ES2845600T3 - Aparato y métodos para la obtención de imágenes de fluorescencia utilizando excitación multiplexada por radiofrecuencia - Google Patents
Aparato y métodos para la obtención de imágenes de fluorescencia utilizando excitación multiplexada por radiofrecuencia Download PDFInfo
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Abstract
Un método de obtención de imágenes por fluorescencia, comprendiendo el método: con un deflector acústico-óptico (22) accionado por un peine de RF (20) y un rayo láser de excitación (16), crear (82) una pluralidad de primeros haces (24) de luz con un rango de ángulos de salida y cambios de frecuencia; con un variador de frecuencia acústico-óptico (28) accionado por un tono de RF y un rayo láser (18) de excitación, crear (84) un segundo haz (30) de luz desplazado en frecuencia; combinar la pluralidad de los primeros haces (24) y el segundo haz (30) para producir una pluralidad de haces de luz (34) combinados desplazados en frecuencia; interrogar (86) simultáneamente a múltiples puntos en una muestra (46) con la pluralidad de haces de luz (34) combinados; y detectar (88) una respuesta fluorescente de la muestra por exposición a la pluralidad de haces de luz combinados.
Description
DESCRIPCIÓN
Aparato y métodos para la obtención de imágenes de fluorescencia utilizando excitación multiplexada por radiofrecuencia
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo de la Invención
Esta invención se refiere en general a dispositivos y métodos de obtención de imágenes ópticas y, más particularmente, a aparatos y métodos para la obtención de imágenes de fluorescencia unidimensional y bidimensional de alta velocidad habilitadas por multiplexación de frecuencia de impulsos.
2. Descripción de la técnica relacionada
La microscopía de fluorescencia es una de las modalidades de imagen más importantes, omnipresentes y poderosas en la investigación biomédica. La resolución espacial de la microscopía de fluorescencia moderna se ha mejorado hasta tal punto que incluso la resolución limitada por sub-difracción es rutinariamente posible. No obstante, la resolución temporal en microscopía de fluorescencia no ha seguido el ritmo de los avances en la resolución espacial.
Si bien existen varias modalidades de microscopía de fluorescencia, la resolución temporal de la técnica está fundamentalmente limitada por la relativamente débil emisión óptica de las muestras fluorescentes. Como resultado, la tasa máxima de fotogramas completos (512 x 512 píxeles) de la microscopía tradicional de fluorescencia de escaneo por láser de un solo punto está limitada aproximadamente a una velocidad de video de 30 fotogramas por segundo, que corresponde a tasas de píxeles de menos de 10 MHz. Los microscopios confocales de escaneo de línea y de disco giratorio son capaces de obtener velocidades de fotogramas más altas al multiplexar la excitación y detección de la fluorescencia, pero las velocidades de fotogramas están limitadas en última instancia por la baja ganancia electrónica y, tanto por el rendimiento óptico del disco giratorio como por el tiempo de lectura del detector, respectivamente.
La demanda de resolución temporal inferior a milisegundos en la microscopía de fluorescencia ha sido la principal fuerza impulsora detrás del desarrollo de muchas tecnologías de imagen avanzadas, tal como la cámara del dispositivo multiplicador de electrones acoplado en carga (EMCCD - Electron Multiplier Charge Coupled Device, en inglés), la cámara de semiconductor de óxido metálico complementario científico (sCMOS - Scientific Complementary Metal-Oxide-Semiconductor, en inglés), el microscopio confocal de disco giratorio de Nipkow y el microscopio confocal de escaneo de línea. Si bien cada uno de estos dispositivos presenta distintas ventajas y compromisos entre sensibilidad, velocidad, resolución y confocalidad, un dispositivo para la obtención de imágenes de la dinámica bioquímica por debajo de por debajo de milisegundos en células vivas e in vivo sigue siendo un desafío técnico excepcional.
La citometría de flujo de obtención de imágenes de alto rendimiento es otra aplicación en la que se requiere la obtención de imágenes de fluorescencia de alta velocidad. La obtención de imágenes de células individuales en un flujo de fluido, en comparación con la medición solamente de la dispersión y de las amplitudes de fluorescencia de un solo punto, proporciona información que se puede utilizar para la detección de células raras de alto rendimiento, así como el análisis de la morfología, la translocación y la señalización celular de un gran número de células en un corto período de tiempo. Los altos caudales asociados con la citometría de flujo exigen una fotodetección de alta sensibilidad y velocidades de obturación rápidas de la cámara para generar imágenes de alta SNR sin desenfoques.
Los citómetros de flujo de obtención de imágenes convencionales utilizan técnicas CCD de integración y retardo de tiempo para evitar este problema, pero la estrategia de lectura en serie de este enfoque limita el dispositivo a un rendimiento de 5.000 células por segundo. A esta velocidad, la detección de alta eficacia de células raras mediante citometría de flujo, tales como las células tumorales circulantes en la sangre, no es práctica para aplicaciones clínicas.
El compromiso entre velocidad y sensibilidad es un factor limitativo significativo en los sistemas de microscopía de fluorescencia de alta velocidad. La capacidad de generar una imagen de alta relación de señal a ruido (SNR - Signal to Noise Ratio, en inglés) a partir de la pequeña cantidad de fotones emitidos por una muestra fluorescente durante un período de tiempo corto (por debajo de milisegundos) tradicionalmente se basa en la capacidad del dispositivo de fotodetección para proporcionar una ganancia electrónica tal que la señal detectada se amplifica por encima de su nivel de ruido térmico. Por esta razón, los tubos fotomultiplicadores de alta ganancia (PMT - PhotoMultiplier Tubes, en inglés) y los EMCCD se utilizan con mayor frecuencia para aplicaciones de obtención de imágenes de fluorescencia de alta velocidad. Si bien los EMCCD de módem presentan una alta eficiencia cuántica y ganancia, el registro de ganancia y la estrategia de lectura de píxeles es en serie, lo que limita su velocidad de fotogramas total a menos de 100 fotogramas por segundo. Los PMT ofrecen mayor ganancia, menor ruido oscuro y mayor velocidad de lectura que los EMCCD, pero habitualmente no se fabrican en formatos de matriz grande, lo que limita su utilidad a las aplicaciones de escaneo de un solo punto. Debido a la utilización de un detector de PMT, la microscopía de fluorescencia de escaneo por láser tiene una alta sensibilidad a velocidades de fotogramas similares a las de los EMCCD, pero la naturaleza en serie del escaneo del haz limita en última instancia la velocidad de obtención de imágenes.
Hasta la fecha, estas deficiencias tecnológicas han impedido el análisis de la obtención de imágenes de fluorescencia de fotograma completo de fenómenos de por debajo de milisegundos en biología. Existe la necesidad de un dispositivo de obtención de imágenes que pueda resolver la sutil dinámica de los fenómenos bioquímicos tales como las ondas de calcio y metabólicas en las células vivas, las secuencias del potencial de acción en grandes grupos de neuronas o los miocitos cardíacos del calcio. liberar correlaciones y señalización en
El documento US 2003226977 A da a conocer un método para microscopía de escaneo en el que se codifica un haz de luz de iluminación que contiene como mínimo una primera luz de una primera longitud de onda y una segunda luz de una segunda longitud de onda. El rayo de luz de iluminación codificado es dirigido a una muestra, y la luz de detección procedente de la muestra es decodificada.
