状況に鑑み、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、がん（例えば、大腸がん）において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、ＭＯＣＳ３遺伝子であることを見出した。本発明者らはさらに、大腸がん細胞株ならびに子宮頸がん細胞株においてＭＯＣＳ３タンパク質の発現を阻害することによって、癌細胞の増殖を抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下に記載するがん治療剤、がん抑制作用を有する候補物質のスクリーニング方法、がん診断剤、がん診断用キット、がんの診断方法などを提供する。
（１）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（２）上記ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質が、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸、
（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子もしくはその一部、またはその転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｃ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
（ｄ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブに作用するＭＯＣＳ３遺伝子変異体
（ｅ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸、
および
（ｆ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写またはＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物（上記核酸を除く）
からなる群から選択される物質を含む、上記（１）に記載のがん治療剤。
（３）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（４）上記ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質が、
（ａ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体、および、
（ｃ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する化合物（上記抗体および変異体を除く）
からなる群から選択される物質を含む、上記（３）に記載のがん治療剤。
（５）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のがん治療剤。
（６）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（７）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する工程、および
（ｃ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（８）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体。
（１０）上記（９）に記載の抗体を含有するがん治療剤。
（１１）放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、上記（１０）に記載のがん治療剤。
（１２）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（１０）または（１１）に記載のがん治療剤。
（１３）上記（９）に記載の抗体を含有するがん診断剤。
（１４）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有するがん診断剤。
（１５）上記がんが、大腸がんである、上記（１３）または（１４）に記載のがん診断剤。
（１６）上記（９）に記載の抗体を含有するがん診断用キット。
（１７）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。
（１８）上記がんが、大腸がんである、上記（１６）または（１７）に記載のがん診断用キット。
（１９）被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３タンパク質またはＭＯＣＳ３遺伝子をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（２０）前記生体試料が、全血、血清、または血漿である、上記（１９）に記載の方法。
（２１）質量分析装置を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、上記（１９）または（２０）に記載の方法。
（２２）抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、上記（１９）〜（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記抗体と、ＭＯＣＳ３タンパク質との結合を検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（２２）に記載の診断方法。
（２４）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（１９）または（２０）に記載の方法。
（２５）がんの診断に用いるための上記（１９）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）前記がんが、大腸がんである、上記（２５）に記載の方法。
（２７）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を包含する、がん治療方法。
（２８）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を患者に投与する工程を包含する、がん治療方法。
（３０）がんを治療するための医薬の製造のための、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質の使用。
（３１）がんを治療するための医薬の製造のための、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質の使用。
本発明により、がん、特に大腸がんの治療および／または診断に有用な新規な薬剤、キットおよび方法、ならびにがん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法が提供される。
特に、がんに対して特異性の高い治療薬および／または診断薬が求められている。
上記のような状況に鑑み、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、がん（例えば、大腸がん）において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、ＭＯＣＳ３遺伝子であることを見出した。本発明者らはさらに、大腸がん細胞株ならびに子宮頸がん細胞株においてＭＯＣＳ３タンパク質の発現を阻害することによって、癌細胞の増殖を抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下に記載するがん治療剤、がん抑制作用を有する候補物質のスクリーニング方法、がん診断剤、がん診断用キット、がんの診断方法などを提供する。
（１）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（２）上記ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質が、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸、
（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子もしくはその一部、またはその転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｃ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
（ｄ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブに作用するＭＯＣＳ３遺伝子変異体
（ｅ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸、
および
（ｆ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写またはＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物（上記核酸を除く）
からなる群から選択される物質を含む、上記（１）に記載のがん治療剤。
（３）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（４）上記ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質が、
（ａ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体、および、
（ｃ）該ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する化合物（上記抗体および変異体を除く）
からなる群から選択される物質を含む、上記（３）に記載のがん治療剤。
（５）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のがん治療剤。
（６）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（７）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する工程、および
（ｃ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（８）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体。
（１０）上記（９）に記載の抗体を含有するがん治療剤。
（１１）放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、上記（１０）に記載のがん治療剤。
（１２）上記がんが、大腸がんまたは子宮頸がんである、上記（１０）または（１１）に記載のがん治療剤。
（１３）上記（９）に記載の抗体を含有するがん診断剤。
（１４）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有するがん診断剤。
（１５）上記がんが、大腸がんである、上記（１３）または（１４）に記載のがん診断剤。
（１６）上記（９）に記載の抗体を含有するがん診断用キット。
（１７）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。
（１８）上記がんが、大腸がんである、上記（１６）または（１７）に記載のがん診断用キット。
（１９）被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３タンパク質またはＭＯＣＳ３遺伝子をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（２０）前記生体試料が、全血、血清、または血漿である、上記（１９）に記載の方法。
（２１）質量分析装置を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、上記（１９）または（２０）に記載の方法。
（２２）抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、上記（１９）〜（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記抗体と、ＭＯＣＳ３タンパク質との結合を検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（２２）に記載の診断方法。
（２４）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（１９）または（２０）に記載の方法。
（２５）がんの診断に用いるための上記（１９）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）前記がんが、大腸がんである、上記（２５）に記載の方法。
（２７）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を包含する、がん治療方法。
（２８）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を患者に投与する工程を包含する、がん治療方法。
（３０）がんを治療するための医薬の製造のための、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質の使用。
（３１）がんを治療するための医薬の製造のための、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質の使用。
本発明により、がん、特に大腸がんの治療および／または診断に有用な新規な薬剤、キットおよび方法、ならびにがん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法が提供される。
図１は、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん患者由来の２００検体における遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒストグラムである。
図２は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６に、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ解析の結果を示す光学顕微鏡写真（位相差像）である。
図３は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を示すグラフである。
図４は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、生細胞数測定によるＲＮＡｉ効果を評価した結果を示すグラフである。
図５は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を光学顕微鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。
図６は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を示すグラフである。
図７は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を生細胞数測定により検証した結果を示すグラフである。
図８は、正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
図９は、ＦＩＳＨ法で解析した大腸癌患者由来の検体組織のがん細胞の一部（６細胞分）の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。
図１０は、検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子のタンパク質が発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す光学顕微鏡写真（明視野像）である。
図１１は、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞株にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ をトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を生細胞数測定により検証した結果を示すグラフである。
図１２は、図１１の実験を時系列に従い、顕微鏡下で撮影し、その動態を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像）である。
図１３ＡおよびＢは、質量分析により解析した（Ａ）大腸がん患者由来の血清および（Ｂ）健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示すグラフである。
図１４Ａ〜Ｃは、ＭＳ／ＭＳ解析によって決定された、図１３に示すピークとアミノ酸（またはアミノ酸配列）との対応関係を示す。
図１５−１および図１５−２は、免疫組織染色法により解析した臓器の内、発現が認められた胃（Ａ：ｓｔｏｍａｃｈ）、結腸（Ｂ：ｃｏｌｏｎ）、直腸（Ｃ：ｒｅｃｔｕｍ）、網膜（Ｄ：ｅｐｉｐｌｏｏｎ）、肺（Ｅ、Ｆ、Ｇ：ｌｕｎｇ）、卵巣（Ｉ、Ｊ：ｏｖａｒｙ）、前立腺（Ｌ：ｐｒｏｓｔａｔｅ）、リンパ節（Ｍ：Ｌｙｍｐｎｏｄｅ）、骨組織（Ｏ：ｂｏｎｅ）、および縦隔（Ｒ：ｍｅｄｉａｓｔｉｎｕｍ）、ならびに弱いながら発現が認められた乳（Ｈ：ｂｒｅａｓｔ）、脾臓（Ｋ：ｓｐｌｅｅｎ）、咽喉（Ｐ：ｔｈｒｏａｔ）、および脂肪組織（Ｑ：ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅ）由来のサンプルの光学顕微鏡写真（明視野像）である。
図２は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６に、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ解析の結果を示す光学顕微鏡写真（位相差像）である。
図３は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を示すグラフである。
図４は、大腸がん細胞株ＲＫＯＥ６にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、生細胞数測定によるＲＮＡｉ効果を評価した結果を示すグラフである。
図５は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を光学顕微鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。
図６は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を示すグラフである。
図７は、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏにＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を生細胞数測定により検証した結果を示すグラフである。
図８は、正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
図９は、ＦＩＳＨ法で解析した大腸癌患者由来の検体組織のがん細胞の一部（６細胞分）の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。
図１０は、検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子のタンパク質が発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す光学顕微鏡写真（明視野像）である。
図１１は、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞株にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ をトランスフェクトした場合の、ＲＮＡｉ効果を生細胞数測定により検証した結果を示すグラフである。
図１２は、図１１の実験を時系列に従い、顕微鏡下で撮影し、その動態を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像）である。
図１３ＡおよびＢは、質量分析により解析した（Ａ）大腸がん患者由来の血清および（Ｂ）健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示すグラフである。
図１４Ａ〜Ｃは、ＭＳ／ＭＳ解析によって決定された、図１３に示すピークとアミノ酸（またはアミノ酸配列）との対応関係を示す。
図１５−１および図１５−２は、免疫組織染色法により解析した臓器の内、発現が認められた胃（Ａ：ｓｔｏｍａｃｈ）、結腸（Ｂ：ｃｏｌｏｎ）、直腸（Ｃ：ｒｅｃｔｕｍ）、網膜（Ｄ：ｅｐｉｐｌｏｏｎ）、肺（Ｅ、Ｆ、Ｇ：ｌｕｎｇ）、卵巣（Ｉ、Ｊ：ｏｖａｒｙ）、前立腺（Ｌ：ｐｒｏｓｔａｔｅ）、リンパ節（Ｍ：Ｌｙｍｐｎｏｄｅ）、骨組織（Ｏ：ｂｏｎｅ）、および縦隔（Ｒ：ｍｅｄｉａｓｔｉｎｕｍ）、ならびに弱いながら発現が認められた乳（Ｈ：ｂｒｅａｓｔ）、脾臓（Ｋ：ｓｐｌｅｅｎ）、咽喉（Ｐ：ｔｈｒｏａｔ）、および脂肪組織（Ｑ：ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅ）由来のサンプルの光学顕微鏡写真（明視野像）である。
本発明者らは、大腸がん患者由来の検体を用いてアレイＣＧＨ法による増幅遺伝子の検証を行い、大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定した。検体において高頻度に増幅が起きている領域のうち、ヒトＭＯＣＳ３（Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ３）遺伝子が大腸がん患者由来の検体において高頻度であることを見出した。
本発明者らの見出したヒトＭＯＣＳ３遺伝子は、モリブデンを含む酸化還元酵素群の合成系に関与する。
モリブデンはマメ科植物、乳製品、食肉など、多くの食品に含まれる微量元素であり、生体内で重要な役割を担っていることが知られている。モリブデンは、Ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ（ＭＴＰ）と結合してＭｏｌｙｎｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ（Ｍｏｃｏ）となる。Ｍｏｃｏは、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、および亜硫酸オキシダーゼ（ＳＯ）の３つの酵素の活性に必須である。ＸＯはプリン誘導体の代謝に関与し、ＡＯはアルデヒドのカルボン酸への酸化を触媒し、ＳＯは含硫黄アミノ酸の代謝に必要とされる亜硫酸塩を硫酸に酸化する酵素である。
モリブデンの欠乏は、心悸亢進、頭痛、精神障害、昏睡状態などの臨床徴候があり、長期の完全非経口栄養を受けている患者において報告がある。このモリブデン不足がもたらす症状は、低いＸＯ活性による血清中と尿中の非常に低い尿酸値、また、低いＳＯ活性による尿中の低い無機硫酸値などである。重篤な脳障害や眼硝子体脱臼などの症状を示す、先天的異常によるモリブデン補因子欠乏症が知られている（Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｖ．Ｍ．（１９９３）Ｎｕｔｒ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．８（６），２７７−８１）。
