JP4514455B2

JP4514455B2 - Ｔｎｐ−４７０ポリマー複合体及びその使用

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Description

発明の背景
近年、血管形成、すなわち既存の脈間構造からの新しい毛細血管の成長は、胚の発達、女性の生殖周期、創傷治癒、及び、器官及び組織の再生のような生理学的プロセスにおいてのみでなく、腫瘍の増殖や転移のような病理学的なプロセスにおいても重要であることが明らかになってきた¹。血管形成は、今や、すべての悪性物にとって、非常に重要なプロセスとして認識されている^2、3。結果として、腫瘍によりリクルートされる微小血管の内皮細胞は、癌治療の重要な第二ターゲットになってきている。内皮細胞ターゲットは、腫瘍細胞それ自体とは違い、遺伝的に安定であることは広く受け入れられている¹。抗血管形生剤は、新しいクラスの薬として近年現れてきた。しかし、これらの薬剤の単独、または、薬物送達システムや従来の化学療法との組み合わせでの使用の最適な手段は、まだ十分に解明されていない。

腫瘍の増殖は血管形成に依存しているという仮説は、生物学的及び薬理学的な証拠により支持されており⁴、遺伝的証拠により確認されている^3、5-7。両方のタイプの証拠が、血管新生阻害剤の現在の臨床試験の科学的根拠を提供している。増加する腫瘍血管形成^4、8及び、血管内皮増殖因子(VEGF/VPF)^8、9、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)⁸、及びインターロイキン-8(IL-8)¹⁰のような血管形成因子のレベルの増加は、悪性固形癌をもつ患者の研究において、生存率の減少及び、再発の危険の増加と相関している。血管形成の重要性は、更に、抗血管形成剤がさまざまな動物モデルで腫瘍の増殖を抑制しているという知見により支持されている。

アメリカでは、現在、30以上の血管新生阻害剤が、末期癌のためのさまざまな臨床試験にかけられている。これらの血管新生阻害剤のうちの一つである、O-(クロロアセチル-カルバモイル)フマジロール(TNP-470)は、Aspergillus fumigatus freseniusにより分泌される化合物であるフマジリン¹¹の低分子量の合成類似体である。TNP-470はインビトロで強力な内皮阻害作用を示す¹²。最近TNP-470は、可能性のある新しい抗癌剤として試験されている。動物モデルでは、TNP-470は、知られている薬剤の中で最も広い抗癌範囲を持つ^4、13。マウスの腫瘍の増殖の91%まで、ヒトの腫瘍を100%まで、マウスのおける転移性の腫瘍を100%まで阻害した(参考文献に概説されている¹³)。ほとんどの研究において、マウスは、一日おきに皮下に、同じ最適投与量の30mg/kgで治療された。臨床試験では、再発した難治性の悪性物で、幾つかの客観的反応が報告され^14-16、TNP-470は、単一薬剤として用いられたときに抗腫瘍活性の証拠を示した。それはまた、従来の化学療法^17、18と組み合わせて用いたときに見込みを示した。しかし、多くの患者が、抗腫瘍活性が見られた服用量で、神経毒性(倦怠感、まれなてんかん発作、無力症、不安、及び神経不安)を経験する^{16、17、19、20}。服用量限界の神経毒性のために、TNP-470は、複数回服用の療法を用いて試験されたが、その毒性を制限するこれらの試みは不成功だった。ほとんど例外なく、TNP-470を摂取した動物において、体重の減少または、体重の増加の不全が観察され²¹、二つの報告が、脾臓の重量の減少を記した^22、23。したがって、その毒性を減らしながら、その活性を保ち、または増加することのできるTNP-470の改良は、非常に望まれている。

発明の概要
本発明は、水溶性ポリマー及びO-(クロロアセチル-カルバモイル)フマジロール(TNP-470)の複合体、及び、腫瘍血管へのTNP-470の、特定の細胞内の担体としてのそれらの複合体の使用に関連する。本発明は更に、TNP-470の神経毒性低下へのそれらの複合体の使用に関する。好ましくは、ポリマーの分子量は、100Da〜800kDaの範囲である。更に好ましくは、ポリマーの分子量は60kDaより大きくはない。更に好ましくは、ポリマーの分子量は、15kDa〜40kDaの範囲である。

好ましいポリマーは、HPMAコポリマーである。HMPAコポリマーは、薬剤関連の毒性の制限を克服し、腫瘍内皮細胞への特定の送達を可能にする、生体適合性で、非免疫原性で、無毒の担体である(Duncan, et al., Hum Exp Toxicol, 17:93-104(1998))。更に、それらの体内での分配は、よく特徴づけられており、それらは強化された浸透性及び保持効果(EPR)ゆえに、腫瘍部分で選択的に蓄積することが知られている(Maeda et al., J Controlled Release, 65:271-284(2000)。その複合体はまた、内皮細胞増殖部分または癌細胞に、または、増殖している内皮細胞と関連した特定の受容体またはマーカーに複合体を向ける、ターゲット部分を含むことができる。

本明細書で紹介されているデータは、HPMAコポリマーに複合したTNP-470が、(i)循環において、高いピークの薬剤レベルを避け、(ii)TNP-470の脳脊髄液への浸透を避け、これゆえ神経毒性の問題を防ぐ、(iii)その半減期を延ばす、(iv)TNP-470の血管新生を伴う器官における蓄積を容易にする、(v)TNP-470を効果の高い、広い有用性も持つ血管新生阻害剤に変えることを説明している。本発明者らは、また驚いたことに、HPMAと複合したTNP-470が、水溶性組成物になるということを見出した。

