ES2826883T3

ES2826883T3 - Métodos de maduración por afinidad de anticuerpos

Info

Publication number: ES2826883T3
Application number: ES10824085T
Authority: ES
Inventors: Juan-Carlos Almagro; Johan Fransson; Gopalan Raghunathan
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2009-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2021-05-19
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: US8580714B2; EP2488867A4; JP2013508287A; US20110092372A1; WO2011047146A3; WO2011047146A2; EP2488867A2; EP2488867B1; DK2488867T3

Abstract

Un método de maduración por afinidad de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo o un fragmento del mismo, en donde el fragmento comprende por lo menos una región variable de la cadena pesada y región variable de la cadena ligera, en donde el método comprende los pasos de: a. obtener una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo; b. preparar una biblioteca de variantes de VL del anticuerpo diversificando los residuos Chothia de la VL del anticuerpo 30a, 30c, 30d, 30f, 32, 50, 91, 92, 93, 94, y 96 con un conjunto de aminoácidos, en donde el conjunto de aminoácidos son (i) RNDGHSY en el residuo Chothia kappa V 30a; (ii) RNDGHWY en el residuo Chothia kappa V 30c; (iii) RNDGHSY en el residuo Chothia kappa V 30d; (iv) RNDGHWY en el residuo Chothia kappa V 30f; (v) RNDY en el residuo Chothia kappa V 32; (vi) YWNK en el residuo Chothia kappa V 50; (vii) SYGH en el residuo Chothia kappa V 91; (viii) SYGN en el residuo Chothia kappa V 92; (ix) STER en el residuo Chothia kappa V 93; (x) YSHT en el residuo Chothia kappa V 94; y (xi) YRWL en el residuo Chothia kappa V 96; c. expresar la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo en un huésped o traducir la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo in vitro; y d. seleccionar de la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo uno o más anticuerpos madurados por afinidad que tienen una afinidad mejorada para un antígeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de maduración por afinidad de anticuerpos

Campo de la divulgación

La divulgación se refiere a métodos de maduración por afinidad de anticuerpos.

Antecedentes de la invención

La generación de anticuerpos para usos terapéuticos suele implicar una fase de descubrimiento de líderes seguida de un proceso de optimización (Almagro y Strohl, Antibody Engineering: Humanization, Affinity Maturation and Selection Methods. 307-327. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. Ed. Zhiqiang An. John Wiley & Sons, Inc. 2009). Las plataformas actualmente disponibles para el descubrimiento de líderes incluyen tecnología de hibridomas (Kohler et al., Nature, 256:495-7, 1975), tecnologías basadas en pantallas in vitro (Hoogenboom, Nat Biotechnol, 23:1105-16, 2005) y ratones transgénicos que expresan inmunoglobulinas humanas (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994). En una campaña de desarrollo de líderes de anticuerpos típica, típicamente se requiere la optimización del descubrimiento inicial para mejorar la afinidad, solubilidad y estabilidad.

Se ha informado de una serie de estrategias para aumentar la afinidad de los anticuerpos, incluyendo los métodos aleatorios (Groves et al., J Immunol Methods, 313:129-39, 2006) y los de mutagénesis dirigida al sitio (SDM) (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91:3809-13, 1994), combinados con, por ejemplo, tecnologías basadas en la presentación in vitro, como la presentación en fagos o ribosomas, para generar bibliotecas de variantes para selecciones posteriores (Almagro y Strohl, Antibody Engineering: Humanization, Affinity Maturation and Selection Methods. 307-327. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. Ed. Zhiqiang An. John Wiley & Sons, Inc. 2009). Sin embargo, solo puede diversificarse un número limitado de residuos ya que el tamaño de las bibliotecas aumenta exponencialmente para cada residuo diversificado. Por ejemplo, una biblioteca construida sobre el esquema de diversificación común NNK, que introduce 32 codones en cada posición, crece 32n por cada n número de residuos. Las bibliotecas de fagos normalmente se limitan a un tamaño de 109-1010 miembros, lo que indica que sólo pueden diversificarse 6-7 residuos si se quiere lograr una cobertura de secuencia completa en la biblioteca.

Las estrategias de diversificación para lograr una cobertura de secuencia máxima incluyen la generación de bibliotecas de anticuerpos dirigidas a residuos de anticuerpos accesibles a solventes (US2005/0266000), o dirigidas a residuos en base a comparaciones de secuencia (WO2006/014498). Las estrategias más enfocadas incluyen la diversificación de residuos en HCDR3 (Schier et al., J Mol Biol 263:551-67, 2006) ya que es bien sabido que esta región del sitio de unión al antígeno es a menudo crítica para definir la especificidad y afinidad de anticuerpos. La diversidad de las bibliotecas se ha diseñado en algunos casos para reflejar la composición y frecuencia de los aminoácidos en los anticuerpos naturales (Cobaugh et al., J Mol Biol, 378:622-33, 2008; Knappik et al., J Mol Biol, 296:57-86, 2000; Lee et al., J Mol Biol, 340:1073-93, 2004; Hoet et al., Nature Biotechnol, 23: 344-8, 2005). Además, se ha usado una combinación de unos pocos aminoácidos (Fellouse et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:12467-72, 2004; Sidhu y Fellouse, Nature Chemical Biology, 2: 682-8, 2006), o un código binario restringido a tirosina y serina (Fellouse et al., J Mol Biol, 348:1153-62, 2005).

El desarrollo de anticuerpos terapéuticos con mayor afinidad puede tener un impacto directo sobre la eficacia, así como sobre la dosificación y, por tanto, la inmunogenicidad potencial y los costes de producción. Por tanto, hay una necesidad de métodos mejorados para la maduración por afinidad de anticuerpos.

Cobaugh et al. (J Mol Biol, 378:622-33, 2008), a la que se hace referencia anteriormente, analiza bibliotecas de anticuerpos sintéticos enfocadas hacia ligandos peptídicos.

Almagro (J Mol Recognit, 172:132-43, 2004) analiza la identificación de diferencias en los residuos determinantes de la especificidad de anticuerpos que reconocen antígenos de diferente tamaño y las implicaciones para el diseño racional de repertorios de anticuerpos.

Pascalis et al. (Clinical Cancer Research, 9(15):5521 -5521, 2003) analiza la maduración por afinidad de V10 de mAb anticarcinoma humanizado reemplazando algunos de los SDRs de V10 con todos los residuos posibles localizados en las posiciones correspondientes en los Abs humanos

Sumario de la invención

La invención es un método de maduración por afinidad de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo o un fragmento del mismo, en donde el fragmento comprende por lo menos una región variable de la cadena pesada y región variable de la cadena ligera, en donde el método comprende los pasos de:

a. obtener una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL);

b. preparar una biblioteca de variantes de VL del anticuerpo diversificando los residuos Chothia de la VL del anticuerpo 30a, 30c, 30d, 30f, 32, 50, 91, 92, 93, 94, y 96 con un conjunto de aminoácidos, en donde el conjunto de aminoácidos son

(i) RNDGHSY en el residuo Chothia kappa V 30a;

(ii) RNDGHWY en el residuo Chothia kappa V 30c;

(iii) RNDGHSY en el residuo Chothia kappa V 30d;

(iv) RNDGHWY en el residuo Chothia kappa V 30f;

(v) RNDY en el residuo Chothia kappa V 32;

(vi) YWNK en el residuo Chothia kappa V 50;

(vii) SYGH en el residuo Chothia kappa V 91;

(viii) SYGN en el residuo Chothia kappa V 92;

(ix) STER en el residuo Chothia kappa V 93;

(x) YSHT en el residuo Chothia kappa V 94; y

(xi) YRWL en el residuo Chothia kappa V 96;

c. expresar la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo en un huésped o traducir la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo in vitro; y

d. seleccionar de la biblioteca de variantes de VL del anticuerpo uno o más anticuerpos madurados por afinidad que tienen una afinidad mejorada para un antígeno.

Sumario de la divulgación

En la presente se divulga un método para la maduración por afinidad de un anticuerpo que comprende los pasos de:

a. obtener una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo;

b. identificar rSDRU en la secuencia de aminoácidos de la VL o VH del anticuerpo;

c. seleccionar un subconjunto de residuos de rSDRU a diversificar;

d. seleccionar un conjunto de aminoácidos usados para diversificar el subconjunto de residuos de rSDRU en el paso c. con el conjunto de aminoácidos seleccionados en el paso d;

f. expresar la biblioteca de variantes de VH o VL del anticuerpo en un huésped o traducir la biblioteca de variantes de VH o VL del anticuerpo in vitro; y

g. seleccionar de la biblioteca de variantes de VH o VL del anticuerpo uno o más anticuerpos madurados por afinidad que tienen una afinidad mejorada por un antígeno.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Correspondencia entre la numeración de Rabat y Chothia para la cadena kappa V del anticuerpo. Las posiciones de los residuos de CDR, HVL y rSDRU se indican en negro en las columnas correspondientes. Solo se muestran los residuos de kappa V alrededor de las CDR.