モリブデン補因子欠乏症は、２つのＭｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １（ＭＯＣＳ１）および２（ＭＯＣＳ２）の変異が関与していることが報告されている（Ｒｅｉｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３，６３９−６４４；Ｒｅｉｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，７０６−７１１）。
大腸菌のＭＴＰ合成関連酵素のＭｏｅＢ遺伝子（Ｌａｋｅ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４，３２５−３２９）のヒト相同性遺伝子として同定されたＭＯＣＳ３は、Ｎ末端側はＭｏｅＢと相同性があるが、Ｃ末端側はＲｈｏｄａｎｅｓｅ（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ：ｃｙａｎｉｄｅ ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｅ．Ｃ．２．８．１．１）と相同性がある（Ｍｅｎｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｇ．（２００２）Ｍｅｔ．Ｉｏｎｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｙｓｔ．３９，３１７−３６８）。
ＭＯＣＳ３は，ＭＴＰ合成系において、硫黄をＭＯＣＳ２に転移しＭＯＣＳ２を活性化する。活性化したＭＯＣＳ２は、ＭＯＣＳ１によりＧＴＰより合成されたＰｒｅｃｕｒｓｏｒＺをＭＴＰに変換する（Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１；Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，７９１２−７９２０）。このように合成されたＭＴＰはモリブデンと結合し、Ｍｏｃｏとなる。Ｍｏｃｏは、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、および亜硫酸オキシダーゼ（ＳＯ）の３つの酵素の活性に必須である。
本発明者らは、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によって抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できることも確認した。したがって、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を抑制することによって、がんを治療することが可能となる。また、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現量を測定することによってがんの診断を行うことも可能となる。
以下、本発明のがん治療剤、スクリーニング方法、診断剤などについて詳細に説明する。
１．がん抑制作用を有する薬剤
まず、本発明は、（１）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤、及び（２）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子」という場合、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０１４４８４で登録されている２４５８塩基からなるヒトＭＯＣＳ３遺伝子（配列番号１）を意味するが、これに限定されず、例えば、当該遺伝子の塩基配列において１つ以上の塩基の置換、欠失、付加、または挿入などを有することによって変化している変異体のような、当該遺伝子の塩基配列またはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子も本明細書中で使用する「ＭＯＣＳ３遺伝子」に含まれるものとする。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列と、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
本明細書中、「遺伝子の発現阻害」とは、遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象（例えば、転写（ｍＲＮＡの生成）、翻訳（タンパク質の生成）を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによってその遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻害することを意味するものとする。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３タンパク質」という場合、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿０５５２９９で登録されている４６０アミノ酸残基からなるヒトＭＯＣＳ３タンパク質（配列番号２）およびこのタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性やＴｉｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性などの酵素活性から選択される一種以上の活性）を保持し、このタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、及び／または付加が生じたアミノ酸配列からなる変異タンパク質をいう。
上記変異タンパク質における、アミノ酸の変異部位および個数は、変異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限り特に制限はないが、変異個数は、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。変異個数は一般的に少ない程好ましい。また、このような変異タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質を含む。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
上記ＭＯＣＳ３タンパク質には、ＭＯＣＳ３タンパク質の「部分ペプチド」も含まれる。ＭＯＣＳ３タンパク質の部分ペプチドとしては、ＭＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の一部の連続するアミノ酸の配列からなる部分ペプチドであって、好ましくは、前述のＭＯＣＳ３タンパク質の活性と同様の活性を有するものであればいずれのものでも良い。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも７０個、より好ましくは少なくとも１００個、最も好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を含有する。また、本発明で使用される部分ペプチドは、上記のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列中の１または複数個（例えば、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらにより好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、付加、置換、または挿入により変更されているものでもよい。
本発明で用いるＭＯＣＳ３タンパク質は、そのタンパク質を発現している細胞や組織から調製することができる。また、これらのタンパク質は、公知のペプチド合成機によっても合成できるし、原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。本発明で用いるＭＯＣＳ３タンパク質は、いずれの種由来のものでもよいが、好ましくはヒト由来である。
「実質的に同質の活性」とは、それらの活性が性質的に同等であることを示す。したがって、酵素活性（Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性やＴｉｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性など）が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。酵素活性の測定は、Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１などの文献に記載の公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
本明細書中、「がん治療剤」という用語は、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤、癌細胞の浸潤抑制剤、がん予防剤等を含む意味で使用される。なお、本願明細書中、用語「癌（または、がん）」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。
１．１ ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤
本発明は、１つの実施形態において、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質」には、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、例えば、（ｉ）ＭＯＣＳ３遺伝子からＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質、および（ｉｉ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡからＭＯＣＳ３タンパク質への翻訳を阻害する物質が含まれる。
ＭＯＣＳ３遺伝子からＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質の例としては、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
（ｃ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブに作用するＭＯＣＳ３遺伝子変異体、あるいは
（ｄ）その他の転写阻害化合物
などが含まれる。
また、ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡからＭＯＣＳ３タンパク質への翻訳を阻害する物質の例としては、
（ｅ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対してＲＮＡｉ作用を有するポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）、
（ｆ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）ＭＯＣＤ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチド、あるいは
（ｈ）その他の翻訳阻害化合物
などが含まれる。
本明細書中、「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ここでいう「核酸」は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであって良い。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていて良く、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のがん治療剤においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、１９〜３０塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），Ｆｅｂ．，１８０−１８３；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），Ａｐｒｉｌ，２４０−２４４；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｐｅ．２１，４０７：６８０２，３１９−２０；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），Ａｐｒ．１６，９４８−９５８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），１６ Ａｐｒ．，５５１５−５５２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），１９ Ａｐｒ．，５５０−５５３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｐｒ．３０，９９：９，６０４７−６０５２；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，４９７−５００；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，５００−５０８；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ １５など）。
本発明で用いられるＲＮＡｉ効果を奏する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２０〜２７塩基、より好ましくは２１〜２５塩基、最も好ましくは２１〜２３塩基である。本発明においては、具体的には、下記ｓｉＲＮＡ（実施例３で使用）を用いることができる、
本明細書中、「アンチセンス核酸」、または「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、ある対象となるＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドを有し、そのポリヌクレオチドが当該領域の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる核酸のことをいう。本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。それらは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するものなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。
例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的である。コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相補性を有する。
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも約１０塩基以上（例えば、１０〜４０個程度）、好ましくは約１５塩基以上であり、より好ましくは約１００塩基以上であり、さらに好ましくは約５００塩基以上である。アンチセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる（例えば、平島および井上、新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３、ｐ．３１９−３４７）、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ．Ｖｏｌ．８，ｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３など参照）。
また、本発明のがん治療剤においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸を有効成分として用いることができる。ここでいう「リボザイム活性」とは、ターゲットとする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを部位特異的に切断する核酸のことをいう。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（タンパク質核酸酵素、１９９０、３５、ｐ．２１９１）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，ｐ．２２８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，ｐ．２８５；タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，ｐ．２１９１；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８９，１７，ｐ．７０５９などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，ｐ．３４９；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９，ｐ．６７５１；菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，ｐ．１１２などを参照することができる。このようなリボザイムを用いて本発明におけるＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
さらに、本発明は、ＭＯＣＳ３遺伝子の転写活性を阻害する核酸以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現・転写に関与する因子に結合する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。
１．２ ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤
本発明はまた、別の実施形態において、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質」には、例えば、
（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体、
（ｂ）ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体、あるいは
（ｃ）ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する化合物（上記抗体および変異体を除く）
などが含まれる。
本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のＭＯＣＳ３タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体（抗ＭＯＣＳ３抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。なお、抗ＭＯＣＳ３抗体の詳細については後述する。
本明細書における「ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体」とは、それをコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す（土田邦博著、遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編、羊土社（２００１）２６−３２など参照）。
さらに、本発明においては、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害し得る物質として、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する、上記抗体または変異体以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合し、その活性を阻害する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。
上記した本発明のＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害し得る物質は、がん治療剤として使用することができる。
２．ＭＯＣＳ３タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明は、がん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法をも提供する。
一つの好ましい態様は、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＭＯＣＳ３タンパク質と結合する化合物は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害する効果を有することが期待される。ここで、該化合物は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性部位に結合することが好ましい。本方法においては、まず、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物とを接触させる。ＭＯＣＳ３タンパク質は、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
本方法においては、次いで、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合を検出する。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＭＯＣＳ３タンパク質への被検化合物の結合により生じるＭＯＣＳ３タンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。タンパク質と被検化合物との結合活性は、公知の手法によって測定することができる（例えば、Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ活性やＳｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 活性の測定（Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１参照））。
本方法においては、次いで、ＭＯＣＳ３タンパク質と結合し、その活性を阻害する被検化合物を選択する。
本方法により単離される化合物は、がん抑制作用を有することが期待され、がん治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を指標とする方法である。
本方法においては、まず、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、トリなど、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＭＯＣＳ３遺伝子を発現している細胞、または外因性のＭＯＣＳ３遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＭＯＣＳ３遺伝子が発現した細胞は、通常、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が用いられる。
ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
