ES2853204T3 - Inhibidores de MetAP2 conjugado con polímero, y métodos terapéuticos de uso de los mismos - Google Patents

Inhibidores de MetAP2 conjugado con polímero, y métodos terapéuticos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que, independientemente para cada aparición: R4 es H o -alquilo de C1-C6; R5 es H o -alquilo de C1-C6; R6 es hidroxialquilo de C2-C6; Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W; AA1 es glicina, alanina o H2N(CH2)mCO2H; AA2, AA3 y AA4 se seleccionan, cada uno independientemente, de un enlace, o alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina; AA5 es un enlace, o glicina, valina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, o asparagina; AA6 es un enlace, o alanina, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, o H2N(CH2)mCO2H; Q-X-Y es **(Ver fórmula)** o W es **(Ver fórmula)** x está en el intervalo de 1 a alrededor de 450; y está en el intervalo de 1 a alrededor de 30; m es 2, 3, 4 o 5; n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50; y el compuesto tiene un peso molecular de menos de alrededor de 60 kDa.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de MetAP2 conjugado con polímero, y métodos terapéuticos de uso de los mismos
SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta Solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos de América, número de serie 61/347.924, presentada el 25 de mayo de 2010.
ANTECEDENTES
Helmut Ringsdorf proporcionó un marco teórico para el diseño de conjugados poliméricos de fármacos de moléculas pequeñas hace más de treinta años (véase Ringsdorf, “Structure and Properties of Pharmacologically Active Polymers”, J. POLYMER SCI.: Symposium No. 51, 135-153 (1975)). Si bien se han sintetizado y evaluado muchos conjugados en animales, pocos han progresado a ensayos clínicos, y esos ensayos han sido en gran medida decepcionantes. La identificación de conjugados de polímero-fármaco que representan mejoras sobre las pequeñas moléculas originales sigue siendo un área de investigación activa.
La fumagilina es una molécula pequeña que se ha utilizado como agente antimicrobiano y antiprotozoario. Sus propiedades fisicoquímicas y su método de producción son bien conocidos (véanse la Patente U.S. n° 2.803.586 (Peterson, et al.) y Turner, J. R. et al., The Stereochemistry of Fumagillin, Proc. Natl. Acad. Sci. 48, 733-735 (1962)). El producto de fermentación, fumagilina, puede hidrolizarse para producir el alcohol fumagilol, que a su vez puede convertirse en diversos derivados, incluyendo el carbamoilfumagilol, MW 325. La síntesis y preparación del carbamoilfumagilol y algunos derivados de moléculas pequeñas se describen en la Patente U.S. n° 5.166.172.
Se cree que la fumagilina y los compuestos relacionados ejercen sus efectos biológicos mediante la inhibición de la metionina aminopeptidasa-2 (MetAP2), una metaloproteasa. Esta enzima elimina la metionina N-terminal de las proteínas celulares nacientes. (Véase Tucker, L.A., et al. “Ectopic Expression of Methionine Aminopeptidase-2 Causes Cell Transformation and Stimulates Proliferation”, Oncogene 27, 3967 (2008)).
El carbamoilfumagilol y sus derivados, así como otros inhibidores de MetAP2, han mostrado beneficios terapéuticos en estudios clínicos y preclínicos. Estos compuestos inhiben la proliferación celular y la angiogénesis, como se describe en la patente U.S. n° 5.166.172 (Kishimoto, et al). Uno de estos derivados, el cloroacetilcarbamoilfumagilol (TNP-470), se ha estudiado extensamente. (Véase H. Mann-Steinberg, et al., “TNP-470: The Resurrection of the First Synthetic Angiogenesis Inhibitor”, Capítulo 35 en Folkman y Figg, Angiogenesis: An Integrative Approach from Science to Medicine, Springer NY (2008)). TNP-470 ha mostrado actividad contra muchos cánceres, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de mama y cáncer de colon. Debido a la neurotoxicidad que limita la dosis, el TNP-470 se ha ensayado utilizando múltiples regímenes de dosificación, pero estos intentos de limitar su toxicidad no han tenido éxito. De este modo, se ha descubierto que TNP-470 es demasiado tóxico para el uso humano. Con pocas excepciones, se observó una pérdida de peso inaceptable o falta de aumento de peso en animales que recibieron TNP-470. El TNP-470 tiene una vida media corta, y requiere una administración intravenosa prolongada para uso terapéutico. Un metabolito del TNP-470, el carbamoilfumagilol, tiene una vida media de 12 minutos en el hombre. (Véase Herbst et al., “Safety and Pharmacokinetic Effects of TNP-470, an Angiogenesis Inhibitor, Combined with Paclitaxel in Patients with Solid Tumors: Evidence for Activity in Non-Small-Cell Lung Cancer”, Journal of Clinical Oncology 20(22) 4440-4447 (2002). Además, la fumagilina y sus derivados son hidrófobos y difíciles de formular.
La metionina aminopeptidasa-2 (MetAP2), una metaloproteasa, es una enzima que procesa la metionina N-terminal de las proteínas celulares nacientes. Se ha demostrado que la inhibición de MetAP2 bloquea la angiogénesis y suprime el crecimiento tumoral en modelos tumorales preclínicos. Curiosamente, se ha demostrado que la fumagilina, el cloroacetilcarbamoilfumagilol, el carbamoilfumagilol, y compuestos relacionados, son inhibidores de MetAP2. (Véase Tucker, L.A., et al. “Ectopic Expression of Methionine Aminopeptidase-2 Causes Cell Transformation and Stimulates Proliferation”, Oncogene 27, 3967 (2008)).
El documento WO 2009/141826 A2 describe conjugados de polímeros que tienen un agente terapéuticamente activo y un resto dirigido contra la angiogénesis unido al mismo, y usos de los mismos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis.
SUMARIO
Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I):
Figure imgf000002_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, independientemente para cada aparición:
R4 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R5 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R6 es hidroxialquilo de C2-C6 ;
Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W;
AA1 es glicina, alanina o H2N(CH2)mCO2H;
AA2 , AA3 y AA4 se seleccionan, cada uno independientemente, de un enlace, o alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina;
AA5 es un enlace, o glicina, valina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, o asparagina; AA6 es un enlace, o alanina, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, o H2N (CH2)mCO2H;
Q-X-Y es
Figure imgf000003_0001
W es
Figure imgf000003_0002
x está en el intervalo de 1 a alrededor de 450;
y está en el intervalo de 1 a alrededor de 30;
m es 2, 3, 4 o 5;
n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50; y
el compuesto tiene un peso molecular de menos de alrededor de 60 kDa.
En algunas realizaciones, el compuesto es:
Figure imgf000004_0001
en el que la relación de x:y es alrededor de 11:1, y n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50. En algunas realizaciones, el compuesto es:
Figure imgf000004_0002
en el que la relación de x:y es alrededor de 11:1, y n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (II):
Z-Q-X-Y-C(O)-W (II)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que, independientemente para cada aparición:
Z es H2N-CH2-C(O)- o -H; y
Q-X-Y es
Figure imgf000005_0001
En algunas realizaciones, el compuesto es:
Figure imgf000005_0002
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de la presente invención para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de un tumor sólido, un cáncer hematológico, enfermedad de las arterias coronarias, fibrosis pulmonar, accidente cerebrovascular, o heridas crónicas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el cambio porcentual de peso en función del tiempo para ratones C57B1/6, inyectados inicialmente con células tumorales B16-F10 (1 x 105), a los que se ha administrado uno de los tres conjugados poliméricos (dosificados a 100 mg/kg, q4d). Se incluyen datos comparativos para TNP-470 (dosificado a 30 mg/kg, qod) y control de disolución salina.
La Figura 2 muestra el cambio porcentual de peso en función del tiempo para ratones C57B1/6, inyectados inicialmente con células tumorales B16-F10 (1 x 105), a los que se ha administrado un conjugado polimérico (dosificado a 100, 50 y 25 mg/kg, q4d). Se incluyen datos comparativos para TNP-470 (dosificado a 30 mg/kg, qod) y control de disolución salina.
La Figura 3 muestra el cambio en el tamaño del tumor en función del tiempo para ratones nu/nu, inyectados inicialmente con células tumorales A549, a los que se ha administrado uno de los tres conjugados poliméricos (dosificados a 20 mg/kg, q4d). Se incluyen datos comparativos para TNP-470 (30 mg/kg, qod), un polímero sin fármaco (100 mg/kg, q4d), y control de disolución salina.
La Figura 4 muestra el cambio en el peso corporal en función del tiempo para ratones nu/nu, inyectados inicialmente con células tumorales A549, a los que se ha administrado uno de los tres conjugados poliméricos (dosificados a 20 mg/kg, q4d). Se incluyen datos comparativos para TNP-470 (30 mg/kg, qod), un polímero sin fármaco (100 mg/kg, q4d), y control de disolución salina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I):
Figure imgf000006_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, independientemente para cada aparición:
R4 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R5 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R6 es hidroxialquilo de C2-C6 ;
Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W;
AA1 es glicina, alanina o H2N(CH2)mCO2H;
AA2 , AA3 y AA4 se seleccionan, cada uno independientemente, de un enlace, o alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina;
AA5 es un enlace, o glicina, valina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, o asparagina; AA6 es un enlace, o alanina, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, o H2N(CH2)mCO2 H;
Q-X-Y es
Figure imgf000006_0002
y está en el intervalo de 1 a alrededor de 30;
m es 2, 3, 4 o 5;
n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50; y
el compuesto tiene un peso molecular de menos de alrededor de 60 kDa.
En ciertas realizaciones, R4 es alquilo de C1-C6. En ciertas realizaciones, R4 es metilo. En ciertas realizaciones, R5 es alquilo de C1-C6. En ciertas realizaciones, R5 es metilo. En ciertas realizaciones, R6 es 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o 3-hidroxipropilo. En ciertas realizaciones, R6 es 2-hidroxipropilo.
En otras realizaciones, el peso molecular es menor que alrededor de 45 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular es menor que alrededor de 35 kDa.
En ciertas realizaciones, la relación de x a y está en el intervalo de alrededor de 30:1 a alrededor de 3:1. En otras realizaciones, la relación de x a y está en el intervalo de alrededor de 20:1 a alrededor de 4:1. En ciertas realizaciones, la relación de x a y está en el intervalo de alrededor de 15:1 a alrededor de 6:1. En ciertas realizaciones, la relación de x a y es alrededor de 15:1. En ciertas realizaciones, la relación de x a y es alrededor de 11:1. En ciertas realizaciones, la relación de x a y es alrededor de 6:1.
Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W. En ciertas realizaciones, AA1 es glicina. En ciertas realizaciones, AA2 es glicina. En ciertas realizaciones, AA3 es glicina. En ciertas realizaciones, AA4 es glicina o fenilalanina. En ciertas realizaciones, AA5 es leucina, fenilalanina, valina, o tirosina. En ciertas realizaciones, AA6 es asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, treonina, o tirosina. En ciertas realizaciones, AA5-AA6 es Leu-Cit, Leu-Gln, Leu-Gly, Leu-Leu, Leu-Met, Leu-Thr, Phe-Cit, Phe-Gln, Phe-Leu, Phe-Met, Phe-Thr, Val-Asn, Val-Cit, Val-Gln, Val-Leu, Val-Met, Val-Thr, Tyr-Cit, Tyr-Leu, o Tyr-Met. En ciertas realizaciones, AA1, AA3 y AA5 son glicina, valina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, o asparagina. En ciertas realizaciones, AA2 , AA4 y AA6 son glicina, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, treonina, o tirosina. En ciertas realizaciones, AA2 es un enlace; y AA3 es un enlace. En ciertas realizaciones, AA1 es glicina; AA4 es fenilalanina; AA5 es leucina; y AA6 es glicina.