Figura 2. Correspondencia entre la numeración de Rabat y Chothia para la cadena VH del anticuerpo. Las posiciones de los residuos de CDR, HVL y rSDRU se indican en negro en las columnas correspondientes. Solo se muestran los residuos de VH alrededor de las CDR.

Figura 3. Estructuras cristalinas de complejos anticuerpo-antígeno usadas para determinar rSDRU.

Figura 4. Secuencias de polipéptidos de las cadenas kappa V de los anticuerpos usados para determinar rSDRU para los anticuerpos A) anti-proteína, B) anti-péptido y C) anti-hapteno. Los residuos de kappa V en contacto con el antígeno las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo/antígeno están resaltadas en gris. La alineación en L3 sigue las convenciones de IMGT (Lefranc et al., Dev Comp Immunol, 27: 55-77, 2003) en lugar de Chothia y Rabat. Se muestran las secuencias de SDRR.

Figura 5. Secuencias de polipéptidos de las cadenas VH de los anticuerpos usados para determinar rSDRU para los anticuerpos A) anti-proteína, B) anti-péptido y C) anti-hapteno. Los residuos de VH en contacto con el antígeno en las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo/antígeno se resaltan en gris. La numeración y alineación en los giros H1 y H2 se depuraron manualmente para ajustarse a las convenciones de Chothia (Chothia y Lesk, Mol Biol, 196:901 -17, 1987). Se muestran las secuencias de SDRR.

Figura 6. Frecuencia (rSDRU) de los contactos del anticuerpo con el antígeno indicado para A) kappa V y B) VH. Figura 7. SDRM de kappa V para A) anticuerpo anti-proteína, B) anti-péptido y C) anti-hapteno.

Figura 8. SDRM de VH para anticuerpo A) anti-proteína, B) anti-péptido; y C) anti-hapteno.

Figura 9. Distribución del número de veces de unión de anticuerpos maduros por afinidad anti-OSM.

Descripción detallada de la divulgación

Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" es una referencia a uno o más polipéptidos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier composición y método similar o equivalente en la puesta en práctica o prueba de la divulgación, en la presente se describen composiciones y métodos ejemplares.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos comprenden por lo menos una parte de una molécula de inmunoglobulina, como una región determinante de la complementariedad (CDR), una región variable (V), una región constante (C), o una región marco (FR) de la cadena ligera o pesada del anticuerpo. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio C de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA¹, IgA², IgG¹, IgG², IgG3 e IgG4.

Un anticuerpo puede ser un Fab, F(ab'), F(ab')², scFv, dsFv o diacuerpo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal (mAb), un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, dimérico, tetramérico o multimérico. Las estructuras de los fragmentos de anticuerpos mencionados anteriormente y las técnicas para la preparación y uso de los anticuerpos y fragmentos de los mismos son bien conocidas en la técnica (Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1987-2001; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Colligan, et al., ed., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1994 2001; Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, 1997-2001; Kohler et al., Nature, 256:495-7, 1975; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:10029-33, 1989; Patente de Estados Unidos N° 4.816.567).

Una "región variable de la cadena ligera" (VL) de anticuerpo y una "región variable de la cadena pesada" (VH) de anticuerpo como se usan en la presente se refieren a partes bien conocidas de la cadena ligera y la cadena pesada de moléculas de anticuerpo que incluyen secuencias de aminoácidos de sitios de unión al antígeno (por ejemplo, CDR1, CDR2, CDR3) y marcos (FR, es decir, FR1, FR2, FR3, FR4). La región variable de la cadena ligera (VL) puede ser kappa o lambda y está codificada por genes IGVK o IGVL e IGJK o IGJL de anticuerpos, y la región variable de la cadena pesada (VH) está codificada por genes IGVH, IGDH e IGJH de anticuerpos. La organización genómica de los loci de los genes de las cadenas pesada y ligera humanas, las estructuras de los genes de los anticuerpos y los reordenamientos de los genes son bien conocidos.

"Afinidad", como se usa en la presente, se refiere a la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo y un antígeno. La afinidad de un anticuerpo puede representarse, por ejemplo, midiendo la afinidad usando un ELISA de un solo punto o mediante la constante de disociación (Kd). Típicamente, el anticuerpo se disocia del complejo antígeno-anticuerpo con una constante (Kd) de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos o 10-10 M o menos.

"Afinidad mejorada", como se usa en la presente, se refiere a por lo menos una señal ELISA dos veces mayor en un ensayo ELISA de un solo punto o por lo menos una reducción dos veces mayor en Kd de un anticuerpo madurado por afinidad en comparación con su anticuerpo original.

Un "anticuerpo madurado por afinidad" como se usa en la presente es un anticuerpo o un fragmento del mismo con una o más sustituciones de aminoácidos en una región variable, lo que da como resultado una afinidad mejorada del anticuerpo para un antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee esas sustituciones. Un anticuerpo ejemplar madurado por afinidad tiene sustituciones en por lo menos un residuo rSDRU.

"Contacto" o "contactos" o "en contacto", como se usa en la presente, se refiere a un residuo de VL o VH de anticuerpo que tiene un átomo pesado a una distancia entre aproximadamente 2,5 Á y 4,5 Á con cualquier átomo pesado de un antígeno en complejo con el anticuerpo en las coordenadas x, y, z de la estructura cristalográfica del complejo antígeno/anticuerpo de rayos X.

"Uso de residuos determinantes de la especificidad relativa", "rSDRU", como se usa en la presente, se refiere a la frecuencia de contactos en una cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo en una colección de estructuras cristalinas de anticuerpos en complejo con tipos similares de antígenos, por ejemplo, antígenos de proteína, péptido o hapteno. rSDRU se define como:

n

rSDRU(i) = ((£Ni)/n)*100

i = l

donde Ni define un recuento de contactos de residuos con un antígeno en el residuo i de Chothia en la cadena del anticuerpo. Ni=1 cuando el residuo de anticuerpo entra en contacto con el antígeno y 0 si no lo hace. "n" es el número de estructuras cristalinas analizadas de complejos anticuerpo/antígeno. Por ejemplo, rSDRU(50)=36 significa que el 36% de los anticuerpos analizados entran en contacto con su antígeno en el residuo 50 de Chothia de la cadena pesada o ligera (por ejemplo, el valor de rSDRU en el residuo 50 es 36). El rSDRU bajo se refiere a valores de rSDRU entre 5-15, rSDRU medio a valores de rSDRU entre 15-40 y rSDRU alto a valores de rSDRU superiores a 40. Un residuo es un "residuo de rSDRU" como se usa en la presente, cuando el valor de rSDRU calculado en ese residuo es >5 (por ejemplo, rSDRU>5).

"Matriz de residuos determinantes de la especificidad", "SDRM", como se usa en la presente, se refiere a las frecuencias de cada aminoácido j en cualquier residuo i de rSDRU dado, y se define como:

n n 20

S D R M ( i , j ) = ( £ M ± i ) / ( £ E M ± i ) 1 0 0

k = l k = l j = 2 0

Mij define un recuento para un residuo de aminoácidos particular en un residuo de rSDRU i en el anticuerpo. Mij=1 si el residuo de aminoácidos particular (por ejemplo Ala) está en el residuo i de rSDRU, en caso contrario Mij=0. "n" es el número de complejos de estructura cristalina de anticuerpo/antígeno analizados. Por ejemplo, SDRM(50,Ala)=42 significa que Ala contribuye al 42% de los contactos en el residuo 50.

El término "Región de residuos determinantes de la especificidad" o "SDRR", como se usa en la presente, se refiere a cinco regiones distintas de contactos de aminoácidos tanto en kappa V como en VH. Hay tres regiones en kappa V, SDRR-L1, SDRR-L2 y SDRR-L3, y dos regiones en VH, SDRR-H1 y SDRR-H2. La SDRR se superpone parcialmente con las CDR y HVL, y su localización se muestra en la Tabla 2.

El término "polipéptido" o "proteína" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden denominarse "péptidos".

El término "hapteno", como se usa en la presente, significa un compuesto orgánico pequeño unido al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.

El término "antígeno", como se usa en la presente, es una molécula que está unida por un anticuerpo. Los antígenos pueden clasificarse en diferentes tipos, como proteínas, péptidos y haptenos. "Anticuerpos que se unen a tipos similares de antígenos" son un grupo de anticuerpos que se unen a antígenos clasificados en un tipo, por ejemplo, proteína, péptido o hapteno.