本方法においては、次いで、該ＭＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。あるいは、ＭＯＣＳ３遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、それぞれＭＯＣＳ３タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＭＯＣＳ３タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、がん治療剤のための候補化合物となる。
３．抗ＭＯＣＳ３抗体及びこの抗体を含有する治療剤、複合体および組成物
本発明はまた、抗ＭＯＣＳ３抗体、この抗体を含有するがん治療剤などを提供する。本発明の１つの好ましい態様では、上記がん治療剤は、がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。
３．１ 抗ＭＯＣＳ３抗体
本明細書中、「抗ＭＯＣＳ３抗体」には、ＭＯＣＳ３タンパク質（その断片（部分ペプチド）もしくはその塩を含む）に特異的に結合する抗体が含まれる。本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。また、ここでいう「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。本発明の抗体は、公知の方法で製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗ Ｅ．＆ Ｌａｎｅ Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照）。
（１）抗原の調製
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、通常、ＭＯＣＳ３タンパク質またはその塩である。上記ＭＯＣＳ３タンパク質には、その部分ペプチドも含まれ、これは、限定されることはないが、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列の断片であって、例えば、２０個以上、４０個以上、６０個以上、８０個以上、１００個以上の、連続するアミノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。これらの断片として、例えば、アミノ（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が用いられる。本発明で用いられる部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜６個））のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたものであってもよい。ここで用いられるＭＯＣＳ３タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸）との塩などが用いられる。抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＭＯＣＳ３タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
（２）ＭＯＣＳ３タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ） 抗体産生細胞の採取
上記のようなＭＯＣＳ３タンパク質、その部分ペプチド又はその塩（本明細書中、抗体に関する説明では、これらをまとめて、「ＭＯＣＳ３タンパク質」という。）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば Ｘ６３Ａｇ．８．６５３、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳ０／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ ２／０などのラットミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比２：１〜３：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ） ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＭＯＣＳタンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、ＭＯＣＳタンパク質と反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
上記のようにして得たハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３）ＭＯＣＳ３タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
まず、上記した抗原を哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１０〜１０００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓｙ）又は ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
次いで、例えば、抗血清中のポリクローナル抗体を、ＭＯＣＳ３タンパク質で固定されたアフィニティーカラムにかけてＭＯＣＳ３タンパク質と反応する抗体（カラム吸着画分）を採取する。ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡ法などで測定することができる。
（４）抗体の断片など
ＦａｂまたはＦａｂ’２断片は、従来の方法によるプロテアーゼ（例えば、ペプシンまたはパパイン）を用いた消化により作製することができる。ヒト化抗体は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｏｃｔ ５；２０３（３）：８２５−８，１９８８）、およびＪｏｎｅｓら（Ｊｏｎｅｓら Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，１９８６）に記載のような方法の１つにより調製することができる。
また、キメラ抗体は、例えば、「実験医学（臨時増刊号）、Ｖｏｌ．１．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４・２５５８５号公報等、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。本発明のＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体は、例えば、癌細胞の増殖もしくは転移の抑制等を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
抗体は、診断剤として用いる場合は、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。必要に応じて、放射性物質、蛍光化合物などにより標識することができる。最も慣用の蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンおよびフルオレスカミンがある。同様に、生体発光性化合物を用いて、抗体ＭＯＣＳ３抗体を標識することもできる。生体発光性タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって測定される。この標識目的に重要な生体発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびイエクオリンである。
なお、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＭＯＣＳ３タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、ＭＯＣＳ３タンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＭＯＣＳ３タンパク質等の検出、被検細胞内におけるＭＯＣＳ３タンパク質の挙動の分析などのために使用することができる、
３．２ 抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する複合体など
また、本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体は、本発明の治療剤または診断剤において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。したがって、本発明は、もう一つの態様において、がん（例えば、大腸がん）の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、抗ＭＯＣＳ３抗体と他の薬剤との複合体、そのような複合体を含有する組成物などをも提供する。このような態様によれば、本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、治療効果を奏する他の薬剤または診断のための標識剤などを、ＭＯＣＳ３タンパク質を高発現する標的部位へ送達することができる。
本発明において用いられる「その他の薬剤」としては、例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターなどが例示される。
本発明において、「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性治治療剤あるいは放射性診断剤として広く利用し得る。例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（６７Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（９０Ｙ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）またはレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。
本発明において、「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、大腸がん細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 １９９６年 癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法 昭和５７年 医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターが使用し得る（例えば、アデノウイルスベクター（Ｗａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２１，４２９−４４１）、レトロウイルスベクター（Ｎａｖｉａｕｘ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０，５７０１−５７０５）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，４５７−４６３）などが挙げられる）。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、大腸がん）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＭＯＣＳ３抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＭＯＣＳ３抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＭＯＣＳ３抗体が認識する抗原（すなわち、ＭＯＣＳ３）が存在する部位に標的化することができる。
抗ＭＯＣＳ３抗体と上記他の薬剤とは、化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。
４．製剤化および製剤の投与方法
本発明のＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する治療剤、または本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療剤は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
本発明の治療剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としてのＭＯＣＳ３タンパク質の活性（またはＭＯＣＳ３遺伝子の発現）阻害物質は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の治療剤は、がん（例えば、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療、好ましくは、大腸がんの予防・治療に用いられる。
本発明の薬剤は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質またはＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されない。また、本発明の薬剤は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質およびＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。
本発明の治療剤において、アンチセンス核酸を用いる場合、該アンチセンス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、公知の手段に従って投与することができる。アンチセンス核酸は、単独で、あるいは生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
また、本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウイルスベクターと抗ＭＯＣＳ３抗体との組み合わせを癌治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０３〜１０１５個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＭＯＣＳ３抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＭＯＣＳ３抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。
５．がんの診断剤及び診断方法
本発明はまた、がんの診断剤を提供する。１つの好ましい態様において、本発明のがんの診断剤は、（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体、又は（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
５．１ 抗体ＭＯＣＳ３抗体を用いる診断剤及び診断方法
ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体は、ＭＯＣＳ３タンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中のＭＯＣＳ３タンパク質を定量することができる。具体的には、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体を用いる診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記抗体と、ＭＯＣＳ３タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を検出および／または定量する工程を包含する。好ましくは、上記検出および／または定量する工程において、標識された抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質またはその断片と抗ＭＯＣＳ３抗体との結合が検出および／または定量される。
本明細書中、「被験者由来の生体試料」は、被験者由来の組織、細胞、または体液（例えば、血液（全血、血漿、血清等を含む）、尿、リンパ液、唾液、汗、***等）を含む。また、「被験者」は、通常、がん検診を受ける、または受けることが望まれるヒト被験体であり、がんに罹患しているか、または罹患していると疑われるヒト被験体等が含まれる。このようながんの例としては、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、大腸がんが好ましい。
上記のような被験者由来の生体試料におけるＭＯＣＳ３の発現を検出するための免疫測定は、がん（例えば、大腸がん）を有すると疑われるか、がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、特異的抗原−抗体結合を生じさせる条件下で抗ＭＯＣＳ３抗体と接触させ、次いで、抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。このような抗体の結合を使用して、ＭＯＣＳ３タンパク質の存在および／または増大した発現が検出される。この場合、増大したＭＯＣＳ３タンパク質発現の検出が疾病状態の指標となる。必要に応じて、生体試料中のＭＯＣＳ３タンパク質のレベルを、がんを有しない健常者のレベルと比較してもよい。
上記免疫測定法の１つの態様では、例えば、血清試料などの生体試料を、試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体と接触させる。次いで、この支持体を緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識した抗ＭＯＣＳ３抗体により処理する。次いで、この固相支持体を緩衝液で２回洗浄し、未結合抗体を除去する。固相支持体上の結合した抗体の量を、周知の方法に従って測定する。各測定に適する検出条件は、慣用的な試験方法を使用して当業者により適宜決定され得る。
抗ＭＯＣＳ３抗体を検出可能に標識する方法の１つにおいて、当該抗体を、酵素、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に使用されるもののような酵素に結合させる［Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．による「酵素標識した免疫吸着アッセイ」（“Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ），１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１〜７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ．ＭＤ；Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７〜５２０，１９７８：Ｂｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．によるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２〜５２３，１９８１］。抗体に結合する酵素を、例えば分光光度測定により、可視手段による蛍光測定により検出することができる化学分子が生成されるような方法で、適当な基質、好ましくは色素原性基質と反応させる。抗体に検出可能な標識を付けるために使用することができる酵素は、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを包含するが、これらに限定されない。この検出はまた、酵素に対する色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。
その他の本発明において使用し得る方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ免疫測定法、イムノメトリック法、ネフロメトリー、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法などが挙げられる（ＷＯ００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行など参照）。
以上のように、本発明の抗体を用いる、生体内でのＭＯＣＳ３タンパク質の定量法を利用することにより、ＭＯＣＳ３タンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の濃度増加が検出された場合は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：大腸がん））である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
なお、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断に用いることもできる。ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、抗体−キレート剤について、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９９０ １７：２４７−２５４に記載されている。また、磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体については、例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２：３３９−３４２に記載されている。
５．２ ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）プローブを用いる診断剤及び診断方法
本発明の診断方法においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプローブ又はプライマーを用いることができる。具体的には、そのような診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチド（プローブ）とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程を包含する。
上記本発明の方法では、被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３遺伝子のＤＮＡ（またはその遺伝子断片）を、上記プローブを使用して検出および／または定量する。プローブとして用いる塩基配列の長さは、例えば、１２塩基以上、１５塩基以上、１８塩基以上、２１塩基以上、２４塩基以上、２７塩基以上、３０塩基以上、またはさらに長い長さのポリヌクレオチド断片であり得る。ハイブリダイゼーションには、上記した低、中又は高ストリンジェントな条件を使用し得る。なお、本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列」には、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列（アンチセンスポリヌクレオチド）も含まれるものとする。プローブおよび核酸のハイブリダイゼーションの方法は当業者に知られており、例えば国際公開公報第８９／０６６９８号、ＥＰ−Ａ０２００３６２、米国特許第２，９１５，０８２号、ＥＰ−Ａ００６３８７９、ＥＰ−Ａ０１７３２５１、ＥＰ−Ａ０１２８０１８に記載されている。