本発明は、更に、血管新生疾病を治療し、TNP-470の神経毒性を減らす方法におけるその複合体の使用に関する。本発明の治療に受け入れられる血管新生疾病は、これに限られないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、水晶体後線維増殖症、トラコーマ、血管新生緑内障、乾癬、顔面皮疹、免疫性及び非免疫性炎症、アテローム硬化型プラーク内の毛細血管形成、血管腫、過度の創傷修復、固形癌、転移、カボジ肉腫などを含む。

本発明にしたがって、もし、分子量が60kDaより大きいポリマーを用いる場合には、ポリマーは分解性のポリマーか、不活性であることが好ましい。本明細書で用いられている「分解性」ポリマーは、インビボで60kD以下の分子量の成分に解体するものである。本明細書の定義では、ポリビニルアルコール(PVA)は、分解性ポリマーではない。

本発明の他の局面は、以下に開示する。

発明の詳細な説明
本発明は、TNP-470のポリマー及びコポリマー複合体に関連する。

本発明にしたがえば、TNP-470は、分子量が100Da〜800Daの範囲の、分解性または非分解性の水溶性ポリマーと結合される。高分子骨格の成分は、アクリルポリマー、アルケンポリマー、ウレタンポリマー、アミドポリマー、ポリイミン、多糖、及びエステルポリマーを含みうる。好ましくは、ポリマーは、天然のポリマーまたはその誘導体よりは、合成したものが良い。好ましくは、骨格成分は、誘導されたポリエチレングリコール、及び、ポリ(ヒドロキシアルキル(アルキ)アクリルアミド)を含み、最も好ましくは、アミン誘導ポリエチレングリコール、または、ヒドロキシプロピル(メタ)アクリルアミド-メタクリル酸コポリマー、またはその誘導体を含む。デキストラン/デキストリン及びポリエチレングリコールポリマー、またはその誘導体も使用されうる。好ましくは、ポリマーは、分子量が60kDaより大きくない。最も好ましい分子量の範囲は、15〜40kDaである。

TNP-470及びポリマーは、リンカー、好ましくは、切断性ペプチド結合を使用して複合される。ペプチド結合は、前もって選択された細胞酵素、例えば、癌細胞のリソソームまたは増殖している内皮細胞で見られる酵素により切断されえることが、最も好ましい。他に、酸加水分解性のリンカーは、エステルまたはアミド結合を含んでいてもよく、例えば、シス-アコニチル結合であってもよい。pH感受性リンカーも使用されうる。

複合体のリンカーの切断は、活性TNP-470を放出する。従って、TNP-470は、その薬剤の活性を変えないようにポリマーと結合されなければならない。リンカーは好ましくは、少なくとも一つの切断性ペプチド結合を含む。好ましくは、リンカーは、好ましくは選択された細胞酵素と特定の結合をし、切断されるのに十分なアミノ酸ユニットを含む酵素切断性オリゴペプチド基である。好ましくは、リンカーは、少なくとも二つのアミノ酸長であり、更に好ましくは、少なくとも三つのアミノ酸長である。

本発明に使用される好ましいポリマーは、ペプチド結合を通して、パラニトロフェニル誘導体またはエチレンジアミンのような活性カルボン酸末端基を持つメタクリル酸に結合した、垂下したオリゴプチド基をもつメタクリル酸を伴うHPMAコポリマーである。

好ましい態様では、ポリマー骨格は、ヒドロキシアルキル(アルキ)アクリルアミドメタクリルアミドコポリマーを含み、最も好ましくは、ヒドロキシプロピル(メタ)アクリルアミドコポリマー(HPMA)を含む。TNP-470の結合より前に、HPMAは、下記に示された構造を持つ。

yは、0.01〜100の範囲であり、xは0〜99.99の範囲でありうる。yは好ましくは、0.04〜20の範囲であり、xは好ましくは、80〜99.96の範囲である。好ましくは、Lは2から10の、最も好ましくは3または4のペプチド基を含むオリゴペプチド基である。

最も好ましい態様において、Lは、Gly-Phe-Leu-Gly-結合である。一つの態様では、UはONp基であり、ここでNpはp-ニトロフェニル基である。好ましくは、yは、0.3〜15の範囲であり、xは99.7〜85の範囲である。最も好ましくは、yは、5〜10の範囲であり、xは90〜95の範囲である。更に好ましい態様では、ポリマー骨格は、上記で定義したx及びyの値を持つHPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミンである。

HPMAコポリマーの最も好ましい態様において、TNP-470複合体は、図1Aに示された構造を持つ。

HPMAポリマー及びその使用は、国際公開公報第01/36002号に開示されている。

別の態様では、複合体は、リポソーム/TNP-470複合体である。好ましくは、複合体は、ペグリポソームTNP-470である。典型的な複合体は、下記を含む。
a)TNP-470；
b)N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩；
c)完全水素化大豆ホスファチジルコリン；
d)コレステロール；
ヒスチジン、塩酸及び／または水酸化ナトリウム、硫酸アンモニウム、及びショ糖；ここで、a:b:c:dの重量パーセント比は、それぞれ約1.0:1.60:4.80:1.60mg/mLである。

抗血管新生剤複合体は、固形癌または他の血管形成が活性な部位に局在化することを、第一にEPRに依存する一方、アクティブターゲッティングを許容する配位子を付着することが望ましいこともあり得る。好ましいターゲッティング配位子は、インテグリンαVβ3に向けられ、トリペプチド配列RGDを含む。細胞受容体、または細胞表面に存在する他の上方制御された分子に向けられた抗体または配位子も、使用されうる。例えば、28参照。