En consecuencia, existe la necesidad de un aparato y método para la detección de fluorescencia y la obtención de imágenes que sea rápido, con una resolución temporal inferior a un milisegundo, para capturar procesos dinámicos en las células, así como la obtención de imágenes de flujo que puedan realizar rápidamente análisis de morfología, translocación y señalización celular de alto rendimiento en grandes poblaciones de células. La presente invención cumple estas necesidades, así como otras, y es una mejora en la técnica.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un nuevo enfoque para la estimulación, detección y obtención de imágenes por fluorescencia utilizando microscopía de escaneo por láser de excitación multiplexada por radiofrecuencia (FIRE). El sistema FIRE emplea técnicas de multiplexación en el dominio ortogonal de la frecuencia para proporcionar tanto excitación de píxeles paralelos como tasas de lectura de píxeles nominales de aproximadamente 80 MHz. No obstante, son posibles frecuencias de píxeles en el intervalo comprendido entre 0,1 y 1.000 MHz.
Los deflectores acústico-ópticos se utilizan para codificar en frecuencia la excitación simultánea de una fila completa de píxeles, lo que permite la detección y demultiplexación de imágenes de fluorescencia utilizando un solo tubo fotomultiplicador y técnicas de recuperación de señal digital coherente en fase.
Específicamente, la microscopía FIRE utiliza la asignación de radiofrecuencia a espacio para codificar la excitación de una muestra fluorescente en el dominio de la frecuencia, de modo que la imagen pueda ser detectada utilizando un solo PMT, y demodular utilizando la detección de bloqueo digital.
En una realización, el sistema FIRE está adaptado para proporcionar un enfoque escalable para la obtención de imágenes de alta velocidad, en el sentido de que aprovecha los anchos de banda de MHz disponibles para la electrónica de radiofrecuencia (RF) y los dispositivos acústicos-ópticos para permitir una lectura de reloj de píxeles equivalente a MHz de cientos de píxeles simultáneamente en un solo flujo de datos. Además, la microscopía FIRE utiliza síntesis digital directa (DDS - Direct Digital Synthesis, en inglés) para diseñar la amplitud y la fase de cada frecuencia de excitación de píxel individual, lo que permite la aplicación de un amplificador de bloqueo digital coherente en fase y algoritmos de multiplexación por división ortogonal de la frecuencia (OFDM - Orthogonal Frequency Division Multiplexing, en inglés) al proceso de demultiplexación de imagen para reducir el ruido de la imagen y la diafonía de píxeles. La flexibilidad del sistema que ofrece la utilización de síntesis digital directa permite un ajuste completo del número de píxeles, la velocidad de lectura y el campo de visión.
El aparato está configurado para producir haces de luz desplazados en frecuencia que pueden ser utilizados para interrogar múltiples puntos en una muestra simultáneamente, de tal manera que cada punto individual de la muestra esté en una radiofrecuencia distinta. Para lograr esto, en primer lugar, se divide un rayo láser de excitación en dos brazos de un interferómetro Mach-Zehnder. La luz en el primer brazo es desplazada en frecuencia mediante un deflector acústico-óptico, que es impulsado por un peine de radiofrecuencia de ingeniería de fase que está diseñado para minimizar la relación de potencia máxima a promedio de la señal. Este peine de RF genera múltiples haces ópticos desviados que poseen un rango tanto de ángulos de salida como de cambios de frecuencia. El segundo brazo del interferómetro es desplazado en frecuencia utilizando un variador de frecuencia acústico-óptico para producir un haz de oscilador local (LO - Local Oscillator, en inglés). Se puede utilizar una lente cilíndrica para hacer coincidir la divergencia angular del brazo LO con la de los haces de peine de RF. Después de ser combinados en un segundo divisor de haz, los dos haces son enfocados a una línea en la muestra utilizando un sistema convencional de lentes de microscopio de escaneo por láser. El escaneo de línea de alta velocidad de la muestra se logra utilizando un espejo de escaneo resonante en la dirección transversal.
Las moléculas fluorescentes de la muestra funcionan como detectores de ley cuadrática, ya que su excitación responde al cuadrado del campo eléctrico total. La fluorescencia resultante se emite en los diversos impulsos definidos por la diferencia de frecuencias de los dos brazos del interferómetro. La emisión de fluorescencia oscila de este modo a la frecuencia de excitación con una modulación apreciable, dada una frecuencia de excitación que no es mucho mayor de 1/t, donde t es el tiempo de vida de la fluorescencia de la muestra. Para los fluoróforos con una vida útil en el rango de un solo nanosegundo, el ancho de banda de RF utilizable de FIRE es de aproximadamente 1 GHz. Puesto que los dispositivos acústico-ópticos son inherentemente resonantes, el variador de frecuencia en el segundo brazo
del interferómetro se elige para heterodinar las frecuencias de impulsos a la banda base a fin de maximizar el ancho de banda utilizable para un fluoróforo dado.
La emisión de fluorescencia de la muestra se recoge preferiblemente mediante la lente del objetivo y se detecta mediante un PMT en una configuración confocal sin escaneado, utilizando una abertura de hendidura para rechazar la emisión de fluorescencia de otros planos de muestra.
Como demostración de la técnica, se realizó la obtención de imágenes de fluorescencia confocal limitada por difracción de células estacionarias a una frecuencia de fotograma de 4,4 kHz y microscopía de fluorescencia en flujo a una velocidad de 1 m s-1, correspondiente a un rendimiento de aproximadamente 50.000 células por segundo.
En combinación con indicadores fluorescentes rápidos y tintes sensibles a la tensión, esta modalidad de obtención de imágenes de alta velocidad tiene el potencial de observar dinámicas por debajo de milisegundos previamente no resueltas en biología, lo que puede conducir a una comprensión más completa de la función neural, de enfermedades autoinmunes, de arritmias cardíacas, y de otros fenómenos biológicos en escala de tiempo de milisegundos.
La multiplexación de frecuencia de impulsos también es aplicable a otros tipos de microscopía de escaneo por láser, incluida la microscopía de fluorescencia excitada por dos fotones. Quizás lo más notable es que, debido a que la emisión de cada píxel está etiquetada con una radiofrecuencia distinta, FIRE es inherentemente inmune a la diafonía de píxeles que surge de la dispersión de la emisión de la fluorescencia en la muestra, limitando habitualmente el efecto la profundidad de la imagen en microscopía multifocal multifotónica. En combinación con fluoróforos rápidos, la microscopía FIRE es capaz de observar fenómenos de escala de tiempo de nano a microsegundos utilizando microscopía de fluorescencia.
Otros aspectos de la invención se resaltarán en las siguientes partes de la memoria descriptiva, en las que la descripción detallada tiene el propósito de revelar completamente las realizaciones preferidas de la invención sin poner limitaciones a las mismas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTES VISTAS DE LOS DIBUJOS
La invención se comprenderá de manera más completa con referencia a los siguientes dibujos, que son solo para fines ilustrativos:
La figura 1 es un diagrama esquemático de una realización de un aparato para la obtención de imágenes por fluorescencia, de acuerdo con la invención.
La figura 2A es un diagrama esquemático de un elemento deflector acústico-óptico de la figura 1 que produce un solo haz difractado de primer orden para cada frecuencia del peine de radiofrecuencia.
La figura 2B es un diagrama esquemático de un divisor de haz que muestra la generación de frecuencia de impulsos a partir de haces con desplazamiento de frecuencia mixta.