本発明の診断方法においては、ＭＯＣＳ３遺伝子に対する特異的ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、公知の手法を用いて標的配列を検出または定量することができる。そのような公知の手法として、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年））、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））、ＦＩＳＨ法、ＤＮＡチップあるいはアレイＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。定量的な検出は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施可能である。 アレイＣＧＨ法は、染色体ＣＧＨ法（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，８１８−８２１）を応用した方法で、スライド上に染色体領域をカバーするゲノムＤＮＡ断片（ＢＡＣ，ＰＡＣ，ＹＡＣなど）を高密度にスポットしたＤＮＡチップを用いて、別々の色素で標識したがん由来ＤＮＡと正常ＤＮＡを、スライド上のゲノムＤＮＡ断片に対して同時にハイブリダイゼーションを行い、その結合状態を検出することにより、がんにおけるＤＮＡコピー数異常を高解像度に検出する方法である（Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０，２０７−２１１）。
なお、本発明においては、ＭＣＯＳ３遺伝子の発現が上方制御されるか否かを検出するために、細胞のＭＣＯＳ３のｍＲＮＡレベルを標準遺伝子（ハウスキーピング遺伝子（例えば、Ｓｈａｐｅｒ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３（１９９８）３１５−３２４；Ｗｕ，Ｙ．Ｙ．およびＲｅｅｓ，Ｊ．Ｌ．、Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．８０（２０００）２−３）のｍＲＮＡレベルと、好ましくはＲＴ−ＰＣＲによって比較することもできる。
上記のような手法によって標的配列（ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）を検出・定量し、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現過多が確認された場合は、例えば、ＭＯＣＳ３の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：大腸がん、子宮頸がん））である可能性が高い、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
５．３診断用キット
本発明はまた、抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する、被験者の体液試料中のＭＯＣＳ３タンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットを提供する。さらに、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有する、被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットをも提供する。これらのキットは、上述の免疫学的手法またはハイブリダイゼーション法等により、がんマーカーを検出するために用いられる。このようながんとしては、例えば、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、大腸がんが好ましい。
本明細書中、「がんマーカー」とは、被験者の体液（例えば、血液、尿、リンパ液、唾液、汗、***等）または細胞もしくは組織中における、正常組織に由来していないか、あるいはがん細胞または組織において選択的に発現の亢進している分子のことをいい、被験者の体液または細胞もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示唆するものをいう。
上記第一の態様のキットは、被験者からの体液試料中のＭＯＣＳ３抗原（ＭＯＣＳ３タンパク質およびその部分ペプチドを含む）を検出および／または定量する成分を含有する。例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質がＥＬＩＳＡで検出および／または定量される場合、このような成分は、例えば、組織切片、または血液や尿のような体液試料中のＭＯＣＳ３のレベルを検出および／または定量するために使用され得る。このような抗体は放射能、蛍光、比色、または酵素標識で標識されていてもよい。本発明のキットは、標識された二次抗体を含有していてもよい。
上記第二の態様のキットは、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。例えば、本発明のキットは、ＤＮＡチップ上に固定された上記ポリヌクレオチドを含有し得る。
本発明のキットは、抗ＭＯＣＳ３抗体、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列等の他に、代表的には、容器およびラベルを含んでいる。容器上のまたは容器に伴うラベルには、薬剤が大腸がんマーカーの検出に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書、標識二次抗体等がさらに含まれていてもよい。
以下、本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
本発明者らの見出したヒトＭＯＣＳ３遺伝子は、モリブデンを含む酸化還元酵素群の合成系に関与する。
モリブデンはマメ科植物、乳製品、食肉など、多くの食品に含まれる微量元素であり、生体内で重要な役割を担っていることが知られている。モリブデンは、Ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ（ＭＴＰ）と結合してＭｏｌｙｎｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ（Ｍｏｃｏ）となる。Ｍｏｃｏは、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、および亜硫酸オキシダーゼ（ＳＯ）の３つの酵素の活性に必須である。ＸＯはプリン誘導体の代謝に関与し、ＡＯはアルデヒドのカルボン酸への酸化を触媒し、ＳＯは含硫黄アミノ酸の代謝に必要とされる亜硫酸塩を硫酸に酸化する酵素である。
モリブデンの欠乏は、心悸亢進、頭痛、精神障害、昏睡状態などの臨床徴候があり、長期の完全非経口栄養を受けている患者において報告がある。このモリブデン不足がもたらす症状は、低いＸＯ活性による血清中と尿中の非常に低い尿酸値、また、低いＳＯ活性による尿中の低い無機硫酸値などである。重篤な脳障害や眼硝子体脱臼などの症状を示す、先天的異常によるモリブデン補因子欠乏症が知られている（Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｖ．Ｍ．（１９９３）Ｎｕｔｒ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．８（６），２７７−８１）。
モリブデン補因子欠乏症は、２つのＭｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １（ＭＯＣＳ１）および２（ＭＯＣＳ２）の変異が関与していることが報告されている（Ｒｅｉｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３，６３９−６４４；Ｒｅｉｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，７０６−７１１）。
大腸菌のＭＴＰ合成関連酵素のＭｏｅＢ遺伝子（Ｌａｋｅ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４，３２５−３２９）のヒト相同性遺伝子として同定されたＭＯＣＳ３は、Ｎ末端側はＭｏｅＢと相同性があるが、Ｃ末端側はＲｈｏｄａｎｅｓｅ（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ：ｃｙａｎｉｄｅ ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｅ．Ｃ．２．８．１．１）と相同性がある（Ｍｅｎｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｇ．（２００２）Ｍｅｔ．Ｉｏｎｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｙｓｔ．３９，３１７−３６８）。
ＭＯＣＳ３は，ＭＴＰ合成系において、硫黄をＭＯＣＳ２に転移しＭＯＣＳ２を活性化する。活性化したＭＯＣＳ２は、ＭＯＣＳ１によりＧＴＰより合成されたＰｒｅｃｕｒｓｏｒＺをＭＴＰに変換する（Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１；Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，７９１２−７９２０）。このように合成されたＭＴＰはモリブデンと結合し、Ｍｏｃｏとなる。Ｍｏｃｏは、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）、および亜硫酸オキシダーゼ（ＳＯ）の３つの酵素の活性に必須である。
本発明者らは、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によって抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できることも確認した。したがって、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を抑制することによって、がんを治療することが可能となる。また、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現量を測定することによってがんの診断を行うことも可能となる。
以下、本発明のがん治療剤、スクリーニング方法、診断剤などについて詳細に説明する。
１．がん抑制作用を有する薬剤
まず、本発明は、（１）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤、及び（２）ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子」という場合、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０１４４８４で登録されている２４５８塩基からなるヒトＭＯＣＳ３遺伝子（配列番号１）を意味するが、これに限定されず、例えば、当該遺伝子の塩基配列において１つ以上の塩基の置換、欠失、付加、または挿入などを有することによって変化している変異体のような、当該遺伝子の塩基配列またはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子も本明細書中で使用する「ＭＯＣＳ３遺伝子」に含まれるものとする。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列と、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
本明細書中、「遺伝子の発現阻害」とは、遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象（例えば、転写（ｍＲＮＡの生成）、翻訳（タンパク質の生成）を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによってその遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻害することを意味するものとする。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３タンパク質」という場合、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿０５５２９９で登録されている４６０アミノ酸残基からなるヒトＭＯＣＳ３タンパク質（配列番号２）およびこのタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性やＴｉｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性などの酵素活性から選択される一種以上の活性）を保持し、このタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、及び／または付加が生じたアミノ酸配列からなる変異タンパク質をいう。
上記変異タンパク質における、アミノ酸の変異部位および個数は、変異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限り特に制限はないが、変異個数は、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。変異個数は一般的に少ない程好ましい。また、このような変異タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質を含む。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
上記ＭＯＣＳ３タンパク質には、ＭＯＣＳ３タンパク質の「部分ペプチド」も含まれる。ＭＯＣＳ３タンパク質の部分ペプチドとしては、ＭＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の一部の連続するアミノ酸の配列からなる部分ペプチドであって、好ましくは、前述のＭＯＣＳ３タンパク質の活性と同様の活性を有するものであればいずれのものでも良い。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも７０個、より好ましくは少なくとも１００個、最も好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を含有する。また、本発明で使用される部分ペプチドは、上記のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列中の１または複数個（例えば、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらにより好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、付加、置換、または挿入により変更されているものでもよい。
本発明で用いるＭＯＣＳ３タンパク質は、そのタンパク質を発現している細胞や組織から調製することができる。また、これらのタンパク質は、公知のペプチド合成機によっても合成できるし、原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。本発明で用いるＭＯＣＳ３タンパク質は、いずれの種由来のものでもよいが、好ましくはヒト由来である。
「実質的に同質の活性」とは、それらの活性が性質的に同等であることを示す。したがって、酵素活性（Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ活性やＴｉｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ活性など）が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。酵素活性の測定は、Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１などの文献に記載の公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
本明細書中、「がん治療剤」という用語は、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤、癌細胞の浸潤抑制剤、がん予防剤等を含む意味で使用される。なお、本願明細書中、用語「癌（または、がん）」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。
１．１ ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤
本発明は、１つの実施形態において、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質」には、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、例えば、（ｉ）ＭＯＣＳ３遺伝子からＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質、および（ｉｉ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡからＭＯＣＳ３タンパク質への翻訳を阻害する物質が含まれる。
ＭＯＣＳ３遺伝子からＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質の例としては、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
（ｃ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブに作用するＭＯＣＳ３遺伝子変異体、あるいは
（ｄ）その他の転写阻害化合物
などが含まれる。
また、ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡからＭＯＣＳ３タンパク質への翻訳を阻害する物質の例としては、
（ｅ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対してＲＮＡｉ作用を有するポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）、
（ｆ）ＭＯＣＳ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）ＭＯＣＤ３ ｍＲＮＡまたはその一部に対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチド、あるいは
（ｈ）その他の翻訳阻害化合物
などが含まれる。
本明細書中、「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ここでいう「核酸」は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであって良い。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていて良く、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のがん治療剤においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、１９〜３０塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），Ｆｅｂ．，１８０−１８３；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），Ａｐｒｉｌ，２４０−２４４；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｐｅ．２１，４０７：６８０２，３１９−２０；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），Ａｐｒ．１６，９４８−９５８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），１６ Ａｐｒ．，５５１５−５５２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），１９ Ａｐｒ．，５５０−５５３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｐｒ．３０，９９：９，６０４７−６０５２；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，４９７−５００；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，５００−５０８；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ １５など）。
本発明で用いられるＲＮＡｉ効果を奏する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２０〜２７塩基、より好ましくは２１〜２５塩基、最も好ましくは２１〜２３塩基である。本発明においては、具体的には、下記ｓｉＲＮＡ（実施例３で使用）を用いることができる、
使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。
例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的である。コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相補性を有する。
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも約１０塩基以上（例えば、１０〜４０個程度）、好ましくは約１５塩基以上であり、より好ましくは約１００塩基以上であり、さらに好ましくは約５００塩基以上である。アンチセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる（例えば、平島および井上、新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３、ｐ．３１９−３４７）、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ．Ｖｏｌ．８，ｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３など参照）。
また、本発明のがん治療剤においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸を有効成分として用いることができる。ここでいう「リボザイム活性」とは、ターゲットとする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを部位特異的に切断する核酸のことをいう。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（タンパク質核酸酵素、１９９０、３５、ｐ．２１９１）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，ｐ．２２８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，ｐ．２８５；タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，ｐ．２１９１；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８９，１７，ｐ．７０５９などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，ｐ．３４９；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９，ｐ．６７５１；菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，ｐ．１１２などを参照することができる。このようなリボザイムを用いて本発明におけるＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