En ciertas realizaciones, R4 y R5 son metilo; R6 es 2-hidroxipropilo; Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W; AA1 es glicina; AA2 es un enlace; AA3 es un enlace; AA4 es fenilalanina; AA5 es leucina; AA6 es glicina; -Q-X-Y- es
Figure imgf000007_0001
y W es
Figure imgf000007_0002
En ciertas realizaciones, R4 y R5 son metilo; R6 es 2-hidroxipropilo; Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W; AA1 es glicina; AA2 es un enlace; AA3 es un enlace; AA4 es fenilalanina; AA5 es leucina; AA6 es glicina; -Q-X-Y- es
Figure imgf000007_0003
y W es
Figure imgf000007_0004
En ciertas realizaciones, -Q-X-Y- es un enlazador autoinmolable que libera el inhibidor de MetAP2 en forma de un derivado de carbamato, como se muestra en el siguiente esquema:
Figure imgf000008_0001
Z-Q-X-Y-C(O)-W (II)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, independientemente para cada aparición:
Z es H2N-CH2-C(O)- o -H; y
Q-X-Y es
Figure imgf000008_0002
W es
Figure imgf000008_0003
En ciertas realizaciones, Z es H. En otras realizaciones, Z es H2N-CH2-C(O)-En ciertas realizaciones, Z es H2N-CH2-C(O)-; Q-X-Y- es
y W es
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En ciertas realizaciones, Z es H2N-CH2-C(O)-; Q-X-Y- es
Figure imgf000009_0003
y W es
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Polímeros ejemplares de la invención se han descrito en las patentes U.S. nos 4.997.878 de Bock et al., 5.037.883 de Kopecek et al., 5.258.453 de Kopecek et al., 6.464.850 de Zhang et al., 6.803.438 de Brocchini et al.,
Se han descrito polímeros ejemplares adicionales en Subr et al., J Controlled Release, 18, 123-132 (1992). Péptidos ejemplares de la invención se han descrito en las patentes U.S. nos 6.835.807 de Susaki et al., 6.291.671 de Inoue et al., 6.811.996 de Inoue et al., 7.041.818 de Susaki et al., 7.091.186 de Senter et al., 7.553.816 de Senter et al. Péptidos ejemplares adicionales y su escisión se han descrito en Shiose et al. Biol. Pharm. Bull. 30(12) 2365-2370 (2007) y Shiose et al. Bioconjugate Chem. 20(1) 60-70 (2009).
En algunas realizaciones, el método de síntesis del polímero puede conducir al acoplamiento de dos o más cadenas de polímero, y puede aumentar el peso molecular medio ponderal del conjugado polimérico. Además, se reconoce que si se produce este acoplamiento, los enlaces serán biodegradables.
En las patentes U.S. nos 6.242.494 de Craig et al, 6.063.812 de Hong et al., 6.887.863 de Craig et al., 7.030.262 de BaMaung et al., 7.491.718 de Comess et al., se han descrito inhibidores de MetAP2 ejemplares.
En Wang et al. “Correlation of tumor growth suppression and methionine aminopeptidase-2 activity blockade using an orally active inhibitor”, PNAS 105(6) 1838-1843 (2008); Lee at al. “Design, Synthesis, and Antiangiogenic Effects of a Series of Potent Novel Fumagillin Analogues”, Chem. Pharm. Bull. 55(7) 1024-1029 (2007); Jeong et al. “Total synthesis and antiangiogenic activity of cyclopentane analogues of fumagillol”, Bioorganic and Medicinal Chemicistry Letters 15, 3580-3583 (2005); Arico-Muendel et al. “Carbamate Analogues of Fumagillin as Potent, Targeted Inhibitors of Methionine Aminopeptidase-2”, J. Med. Chem. 52, 8047-8056 (2009); y en la Publicación Internacional n° WO 2010/003475 de Heinrich et al. se han descrito inhibidores de MetAP2 ejemplares adicionales.
Debido a que la bibliografía científica ha establecido una relación causal entre la inhibición de MetAP2 y la inhibición resultante de la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis, se puede inferir que los inhibidores de MetAP2 descritos aquí poseen actividad antiangiogénica. Como inhibidores de la angiogénesis, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de tumores sólidos tanto primarios como metastásicos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (que incluye riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (que incluye cuello uterino, útero y ovarios, así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (que incluye próstata, vesículas seminales, testículos, y tumores de células germinales), glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, suprarrenales y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo los que se originan en huesos y tejidos blandos, así como sarcoma de Kaposi), y tumores del cerebro, nervios, ojos, y meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, schwannomas y meningiomas). Dichos compuestos también pueden ser útiles en el tratamiento de tumores sólidos que surgen de neoplasias hematopoyéticas tales como leucemias (es decir, cloromas, plasmacitomas, y las placas y tumores de micosis fungósidos y linfoma/leucemia cutánea de células T), así como en el tratamiento de linfomas (linfomas tanto de Hodgkin como no de Hodgkin). Además, estos compuestos pueden ser útiles en la prevención de metástasis de los tumores descritos anteriormente cuando se usan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos. Los compuestos de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de las afecciones mencionadas anteriormente mediante mecanismos distintos de la inhibición de la angiogénesis.
Otros usos incluyen el tratamiento y profilaxis de enfermedades tales como enfermedades de los vasos sanguíneos, tales como hemagiomas y proliferación capilar dentro de placas ateroscleróticas; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de placa; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; y granulación de heridas. Otros usos incluyen el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una proliferación excesiva o anormal de células endoteliales, que incluyen, sin limitación, adherencias intestinales, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, esclerodermia, y cicatrices hipertróficas, es decir, queloides. Otro uso es como agente anticonceptivo, al inhibir la ovulación y el establecimiento de la placenta. Los compuestos de la invención también son útiles en el tratamiento de enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica, tales como la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minutesalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori). Los compuestos de la invención también son útiles para reducir el sangrado mediante la administración antes de la cirugía, especialmente para el tratamiento de tumores resecables.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende cualquiera de los compuestos descritos aquí, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende DMSO.
Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto o composición como se describe aquí para uso en un método para tratar una enfermedad o afección administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición, en el que la enfermedad es cáncer, una enfermedad caracterizada por vasculatura irregular, una enfermedad o afección caracterizada por vasculatura hiperpermeable, cardiovascular, vasculitis coronaria, derrame pleural, edema asociado a IL-2, edema, o rechazo de trasplante. En ciertas realizaciones, la enfermedad es un tumor sólido. En ciertas realizaciones, el tumor sólido es un melanoma, metástasis, adenocarcinoma, sarcoma, timoma, linfoma, tumor de pulmón, tumor de hígado, tumor de colon, tumor de riñón, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia, tumor uterino, tumor de mama, tumor testicular, tumor óseo, tumor muscular, tumor de cabeza y cuello, tumor de esófago, tumor de tiroides, tumor nasofaríngeo, tumor endocrino, tumor cerebral, tumor de piel, tumor de tejidos blandos, tumor de placenta, o tumor gástrico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto o composición como se describe aquí para uso en un método para tratar una enfermedad angiogénica administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto o composición como se describe aquí para uso en un método para tratar cáncer administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición. En ciertas realizaciones, el cáncer es adenocarcinoma, anal, astrocitoma, vejiga, sangre, hueso, cerebro, mama, carcinoma, colon, cervical, endocrino, endometrial, esofágico, ocular, gástrico, genital, de cabeza y cuello, hemangioma, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, riñón, laringe, leucemia, hígado, pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, metastásico, boca, músculo, mieloma, nasal, nasofaríngeo, oral, ovárico, pancreático, pene, placenta, próstata, rectal, renal, sarcoma, de piel, tejidos blandos, testicular, garganta, timoma, tiroides, células de transición, uréter, uterino, o vaginal.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto o composición como se describe aquí para uso en un método de tratamiento o inhibición de una proliferación indeseable de células administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición.
Los compuestos de la presente invención son útiles para inhibir la proliferación de células endoteliales, células tumorales, células del músculo liso, células metastásicas, y otras, tanto in vitro como in vivo. Es de particular interés la prevención o inhibición de la diferenciación de células endoteliales en estructuras capilares. Las células endoteliales susceptibles de inhibición por los compuestos de la invención están presentes en varios sitios en un mamífero, e incluyen dermis, epidermis, endometrio, retina, sitios quirúrgicos, tracto gastrointestinal, hígado, riñón, sistema reproductivo, piel, hueso, músculo, sistema endocrino, cerebro, sistema linfoide, sistema nervioso central, sistema respiratorio, cordón umbilical, tejido mamario, y tracto urinario. Los compuestos descritos aquí son particularmente útiles para prevenir o inhibir la proliferación de células endoteliales en sitios de vasculatura irregular, vasculatura hiperpermeable, inflamación, y tumorigénesis.
Los compuestos de la invención son particularmente útiles en métodos para inhibir la tumorigénesis en un mamífero. Los tumores que se pueden prevenir o inhibir previniendo o inhibiendo la proliferación de células tumorales con el compuesto incluyen melanoma, metástasis, adenocarcinoma, sarcomas, timoma, linfoma, tumores de pulmón, tumores de hígado, tumores de colon, tumores de riñón, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, mieloma múltiple, tumores uterinos, tumores de mama, tumores de próstata, tumores renales, tumores de ovario, tumores pancreáticos, tumores cerebrales, tumores testiculares, tumores óseos, tumores musculares, tumores de la placenta, y tumores gástricos.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
Al proporcionar a un mamífero uno o más de los compuestos descritos aquí, la dosis de compuesto o compuestos administrados variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, estado médico general, historial médico previo, progresión de la enfermedad del mamífero, carga tumoral, vía de administración, y formulación. Por ejemplo, una dosis adecuada de un compuesto de la invención para un mamífero que necesita tratamiento como se describe aquí está en el intervalo de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 2000 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal. Además, debido a los efectos de estar unidos al polímero, los agentes pueden administrarse en dosis más bajas que las que se usan típicamente en el tratamiento de un trastorno particular. Sorprendentemente, en algunas realizaciones, los conjugados poliméricos de la invención son más activos en peso/peso que las moléculas pequeñas correspondientes.
La presente invención también abarca un compuesto como se describe aquí para uso en terapia de combinación con, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, o un agente antihipertensivo. Los agentes terapéuticos también pueden conjugarse con un polímero.
La vía de administración puede ser intravenosa (I.V.), intramuscular (I.M.), subcutánea (S.C.), intradérmica (I.D.), intraperitoneal (I.P.), intratecal (I.T.), intrapleural, intrauterina, rectal, vaginal, tópica, o intratumoral.