本発明の複合体は、インビトロ及びインビボの両方において、内皮細胞の血管新生機能を阻害するのに有用である。特に関心があるのは、毛細血管構造への、内皮細胞の分化の妨害または阻害である。複合体による阻害を受け入れられる内皮細胞は、哺乳類でいくつかのサイトに存在し、これに限定されないが、真皮、表皮、子宮内膜、網膜、手術部位、消化管、肝臓、腎臓、生殖系、皮膚、骨、筋肉、内分泌系、脳、リンパ系、中枢神経系、呼吸器系、臍帯、***器官、尿路などを含む。複合体を用いた本発明の治療方法は、炎症及び腫瘍形成サイトに置ける内皮細胞による血管新生を、妨害または阻害するのに、特に有用である。

複合体は、哺乳類の腫瘍形成サイトにおける血管新生阻害方法において、特に有用である。そのようなサイトに投与される複合体は、そのサイトにおける血管形成を妨害または阻害し、それにより腫瘍の発達または成長を阻害する。その複合体を用いて血管新生を妨害または阻害することにより、妨害または阻害されうる腫瘍は、それに限られないが、メラノーマ、転移、腺癌、肉腫、胸腺腫、リンパ腫、肺腫瘍、肝臓腫瘍、大腸腫瘍、腎臓腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮腫瘍、***腫瘍、前立腺腫瘍、腎臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、脳腫瘍、精巣腫瘍、骨腫瘍、筋肉腫瘍、胎盤腫瘍、胃腫瘍などを含む。

哺乳動物、好ましくはヒトにその複合体を提供することにおいて、投与される複合体の服用量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般の医学的状態、それまでの病歴、病気の進行、腫瘍の負担、投与経路、製剤形態などのような因子によって変わる。例えば、本明細書で述べられた治療の必要な哺乳動物のための、複合体の適当な服用量は、体重キログラムあたり約1mg〜約2000mgTNP-470の範囲である。

投与経路は、静脈内(I.V.)、筋肉内(I.M.)、皮下(S.C.)、皮内(I.D.)、腹腔内(I.P.)、くも膜下腔内(I.T.)、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所的、腫瘍内、などでありうる。

本発明は、複合体が、タキソール、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビルなどのような、化学療法薬と組み合わせて用いられる併用療法を包含する。化学療法薬は、ポリマーと接合されているかもしれない。そのような療法は、特に、治療される哺乳動物がかなり血管新生化した大きい既存の腫瘍塊をもつ場合に、特に有用である。化学療法薬は、腫瘍塊を減らすのに役立ち、複合体は、腫瘍塊の中または周りの新血管新生を妨害または阻害する。化学療法薬は、また、通常使用されるより少ない服用量で投与されえ、そのような服用量においては、抗血管新生薬として機能する。

本発明は、下記の実施例により更に説明される。これらの実施例は、発明の理解に役立つものとして提供され、それに制限されるものとして解釈されない。

実施例1
方法
材料
約10mol%のMA-GFLG-ONpモノマーユニットを組み入れるメタクリロイル-Gly-Phe-Leu-Gly-p-ニトロフェニルエステル(HPMAコポリマー-Ma-GFLG-ONp)と共重合化されたHPMAランダム共重合体が、前に報告されたように²⁴準備され、ポリマーラボラトリーズ(UK)により提供された。ポリマー前駆体がエチレンジアミン(en)取り込みに用いられ、生成物HPMAコポリマー-GFLG-enは、Mwが31,600Da、多分散性(PD)は1.66だった。TNP-470は、NCI(USA)からDouglas Figgによって、快く提供された。2-プロパノール、メタノール、オルトリン酸、及び、クロロホルムは、Sigma(すべてHPLCグレード)から、ジメチルホルムアミド(DMF)及びジメチルスルホキシド(DMSO)はAldrich(USA)からのものであった。他のすべての化学製品は、他に述べていなければ、Aldrich(USA)及びFisher Chemicals(USA)からの分析級のものであった。Vivacell70ml(10kDaMWカットオフPES)は、VivaScience(USA)からのものであった。イソフルランは、Baxter Healthcare Corporation(USA)から購入した。マトリゲル基底膜基質(Engelbreth-Holm-Swarmマウスの腫瘍から)は、Becton Dickinson(USA)から購入した。トリブロモエタノール(Avertin)は、Fisher(USA)から購入した。

A2058ヒトメラノーマ細胞は、ATCCから入手した。LLC細胞は、以前に述べられたように⁴⁷、マウスからマウスに継代した。細胞は、37℃の湿潤5%CO₂インキュベーターに、10%不活性化ウシ胎児血清(Life Technologies Inc.)、0.29mg/ml L-グルタミン、100units/mlペニシリン、及び、100μg/mlストレプトマイシン(GPS)(Gibco)を含む DMEM培地で維持された。BCE細胞は、本発明者らの実験室で単離し、述べられたように⁴⁸、37℃の加湿された10%CO₂インキュベーターで培養した。BCE細胞は、10%仔ウシ血清(BCS)、GPS、及び、3ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)で補充された、DMEM培地で育てた。C57BL/6Jマウスは、Jackson Laboratories(USA)から購入し、SCIDマウスは、Massachusetts General Hospital(USA)からのものであり、BALB/cマウスは、Charles River(USA)からのものであった。

合成
TNP-470をHPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミンに、TNP-470のα-カルボニルに対して求核攻撃することにより塩素を放出して、複合した。簡潔には、HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミン(100mg)をDMF(1.0ml)に溶解した。次に、TNP-470(100mg)を1.0mlDMFに溶解し、溶液に加えた。混合物を暗所で4℃で12時間攪拌した。DMFを蒸発させ、生成物、HPMAコポリマー-TNP-470複合体を水に再溶解し、遊離のTNP-470と他の低分子量混入物を除くために、水に対して透析し(10kDa MWCO)、凍結乾燥し、-20℃で保存した。C18カラムを用いた逆相HPLC分析を用い、複合体を同定した。

ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞増殖アッセイ法
BCE細胞を、以前に報告されたように^４８入手し育てた。増殖アッセイ法のために、細胞をPBSで洗い、0.05%トリプシン溶液に分散させた。細胞は、10%BCS及び1%GPSを補充されたDMEMに懸濁し(15,000細胞/ml)、ゼラチン化した24穴の培養プレート(0.5ml/穴)に蒔き、24時間(37℃、10%CO₂)でインキュベートした。培養液は、0.25mlのDMEM、 5%BCS、及び1%GPSで置き換えられテストサンプルが加えられた。細胞は、遊離のまたは、複合化されたTNP-470(1μg/ml TNP-470当量濃度に対して10pg/ml)で検証した。30分のインキュベーション後、培養液及びbFGFを加え、0.5mlのDMEM、5%BCS、1%GPS及び1ng/mlbFGFの最終量を得た。対照細胞は、bFGFあり、またはなしで育てた。72時間後、細胞をトリプシンに分散し、Hematall(Fisher Scientific Pittsburgh, PA)に再懸濁し、Coulterカウンターで数えた。

ニワトリ大動脈環アッセイ法
大動脈弓を１４日目のニワトリ胎児から解体し、横断面部分に切り、以前に述べられた方法(V/Muthukkaruppan, Personal Communication)の修正を用いて、マトリゲルに、インビトロで移植した。5%ウシ胎児血清で補充されたMCDB-131培地で培養された場合、内皮細胞が出芽し、血管チャネル形成が24〜48時間で起こった。遊離のまたは複合化したTNP-470(10pg/ml〜1μg/ml)を培養液に加えた。

肝切除モデル
雄のC57BL/6Jマウスに、イソフルラン³³で全身麻酔した後に正中線切開で部分肝切除を行った。遊離または複合化したTNP-470(30mg/kg)を、手術の日から1日おきに8日間、図4aに示した方法によって、皮下注射で与えた。または、与えられる服用量を、手術の日とその4日後は60mg/kgとし、または、部分肝切除の日に一度120mg/kgとした。肝臓を8日目に回収し、重量を測り、組織像により分析した。

LLC皮下注射を受けたマウスにおける遊離TNP-470及びHPMAコポリマー-TNP-470の体分布の評価
雄のC57BL/6Jマウスに5×10⁶の生存可能なLLC細胞を皮下注射で接種し、腫瘍をおよそ体積100mm³まで成長させた。動物に、遊離の、または、複合化したTNP-470(30mg/kg)を静脈注射した。C57BL/6Jマウスの脳からのCSFの脳内離脱を、マウス脳地図⁴⁹に述べられた定位座標及びwaynforth⁵⁰に述べられた方法に従って、モデル310定位固定装置(Stoelting Co., Wooddale IL)を用いて行った。望ましい量の体液(およそ20μl)が得られたら、動物を72時間までに、頚部脱臼により屠殺した。腫瘍、主な器官、血液、尿、及びCSFを集め、ホモジナイズした。その後、TNP-470をクロロホルムで抽出した。クロロホルムを蒸発させた後、サンプルを再溶解し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)/タンデム型質量分析(LC-MS/MS)を用い、遊離のTNP-470の、サンプル内の量を以前に述べたように³⁶決定した。

HPMAコポリマー-TNP-470の抗腫瘍活性の評価
雄のC57BL/6Jマウス(〜8週齢、〜20g)に、5×10⁶の生存可能なLLCまたはA2058メラノーマ細胞を皮下注射により接種した。腫瘍を体積およそ100mm³まで成長させた。動物に、遊離のTNP-470、または、HPMAコポリマー-TNP-470(30mg/kg、TNP-当量)または、生理食塩水(250μl静注)を静脈注射した。それぞれのグループは５匹のマウスからなっていた。腫瘍が、体重の30%に相当するサイズになりまたは越えたときに、マウスを屠殺した。動物の体重を毎日量り、腫瘍の進行の徴候を観察し、体重が、スタートの体重の80%より少なくなったら屠殺した。動物の健康状態、体重減、及び腫瘍の進行をモニターした。終了時、マウスの死後検査を行い、腫瘍を解剖し重さを量った。腫瘍が500mm³になった時に、複合体の更に多い服用量での治療を開始した同様の実験を繰り返した。同じ服用スケジュールが、5×10⁶の生存可能なA2058ヒトメラノーマ細胞を皮下注射により接種し、上記の方法で治療された白い雄のSCIDマウス(〜8週齢、〜20g)で繰り返された。

統計学的方法
すべてのインビトロデータは、平均値±平均値の標準偏差(S.D.)で表す。すべてのインビボデータは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.)で表す。統計学的有意性は、Student-t検定を用いて評価した。0.05またはそれ未満のP値は、統計学的に有意とみなした。