さらに、本発明は、ＭＯＣＳ３遺伝子の転写活性を阻害する核酸以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現・転写に関与する因子に結合する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。
１．２ ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤
本発明はまた、別の実施形態において、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、「ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質」には、例えば、
（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体、
（ｂ）ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体、あるいは
（ｃ）ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する化合物（上記抗体および変異体を除く）
などが含まれる。
本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のＭＯＣＳ３タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体（抗ＭＯＣＳ３抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。なお、抗ＭＯＣＳ３抗体の詳細については後述する。
本明細書における「ＭＯＣＳ３タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＭＯＣＳ３タンパク質変異体」とは、それをコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す（土田邦博著、遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編、羊土社（２００１）２６−３２など参照）。
さらに、本発明においては、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害し得る物質として、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合する、上記抗体または変異体以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合し、その活性を阻害する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。
上記した本発明のＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害し得る物質は、がん治療剤として使用することができる。
２．ＭＯＣＳ３タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明は、がん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法をも提供する。
一つの好ましい態様は、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＭＯＣＳ３タンパク質と結合する化合物は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性を阻害する効果を有することが期待される。ここで、該化合物は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性部位に結合することが好ましい。本方法においては、まず、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物とを接触させる。ＭＯＣＳ３タンパク質は、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
本方法においては、次いで、ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合を検出する。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＭＯＣＳ３タンパク質への被検化合物の結合により生じるＭＯＣＳ３タンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。タンパク質と被検化合物との結合活性は、公知の手法によって測定することができる（例えば、Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ活性やＳｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 活性の測定（Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１（１６），５９４６−５９５１参照））。
本方法においては、次いで、ＭＯＣＳ３タンパク質と結合し、その活性を阻害する被検化合物を選択する。
本方法により単離される化合物は、がん抑制作用を有することが期待され、がん治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現を指標とする方法である。
本方法においては、まず、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、トリなど、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＭＯＣＳ３遺伝子を発現している細胞、または外因性のＭＯＣＳ３遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＭＯＣＳ３遺伝子が発現した細胞は、通常、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が用いられる。
ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
本方法においては、次いで、該ＭＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。あるいは、ＭＯＣＳ３遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、それぞれＭＯＣＳ３タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＭＯＣＳ３タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、がん治療剤のための候補化合物となる。
３．抗ＭＯＣＳ３抗体及びこの抗体を含有する治療剤、複合体および組成物
本発明はまた、抗ＭＯＣＳ３抗体、この抗体を含有するがん治療剤などを提供する。本発明の１つの好ましい態様では、上記がん治療剤は、がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。
３．１ 抗ＭＯＣＳ３抗体
本明細書中、「抗ＭＯＣＳ３抗体」には、ＭＯＣＳ３タンパク質（その断片（部分ペプチド）もしくはその塩を含む）に特異的に結合する抗体が含まれる。本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。また、ここでいう「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。本発明の抗体は、公知の方法で製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗ Ｅ．＆ Ｌａｎｅ Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照）。
（１）抗原の調製
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、通常、ＭＯＣＳ３タンパク質またはその塩である。上記ＭＯＣＳ３タンパク質には、その部分ペプチドも含まれ、これは、限定されることはないが、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列の断片であって、例えば、２０個以上、４０個以上、６０個以上、８０個以上、１００個以上の、連続するアミノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。これらの断片として、例えば、アミノ（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が用いられる。本発明で用いられる部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜６個））のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたものであってもよい。ここで用いられるＭＯＣＳ３タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸）との塩などが用いられる。抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＭＯＣＳ３タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
（２）ＭＯＣＳ３タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ） 抗体産生細胞の採取
上記のようなＭＯＣＳ３タンパク質、その部分ペプチド又はその塩（本明細書中、抗体に関する説明では、これらをまとめて、「ＭＯＣＳ３タンパク質」という。）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば Ｘ６３Ａｇ．８．６５３、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳ０／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ ２／０などのラットミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比２：１〜３：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ） ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＭＯＣＳタンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、ＭＯＣＳタンパク質と反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
上記のようにして得たハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３）ＭＯＣＳ３タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
まず、上記した抗原を哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１０〜１０００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓｙ）又は ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
次いで、例えば、抗血清中のポリクローナル抗体を、ＭＯＣＳ３タンパク質で固定されたアフィニティーカラムにかけてＭＯＣＳ３タンパク質と反応する抗体（カラム吸着画分）を採取する。ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡ法などで測定することができる。
（４）抗体の断片など
ＦａｂまたはＦａｂ’２断片は、従来の方法によるプロテアーゼ（例えば、ペプシンまたはパパイン）を用いた消化により作製することができる。ヒト化抗体は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｏｃｔ ５；２０３（３）：８２５−８，１９８８）、およびＪｏｎｅｓら（Ｊｏｎｅｓら Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，１９８６）に記載のような方法の１つにより調製することができる。
また、キメラ抗体は、例えば、「実験医学（臨時増刊号）、Ｖｏｌ．１．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４・２５５８５号公報等、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。本発明のＭＯＣＳ３タンパク質に結合する抗体は、例えば、癌細胞の増殖もしくは転移の抑制等を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
抗体は、診断剤として用いる場合は、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。必要に応じて、放射性物質、蛍光化合物などにより標識することができる。最も慣用の蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンおよびフルオレスカミンがある。同様に、生体発光性化合物を用いて、抗体ＭＯＣＳ３抗体を標識することもできる。生体発光性タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって測定される。この標識目的に重要な生体発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびイエクオリンである。
なお、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＭＯＣＳ３タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、ＭＯＣＳ３タンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＭＯＣＳ３タンパク質等の検出、被検細胞内におけるＭＯＣＳ３タンパク質の挙動の分析などのために使用することができる、
３．２ 抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する複合体など
また、本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体は、本発明の治療剤または診断剤において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。したがって、本発明は、もう一つの態様において、がん（例えば、大腸がん）の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、抗ＭＯＣＳ３抗体と他の薬剤との複合体、そのような複合体を含有する組成物などをも提供する。このような態様によれば、本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、治療効果を奏する他の薬剤または診断のための標識剤などを、ＭＯＣＳ３タンパク質を高発現する標的部位へ送達することができる。
本発明において用いられる「その他の薬剤」としては、例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターなどが例示される。
本発明において、「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性治治療剤あるいは放射性診断剤として広く利用し得る。例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（６７Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（９０Ｙ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）またはレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。
本発明において、「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、大腸がん細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 １９９６年 癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法 昭和５７年 医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターが使用し得る（例えば、アデノウイルスベクター（Ｗａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２１，４２９−４４１）、レトロウイルスベクター（Ｎａｖｉａｕｘ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０，５７０１−５７０５）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，４５７−４６３）などが挙げられる）。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、大腸がん）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＭＯＣＳ３抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＭＯＣＳ３抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＭＯＣＳ３抗体が認識する抗原（すなわち、ＭＯＣＳ３）が存在する部位に標的化することができる。
抗ＭＯＣＳ３抗体と上記他の薬剤とは、化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。
４．製剤化および製剤の投与方法
本発明のＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する治療剤、または本発明において使用する抗ＭＯＣＳ３抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療剤は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
本発明の治療剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としてのＭＯＣＳ３タンパク質の活性（またはＭＯＣＳ３遺伝子の発現）阻害物質は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の治療剤は、がん（例えば、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療、好ましくは、大腸がんの予防・治療に用いられる。
本発明の薬剤は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質またはＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されない。また、本発明の薬剤は、ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質およびＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。
本発明の治療剤において、アンチセンス核酸を用いる場合、該アンチセンス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、公知の手段に従って投与することができる。アンチセンス核酸は、単独で、あるいは生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
また、本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウイルスベクターと抗ＭＯＣＳ３抗体との組み合わせを癌治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０３〜１０１５個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＭＯＣＳ３抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＭＯＣＳ３抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。
５．がんの診断剤及び診断方法
本発明はまた、がんの診断剤を提供する。１つの好ましい態様において、本発明のがんの診断剤は、（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体、又は（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
５．１ 抗体ＭＯＣＳ３抗体を用いる診断剤及び診断方法
ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体は、ＭＯＣＳ３タンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中のＭＯＣＳ３タンパク質を定量することができる。具体的には、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体を用いる診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記抗体と、ＭＯＣＳ３タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を検出および／または定量する工程を包含する。好ましくは、上記検出および／または定量する工程において、標識された抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質またはその断片と抗ＭＯＣＳ３抗体との結合が検出および／または定量される。
本明細書中、「被験者由来の生体試料」は、被験者由来の組織、細胞、または体液（例えば、血液（全血、血漿、血清等を含む）、尿、リンパ液、唾液、汗、***等）を含む。また、「被験者」は、通常、がん検診を受ける、または受けることが望まれるヒト被験体であり、がんに罹患しているか、または罹患していると疑われるヒト被験体等が含まれる。このようながんの例としては、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、大腸がんが好ましい。
上記のような被験者由来の生体試料におけるＭＯＣＳ３の発現を検出するための免疫測定は、がん（例えば、大腸がん）を有すると疑われるか、がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、特異的抗原−抗体結合を生じさせる条件下で抗ＭＯＣＳ３抗体と接触させ、次いで、抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。このような抗体の結合を使用して、ＭＯＣＳ３タンパク質の存在および／または増大した発現が検出される。この場合、増大したＭＯＣＳ３タンパク質発現の検出が疾病状態の指標となる。必要に応じて、生体試料中のＭＯＣＳ３タンパク質のレベルを、がんを有しない健常者のレベルと比較してもよい。
