CN117659201A - 抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒 - Google Patents

抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒 Download PDF

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CN117659201A CN202211015035.3A CN202211015035A CN117659201A CN 117659201 A CN117659201 A CN 117659201A CN 202211015035 A CN202211015035 A CN 202211015035A CN 117659201 A CN117659201 A CN 117659201A
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钟冬梅
覃文新
游辉
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Abstract

本发明公开了抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒，涉及抗体领域。本发明公开的抗***抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为***的检测提供了重要的原料来源，具有提高的亲和力和活性。

Description

抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒。
背景技术
***(Cocaine，COC)是一种莨菪烷型生物碱，提炼自古柯叶，又称古柯碱，多呈白色晶体状，无臭，味苦而麻，是人类发现的第一种具有局麻作用的天然生物碱，为长效酯类局麻药，脂溶性高，穿透力强，对神经组织亲和性良好，产生良好的表面麻醉作用。在医学中，曾被用作局部***或血管收缩剂。
***可增加警觉性，引起欣快感，使用后会感觉精力充沛，但其滥用会造成人体对药物的依赖型，长期小剂量滥用可导致人体慢性中毒，对消化***、免疫***、心血管***和泌尿生殖***都有损伤作用，尤其作为剂量依赖性肝毒素，可导致肝细胞坏死。长期使用量大者常觉得紧张、生病、无法放松、焦躁易怒、视力模糊、盗汗、耳鸣、抽筋、失去协调性，而导致人格异常或妄想性精神病症状，若突然停用，就会出现不安、焦虑、忽冷忽热、起鸡皮疙瘩、流泪、流涕、出汗、恶心、腹痛等，并可能发生严重的忧郁及昏昏欲睡现象即为成瘾发作症状。这种戒断反应的痛苦，反过来又促使吸毒者为避免这种痛苦而千方百计地维持吸毒状态，故国家将其列为管制药品，明令禁止非法使用。建立***的快速检测方法，对于禁毒、毒物检测、刑事鉴定等具有非常重要的实践意义和应用价值。
目前，***的检测方法主要有胶体金免疫层析法，具有快速，操作简单等优点，在滥用药物后24h内即可检出，其是基于抗体和抗原的特异性反应，同时利用胶体金对被检测信号进行放大和显示的一种免疫学检测方法，而获得抗***的抗体是研制胶体金免疫层析试纸的关键。
因此，本领域对于有效且特异性结合***并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供抗***抗体或其功能性片段、检测***的试剂和试剂盒。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括(a)～(c)中的任意一种：(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示或如SEQ ID No:1、2和4所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如以下任意项所示：SEQ ID No:5、7和8；SEQ ID No:6、7和8；SEQ ID No:5、7和9；SEQ ID No:6、7和9；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:10～14任一项所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:21～24任一项所示的轻链可变区；
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～3和LCDR1～3。
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述实施例所述的抗体偶联物。
第四方面，本发明实施例提供了一种检测***的方法，其包括：将如前述实施例所述的抗体或其功能性片段与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的***接触，形成免疫复合物。
第五方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第六方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。
第七方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体。
第八方面，本发明实施例提供了一种制备前述实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养前述实施例所述的细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开的抗***抗体包括上述重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为***的检测提供了重要的原料来源，具有提高的亲和力和活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-COC 7F10的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示或如SEQ ID No:1、2和4所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如以下任意项所示：SEQ ID No:5、7和8；SEQ ID No:6、7和8；SEQ ID No:5、7和9；SEQ ID No:6、7和9。在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，重链可变区中含有的3个CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，轻链可变区中含有的3个CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号***。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明实施例采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:10～14任一项所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:21～24任一项所示的轻链可变区。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～3和LCDR1～3。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:10～14任一项所示的重链可变区中的重链框架区，和SEQ ID NO:21～24任一项所示的轻链可变区中的轻链框架区。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:15所示或与其具有至少80％的同一性。
在可选的实施方式中，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:25所示或与其具有至少80％的同一性。
具体地，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ ID NO:15或25)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原***二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:16～20任一项所示的重链，和氨基酸序列如SEQ IDNO:26～29任一项所示的轻链。
在可选的实施方式中，前述实施例所述的抗体或其功能性片段以KD＜8.75×10- 08M的亲和力结合***。
在可选的实施方式中，前述实施例所述的抗体或其功能性片段以KD≤10-08M、KD≤10-09M、KD≤10-10M、KD≤10-11M或KD≤10-12M的亲和力结合***。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体。抗体偶联物中，所述抗体偶联至固相载体。
在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述固相载体为硝酸纤维素膜。
另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物。含有所述抗体或其功能性片段的检测试剂或试剂盒具有改善的检测灵敏度和特异性。
另一方面，本发明实施例还提供了一种检测***的方法，其包括：
将如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的***接触，形成免疫复合物。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与***结合。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在检测***或制备检测***的产品中的应用。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：毒物检测、刑事鉴定等中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
另一方面，本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段。
另一方面，本发明实施例还提供了一种载体，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸。
另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的载体。
另一方面，本发明实施例还提供了一种制备如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如前述任意实施例所述的细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-COC 7F10单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由基因测序公司完成。
1.表达质粒构建
1.1、Anti-COC 7F10抗体基因制备
从分泌Anti-COC 7F10单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，并将其***到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因的阳性克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
1.2、Anti-COC 7F10抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为336bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为363bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