Definiciones
El término “alquilo” se refiere a un radical de cadena de carbono ramificado o no ramificado, completamente saturado, que tiene el número de átomos de carbono especificado, o hasta 30 átomos de carbono si no se hace ninguna especificación. Por ejemplo, un “alquilo inferior” se refiere a un alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, y octilo, y aquellos que son isómeros posicionales de estos alquilos. Alquilo de 10 a 30 átomos de carbono incluye decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosilo, heneicosilo, docosilo, tricosilo y tetracosilo. En ciertas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o ramificada tiene 30 o menos átomos de carbono en su estructura (por ejemplo, C1-C30 para cadenas lineales, C3-C30 para cadenas ramificadas), y más preferiblemente 20 o menos. Asimismo, ciertos cicloalquilos tienen 3-10 átomos de carbono en su estructura anular, y pueden tener 5, 6 o 7 carbonos en la estructura anular.
A menos que el número de carbonos se especifique de otra manera, “alquilo inferior”, como se usa aquí, significa un grupo alquilo, como se define anteriormente, pero que tiene de uno a diez carbonos, o de uno a seis átomos de carbono en su estructura principal, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, y tercbutilo. Asimismo, “alquenilo inferior” y “alquinilo inferior” tienen longitudes de cadena similares. A lo largo de la solicitud, ciertos grupos alquilo son alquilos inferiores. En ciertas realizaciones, un sustituyente designado aquí como alquilo es un alquilo inferior.
El término “carbociclo”, como se usa aquí, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada átomo del anillo es carbono.
El término “arilo”, como se usa aquí, incluye grupos aromáticos de un solo anillo de 5, 6 y 7 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina, y pirimidina. Los grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura anular también pueden denominarse “aril heterociclos” o “heteroaromáticos”. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones anulares con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, por ejemplo halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF3 , o -CN. El término “arilo” también incluye sistemas anulares policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos contiguos (los anillos son “anillos condensados”) en los que al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, y/o heterociclilos.
“Alquenilo” se refiere a cualquier radical de cadena de carbono insaturado, ramificado o no ramificado, que tiene el número de átomos de carbono especificado, o hasta 26 átomos de carbono si no se especifica ninguna limitación en el número de átomos de carbono; y que tiene 1 o más dobles enlaces en el radical. El alquenilo de 6 a 26 átomos de carbono está ejemplificado por hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo, undecenilo, dodenilo, tridecenilo, tetradecenilo, pentadecenilo, hexadecenilo, heptadecenilo, octadecenilo, nonadecenilo, eicosenilo, heneicosoenilo, docosenilo, tricosenilo, y tetracosenilo, en sus diversas formas isoméricas, en los que el enlace o enlaces insaturados pueden estar ubicados en cualquier parte del radical, y pueden tener la configuración (Z) o (E) alrededor del enlace o enlaces dobles.
El término “alquinilo” se refiere a radicales hidrocarbilo del alcance de alquenilo, pero que tienen uno o más triples enlaces en el radical.
Los términos “alcoxilo” o “alcoxi”, como se usan aquí, se refieren a un grupo alquilo, como se define a continuación, que tiene un radical oxígeno unido al mismo. Los grupos alcoxi representativos incluyen metoxi, etoxi, propoxi, y tercbutoxi. Un “éter” son dos hidrocarburos unidos covalentemente por un oxígeno. Por consiguiente, el sustituyente de un alquilo que hace a ese alquilo un éter es o se asemeja a un alcoxilo, tal como puede ser representado por uno de -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-alquinilo, -O-(CH2)m-R1, en el que m y R1 se describen a continuación.
Los términos “heterociclilo” o “grupo heterocíclico” se refieren a estructuras anulares de 3 a 10 miembros, más preferiblemente anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras anulares incluyen uno a cuatro heteroátomos. Los heterociclos también pueden ser policiclos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiína, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazano, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tales como azetidinonas y pirrolidinonas, sultamas, y sultonas. El anillo heterocíclico puede estar sustituido en una o más posiciones con sustituyentes como se describen anteriormente, como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, sulfamoilo, sulfinilo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un heterociclilo, un resto aromático o heteroaromático, -CF3 , o -CN.
El término “alquiltio” se refiere a un grupo alquilo, como se definió anteriormente, que tiene un radical azufre unido al mismo. En ciertas realizaciones, el resto “alquiltio” está representado por uno de -(S)-alquilo, -(S)-alquenilo, -(S)-alquinilo y -(S)-(CH2)m-R1, en el que m y R1 se definen a continuación. Los grupos alquiltio representativos incluyen metiltio y etiltio
Como se usa aquí, el término “nitro” significa -NO2 ; el término “halógeno” designa F, Cl, Br o I; el término “sulfhidrilo” significa -SH; el término “hidroxilo” significa -OH; y el término “sulfonilo” significa -SO2-.
Los términos “amina” y “amino” son reconocidos en la técnica, y se refieren tanto a aminas sustituidas como no sustituidas, por ejemplo un resto que puede representarse mediante las fórmulas generales:
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en las que R3, R5 y R6 representan, cada uno independientemente, un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH2)m-R1, o R3 y R5, tomados junto con el átomo de N al que están unidos, completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura del anillo; R1 representa un alquenilo, arilo, cicloalquilo, un cicloalquenilo, un heterociclilo o un policiclilo; y m es cero o un número entero en el intervalo de 1 a 8. En ciertas realizaciones, solo uno de R3 o R5 puede ser un carbonilo, por ejemplo R3, R5 y el nitrógeno, juntos, no forman una imida. En ciertas realizaciones, R3 y R5 (y opcionalmente R6) representa, cada uno independientemente, un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, o -(CH2)m-R1. De este modo, el término “alquilamina”, como se usa aquí, significa un grupo amina, como se define anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o no sustituido unido al mismo, es decir, al menos uno de R3 y R5 es un grupo alquilo. En ciertas realizaciones, un grupo amino o una alquilamina es básico, lo que significa que tiene un pKa s 7,00. Las formas protonadas de estos grupos funcionales tienen pKas con respecto al agua por encima de 7,00.
El término “carbonilo” (C(O)) está reconocido en la técnica, e incluye los restos que se pueden representar mediante la fórmula general:
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en las que X es un enlace o representa un oxígeno o un azufre, y R7 representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH2)m-Ri o una sal farmacéuticamente aceptable, R8 representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH2)m-R1, en el que m y R1 son como se definen anteriormente. Cuando X es un oxígeno y R7 o R8 no es hidrógeno, la fórmula representa un “éster”. Cuando X es un oxígeno y R7 es como se definió anteriormente, el resto se denomina aquí un grupo carboxilo, y particularmente cuando R7 es un hidrógeno, la fórmula representa un “ácido carboxílico”. Cuando X es un oxígeno y R8 es hidrógeno, la fórmula representa un “formiato”. En general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior se reemplaza por azufre, la fórmula representa un grupo “tiocarbonilo”. Cuando X es un azufre y R7 o R8 no es hidrógeno, la fórmula representa un grupo “tioéster”. Cuando X es un azufre y R7 es hidrógeno, la fórmula representa un grupo “ácido tiocarboxílico”. Cuando X es un azufre y R8 es hidrógeno, la fórmula representa un grupo “tioformiato”. Por otro lado, cuando X es un enlace y R7 no es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo “cetona”. Cuando X es un enlace y R7 es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo “aldehído”.
Como se usa aquí, se contempla que el término “sustituido” incluya todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos aquí anteriormente. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más, e iguales o diferentes, para los compuestos orgánicos apropiados. Se entenderá que “sustitución” o “sustituido con” incluye la condición implícita de que dicha sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo que no sufre espontáneamente transformación tal como por reordenamiento, ciclación, eliminación, etc.
El término “sulfamoílo” está reconocido en la técnica, e incluye un resto que puede representarse mediante la fórmula general:
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en la que R3 y R5 son como se definen anteriormente.
El término “sulfato” está reconocido en la técnica, e incluye un resto que puede representarse mediante la fórmula general:
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en la que R7 es como se define anteriormente.
El término “sulfamido” está reconocido en la técnica, e incluye un resto que puede representarse mediante la fórmula general:
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en la que R2 y R4 son como se definen anteriormente.
El término “sulfonato” está reconocido en la técnica, e incluye un resto que puede representarse mediante la fórmula general:
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en la que R7 es un par de electrones, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, o arilo.
Los términos “sulfóxido” o “sulfinilo”, como se usan aquí, se refieren a un resto que puede representarse mediante la fórmula general:
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en la que R12 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo, o arilo.
Se pueden realizar sustituciones análogas a los grupos alquenilo y alquinilo para producir, por ejemplo, aminoalquenilos, aminoalquinilos, amidoalquenilos, amidoalquinilos, iminoalquenilos, iminoalquinilos, tioalquenilos, tioalquinilos, alquenilos o alquinilos sustituidos con carbonilo.
Como se usa aquí, la definición de cada expresión, por ejemplo alquilo, m, n, etc., cuando aparece más de una vez en cualquier estructura, pretende ser independiente de su definición en cualquier otro lugar en la misma estructura.
Para los fines de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67a Ed., 1986-87, 1986-87, cubierta interior.
La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea aquí para referirse a aquellos ligandos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales, sustancialmente no pirogénicos, sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La frase “vehículo farmacéuticamente aceptable”, como se usa aquí, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, involucrado en llevar o transportar la sustancia química en cuestión desde un órgano o porción del cuerpo a otro órgano o porción del cuerpo. Cada vehículo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, no perjudicial para el paciente, y sustancialmente apirógeno. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao, DMSO, y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz, y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol, y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) disolución salina isotónica; (18) disolución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones amortiguadas con fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son apirógenas, es decir, no inducen elevaciones significativas de temperatura cuando se administran a un paciente.
La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a las sales de adición de ácidos orgánicos e inorgánicos, relativamente no tóxicas, del inhibidor o inhibidores. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación del inhibidor o inhibidores, o haciendo reaccionar por separado un inhibidor o inhibidores purificados en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal así formada. Las sales representativas incluyen las sales de hidrobromuro, hidrocloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19)
En otros casos, los compuestos útiles en los métodos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos, y, de este modo, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. La expresión “sales farmacéuticamente aceptables”, en estos casos, se refiere a las sales de adición de bases orgánicas e inorgánicas, relativamente no tóxicas, de un inhibidor o inhibidores. Estas sales también se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y la purificación del inhibidor o inhibidores, o haciendo reaccionar por separado el inhibidor o inhibidores purificados en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato, o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoníaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, y aluminio. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, y piperazina. (Véase, por ejemplo, Berge et al., más arriba).
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto, con respecto al uso en el tratamiento, se refiere a una cantidad de un compuesto en una preparación que, cuando se administra como parte de un régimen de dosificación deseado (a un mamífero, preferiblemente un ser humano), alivia un síntoma, mejora una afección, o ralentiza o previene el comienzo de afecciones de la enfermedad de acuerdo con estándares clínicamente aceptables para el trastorno o afección a tratar o el fin cosmético, por ejemplo con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es sinónimo de “dosis eficaz”.
Un “paciente” o “sujeto” a ser tratado por el método en cuestión puede significar un sujeto humano o no humano.