上記免疫測定法の１つの態様では、例えば、血清試料などの生体試料を、試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体と接触させる。次いで、この支持体を緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識した抗ＭＯＣＳ３抗体により処理する。次いで、この固相支持体を緩衝液で２回洗浄し、未結合抗体を除去する。固相支持体上の結合した抗体の量を、周知の方法に従って測定する。各測定に適する検出条件は、慣用的な試験方法を使用して当業者により適宜決定され得る。
抗ＭＯＣＳ３抗体を検出可能に標識する方法の１つにおいて、当該抗体を、酵素、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に使用されるもののような酵素に結合させる［Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．による「酵素標識した免疫吸着アッセイ」（“Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ），１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１〜７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ．ＭＤ；Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７〜５２０，１９７８：Ｂｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．によるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２〜５２３，１９８１］。抗体に結合する酵素を、例えば分光光度測定により、可視手段による蛍光測定により検出することができる化学分子が生成されるような方法で、適当な基質、好ましくは色素原性基質と反応させる。抗体に検出可能な標識を付けるために使用することができる酵素は、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを包含するが、これらに限定されない。この検出はまた、酵素に対する色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。
その他の本発明において使用し得る方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ免疫測定法、イムノメトリック法、ネフロメトリー、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法などが挙げられる（ＷＯ００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行など参照）。
以上のように、本発明の抗体を用いる、生体内でのＭＯＣＳ３タンパク質の定量法を利用することにより、ＭＯＣＳ３タンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の濃度増加が検出された場合は、例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：大腸がん））である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
なお、本発明の抗ＭＯＣＳ３抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断に用いることもできる。ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、抗体−キレート剤について、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９９０ １７：２４７−２５４に記載されている。また、磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体については、例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２：３３９−３４２に記載されている。
５．２ ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）プローブを用いる診断剤及び診断方法
本発明の診断方法においては、ＭＯＣＳ３遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプローブ又はプライマーを用いることができる。具体的には、そのような診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチド（プローブ）とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程を包含する。
上記本発明の方法では、被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３遺伝子のＤＮＡ（またはその遺伝子断片）を、上記プローブを使用して検出および／または定量する。プローブとして用いる塩基配列の長さは、例えば、１２塩基以上、１５塩基以上、１８塩基以上、２１塩基以上、２４塩基以上、２７塩基以上、３０塩基以上、またはさらに長い長さのポリヌクレオチド断片であり得る。ハイブリダイゼーションには、上記した低、中又は高ストリンジェントな条件を使用し得る。なお、本明細書中、「ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列」には、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列（アンチセンスポリヌクレオチド）も含まれるものとする。プローブおよび核酸のハイブリダイゼーションの方法は当業者に知られており、例えば国際公開公報第８９／０６６９８号、ＥＰ−Ａ０２００３６２、米国特許第２，９１５，０８２号、ＥＰ−Ａ００６３８７９、ＥＰ−Ａ０１７３２５１、ＥＰ−Ａ０１２８０１８に記載されている。
本発明の診断方法においては、ＭＯＣＳ３遺伝子に対する特異的ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、公知の手法を用いて標的配列を検出または定量することができる。そのような公知の手法として、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年））、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））、ＦＩＳＨ法、ＤＮＡチップあるいはアレイＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。定量的な検出は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施可能である。 アレイＣＧＨ法は、染色体ＣＧＨ法（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，８１８−８２１）を応用した方法で、スライド上に染色体領域をカバーするゲノムＤＮＡ断片（ＢＡＣ，ＰＡＣ，ＹＡＣなど）を高密度にスポットしたＤＮＡチップを用いて、別々の色素で標識したがん由来ＤＮＡと正常ＤＮＡを、スライド上のゲノムＤＮＡ断片に対して同時にハイブリダイゼーションを行い、その結合状態を検出することにより、がんにおけるＤＮＡコピー数異常を高解像度に検出する方法である（Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０，２０７−２１１）。
なお、本発明においては、ＭＣＯＳ３遺伝子の発現が上方制御されるか否かを検出するために、細胞のＭＣＯＳ３のｍＲＮＡレベルを標準遺伝子（ハウスキーピング遺伝子（例えば、Ｓｈａｐｅｒ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３（１９９８）３１５−３２４；Ｗｕ，Ｙ．Ｙ．およびＲｅｅｓ，Ｊ．Ｌ．、Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．８０（２０００）２−３）のｍＲＮＡレベルと、好ましくはＲＴ−ＰＣＲによって比較することもできる。
上記のような手法によって標的配列（ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）を検出・定量し、ＭＯＣＳ３遺伝子の発現過多が確認された場合は、例えば、ＭＯＣＳ３の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：大腸がん、子宮頸がん））である可能性が高い、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
５．３診断用キット
本発明はまた、抗ＭＯＣＳ３抗体を含有する、被験者の体液試料中のＭＯＣＳ３タンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットを提供する。さらに、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有する、被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットをも提供する。これらのキットは、上述の免疫学的手法またはハイブリダイゼーション法等により、がんマーカーを検出するために用いられる。このようながんとしては、例えば、大腸がん、胃がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、大腸がんが好ましい。
本明細書中、「がんマーカー」とは、被験者の体液（例えば、血液、尿、リンパ液、唾液、汗、***等）または細胞もしくは組織中における、正常組織に由来していないか、あるいはがん細胞または組織において選択的に発現の亢進している分子のことをいい、被験者の体液または細胞もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示唆するものをいう。
上記第一の態様のキットは、被験者からの体液試料中のＭＯＣＳ３抗原（ＭＯＣＳ３タンパク質およびその部分ペプチドを含む）を検出および／または定量する成分を含有する。例えば、ＭＯＣＳ３タンパク質がＥＬＩＳＡで検出および／または定量される場合、このような成分は、例えば、組織切片、または血液や尿のような体液試料中のＭＯＣＳ３のレベルを検出および／または定量するために使用され得る。このような抗体は放射能、蛍光、比色、または酵素標識で標識されていてもよい。本発明のキットは、標識された二次抗体を含有していてもよい。
上記第二の態様のキットは、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。例えば、本発明のキットは、ＤＮＡチップ上に固定された上記ポリヌクレオチドを含有し得る。
本発明のキットは、抗ＭＯＣＳ３抗体、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列等の他に、代表的には、容器およびラベルを含んでいる。容器上のまたは容器に伴うラベルには、薬剤が大腸がんマーカーの検出に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書、標識二次抗体等がさらに含まれていてもよい。
以下、本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
実施例１：アレイＣＧＨ法による大腸がん特異的増幅遺伝子の同定
本実施例では、大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定するために、大腸がん検体２００症例のサンプル調製およびアレイＣＧＨ法に基づく検証を実施した。
その結果、大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内、公共ＤＢでの遺伝子情報（ＮＣＢＩ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を利用し、精査した結果、使用したＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰｌｌ−３７９Ｄ４に位置している、ＭＯＣＳ３（Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ３）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０１４４８４）遺伝子が大腸がん患者において高頻度で高値であることを見出した（図１，表２）。図１は、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん患者２００検体での増幅度に対する頻度を示すヒストグラムである。また、下記の表２は、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん患者２００検体での増幅度（Ｇ／Ｒ値）および頻度を示す。平均値は、Ｇ／Ｒ値が１．２以上の検体での平均値を示している。
表２に示されるように、ＭＯＣＳ３遺伝子は、２００検体の大腸がん患者の６８．５％において増幅が認められ、その増幅度の平均値は、１．７３であった。最大値は３．０９であり、非常に高頻度で顕著な増幅が起こっていた。
実施例２：大腸由来培養細胞株での遺伝子増幅度の検証
本実施例では、大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域について、大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。
＜サンプル調製＞
培養細胞株は、大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６，Ｃａｃｏ２を使用した。培養細胞よりＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、キット添付のプロトコールに従い、ゲノムＤＮＡを抽出した。
＜アレイＣＧＨ＞
遺伝子領域の増幅を確認するために、アレイＣＧＨを実施した。方法の詳細は実施例１と同様に実施した。
結果
表３に、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度（Ｇ／Ｒ値）を示した。示されるように、大腸がん由来細胞株においても、ＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−３７９Ｄ４に位置している、ＭＯＣＳ３遺伝子で増幅が起きていることを見出した。
＜定量的ＰＣＲ＞
ＭＯＣＳ３遺伝子領域の増幅を確認するために、定量的ＰＣＲを実施した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付のプロトコールに従い、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマーは、以下の配列を合成し（ＯＰＥＲＯＮに合成委託）使用した。
プライマー配列：
５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号３）
５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号４）
結果
表４に、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度を示した。値は対照ＤＮＡ（正常）との相対値を示している。示されるように、大腸がん由来細胞株においても、ＭＯＣＳ３遺伝子領域に増幅が起きていることを見出した。
これらの結果により、大腸がん由来の細胞株（ＲＫＯＥ６，Ｃａｃｏ２）においても、ＭＯＣＳ３遺伝子が増幅していることが確認された。よって、がんにおけるＭＯＣＳ３遺伝子の機能解析に使用可能な培養細胞が選択された。
実施例３：大腸がん細胞株を用いたＲＮＡｉ解析による機能解析
本実施例では、大腸がん患者２００検体において高頻度に増幅が認められたＭＯＣＳ３遺伝子について、大腸がん由来の細胞株であり、且つ、ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株（ＲＫＯＥ６）を用いて、ＲＮＡｉ解析を行い、その表現型を観察した。
＜ＲＮＡｉ解析＞
細胞株はＡＴＣＣより購入し、添付のプロトコールに従い培養を行った。ｓｉＲＮＡは遺伝子内の特異的な２１ｍｅｒを選択しその配列を標的とするｓｉＲＮＡを合成した（ＱＩＡＧＥＮに合成委託）。
ｓｉＲＮＡのＲＫＯＥ６細胞内への導入は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。細胞に導入後４日間、倒立顕微鏡下で観察した。
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｓｉＲＮＡの効果をｍＲＮＡレベルで検証した。ｓｉＲＮＡ導入後２４時間の細胞から、Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。
このｃＤＮＡを鋳型にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付のプロトコールに従い、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマーは、以下の配列を合成し（ＯＰＥＲＯＮに合成委託）使用した。
プライマー配列：
５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１１）
５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）
相対比を算出するための標準遺伝子にはＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＧＡＰＤＨの発現量を求め、相対比を算出した。
＜生細胞数の測定＞
ｓｉＲＮＡ導入後の生細胞数をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、添付のプロトコールに従い、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ／Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定した。
結果
大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６を用いて、ＭＯＣＳ３遺伝子のＲＮＡｉ解析を実施した。
図２に、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の観察像を示す（上段：×４０；下段：×２００）。ａ，ｂ，およびｃは、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種であり、ＮＣはネガティブコントロールを示す。示されるように、表現型の観察では、ａ、ｂ、およびｃ３種類のｓｉＲＮＡ共にＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）と比較して顕著に細胞数が減少していた（図２）。
図３には、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして２４時間後に細胞を回収し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの相対比を用いて、ＮＣに対する相対量を示した。示されるように、ＲＮＡレベルでの効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した結果、三種類のｓｉＲＮＡ共に顕著に発現量が減少していた（図３）。
図４には、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示した。示されるように、生細胞数の測定を行った結果、表現型同様、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）と比較して顕著に細胞数が減少していた（図４）。ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種（ａ，ｂ，ｃ）全てについて、ｔ検定において有意（ｐ＜０．０１）であった。
よって、ＲＮＡｉ効果によりＭＯＣＳ３遺伝子の発現が抑制された結果、ＲＫＯＥ６において、顕著にがん細胞の増殖が抑制されることが見出された。
実施例４：大腸由来正常細胞株を用いたＲＮＡｉ解析による機能解析
本実施例では、大腸の正常組織由来の細胞株を用いてＲＮＡｉ解析を実施することにより、標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを検証した。
＜ＲＮＡｉ解析＞
細胞株はＡＴＣＣより購入したＣＣＤ１８Ｃｏを使用した。培養条件は、添付のプロトコールに従った。使用したｓｉＲＮＡは、実施例３のａ配列を使用した。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。導入後５日間、倒立顕微鏡下で観察した。
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
実施例３の記載方法と同様に実施した。
＜生細胞数の測定＞
実施例３の記載方法と同様に実施した。
結果
ＭＯＣＳ３遺伝子の、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏでのＲＮＡｉの効果は以下の通りである。
図５に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、５日目に得た観察像を示す（上段：×４０；下段：×２００）。ａ，ｂ，およびｃは、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種であり、ＮＣはネガティブコントロールを示す。示されるように、表現型の観察では、ＮＣとほぼ同様で、効果は認められなかった（図５）。
図６に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして２４時間後に細胞を回収し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの相対比を用いて、ＮＣに対する相対量を示した。ＲＮＡレベルでの効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した結果、発現量の低下が認められた（図６）。
図７に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、５日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示す。その結果、表現型同様、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）とほぼ同様で、効果は認められなかった（図７）。
このことにより、大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６では、ＲＮＡｉ効果によりＭＯＣＳ３遺伝子の発現が抑制された結果、顕著にがん細胞の増殖が抑制されたが、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８Ｃｏでは影響が無いことが見出された。よって、ＭＯＣＳ３遺伝子が、正常細胞には影響が少ないことより、がん特異的な創薬標的遺伝子となりうることを見出した。
実施例５：臓器特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が正常組織でどのような臓器特異的な発現がされているのか、当該技術分野で公知のノーザンハイブリダイゼーション法により、実施した。
ＭＴＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、添付のプロトコールに従い、１０６ｂｐ（ＮＭ＿０１４４８４：３５−１４０）のＤＮＡ Ｐｒｏｂｅでハイブリダイゼーションを実施した。