La figura 3 es un diagrama de flujo de un método para inducir y detectar fluorescencia a partir de una muestra con haces de frecuencia desplazada, de acuerdo con la invención.
La figura 4 es un diagrama de flujo de un método para microscopía de fluorescencia, de acuerdo con la invención.
La figura 5 es un diagrama de flujo de un algoritmo de reconstrucción de imágenes, de acuerdo con la invención. La figura 6 es un diagrama de flujo de un segundo algoritmo de reconstrucción de imágenes, de acuerdo con la invención.
La figura 7 es un diagrama de flujo de un tercer algoritmo de reconstrucción de imágenes, de acuerdo con la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Haciendo referencia más específicamente a los dibujos, con fines ilustrativos, varias realizaciones del esquema del sistema de la presente invención y los métodos asociados para la excitación y detección de fluorescencia se representan de manera general en la figura 1 a la figura 7. Se apreciará que los métodos pueden variar en cuanto a las etapas y secuencia específicos y la arquitectura del aparato puede variar en cuanto a detalles estructurales, sin apartarse de los conceptos básicos que se dan a conocer en el presente documento. Las etapas del método son meramente a modo de ejemplo del orden en que pueden ocurrir estas etapas. Las etapas pueden ocurrir en cualquier orden que se desee, de tal manera que aún se cumplan los objetivos de la invención reivindicada.
Pasando ahora a la figura 1, figura 2A y figura 2B, se muestra esquemáticamente una realización de un aparato 10 para la obtención de imágenes de fluorescencia utilizando excitación multiplexada por radiofrecuencia para ilustrar la invención. La excitación de puntos individuales en la muestra a una radiofrecuencia distinta es una característica importante del aparato y procedimiento FIRE. En la realización mostrada en la figura 1, la multiplexación de excitación de frecuencia de impulsos se realiza mediante la utilización de dispositivos acústico-ópticos en una configuración de interferómetro Mach-Zehnder (MZI - Mach-Zehnder Interferometer, en inglés).
Un láser 12 de excitación produce un haz que es dividido mediante un divisor de haz 14 no polarizador y el primer haz 16 resultante es dirigido hacia un deflector acústico-óptico (AOD - Acousto-Optical Deflector, en inglés) 22 y el segundo haz 18 del divisor 14 es dirigido a un variador de frecuencia acústico-óptico (AOFS - Acousto-Optic Frequency Shifter, en inglés) 28.
Tal como se muestra en la figura 1, el haz de luz 16 de excitación en un brazo del MZI puede ser desplazado en frecuencia mediante un AOD 22 de 100 MHz de ancho de banda, por ejemplo, impulsado por un peine de radiofrecuencias producidas por el generador de peine de RF 20 de DDS. El peine de radiofrecuencia del generador de peine de RF 20 de DDS es diseñado, preferiblemente, por fase, para minimizar su relación de potencia máxima con respecto a promedio. Tal como se ve en la figura 2A, el AOD 22 produce múltiples haces 24 ópticos desviados con una gama de ángulos de salida y cambios de frecuencia. El AOD 22 produce un solo haz difractado de primer orden para cada frecuencia del peine de radiofrecuencia.
El haz de luz 18 en el segundo brazo del interferómetro pasa a través de un variador de frecuencia acústico-óptico 28, preferiblemente impulsado por un solo tono de radiofrecuencia producido por un generador de tono 26 de RF de DDS, que proporciona un haz 30 del oscilador local (LO). Una lente cilindrica (no mostrada) puede ser colocada después del AOFS 28 para hacer coincidir la divergencia del haz 30 del oscilador local (LO) con la de los haces de radiofrecuencia.
En la salida del MZI, los dos haces 24, 30 son combinados mediante un segundo divisor de haz 32. La figura 2B también muestra la generación de frecuencia de impulsos en la salida del MZI y del divisor de haz 32. El haz 34 combinado es enfocado finalmente hacia una linea horizontal en la muestra, asignando el cambio de frecuencia al espacio utilizando un sistema de lentes de microscopio convencional de escaneo por láser.
En el aparato de la figura 1, el haz 34 combinado es reflejado desde el espejo dicroico 36 a un galvanómetro 38 de espejo de escaneo resonante hacia la muestra a través de la lente de escaneo 40, la lente del tubo 42 y la lente del objetivo 44. Las células de muestra 46 están en un canal 48 y son llevadas a través del haz 34 combinado en esta ilustración.
Las emisiones de fluorescencia 50 de la muestra 46 expuesta se detectan mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) 58 en una configuración confocal, utilizando una abertura de hendidura 56 para rechazar la emisión de fluorescencia fuera del plano. Un espejo de escaneo resonante 38 realiza un escaneo de alta velocidad en la dirección transversal para la obtención de imágenes bidimensionales. Los puntos en la dirección horizontal se excitan en paralelo en distintas frecuencias de radio. El escaneo de esta excitación de escaneo de linea en la dirección vertical utilizando un galvanómetro genera una imagen bidimensional.
En la realización de la figura 1, el haz de emisión 50 de la lente del objetivo 44, la lente de tubo 42, la lente de escaneo 40 y el espejo de escaneo resonante 38 es dirigido a través del espejo dicroico 36 y los filtros de emisión de fluorescencia 52, 54 y la abertura 56 de la hendidura hacia como minimo un tubo fotomultiplicador 58. El tubo fotomultiplicador 58 está acoplado a un dispositivo de cálculo y registro 60, tal como un osciloscopio de registro digital.
En una realización, el dispositivo de cálculo 60 está configurado para controlar los otros componentes tales como el espejo de escaneo de resonancia 38, el láser 12, el peine de RF 20 y los generadores de tono de RF26 y la óptica, asi como para procesar las señales del PMT. El dispositivo de cálculo también puede tener una pantalla.
Por consiguiente, se da a conocer un método para la excitación y detección de fluorescencia utilizando luz de frecuencia desplazada que se puede utilizar para interrogar simultáneamente a múltiples puntos en una muestra. Un método 70 para la excitación y la detección de fluorescencia se muestra esquemáticamente en la figura 3. En el bloque 72 de la figura 3, se crean haces de luz con frecuencia desplazada. Los haces de luz con desplazamiento de frecuencia se pueden crear mediante diferentes métodos. Se puede producir un solo haz difractado de primer orden para cada frecuencia del peine de radiofrecuencia mediante un deflector acústico-óptico tal como se muestra en la figura 2A.
Debido a que las moléculas fluorescentes en la muestra 46 funcionan como detectores de ley cuadrada del campo óptico total, la fluorescencia es excitada en los diversos impulsos definidos por la diferencia de frecuencias de los dos brazos del interferómetro. Dada la respuesta de frecuencia finita de los fluoróforos, el cambio de frecuencia del haz del LO se elige para heterodinar el espectro de excitación de frecuencia de impulsos a la banda base para maximizar el ancho de banda de modulación utilizable. Esto es necesario porque los AOD habitualmente funcionan sobre una banda de paso de sub-octava con cambio ascendente para evitar interferencias armónicas.
La sintesis digital directa (DDS) del peine de radiofrecuencia 20 utilizado para impulsar el AOD 22 define la excitación de cada pixel mediante una radiofrecuencia y fase especificas, lo que da como resultado una coherencia de fase entre el peine de radiofrecuencia y la señal detectada. Esta coherencia de fase permite la demultiplexación de imágenes utilizando una matriz paralela de amplificadores de bloqueo digitales sensibles a la fase, implementados en el ordenador 60. La lectura paralela de FIRE da como resultado una tasa de pixeles máxima igual al ancho de banda del AOD.