El término tratamiento “profiláctico o terapéutico” está reconocido en la técnica, e incluye la administración al hospedante de una o más de las composiciones en cuestión. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedante), entonces el tratamiento es profiláctico (es decir, protege al hospedante contra el desarrollo de la afección no deseada), mientras que si se administra después de la manifestación de la afección no deseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, está destinado a disminuir, mejorar o estabilizar la afección no deseada existente o sus efectos secundarios).
Se pretende que el término “aminoácido” abarque todos los compuestos, ya sean naturales o sintéticos, que incluyen tanto una funcionalidad amino como una funcionalidad ácida, incluyendo los análogos y derivados de aminoácidos. En ciertas realizaciones, los aminoácidos contemplados en la presente invención son los aminoácidos que se encuentran de forma natural en las proteínas, o los productos anabólicos o catabólicos de origen natural de dichos aminoácidos, que contienen grupos amino y carboxilo. Los aminoácidos de origen natural se identifican en su totalidad por las abreviaturas convencionales de tres letras y/o una letra, correspondientes al nombre trivial del aminoácido, de acuerdo con la siguiente lista. Las abreviaturas están aceptadas en la técnica de los péptidos, y están recomendadas por la comisión de la IUPAC-IUB en nomenclatura bioquímica.
Mediante la expresión “resto de aminoácido” se entiende un aminoácido. En general, las abreviaturas utilizadas aquí para designar los aminoácidos de origen natural se basan en las recomendaciones de la Comisión de la IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (véase Biochemistry (1972) 11:1726-1732). Por ejemplo, Met, Ile, Leu, Ala y Gly representan “restos” de metionina, isoleucina, leucina, alanina y glicina, respectivamente. Por resto se entiende un radical derivado del correspondiente a-aminoácido mediante la eliminación de la porción OH del grupo carboxilo y la porción H del grupo a-amino.
La expresión “cadena lateral de aminoácidos” es aquella parte de un resto de aminoácido exclusiva de la cadena principal, como se define por K. D. Kopple, “Peptides and Amino Acids”, W. A. Benjamin Inc., Nueva York y Ámsterdam, 1966, páginas 2 y 33; ejemplos de tales cadenas laterales de los aminoácidos comunes son -CH2CH2SCH3 (la cadena lateral de la metionina), -CH2(CH3)-CH2CH3 (la cadena lateral de isoleucina), -CH2CH(CH3)2 (la cadena lateral de leucina) o H-(la cadena lateral de glicina). Estas cadenas laterales cuelgan del carbono Ca del esqueleto.
El término “péptido”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia de restos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o mediante enlaces peptídicos modificados. El término “péptido” pretende abarcar análogos de péptidos, derivados de péptidos, peptidomiméticos, y variantes de péptidos. Se entiende que el término “péptido” incluye péptidos de cualquier longitud. Las secuencias de péptidos expuestas aquí están escritas de acuerdo con la convención generalmente aceptada por la cual el aminoácido W-terminal está a la izquierda, y el aminoácido C-terminal está a la derecha (por ejemplo, H2N-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-CO2H).
Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisoméricas particulares. La presente invención contempla todos estos compuestos, incluyendo los isómeros cis y trans, enantiómeros R y S, diastereómeros, isómeros (D), isómeros (L), las mezclas racémicas de los mismos, y otras mezclas de los mismos, según caen dentro del alcance de la invención. Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Se pretende que todos estos isómeros, así como sus mezclas, estén incluidos en esta invención.
Si, por ejemplo, se desea un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, se puede preparar por síntesis asimétrica o por derivación con un auxiliar quiral, en la que la mezcla diastereomérica resultante se separa, y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar el enantiómero puro deseado. Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo funcional ácido, tal como carboxilo, las sales diastereoméricas se forman con un ácido o base ópticamente activo apropiado, seguido de la resolución de los diastereómeros así formados por cristalización fraccionada o medios cromatográficos bien conocidos en la técnica, y posterior recuperación del enantiómero puro.
EJEMPLIFICACIÓN
Habiéndose descrito ahora la invención de forma general, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención. Los ejemplos 25 y 31 están de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos relacionados con compuestos que no se incluyen en las reivindicaciones adjuntas son ejemplos de referencia.
Procedimientos generales
Se utilizó filtración de flujo tangencial (TFF) para purificar los productos poliméricos de la invención. La TFF se realizó con un sistema de TFF de cápsula Pall Minimate™ y Minimate™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la purificación se usó una cápsula de TFF Minimate con membrana Omega de 5 kDa (5K) o una cápsula de TFF Minimate con un cartucho de membrana Omega de 10 kDa (10K). En todos los casos, el permeado se descartó, y el retenido se liofilizó para producir el producto polimérico. Las estructuras de los productos se confirmaron por RMN 1H, las moléculas pequeñas también se caracterizaron por MS. Los pesos de los polímeros indicados en los ejemplos no se corrigieron para el contenido de agua.
El carbamoilfumagilol y el cloroacetilcarbamoilfumagilol se pueden preparar de acuerdo con los métodos descritos en la patente U.S. 5.166.172 (Kishimoto, et al.).
El carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo se puede preparar de acuerdo con los procedimientos publicados. (Véase Han, C. et al. Biorg. Med. Chem. Lett.2000, 10, 39-43). MA-GFLG-ONp se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en la patente U.S. 5.258.453 (Kopecek et al.).
Ejemplo 1: Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)
Figure imgf000016_0001
Se desgasificó (congelación, bombeo, descongelación, 4 ciclos) una mezcla de hidroxipropilmetacrilamida (HPMA, 22,16 g, 155 mmoles), éster p-nitrofenílico de N-metacril-gly-phe-leu-gly (MA-GFLG-ONp, 10,00 g, 17,19 mmoles), AIBN (1,484 g, 9,037 mmoles) y acetona (225 g). La mezcla de reacción resultante se agitó a 50°C durante 48 horas, y después se enfrió hasta temperatura ambiente. El producto deseado se purificó mediante trituración con acetona, después se secó a vacío para producir 17,6 g de poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) como un sólido blanco. La estructura se verificó por RMN 1H, y se mostró que el producto estaba libre de impurezas sustanciales (por ejemplo, p-nitrofenol). Basado en la absorbancia UV, el copolímero contenía 0,47 mmoles de éster de p-nitrofenilo por gramo de polímero. El copolímero de este ejemplo se usa en la mayoría de los ejemplos subsiguientes. Se puede preparar una amplia gama de copolímeros basados en diferentes monómeros y/o relaciones de monómeros siguiendo este procedimiento ajustando la estequiometría y/o usando diferentes monómeros.
Ejemplo 2. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-OH)
Poli (HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (700 mg) se añadió en porciones a una disolución de NaOH 0,1 M (11,3 ml) a 0°C. La mezcla de reacción amarilla se agitó a 0°C durante 0,5 horas, después a temperatura ambiente durante 4 horas. La mitad de la disolución se acidificó con HCl 0,1 M hasta pH = 6. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo para eliminar el exceso de p-nitrofenol. La fase acuosa se liofilizó para producir poli(HPMA-co-MA-GFLG-OH) como un sólido incoloro (360 mg).
Ejemplo 3. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2N(Me)BOC) y procedimiento general A.
Figure imgf000016_0002
Una disolución de poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (1,0 g, 0,534 mmoles) en DMF ( 6 ml) y H2O (10 ml) se añadió gota a gota durante un intervalo de 15 minutos a una disolución de W-(2-aminoetil)-W-metilcarbamato de ferc-butilo (0,20 g, 1,15 mmoles) en agua (20 ml) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 15 minutos, después se calentó hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 12 horas. Los disolventes se evaporaron a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en agua (50 ml), el pH se ajustó hasta aproximadamente 8,0 con NaOH 0,1 M. La disolución se filtró a través de un filtro VacuCap, y después se purificó usando TFF (10 K). La disolución que contiene polímero se lavó (como parte del procedimiento de TFF) con una disolución de NaCl 25 mM (800 ml) para eliminar el p-nitrofenol, el pH de la disolución se ajustó a aproximadamente 4 con HCl 0,1 M, y después se lavó (como parte del procedimiento de TFF) con agua (400 ml). La disolución de polímero se liofilizó para aislar el compuesto poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2N(Me)BOC) como un sólido amarillo pálido (720 mg, 71%).
Ejemplo 4. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NHMe)
Figure imgf000016_0003
Una disolución de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2N(Me)BOC) (260 mg, 0,136 mmoles) en D2O (5,2 ml) se irradió con radiación de microondas a 150°C con agitación durante 6 horas. La RMN 1H de este material indicó que se había producido la desprotección del grupo BOC. La disolución acuosa se liofilizó para aislar el poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NHMe) como un sólido amarillo pálido (210 mg, 85%).
Ejemplo 5. Síntesis de N-({[2-(acetilamino)etil](metil)amino}acetil)carbamoilfumagilol y Procedimiento General B.
Figure imgf000017_0001
Se añadió diisopropiletilamina (DIEA) (130 mg) a una disolución de hidrocloruro de N-[2-(metilamino)etil]acetamida (76 mg) y cloroacetilcarbamoilfumagilol (200 mg) en DMF anhidra a 0°C bajo N2. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 12 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo resultante se suspendió en agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (las fases acuosa y orgánica de la emulsión formada se separaron usando una centrifugadora) para eliminar el exceso de cloroacetilcarbamoilfumagilol. Se hizo pasar nitrógeno a través de la disolución acuosa para reducir el nivel residual de EtOAc. El producto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (metanol/cloruro de metileno) para producir N-({[2-(acetilamino)etil](metil)amino}acetil)carbamoilfumagilol (75 mg) como una espuma blanquecina.
Ejemplo 6. BocNHCH 2 CH 2 N(Me)CH 2 C(O)NHC(O) 2 -fumagil-6-ilo (alquilación de N-BOC,N’-metiletilendiamina con cloroacetilcarbamoilfumagilol)
Figure imgf000017_0002
Una disolución de TNP-470 (0,2 g) y DIEA (0,105 g) en DMF (3 ml) se enfrió hasta 0°C. Se añadió una disolución de W-[2-(metilamino)etil]carbamato de ferc-butilo (0,105 g) en DMF (3 ml), y la mezcla se agitó durante 3 horas a 0°C, y después toda la noche. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se extrajo con agua. La fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo, y las fases orgánicas combinadas se extrajeron con salmuera, se secaron (MgSO4) y se evaporaron para producir un aceite. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (metanol/cloruro de metileno) y la evaporación de las fracciones del producto dieron BocNHCH2CH2N(Me)CH2C(O)NHC(O)2-fumagil-6 -ilo en forma de espuma blanca (0,16 g, 60%).
Ejemplo 7. Reacción de N-[2-aminoetil]carbamato de ferc-butilo con cloroacetilcarbamoilfumagilol
Figure imgf000018_0001
Se añadió a DMF (270 ul) una alícuota de 30 ul de una disolución 1 M de Boc-etilendiamina en DMF. La disolución se enfrió hasta 0°C, y se añadió gota a gota una disolución de TNP-470 (48 mg) en DMF (600 ul) durante 2 minutos. La reacción se monitorizó mediante LC/MS. La mayor cantidad del producto de alquilación deseado observada fue 34%. También se produjo carbamoilfumagilol. La relación de producto deseado a carbamoilfumagilol fue 1,0 a 0,4. El intento de aislamiento del producto deseado dio como resultado el aislamiento de hidantoína y fumagilol.