"Proteína de fusión", como se usa en la presente, significa una molécula que tiene por lo menos dos péptidos o proteínas o una combinación de los mismos enlazados en un polipéptido continuo. Los por lo menos dos péptidos o proteínas enlazados en una proteína de fusión se derivan típicamente de dos fuentes independientes y, por tanto, un polipéptido de fusión comprende a menudo dos proteínas enlazadas que normalmente no se encuentran enlazadas en la naturaleza. Las secuencias de enlace son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, un enlace amida o un conector rico en glicina. Las proteínas de fusión ejemplares son las fusiones VL y VH con proteínas de la cubierta del bacteriófagos, por ejemplo pIII, pVII o pIX (Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:6025-30, 1999). Las proteínas de fusión se elaboran usando métodos bien conocidos, por ejemplo, la expresión recombinante después de clonación rutinaria.

La "actividad biológica deseada" de un anticuerpo incluye, por ejemplo, unión mejorada o modificada, afinidad mejorada o modificada, constante de asociación, constante de disociación, especificidad, vida media, inmunogenicidad reducida, expresión y producción eficientes a partir de una variedad de huéspedes, estabilidad de anticuerpos y buenas propiedades en solución, o cualquier otra característica adecuada.

El término "sustituir" o "dar variedad" o "mutar" o "diversificar" puede usarse indistintamente y como se usa en la presente se refiere a alterar uno o más aminoácidos o nucleótidos en un polipéptido o secuencia de polinucleótidos para generar una variante de esa secuencia.

"Variante", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia y puede tener o no propiedades alteradas. Un polipéptido variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o eliminaciones.

"Biblioteca", como se usa en la presente, se refiere a una colección de dos o más variantes.

Están en uso varios sistemas de numeración para identificar residuos de VH y VL de anticuerpos. La correspondencia entre los dos sistemas de numeración más usados, Kabat (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991) y Chothia (Chothia y Lesk, Mol Biol, 196:901-17, 1987) así como CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), giros hipervariables (HV, HRL) (Chothia y Lesk, Mol Biol, 196:901-17, 1987), y residuos de rSDRU se muestran en la Figura 1 y 2 para las VL y Vh del anticuerpo, respectivamente. En esta solicitud, toda la numeración de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos se realiza de acuerdo con Chothia a menos que se especifique lo contrario.

Los "residuos Chothia" son los residuos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo numerados de acuerdo con Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol, 273:927-48, 1997).

Los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras se usan en la presente de la siguiente manera:

Aminoácido Código de tres letras Código de una letra

Alanina ala A

Arginina arg R

Asparagina asn N

Aspartato asp D

Cisteína cys C

Glutamato glu E

Glutamina gln Q

Glicina gly G

Histidina his H

Isoleucina ile I

Leucina leu L

Lisina lys K

Metionina met M

Fenilalanina phe F

Prolina pro P

Serina ser S

Treonina thr T

Triptófano trp W

Tirosina tyr Y

Valina val V

En la presente se divulgan métodos de maduración por afinidad de anticuerpos utilizando enfoques centrados en generar bibliotecas de variantes de VL y VH de anticuerpos. El método de la presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden generar bibliotecas que producen anticuerpos con el nivel más alto de afinidad mejorada restringiendo la diversidad de la biblioteca a un número limitado de residuos de VH y VL (por ejemplo, un subconjunto de residuos de rSDRU) y generando las variantes que utilizan conjuntos definidos de aminoácidos que se encuentran frecuentemente en contacto con el antígeno en las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo/antígeno. Los diseños de bibliotecas dependen del tamaño de la biblioteca deseado y del tipo de antígeno contra el que se revisará la biblioteca.

Seleccionar posiciones para la diversificación

La determinación de la localización y frecuencia de los residuos en contacto por separado para los anticuerpos que se unen a diferentes tipos de antígenos (por ejemplo, proteínas, péptidos o haptenos) (por ejemplo, RSDRU) utilizando estructuras cristalinas existentes de complejos anticuerpo/antígeno, proporciona una medida de la probabilidad de que un residuo de Chothia particular en cualquier anticuerpo entre en contacto con un antígeno. Este conocimiento puede usarse para diseñar bibliotecas enfocadas de variantes con el objetivo de diversificar solo un número limitado de residuos de la cadena ligera o pesada del anticuerpo que se unen al antígeno objetivo. Las bibliotecas enfocadas pueden diseñarse y construirse incluso en ausencia de información de la estructura cristalina para el complejo anticuerpo-antígeno particular. Las bibliotecas resultantes pueden usarse para la maduración por afinidad de anticuerpos existentes. Las bibliotecas también pueden usarse para campañas de selección para el descubrimiento de anticuerpos de novo. El diseño de la diversidad en residuos restringidos aumentará la funcionalidad de la biblioteca al evitar la diversificación innecesaria de residuos que no implican el reconocimiento del antígeno, por ejemplo, mutaciones neutras y/o residuos de aminoácidos que son perjudiciales para el anticuerpo. Una funcionalidad más alta de la biblioteca debería aumentar la tasa de aciertos (número de clones positivos que producen "aglutinantes" de antígeno), la diversidad de los clones seleccionados y la probabilidad de obtener anticuerpos con mayor afinidad, más solubles y más estables.

En los métodos divulgados en la presente, las bibliotecas se diversifican en un subconjunto de residuos de rSDRU como se define en la presente.

Los residuos de VL y VH de anticuerpos en contacto con el antígeno se identifican analizando las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo-antígeno disponibles en bases de datos públicas, por ejemplo, el Banco de Datos de Proteínas (PDB; www_pdb_org). La base de datos inmunogenética (IMGT; www_imgt_cines_fr) recopila información sobre la estructura cristalina y proporciona las secuencias de polipéptidos de VL y VH de anticuerpos que tienen una estructura cristalina en complejo con su antígeno (Figura 3). Las secuencias de VL y VH están alineadas con otras secuencias de anticuerpos que se unen a tipos similares de antígenos. Los residuos de anticuerpos en contacto con sus respectivos antígenos se indican en las alineaciones (Figura 4 y 5), y los rSDRU que indican la frecuencia de contactos de un residuo de VH o VL particular con un tipo similar de antígeno se determinan dentro del conjunto de datos descargado (Figura 6 y 7).

A medida que los conjuntos de datos evolucionan mediante la incorporación de nuevas estructuras de anticuerpos resueltas en un complejo con diversos antígenos, es posible que la localización y/o frecuencia de los contactos dentro de un conjunto de datos expandido y, por tanto, los rSDRU definidos, puedan cambiar. Sin embargo, no se espera una gran fluctuación, ya que la expansión de tres veces del conjunto de datos analizados usado en los métodos divulgados en la presente dio como resultado solo pequeñas diferencias en la frecuencia de los residuos en contacto (Almagro, J Mol Recognit, 172:132-43, 2004).

Las estructuras de anticuerpos en complejo con sus antígenos utilizados para determinar los rSDRU se muestran en la Figura 3. Los residuos de VL y VH en contacto con el antígeno en las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo/antígeno se resaltan en gris en las Figuras 4 y 5, respectivamente. La Figura 6 muestra las frecuencias de contactos para cada residuo para kappa V y VH para anticuerpos anti-proteína, anti-péptido o antihapteno.

El rSDRU se calculó de acuerdo con la fórmula de rSDRU mostrada anteriormente por separado para cada residuo de anticuerpos que se unen a tipos similares de antígenos. Los residuos de rSDRU se identificaron como residuos en los que el valor de rSDRU era igual o superior a 5, por ejemplo, residuos que están en contacto con el antígeno en más del 5% de las estructuras cristalinas analizadas de los complejos anticuerpo-antígeno. La Tabla 1 muestra los residuos de rSDRU en los dominios de VL y VH para anticuerpos anti-proteína, anti-péptido y antihapteno. Los valores de rSDRU se asignaron como rSDRU bajo (L); por ejemplo, valores de rSDRU entre 5-15, rSDRU medio (M); por ejemplo, valores de rSDRU entre 15-40 y rSDRU alto (H); por ejemplo, valores de rSDRU superiores a 40. Las Regiones de Residuos Determinantes de la Especificidad (SDRR) para anticuerpos antiproteína, anti-péptido y anti-hapteno se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1

Dependiendo del grado de diversidad deseado y cobertura de secuencia de las bibliotecas, pueden seleccionarse diferentes subconjuntos de residuos de rSDRU para la diversificación. Por ejemplo, pueden elegirse subconjuntos de residuos de rSDRU en VL o VH que tienen rSDRU>5, rSDRU>15, rSDRU>30, rSDRU>40, rSDRU>50, rSDRU>60 o con valores de rSDRU entre 5-15, 15-30, 15 -40, 15-50, 15-60, 40-50 o 40-60 para la diversificación. "Subconjunto de residuos de rSDRU", como se usa en la presente, se refiere a un grupo de residuos que tienen un intervalo de valores de rSDRU definido. Por ejemplo, un subconjunto de residuos de rSDRU puede consistir de los residuos 30, 31, 49, 53 y 96 (por ejemplo, residuos de VL que tienen valores de rSDRU entre 15 y 40). Los subconjuntos de residuos de rSDRU elegidos para ser diversificados difieren dependiendo del tipo de antígeno al que se une el anticuerpo. En un esquema de diversificación ejemplar de VL, los residuos 32, 50, 91, 92, 93, 94 y 96 están diversificados, por ejemplo, un subconjunto de residuos de rSDRU que tienen rSDRU>30 en anticuerpos anti-proteína. En un esquema de diversificación ejemplar de VH, los residuos 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 56 y 58 están diversificados, por ejemplo, un subconjunto de residuos de rSDRU que tienen rSDRU>60 en anticuerpos anti-péptido.