Puesto que la excitación de cada píxel se define mediante una radiofrecuencia y una fase específicas utilizando el sintetizador digital directo (DDS), la fluorescencia detectada es desplazada en fase y es escalada con respecto a la señal de activación. Esta emisión de fase coherente permite la recuperación de la señal del amplificador de bloqueo digital, una técnica de detección ultrasensible bien conocida.
En el bloque 74 de la figura 3, se interroga a una muestra con los haces desplazados en frecuencia con cada punto en una frecuencia de radio distinta para excitar la fluorescencia en la muestra. La respuesta de la muestra a la exposición a los haces desplazados en frecuencia se detecta en el bloque 76 de la figura 3.
Una característica importante del aparato y los métodos FIRE es su capacidad para excitar la fluorescencia en cada punto individual de la muestra en una radiofrecuencia distinta. El “etiquetado” de radiofrecuencia sintetizado digitalmente de la emisión de fluorescencia de cada píxel se produce en la frecuencia de pulsación entre dos rayos láser desplazados en frecuencia que interfieren. Con la multiplexación en el dominio de la frecuencia, a cada píxel de una fila de una imagen FIRE se le asigna su propia radiofrecuencia. En una imagen FIRE bidimensional, los píxeles son análogos a los puntos en una red de Gabor de tiempo y frecuencia. Un fotodetector de un solo elemento detecta simultáneamente la fluorescencia de varios píxeles y se reconstruye una imagen a partir de los componentes de frecuencia de la salida del detector, que se resuelven mediante la amplificación de bloqueo en paralelo en el dominio digital. La respuesta de la muestra a la exposición a los haces desplazados en frecuencia se detecta en el bloque 76 de la figura 3. El análisis de la señal detectada puede ser simplemente una medición multipunto de la muestra o puede incluir la creación de una imagen del sujeto.
Una adaptación del método para microscopía de fluorescencia 80 se muestra esquemáticamente en la figura 4. En el bloque 82, se realiza un desplazamiento de frecuencia de un primer haz de luz con un deflector acústico-óptico accionado por un peine de radiofrecuencias, preferiblemente diseñado por ingeniería de fase para minimizar su relación de potencia máxima con respecto a promedio. El deflector acústico-óptico (AOD) produce múltiples haces ópticos desviados con un rango de ángulos de salida y desplazamientos de frecuencia.
La luz de un segundo haz pasa a través de un variador de frecuencia acústico-óptico, impulsado por un solo tono de radiofrecuencia, que proporciona un haz de oscilador local (LO) en el bloque 84 de la figura 4. Se puede utilizar una lente cilíndrica opcional para hacer coincidir la divergencia angular del haz del LO con la de los haces del peine de radiofrecuencia.
La interrogación de la muestra con los haces en el bloque 86 utiliza preferiblemente un enfoque de multiplexación de píxeles que utiliza modulación de frecuencia de impulsos. En una realización, los haces de frecuencia desplazada se dirigen a una muestra utilizando un sistema de lentes de microscopio convencional de escaneo de línea. El escaneo de línea de alta velocidad de la muestra se puede lograr utilizando un espejo de escaneo resonante en la dirección transversal.
Puesto que la excitación de las moléculas fluorescentes en la muestra responde al cuadrado del campo eléctrico total, la fluorescencia resultante se emite en los diversos impulsos definidos por la diferencia de frecuencias del primer y segundo haz de interrogación:
E t - E RF E L0
La interferencia de dos ondas de frecuencia desplazada da como resultado una modulación en amplitud de la intensidad resultante en la frecuencia de impulsos:
C _ ü p j(®o~*~®RF
ü r f - £ 0 e
La emisión de fluorescencia oscila de este modo a la frecuencia de excitación con una modulación apreciable, dada una frecuencia de excitación no mucho mayor de 1/t , donde t es el tiempo de vida de la fluorescencia de la muestra.
La frecuencia máxima de modulación y, por lo tanto, la velocidad máxima de lectura de píxeles, está intrínsecamente limitada por la vida útil de la fluorescencia de la muestra. Si la frecuencia de excitación es menor de 1/t , donde t es el
tiempo de vida de la fluorescencia de la muestra, la fluorescencia emitida oscilará a la frecuencia de excitación con una modulación apreciable.
Además, la modulación de la frecuencia de impulsos es fundamental para la velocidad de FIRE; el impulso de dos ondas ópticas coherentes con desplazamiento de frecuencia produce un solo tono de radiofrecuencia, sin armónicos que puedan introducir diafonía de píxeles y reducir el ancho de banda utilizable. Debido a que el sistema FIRE está diseñado para que cada píxel sea resuelto espacialmente en el límite de difracción, la pulsación de la luz de excitación de dos píxeles adyacentes genera una señal de fluorescencia en la frecuencia de separación del peine.
No obstante, esta frecuencia se encuentra fuera de la banda de imagen y no produce diafonía de píxeles. Con respecto a la obtención de imágenes sin desenfoque de fenómenos rápidos en muestras tales como células vivas, la velocidad del evento dinámico más rápido que se puede obtener en la imagen está determinada por la frecuencia de banda lateral máxima permitida (la mitad de la separación del peine).
También se puede diseñar la resolución espacial, el número de píxeles y el campo de visión. La microscopía FIRE es una técnica de difracción limitada. Al igual que otras técnicas de microscopía de escaneo por láser, la resolución espacial transversal mínima es el tamaño del punto limitado por difracción determinado por la apertura numérica del objetivo y la longitud de onda de excitación del láser.
La velocidad de píxeles preferida del sistema es igual al producto de la velocidad de línea nominal y el número de píxeles por línea. Con la velocidad de línea nominal limitada a la separación del peine, la velocidad máxima de píxeles de FIRE es igual al ancho de banda del AOD (Baod), dado Baod = px x rlínea, donde px es el número de píxeles en una línea, y rlínea es la velocidad de línea. El eje x se eligió como la dirección de deflexión del AOD.
El número de puntos que pueden ser resueltos por línea es igual al producto de ancho de banda de tiempo del AOD (TBPaod). Para cumplir el criterio de muestreo espacial de Nyquist, el número de píxeles por línea debe ser como mínimo el doble de este valor, Px = 2 x TBPaod.
El campo de visión en la dirección x (FOVx) es el número de puntos que se pueden resolver multiplicado por el tamaño del punto limitado por difracción, d: FOVx dado= d x TBPaod = d x px/2.
También se debería cumplir el sobremuestreo de Nyquist en la dirección y. En el caso de obtención de imágenes 2-D con un espejo de escaneo, la velocidad de fotogramas, el campo de visión y el número de píxeles en la dirección y deben cumplir las relaciones py x rfotograma = rlínea y FOVy = d x py/ 2, donde rfotograma es la velocidad de fotogramas en 2-D. El rango del espejo de escaneo se debe elegir para que coincida con el campo de FOVy citado anteriormente.
Estos criterios para el sobremuestreo en la dirección y no son exclusivos para FIRE y se pueden cumplir con cualquier sistema de obtención de imágenes. No obstante, cumplir el criterio de Nyquist en la dirección y es especialmente preferido para FIRE. El submuestreo en la dirección y puede dar lugar a una velocidad de cambio de fluorescencia superior a la mitad de la velocidad de línea, incluso para muestras estáticas. En el dominio de la frecuencia, las bandas laterales generadas se extenderán más allá de la mitad de la separación del peine de frecuencias, lo que dará como resultado una diafonía entre píxeles y un efecto de desenfoque en la dirección x.