Ejemplo 8. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2N(Me)CH2C(O)NHC(O)2-fumagil-6-ilo)
Figure imgf000018_0002
Se siguió el Procedimiento General B utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NHMe) (105 mg, 0,058 mmoles) y cloroacetilcarbamoilfumagilol (46 mg, 0,114 mmoles) en DMF (5 ml) al que se añadió DIEA (29,5 mg, 0,228 mmoles) en N2. El producto se purificó usando TFF (5 K) lavando con agua (150 ml) para eliminar el hidrocloruro de DIEA. La disolución de polímero se liofilizó para obtener el conjugado polimérico (60 mg, 48%) como un sólido amarillo pálido.
Ejemplo 9. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NH2HCl) y Procedimiento General C para la reacción de diaminas con poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp)
Figure imgf000018_0003
Una disolución de etilendiamina (0,33 g, 5,49 mmoles) en agua (20 ml), pH 11,7, se ajustó hasta pH 9,1 mediante la adición de HCl acuoso al 37% (17-18 gotas). La disolución se enfrió en un baño de hielo, y se añadió gota a gota poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (1,03 g) en DMF ( 6 ml) durante 20 minutos mientras se mantenía la temperatura por debajo de 4°C. La disolución se agitó durante 20 minutos a 4°C, 50 minutos a temperatura ambiente para dar una disolución de color amarillo limón, pH 8,1. La disolución se evaporó a 40°C. Se añadió H2O (3 x 10 ml) y se evaporó. El producto se diluyó con agua (60 ml), y la disolución se ajustó con NaOH hasta pH 8,0. La disolución se filtró a través de un filtro VacuCap y se purificó mediante TFF como sigue. La disolución de polímero se lavó primero con una disolución de NaCl 25 mM (800 ml) para eliminar el p-nitrofenol. La disolución se lavó con agua (400 ml), y después se ajustó hasta pH 4 con HCl 0,1 M. Se recogió el retenido de TFF, y el filtro se lavó con 2 x 10 ml de agua. El retenido y los lavados combinados dieron una disolución de polímero que se liofilizó para aislar el compuesto poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NH2-HCl) como un sólido amarillo pálido (0,71 g, 72%).
Ejemplo 10. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH 2 CH 2 NHMeHCl)
Figure imgf000019_0001
Se siguió el Procedimiento General C usando N,N’-dimetiletilendiamina (0,47 g, 5,36 mmoles) y poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (1,0 g) para producir poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH2CH2NHMeHCl) como un sólido blanquecino (0,78 g).
Ejemplo 11. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH 2 CH 2 N(Me)CH 2 C(O)NHC(O) 2 -fumagil-6-ilo)
Figure imgf000019_0002
Se siguió el Procedimiento General B utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH2CH2NHMe) (200 mg, 0,108 mmoles) y cloroacetilcarbamoilfumagilol ( 86 mg, 0,213 mmoles) para producir poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH2CH2N(Me)CH2C(O)NHC(O)2-fumagil-6 -ilo) como un sólido amarillo pálido (180 mg).
Ejemplo 12. Síntesis de N-[(2R)1-hidroxi-2-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol y Procedimiento General D
Figure imgf000019_0003
Una disolución de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (400 mg, 0,89 mmoles) y (R)-2-amino-3-metil-1-butanol (280 mg, 2,71 mmoles) se agitaron en etanol (10 ml) a temperatura ambiente durante 12 horas. La disolución amarilla se concentró, y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (metanol/cloruro de metileno) para producir N-[(2R)1-hidroxi-2-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol (340 mg, 0,83 mmoles) como un aceite incoloro.
Ejemplo 13. Síntesis de N-(6-hidroxihexil)carbamoilfumagilol
Figure imgf000019_0004
Se siguió el Procedimiento General D usando carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (150 mg) en etanol (10 ml) y 6 ­ aminohexanol (48 mg). El producto se aisló como un aceite incoloro (110 mg, 78%).
Ejemplo 14. Síntesis de N-[1-(hidroximetil)ciclopentil]carbamoilfumagilol
Se siguió el Procedimiento General D usando carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (100 mg) en etanol (3 ml) y THF (1 ml) y cicloleucinol (52 mg) para producir N-[1-(hidroximetil)ciclopentil]carbamoilfumagilol como un aceite (50 mg).
Ejemplo 15. Síntesis de N-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamoilfumagilol
Figure imgf000020_0001
Se siguió el Procedimiento General D usando carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (100 mg) en etanol (3 ml) y THF (2 ml) y 2-amino-2-metilpropanol (40 mg) para producir N-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)carbamoilfumagilol como un aceite (37 mg).
Ejemplo 16. Síntesis de (2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carboxilato de fumagil-6-ilo
Figure imgf000020_0002
Se siguió el Procedimiento General D. El S-prolinol ( 68 mg, 0,67 mmoles) se hizo reaccionar con carbonato de pnitrofenilo y fumagil-6 -ilo (150 mg, 0,335 mmoles) en etanol (4 ml). El producto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (metanol/cloruro de metileno) para producir (2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carboxilato de fumagil-6 -ilo como una espuma blanca (81 mg, 63%).
Ejemplo 17. Síntesis de (2S)-2-({[(cloroacetil)carbamoil]oxi}metil)pirrolidin-1-carboxilato de fumagil-6-ilo
Figure imgf000020_0003
Una disolución de (2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1 -carboxilato de fumagil-6 -ilo (330 mg) en cloruro de metileno (2,1 ml) se enfrió hasta 0°C, y se añadió gota a gota cloroacetilisocianato (115 mg) en cloruro de metileno (1,5 ml). Después de 40 minutos, la mezcla se diluyó con cloruro de metileno (20 ml), y la fase orgánica se lavó con agua (3x). La fase orgánica se secó (Na2SÜ4) y se evaporó para producir (2S)-2-(([(cloroacetil)carbamoil]oxi|metil)pirrolidin-1 -carboxilato de fumagil-6 -ilo como una espuma blanca (400 mg).
Ejemplo 18. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-NCH2CH2N(Me)-acetilcarbamoil-[(2R)-1-hidroxi-3-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol]
Figure imgf000020_0004
[0119] Se siguió el Procedimiento General B usando cloroacetilcarbamoil[(2R)-1-hidroxi-3-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol (120 mg) (y poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NHMe) (200 mg) con DIEA (57 mg) en DMF (5 ml) para producir 2 -poli[HPMA-co-MA-GFLG-NCH2CH2N(Me)]-acetilcarbamoil- [1 -hidroxi-3-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol ( 20 0 mg, 80%).
Ejemplo 19. Síntesis de 2-(pol¡[HPMA-co-MA-GFLG-NCH2CH2N(Me)]-acet¡lcarbamo¡lh¡drox¡met¡l)p¡rrol¡d¡n-1-carboxilato) de fumagM-6-No
Figure imgf000021_0001
Se siguió el Procedimiento General B usando (2S)-2-(cloroacetilcarbamoilhidroximetil)pirrolidin-1-carboxilato de fumagil-6-ilo (90 mg) (y poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NHMe) (200 mg) con DIEA (57 mg) en DMF (5 ml) para producir 2-poli[HPMA-co-MA-GFLG-NCH2CH2N(Me)]-acetilcarbamoilhidroximetil)pirrolidin-1 -carboxilato de fumagil-6-ilo como un sólido amarillo pálido (150 mg, 60%).
Ejemplo 20. Síntes¡s de N-(6-aminohexil)carbamoilfumagilol
Figure imgf000021_0002
Una disolución de 1,6-diaminohexano (0,13 g) en metanol (8 ml) se enfrió hasta 0°C, y se añadió gota a gota carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6-ilo (0,13 g) en metanol (2 ml). El disolvente se redujo hasta alrededor de 2 ml mediante evaporación giratoria. Se añadió acetato de etilo, y la fase orgánica se lavó con agua, NaOH 0,1 N, agua, salmuera, y se secó con sulfato de sodio. El disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en etanol (15 ml). Se añadió ácido DL-tartárico (16 mg), la disolución se almacenó durante la noche, y después se evaporó hasta alrededor de 0,5 ml. Se añadió éter, y se formó un sólido blanco. El sólido se recogió por filtración, se lavó con éter, y se secó para producir la sal de tartrato de N-(6-aminohexil)carbamoilfumagilol (74 mg).
Ejemplo 21. Síntes¡s de pol¡[HPMA-co-MA-GFLG- NH(CH2)6NH2-HCl]
Se siguió el Procedimiento General C usando 1,6-diaminohexano (621 mg, 5,36 mmoles) y poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (1,0 g). El producto bruto se purificó por TFF (5 K) usando NaCl acuoso (25 mM), y después se acidificó hasta pH 4,0 con HCl 0,1 M y después se purificó por TFF con agua para producir poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH(CH2)6NH2 -HCl] como un sólido blanquecino (860 mg).
Ejemplo 22. Síntes¡s de carbonato de p-n¡trofen¡lo y N-[(2R)1-hidroxi-2-metilbutan-2-il]carbamoilfumagil-6-ilo y Proced¡m¡ento General E
Figure imgf000021_0003
A una disolución del alcohol N-[(2R)1 -hidroxi-2-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol (1,11 g) en cloruro de metileno a 0°C bajo N2 se añadió DMAP (660 mg, 5,40 mmoles), seguido de la adición en porciones de cloroformiato de p-nitrofenilo (810 mg). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 1 hora. El disolvente se evaporó, y el residuo resultante se disolvió en EtOAc y se lavó con agua, salmuera, y se secó (Na2SO4). La evaporación de EtOAc proporcionó el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, eluyendo con hexanos al 100% y después con EtOAc al 2-30%). Las fracciones que contenían producto puro se combinaron y evaporaron para aislar N-[(2R)1-(pnitrofenolcarbonilhidroxi-2-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol (1,25 g, 80%) como un sólido blanco.
Ejemplo 23. Síntesis de N-[1-(p-nitrofenoxicarbonilhidroximetil)-2-metilpropan-2-il)carbamoilfumagilol
Figure imgf000022_0001
Siguiendo el Procedimiento General E, se hicieron reaccionar alcohol dimetílico (60 mg), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (46 mg), y DMAP (37 mg), en cloruro de metileno ( 8 ml). La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, y se lavó con agua (3x) y después con salmuera. La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó hasta una espuma amarilla (87 mg) que se usó sin purificación adicional.
Ejemplo 24. Síntesis de N-[1-(p-nitrofenoxicarbonilhidroximetil)ciclopentil]carbamoilfumagilol
Figure imgf000022_0002
Siguiendo el Procedimiento General E, se hicieron reaccionar N-[1-(hidroximetil)ciclopentil]carbamoilfumagilol (producto del Ejemplo 14, 74 mg), cloroformiato de p-nitrofenilo (53 mg), y DMAP (43 mg), en cloruro de metileno (5 ml). Después del tratamiento extractivo, se utilizó N-[1-(p-nitrofenoxicarbonilhidroximetil)ciclopentil]carbamoilfumagilol ( 10 0 mg) sin purificación adicional.
Ejemplo 25. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH(CH2)6NHcarbamoil-[1-hidroxi-3-metilbutan-2-il]carbamoilfumagilol] (de acuerdo con la presente invención) y Procedimiento General F.