結果
合成及び特徴分析
HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミン-TNP-470複合体(図1A)を合成し、精製し、HPLCで特徴分析した。Gly-Phe-Leu-Gly-ポリマー-TNP-470リンカーは、カテプシンBのような、リソソームのシステインプロテアーゼ²⁹の働きにより、リソソーム内でTNP-470を遊離させるようにデザインされた。カテプシンBが多くの腫瘍細胞で過剰発現していることが報告されている³⁰。複合体は、EPR効果により腫瘍組織に選択的に蓄積され、液相飲作用により腫瘍層の内皮細胞にゆっくりと内部移行する。複合体は、正常の静止状態の内皮細胞に内部移行するべきでなく、それゆえ、リソソームの酵素にさらされず、リンカーは無傷のまま残る。遊離のTNP-470は、保持時間13.0分でシングルピークとして溶出し、複合体は、10.0分で、幅広いピークとして溶出した(結果は示されない)。透析による精製の繰り返しで、遊離の薬剤は無視できた(<総TNP-470の0.01%)。TNP-470は水溶性でないが、HPMAコポリマーとの複合で溶解性になった。複合体は、リン酸緩衝生理食塩水、または、クエン酸緩衝液、PH5.5、0.2M、37℃で3日間安定だった。しかし、同じ状態の下で、リソソームの酵素カテプシンBを加えると、ポリマーと薬(Gly-Phe-Leu-Gly³¹)の間のリンカーが開裂し、TNP-470が放出された(図1B)。このような状態は、カテプシンBのようなリソソームの酵素が存在する内皮細胞のリソソームの環境に似ている。複合体からのTNP-470の放出は、カテプシンBでのインキュベーション５時間内に、プラトーに到達し、5日後でさえも目に見えるほど増加しなかった。その後、インキュベートされた溶液は、分析され、TNP-470の含有量は、およそ10mol%だった。本発明者らは、次に、HPMAコポリマー-TNP-470複合体の活性を、インビトロの二つの血管新生アッセイ法、内皮細胞増殖アッセイ法、及びニワトリ大動脈環アッセイ法でテストした。

ウシ毛細血管内皮細胞(BCE)増殖
HPMAコポリマー-TNP-470が内皮細胞で活性かどうか決定するために、インビトロでBCE細胞増殖に対する阻害効果をテストした。bFGFによって刺激されたBCE細胞の成長は、TNP-470及びHPMAコポリマー-TNP-470によって同様に阻害された(図2A)。遊離の及び複合化したTNP-470は、bFGF誘発のBCE細胞の増殖を、10pg/ml〜1μg/ml TNP-470当量濃度で阻害した(細胞***停止効果)。しかし、1μg/mlより多い服用量では、遊離の及び複合化したTNP-470は、細胞毒性であった。これらのデータは、異なった内皮細胞^11、32における遊離のTNP-470の発表された結果と一致している。

ニワトリ大動脈環アッセイ法
複合体がインビトロで内皮細胞成長を阻害することが立証されたので、マトリゲルに移植されたニワトリ大動脈環のエキソビボモデルを、HPMAコポリマー-TNP-470複合体の更なる特徴分析に用いた。遊離の及び複合化したTNP-470は、両方とも、ニワトリ大動脈環から成長した血管発芽の数及び長さを50pg/mlで減少させ、100 pg/mlで成長を完全に阻害した(図2B)。対照の大動脈環(左の長方形)は、大量の出芽を示した。同様の服用量依存性が、マウス大動脈環アッセイ法で、遊離のTNP-470で見られた(Moulton、未発表の結果)。

肝切除
本発明者らは、HPMAコポリマー-TNP-470が遊離のTNP-470とインビトロで同様な活性があることを示した。それゆえ、本発明者らは、インビボでのその抗血管新生活性を評価した。

インビボでの腫瘍モデルにおいて複合体をテストする前に、本発明者らは、肝切除モデルにおけるHPMAコポリマー-TNP-470複合体の有効性を確立した(図3A)。この非腫瘍性モデルは、比較的早い(8日)インビボでの抗血管新生依存プロセスである³³。肝切除後の肝臓再生は、腫瘍増殖と似て、抗血管新生依存であるので^33、34、本発明者らは、肝切除モデルを、遊離の及び複合化したTNP-470の内皮細胞阻害活性を比較するために用いた。部分肝切除に続いて、対照マウスは、切除された肝臓が手術前の重量(〜1.2g)に、手術後8日までに再生した(図3B)。遊離のTNP-470またはポリマー複合体で、1日おきに(q.o.d)30mg/kg皮下に(s.c.)処置したマウスは、肝臓の再生が阻害され、手術後8日で、平均サイズ0.7gになった(図3B)。遊離のTNP-470は、4日おきに60mg/kg注射する、または、肝切除の日に1回120mg/kg注射した場合に、肝臓再生を阻害しなかった。しかし、HPMAコポリマー-TNP-470複合体は、4日おきに(q.4.d.)60mg/kg与えられる、または、肝切除の日に1回120mg/kg与えられた場合と、30mg/kg q.o.d服用スケジュールと同じような効果を示した。これは、複合体が、インビボで、遊離のTNP-470より長い循環時間を持つこと、及び／または、複合体が増殖している内皮細胞のサイトにおいて蓄積し、ポリマーから持続したTNP-470の放出を導いていることを示している。肝臓の再生は、内皮細胞によって調節されているので^33、34、複合体がEPR効果により蓄積する腫瘍組織の、増殖している内皮細胞でも同様の効果が起こるであろうことが期待される。

初期のマウスの発達
遊離の及び複合化したTNP-470を、通常の発達におけるそれらの効果をテストするために、生後7及び17日のBALB/cマウスに注射した。遊離のTNP-470は、この臨界齢において、体重の増加を阻害することによって、成長を阻害した。しかし、 HPMAコポリマー-TNP-470複合体で治療されたマウスは、生理食塩水を注射した対照グループと同様に発達した(図3C)。これらの結果は、肝切除実験から得られた結果と異なっている。HPMAコポリマー-TNP-470複合体は、肝切除後の肝臓の再生を阻害するが、新生児マウスの通常の発達を阻害しなかった。可能な説明は、複合体は、手術後の肝臓の漏出性血管を通って血管外遊出するということである(すなわち、TNP-470により遅延された創傷治癒に見られる同様の阻害³⁵)。しかし、複合体は、新生児の通常の血管発達から漏出しなかった。