Con el sobremuestreo de cada punto de difracción limitado de una muestra, este efecto de desenfoque se puede evitar. Para muestras dinámicas, como células en vivo, la velocidad de fotogramas y la separación de frecuencia de píxeles también se deben elegir adecuadamente para evitar el desenfoque de la banda lateral, dependiendo de la dinámica de la muestra. La separación de píxeles en el espacio de frecuencia debe ser como mínimo dos veces mayor que la velocidad máxima de cambio de la señal de fluorescencia. La ampliación del sistema óptico debe ser ajustada de tal manera que los píxeles individuales se resuelvan espacialmente en la muestra.
En el sistema FIRE descrito anteriormente, la velocidad de obturación de escaneo de línea más rápida es de 1,25 ms (separación del peine de 800 kHz), lo que permite la captura de la dinámica de píxeles con contenido de frecuencia de hasta 400 kHz.
La fluorescencia de la muestra interrogada se detecta a lo largo del tiempo en el bloque 88 y se puede generar una imagen en el bloque 90 de la figura 4. La detección se realiza, preferiblemente mediante como mínimo un tubo fotomultiplicador (PMT). No obstante, se pueden adaptar otros esquemas de detección.
La obtención de imágenes de fluorescencia genera imágenes de campo oscuro de muestras estimando el número de fotones emitidos por cada píxel excitado de una muestra. En la obtención de imágenes por fluorescencia convencional, el número de fotones se estima mediante la integración de la señal óptica. En FIRE, la luz emitida por cada píxel es modulada a una radiofrecuencia particular, y la intensidad de la señal que proviene de cada píxel se diferencia mediante la realización de una transformada de Fourier de corta duración o la demodulación de la señal de cada píxel mediante amplificación de bloqueo digital paralela., por ejemplo. Como resultado, FIRE lee varios píxeles en paralelo,
lo que aumenta la velocidad de la formación de imágenes y aumenta el tiempo de integración para una velocidad de fotogramas determinada.
La flexibilidad que ofrece la síntesis digital de la amplitud y la fase del espectro de radiofrecuencia proporciona un control completo en tiempo real sobre el número de píxeles, la separación en frecuencia de los píxeles, la falta de uniformidad de los píxeles y el campo de visión. Debido a que los PMT tienen inherentemente un rango dinámico más pequeño que las tecnologías CCD o CMOS, maximizar esta cantidad por píxel es importante para el desempeño del procedimiento FIRE. Específicamente, la ingeniería de fases del peine de frecuencias de excitación permite escalar el rango dinámico de cada píxel como D/VM, donde D es el rango dinámico de la PMT y M es el factor de multiplexación de píxeles. Esto contrasta con el caso en el que las fases iniciales de todas las frecuencias de excitación están bloqueadas, lo que produce imágenes con un rango dinámico de D/M.
Aunque FIRE presenta fundamentalmente un compromiso en el rango dinámico por la velocidad, mejora la sensibilidad en comparación con la microscopía de fluorescencia del escaneo de un solo punto, ya que multiplexar la excitación de la muestra por un factor de M produce un aumento de M veces del tiempo de permanencia de cada píxel. No obstante, debido a la naturaleza paralela de la detección, FIRE comparte el ruido de disparo en todos los píxeles seguidos. Esto hace que la incertidumbre limitada por ruido de disparo en cada píxel se escale con la raíz cuadrada del número total de fotones recogidos de todos los píxeles en un escaneo de línea. La medida en que este efecto degrada la SNR en cada píxel depende inversamente de la escasez de la muestra.
Tal como se describió anteriormente, la síntesis digital directa del oscilador local (LO) y los haces de peine de radiofrecuencia (RF) se puede lograr utilizando las dos salidas de un generador de forma de onda arbitraria de 5 GS/s, por ejemplo, que se amplifican para impulsar el acústico-óptico (AOD) y el variador de frecuencia acústico-óptico (AOFS). Después de la fotodetección y la digitalización, se pueden utilizar dos algoritmos de demultiplexación digitales para recuperar la imagen de fluorescencia a partir de los datos multiplexados en frecuencia. El primer método para recuperar la señal fluorescente emplea una transformada de Fourier de corta duración (STFT - Short Time Fourier Transform, en inglés). El segundo método utiliza una serie de amplificadores de bloqueo digitales para heterodinar y demultiplexar cada línea de peine por separado.
El algoritmo de reconstrucción de imágenes 100 del primer método se muestra esquemáticamente en la figura 5. El método de STFT funciona segmentando la secuencia de datos en fotogramas y realizando una transformada de Fourier discreta (DFT - Discrete Fourier Transform, en inglés) sobre cada fotograma para recuperar la señal multiplexada en frecuencia. Cada fotograma corresponde a un escaneo de línea 1D. Con el fin de evitar la diafonía de píxel a píxel debido a que la potencia se propaga a través de los bins de frecuencia, la duración de cada fotograma se establece como un múltiplo entero del inverso de la separación del peine de frecuencias. En este caso, se dice que los canales de frecuencia son ortogonales, y los bins de DFT se encuentran precisamente en las líneas del peine de frecuencias. La velocidad de línea máxima en este escenario es igual a la separación del peine de frecuencias, y corresponde a velocidades de línea de 300 kHz, 400 kHz y 800 kHz.
Por consiguiente, tal como se ve en la figura 5, la entrada de señal 102 es dividida en fotogramas 106 y sometida a una transformada rápida de Fourier 108. Al mismo tiempo, el peine de referencia 104 es sometido a una transformada rápida de Fourier 110 y las frecuencias de la línea de peine se identifican y registran en 112. Los valores de la señal en las frecuencias de la línea de peine se registran en el bloque 114 y, a continuación, se genera 116 una imagen mapeada en color.
En el segundo método de reconstrucción de imágenes, existen dos enfoques de amplificador de bloqueo digital que pueden ser utilizados, y que se ilustran en la figura 6 y la figura 7 respectivamente. En general, en la segunda reconstrucción de imagen, se implementa una técnica de demodulación de amplificador de bloqueo mezclando digitalmente la señal de datos con copias de cada línea de peine de frecuencias. La mezcla de las líneas del peine y de la señal reduce la frecuencia de la línea de peine correspondiente a la banda base. Se puede utilizar un filtro de paso bajo (LPF - Low Pass Filter, en inglés) para extinguir todas las demás líneas del peine, dejando solo la señal fluorescente modulada de la línea de interés del peine. Para evitar el bloqueo en fase de la referencia a la señal, se pueden calcular términos de mezcla tanto en fase (I) como en cuadratura (Q). La magnitud de la suma de los canales I y Q es igual a la amplitud de la señal. El ancho de banda del LPF es menos de la mitad de la separación del peine, para evitar la diafonía de píxeles en la frecuencia y el espacio. Con el ancho de banda analógico reducido después del filtrado, la señal de cada píxel puede ser promediada y submuestreada como mínimo a la tasa de Nyquist, igual a la separación del peine de frecuencias. La velocidad de datos submuestreada corresponde a la velocidad de línea de sistema.