Figure imgf000022_0003
A una disolución de polímero (400 mg) y carbonato de p-nitrofenilo y N-[(2R)1-hidroxi-3-metilbutan-2-il]carbamoilfumagil-6 -ilo (240 mg) en DMF ( 8 ml) a 0°C se añadió gota a gota DIEA (0,11 g). La disolución se agitó a 0°C durante una hora, y se dejó calentar hasta temperatura ambiente. Después de 3 días, se evaporó el disolvente, y se añadió agua (80 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (500 ml en total) hasta que nada del carbonato de partida fue detectable por MS. La fase acuosa se purificó mediante TFF (10 K), y el retenido se liofilizó para producir el conjugado como un sólido blanco (380 mg, 77%).
RMN 1H ((DMSO-d6 ): 88,25 (bs, 2H, amida-NH), 8,0 (bs, 1H, amida-NH), 7,70 (bs, 2H, amida-NH), 7,10-7,30 (m, 15H, fenilalanina y amida-NH), 7,10 (bt, 1H, NH-Fum), 6,92 (bd, 1H, NH-Fum), 5,26 (m, H-5-Fum), 5,18 (bt, alqueno-Fum), 4,50-4,80 (m, 1H, protón alfa de fenilalanina), 4,0-4,21 (m, 1H, protón alfa de leucina), 3,50-3,84 (m, 19H), 3,29 (s, 3H, OMe-Fum), 2,80-3,10 (m, 28H), 2,51 (d, 1H, J = 4,4 Hz, H-2-Fum), 2,19 (m, 2H, alílico-Fum), 0,82-1,92 [m, 131H {1,84 (m, 2H, Fum), 1,72 (s, 3H, Fum-Me), 1,60 (s, 3H, Fum-Me), 1,09 (s, 3H, Fum-Me), 0,84 (dd, 6 H, Fum-isopropilo}].
Ejemplo 26. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(2-aminoetil)carbamoilfumagilol]
Se siguió el Procedimiento General F utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NH2 -HCl) (200 mg), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (100 mg) y DIEA (57 mg) en DMF (10 ml). El producto se purificó mediante TFF (10 K) con agua, y se liofilizó para producir el conjugado como un sólido amarillo pálido (160 mg).
Ejemplo 27. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)-(2-metilaminoetil)carbamoilfumagilol]
Figure imgf000023_0001
Se siguió el Procedimiento General F utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH2CH2NHMeHCl) (200 mg), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (100 mg) y DIEA (57 mg) en DMF (5 ml). El producto se purificó usando TFF (10 K) con agua, y se liofilizó para producir el conjugado como un sólido blanquecino (180 mg).
Ejemplo 28. Síntesis de poli(HPMA-co-MA-GFLG-N-(2-aminoetil)carbamoildihidrofumagilol
Figure imgf000023_0002
Se siguió el Procedimiento General F utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NH2HCl) (200 mg), carbonato de p-nitrofenilo y dihidrofumagil-6 -ilo (200 mg) y DIEA (57 mg) en DMF (10 ml). El producto se purificó mediante TFF (10 K) con agua (150 ml), y se liofilizó para producir poli(HPMA-co-MA-GFLG-N-(2-aminoetil)carbamoildihidrofumagilol como un sólido amarillo pálido (160 mg).
Ejemplo 29. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(3-aminopropil)carbamoilfumagilol]
Figure imgf000023_0003
Se siguió el Procedimiento General F utilizando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2 CH2NH2 -HC!) ( 2 20 mg), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (110 mg) y DIEA (63 mg) en DMF ( 6 ml). El disolvente se evaporó, y la disolución resultante se diluyó con agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo, y se purificó por TFF usando 350 ml de agua. El retenido se liofilizó para producir poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(3-aminopropil)carbamoilfumagilol] como un polvo rosa claro ( 2 00 mg).
Ejemplo 30. Síntesis de poli-[HPMA-co-MA-GFLG-N-(6 -aminohexil)carbamoilfumagilol]
Figure imgf000023_0004
Se siguió el Procedimiento General F usando poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(frans-4-aminociclohexilaminaHCl)] (1,0 g), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (0,48 g) y DIEA (0,27 g) en DMF (25 ml). El disolvente se evaporó, y la disolución se diluyó con agua. La fase acuosa (300 ml) se extrajo con acetato de etilo (700 ml en total), y se purificó mediante TFF usando 350 ml adicionales de agua. El retenido se liofilizó para producir poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(4-aminociclohexil)carbamoilfumagilol]como un sólido rosa claro (0,9 g).
RMN 1H (DMSO-d6 ): 8 8,10-8,35 (m, 3H, amida-NH), 7,90-8,10 (m, amida-NH), 7,05-7,32 (m, 22H, amida-NH) 5,27 (m, H-5-Fum), 5,18 (bt, alqueno-Fum), 4,60-4,90 (m, 14H), 4,50-4,60 (m, 1H, protón alfa de fenilalanina), 4,10-4,30 (m, 1 H, protón alfa de leucina), 3,40-3,80 (m, 2 1 H), 3,27 (s, 3H, OMe-Fum), 2,80-3,20 (m, 33H), 2,56 (d, 1 H, H = 3,90 Hz, H-2-Fum), 2,18 (m, 2H, alílico-Fum), 0,37-2,0 [m, 147H {1,70 (s, 3H, Fum-Me), 1,60 (s, 3H, Fum-Me), 1,07 (s, 3H, Fum-Me)}].
Ejemplo 31. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(trans-4-aminociclohexil)carbamoilfumagilol] (de acuerdo con la presente invención)
Figure imgf000024_0001
Se siguió el Procedimiento General F usando poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(frans-4-aminociclohexilamina-HCl)] (1,0 g), carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (0,48 g) y DIEA (0,27 g) en DMF 25 ml. El disolvente se evaporó, y la disolución se diluyó con agua. La fase acuosa (300 ml) se extrajo con acetato de etilo (700 ml en total), y se purificó mediante TFF usando 350 ml adicionales de agua. El retenido se liofilizó para producir poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(3-aminohexil)carbamoilfumagilol] como un sólido rosa claro (0,9 g).
RMN 1H (DMSO-d6 ): 8 7,90-8,35 (m, 4H, amida-NH), 7,0-7,70 (m, 25H, fenilalanina y amida-NH), 5,26 (m, H-5-Fum), 5,18 (bt, alqueno-Fum), 4,60-4,90 (m, 14h), 4,50-4,60 (m, 1H, protón alfa de fenilalanina), 4,10-4,30 (m, 1H, protón alfa de leucina), 3,40-3,80 (m, 21H), 3,26 (s, 3H, OMe-Fum), 2,80-3,10 (m, 31H), 2,17 (m, 2H, alílico-Fum), 0,37-2,0 [m, 166H {1,69 (s, 3H, Fum-Me), 1,59 (s, 3H, Fum-Me), 1,07 (s, 3H, Fum-Me)}]
Ejemplo 32. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-[2-(4-aminofenil)etil]carbamoilfumagilol]
Figure imgf000024_0002
A una suspensión de poli[HPMA-co-MA-GFLG-OH] (200 mg), N-[2-(4-aminofenil)etil]carbamoilfumagilol] (100 mg) y DIEA (75 mg) en DMF ( 6 ml) a 0°C se añadió EDCI (total 44 mg) en porciones. La disolución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se evaporó el disolvente, el residuo se suspendió en agua, y la suspensión se extrajo con EtOAc (7 veces, 250 ml en total). La fase acuosa se purificó mediante TFF (10 K) usando agua (350 ml). El retenido se liofilizó para producir el polímero como un sólido blanco esponjoso (170 mg).
Ejemplo 33. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH-2-[(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil]carbamoilfumagilol]
Figure imgf000024_0003
A una disolución de 2,2’-(etilendioxi)bis(etilamina) (0,79 g, 5,34 mmoles) en agua destilada (20 ml) a 0°C (pH = 11,56) se añadió HCl conc. hasta que el pH de la disolución fue 9,01 (medido con un medidor de pH). Se añadió gota a gota durante un período de 15 minutos poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (1 , 0 g, 0,534 mmoles) en DMF ( 6 ml) y H2O ( 10 ml) a la disolución que contenía amina, y la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 15 minutos. Después, la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Se midió que el pH de la disolución era 8,15. La mezcla de reacción se diluyó con agua destilada (300 ml) y se filtró a través de un filtro VacuCap, el matraz de reacción se lavó con agua (100 ml). La disolución de polímero se concentró hasta 40 ml mediante TFF (10 K) y se lavó con NaCl 25 mM (800 ml) para eliminar el p-nitrofenol, el pH después se ajustó hasta 4 con HCl 0,1 M, y finalmente se lavó con agua (400 ml). La disolución de polímero puro se liofilizó para aislar poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etilaminaHCl] como un sólido rosa (800 mg, 78%).
A una mezcla de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (93 mg, 0,208 mmoles) y poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-2-[(2-(2 -aminoetoxi)]etoxi)etilaminaHcl] ( 2 00 mg, 0,104 mmoles) en DMF anhidro (5 ml) a 0 °C bajo N2 se añadió DIEA (57 mg, 0,416 mmoles). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo resultante se suspendió en agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (las fases acuosa y orgánica de la emulsión formada se separaron usando una centrifugadora) para eliminar el exceso de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo y p-nitrofenol. Se hizo pasar nitrógeno a través de la disolución acuosa para eliminar las trazas de EtOAc y se purificó usando TFF (5K) lavándola con agua (150 ml) para eliminar el hidrocloruro de DIEA. La disolución de polímero se liofilizó para obtener el conjugado polimérico deseado poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxietil]carbamoilfumagilol] (220 mg, 95%) como un sólido blanquecino.
Ejemplo 34. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH-(6-aminodecil)carbamoilfumagilol]
Figure imgf000025_0001
A una mezcla de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (300 mg, 0,67 mmoles) y poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-10-[decilaminaHCl] (300 mg, 0,15 mmoles; preparado de manera similar al Ejemplo 33, excepto que se usó 1,10-diaminodecano como amina) en DMF anhidra ( 6 ml) a 0°C bajo N2 se añadió DIEA (83 mg, 0,64 mmoles). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo resultante se suspendió en agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (las fases acuosa y orgánica de la emulsión formada se separaron usando una centrifugadora) para eliminar el exceso de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo y p-nitrofenol. Se hizo pasar nitrógeno a través de la disolución acuosa para eliminar las trazas de EtOAc. La disolución acuosa bruta se purificó usando TFF (10K) lavando con agua (150 ml) para eliminar el hidrocloruro de DIEA. La disolución de polímero se liofilizó para obtener el conjugado polimérico deseado poli[HPMA-co-MA-GFLG-NH-(10-aminodecil)carbamoilfumagilol] (300 mg, 87%) como un sólido blanquecino.
Ejemplo 35. Síntesis de N-(2-acetamidoetil)carbamoilfumagilol
Figure imgf000025_0002
A una disolución de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (200 mg) en etanol (5 ml) a 0°C se añadió N-(2-aminoetil)acetamida (0,132 ml). La disolución se agitó a 0°C durante una hora, y durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con acetato de etilo, y se lavó con agua. La fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de etilo, y las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4). El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida. El producto era un sólido amarillo (120 mg).