A2058ヒトメラノーマを皮下にもつSCIDマウスにおけるHPMAコポリマー-TNP-470の抗腫瘍活性の評価
A2058メラノーマを皮下にもつマウスは、遊離の及び複合化したTNP-470(TNP-470ではT/C=0.34及び複合体では0.12)で治療すると生存率の増加を示した(図4A)。T/Cは、治療される動物の腫瘍の平均体積(T)を、治療されていない対照グループの腫瘍の平均体積(C)で割った比により定義される。この実験の間、複合体で治療されたマウスで、毒性による死または体重減ものはなく、複合体の服用量の増加は可能なことを示している。腫瘍の成長率の顕著な減少が、対照と比較して、TNP-470(p<0.03)及び HPMAコポリマー-TNP-470(p<0.05)で治療された動物において観察された(図4A、B、C)。図4Cは、H&Eで着色された三つの処理されたグループ(生理食塩水、遊離の及び複合化したTNP-470)を代表し、すべて生存可能な腫瘍細胞を示す腫瘍の組織学的切片を表している。

LLCを皮下にもつC57BL/6JマウスにおけるHPMAコポリマー-TNP-470の抗腫瘍活性の評価
LLCを皮下に持つマウスは、遊離の、及び、結合したTNP-470で、30mg/kgq.o.d.のTNP-470と当量の濃度で治療したとき、生存率の増加を示した。HPMAコポリマー-TNP-470は、遊離のTNP-470に比べて、優れた抗腫瘍活性を示した。８日目に、対照マウスを処理したところ、遊離のTNP-470が67%(P<0.05)腫瘍の成長を阻害したのに対し、HPMAコポリマー-TNP-470は、86%(P<0.03)腫瘍の成長を阻害した(図5A、5B)。それに加えて、遊離のTNP-470が体重の減少を引き起こしたのに対し、複合体は体重の減少を引き起こさなかった(データは示されていない)。HPMAコポリマー-TNP-470が体重の減少を引き起こさなかったので、LLCを持つマウスに、複合体を、30 mg/kg/q.o.d.とともに、それより高い服用量の60及び90 mg/kg/q.o.d.でもテストした。複合体は、30または60 mg/kg/q.o.d.で(P<0.03、T/C=0.4、8日)、等しく腫瘍の成長を阻害した。腫瘍の抑制は、90 mg/kg/q.o.d. (P<0.05、T/C=0.24、8日)で、非常に強められた(図5C、D)。90 mg/kg/q.o.d.の多い服用量でさえ、動物の体重の減少はなく、本発明者らは、最大耐容量(MTD)に到達しなかったことを示している。これらの服用量の遊離のTNP-470は、マウスに有毒であることが知られている。このセットの実験で、治療は、腫瘍が500mm³に達したときに開始し、それゆえ、腫瘍が100 mm³のとき治療を始めた以前の実験とは結果が異なった。

LLCを皮下にもつマウスの脳脊髄液におけるTNP-470及びHPMAコポリマー-TNP-470の評価
HPLC質量分析(LC-MS/MS)は、遊離のTNP-470が、薬のi.v.投与後にLLCを皮下にもつマウスの脳脊髄液(CSF)に存在することを示した。しかし、HPMAコポリマー-TNP-470複合体が注射された場合には、TNP-470もその知られている代謝産物³⁶もCSFには検出されなかった。これらの結果は、TNP-470関連神経毒性は、TNP-470をHPMAコポリマーと複合化した場合には避けられうることを示している。LC-MS/MSで分析された、遊離の及び複合化したTNP-470の正常組織、血液、尿、及び腫瘍での全体分布と薬物動態は、別に公表される。

結論
癌治療における新たな進展であるにもかかわらず、いくつかのポリマー-薬物複合体がすでに早期の臨床試験にかかっている³⁷。これらは、HPMAコポリマー-ドキソルビシン(PK1、FCE28068)、HPMAコポリマー-パクリタキセル(PNU166945)、HPMAコポリマー-カンプトテシン、ポリエチレングリコール(PEG)-カンプトテシン、ポリグルタミン酸-パクリタキセル、HPMAコポリマー-プラチネート(AP5280)及びまた、追加的にガラクトサミンをもつHPMAコポリマー-ドキソルビシン複合体(PK2、FCE28069)³⁸を含む。毒性の減少と化学療法における活性が、難治性の患者において報告されている。フェーズIにおいて、PK1が、320mg/m²(遊離のドキソルビシンが60 mg/m²であるのに対し)の最大耐容量を示し、抗腫瘍活性も示した³⁹。さらに、臨床的薬物動態(PK1t_1/2α=1.8時間、遊離のドキソルビシンでは数分であるのに対し、クリアランスは服用量に依存していない)は、動物で報告された薬物動態ときわめて類似していた²⁵。PK1は、動物及びヒトにおいて、付随する、1〜5時間の間に低い血中濃度にする^25、39腎臓排出とともにEPR効果により固形癌をターゲットにする能力を証明した。