Por consiguiente, la reconstrucción de la imagen 120 en la figura 6, la señal 122 y el peine 124 de referencia se proporcionan como entradas. El peine 124 de referencia es sometido a una transformada rápida de Fourier 126 y las frecuencias de la línea de peine son registradas en 128 y las líneas individuales del peine son filtradas en 130. Las líneas del peine 130 filtradas son sometidas a una transformada rápida de Fourier inversa 132 y la señal 122 es mezclada con cada tono 134 del peine. La señal mixta es filtrada con un filtro 136 de paso bajo para determinar la
resolución temporal que es submuestreada en 138 para determinar la velocidad de línea. A continuación, se forma 140 una imagen mapeada en color a partir de la señal resultante.
En la figura 7 se muestra una realización alternativa de la reconstrucción de la imagen de demodulación del amplificador de bloqueo. En este caso, tiene lugar el mismo procesamiento del peine de referencia y el procesamiento de la señal inicial, tal como se muestra en la figura 6. No obstante, cada peine de la salida de señal / tono de peine mezclado es filtrado en paralelo mediante un filtro 152 digital de paso bajo. La señal filtrada es sobremuestreada y promediada en el bloque 154 y se forma una imagen mapeada en color en el bloque 156.
Aunque tanto la técnica de DFT como la técnica de bloqueo se pueden utilizar para demultiplexar la imagen de fluorescencia, la técnica de bloqueo tiene ciertas ventajas: (a) no hay un requisito de ortogonalidad, lo que deja más flexibilidad en la configuración de la línea de peine, (b) la velocidad de línea nominal está determinada por el factor de submuestreo, lo que permite velocidades de línea superiores a la velocidad de Nyquist mínima, y (c) la referencia y la señal pueden ser bloqueadas en fase, ya sea mediante una estimación a priori de la fase de la señal o mediante deducción de la relación de los canales I y Q. La operación de bloqueo de fase rechaza el ruido fuera de fase, lo que resulta en una mejora de 3 dB en la relación de señal / ruido (SNR).
La invención se puede entender mejor con referencia a los ejemplos adjuntos, que están destinados únicamente a fines ilustrativos y no deben ser interpretados en ningún sentido como limitativos del alcance de la presente invención tal como está definida en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1
Para demostrar los principios operativos de la microscopía FIRE, se obtuvieron imágenes de una muestra de perlas de poliestireno fluorescente inmovilizadas de 15 pm de diámetro utilizando 256 frecuencias de excitación separadas por 300 kHz (ancho de banda total de 76,8 MHz). Las imágenes fueron recogidas a una velocidad de fotogramas de 4,2 kHz. La señal de PMT en el dominio del tiempo detectada no ofrece ninguna indicación de la ubicación del cordón lateral. Se utilizó una transformada rápida de Fourier (FFT - Fast Fourier Transform, en inglés) de tres ventanas de la señal para indicar las diferentes componentes de la frecuencia asociadas con las posiciones de cada cuenta.
Esto ilustró la asignación de frecuencia con respecto a espacio de la excitación y la emisión de la muestra. La ubicación vertical de las perlas en la imagen fue recuperada de la salida de referencia del espejo de escaneo resonante. Para evitar la asignación de espacio respecto a tiempo no lineal del espejo de escaneo resonante en la dirección vertical, se coloca una abertura en el plano de imagen intermedio para limitar la excitación de la muestra a la porción lineal del campo de escaneo, y se aplica, además, a la imagen, un algoritmo de corrección sinusoidal, para compensar cualquier distorsión residual en la imagen.
La resolución axial del sistema FIRE se midió excitando una perla fluorescente de 500 nm con una excitación de 488 nm, y escaneando la muestra a través del foco a intervalos de 1 pm, utilizando una excitación de 488 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 100x, 1,4-NA en combinación con una lente de tubo de longitud focal de 200 mm y una abertura de hendidura de 100 pm de altura colocada antes del PMT. Un ajuste gaussiano a los datos mostró una FWHM de 5,9 pm. Esta resolución axial podría mejorarse aún más mediante la utilización de una hendidura más pequeña, ya que la hendidura de 100 pm es más grande que el disco de Airy con este aumento.
Para demostrar la capacidad de FIRE bidimensional para registrar fenómenos dinámicos fluorescentes, perlas fluorescentes fluyen a una velocidad de 2,3 mm s-1 dentro de un canal de microfluidos. En la implementación bidimensional de FIRE, las imágenes son obtenidas en un microscopio invertido, en una configuración sin escaneo, utilizando un espejo de escaneo resonante de 2,2 kHz. Para evitar la asignación de espacio con respecto a tiempo no lineal del escáner resonante en la dirección vertical, se colocó una abertura en el plano de imagen intermedio del sistema de imagen, para limitar la excitación de la muestra a la porción aproximadamente lineal del campo de escaneo. Se aplicó, además, a la imagen, un algoritmo de corrección sinusoidal en Matlab, para compensar cualquier distorsión residual en la imagen que surja del patrón de desviación sinusoidal del espejo. Se realizaron ajustes de brillo y contraste, umbrales y filtrado de paso bajo bidimensional en todas las imágenes.
La emisión de fluorescencia se detectó mediante un tubo fotomultiplicador bialcalino (PMT) (R3896, Hamamatsu) después de pasar a través de un espejo dicroico y un filtro de paso de banda. La señal de corriente del PMT se amplificó mediante un amplificador de corriente de ancho de banda de 400 MHz con una ganancia de trans-impedancia de 5 kV/A. Esta señal de tensión se digitalizó utilizando un osciloscopio de resolución de 8 bits y 250 MS s. Para las imágenes escaneadas en 2-D, la salida de referencia del espejo de escaneo resonante se utilizó para la activación, y también se digitalizó y guardó para la reconstrucción de la imagen. Para los experimentos de citometría de flujo, el digitalizador se activó a partir de la propia señal de imagen. Luego, los datos digitalizados se transfirieron a un PC para procesar la señal.
Ejemplo 2
Para demostrar la microscopía FIRE en muestras biológicas, se obtuvieron imágenes de células adherentes teñidas con diversos fluoróforos a una frecuencia de fotogramas de 4,4 kHz. Fibroblastos embrionarios de ratón NIH 3T3,
fibroblastos gliales de rata astrocito C6 y las levaduras Saccharomyces cerevisiae se tiñeron con una tinción de citosol fluorescente (Calceína AM) o tinción de ácido nucleico (Syto16). Las células NIH 3T3 y MCF-7 y los astrocitos C6 se propagaron en un medio Eagle modificado de Dulbecco con suero bovino fetal al 10 % y penicilina estreptomicina al 1 % a 37 °C y 5 % de CO2. Cultivos líquidos de Saccharomyces cerevisiae se cultivaron en caldo de soja tríptico a 240 rpm y 37 °C.
Antes de la tinción, se liberaron células de mamífero cultivadas de matraces de cultivo, se sembraron en portaobjetos de vidrio y se dejaron esparcir durante 24 horas. Las células de mamífero se tiñeron con tinción de ácido nucleico fluorescente verde Sytol 64 |uM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos, 1 |uM de Calceína Rojo-Naranja AM en medio de cultivo durante 45 minutos o Calceína AM 1 |uM en medio de cultivo durante 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS y, a continuación, se fijaron durante 10 minutos con paraformaldehído al 4 % en PBS. Después de la fijación, las células se lavaron dos veces con PBS y se prepararon para la obtención de imágenes microfluídicas estacionarias o de flujo continuo.