1.3、重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体经改造引入多克隆酶切位点，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-COC 7F10抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有限制性内切酶酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.74kb的Light Chain基因片段和1.42kb的HeavyChain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用限制性内切酶进行双酶切，3.4A载体采用限制性内切酶进行双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和LightChain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2.稳定细胞株筛选
2.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至40μg/100μL，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液(主要成分NaHCO3)稀释COC-BSA至2μg/mL，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔)，加入显色液B液(50μL/孔)，10min；加入终止液，50μL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对COC-BSA有活性。用上述相同方法检测细胞上清与BSA的反应性，结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD小于0.1，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对BSA无活性，进一步证明细胞上清对COC有活性。
备注：A液(主要成份柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)；B液(主要成份柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)；终止液(EDTA·2Na+浓H2SO4)。
2.2重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100ug/管、PvuⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
2.3重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至40μg/100μL，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2mL进行批培养，细胞密度0.3×106cells/mL，2mL进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3.重组抗体生产
3.1细胞扩培
细胞复苏之后先在125mL规格的摇瓶中培养，接种体积为30mL，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/mL接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/mL左右进行生产。
3.2摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取3μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2亲和力及活性优化
实施例1得到的Anti-COC 7F10单克隆抗体虽然具备结合***的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。得到如下单克隆抗体Anti-COC-7F10RMb1～Anti-COC-7F10RMb6，其重链和轻链氨基酸序如下：
表1抗体序列
样品名称 重链序号 轻链序号
Anti-COC-7F10RMb1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:26
Anti-COC-7F10RMb2 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:26
Anti-COC-7F10RMb3 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:26
Anti-COC-7F10RMb4 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:27
Anti-COC-7F10RMb5 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:28
Anti-COC-7F10RMb6 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:26
实施例3亲和力分析
利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10μg/ml，COC-BSA用PBST进行梯度稀释。
运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3(PBST)进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。PBST主要成分Na2HPO4+NaCl+TW-20)。结果可知：Anti-COC-7F10RMb1至Anti-COC-7F10RMb5亲和力优于Anti-COC-7F10RMb6和对照抗体。
表2亲和力分析数据
样品名称 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
对照抗体 8.75E-08 2.89E+04 2.53E-03
Anti-COC-7F10RMb1 6.66E-09 9.69E+04 6.45E-04
Anti-COC-7F10RMb2 6.42E-09 8.79E+04 5.64E-04
Anti-COC-7F10RMb3 7.86E-09 6.79E+04 5.33E-04
Anti-COC-7F10RMb4 6.96E-09 8.19E+04 5.70E-04
Anti-COC-7F10RMb5 6.48E-09 8.69E+04 5.63E-04
Anti-COC-7F10RMb6 6.00E-08 1.33E+04 7.98E-04
实施例4活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释COC-BSA至2μg/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成分Na2HPO4+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100μL/孔，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔)，加入显色液B液(50μL/孔)，10min；加入终止液，50μL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
备注：A液(主要成分柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)；B液(主要成分柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)；终止液(EDTA·2Na+浓H2SO4)。
表3活性数据
浓度(ng/ml) 3.906 1.953 0.977 0.488 0.244 0
对照抗体 1.336 0.791 0.415 0.241 0.131 0.068
Anti-COC-7F10RMb1 1.746 1.443 0.883 0.466 0.219 0.079
Anti-COC-7F10RMb2 1.756 1.465 0.895 0.487 0.239 0.033
Anti-COC-7F10RMb3 1.646 1.315 0.793 0.396 0.179 0.065
Anti-COC-7F10RMb4 1.716 1.398 0.852 0.455 0.208 0.074
Anti-COC-7F10RMb5 1.709 1.354 0.837 0.402 0.184 0.032
Anti-COC-7F10RMb6 1.422 0.821 0.463 0.267 0.138 0.072
实施例5抗体稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明表达的抗体稳定。下表为考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性数据
样品浓度(ng/ml) 1.953 0.488 0
4℃，21天样品 1.421 0.432 0.032
-80℃，21天样品 1.476 0.479 0.023
37℃，21天样品 1.410 0.422 0.053
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：
/>

Claims (11)

1.一种抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括(a)～(c)中的任意一种：
(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示或如SEQ ID No:1、2和4所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如以下任意项所示：SEQ ID No:5、7和8；SEQ ID No:6、7和8；SEQ ID No:5、7和9；SEQ ID No:6、7和9；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:10～14任一项所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:21～24任一项所示的轻链可变区；
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～3和LCDR1～3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段以KD＜8.75×10-08M的亲和力结合***。
3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种；
可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:15所示或与其具有至少80％的同一性；
可选地，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:25所示或与其具有至少80％的同一性；
可选地，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:16～20任一项所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:26～29任一项所示的轻链。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
5.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种；
可选地，所述标记物为胶体金。
6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段或如权利要求5所述的抗体偶联物。
7.一种检测***的方法，其特征在于，其包括：
将如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的***接触，形成免疫复合物；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与***结合。
8.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段。
9.一种载体，其特征在于，其含有权利要求8所述的核酸。
10.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。
11.一种制备权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的细胞。
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