Tabla 2.

En los métodos divulgados en la presente, pueden incluirse consideraciones adicionales cuando se determinan esquemas de diversificación para generar bibliotecas de variantes de anticuerpos para mejorar la funcionalidad de la biblioteca. El diseño de la biblioteca puede refinarse mapeando los residuos de rSDRU en la estructura de rayos X del Fv. En ausencia de la estructura de rayos X experimental, puede usarse un modelo 3D del Fv. Un sitio web para el modelado automatizado de anticuerpos basado en el modelo de estructura canónica denominado PIGS (Predicción automática de estructuras de inmunoglobulina) puede encontrarse en http://arianna_bio_uniroma1_it/pigs/. Un procedimiento de modelado de anticuerpos basado en la homología de secuencia con respecto a anticuerpos de estructura conocida ha sido desarrollado por Accelrys Inc. como parte de su software de simulación y modelado Life Sciences en Discovery Studio. (http://accelrys_com/products/discoverystudio/). El PIGS y el Discovery Studio generan modelos con una precisión razonable en Vl y la mayor parte de VH.

En la estructura o modelo, los residuos de rSDRU pueden evaluarse para su exposición al solvente, así como su colocación para establecer contactos con antígenos. Por ejemplo, la inserción de residuos en el giro hipervariable (HVL) L1 puede cambiar la orientación relativa de los residuos 30 y 31, así como interferir con los residuos en HVL L2. Las inserciones en HVL H2 o diferentes estructuras canónicas en este giro pueden exponer o enterrar residuos en la punta del HVL H2 (residuos 50-54). Los giros HVL H3 largos o cortos también pueden desempeñar un papel en la exposición u obstaculización de residuos en los HVL L3, L1 y H2. Por tanto, la estructura o el modelo pueden usarse para maximizar el número de residuos de rSDRU con una mayor probabilidad de hacer contactos con el antígeno para un Fv dado, es decir, exposición al solvente, dirección a la que apuntan las cadenas laterales y el tamaño y naturaleza de las cadenas laterales (polares, pequeñas, aromáticas) usadas para diversificar los residuos de rSDRU. Por ejemplo, si las cadenas laterales de los residuos en un residuo de rSDRU dado no están expuestas al solvente, o no apuntan a un antígeno, ese residuo de rSDRU puede no ser objetivo de la diversificación.

En un diseño ejemplar, las posiciones dirigidas para la diversificación incluyen los residuos de rSDRU 32, 50, 91, 92, 93, 94 y 96 (por ejemplo, residuos de rSDRU con rSDRU>30) en un anticuerpo que tiene una cadena B3 kappa V, o una variante de la cadena B3, como las cadenas VL del anticuerpo anti-OSM del ejemplo 3. Un modelo 3D de B3 indica que de seis residuos en la inserción de HVL L1 en B3, los residuos 30a, 30c, 30d y 30f apuntan hacia el sitio de unión al antígeno y, por tanto, pueden ser objetivo para la diversificación, aunque estos residuos tienen valores de rSDRU entre 5-15, debido a la falta de un número suficiente de estructuras cristalinas que tienen esa inserción en la base de datos (ver Figura 4).

Polipéptidos que pueden usarse como plantillas para la diversificación incluye polipéptidos que codifican las cadenas ligera o pesada del anticuerpo, o fragmentos de las mismas, por ejemplo VL y VH. Los polipéptidos pueden ser naturales o sintéticos. Las plantillas ejemplares incluyen secuencias de dominio variable de anticuerpos anti-OSM descrita en el Ejemplo 3.

Generación de variantes

La determinación de la distribución de aminoácidos en cada residuo de rSDRU identifica conjuntos de aminoácidos favorecidos por anticuerpos para contactar con diferentes tipos de antígenos en complejos antígenoanticuerpo de estructura conocida. Estos conjuntos de aminoácidos pueden utilizarse para diversificar bibliotecas de una manera enfocada para maximizar la cobertura de la biblioteca. En los métodos divulgados en la presente, la diversificación de subconjuntos restringidos de residuos de rSDRU con conjuntos de aminoácidos en los que la diversidad estaba sesgada hacia la diversidad natural identificada en los contactos de anticuerpos en estructuras antígeno-anticuerpo existentes, produjo colecciones de anticuerpos con propiedades mejoradas sobre bibliotecas con diversidad aleatoria en subconjuntos idénticos de residuos de rSDRU. Las bibliotecas enfocadas generadas pueden usarse para la maduración por afinidad de anticuerpos existentes. Las bibliotecas también pueden usarse para campañas de selección para el descubrimiento de anticuerpos de novo.

En los métodos divulgados en la presente, las bibliotecas se diversifican en subconjuntos de residuos de rSDRU usando conjuntos de aminoácidos como se define en la presente.

Las frecuencias de aminoácidos en cada residuo de rSDRU se determinaron analizando las estructuras cristalinas de los complejos anticuerpo-antígeno disponibles. Las frecuencias se determinaron de acuerdo con la fórmula de SDRM descrita anteriormente para cada residuo de rSDRU por separado para kappa V y VH para anticuerpos anti-proteína, anti-péptido y anti-hapteno (Figuras 7 y 8). Por ejemplo, los aminoácidos Q y E se encontraron presentes en el 71% y el 28% de las estructuras cristalinas analizadas de anticuerpos en complejo con antígenos de proteína en el residuo 27 de kappa V (Figura 7A). Los aminoácidos I, K, S y T se encontraron presentes en el 8%, 11%, 26% y 52% de las estructuras cristalinas analizadas de anticuerpos en complejo con antígeno y residuo 30 de VH.

"Un conjunto de aminoácidos", como se usa en la presente, se refiere al grupo de aminoácidos presentes en cada posición definida de rSDRU en estructuras cristalinas de complejos anticuerpo-antígeno en el conjunto de datos analizado. En las Figuras 7 y 8 se muestran conjuntos representativos de aminoácidos. Por ejemplo, un "conjunto de aminoácidos" puede consistir de los aminoácidos I, K, S y T, por ejemplo, un grupo de aminoácidos identificado en el residuo 30 de rSDRU de VH en anticuerpos anti-proteína (Figura 8a). Un "conjunto de aminoácidos" diferente puede consistir de los aminoácidos G, F e Y, por ejemplo, un grupo de aminoácidos identificado en el residuo 32 de rSDRU de VH en anticuerpos anti-péptido (Figura 8b).

Cada residuo de rSDRU seleccionado puede diversificarse usando el conjunto de aminoácidos que está presente en el residuo de rSDRU seleccionado en las secuencias de kappa V y VH en anticuerpos que se unen a tipos similares de antígenos.

Puede implementarse un corte de frecuencia para limitar el número de aminoácidos usados para diversificar un residuo de rSDRU particular, y puede ser necesario en casos, por ejemplo, en los que el tamaño de la biblioteca resultante sería mayor de lo deseado. Por ejemplo, los aminoácidos identificados en más del 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de frecuencia en un residuo de rSDRU particular pueden usarse para la diversificación de ese residuo de rSDRU. Por tanto, un "conjunto de aminoácidos" puede consistir de los aminoácidos K, S y T, por ejemplo, un grupo de aminoácidos identificado en el residuo 30 de rSDRU de VH en los anticuerpos anti-proteína (Figura 8a), o el aminoácido Y, por ejemplo., un grupo de aminoácidos identificado en el residuo 32 de rSDRU de VH en anticuerpos anti-péptido cuando el corte de frecuencia se establece en el 10% (Figura 8b). En un esquema de diversificación ejemplar, el residuo 30 kappa V del anticuerpo anti-proteína puede diversificarse usando los aminoácidos NGHKSY, NGHKSY o GSY, dependiendo de la rigurosidad de frecuencia deseada en ese residuo de rSDRU particular (sin corte, 5% y 10%, respectivamente). De manera similar, un residuo 50 de VH de anticuerpo anti-proteína puede diversificarse usando los aminoácidos RNEGLMSTWYV, EGLTWY, o EWY, dependiendo de la restricción de frecuencia deseada (sin corte, 5% y 10%, respectivamente) (Figuras 7 y 8).