Ejemplo 36. Conjugado de lisina de polímero y resto de inhibidor de MetAP2
Figure imgf000025_0003
A una disolución de carbonato de p-nitrofenilo y fumagil-6 -ilo (400 mg) e hidrocloruro de N-e-Cbz-O-metil-L-lisina en DMF (10 ml) a 0°C se añadió DIEA (350 mg). La reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La disolución se diluyó con acetato de etilo, se lavó con NaOH 0,1 N (4x), con agua, y después con salmuera.
La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (sílice; metanol/cloruro de metileno) para proporcionar N-e-Cbz-O-metil-lisina-carbonilfumagilol (550 mg).
Figure imgf000026_0001
A una disolución de N-e-Cbz-O-metil-lisina-carbonilfumagilol (200 mg) en acetato de etilo (10 ml) se añadió PtO2 monohidratado (20 mg), y la disolución se hidrogenó a STP durante 20 minutos. La reducción del doble enlace, pero no la desprotección del Cbz, se verificó mediante MS. La disolución se filtró y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol (10 ml), y se añadió Pd al 10%/C (20 mg). La disolución se hidrogenó en STP durante 5 minutos, y la eliminación del grupo Cbz se confirmó por MS. La disolución se filtró con celite, y se evaporó para proporcionar O-metil-L-Lys-carbonildihidrofumagilol como un aceite incoloro (0,15 g).
Figure imgf000026_0002
A una disolución agitada de O-metil-L-lys-carbonildihidrofumagilol (150 mg, 0,32 mmoles) en DMF ( 6 ml) se añadió poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (300 mg) a 0°C. La disolución amarilla resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se suspendió en agua (30 ml). La suspensión se extrajo seis veces con acetato de etilo (volumen total de acetato de etilo = 150 ml). La fase acuosa se liofilizó para proporcionar el conjugado polimérico como un sólido blanco (180 mg, 63%).
Ejemplo 37. Conjugado de aminotiofenol de polímero y resto de inhibidor de MetAP2
Figure imgf000026_0003
A una disolución de cloroacetilcarbamoilfumagilol (500 mg) y 4-aminotiofenol (180 mg) en DMF (10 ml) a 0°C se añadió DIEA (193 mg). La disolución se agitó a 0°C durante 1,5 horas, y después a temperatura ambiente durante la noche. La disolución se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La purificación por cromatografía ultrarrápida (MeOH/CH2Cl2), seguida de una segunda cromatografía (EtOAc/hexanos) dio 4-aminofeniltioacetilcarbamoilfumagilol (460 mg).
Figure imgf000026_0004
A una disolución de poli(HPMA-co-MA-GFLG-ONp) (200 mg) y 4-aminofeniltioacetilcarbamoilfumagilol (100 mg) en DMF (5 ml) a 0°C se añadió DIEA (106 mg). La disolución se dejó calentar hasta temperatura ambiente, y después se calentó hasta 50°C y se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se suspendió en agua. La suspensión se extrajo con acetato de etilo (150 ml). La fase acuosa se liofilizó para producir el conjugado polimérico como un sólido blanco (180 mg).
Ejemplo 38.
Figure imgf000027_0001
A una disolución de poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2NH2 -HCl) (200 mg) y N-(5-carboxipentil)carbamoilfumagilol (96 mg) en DMF (6 ml) a 0°C se añadió DIEA (104 mg), seguido de hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida (42 mg). La disolución se dejó calentar hasta RT y se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en agua (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (200 ml). La fase acuosa se purificó mediante TFF con agua (450 ml). El retenido se liofilizó para producir el polímero (200 mg) como un sólido amarillo pálido.
Ejemplo 39.
Figure imgf000027_0002
A una disolución de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N(CH2)6NH2 -HCl] (216 mg), 2-carboxietilcarbamoilfumagilol (91 mg) en DMF (8 ml) a 0°C se añadió DIEA (118 mg), seguido de hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida (88 mg). La disolución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en agua (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (200 ml). La fase acuosa se purificó mediante TFF (10 K) con agua (1 l). El retenido se liofilizó para producir el polímero (170 mg) como un sólido amarillo pálido.
Ejemplo 40.
Figure imgf000027_0003
Se siguió el Procedimiento General F usando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2CH2NH2 -HCl) (220 mg) y carbonato (Ejemplo 24, 100 mg) en DMF ( 6 ml) con DIEA (63 mg). La reacción se extrajo con acetato de etilo. Después de la purificación mediante TFF (10 K) con agua, y la liofilización, el producto se aisló como un polvo de color rosa claro (140 mg).
Ejemplo 41.
Se siguió el Procedimiento General F usando poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2CH2NH2 -HCl) (200 mg) y carbonato (Ejemplo 23, 86 mg) en DMF (5 ml) con DIEA (57 mg). La extracción se realizó con acetato de etilo. Después de la purificación mediante TFF con agua, y la liofilización, el producto se aisló como un polvo de color rosa claro (200 mg).
Ejemplo 42. Síntesis de poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(6-am¡nohex¡l)acetam¡da]
Figure imgf000028_0001
A una disolución de aminohexilpolímero (600 mg) y acetato de p-nitrofenilo (110 mg) en DMF (16 ml) a 0°C se añadió DIEA gota a gota. La disolución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en agua (50 ml), se filtró a través de un filtro vacu-cap con 25 ml adicionales de agua. El pH se ajustó hasta 8,0 con NaOH 0,1 M, y la disolución se concentró hasta 50 ml (TFF). El retenido se lavó con NaCl acuoso (25 mM, 450 ml) hasta que el permeado fue casi incoloro, y después se lavó con agua (400 ml) hasta una conductividad de 0,00 uS. El retenido se liofilizó para producir 0,59 g de un sólido rosa.
Ejemplo 43. Estabilidad acuosa del carbamoilfumagilol
Se diluyó una disolución madre de carbamoilfumagilol en DMSO en un tubo de polipropileno con tapón de rosca de 15 ml con 5 ml de amortiguador de acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 o 5,3, o amortiguador de fosfato de potasio a pH 6,7 u 8,0 a 37°C. La concentración final de carbamoilfumagilol en la disolución amortiguadora fue 5 pM. En los momentos apropiados, se extrajo una muestra de 50 pl y se diluyó con tres volúmenes de metanol que contenía propranolol como patrón interno (se preparó una disolución para todo el estudio). La concentración de carbamoilfumagilol en la disolución se analizó mediante LC/MS/MS durante siete días. Desde un pH de 5,3 hasta 8,0, se observó menos del 20% de descomposición durante el período de siete días. Las constantes de velocidad estimadas se presentan en la Tabla 1.
Figure imgf000028_0002
Ejemplo 44. Agua en conjugados poliméricos
Los polímeros seleccionados fueron analizados por Karl Fisher (QTI Salem Industrial Park - Bldg. #5 Whitehouse, NJ 08888) para determinar el contenido de agua del polímero. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 2.
Figure imgf000028_0003
Ejemplo 45. Reacción de carbamoilfumagilol con 2-mercaptopirimidina
Figure imgf000029_0001
Se añadió una disolución madre, 1 mg/ml, de 2-mercaptopirimidina (2,2 ml) en metanol-D4 a carbamoilfumagilol (6,4 mg). Se eliminó un ml de la disolución resultante, y se añadió una segunda porción de la disolución madre (1 ml). Se añadió K2CO3 sólido, y la disolución se monitorizó mediante RMN 1H. Se identificó un único producto, el aducto 1:1 de 2 -mercaptopirimidina y carbamoilfumagilol.
Las siguientes resonancias se usaron para monitorizar la reacción mediante RMN 1H:
La 2-mercaptopirimidina mostró resonancias a 6,7 ppm (1H, H-4) y 8,1 ppm (2H, H-3, H-5).
El aducto de 2-mercaptopirimidina mostró resonancias a 7,2 ppm (1H, H-4) y 8,5-8,6 ppm (2H, H-3, H-5).
Ejemplo 46. Reacción de conjugados poliméricos con 2-mercaptopirimidina
Se añadió una disolución madre, 1 mg/ml, de 2-mercaptopirimidina (1,1 ml) en metanol-D4 al conjugado polimérico (10 mg). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y se analizó mediante RMN 1H para determinar la relación de tiol sin reaccionar (8,1 ppm) a tiol reaccionado (8,5-8,6 ppm). Se esperaba que la cantidad de tiol reaccionado fuera equivalente a la cantidad de fumagilol en el conjugado polimérico. El polímero rematado con acetamida que no contenía epóxido no mostró producto de reacción con 2 -mercaptopirimidina como se indica en la Tabla 3.
Figure imgf000029_0002
Ejemplo 47. Liberación de catepsina B de análogos de fumagilol
Se diluyó catepsina B (Sigma n° de Cat C6286, n° de Lote 025K7672) hasta una concentración 10x en amortiguador de activación que consiste en aproximadamente 400 nM de enzima, DTT 30 mM, EDTA 15 mM, y amortiguador de acetato, pH = 5,5, durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Los conjugados de HPMA se prepararon en una disolución madre 10x en amortiguador de pH 5,5. La reacción final se realizó diluyendo la enzima y el sustrato 10 veces en amortiguador a pH = 5,5 o pH = 6 ,8. La reacción enzimática final consistió en catepsina B 40 nM, aproximadamente 2,5 mg/ml de agente de ensayo, y amortiguador a 37°C. La reacción se detuvo a las 0, 2, 6 y 24 horas. Para detener la reacción, se añadieron 3 volúmenes de metanol enfriado con hielo que contenía patrón interno de propranolol (a 1,0 pM), y se dejó en hielo. A continuación, las muestras se analizaron mediante LC/MS/MS.
Se demostró que poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(6 -aminohexil)carbamoilfumagilol] libera N-(6 -aminohexil)carbamoilfumagilol y {6 -[(aminoacetil)amino]hexil}carbamato de fumagil-6 -ilo.
Se demostró que poli(HPMA-co-MA-GFLG-NHCH2CH2 N(Me)CH2C(O)NHC(O)2-fumagil-6 -ilo) libera fumagilol, carbamoilfumagilol, y (2 -aminoetil)metilcarbamato de fumagil-6 -ilo.
Se demostró que poli(HPMA-co-MA-GFLG-N(Me)CH2CH2 N(Me)CH2C(O)NHC(O)2-fumagil-6 -ilo) libera fumagilol, carbamoilfumagilol, metil[2 -(metilamino)etil]carbamato de fumagil-6 -ilo], y {2 -[(aminoacetil)(metil)amino]etil}metilcarbamato de etilo.
Ejemplo 48. Materiales y métodos generales para análisis in vitro
Los compuestos de ensayo, moléculas pequeñas o conjugados poliméricos, se disolvieron en dimetilsulfóxido hasta una concentración madre de 5 mg/ml. A continuación, los agentes de ensayo se diluyeron hasta una concentración intermedia a 200 mg/ml en DMSO al 10%. Se completaron diluciones adicionales en serie 3 veces en DMSO al 10% para producir 12 concentraciones decrecientes para análisis in vitro. Para alcanzar las concentraciones diana de los ensayos in vitro, se administró a las células (sembradas en un volumen de 50 ml) 1 ml de la preparación de fármaco intermedio. La concentración final de DMSO para los ensayos fue 0,2% para todas las dosis de agente de ensayo.