Para la obtención de imágenes estacionarias, se colocaron cubreobjetos número 1,5 en portaobjetos y se sellaron. En un esfuerzo por preservar la forma de las células de mamíferos adheridas para experimentos de microfluidos de flujo continuo, se utilizó un raspador de células, para eliminar y extender las células fijadas y teñidas de los portaobjetos de vidrio. Las células se diluyeron en PBS.
S. cerevisiae se tiñeron en suspensión utilizando la misma concentración de Calceína AM durante 45 minutos, se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS y se lavaron dos veces con PBS. Para la obtención de imágenes estacionarias, las células se sembraron en portaobjetos de vidrio y se sellaron con cubreobjetos número 1,5.
Para comparar la microscopía FIRE con las imágenes de fluorescencia de campo amplio, se utilizó la excitación láser a 488 nm para la obtención de imágenes FIRE (8,5 mW por píxel, medido antes del objetivo), y la excitación con lámpara de mercurio se utilizó para las imágenes de campo amplio. Todas las imágenes FIRE que se generaron utilizaron un espacio de frecuencia del peine de radiofrecuencia de 400 kHz y estaban compuestas por 200 x 92 píxeles. Se observó un ligero viñeteado en las imágenes de FIRE debido al desajuste del perfil gaussiano del haz del LO con el haz del peine de radiofrecuencia de superficie plana. Este desajuste y el viñeteado resultante se pueden eliminar utilizando la ecualización previa digital del peine de radiofrecuencia en el generador de síntesis digital directa.
Las imágenes de las células se tomaron tanto con el microscopio FIRE como con un microscopio de fluorescencia de campo amplio convencional basado en una cámara CMOS de 1.280 x 1.024 píxeles. La diferencia de frecuencia de fotograma de casi tres órdenes de magnitud se mitiga con la ganancia del detector de PMT combinado con la demodulación de imagen del amplificador de bloqueo digital. Las comparaciones de fotogramas individuales indicaron que la intensidad por píxel de la excitación FIRE era aproximadamente 10 veces la de la excitación de campo amplio. No obstante, la energía de excitación total incidente sobre la muestra por píxel por cada fotograma en las imágenes FIRE fue 100 veces menor que en las imágenes de campo amplio.
Ejemplo 3
La citometría de flujo es una aplicación que requiere mediciones de fluorescencia de alta velocidad. En comparación con la citometría de flujo de un solo punto, la citometría de flujo de imágenes proporciona información que puede ser particularmente útil para la detección de células raras de alto rendimiento. Las altas velocidades de flujo asociadas con la citometría de flujo exigen velocidades de obturación de imágenes rápidas y fotodetección de alta sensibilidad para generar imágenes de alta SNR y sin desenfoque. Los citómetros de flujo de imágenes convencionales utilizan tecnología de CCD de integración y retardo de tiempo para evitar este problema, pero la estrategia de lectura de píxeles en serie de esta tecnología limita actualmente los dispositivos a un rendimiento de aproximadamente 5.000 células por segundo.
Para demostrar la citometría de flujo de imágenes de alta velocidad utilizando FIRE, se utilizó un escaneo de una sola línea estacionaria de 125 píxeles separados por 800 kHz (velocidad de lectura de píxeles de 100 MHz, velocidad de escaneo de línea de 800 kHz) para obtener imágenes de células de carcinoma de una mama humana MCF-7 teñida con Syto16 que fluyen en un canal de microfluidos a una velocidad de 1 ms-1. Suponiendo un diámetro de célula de 20 mm, esta velocidad corresponde a un rendimiento de 50.000 células por segundo.
Para la citometría de flujo de imágenes, las células de carcinoma de mama MCF-7 se tiñeron con Syto16, antes de la fijación con formaldehído. A continuación, las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato y se hicieron fluir a través de un canal microfluídico lineal de sección transversal rectangular de 110 gm x 60 gm realizado de polidimetilsiloxano, utilizando una bomba de jeringa, a una velocidad volumétrica fija. La velocidad del flujo de fluido se calcula utilizando la ecuación V = Q / A donde Q es el caudal volumétrico y A es el área de la sección transversal del canal. La calibración de escala vertical de las imágenes se realizó después de obtener imágenes de perlas esféricas de 10 gm que fluían con el mismo caudal volumétrico.
A modo de comparación, también se obtuvieron imágenes de células MCF-7 teñidas con Syto16 en un flujo de fluido a la misma velocidad utilizando un EMCCD de transferencia de fotogramas en modo de exposición única (512 x 512 píxeles). Aunque la alta sensibilidad y ganancia del EMCCD juntas producen una imagen de SNR razonable, el tiempo de exposición mínimo de la cámara de 10 ms y su naturaleza de transferencia de fotogramas crean un desenfoque significativo a estas velocidades de flujo. Por el contrario, la velocidad de obturación de escaneo de línea FIRE de 1,25 ms produce imágenes sin desenfoque con SNR comparable. Esta configuración del sistema FIRE presenta velocidades de lectura de píxeles en el rango de 100 MHz, pero esta velocidad puede ser extendida directamente a más de 1 GHz mediante la utilización de deflectores acústico-ópticos de ancho de banda más amplio. La frecuencia de modulación máxima de FIRE y, por lo tanto, la velocidad máxima de lectura de píxeles, está intrínsecamente limitada por la vida útil de la fluorescencia de la muestra.
Se puede ver que el enfoque de excitación multiplexada por radiofrecuencia del método se puede adaptar a muchos dispositivos de diagnóstico diferentes. Por ejemplo, los métodos pueden ser adaptados a la microscopía rápida de fluorescencia de escaneo por láser utilizada en neurología, fisiología, inmunología e investigación. El método se puede adaptar para su utilización en microscopía de fluorescencia excitada por múltiples fotones, así como en microscopía estimulada Raman, CARS, de 2° armónico y de 3er armónico, etc. Otras modalidades de obtención de imágenes tales como la microscopía rápida de obtención de imágenes de fluorescencia de vida útil (FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, en inglés) en el dominio de la frecuencia), citometría de flujo de obtención de imágenes que utiliza la fluorescencia y la citometría de flujo basada en la fluorescencia de un solo punto simultáneo de fluorescencia y canal de flujo múltiple también puede beneficiarse de los métodos.
Aunque la descripción en el presente documento contiene muchos detalles, estos no deben ser interpretados como limitativos del alcance de la invención, sino como que simplemente proporcionan ilustraciones de algunas de las realizaciones actualmente preferidas de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de la presente invención abarca completamente otras realizaciones que pueden resultar obvias para los expertos en la técnica.
Las realizaciones de la presente invención pueden ser descritas con referencia a ilustraciones de diagrama de flujo de métodos y sistemas de acuerdo con realizaciones de la invención y/o algoritmos, fórmulas u otras representaciones computacionales, que también pueden ser implementadas como productos de programas informáticos. En este sentido, cada bloque o etapa de un diagrama de flujo y combinaciones de bloques (y/o etapas) en un diagrama de flujo, algoritmo, fórmula o representación computacional se puede implementar por diversos medios, tales como hardware, firmware y/o software. que incluyen una o más instrucciones de programa informático incorporadas en lógica de código de programa legible por ordenador. Tal como se apreciará, cualquiera de estas instrucciones de programa informático puede ser cargada en un ordenador, incluyendo, sin limitación, un ordenador de propósito general o un ordenador de propósito especial, u otro aparato de procesamiento programable para producir una máquina, de tal manera que las instrucciones del programa informático que se ejecutan en el ordenador o en otros aparatos de procesamiento programables crean medios para implementar las funciones especificadas en el bloque o bloques del diagrama o diagramas de flujo.