La frecuencia de los aminoácidos en contacto con el antígeno puede determinarse no solo independientemente para cada residuo de rSDRU como se ha descrito anteriormente, sino también colectivamente para todos los residuos de rSDRU localizados en las cadenas de VL y VH. El "conjunto universal de aminoácidos", como se usa en la presente, se refiere a un grupo de aminoácidos presente con mayor frecuencia en todos los residuos de rSDRU en anticuerpos tanto de cadena pesada como ligera. El "conjunto universal de aminoácidos" puede consistir de los aminoácidos R, N, D, G, H, S, W e Y, (RNDGHSWY) o de los aminoácidos R, N, D, G, H, S e Y, (RNDGHSY) o de los aminoácidos R, N, D, G, H, W e Y, (RNDGHWY) o de los aminoácidos R, D, H, S, W, Y y G (RDGHSWY). Juntos, estos aminoácidos proporcionan una amplia gama de propiedades de reconocimiento molecular. El conjunto universal de aminoácidos puede usarse para la diversificación de algunos de todos los residuos de rSDRU si se va a generar la máxima diversidad en esas posiciones, por ejemplo, para enfocar la diversificación en los residuos de rSDRU en SDRR-L1, SDRR-L2, SDRR-L3, SDRR-H1 y s Dr R-H2. El conjunto universal de aminoácidos también puede usarse para simplificar el diseño y la síntesis de la biblioteca, ya que puede emplearse la misma mezcla de codones en todas las posiciones que se van a diversificar. El conjunto universal de aminoácidos puede usarse para diversificar residuos que tengan datos mínimos sobre contactos, lo que da como resultado valores de rSDRU artificialmente bajos para ese residuo. Tales residuos ejemplares son residuos en las inserciones L1 de HVL (residuos 30a-30f), inserciones H2 (residuos 52a-d) e inserciones L3 (residuos 95a-c) o en la inserción sintética en una HVL dada que forma el sitio de unión al antígeno.

Los anticuerpos, como cualquier otra proteína, son propensos a una variedad de inestabilidades físicas y/o químicas, lo que da como resultado efectos adversos en el procesamiento en sentido descendente de fármacos a base de anticuerpos. Por ejemplo, la inestabilidad física y química puede llevar a la agregación, degradación, bajo rendimiento del producto, pérdida de potencia, mayor potencial de inmunogenicidad, heterogeneidad molecular y pérdida de actividad. Por tanto, se tiene cuidado durante el diseño de las bibliotecas de variantes de anticuerpos para minimizar la presencia de posibles residuos inductores de inestabilidad y secuencias de reconocimiento.

Por ejemplo, Met y Trp expuestos a la superficie pueden oxidarse en condiciones de almacenamiento, lo que posiblemente lleve a una pérdida de la potencia del anticuerpo. Por tanto, Met y Trp pueden omitirse del conjunto universal de aminoácidos usados para diversificar los residuos de rSDRU que están expuestos al solvente. Si el residuo de rSDRU no está expuesto al solvente, pude incluirse Trp pero puede omitirse Ser. Además, si varios rSDRU convergen en la misma región del sitio de unión al antígeno, Trp puede omitirse del conjunto universal de aminoácidos para evitar la interferencia debido al gran tamaño de Trp.

La presencia de Asn en un conjunto universal de aminoácidos puede generar sitios de reconocimiento de N-glicosilación (NXS/T) bien conocidos en una biblioteca dependiendo de la secuencia colindante. Asn puede eliminarse del conjunto universal de aminoácidos si el residuo de rSDRU diversificado va seguido de residuos que generarían el sitio de N-glicosilación. Asn puede estar desamidado en proteínas cuando es seguido por Gly en secuencia, posiblemente generando heterogeneidad (Robinson Proc Natl Acad Sci USA, 99:5283-8, 2002) y por tanto Asn puede eliminarse del conjunto universal de aminoácidos cuando se usa para diversificar el residuo de rSDRU seguido de Gly, o reemplazarse por Gln.

De manera similar, Trp y Asn pueden eliminarse de cualquiera o de todos los conjuntos de aminoácidos usados para diversificar uno o más residuos de rSDRU. Alternativamente, Trp y Asn pueden retenerse a un nivel bajo, por ejemplo, al 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% o 20% en los conjuntos de aminoácidos usados para diversificar cualquier biblioteca de anticuerpos.

En un esquema de diversificación ejemplar, los residuos de rSDRU de Kappa V 30a, 30c, 30d, 30f, 32, 50, 91, 92, 93, 94 y 96 se diversifican con RNDGHSY, RNDGHWY, RNDGHSY, RNDGHWY, RNDY, YWNK, SYGH, SYGN, STER, WYSH, y YRWL, respectivamente, en anticuerpos antiproteína.

También se divulga un método de maduración por afinidad de un anticuerpo, que comprende los pasos de:

b. identificar residuos de rSDRU en la secuencia de aminoácidos de VL o VH del anticuerpo;

c. seleccionar un subconjunto de los residuos rSDRU para diversificar;

d. seleccionar un conjunto de aminoácidos o un conjunto universal de aminoácidos usados para diversificar el subconjunto de residuos de rSDRU;

e. preparar una biblioteca de variantes de VL o VH de anticuerpos diversificando el subconjunto de residuos de rSDRU seleccionados en el paso c. con el conjunto de aminoácidos seleccionados en el paso d.;

f. expresar la biblioteca de variantes de VH o VL de anticuerpos en un huésped o traducir de la biblioteca de variantes de VH o VL de anticuerpos in vitro; y

g. seleccionar de la biblioteca de variantes de VH o VL de anticuerpos uno o más anticuerpos madurados por afinidad que tienen una afinidad mejorada para un antígeno.

Las secuencias de aminoácidos de VH o VL pueden obtenerse usando métodos de secuenciación rutinarios.

Los residuos de rSDRU pueden identificarse como se ha descrito anteriormente. El número de residuos de rSDRU elegidos para la diversificación depende de la complejidad deseada de la biblioteca resultante. Puede elegirse un subconjunto de residuos de rSDRU que tienen valores de rSDRU entre 5 y 15, por ejemplo, los residuos de rSDRU de bajo uso para diversificación. En otros casos, puede elegirse un subconjunto de residuos de rSDRU que tienen rSDRU>40, por ejemplo, residuos de rSDRU de uso alto para la diversificación. Para la maduración por afinidad de anticuerpos, pueden diversificarse los residuos de rSDRU que residen en kappa V o VH. Los conjuntos de aminoácidos elegidos para diversificar subconjuntos seleccionados de residuos de rSDRU se han descrito anteriormente. El conjunto de aminoácidos y el conjunto universal de aminoácidos seleccionados depende de la afinidad requerida del anticuerpo, el tipo de antígeno, el tamaño de la biblioteca a generar, el contenido deseado de residuos hidrófobos/hidrófilos y el deseo de reducir la frecuencia de residuos de aminoácidos que pueden proporcionar características de anticuerpos no beneficiosas, por ejemplo, Trp, Met y Asn.

La generación de variantes de anticuerpos y la construcción de las bibliotecas se logra típicamente a nivel de ácido nucleico. Las bibliotecas de variantes de anticuerpos con distribución de aminoácidos sesgada en las posiciones que se van a variar pueden sintetizarse, por ejemplo, usando la tecnología Slonomics® (http: _//www_sloning_com). Esta tecnología usa una biblioteca de tripletes de cadena doble prefabricados que actúan como bloques de construcción universales suficientes para miles de procesos de síntesis de genes. La biblioteca de tripletes representa todas las posibles combinaciones de secuencias necesarias para construir cualquier molécula de ADN deseada. Las bibliotecas también pueden sintetizarse usando síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos US6521427 y US6670127, utilizando oligonucleótidos degenerados que coinciden con la diversidad diseñada. Las variantes en la biblioteca que tienen sustituciones aleatorias pueden generarse usando codones NNK, que codifican los 20 aminoácidos naturales. Pueden usarse los codones CGT/CGC/CGA/CGG/AGA/AGG (Arg), AAT/AAC (Asn), GAT/GAC (Asp), CAT/CAC (His), TCT/TCC/TCA/TCG/AGT/AGC (Ser), TGG (Trp), TAT/TAC (Tyr), GGT/GGC/GGA/GGG (Gly) para generar el perfil del conjunto de datos universal de aminoácidos.