Las células se expusieron a doce concentraciones crecientes de agente de ensayo formulado, desde 2 x 10-6 hasta 4,0 mg/ml durante 72 horas. Después de 72 horas de exposición, se añadieron a cada pocillo 25 ml de reactivo CellTiter-Glo®. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37°C en una incubadora humidificada. Después de la incubación, se registró la luminiscencia utilizando el lector multimodo Molecular Devices AnalystGT.
Determinación de IC50
Los datos se expresan como el porcentaje de crecimiento celular del control sin tratar (vehículo) calculado a partir de las señales de luminiscencia. La fracción superviviente de células se determina dividiendo los valores medios de luminiscencia de los agentes de ensayo entre los valores medios de luminiscencia del control sin tratar. El valor de concentración inhibidora para el o los agentes de ensayo y el control se estimaron usando el software Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) ajustando la curva de los datos usando el análisis de regresión no lineal.
Ejemplo 49. Ensayo de viabilidad celular de carcinoma de pulmón no microcítico humano A549
Las líneas celulares de tumores humanos A549 y HCT-116 se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células epiteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de Lonza (Basilea, Suiza). Las células A549 se mantuvieron en RPMI 1640 con L-glut suplementado con FBS al 5%. Las células HCT-116 se mantuvieron en McCoy 5a suplementado con FBS al 5%. La línea HUVEC se cultivó en medio de crecimiento endotelial con suplementos y factores de crecimiento (BBE, hidrocortisona, hEGF, FBS, y gentamicina/anfotericina-B). Todas las células se alojaron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C. Las células se disociaron con tripsina al 0,05% y EDTA al 0 ,0 2 %.
La línea de células tumorales humanas A549 se obtuvo de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células A549 se mantuvieron en RPMI 1640 con L-glut suplementado con FBS al 5%. Las células A549 se sembraron a razón de 500 células por pocillo 24 horas antes de la exposición al agente de ensayo en un volumen de 50 ml. Las células se alojaron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C. Las células se disociaron con tripsina al 0,05% y EDTA al 0 ,0 2 %.
Tabla 4. A549 - Moléculas pequeñas
Figure imgf000030_0001
Tabla 5. A549 - Conjugados poliméricos
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 50. Ensayo de viabilidad de células tumorales de colon humano HCT-116
Las líneas celulares de tumores humanos A549 y HCT-116 se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células HCT-116 se mantuvieron en McCoy 5a suplementado con FBS al 5%. Se sembraron células HCT-116 a razón de 500 células por pocillo 24 horas antes de la exposición al agente de ensayo en un volumen de 50 ml. Las células se alojaron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C. Las células se disociaron con tripsina al 0,05% y EDTA al 0,02%.
Las células se expusieron a doce concentraciones crecientes de agente de ensayo formulado, desde 2,3 x 10-6 hasta 4,02 mg/ml durante 72 horas. Después de 72 horas de exposición, se añadieron a cada pocillo 25 ml de reactivo CellTiter-Glo®. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37°C en una incubadora humidificada. Después de la incubación, se registró la luminiscencia utilizando el lector multimodo Molecular Devices AnalystGT.
Tabla 6. HCT116 - Moléculas pequeñas
Figure imgf000032_0001
Tabla 7. HCT 116 - Conjugados poliméricos
Figure imgf000032_0002
Ejemplo 51. Ensayo de viabilidad de células epiteliales de la vena umbilical humana
Las células epiteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de Lonza (Basilea, Suiza). La línea HUVEC se cultivó en medio de crecimiento endotelial con suplementos y factores de crecimiento (BBE, hidrocortisona, hEGF, FBS, y gentamicina/anfotericina-B). Todas las células se alojaron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C. Las células se disociaron con tripsina al 0,05% y EDTA al 0,02%.
Las células HUVEC se sembraron a 1000 células por pocillo 24 horas antes de la exposición al agente de ensayo en un volumen de 50 pl. Las células se expusieron a doce concentraciones crecientes de agente de ensayo formulado, desde 2,3 x 10-6 hasta 4,02 pg/ml durante 72 horas. Después de 72 horas de exposición, se añadieron a cada pocillo 25 pl de reactivo CellTiter-Glo®. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37°C en una incubadora humidificada. Después de la incubación, se registró la luminiscencia utilizando el lector multimodo Molecular Devices AnalystGT.
Tabla 8. HUVEC - Moléculas pequeñas
Figure imgf000033_0001
Tabla 9. HUVEC - Conjugados poliméricos
Figure imgf000033_0002
Ejemplo 52. Selectividad por A549/HUVEC
La relación de IC50 de HUVEC/IC50 de A549 se presenta en la Tabla 10 a continuación. Cuando se comparan con carbamoilfumagilol y TNP-470, los conjugados poliméricos son más activos contra las células tumorales, A549, que contra las células HUVEC normales.
Figure imgf000033_0003
Figure imgf000034_0002
Ejemplo 53. Metabolitos de A549
Las células se trataron como en el Ejemplo 51, excepto que al final de la exposición de 72 horas al agente de ensayo, las células se congelaron (-70°C) y se almacenaron para la evaluación posterior mediante LC/MS. Los metabolitos identificados de las células tratadas con poli[HPMA-co-MA-GFLG-N-(6-aminohexil)carbamoilfumagilol] incluyen N-(6-aminohexil)carbamoilfumagilol, {6-[(aminoacetil)amino]hexilcarbamato de fumagil-6-ilo, y el producto de la hidrólisis del epóxido, 6-aminohexilcarbamato de (3S,7aR)-7a-(hidroximetil)-4-metoxi-3-metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il)octahidro-1 -benzofuran-3-ol-5-ilo.
Ejemplo 54. Ensayo in vivo de melanoma murino B16-F10
A ratones hembra C57B16 (N = 8) se les inyectaron (vena de la cola) 1 x 105 células tumorales B16-F10. Después de un día, los ratones se trataron con conjugados poliméricos como disoluciones en disolución salina (administración IV, q4d, cuatro dosis excepto que en un grupo se administró O-7175 como una sola dosis el día 1). Se utilizó TNP-470 como control positivo, disolución salina como control negativo. Los ratones se sacrificaron después de 15 días. Los resultados del tratamiento se evaluaron contando las metástasis pulmonares.
Tabla 11. Recuento de metástasis
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Ejemplo 55. Ensayos in vivo en ratones C57B16 - Cambios de peso
A ratones hembra C57B16 (N = 8) se les inyectaron (vena de la cola) 1 x 105 células tumorales B16-F10. Después de un día, los ratones se trataron con conjugados poliméricos como disoluciones en disolución salina (administración IV, q4d, cuatro dosis). Los cambios de peso para tres polímeros con respecto al control del vehículo salino y TNP-470 se muestran en la Figura 1. Los cambios de peso se referencian al peso del grupo en el momento cero. Todos los polímeros se dosificaron a 100 mg/kg. Las dosis de polímero y el vehículo de disolución salina se administraron los días 1,5 y 9. Las dosis de polímero de 100 mg/kg y TNP-470 mostraron una reducción en las metástasis del 44-63% con respecto al control de disolución salina.
Ejemplo 56. Ensayo in vivo de ratones C57B16 - Cambios de peso
A ratones hembra C57B16 (N = 8) se les inyectaron (vena de la cola) 1 x 105 células tumorales B16-F10. Después de un día, los ratones se trataron con conjugados poliméricos como disoluciones en disolución salina (administración IV, q4d, cuatro dosis). Los cambios de peso para un polímero en tres dosis diferentes con respecto al control se muestran en la Figura 2. Los cambios de peso se referencian al peso del grupo en el momento cero. Las dosis de polímero fueron 50 mg/kg, o 100 mg/kg. Las dosis de polímero se administraron los días 1,5 y 9. Las dosis de polímero de 25, 50 y 100 mg/kg y TNP-470 mostraron una reducción en las metástasis del 45-61% con respecto al control de disolución salina.
Ejemplo 57. Ensayo in vivo de ratones nu/nu - Xenoinjerto A549
A ratones hembra nu/nu (N = 8) se les inyectaron (flanco derecho subcutáneo) 5 x 106 células tumorales A549 (vehículo de inoculación 50% de medio/matrigel, flanco derecho subcutáneo). Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de 116 mg, los ratones se trataron con conjugados poliméricos como disoluciones en disolución salina (20 mg/kg, administración IV, q4d, seis dosis) o con un polímero de control sin un resto inhibidor de MetAP2 (100 mg/kg, q4d) o con TNP-470 (30 mg/kg, qod, nueve dosis). El crecimiento del tumor se determinó midiendo el tamaño del tumor en dos direcciones con calibradores a intervalos de unos pocos días. El tamaño del tumor en función del tiempo se muestra en la Figura 3. Las dosis utilizadas se resumen en la tabla siguiente.
Tabla 12
Calendario n° de dosis Dosis única Dosis total Dosis total
mg/kg mg mmol activo
TNP-470 qod 9 30 270 0,67
Polímero q4d 6 20 120 0,044
frecuencia n° de dosis p/p p/p mol/mol
% de polímero 50% 67% 67% 44% 7%
El cambio en el peso corporal frente al tiempo para el experimento de xenoinjerto A549 se muestra en la Figura 4. Los ratones en los grupos tratados con polímero activo muestran cambios de peso similares a los del grupo de TNP-470 y los grupos de control.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000036_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que, independientemente para cada aparición:
R4 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R5 es H o -alquilo de C1-C6 ;
R6 es hidroxialquilo de C2-C6 ;
Z es -NH-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-C(O)-Q-X-Y-C(O)-W;
AA1 es glicina, alanina o H2N(CH2)mCO2H;
AA2 , AA3 y AA4 se seleccionan, cada uno independientemente, de un enlace, o alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina;
AA5 es un enlace, o glicina, valina, tirosina, triptófano, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, o asparagina; AA6 es un enlace, o alanina, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, o H2N(CH2)mCO2H;
Q-X-Y es
Figure imgf000036_0002
W es
Figure imgf000036_0003
x está en el intervalo de 1 a alrededor de 450;
y está en el intervalo de 1 a alrededor de 30;
m es 2, 3, 4 o 5;
n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50; y
el compuesto tiene un peso molecular de menos de alrededor de 60 kDa.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto es:
Figure imgf000037_0001
en el que la relación de x:y es alrededor de 11:1, y n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto es:
Figure imgf000038_0001
en el que la relación de x:y es alrededor de 11:1, y n está en el intervalo de 1 a alrededor de 50.
4. Un compuesto de Fórmula II:
Z-Q-X-Y-C(O)-W (II)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que, independientemente para cada aparición: Z es H2N-CH2-C(O)- o -H; y
Q-X-Y es
Figure imgf000038_0002
W es
Figure imgf000038_0003
5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que el compuesto es:
Figure imgf000039_0001
6. El compuesto de la reivindicación 4, en el que el compuesto es:
Figure imgf000039_0002
7. Un compuesto de la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de un tumor sólido, un cáncer hematológico, enfermedad de las arterias coronarias, fibrosis pulmonar, accidente cerebrovascular, o heridas crónicas.
8. Un compuesto de la reivindicación 4, para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de un tumor sólido, un cáncer hematológico, enfermedad de las arterias coronarias, fibrosis pulmonar, accidente cerebrovascular, o heridas crónicas.
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