ポリマー-血管新生阻害剤複合体は、巨大分子がEPR効果²⁶により受動的に固形癌組織をターゲットにする能力を利用することができる(PK1と類似)。この効果は、あまり組織化されていない腫瘍の脈管構造⁴¹により起こり、結果として循環する分子に対して、「強化された透過性」となる。腫瘍組織における劣るリンパ性排出が、「保持時間」を増加させる。遊離の薬物に対して、ポリマー-薬物複合体の改良された抗腫瘍活性の主な理由は、このEPR効果の結果による腫瘍ターゲッティング³⁷であると受け入れられている。この研究で用いられたGly-Phe-Leu-Glyポリマー- TNP-470リンカーは、リソソームのシステインプロテアーゼ²⁹の働きにより、TNP-470をリソソーム内で遊離させるようにデザインされた。抗腫瘍活性を働かせるためには、活性TNP-470種を腫瘍サイトで放出させ、内皮細胞で、メチオニンアミノペプチターゼ2(MetAP2)と相互作用しなければならない。内皮細胞の増殖に関する選択的効果の根底にある正確なメカニズムはまだわからないが⁴²、MetAP2は最近同定されたTNP-470の分子ターゲットである。それゆえ、0.12-0.14の複合体のT/C値は、TNP-470が、循環の間重合体骨格を持っており、腫瘍サイトで放出されることを示した。TNP-470部分の放出のメカニズムは、細胞の取り込みに続く、内皮細胞のリソソーム内でのペプチドリンカーの酵素的切断に関係する。腫瘍に蓄積する複合体のいくつかは、腫瘍細胞で吸収されるらしい。しかし、より高い濃度(logで3より高い)のTNP-470が、腫瘍細胞に影響を与えるために必要とされるだろう。

血管新生誘発剤及び阻害剤に関する多くの研究が、有効性の指標としてインビトロまたはインビボモデルに頼っている。しかし、これらのモデルは価値があるものの、それぞれに限界がある。それゆえ、インビトロ及びインビボアッセイの両方を含む、複数のアッセイ使用が、今のところ、いかなる特定のアッセイ⁴³に固有な問題をも最小限にする最善の方法である。このようにして、遊離の及び複合化したTNP-470の間の適正な評価と比較が達成された。

まとめると、本発明者らは、腫瘍成長率を、腫瘍血管をターゲットにしている抗血管新生剤の組織的送達により、顕著に減らすことができたことを示した。更に、この複合体は、遊離の形のものと違って、CSFに入らないので、おそらく毒性を減らし、新生児及び大人のマウスの体重減を起こさない。遊離のTNP-470と比較した(肝切除モデルで述べられたように)、複合体の活性の強化と効果の長期化は、新しく血管新生化した組織での蓄積の増加と、複合体のより大きな安定性に帰することができる。このストラテジーのいくつかの構成成分が、明白な抗腫瘍活性に貢献しており、ヒトでの将来の治療を容易にすることができるかも知れない。第一に、この研究で用いられたHPMAコポリマーは、多価の副鎖を持っており、高負荷のTNP-470または新生血管に対する他の薬剤を目指すことを、EPR効果によって可能にする。第二に、内皮細胞をターゲットする部分を、重合体骨格のそれらの副鎖に複合化することが可能である⁴⁴。第三に、本発明者らは、(a)血管新生阻害剤は、血管内腔の中からの内皮の成長をおさえ、また、漏出性腫瘍血管を横切りうる；(b)HPMAコポリマー- TNP-470複合体は、内皮に薬剤を長期間さらすことを提供し；(c) TNP-470複合体は、通常の血液脳関門を横切ることができないことを強調する。最後に、ポリマーは、ウイルス性のベクターよりも免疫原性が少なく、結合タンパク質の免疫原性を減らす、または、抑止さえし、循環時間を長くすることが知られている^24、25。急性リンパ性白血病の治療のためのポリエチレングリコール(PEG)-L-アスパラギナーゼ(Oncaspar(登録商標))のようなポリマー-酵素複合体は、FDA認可であり、商業的に入手可能である⁴⁶。それゆえ、血管新生及び血管修復に依存する病気の持続した治療のために、治療遺伝子またはタンパク質を、繰り返し新生血管に運ぶことが可能でありえる。この研究は、ポリマーに複合化することにより、有効な血管新生阻害剤を顕著に改良することができ、その毒性を減らすことができるかの例を示している。

実施例2
マイルズアッセイ法
血管新生依存の病気にかかわる問題の一つは、浮腫及びタンパク質の喪失につながる血管の透過性の増加(高レベルVPFによる)である。血管透過性の減少は、それらの病気に有効である。本発明者らは、マイルズアッセイ法(Claffey et al., Cancer Res., 56:172-181(1996))を用い、遊離の及び結合したTNP-470が、透過性をブロックすることを見出した。Evans Blueという色素をi.v.で、麻酔されたマウスに注射した。10分後、ヒト組換えVEGF₁₆₅を内皮的に背中の皮膚に注射した。タンパク質結合色素の漏れが、注射箇所の周りの背中の皮膚の下側に、青い斑点として観察された。20分後、マウスを屠殺した。その後、皮膚を摘出し、5日間ホルムアミドに置き抽出し、溶液を620nmで測定した。遊離の及び複合化したTNP-470のような推定上の血管新生阻害剤をVEGF負荷に先立って3日間毎日注射した。同じことを腫瘍を持つマウスに、腫瘍血管透過性についての血管新生阻害剤の効果を評価するために繰り返した。

本発明者らは、遊離の及び複合化したTNP-470を、マイルズアッセイ法において他の血管新生阻害剤と比較した。本発明者らは、遊離のTNP-470及びHPMAコポリマー- TNP-470が、対照グループ、及び、ハーセプチンやサリドマイドのような間接的血管新生阻害剤と比較して、VEGF誘発血管透過性に対して類似の阻害効果があることを見出した(図6)。