Pueden usarse técnicas de clonación estándar para clonar las bibliotecas en un vector para expresión y/o presentación. La biblioteca puede expresarse en varios formatos que incluyen IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv o Fv usando un sistema conocido. Las bibliotecas también pueden expresarse como proteínas de fusión y pueden presentarse en la superficie de cualquier fago adecuado. Los métodos para presentar polipéptidos de fusión que comprenden fragmentos de anticuerpos en la superficie de un bacteriófago son bien conocidos (Patente de Estados Unidos N° 6.969.108; Patente de Estados Unidos N° 6.172.197; Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Patente de Estados Unidos N° 6.582.915; Patente de Estados Unidos N° 6.472.147). Las bibliotecas para el aislamiento de anticuerpos de novo y la maduración por afinidad pueden presentarse en pIX (documento WO2009/085462, Tornetta et al., J Immunol Methods, 360:39-46, 2010). Las bibliotecas también pueden traducirse in vitro, por ejemplo, usando presentación de ribosomas (Hanes y Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94:4937, 1997), presentación de ARNm (Roberst y Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94:12297, 1997), u otros sistemas libres de células (Patente de Estados Unidos N° 5.643.768).

La biblioteca resultante puede examinarse en busca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la actividad biológica deseada, por ejemplo unión reducida, potenciada o modificada, reactividad cruzada, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, o especificidad, o cualquier otra característica adecuada. Puede usarse un ELISA de un solo punto para clasificar la actividad de unión de los anticuerpos maduros en comparación con el anticuerpo original, seguido de una estimación más precisa de la afinidad y las constantes cinéticas de los candidatos mejor clasificados usando análisis Biacore o KinExA.

Ejemplo 1

Determinación de rSDRU

Los rSDRU se identificaron analizando los complejos antígeno-anticuerpo disponibles en IMGT (http:_//imgt_cines_fr), de una manera similar a la descrita anteriormente para un conjunto más pequeño de estructuras complejas (Almargo, J Mol Recognit. 17:132-43, 2004.). Se compilaron un total de 933 estructuras en la base de datos el 23 de marzo de 2008. De estas, 478 entradas contenían anticuerpos en complejos con proteínas, péptidos o haptenos. Las 478 estructuras se filtraron adicionalmente usando los siguientes criterios: (1) estructuras resueltas a una resolución de 3,0 Á o menor, (2) anticuerpos kappa V, (3) anticuerpos humanos o de ratón y (4) anticuerpos únicos según el nombre del anticuerpo y las comparaciones de secuencias. Después de este paso de filtrado, las 142 estructuras resultantes incluían 67 anticuerpos en complejo con proteínas, 28 en complejo con péptidos y 47 en complejo con haptenos. El conjunto de datos consistía de anticuerpos 91% de ratón y 9% humanos que se resumen en la Figura 3.

Las Figuras 4 y 5 muestran las secuencias kappa V y VH de los anticuerpos usados en el estudio, respectivamente. Los residuos de anticuerpos que se identificaron que estaban en contacto con el antígeno respectivo se recopilaron de IMGT y están resaltados en gris. A partir del conjunto de datos, se identificaron rSDRU de uso alto, medio y bajo. La Figura 6 muestra rSDRU dentro de las respectivas SDRR, y los datos se resumen en la Tabla 1. Se identificaron cinco SDRR distintas tanto en kappa V como en VH. Estas regiones se superponen parcialmente con las CDR y HVL y se definieron como SDRR-L1, -L2, -L3, -H1 y -H2, en consecuencia. La Tabla 2 muestra las regiones de SDRR. Los contactos para los residuos que residen en CDR-H3 no se calcularon debido a la alta variabilidad en la longitud, la conformación y el contenido de aminoácidos de la CDR en esta región. Como las SDRR identifican regiones de las cadenas variables que hacen contacto con los antígenos dependiendo del tipo de antígeno reconocido, puede usarse como guía en los protocolos de humanización para reducir el número de residuos no humanos que se transfieren a un contexto humano.

En general, VH tiene más rSDRU que kappa V para todos los tipos de anticuerpos, lo que podría reflejar el papel preponderante de VH sobre VL en el mecanismo de unión al antígeno. En los anticuerpos anti-proteína y antipéptido, el número y la localización de rSDRU son similares pero difieren significativamente de los anticuerpos antihapteno, donde las magnitudes de rSDRU en todos los sitios son inferiores a 40, con la excepción de las posiciones 92 en kappa V y 34 en VH. En los anticuerpos que reconocen proteínas y péptidos, varias posiciones alcanzan valores de rSDRU superiores a 60. Los residuos 32, 34 (SDRR-L1), 49, 50 (s Dr R-L2) y 91-94, y 96 (SDRR-L3) hacen contacto con los tres tipos de antígenos. Se observan variaciones en las frecuencias con las que los tres antígenos contactan con cada uno de estos sitios.

Ejemplo 2

Cálculo de matrices de residuos determinantes de la especificidad "SDRM"

Se definieron las distribuciones de aminoácidos en cada rSDRU de kappa V o VH y se presentan en forma de SDRM (matrices de residuos determinantes de la especificidad). SDRM representa la contribución de cada uno de los 20 aminoácidos en cada residuo de rSDRU (Figura 8 y 9). En general, los anticuerpos anti-proteína mostraron la mayor diversidad en residuos de aminoácidos en las SDRM. Los anticuerpos anti-hapteno utilizaron un conjunto más restringido de aminoácidos para reconocer los antígenos.

SDRM de kappa V

Se observaron diferencias en la distribución de los tipos de aminoácidos entre las regiones de SDRR y entre los tipos de antígenos en kappa V (Figura 7). En todos los tipos de antígenos, Arg, Asn, Asp, His, Ser, Thr y Tyr se producen con mayor frecuencia en los sitios de contacto. Cys, Pro, Gin, Glu y aminoácidos hidrófobos como Ala, Ile, Leu, Met, Phe y Val se producen con menos frecuencia. Por tanto, los aminoácidos hidrófilos predominan sobre los residuos hidrófobos. Comparando diferentes regiones de SDRR, Asn y Asp se producen con más frecuencia en SDRR-L1 que en SDRR-L3. En SDRR-LI, Arg es raro y Trp está ausente. SDRR-L2 tiene menos diversidad que SDRR-L1 y SDRR-L3; por ejemplo, SDRR-L2 tiene mucho menos Ser. De manera similar, se observaron diferencias en las distribuciones de SDRR dentro de la misma clase de antígeno. Por ejemplo, en los anticuerpos anti-proteína, Trp se produce con más frecuencia en SDRR-L3 que en SDRR-L1 o SDRR-L2.

Se observaron similitudes y diferencias para la misma región entre los anticuerpos que se unen a diferentes clases de antígenos. En los anticuerpos anti-proteína, los residuos predominantes en los sitios de contacto son: Asn, Asp, His, Lys, Ser y Thr en SDRR-L1; Arg, Glu, Ser y Thr en SDRR-L2; y Arg, Ser, Thr, Trp y Tyr en SDRR-L3. En anticuerpos anti-péptido, los residuos correspondientes son: Arg, Asn, Asp, His, Ser y Tyr en SDRR-L1; Tyr en SDRR-L2; y Ser, Tyr y Val en SDRR-L3. En los anticuerpos anti-hapteno, los residuos son: Asn, His y Ser en SDRR L1; Ser en SDRR-L2; y Gln, Gly, His, Ser y Tyr en SDRR-L3. Estratificadas sobre estas distribuciones hay diferencias en abundancia relativa entre las clases de antígenos. Por tanto, los anticuerpos anti-proteína tienen una mayor frecuencia de Asp y un mayor número de residuos de contacto en SDRR-L1 y una mayor frecuencia de Arg y Trp en SDRR-L3. Por el contrario, los anticuerpos anti-hapteno tienen más Gln, Gly e His en los sitios de contacto con el antígeno.

Este análisis de aminoácidos en contacto con el antígeno proporciona una guía para la sustitución de residuos en las posiciones de rSDRU de kappa V (Figura 7). Por ejemplo, el residuo 34 puede diversificarse usando los aminoácidos NHYF en anticuerpos anti-proteína, NEHSTY en anticuerpos anti-péptido y ARNDGHSY en anticuerpos anti-hapteno cuando no se define una frecuencia de corte. De igual manera, el residuo 93 de la cadena ligera puede diversificarse usando RNEHIKMSTV en anticuerpos anti-proteína, ARNQEHFS en anticuerpos antipéptido y EGHT en anticuerpos anti-hapteno. Si se aplica un límite de corte de por lo menos el 10%, la diversidad en la posición 93 se reduce a EST, EHS y EGH en anticuerpos anti-proteína, anti-péptido y anti-hapteno, respectivamente.