結果
正常な各臓器組織でのＲＮＡレベルの発現分布について、２３種の臓器（心臓（Ｈｅａｒｔ）、脳（Ｂｒａｉｎ）、胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、睾丸（Ｔｅｓｔｉｓ）、卵巣（Ｏｖａｒｙ）、小腸（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、結腸（Ｃｏｌｏｎ）、末梢血白血球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ）、脊髄（Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ）、リンパ節（Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ）、気管（Ｔｒａｃｈｅａ）、副腎（Ａｄｒｅｎａｌ Ｇｌａｎｄ）、骨髄（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ））についてノーザンハイブリダイゼーション法により、解析した。なお、前述のとおり、ＭＯＣＳ３の遺伝子配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４４８４で２，４５８ｂｐの配列がｍＲＮＡとして登録されている。
図８は、正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。図に示すように、精巣において約２．５ｋｂ付近にバンドが認められ、他の臓器については、発現量が少ないことが確認された。正常組織において発現量が少なく、精巣特異的であることは、この遺伝子を標的にした薬剤の影響が正常組織に対して少ないことが推定できる。
実施例６：遺伝子増幅の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が検体組織内のがん細胞で遺伝子増幅が起きていることを、当該技術分野で公知のＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により実施した。
アレイＣＧＨ法により、遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった検体組織（大腸癌患者由来）を用いて、ＭＯＣＳ３遺伝子が位置するＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−３７９Ｄ４のＤＮＡ Ｐｒｏｂｅでハイブリダイゼーションを実施した。
検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子領域で遺伝子増幅がおきていることをＦＩＳＨ法により評価した。
結果
図９は、観察したがん細胞の一部（６細胞分）の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。示されるように、がん細胞においてシグナルが３スポット以上見出された。アレイＣＧＨ法により遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった１０検体において、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が増幅していることが確認された。また、病態ステージの初期から後期にわたり遺伝子増幅が起きていることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が、がん治療薬の分子標的としてだけでなく、ＦＩＳＨ法によるがん診断に応用できることを示している。
実施例７：がん特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が、がん検体組織で発現していることを、当該技術分野で公知の免疫染色法により実施した。
アレイＣＧＨ法により、遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった検体組織（大腸癌患者由来）を用いて、抗ＭＯＣＳ３遺伝子ポリクローナル抗体で免疫組織染色法を実施した。
結果
図１０は、検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子のタンパク質が発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す。図に示されるように、がん部特異的に発現していることが確認された。低分化腺がん部の、複数の核が重なり構造が不規則な上皮細胞で染色が認められた。一方、細胞が秩序良く整列した、粘膜固有層や正常な腸腺部での染色は、認められなかった。
アレイＣＧＨ法により遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった１０検体の内、１０検体のがん部でＭＯＣＳ３遺伝子の発現が確認され、遺伝子増幅が起きている検体において、高頻度に発現が亢進していることが示された。
また、病態ステージの初期から後期にわたり発現が亢進していることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が、がん治療薬の分子標的としてだけでなく、がん診断に応用できることを示している。
実施例８：子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ細胞株でのＲＮＡｉ効果の評価
大腸がん細胞株ではＭＯＣＳ３遺伝子のノックダウンにより、増殖抑制効果が認められたが、子宮頸がん細胞株においてどのような効果が認められるのか、前述のＲＮＡｉ解析法により、評価した。
子宮頸がん細胞であるＨｅＬａ細胞株を用いて、前出の３種のｓｉＲＮＡ（実施例３：表５）を用いて実施例３の記載方法と同様にＲＮＡｉ解析を実施した。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。
結果
図１１は、ＨｅＬａ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示した。図に示されるように、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種（ａ，ｂ，ｃ）の内、ｓｉＲＮＡ ｂにおいて１５％、ｓｉＲＮＡ ｃにおいて２５％の増殖抑制効果が認められた（ｐ＜０．０１のｔ検定において有意）。
さらに、時系列に従い、顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、その動態を詳細に観察した。その結果を、図１２に示す。図中、ａ、ｂ、およびｃはそれぞれ、図１１のｓｉＲＮＡａ、ｓｉＲＮＡｂ、およびｓｉＲＮＡｃに対応する。図１２に示されるように、増殖抑制が認められたｂ、ｃにおいて細胞死の誘導が認められた。（３日後のｂ、ｃにおいて、死細胞を赤点で示した。）
この結果よりＭＯＣＳ３遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、子宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。
実施例９：質量分析による血中ＭＯＣＳ３タンパク質の検出
１）血液検体の前処理
大腸癌患者の血清検体１０μＬ及び健常者血清検体１０μＬを、希釈バッファ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐｈ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５００μＬで希釈後、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＩｇＹ−１２ ＳＣ プロテオームパーティショニングキット（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ：Ａ２４６１８）を用いてアルブミン、グロブリン等の血清中多量蛋白質を除去した。得られた画分に終濃度１０ｍＭとなるようにジチオスレイトール（Ｗａｋｏ：０４９−０８９７２）を加え、還元反応を６０℃で３０分間行った。反応終了後、終濃度１０ｍＭとなるようにヨードアセトアミド（ＳＩＧＭＡ：１４４−４８−９）を加え、アルキル化反応を室温で３０分間、遮光状態で行った。反応終了後、反応液の４倍量の冷アセトン（Ｗａｋｏ：０１４−０８６８１，−２０℃）を加え、−８０℃に１時間静置した後に１５，０００ｘｇで３０分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。回収したタンパク質は８０μＬの２Ｍ尿素＋１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に溶解した。溶解後に一部をＢＣＡ法によるタンパク質濃度測定に供した。試料タンパク質と１／５０（ｗ／ｗ）となるようにトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｖ５１１Ｃ）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行った。
２）Ｎａｎｏ−ＨＰＬＣ直結質量分析装置による解析
ペプチド断片０．７μｇ量をμ−Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ３００，５μｍ，３００Å，３００μｍ ｉ．ｄ．ｘ５ｍｍ ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ：１６３５８９）と直結させたナノカラム（Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ ３μｍ，１００Å，７５μｍ ｉ．ｄ．ｘ１５０ｍｍ ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ：１６０３２１）により分離した。ＨＰＬＣ装置はＵｌｔｉｍａｔｅ Ｐｌｕｓ（ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ）を用いた。流速は２００ｎＬ／ｍｉｎ、０．１％ギ酸（Ｗａｋｏ：０６２−０２９０１）含有２％アセトニトリル（ＭＥＲＣＫ：１２８７２２９）と０．１％ギ酸含有９０％アセトニトリルの濃度勾配が０．５７％／ｍｉｎの直線グラジエントを設定して解析を行った。Ｎａｎｏ−ＨＰＬＣで分離した試料はＰｉｃｏＴｉｐ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＦＳ３６０−２０−１０−Ｄ−２０）を通して直結したイオントラップ型質量分析装置に連続的に導入した。質量分析装置はＨＣＴ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いた。試料のイオン化はキャピラリー電圧１５００Ｖ、エンドプレートオフセット値５００Ｖ、ドライガス流量１２Ｌ／ｍｉｎ、ドライガス温度２５０℃の条件で行った。イオントラップの設定は標的ｍ／ｚの前後２Ｄａの取り込みとし、ＭＲＭモードでのＭＳ／ＭＳ解析を行った。
３）データ解析
質量分析装置から得た全分析データはＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を介して出力した。出力した全データ中から標的分子の分析データのみを抽出した。抽出したデータの中から各分析時間におけるＭＳ／ＭＳデータを精査し、標的分子のフラグメントイオンに相当する質量を持つイオンピークの有無を解析した。
結果
図１３ＡおよびＢは、（Ａ）大腸がん患者由来の血清および（Ｂ）健常者由来の血清について、上記の方法で解析した結果をそれぞれ示す。
図１４Ａ〜Ｃは、ＭＳ／ＭＳ解析によって決定された、図１３に示すピークとアミノ酸（またはアミノ酸配列）との対応関係を示す。
図１３および１４に示されるように、標的分子のフラグメントイオンに相当するイオンピークが、大腸がん患者由来の血清中に明確に認められた。すなわち、図１４Ｂに示すように、少なくともＣ末端側からＥＰＳＬＬＱという部分配列が決定され、これは、ＭＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中の、３２８位〜３３３位のアミノ酸配列に相当することから、アミノ酸配列３２６位〜３３５位の標的ペプチドフラグメント（配列番号１３）が同定された。このような部分配列に対応するイオンピークは健常者血清を用いた解析では認められなかった（図１４Ｃを参照）。よって、この標的分子（すなわち、ＭＯＣＳ３タンパク質）は癌特異的に血中存在量が増加している可能性が強く示唆された。
実施例１０：種々のがん種における特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が、大腸がん以外の臓器癌で発現しているかどうかについて、当該技術分野で公知の免疫染色法により実施した。
３５種類の臓器の癌組織が９６サンプル配置された、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社）を用いて、抗ＭＯＣＳ３遺伝子ポリクローナル抗体で免疫組織染色法を実施した。
免疫組織染色法は、賦活化方法についてはＹａｍａｓｈｉｔａ Ｓ ＆ Ｏｋａｄａ Ｙ．（２００５）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．Ｎｏｖ；５３（１１）：１４２１−３２に、染色方法については、渡辺・中野 酵素抗体法 改訂四版（学際企画）に準じた。
ネガティブコントロールにウサギＩｇＧを使用した。
結果
３５種類の臓器（脳、食道、胃、肝、小腸、結腸、直腸、膵、網膜、肺、子宮頚部、子宮、乳、卵巣、脾、前立腺、精巣、腎、膀胱、リンパ節、縦隔、腸間膜、骨組織、喉頭軟骨、頬、唇、鼻、咽喉、喉頭、咽頭、舌、脂肪組織、線維組織、甲状腺、皮膚）のがん組織についてＭＯＣＳ３タンパク質の発現を免疫組織染色法で解析し、いくつかのがん種において特異的な発現が認められた。その結果を図１５−１および図１５−２に示す。
図１５−１および図１５−２は、解析した臓器の内、発現が認められた胃（Ａ：ｓｔｏｍａｃｈ）、結腸（Ｂ：ｃｏｌｏｎ）、直腸（Ｃ：ｒｅｃｔｕｍ）、網膜（Ｄ：ｅｐｉｐｌｏｏｎ）、肺（Ｅ、Ｆ、Ｇ：ｌｕｎｇ）、卵巣（Ｉ、Ｊ：ｏｖａｒｙ）、前立腺（Ｌ：ｐｒｏｓｔａｔｅ）、リンパ節（Ｍ：Ｌｙｍｐ ｎｏｄｅ）、骨組織（Ｏ：ｂｏｎｅ）、および縦隔（Ｒ：ｍｅｄｉａｓｔｉｎｕｍ）における結果を示す。また、弱いながらも、乳（Ｈ：ｂｒｅａｓｔ）、脾臓（Ｋ：ｓｐｌｅｅｎ）、咽喉（Ｐ：ｔｈｒｏａｔ）、および脂肪組織（Ｑ：ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅ）においても発現が認められた。
傾向としてリンパ腫において比較的顕著な発現が認められた（図１５−１Ｂ、図１５−２Ｋ、Ｍ、Ｎ、およびＲ）。また、ＭＯＣＳ３は腺腫において発現が認められた（図１５−１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、および図１５−２Ｌ）。
これにより、ＭＯＣＳ３が幅広いがん種で発現が亢進していることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３が、がん治療薬の分子標的としてのがん特異性が示されたと同時に、大腸がんだけではなく、幅広いがん種に対しての適用が可能であることが示唆された。これは、がん診断への応用においても同様であり、ＭＯＣＳ３の重大な有効性を示唆している。
本実施例では、大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定するために、大腸がん検体２００症例のサンプル調製およびアレイＣＧＨ法に基づく検証を実施した。
その結果、大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内、公共ＤＢでの遺伝子情報（ＮＣＢＩ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を利用し、精査した結果、使用したＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰｌｌ−３７９Ｄ４に位置している、ＭＯＣＳ３（Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ３）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０１４４８４）遺伝子が大腸がん患者において高頻度で高値であることを見出した（図１，表２）。図１は、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん患者２００検体での増幅度に対する頻度を示すヒストグラムである。また、下記の表２は、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん患者２００検体での増幅度（Ｇ／Ｒ値）および頻度を示す。平均値は、Ｇ／Ｒ値が１．２以上の検体での平均値を示している。
表２に示されるように、ＭＯＣＳ３遺伝子は、２００検体の大腸がん患者の６８．５％において増幅が認められ、その増幅度の平均値は、１．７３であった。最大値は３．０９であり、非常に高頻度で顕著な増幅が起こっていた。
本実施例では、大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域について、大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。
＜サンプル調製＞
培養細胞株は、大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６，Ｃａｃｏ２を使用した。培養細胞よりＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、キット添付のプロトコールに従い、ゲノムＤＮＡを抽出した。
＜アレイＣＧＨ＞
遺伝子領域の増幅を確認するために、アレイＣＧＨを実施した。方法の詳細は実施例１と同様に実施した。
結果
表３に、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度（Ｇ／Ｒ値）を示した。示されるように、大腸がん由来細胞株においても、ＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−３７９Ｄ４に位置している、ＭＯＣＳ３遺伝子で増幅が起きていることを見出した。
ＭＯＣＳ３遺伝子領域の増幅を確認するために、定量的ＰＣＲを実施した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付のプロトコールに従い、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマーは、以下の配列を合成し（ＯＰＥＲＯＮに合成委託）使用した。
プライマー配列：
５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号３）
５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号４）
結果
表４に、ＭＯＣＳ３遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度を示した。値は対照ＤＮＡ（正常）との相対値を示している。示されるように、大腸がん由来細胞株においても、ＭＯＣＳ３遺伝子領域に増幅が起きていることを見出した。
実施例３：大腸がん細胞株を用いたＲＮＡｉ解析による機能解析
本実施例では、大腸がん患者２００検体において高頻度に増幅が認められたＭＯＣＳ３遺伝子について、大腸がん由来の細胞株であり、且つ、ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株（ＲＫＯＥ６）を用いて、ＲＮＡｉ解析を行い、その表現型を観察した。
＜ＲＮＡｉ解析＞
細胞株はＡＴＣＣより購入し、添付のプロトコールに従い培養を行った。ｓｉＲＮＡは遺伝子内の特異的な２１ｍｅｒを選択しその配列を標的とするｓｉＲＮＡを合成した（ＱＩＡＧＥＮに合成委託）。
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｓｉＲＮＡの効果をｍＲＮＡレベルで検証した。ｓｉＲＮＡ導入後２４時間の細胞から、Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。
このｃＤＮＡを鋳型にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付のプロトコールに従い、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマーは、以下の配列を合成し（ＯＰＥＲＯＮに合成委託）使用した。
プライマー配列：
５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１１）
５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）
相対比を算出するための標準遺伝子にはＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＧＡＰＤＨの発現量を求め、相対比を算出した。
＜生細胞数の測定＞
ｓｉＲＮＡ導入後の生細胞数をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、添付のプロトコールに従い、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ／Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定した。
結果
大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６を用いて、ＭＯＣＳ３遺伝子のＲＮＡｉ解析を実施した。
図２に、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の観察像を示す（上段：×４０；下段：×２００）。ａ，ｂ，およびｃは、それぞれＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種であり、ＮＣはネガティブコントロールを示す。示されるように、表現型の観察では、ａ、ｂ、およびｃ３種類のｓｉＲＮＡ共にＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）と比較して顕著に細胞数が減少していた（図２）。
図３には、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして２４時間後に細胞を回収し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの相対比を用いて、ＮＣに対する相対量を示した。示されるように、ＲＮＡレベルでの効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した結果、三種類のｓｉＲＮＡ共に顕著に発現量が減少していた（図３）。
図４には、ＲＫＯＥ６細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示した。示されるように、生細胞数の測定を行った結果、表現型同様、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）と比較して顕著に細胞数が減少していた（図４）。ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種（ａ，ｂ，ｃ）全てについて、ｔ検定において有意（ｐ＜０．０１）であった。
よって、ＲＮＡｉ効果によりＭＯＣＳ３遺伝子の発現が抑制された結果、ＲＫＯＥ６において、顕著にがん細胞の増殖が抑制されることが見出された。