En consecuencia, los bloques de los diagramas de flujo, algoritmos, fórmulas o representaciones computacionales soportan combinaciones de medios para realizar las funciones especificadas, combinaciones de etapas para realizar las funciones especificadas e instrucciones de programa informático, tales como las incorporadas en medios lógicos de código de programa legibles por ordenador, para realizar las funciones especificadas. También se comprenderá que cada bloque de las ilustraciones del diagrama de flujo, algoritmos, fórmulas o representaciones computacionales y combinaciones de los mismos descritos en el presente documento, puede ser implementado mediante sistemas informáticos basados en hardware para propósitos especiales, que realizan las funciones o etapas especificados, o combinaciones de hardware de propósito especial y medios lógicos de código de programa legible por ordenador.
Además, estas instrucciones de programa informático, tales como las incorporadas en la lógica de código de programa legible por ordenador, también pueden ser almacenadas en una memoria legible por ordenador que puede dirigir un ordenador u otro aparato de procesamiento programable para que funcione de una manera particular, de tal manera que las instrucciones almacenadas en la memoria legible por ordenador, producen un artículo de fabricación que incluye medios de instrucciones que implementan la función especificada en el bloque o bloques del diagrama de flujo. Las instrucciones del programa informático también pueden ser cargadas en un ordenador o en otro aparato de procesamiento programable para hacer que se realicen una serie de etapas operativas en el ordenador o en otro aparato de procesamiento programable para producir un proceso implementado por ordenador de tal manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador o en otro aparato de procesamiento programable proporcionan etapas para implementar las funciones especificadas en el bloque o bloques del diagrama o diagramas de flujo, algoritmo o algoritmos , fórmula o fórmulas o descripción o descripciones computacionales.
Claims (14)
1. Un método de obtención de imágenes por fluorescencia, comprendiendo el método:
con un deflector acústico-óptico (22) accionado por un peine de RF (20) y un rayo láser de excitación (16), crear (82) una pluralidad de primeros haces (24) de luz con un rango de ángulos de salida y cambios de frecuencia; con un variador de frecuencia acústico-óptico (28) accionado por un tono de RF y un rayo láser (18) de excitación, crear (84) un segundo haz (30) de luz desplazado en frecuencia;
combinar la pluralidad de los primeros haces (24) y el segundo haz (30) para producir una pluralidad de haces de luz (34) combinados desplazados en frecuencia;
interrogar (86) simultáneamente a múltiples puntos en una muestra (46) con la pluralidad de haces de luz (34) combinados; y
detectar (88) una respuesta fluorescente de la muestra por exposición a la pluralidad de haces de luz combinados.
2. El método de la reivindicación 1, en el que una diferencia de frecuencia entre un primer haz (24) desplazado en frecuencia y el segundo haz (30) desplazado en frecuencia no es mayor que la inversa de la vida útil de fluorescencia de la especie de la muestra que se va a detectar.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, además:
asignar una radiofrecuencia distinta a cada píxel excitado en una fila de píxeles.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, además:
generar una imagen de la muestra a partir de la respuesta de fluorescencia detectada.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha generación de imágenes comprende:
aplicar (110) una transformada rápida de Fourier a un peine de referencia para identificar (112) frecuencias de la línea de peine;
dividir (106) una señal recibida (102) en fotogramas;
aplicar (108) una transformada rápida de Fourier a la señal dividida;
registrar (114) valores de la señal transformada a frecuencias de la línea de peine; y
formar (116) una imagen a partir de los valores registrados.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha generación de imágenes comprende:
obtener una señal (122) del detector;
calcular (126, 128, 130) tonos de peine;
mezclar (134) la señal con cada tono de peine para producir una señal mixta;
pasar (136) la señal a través de un filtro de paso bajo para determinar la resolución temporal; submuestrear (138) la señal filtrada; y
formar (140) una imagen.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha generación de imágenes comprende:
obtener una señal del detector;
calcular tonos de peine;
mezclar la señal con cada tono de peine para producir una señal mixta;
pasar cada tono de peine de la señal a través de un filtro de paso bajo digital, en paralelo; sobremuestrear las señales filtradas; y
formar una imagen.
8. Aparato para el interrogatorio óptico de una muestra, que comprende:
un primer generador de haz (12, 20, 22), que comprende:
una primera fuente de luz (12) de láser;
un deflector acústico-óptico (22); y
un generador de peine de radiofrecuencia (20);
estando dispuesto el primer generador de haz (12), con dicho deflector acústico-óptico (22), accionado por dicho peine de RF (20) y un rayo láser de excitación (16) desde dicha primera fuente de luz (12) de láser,
creando una pluralidad de primeros haces (24) de luz con un rango de ángulos de salida y cambios de frecuencia;
un segundo generador de haz (12, 26, 28), que comprende:
una segunda fuente de luz (12) de láser;
un variador de frecuencia acústico-óptico (28); y
un generador de tonos de radiofrecuencia (26);
estando dispuesto el segundo generador de haz (12), con dicho variador de frecuencia acústico-óptico (28) impulsado por un tono de RF de dicho generador de tono (26) de radiofrecuencia y un haz de láser de excitación (18) de dicha segunda fuente de luz (12) de láser, para crear un segundo haz (30) de luz desplazado en frecuencia;
medios (32) para combinar la pluralidad de primeros haces (24) y el segundo haz (30) para producir una pluralidad de haces de luz (34) combinados desplazados en frecuencia que se pueden utilizar para interrogar simultáneamente a múltiples puntos en una muestra;
un sistema de lentes de objetivo (38, 40, 42, 44), configurado para exponer una muestra a dichos haces de luz (34) combinados a lo largo del tiempo; y
un fotodetector (52, 54, 56, 58);
en donde las emisiones de luz de la muestra (46) de la exposición a dichos haces (34) combinados son detectadas por el fotodetector (58).
9. El aparato de acuerdo con la reivindicación 8, en el que una diferencia de frecuencia entre un primer haz (24) desplazado en frecuencia y el segundo haz (30) desplazado en frecuencia no es mayor que la inversa de la vida útil de fluorescencia de la especie de muestra a detectar.
10. El aparato de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho sistema de lentes de objetivo (38, 40, 42, 44) comprende:
un espejo de escaneo (38);
una lente de escaneo (40);
una lente de tubo (42); y
un objetivo (44).
11. El aparato de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho fotodetector (52, 54, 56, 58) comprende:
un filtro de emisión de fluorescencia (52, 54);
una abertura de hendidura (56); y
un tubo fotomultiplicador (58).
12. El aparato de acuerdo con la reivindicación 10, comprendiendo, además, dicho fotodetector:
un ordenador con programación para generar una imagen de la muestra a partir de las emisiones de fluorescencia detectadas.
13. El aparato de acuerdo con la reivindicación 8, en el que:
dichos medios para combinar la pluralidad de primeros haces (24) y el segundo haz comprenden un divisor de haz (32) no polarizador configurado para combinar un haz (24) del primer generador de haz con un haz (30) del segundo generador de haz para producir un haz (34) combinado que es dirigido a través del sistema de lentes de objetivo (38, 40, 42, 44) hacia una muestra (46).
14. El aparato de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende, además:
un controlador, configurado para controlar el sistema de lentes de objetivo (38, 40, 42, 44) y el fotodectector (52, 54, 56, 58).
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