SDRM de VH

Similar a kappa V, las diferencias en el tipo de aminoácidos implicados en la interacción con diferentes tipos de antígeno en VH se muestran en la Figura 8. En todas las clases de antígenos, los residuos predominantes en contacto en SDRR-H1 y SDRR-H2 son: Arg, Asn y Asp en SDRR-H1; Glu, Gly y His en SDRR-H2, y Ser, Thr, Trp y Tyr en la base de H3. Como en el caso de kappa V, Ser, Thr y Tyr se producen frecuentemente en los sitios de contacto; y Cys, Pro, Gln, Glu y aminoácidos hidrófobos como Ala, Ile, Leu, Met, Phe y Val son menos abundantes. En comparación con V ^k , V^htiene más contactos que implican aminoácidos cargados negativamente, particularmente en SDRR-H2. En consecuencia, Lys se produce con menos frecuencia en general y Arg se produce con poca abundancia en SDRR-H1.

En los anticuerpos anti-proteína, los residuos predominantes en los sitios de contacto son: Asn, Asp, Gly, Ser, Thr y Tyr en SDRR-H1; y Arg, Asn, Asp, Gly, Ser, THr y Tyr en SDRR-H2. En los anticuerpos anti-péptido, los residuos correspondientes son: Asn, Gly, Ile, Ser, Thr y Tyr en SDRR-H1; y Arg, An, Gly, Ser, Thr, Trp y Tyr en SDRR-H2. En anticuerpos anti-hapteno, los residuos son: Asn, Gly, Ser, Thr y Tyr en SDRR-H1; y Arg, Asn, Ser, Thr, Trp y Tyr en SDRR-H2. En la Figura 8 se muestra una guía para la sustitución de residuos de rSDRU. Por ejemplo, en el residuo 50 de VH, los aminoácidos RNEGLMSTWYV, EGLTWY o EWY están indicados para anticuerpos anti-proteína en frecuencias de corte del 0, 5 y 10%, respectivamente. Los aminoácidos correspondientes son RDEGHFTWY, REGHTWY o RGWY para anticuerpos anti-péptido y RNDELMSTWYV, RESWY o RSWY para anticuerpos anti-hapteno.

Conjunto universal de aminoácidos

El conjunto universal de aminoácidos se seleccionó en base a la frecuencia de aminoácidos en todos los residuos de rSDRU para las cadenas pesada y ligera y a las propiedades de las cadenas de aminoácidos. El conjunto universal de aminoácidos consiste de los residuos Arg, Asn, Asp, Gly, His, Ser, Trp y Tyr. En este conjunto, Trp, Asp y Ser pueden eliminarse en algunos casos como se ha descrito anteriormente, dando como resultado conjuntos universales alternativos de aminoácidos que consisten de los aminoácidos Arg, Asn, Asp, Gly, His, Ser y Tyr, o de amino ácidos Arg, Asn, Asp, Gly, His, Trp y Tyr, o de los aminoácidos Arg, Asp, His, Ser, Trp, Tyr y Gly. Puede lograrse una amplia gama de propiedades de reconocimiento molecular con estos conjuntos limitados de aminoácidos. Arg es un proxy para aminoácidos cargados positivamente y su grupo guanidinio puede participar en enlaces de hidrógeno, tanto como donante como aceptor. Asp proporciona la carga negativa pero no es tan flexible como Glu y por tanto menos entrópico; además, puede formar puentes salinos y actuar como aceptor de enlaces de hidrógeno. Asn puede actuar como aceptor de enlaces de hidrógeno. His proporciona interacciones de apilamiento y también puede contribuir con una carga positiva en su estado de protonación. Trp y Tyr proporcionan interacciones aromáticas, enlaces de hidrógeno e interacciones de apilamiento. Ser proporciona enlaces de hidrógeno y también es el residuo de cadena lateral más pequeño. Ser, y particularmente Gly, proporcionan la flexibilidad estereoquímica y permiten la orientación apropiada de los aminoácidos colindantes para la interacción con el antígeno. El desgaste en el número de sitios posibles y la reducción en el número de sustituciones en cada sitio por el conjunto universal de aminoácidos permite la exploración de una gran superficie de unión en bibliotecas combinatorias. El conjunto universal de aminoácidos puede usarse para diversificar bibliotecas para la maduración por afinidad de anticuerpos así como bibliotecas para descubrimiento de novo.

Ejemplo 3

Maduración por afinidad de anticuerpos anti-oncostatina M

La oncostatina M (OSM) (N° de registro de GenBank NP_065391) es un miembro multifuncional de la familia de citoquinas IL-6 secretadas por monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos T activados (Tanaka & Miyajima, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 149:39-53, 2003) y funciona en procesos oncogénicos y vías inflamatorias e hipertróficas que llevan a afecciones deletéreas como la fibrosis pulmonar.

Se seleccionaron bibliotecas Fab-pIX de novo (Shi et al., J Mol Biol, 397:385-96, 2010; WO2009/085462; U.S. Na de Serie 12/546850) usando OSM humano biotinilado (R&D Systems, aminoácidos 26 -221 de NP_065391) capturado en perlas de estreptavidina paramagnéticas (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo un protocolo publicado para la selección de fagos (Marks y Bradbury, Antibody Engineering, Vol. 248: 161-176, Humana Press, 2004). Las bibliotecas se generaron diversificando los genes IGVH de línea germinal humana IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01, y los genes IGVK de línea germinal humana 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) y B3 (IGKV4-1 *01). Las tres bibliotecas de VH resultantes se combinaron con las cuatro bibliotecas de VL para generar 12 combinaciones únicas de VH:VL para la selección. Los Fab de unión a OSM confirmados se convirtieron en mAb de IgG1 humanos de longitud completa y se caracterizaron usando varios ensayos que incluían mediciones de afinidad por resonancia de plasmones de superficie (Biacore) y su capacidad para bloquear la señalización de Stat3. De los análisis, cuatro mAbs, OSMM5, OSMM6, OSMM9 y OSMM10, fueron seleccionados para la maduración por afinidad. La Tabla 3 muestra las características de los mAb elegidos para la maduración por afinidad.

Tabla 3. Caracterización de mAbs anti-OSM.

Maduración por afinidad

Para la maduración por afinidad, las cadenas de VH de los mAbs OSMM5, OSMM6, OSMM9 y OSMM10 (H135, H14, H17 y H2) se combinaron con tres bibliotecas de VL distintas presentadas en pIX y se analizaron usando huOSM (R&D Systems) y cynoOSM maduro. Las cadenas de VL de los mAbs M5, M6, M9 y M10 (L111, L12, B3, L2) se originaron todas a partir de la biblioteca pIX de novo de B3, por lo que se seleccionó B3 como plantilla para generar bibliotecas para la maduración por afinidad.

Una de las bibliotecas usadas para la maduración ("Biblioteca 3") fue la misma biblioteca usada para el descubrimiento de novo siguiendo el procedimiento descrito por Shi et al., J Mol Biol, 397:385-396, 2010 y la WO2009/085462; U.S. N° de serie 12/546850. La diversidad en esta biblioteca se diseñó identificando posiciones en la cadena ligera observadas con mayor frecuencia en contacto con antígenos de proteínas y péptidos y usando aminoácidos que se encontraron en posiciones correspondientes dentro de la familia de genes de la línea germinal B3 y en anticuerpos reorganizados derivados de B3. Se generaron dos bibliotecas adicionales, la Biblioteca 1 ("biblioteca SDRU enfocada") y la Biblioteca 2 ("biblioteca NNK SDRU"), para comparar el impacto de elegir distintos residuos de rSDRU y estrategias de diversificación sobre la eficiencia de la maduración por afinidad. Las bibliotecas 1 y 2 se dirigieron a los mismos residuos de rSDRU pero diferían en los aminoácidos usados para la diversificación (Tabla 4).

Los residuos de rSDRU dirigidos a la diversificación en las Bibliotecas 1 y 2 se eligieron de la siguiente manera. Primero, se identificaron posiciones en kappa V que tienen una alta frecuencia de contacto con antígenos de proteínas (rSDRU>40) y que son comunes a todas las cadenas kappa V, excluyendo residuos dentro de la inserción y deleciones en la cadena de kappa V (por ejemplo, Residuos 30a-f y 95a-c). En segundo lugar, se ensambló un modelo estructural tridimensional de B3 recombinado con Jkappa1 y se incluyeron residuos dentro de las inserciones 30a-f que apuntaban en la dirección del sitio de unión al antígeno (30a, 30c, 30d y 30f) en las posiciones que se iban a diversificar. El conjunto combinado de residuos de rSDRU seleccionados para la diversificación en B3 fueron los residuos de Chothia 30a, 30c, 30d, 30f, 32, 50, 91,92, 93, 94 y 96.