本明細書を通して引用された参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

参考文献

上記した本発明は、理解を明確にする目的で、実例や例示により詳細が述べられたが、当業者には、ある一定の変更や修正が特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく行われうることが、容易に理解される。

図1Aは、HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミン-TNP-470の構造を表す。図1Bはインビトロでの、カテプシンBの存在下(-■-)及び欠乏下(-◆-)でのHPMAコポリマーからのTNP-470の解離を示す。図2Aは、インビトロでの72時間後のBCE増殖の阻害を示す。TNP-470(-▲-)及びHPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-en-TNP-470(-■-)は、bFGF誘導の内皮細胞増殖において、1μg/mlより少ない服用量で類似の細胞***停止効果と、1μg/mlより大きい服用量で類似の細胞毒性効果があった。点線はbFGF誘導のBCE細胞増殖を表し(---)、実線はbFGF欠乏化でのBCE細胞増殖を表す(-)。図2Bは、ニワトリ大動脈環内皮発芽アッセイ法を示す。TNP-470(中央の長方形)及び、HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-en-TNP-470(右の長方形)の100pg/mlTNP-470当量の用量における効果が示されている。大量発芽を伴った対照ニワトリ大動脈環(左の長方形)が示されている。図3Aは、肝切除モデルの模式的表現を示す。処理されていない肝臓は8日で再生するが、TNP-470 30mg/kg/q.o.d.s.c.で処理された場合は再生しない。図3Bは、遊離のTNP-470(斜線の棒)が30mg/kg/q.o.d.s.c.で用いられたとき、肝臓再生を阻害したことを示す。しかし、他の服用スケジュールでは、肝臓再生を阻害しない。複合したTNP-470(塗りつぶされた棒)は、30mg/kg/q.o.d.s.c.または60mg/kg/q.2.d.s.c.または手術日の120mg/kg/s.c.の単独服用でさえも、対照再生グループ(ドットの棒)に比べて、肝臓再生を阻害した。図3Cは、遊離のTNP-470(-●-)が生まれたてのマウスの発達を遅らせることを示しているが、複合体(-▲-)で用いたときには、対照マウス(-■-)と類似して、体重には影響を与えなかった。矢印は治療の日を表す。データは平均値±SE、n=9マウス(グループあたり)を表す。図4は、A2058ヒトメラノーマを有するオスのSCIDマウスを用いて測定した抗腫瘍活性を示す。図4Aは、腫瘍についてのTNP-470(-●-)；HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-en-TNP-470(-▲-)の効果；及び対照マウス(-■-)を示す。データは平均値±SE、n=8マウス(グループあたり)を表す。P値<0.05のものは*でマークし、P<0.03のものは**、P<0.01のものは***とした。図4Bは、SCIDマウス及び治療8日目のパネル(A)に関連する切除された腫瘍を示す。図4Cは8日目における強力及び低出力の異なったグループの動物から切除された腫瘍の、H&E染色を示す。図5は、LLCを有するオスのC57マウスを用いて測定した抗腫瘍活性を示す。図5Aは、腫瘍の成長についてのTNP-470 30mg/kg/q.o.d.s.c. (-●-)の効果；HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-en-TNP-470 30mg/kg/q.o.d.s.c. (-▲-)の効果を示しており；対照マウス(-■-)も示されている。データは平均値±SE、n=10マウス(グループあたり)を表す。図5Bは、治療を続けた10日目の(A)に関連する代表的C57マウスを示す。図5Cは、HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-en-TNP-470の30mg/kg/q.o.d.(-▲-)、 60mg/kg/q.o.d. (-●-)、及び90mg/kg/q.o.d. (-◆-)の服用量の増大を示しており、対照マウス(-■-)が示されている。データは平均値±SE、n=10マウス(グループあたり)である。図5Dは、(C)に関連するC57マウスを示す。P値<0.05のものは*でマークし、P<0.03のものは**、P<0.01のものは***とした。図6はマイルズアッセイ法の結果を示す。

Claims

水溶性であり、分子量が１００Ｄａ〜６０ｋＤａの範囲であるポリマーに複合化した、ＴＮＰ−４７０を含み、該ポリマーがヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド−メタクリル酸コポリマーである、組成物。
ポリマーの分子量が１５〜４０ｋＤａの範囲である、請求項１記載の組成物。
ＴＮＰ−４７０とポリマーとの間にペプチドリンカーを更に含む、請求項１記載の組成物。
ターゲット配位子を更に含む、請求項１記載の組成物。
下記の構造を含む、請求項１記載の組成物：

式中、ｙは０．０４〜２０の範囲であり、ｘは８０〜９９．９６の範囲である。
血管新生疾病を治療するための、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
血管新生疾病が固形癌である、請求項６記載の組成物。
水溶性であり、分子量が１００Ｄａ〜６０ｋＤａの範囲であるポリマーにＴＮＰ−４７０を複合化する工程を含み、該ポリマーがヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド−メタクリル酸コポリマーである、ＴＮＰ−４７０の神経毒性を減らすための方法。
ポリマーの分子量が１５〜４０ｋＤａの範囲である、請求項８記載の方法。
抗血管新生剤とポリマーとの間にペプチドリンカーを更に含む、請求項８記載の方法。
ポリマーにＴＮＰ−４７０を複合化する工程の生産物が、下記の構造を含む、請求項８記載の方法：

式中、ｙは０．０４〜２０の範囲であり、ｘは８０〜９９．９６の範囲である。
ｙは５〜１０であり、ｘは９０〜９５である、請求項１１記載の方法。
下記の構造を含む、ＨＰＭＡ−ＴＮＰ−４７０複合体：

式中、ｘは９０〜９５であり、ｙは５〜１０である。