実施例４：大腸由来正常細胞株を用いたＲＮＡｉ解析による機能解析
本実施例では、大腸の正常組織由来の細胞株を用いてＲＮＡｉ解析を実施することにより、標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを検証した。
＜ＲＮＡｉ解析＞
細胞株はＡＴＣＣより購入したＣＣＤ１８Ｃｏを使用した。培養条件は、添付のプロトコールに従った。使用したｓｉＲＮＡは、実施例３のａ配列を使用した。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。導入後５日間、倒立顕微鏡下で観察した。
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
実施例３の記載方法と同様に実施した。
＜生細胞数の測定＞
実施例３の記載方法と同様に実施した。
結果
ＭＯＣＳ３遺伝子の、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８ＣｏでのＲＮＡｉの効果は以下の通りである。
図５に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、５日目に得た観察像を示す（上段：×４０；下段：×２００）。ａ，ｂ，およびｃは、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種であり、ＮＣはネガティブコントロールを示す。示されるように、表現型の観察では、ＮＣとほぼ同様で、効果は認められなかった（図５）。
図６に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして２４時間後に細胞を回収し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの相対比を用いて、ＮＣに対する相対量を示した。ＲＮＡレベルでの効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した結果、発現量の低下が認められた（図６）。
図７に、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、５日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示す。その結果、表現型同様、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）とほぼ同様で、効果は認められなかった（図７）。
このことにより、大腸がん由来の細胞株であるＲＫＯＥ６では、ＲＮＡｉ効果によりＭＯＣＳ３遺伝子の発現が抑制された結果、顕著にがん細胞の増殖が抑制されたが、大腸正常組織由来の細胞株ＣＣＤ１８Ｃｏでは影響が無いことが見出された。よって、ＭＯＣＳ３遺伝子が、正常細胞には影響が少ないことより、がん特異的な創薬標的遺伝子となりうることを見出した。
実施例５：臓器特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が正常組織でどのような臓器特異的な発現がされているのか、当該技術分野で公知のノーザンハイブリダイゼーション法により、実施した。
ＭＴＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、添付のプロトコールに従い、１０６ｂｐ（ＮＭ＿０１４４８４：３５−１４０）のＤＮＡ Ｐｒｏｂｅでハイブリダイゼーションを実施した。
結果
正常な各臓器組織でのＲＮＡレベルの発現分布について、２３種の臓器（心臓（Ｈｅａｒｔ）、脳（Ｂｒａｉｎ）、胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、睾丸（Ｔｅｓｔｉｓ）、卵巣（Ｏｖａｒｙ）、小腸（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、結腸（Ｃｏｌｏｎ）、末梢血白血球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ）、脊髄（Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ）、リンパ節（Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ）、気管（Ｔｒａｃｈｅａ）、副腎（Ａｄｒｅｎａｌ Ｇｌａｎｄ）、骨髄（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ））についてノーザンハイブリダイゼーション法により、解析した。なお、前述のとおり、ＭＯＣＳ３の遺伝子配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４４８４で２，４５８ｂｐの配列がｍＲＮＡとして登録されている。
図８は、正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。図に示すように、精巣において約２．５ｋｂ付近にバンドが認められ、他の臓器については、発現量が少ないことが確認された。正常組織において発現量が少なく、精巣特異的であることは、この遺伝子を標的にした薬剤の影響が正常組織に対して少ないことが推定できる。
実施例６：遺伝子増幅の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が検体組織内のがん細胞で遺伝子増幅が起きていることを、当該技術分野で公知のＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により実施した。
アレイＣＧＨ法により、遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった検体組織（大腸癌患者由来）を用いて、ＭＯＣＳ３遺伝子が位置するＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−３７９Ｄ４のＤＮＡ Ｐｒｏｂｅでハイブリダイゼーションを実施した。
検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子領域で遺伝子増幅がおきていることをＦＩＳＨ法により評価した。
結果
図９は、観察したがん細胞の一部（６細胞分）の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。示されるように、がん細胞においてシグナルが３スポット以上見出された。アレイＣＧＨ法により遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった１０検体において、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が増幅していることが確認された。また、病態ステージの初期から後期にわたり遺伝子増幅が起きていることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が、がん治療薬の分子標的としてだけでなく、ＦＩＳＨ法によるがん診断に応用できることを示している。
実施例７：がん特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が、がん検体組織で発現していることを、当該技術分野で公知の免疫染色法により実施した。
アレイＣＧＨ法により、遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった検体組織（大腸癌患者由来）を用いて、抗ＭＯＣＳ３遺伝子ポリクローナル抗体で免疫組織染色法を実施した。
結果
図１０は、検体組織のがん細胞においてＭＯＣＳ３遺伝子のタンパク質が発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す。図に示されるように、がん部特異的に発現していることが確認された。低分化腺がん部の、複数の核が重なり構造が不規則な上皮細胞で染色が認められた。一方、細胞が秩序良く整列した、粘膜固有層や正常な腸腺部での染色は、認められなかった。
アレイＣＧＨ法により遺伝子増幅度（Ｇ／Ｒ）が１．２以上であった１０検体の内、１０検体のがん部でＭＯＣＳ３遺伝子の発現が確認され、遺伝子増幅が起きている検体において、高頻度に発現が亢進していることが示された。
また、病態ステージの初期から後期にわたり発現が亢進していることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３遺伝子領域が、がん治療薬の分子標的としてだけでなく、がん診断に応用できることを示している。
実施例８：子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ細胞株でのＲＮＡｉ効果の評価
大腸がん細胞株ではＭＯＣＳ３遺伝子のノックダウンにより、増殖抑制効果が認められたが、子宮頸がん細胞株においてどのような効果が認められるのか、前述のＲＮＡｉ解析法により、評価した。
子宮頸がん細胞であるＨｅＬａ細胞株を用いて、前出の３種のｓｉＲＮＡ（実施例３：表５）を用いて実施例３の記載方法と同様にＲＮＡｉ解析を実施した。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。
結果
図１１は、ＨｅＬａ細胞にＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、４日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。グラフはＮＣに対する相対量を示した。図に示されるように、ＭＯＣＳ３遺伝子のｓｉＲＮＡ３種（ａ，ｂ，ｃ）の内、ｓｉＲＮＡ ｂにおいて１５％、ｓｉＲＮＡ ｃにおいて２５％の増殖抑制効果が認められた（ｐ＜０．０１のｔ検定において有意）。
さらに、時系列に従い、顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、その動態を詳細に観察した。その結果を、図１２に示す。図中、ａ、ｂ、およびｃはそれぞれ、図１１のｓｉＲＮＡａ、ｓｉＲＮＡｂ、およびｓｉＲＮＡｃに対応する。図１２に示されるように、増殖抑制が認められたｂ、ｃにおいて細胞死の誘導が認められた。（３日後のｂ、ｃにおいて、死細胞を赤点で示した。）
この結果よりＭＯＣＳ３遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、子宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。
実施例９：質量分析による血中ＭＯＣＳ３タンパク質の検出
１）血液検体の前処理
大腸癌患者の血清検体１０μＬ及び健常者血清検体１０μＬを、希釈バッファ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐｈ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５００μＬで希釈後、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＩｇＹ−１２ ＳＣ プロテオームパーティショニングキット（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ：Ａ２４６１８）を用いてアルブミン、グロブリン等の血清中多量蛋白質を除去した。得られた画分に終濃度１０ｍＭとなるようにジチオスレイトール（Ｗａｋｏ：０４９−０８９７２）を加え、還元反応を６０℃で３０分間行った。反応終了後、終濃度１０ｍＭとなるようにヨードアセトアミド（ＳＩＧＭＡ：１４４−４８−９）を加え、アルキル化反応を室温で３０分間、遮光状態で行った。反応終了後、反応液の４倍量の冷アセトン（Ｗａｋｏ：０１４−０８６８１，−２０℃）を加え、−８０℃に１時間静置した後に１５，０００ｘｇで３０分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。回収したタンパク質は８０μＬの２Ｍ尿素＋１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に溶解した。溶解後に一部をＢＣＡ法によるタンパク質濃度測定に供した。試料タンパク質と１／５０（ｗ／ｗ）となるようにトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｖ５１１Ｃ）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行った。
２）Ｎａｎｏ−ＨＰＬＣ直結質量分析装置による解析
ペプチド断片０．７μｇ量をμ−Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ３００，５μｍ，３００Å，３００μｍ ｉ．ｄ．ｘ５ｍｍ ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ：１６３５８９）と直結させたナノカラム（Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ ３μｍ，１００Å，７５μｍ ｉ．ｄ．ｘ１５０ｍｍ ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ：１６０３２１）により分離した。ＨＰＬＣ装置はＵｌｔｉｍａｔｅ Ｐｌｕｓ（ＬＣ ＰＡＣＫＩＮＧＳ）を用いた。流速は２００ｎＬ／ｍｉｎ、０．１％ギ酸（Ｗａｋｏ：０６２−０２９０１）含有２％アセトニトリル（ＭＥＲＣＫ：１２８７２２９）と０．１％ギ酸含有９０％アセトニトリルの濃度勾配が０．５７％／ｍｉｎの直線グラジエントを設定して解析を行った。Ｎａｎｏ−ＨＰＬＣで分離した試料はＰｉｃｏＴｉｐ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＦＳ３６０−２０−１０−Ｄ−２０）を通して直結したイオントラップ型質量分析装置に連続的に導入した。質量分析装置はＨＣＴ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いた。試料のイオン化はキャピラリー電圧１５００Ｖ、エンドプレートオフセット値５００Ｖ、ドライガス流量１２Ｌ／ｍｉｎ、ドライガス温度２５０℃の条件で行った。イオントラップの設定は標的ｍ／ｚの前後２Ｄａの取り込みとし、ＭＲＭモードでのＭＳ／ＭＳ解析を行った。
３）データ解析
質量分析装置から得た全分析データはＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を介して出力した。出力した全データ中から標的分子の分析データのみを抽出した。抽出したデータの中から各分析時間におけるＭＳ／ＭＳデータを精査し、標的分子のフラグメントイオンに相当する質量を持つイオンピークの有無を解析した。
結果
図１３ＡおよびＢは、（Ａ）大腸がん患者由来の血清および（Ｂ）健常者由来の血清について、上記の方法で解析した結果をそれぞれ示す。
図１４Ａ〜Ｃは、ＭＳ／ＭＳ解析によって決定された、図１３に示すピークとアミノ酸（またはアミノ酸配列）との対応関係を示す。
図１３および１４に示されるように、標的分子のフラグメントイオンに相当するイオンピークが、大腸がん患者由来の血清中に明確に認められた。すなわち、図１４Ｂに示すように、少なくともＣ末端側からＥＰＳＬＬＱという部分配列が決定され、これは、ＭＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中の、３２８位〜３３３位のアミノ酸配列に相当することから、アミノ酸配列３２６位〜３３５位の標的ペプチドフラグメント（配列番号１３）が同定された。このような部分配列に対応するイオンピークは健常者血清を用いた解析では認められなかった（図１４Ｃを参照）。よって、この標的分子（すなわち、ＭＯＣＳ３タンパク質）は癌特異的に血中存在量が増加している可能性が強く示唆された。
実施例１０：種々のがん種における特異性の評価
ＭＯＣＳ３遺伝子が、大腸がん以外の臓器癌で発現しているかどうかについて、当該技術分野で公知の免疫染色法により実施した。
３５種類の臓器の癌組織が９６サンプル配置された、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社）を用いて、抗ＭＯＣＳ３遺伝子ポリクローナル抗体で免疫組織染色法を実施した。
免疫組織染色法は、賦活化方法についてはＹａｍａｓｈｉｔａ Ｓ ＆ Ｏｋａｄａ Ｙ．（２００５）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．Ｎｏｖ；５３（１１）：１４２１−３２に、染色方法については、渡辺・中野 酵素抗体法 改訂四版（学際企画）に準じた。
ネガティブコントロールにウサギＩｇＧを使用した。
結果
３５種類の臓器（脳、食道、胃、肝、小腸、結腸、直腸、膵、網膜、肺、子宮頚部、子宮、乳、卵巣、脾、前立腺、精巣、腎、膀胱、リンパ節、縦隔、腸間膜、骨組織、喉頭軟骨、頬、唇、鼻、咽喉、喉頭、咽頭、舌、脂肪組織、線維組織、甲状腺、皮膚）のがん組織についてＭＯＣＳ３タンパク質の発現を免疫組織染色法で解析し、いくつかのがん種において特異的な発現が認められた。その結果を図１５−１および図１５−２に示す。
図１５−１および図１５−２は、解析した臓器の内、発現が認められた胃（Ａ：ｓｔｏｍａｃｈ）、結腸（Ｂ：ｃｏｌｏｎ）、直腸（Ｃ：ｒｅｃｔｕｍ）、網膜（Ｄ：ｅｐｉｐｌｏｏｎ）、肺（Ｅ、Ｆ、Ｇ：ｌｕｎｇ）、卵巣（Ｉ、Ｊ：ｏｖａｒｙ）、前立腺（Ｌ：ｐｒｏｓｔａｔｅ）、リンパ節（Ｍ：Ｌｙｍｐ ｎｏｄｅ）、骨組織（Ｏ：ｂｏｎｅ）、および縦隔（Ｒ：ｍｅｄｉａｓｔｉｎｕｍ）における結果を示す。また、弱いながらも、乳（Ｈ：ｂｒｅａｓｔ）、脾臓（Ｋ：ｓｐｌｅｅｎ）、咽喉（Ｐ：ｔｈｒｏａｔ）、および脂肪組織（Ｑ：ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅ）においても発現が認められた。
傾向としてリンパ腫において比較的顕著な発現が認められた（図１５−１Ｂ、図１５−２Ｋ、Ｍ、Ｎ、およびＲ）。また、ＭＯＣＳ３は腺腫において発現が認められた（図１５−１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、および図１５−２Ｌ）。
これにより、ＭＯＣＳ３が幅広いがん種で発現が亢進していることが示された。このことは、ＭＯＣＳ３が、がん治療薬の分子標的としてのがん特異性が示されたと同時に、大腸がんだけではなく、幅広いがん種に対しての適用が可能であることが示唆された。これは、がん診断への応用においても同様であり、ＭＯＣＳ３の重大な有効性を示唆している。
本発明は、がんの治療剤、診断剤、診断方法、治療方法、ならびにそれに使用するキットなどを提供する。したがって、本発明は、がんの診断、または標的治療等の分野において有用である。
［配列表］
［配列表］
Claims (26)
- ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
- 前記ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質が、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸、
（ｂ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、
および
（ｃ）ＭＯＣＳ３遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸、
からなる群から選択される物質を含む、請求項１に記載のがん治療剤。 - ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
- 前記ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質が、
該ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体、
を含む、請求項３に記載のがん治療剤。 - 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、請求項１〜４のいずれかに記載のがん治療剤。
- ＭＯＣＳ３遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。 - ＭＯＣＳ３タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する工程、および
（ｃ）該ＭＯＣＳ３タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。 - 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、請求項６または７に記載の方法。
- ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体。
- 請求項９に記載の抗体を含有するがん治療剤。
- 放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、請求項１０に記載のがん治療剤。
- 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、請求項１０または１１に記載のがん治療剤。
- 請求項９に記載の抗体を含有するがん診断剤。
- ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有するがん診断剤。
- 前記がんが大腸がんである、請求項１３または１４に記載のがん診断剤。
- 請求項９に記載の抗体を含有するがん診断用キット。
- ＭＯＣＳ３遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。
- 前記がんが大腸がんである、請求項１６または１７に記載のがん診断用キット。
- 被験者由来の生体試料中のＭＯＣＳ３タンパク質またはＭＯＣＳ３遺伝子をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
- 前記生体試料が、全血、血清、または血漿である、請求項１９に記載の方法。
- 質量分析装置を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、請求項１９または２０に記載の方法。
- 抗ＭＯＣＳ３抗体を用いて、ＭＯＣＳ３タンパク質を検出および／または定量する、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
- （ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）前記試料中での前記抗体と、ＭＯＣＳ３タンパク質との結合を検出および／または定量する工程、
を包含する、請求項２２に記載の方法。 - （ａ）被験者由来の生体試料と、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、ＭＯＣＳ３遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程、
を包含する、請求項１９または２０に記載の方法。 - がんの診断に用いるための請求項１９〜２４のいずれかに記載の方法。
- 前記がんが、大腸がんである、請求項２５に記載の方法。
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2006
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| Publication number | Publication date |
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| WO2007026960A1 (ja) | 2007-03-08 |
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