Para la Biblioteca 1, la diversidad en cada posición fue el conjunto que se produjo con mayor frecuencia en contacto con ligandos de proteínas (por ejemplo, residuos más frecuentes en la SDRM). Para las posiciones 30a-30f, no había suficiente información disponible sobre la estructura cristalina para determinar la contribución de los residuos implicados en el contacto con el antígeno. En estas posiciones, se usó el conjunto universal de aminoácidos descrito anteriormente. Se incluyó triptófano (W) sólo en unas pocas posiciones (por ejemplo, 30c y 30f) para evitar la oxidación potencial y el choque estérico que podría llevar a la agregación.

Las Bibliotecas 1 y 2 se sintetizaron usando síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.427 y la Patente de Estados Unidos N° 6.670.127. Se emplearon dinucleótidos para adaptar la diversidad de la Biblioteca 1 mientras que se usaron oligonucleótidos degenerados (NNK) para la síntesis de la Biblioteca 2. La Biblioteca 3 se construyó como se describe por Shi et al., J Mol Biol, 397:385-96, 2010 y la W02009/085462; U.S. N2 de serie 12/546850.

La Tabla 4 resume la diversidad en las Bibliotecas 1,2 y 3. Durante el control de calidad de la biblioteca, se identificaron algunos aminoácidos que no formaban parte del diseño original y, por lo tanto, se introdujeron como consecuencia del método de síntesis. Para la biblioteca 1, estos aminoácidos fueron: S (posición 30c), T (posición 30d), EK (posición 30f), IW (posición 32), TV (posición 50), I (posición 92), D (posición 93) y F (posición 96).

Tabla 4.

Las bibliotecas se clonaron y presentaron siguiendo protocolos estándar (Shi et al., J Mol Biol, 397:385-96, 2010; WO2009/085462; U.S. N° de Serie 12/546850). Los Fab se presentaron en pIX mediante la expresión de un vector dicistrónico en el que el dominio VH-CH1 se fusiona con la secuencia de la proteína de la cubierta y la VL-Ckappa se expresa como un polipéptido libre que se asocia con la VH-CH1. Se llevaron a cabo tres rondas de adsorción con OSM humano biotinilado 1 nM (R&D Systems), 0,1 nM de cynoOSM maduro biotinilado y 0,01 nM de OSM humano biotinilado (R&D Systems) en cada ronda, respectivamente.

Después de la adsorción, los Fab de cada biblioteca se compararon con el Fab original para la unión de OSM en un ensayo ELISA usando 2 nM y 0,2 nM de OSM humano. El 81,3%, 63,5% y 97,9% de los Fab identificados de la Biblioteca 1, 2 y 3, respectivamente, mostraron una unión mejorada en comparación con el Fab original. La distribución de la mejora de veces con respecto a la unión original se muestra en la Figura 9. Aunque, la tasa de aciertos de la biblioteca 3 fue mejor que las tasas de aciertos de las bibliotecas 1 y 2, la afinidad de los anticuerpos generados a partir de las Bibliotecas 1 y 2 fue mayor que para los de la Biblioteca 3. Además, la Biblioteca 1 produjo Fab con las afinidades más altas con una mejora de hasta 9 veces en la unión con respecto a los anticuerpos originales comparados. Por tanto, la combinación de seleccionar posiciones en base a rSDRU y la diversificación en base a conjuntos definidos de aminoácidos produjo anticuerpos con los niveles más altos de afinidad mejorada.

Para caracterizar adicionalmente el resultado de las selecciones, las regiones kappa V seleccionadas obtenidas de la selección de la biblioteca 1 se emparejaron con cadenas VH originales de OSMM6 y OSMM9, y se clonaron como constructos completos de IgG1/kappa para expresión en células de mamífero. Las afinidades de los anticuerpos purificados por huOSM y cynoOSM se determinaron mediante BIAcore y sus potencias neutralizantes se midieron mediante inhibición de la fosforilación de STAT3 en cultivo celular (Tabla 5). Las secuencias de los clones seleccionados en las posiciones diversificadas se muestran en la Tabla 6.

Tabla 5.

Tabla 6.

Todos los clones seleccionados mostraron una mayor afinidad y potencia neutralizante que sus Abs originales. Las afinidades medidas por BIAcore variaron de 30 pM a 1,7 nM. El intervalo de mejora de la afinidad medido en BIAcore se asemeja a la distribución de afinidades observada en el ensayo ELISA usado para clasificar las variantes. Las afinidades por cynoOSM se correlacionan bien con huOSM. La potencia de neutralización no se correlacionó estrictamente con la afinidad medida, pero mostró la misma tendencia general. Esto puede reflejar una fluctuación experimental. Por tanto, los anticuerpos seleccionados de la Biblioteca 1 mejoraron tanto en afinidad como en potencia neutralizante in vitro.

Ensayos y reactivos

Expresión y purificación de OSM

Las formas precursoras y maduras de OSM humano y de mono Cynomolgus (M acaca fascicularis) (huOSM y cynoOSM) se expresaron en HEK293 y se purificaron usando metodologías estándar. El huOSM maduro y el cynoOSM comprenden aa 1-184 de sus respectivas formas precursoras. Se añadieron una etiqueta His6 y una AviTag a la proteína durante el proceso de clonación. Las actividades funcionales de las proteínas se probaron en los ensayos de proliferación celular A375-S2 y de señalización de pSTAT3.

Ensayos ELISA

Después de la adsorción, se prepararon reservas de glicerol y se extrajo el ADN policlonal. El gen que codifica la proteína de la cubierta pIX se escindió del conjunto de a Dn , lo que permite añadir una etiqueta de polihistidina (His) en marco al extremo C terminal del dominio Fab CH1. Después de la transformación en bacterias, se recogieron los clones individuales y se produjeron y recuperaron Fab del sobrenadante bacteriano. Los Fab se capturaron en placas MaxiSorp negras (Nunc, N° de Cat. 437111) con un anticuerpo Fd de oveja antihumano (CH1) (1 pg/ml) (The Binding Site, N° de cat. PC075). Después de lavar y bloquear, se añadieron a las placas 50 gl de sobrenadante bacteriano sin diluir que contenía el Fab. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Después de los lavados, se añadió huOSM o CynoOSM biotinilado diluido en serie a los pocillos, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual se detectó la señal usando SA-HRP (Invitrogen, N° de cat. 43-4323) y quimioluminiscencia.

Mediciones de EC50

Se sembraron células A375-S2 en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 25.000 células/pocillo en 200 pl en medio de crecimiento completo y se incubaron durante 24 horas. Las células se trataron con una solución que contenía 5 ng/ml de huOSM preincubado durante 3 horas a temperatura ambiente con mAb experimental diluido en serie 1:5 comenzando a 10 pg/ml. Se midió el STAT3 fosforilado (pSTSAT3) usando el kit de lisado de células completas Phospho-STAT3 (Ms D; N° de Cat. K150DID-1, Lote N° K0010570) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se obtuvieron las curvas de respuesta a la dosis de EC50 y se representaron como porcentaje normalizado de la señal pSTAT3.

Medición de afinidad por resonancia de plasmones de superficie (Biacore)

Se midieron las afinidades de unión usando Resonancia de plasmones de superficie (SPR) con un biosensor óptico Biacore 3000 (Biacore) usando constructos de OSM humanos o de Cyno como se ha descrito. Se preparó una superficie de biosensor acoplando una mezcla de anticuerpos anti-IgG Fc de anti-ratón (Jackson, N° de cat. 315-005-046) y antihumano (Jackson, N° de cat. 109-005-098) a la superficie de dextrano carboximetilada de un chip CM-5 (Biacore, N° de Cat. BR-1000-14) usando las instrucciones del fabricante para la química de acoplamiento de amina. Se inmovilizaron aproximadamente 19.000 RU (unidades de respuesta) de anticuerpo anti-OSM en cada una de las cuatro celdas de flujo. Los experimentos cinéticos se realizaron a 25° C en tampón de ejecución (DPBS P20 al 0,005% EDTA 3 mM). Se prepararon diluciones en serie de ECD de OSM humano y de Cyno de 100 nM a 0,412 nM en tampón de ejecución. Se capturaron alrededor de 200 RU de mAb en las celdas de flujo 2 a 4 del chip sensor. La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia. La captura de mAb fue seguida por una inyección de tres minutos (fase de asociación) de antígeno a 50 pl/min, seguida de 10 minutos de flujo de tampón (fase de disociación). La superficie del chip se regeneró mediante dos pulsos de inyecciones de 18 segundos de H3PO4 100 mM (Sigma, N° de cat. 7961) a 50 gl/min.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de maduración por afinidad de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completo o un fragmento del mismo, en donde el fragmento comprende por lo menos una región variable de la cadena pesada y región variable de la cadena ligera, en donde el método comprende los pasos de:

a. obtener una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo;