ES2824101T3 - Anticuerpo anti-RANKL humano, anticuerpo humanizado del mismo, y composición farmacéutica y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-RANKL humano que es capaz de unirse específicamente con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-RANKL humano, anticuerpo humanizado del mismo, y composición farmacéutica y uso de los mismos

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente China N° 201310753972.3, presentada el 31 de diciembre de 2013.

Antecedentes

Los huesos humanos son un sistema dinámico en constante cambio. Después de que los osteoclastos absorban esclerotina, los osteoblastos generan esclerotina y, por tanto, se completa un ciclo normal de remodelación ósea. La tasa de remodelación ósea está en un intervalo de 2% a 10% anual para un adulto. En circunstancias normales, se mantiene un equilibrio dinámico entre la absorción ósea y la formación de hueso (metabolismo óseo), pero se produce demasiada esclerotina (osteosclerosis) o muy poca esclerotina (osteoporosis) después de que se rompe el equilibrio entre osteoclastos y osteoblastos.

Las señales de diferenciación para osteoclastos son transferidas por osteoblastos/células madre mesenquimales. Las señales para inducir la formación de osteoclastos se transfieren a los osteoblastos/células madre mesenquimales a través de varios factores para estimular la absorción ósea para inducir la expresión del factor de diferenciación de osteoclastos 1 (abreviado como ODF-1) en su membrana. ODF-1 también se conoce como el ligando del receptor activador del factor del factor nuclear kB (abreviado como RANKL). RANKL es capaz de unirse directamente con el receptor de diferenciación y activación de osteoclastos (abreviado como ODAR) en la membrana de los precursores de osteoclastos para transferir señales a los precursores de osteoclastos, provocando así reacciones en cascada y estimulando la diferenciación, formación y maduración de los osteoclastos. ODAR también se conoce como el receptor activador del factor del factor nuclear kB (abreviado como, RANK). En el proceso del metabolismo óseo, el sistema OPG/RANKL/RANK es una ruta de señalización clave que desempeña un importante papel modulador. Se ha informado en la bibliografía que algunas enfermedades óseas metabólicas sistémicas tales como la osteoporosis, enfermedad reumatoide, cáncer, fracturas y otras enfermedades se curan mejorando la actividad de remodelación ósea, que está estrechamente relacionada con el sistema RANK/RANKL/OPG.

Muchas enfermedades ocurren debido a la pérdida ósea causada por el aumento del número de osteoclastos y (o) la mejora de la actividad de los osteoclastos, como la osteoporosis posmenopáusica y senil, cáncer complicado por hipercalcemia humoral, metástasis tumoral, enfermedad ósea de Paget, artritis reumatoide, hiperparatiroidismo y autólisis ósea alrededor de la prótesis. Dado que los niveles de estrógenos disminuyen después de la menopausia, la expresión génica de IL-21, IL-26, TNF-a aumenta, se promueve la proliferación, diferenciación e integración de los osteoclastos, se inhibe la apoptosis de los osteoclastos, aumenta la absorción ósea, el acoplamiento del metabolismo óseo está desequilibrado y, por tanto, se produce la osteoporosis.

Las enfermedades de osteoporosis se tratan en dos enfoques principales como sigue: (i) promover la formación ósea de osteoblastos; (ii) inhibir la absorción ósea de osteoclastos. La formación y la actividad de los osteoclastos se pueden inhibir bloqueando una ruta de señalización de RANKL/RANK, se bloquea la absorción ósea y, por lo tanto, se tratan las enfermedades de osteoporosis, lo que ha demostrado ser una forma factible. Prolia producido por Amgen es un anticuerpo monoclonal anti-RANKL humano (RANKL humano o hRANKL) completamente humanizado obtenido inmunizando ratones transgénicos XenoMouse™ contra IgG humana, que puede bloquear la ruta de señalización de RANKL/RANK, inhibir eficazmente la formación y actividad de osteoclastos y bloquear la absorción ósea y la destrucción ósea. Prolia fue aprobado por la FDA de EE.UU. para su uso en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica en mujeres en 2010. Prolia también está aprobado para su uso en el tratamiento de la pérdida ósea relacionada con el cáncer de próstata en Europa. La eficacia clínica de Prolia confirma que el anticuerpo contra RANKL como fármaco de anticuerpo monoclonal es un nuevo objetivo para el tratamiento de una serie de enfermedades del metabolismo óseo, tales como la pérdida de masa ósea debido al aumento de la actividad de los osteoclastos.

Con ventajas de alta especificidad, efectos secundarios pequeños y efectos curativos obvios, el fármaco de anticuerpos monoclonales se ha convertido en una herramienta importante contra el cáncer, las enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias para los pacientes. Actualmente, la tecnología de fusión celular e hibridoma sigue siendo el método más confiable para preparar un anticuerpo monoclonal, que generalmente se usa para inmunizar animales tales como ratones, ratas, ovejas y conejos. El murino se usa con mayor frecuencia, que incluye ratas y ratones. El anticuerpo monoclonal obtenido con el método es de origen animal, y debe realizarse la modificación de humanización en anticuerpos monoclonales de origen animal para desarrollar los anticuerpos monoclonales de origen animal para que sean fármacos de anticuerpos aplicados a seres humanos, reduciendo así las respuestas de anticuerpos humanos anti-animal (abreviado como HAAA) causadas por un anticuerpo heterólogo, activando de manera más efectiva el sistema inmunitario del cuerpo, reduciendo la tasa de eliminación del fármaco de anticuerpo y extendiendo la semivida del fármaco de anticuerpo.

Las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo (abreviadas como CDR) son regiones donde el anticuerpo interacciona con los aminoácidos del epítopo en la molécula de antígeno bajo el soporte de las regiones armazón del anticuerpo (abreviadas como FR). El acoplamiento molecular preciso de las CDR y los epítopos del antígeno prepara la base molecular para la afinidad y especificidad del anticuerpo, y la conformación en las CDR del anticuerpo parental natural representa la mayor afinidad y la mejor especificidad de unión al antígeno. Teóricamente, el cambio de aminoácidos en las FR puede hacer que cambie la conformación en las CDR, disminuyendo así la afinidad. Los estudios han demostrado que, entre todos los aminoácidos en las FR, el reemplazo humanizado de la mayoría de los aminoácidos tiene solo un ligero efecto sobre la conformación en las CDR, y la afinidad del anticuerpo no se ve seriamente afectada, pero hay algunos aminoácidos cruciales. Una vez que estos aminoácidos cruciales se reemplazan con los correspondientes aminoácidos humanos, la conformación en las CDR cambia significativamente y, por lo tanto, la afinidad del anticuerpo disminuye seriamente.

Edward M Schwarz et al. (Arthritis research & therapy, 2007-01-01, páginas S7-S7) describieron un anticuerpo anti-RANKL completamente humano denosumab/AMG162 para el tratamiento de enfermedades óseas. El anticuerpo denosumab/AMG162 incluye la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4

El documento WO 03/002713 describía un anticuerpo anti-RANKL aOPGL-1. Dicho anticuerpo es el mismo del anticuerpo de referencia denosumab/AMG162.

El documento WO2010/022120 describía varios anticuerpos anti-RANKL y utilizaba denosumab como el anticuerpo de control. Sin embargo, los anticuerpos anti-RANKL descritos en este documento no tienen una afinidad de unión al antígeno satisfactoria.

El documento WO 2011/017294 describía también anticuerpos anti-RANKL. Sin embargo, estos anticuerpos no tienen una afinidad de unión al antígeno satisfactoria.

El documento WO 2012/163387 describía un nuevo anticuerpo (ALX-0140) dirigido a RANKL, que incluye dos unidades de nanocuerpos anti-RANKL y un nanocuerpo anti-HAS. Sin embargo, considerando su estructura antinatural, dicho anticuerpo podría tener riesgo de desarrollar inmunogenicidad no deseada.

El documento CN 103965357 describía un anticuerpo anti-RANKL desarrollado por tecnología de evolución macular artificial programada. Sin embargo, este anticuerpo no muestra una inhibición satisfactoria de la osteoclastogénesis inducida por RANKL.

El documento CA 2831 247 describía un agente inmunopotenciador para el cáncer que contiene un antagonista de RANKL y el uso del anticuerpo neutralizante anti-RANKL.

Compendio

El problema técnico subyacente de la invención es proporcionar un anticuerpo anti-RANKL humano, un anticuerpo humanizado para el anticuerpo anti-RANKL humano, una composición farmacéutica y un uso del mismo.

En un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-RANKL humano de acuerdo con la invención, y el anticuerpo anti-RANKL humano es capaz de unirse específicamente con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la región variable de dicho anticuerpo en una cadena pesada de un anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y la región variable de dicho anticuerpo en una cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

Se describe, pero fuera del alcance de la invención, una región variable en una cadena pesada de un anticuerpo anti-RANKL humano que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2-5, 7-9; y una región variable en una cadena ligera de un anticuerpo anti-RANKL humano que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10-13, 15-17.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano es un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo humanizado o anticuerpos monoclonales murinos obtenidos mediante la técnica del hibridoma.

La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-RANKL humano y a células hospedantes que contienen los ácidos nucleicos.

La invención se refiere además a un método para preparar o producir el anticuerpo anti-RANKL humano, los ácidos nucleicos, las células hospedantes, la producción y la composición descritas en la invención.

Se describe, pero fuera del alcance de la invención, un anticuerpo humanizado para un anticuerpo anti-RANKL humano, que el anticuerpo humanizado es capaz de unirse específicamente con RANKL humano, una región variable en una cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, NO: 23, NO: 25, NO: 27 o NO: 29, y una región variable en una cadena ligera se selecciona de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, NO: 31, NO: 33, NO: 35, NO: 37 o NO: 39.

En algunas realizaciones, una región constante en la cadena pesada del anticuerpo anti-RANKL humano se selecciona de IgG2 humana, y una región constante en la cadena ligera se selecciona de Kappa humana; o, una región constante en la cadena pesada del anticuerpo anti-RANKL humano se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, y una región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado es un segmento de unión al antígeno seleccionado de scFv, (scFv)2, Fab, Fab' o F (ab')2.

En algunas realizaciones, una cadena pesada completa del anticuerpo anti-RANKL humano es una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y/o una cadena ligera completa es una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

En un tercer aspecto, se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, y los ingredientes activos de la composición farmacéutica incluyen el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado.

En un cuarto aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-RANKL humano para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de pérdida ósea según la invención.

Se describe, pero fuera del alcance de la invención, un método para mejorar las afecciones de pacientes con enfermedades de pérdida ósea o tratar pacientes con enfermedades de pérdida ósea, y el método incluye proporcionar a los pacientes una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o la composición farmacéutica.

Hay tres formas de proteína RANKL humana natural en el cuerpo, que incluyen una proteína transmembrana de longitud completa, una proteína de unión a la membrana sin área intracelular y una proteína soluble (desde Gly en la posición 136 hasta Asp en la posición 317, un total de 182 aminoácidos). Los estudios han mostrado que RANKL existe principalmente en la superficie de osteoblastos en una forma transmembrana en condiciones fisiológicas, pero en condiciones patológicas, RANKL en la forma transmembrana es cortada de la superficie de los osteoblastos por la metaloproteinasa 14 de la matriz (MMP14) y la metaloproteasa 10 (ADAM10), y se libera una proteína RANKL soluble, dando así como resultado un aumento significativo de RANKL soluble en el ciclo y mejora de la actividad de los osteoclastos. Por tanto, según la invención, la proteína RANKL soluble se utiliza como un antígeno, los anticuerpos monoclonales de ratón anti-RANKL humano se obtienen mediante inmunización de ratones y tecnología de fusión de hibridomas mediante una serie de cribados, y se confirma que estos anticuerpos murinos no sólo se unen específicamente con RANKL humano, sino que también tienen una reacción inmunitaria cruzada con el RANKL de macaco cangrejero, pero no tienen una reacción inmunitaria cruzada con RANKL murino. Más importante aún, a través de experimentos de unión competitiva entre RANK y un receptor de RANKL respectivo, se obtienen mediante cribado los anticuerpos monoclonales que pueden bloquear la unión RANKL/RANK, y sus capacidades de bloqueo no son menores o son incluso mejores que el Denosumab. Estos anticuerpos pueden inhibir eficazmente la diferenciación en osteoclastos inducida por RANKL in vitro. Por consiguiente, se cree que estos anticuerpos monoclonales deberían inhibir eficazmente la absorción ósea y la osteoporosis in vivo. Los anticuerpos murinos se reconstruyen mediante transformación humanizada o quimérica humano-ratón, o los anticuerpos murinos se unen con un antígeno e incluyen fragmentos de anticuerpos que tienen efecto neutralizante, y los anticuerpos murinos se producen cultivando sistemáticamente células de mamífero o células procariotas. Por tanto, los anticuerpos murinos se convierten en fármacos de anticuerpos monoclonales adecuados para el tratamiento en farmacología clínica.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra secuencias de nucleótidos de RANKL humano recombinante construido (SEQ ID NO: 101).

La Fig. 2 muestra una curva de unión del anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL y RANKL humano.

La Fig. 3 muestra una curva de unión del anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL y RANKL de mono.

La Fig. 4 muestra una curva de anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL que inhibe la unión entre RANKL y RANK-Fc.

La Fig. 5 muestra una curva de anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL que inhibe la actividad de diferenciación de células RAW264.7 inducida por RAn Kl humano.

La Fig. 6 muestra un diagrama esquemático del plásmido scFv pFL249-7.19.12.

La Fig. 7 muestra un electroforetograma para el cribado por PCR de una colonia en una biblioteca de mutaciones de VH de un primer lote.

La Fig. 8 muestra un electroforetograma para el cribado por PCR de una colonia en una biblioteca de mutaciones de VH de un segundo lote.

La Fig. 9 muestra un electroforetograma para el cribado por PCR de una colonia en una biblioteca de mutaciones de VL.

La Fig. 10 muestra los resultados del cribado mediante ELISA en la biblioteca de VH.

La Fig. 11 muestra los resultados del cribado mediante ELISA en la biblioteca de VL.

La Fig. 12 muestra un mapa plasmídico esquemático para la cadena pesada H16.

La Fig. 13 muestra el mapa plasmídico esquemático de la cadena ligera Kappa L10.

Las Figs. 14A-14C muestran la comparación de la actividad de unión entre el anticuerpo humanizado y hRANKL.

Las Figs. 15A-15C muestran la comparación de la actividad del anticuerpo humanizado que inhibe competitivamente la unión entre hRANKL y RANK-Fc.

Las Figs. 16A-16D muestran la comparación de la actividad del anticuerpo humanizado que inhibe la diferenciación de las células RAW264.7 en osteoclastos.

La Fig. 17 muestra los resultados del anticuerpo humanizado que inhibe la fosforilación de ERK1/2 en las células RAW264.7 inducida por hRANKL.

Descripción detallada

A menos que se indique o defina lo contrario, todos los términos usados tienen el significado habitual en la técnica, el significado debe ser entendido por los expertos en la técnica. Se hace referencia a manuales convencionales, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2a edición), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990); y Roitt et al., "Immunology" (2 a edición), Gower Medical Publishing, Londres, Nueva York (1989), así como la técnica anterior general citada en este documento. Además, a menos que se indique lo contrario, todos los métodos, etapas, tecnología y operaciones no descritos en detalle se pueden y se han llevado a cabo de una manera conocida, lo que debería ser entendido por los expertos en la técnica. También se hace referencia a otras referencias citadas en manuales convencionales y la técnica anterior general mencionada anteriormente.

A menos que se indique lo contrario, el término "inmunoglobulina" y "anticuerpo" se refieren a inmunoglobulinas intactas y fragmentos inmunológicamente activos que son capaces de unir el antígeno requerido. Las inmunoglobulinas y los fragmentos inmunológicamente activos (unión de antígeno) incluyen sitios de unión a epítopos (es decir, sitios de unión específicos de antígeno o epítopos que pueden ser identificados por anticuerpos). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, F (v), Fab', F (ab')2, "media molécula" derivada de la reducción de enlaces disulfuro de las inmunoglobulinas, inmunoglobulinas monocatenarias u otros fragmentos de unión al antígeno adecuados (véase, p. ej., Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., PMS, (EE.UU.), 85:. 5879 (1988); Webber et al., Mol Immunol, 32: 249 (1995)). El anticuerpo o los fragmentos inmunológicamente activos pueden derivar de un animal (p. ej., un roedor, como un ratón o rata) o ser quiméricos (véase Morrison et al., PNAS, 81 : 6851 (1984); Jones et al., Nature, 321: 522 (1986)). Además, generalmente debe entenderse que el término "secuencia" (p. ej., en las expresiones "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia de anticuerpo" o "secuencia de proteína" y similares) utilizado en el presente documento incluye la secuencia de aminoácidos relevante y un secuencia de ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos, a menos que se requiera una interpretación más limitada en el presente documento.

El término "dominio"/"región" (de polipéptido o proteína) usado en el presente documento se refiere a un dominio de proteína plegado, que puede mantener su estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, un dominio es responsable de una propiedad funcional individual de la proteína y se puede añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin dañar el resto de la proteína y/o la función del dominio en muchos casos.

La expresión "dominio variable de anticuerpo" utilizado en el presente documento se refiere a tres "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR", es decir, "región determinante de complementariedad I" o "CDR1", "región determinante de complementariedad 2" o "CDR2", y "región determinante de complementariedad 3" o "CDR3" sustancialmente en la técnica y en lo sucesivo. La especificidad del anticuerpo por el antígeno se genera ya que las regiones variables del anticuerpo tienen sitios de unión al antígeno.

La unión específica de una proteína de unión a antígeno con un antígeno o epítopo puede medirse de cualquier manera conocida adecuada, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (tal como inmunoensayo de radiación (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA) y análisis de competición tipo sándwich) y diferentes variaciones conocidas en la técnica.

Como es bien conocido en la técnica, los restos de aminoácidos se indican mediante el código de aminoácidos estándar de consenso de tres letras o de una letra. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, la expresión "diferencia de aminoácidos" se refiere a la inserción, deleción o sustitución de un número específico de aminoácidos en una determinada posición en la secuencia de referencia en comparación con la segunda secuencia. En un caso de sustitución, la sustitución es preferiblemente sustitución de aminoácidos conservadora, el aminoácido conservador se refiere a un aminoácido en el que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido con una estructura química similar, y la sustitución tiene efecto menor o sustancialmente ningún efecto sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. La sustitución conservadora de aminoácidos es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, según el documento WO98/49185, la sustitución conservadora de aminoácidos se implementa preferiblemente sustituyendo un resto de aminoácido en los siguientes grupos (i) -(v) por otro resto de aminoácido en el mismo grupo. Los siguientes grupos (i) -(v) incluyen: (i) restos pequeños alifáticos no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) restos polares cargados negativamente y sus amidas (no cargadas): Asp, Asn, Glu y Gln; (iii) restos polares cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) restos grandes no polares alifáticos: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (V) restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Específicamente preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen: Ala sustituida por Gly o Ser; Arg sustituida por Lys; Asn sustituida por Gln o His; Asp sustituido por Glu; Cys sustituida por Ser; Gln sustituida por Asn; Glu sustituido por Asp; Gly sustituida por Ala o Pro; His sustituida por Asn o Gln; Ile sustituida por Leu o Val; Leu sustituida por Ile o Val; Lys sustituida Arg, Gln o Glu; Met sustituida por Leu, Tyr o Ile; Phe sustituida por Met, Leu o Tyr; Ser sustituida por Thr; Thr sustituida por Ser; Trp sustituido por Tyr; Tyr sustituida por Trp o Phe; Val sustituida por Ile o Leu.

Los expertos en la técnica pueden determinar las variantes apropiadas de los polipéptidos mencionados en el presente documento aplicando el conocimiento común. En algunas realizaciones, los expertos en la técnica pueden identificar una región que no se considera importante para la actividad mediante la guía y pueden cambiar pero no destruir las partes apropiadas de la molécula activa. En algunas realizaciones, pueden identificarse restos conservadores y porciones de moléculas entre polipéptidos similares. En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos también se pueden llevar a cabo en la región importante para la actividad biológica o la estructura sin destruir la actividad biológica o afectar adversamente a la estructura del polipéptido.

Además, los expertos en la técnica pueden revisar estudios de estructura y función, identificar restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. Se considera que con dicha comparación se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína, lo que es equivalente a los restos de aminoácidos en proteínas similares que son importantes para la actividad o estructura. Tales restos de aminoácidos importantes previstos pueden sustituirse por aminoácidos químicamente similares para los expertos en la técnica.

Los expertos en la técnica también pueden analizar una estructura tridimensional y una secuencia de aminoácidos relacionada con estructuras en los polipéptidos similares. Según dicha información, los expertos en la técnica pueden predecir el alineamiento de las secuencias de aminoácidos en la estructura tridimensional del anticuerpo. En algunas realizaciones, los expertos en la técnica pueden no cambiar los restos de aminoácidos previstos en la superficie de la proteína, porque tales restos juegan un papel en interacciones importantes con otras moléculas. Además, los expertos en la técnica pueden preparar variantes experimentales que incluyen una sustitución de un solo aminoácido en los restos de aminoácidos deseados, y luego estas variantes se pueden cribar mediante ensayos de actividad bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas variantes también pueden usarse para recopilar información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se encuentra que el cambio de un resto de aminoácido particular da como resultado la destrucción no deseada reducida o una actividad inadecuada, tal cambio puede evitarse. En otras palabras, basándose en la información obtenida de tales experimentos de rutina, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente qué sustituciones deben evitarse, ya sea solas o junto con otras mutaciones.

Se ha publicado un gran número de publicaciones científicas sobre predicción de estructuras secundarias. Ver Moult J, Curr. Opin. Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47: 45-148 (1978).); Chou et al., Ann. Rev. Biochem, 47: 251-276, y Chou et al. Biophys. J, 26: 367-384 (1979). Además, está disponible actualmente la predicción de estructura secundaria asistida con programas informáticos. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la simulación de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas con secuencias de más de 30% de identidad "I" o similitud mayor de 40% normalmente tienen una topología estructural similar. El crecimiento más reciente de la base de datos de estructuras de proteínas (PDB) proporciona una capacidad de predicción mejorada de estructuras secundarias, incluido el número de posibles plegamientos en estructuras de polipéptidos o proteínas. Véase, Holm et al., Nucí. Acid. Res, 27 (I): 244-247 (1999). Se propone (Brenner et al., Curr.0p.Struct.Biol,. 7 (3): 369-376 (1997)) que existe un número limitado de plegamientos en los polipéptidos o proteínas dados, y la predicción de la estructura se vuelve más precisa de forma adecuada una vez que se determina el número crítico de plegamientos.

Los métodos adicionales para predecir estructuras secundarias incluyen "enhebrado" ("threading”) (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7 (3): 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15-19 (1996)), "análisis gráfico" (Bowie et al., Science, 253: 164170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym, 183: 146-159 (1990).); Gribskov et al., Proc.NatAcad. Sci, 84 (13): 4355-4358 (1987)), y la "clave evolutiva" (véase, Holm, el mencionado anteriormente (1999), y Brenner, el mencionado anteriormente (1997)).

El término "polipéptido" como término genético se refiere a proteínas nativas o secuencias nativas con la deleción, adición y/o sustitución de uno o más aminoácidos. El término "polipéptido" también incluye el anticuerpo contra RANKL o una CDR del mismo (como se describe a continuación, SEQ ID NO: 2-9 y SEQ ID NO: 10-17), o secuencias con la deleción, adición y/o sustitución de uno o más aminoácidos.

Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable VH y tres dominios de región constante CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está ubicado en el extremo amino de un polipéptido, el dominio CH3 está ubicado en el extremo carboxi de un polipéptido. La expresión "cadena pesada" utilizado en el presente documento incluye la cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma.

Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable y dominios de región constante. De manera similar a la cadena pesada, el dominio de la región variable de la cadena ligera está ubicado en el extremo amino de un polipéptido. La expresión "cadena ligera" utilizado en el presente documento incluye la cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma. Los anticuerpos monocatenarios son moléculas Fv, en las que las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera están conectadas a través de conectores flexibles para formar un polipéptido monocatenario que forma una región de unión al antígeno. Los anticuerpos monocatenarios se describen en detalle en el documento WO88/01649 y patentes de EE.UU. N° 4946778 y 5260203.

En algunas realizaciones, se entiende generalmente que cada sitio de unión es el mismo, para anticuerpos divalentes en lugar de anticuerpos "multiespecíficos" o "multifuncionales".

En el caso de que una cantidad excesiva de anticuerpos reduzca la cantidad de unión del receptor con el anti-receptor en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más (basado en un ensayo de unión competitivo in vitro), el anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión entre el receptor y los ligandos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. En algunas realizaciones, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo. En algunas realizaciones, los determinantes de epítopos pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. El epítopo es una región donde el anticuerpo se une al antígeno. En algunas realizaciones, se considera que el anticuerpo se une específicamente al antígeno en el caso de que se reconozca preferentemente el antígeno diana en la mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término "agente" utilizado en el presente documento se refiere a un compuesto, mezcla de compuestos, una macromolécula biológica o extractos preparados a partir de una sustancia biológica.

El término "marcador" o "marcado" utilizado en el presente documento se refiere a la inserción de un marcador detectable, p. ej., inserción de un aminoácido radiomarcado o un polipéptido de biotina de conexión detectable por la proteína anti-biotina marcada (p. ej., proteína de estreptavidina anti-biotina que incluye un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante un método de detección óptico o colorimétrico). En algunas realizaciones, las etiquetas o marcadores también pueden ser terapéuticos. Se conocen en la técnica y se pueden usar varios métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores de polipéptido incluyen, pero no se limitan al grupo de: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), agente quimioluminiscente, un grupo de biotina, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un segundo indicador molecular (tal como secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, marcadores de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores están conectados por espaciadores de varias longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

La expresión "muestra biológica" utilizada en el presente documento incluye, pero no se limita a cualquier cantidad de sustancias de un ser vivo o un ser vivo anterior. Dicho ser vivo incluye, pero no se limita a seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen, pero no se limitan a sangre, suero, orina, células, tejidos, órganos, huesos, médula ósea, ganglios linfáticos y piel.

La expresión "enfermedades osteopénicas" incluye, pero no se limita a osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Paget, metástasis osteolíticas, periodontitis, artritis reumatoide y pérdida ósea debido a la fijación. Además de estas enfermedades de los huesos, se sabe que algunos cánceres aumentan la actividad de los osteoclastos e inducen la absorción ósea, tales como el cáncer de mama, cáncer de próstata y mieloma múltiple. En la actualidad, se sabe que estos cánceres producen factores que conducen a la sobreexpresión de RANKL en el hueso y conducen a un aumento en el número y la actividad de los osteoclastos.

El término "medicamento o fármacos" se refiere a un compuesto o composición que induce un efecto terapéutico deseado cuando se administra correctamente al paciente.

El término "modulador" se refiere a compuestos para cambiar la actividad o función de la molécula. Por ejemplo, en comparación con el valor de la actividad o función en ausencia de moduladores, los moduladores pueden producir el aumento o la disminución de algunos valores de actividad o función. En algunas realizaciones, el modulador es un inhibidor, que reduce al menos un valor de actividad o función de la molécula. Algunas actividades y funciones de ejemplo de las moléculas incluyen, pero no se limitan a afinidad de unión, actividad enzimática y transducción de señales. Algunos inhibidores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o pequeñas moléculas orgánicas, donde los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO01/83525.

La expresión "sustancialmente puro" significa que la sustancia objeto existe predominantemente (p. ej., las sustancias objeto son más abundantes que cualquier otra de diversas sustancias en la composición en una base molar). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la sustancia objeto representa al menos aproximadamente 50% (relación molar) de todas las sustancias macromoleculares. En algunas realizaciones, una composición sustancialmente pura incluye aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o más de 99% de todas las sustancias macromoleculares presentes en la composición. En algunas realizaciones, la sustancia objeto se purifica para que sea sustancialmente homogénea (las impurezas en la composición no pueden detectarse mediante métodos de detección convencionales) y la composición consiste esencialmente en una única sustancia macromolecular.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y animales.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos monoclonales murinos anti-RANKL humano. En algunas realizaciones, se proporcionan secuencias de aminoácidos que corresponden especialmente a la región variable y secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos, que incluyen inmunoglobulinas con una cadena pesada y una cadena ligera. En algunas realizaciones, se proporcionan secuencias que corresponden a regiones determinantes de complementariedad (CDR), especialmente desde CDR1 a CDR3. Según algunas realizaciones, se proporcionan además líneas celulares de hibridoma para expresar dichas moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano mencionado anteriormente.

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere principalmente a un anticuerpo de reexpresión después de que el anticuerpo monoclonal murino se modifique por clonación de genes y tecnología de ADN recombinante, para lo cual la mayoría de las secuencias de aminoácidos se reemplazan por secuencias humanizadas, se retienen sustancialmente la afinidad y especificidad de los anticuerpos monoclonales murinos parentales y se reduce la heterología, lo que es ventajoso para su uso en seres humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos modificados y anticuerpos completamente humanos. El principio básico del humanizado es cambiar la especificidad del reconocimiento de antígenos, es decir, dominios CDR, en el entorno de las inmunoglobulinas humanas ("injerto de CDR", Winter y Milstein). Es necesario un compromiso entre requisitos opuestos en el cambio de un anticuerpo animal (normalmente un ratón) a un anticuerpo humanizado, para lo cual la solución se cambia según las situaciones. Con el fin de minimizar la inmunogenicidad, la inmunoglobulina sigue siendo tanto como sea posible una secuencia humana aceptable. En cualquier caso, para mantener las propiedades de unión originales, el armazón de la inmunoglobulina debe contener un número suficiente de mutaciones en las secuencias humanas aceptables para asegurar que la conformación de las regiones CDR sea similar a la conformación de las regiones CDR para la inmunoglobulina murina donante tanto como sea posible. Se hace referencia específica a Maeda et al., 1991; Singer et al., 1993; Tempest et al., 1994; Kettleborough et al., 1991; Hsiao et al., 1994; Baca et al., 1997; Leger et al., 1997; Ellis et al., 1995; Sato et al., 1994; Jones et al., 1986; Benhar et al., 1994; Sha y Xiang, 1994; Shearman et al., 1991; Rosok et al., 1996; Gussow y Seemann, 1991; Couto et al., 1994; Kashmiri et al., 1995; Baker et al., 1994; Riechmann et al., 1988; Gorman et al., 1991; Verhoeyen et al., 1988; Foote y ffinter, 1992; Lewis y Crowe, 1991; Co et al., 1991; Co et al., 1991; Verhoeyen et al., 1991; Figenbrot et al., 1994; Hamilton et al., 1997; Tempest et al., 1995; Verhoeyen et al., 1993; Cook et al., 1996; Poul et al., 1995; Co et al., 1992; Graziano et al., 1995; Presta et al., 1993; Hakimi et al., 1993; Roguska et al., 1996; Adair et al., 1994; Sato et al., 1993; Tempest et al., 1991; Sato et al., 1996; Kolbinger et al., 1993; Zhu y Carter, 1995; Sims et al., 1993; Routledge et al., 1991; Roguska et al., 1994; Queen et al., 1989; Carter et al., 1992; patente EP 592106; EP 1709076, et al.

Estructura de anticuerpos de origen natural

La estructura de anticuerpos de origen natural incluye típicamente un tetrámero. Tal tetrámero típicamente se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una "cadena ligera" de longitud completa (en algunas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una "cadenas pesadas" de longitud completa (en alguna realización, aproximadamente 50- 70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye típicamente una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, que generalmente es responsable del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena incluye típicamente una región constante responsable de la función del efector. Las cadenas ligeras humanas generalmente se clasifican como cadena ligera k y una cadena ligera A. Las cadenas pesadas generalmente se clasifican como p, 5, y, a o £. Los isotipos de anticuerpos se definen como IgM, IgD, IgG, IgA, IgE. La IgG incluye varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La IgM incluye varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a IgM 1 e IgM2. De manera similar, la IgA se divide en varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a IgA1 e IgA2. Generalmente, las regiones variables y las regiones constantes en las cadenas ligeras de longitud completa y las cadenas pesadas de longitud completa están conectadas a través de regiones "J" que incluyen aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye regiones "D" que incluyen aproximadamente 10 o más aminoácidos. Se hace referencia a, por ejemplo, Capítulo VII de Fundamental Immunology (Paul, W. ed., Segunda Edición, Raven Press, NY (1989)) (incorporado por referencia para todos los propósitos). Los sitios de unión al antígeno se forman generalmente en las regiones variables de las cadenas ligeras/pesadas.

La región variable generalmente tiene una estructura general de las mismas regiones armazón (FR) relativamente conservadas, a través de tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o regiones CDR. Las CDR de las dos cadenas están dispuestas generalmente a través de las regiones armazón, que pueden unirse con un epítopo específico. Las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada incluyen típicamente dominios estructurales FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 desde el extremo N al extremo C. Los aminoácidos están dispuestos en cada dominio generalmente según la definición en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nation Institutes of Health, Bethesda, Md (1987,1991).), o Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987).); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).

Anticuerpos biespecíficos y bifuncionales

Los anticuerpos biespecíficos y bifuncionales son generalmente anticuerpos sintéticos artificiales que tienen dos pares de cadena pesada/cadena ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Se pueden usar varios métodos para preparar anticuerpos biespecíficos, que incluyen, pero no se limitan a la fusión de hibridomas o la conexión de fragmentos Fab'. Se hace referencia a, por ejemplo, Songsivi lai y Lachmann Clin. Exp.Tmmunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J.lmmunol. 148: 1547-1553 (1992).

La preparación de los anticuerpos monoclonales murinos anti-RANKL humano de acuerdo con la presente descripción es bien conocida por los expertos en la técnica. Las secuencias de ADN del anticuerpo humanizado para los anticuerpos monoclonales murinos anti-RANKL humano están unidas operativamente (es decir, están ubicadas de tal manera que aseguren su funcionalidad) a las secuencias de control de la expresión y luego se expresan en una célula hospedante. Estos vectores como vectores de expresión o como una parte integrada del ADN cromosómico generalmente pueden clonarse en un organismo hospedante. En general, el vector de expresión contiene marcadores seleccionables para identificar células transformadas con secuencias de ADN diana. La inmunoglobulina humanizada según la invención se produce en forma de scFv recombinante o en forma de Fab, preferiblemente en un sistema procariota. E. coli es uno de los hospedantes procariotas particularmente útil para clonar secuencias de ADN según la invención. Además, existe un gran número de promotores bien caracterizados, tales como los operones Lac o trp o las p-lactamasas o los fagos A. Generalmente, estos promotores controlan la expresión y tienen sitios de unión de ribosomas, con el fin de iniciar y completar correctamente la transcripción y traducción. El período de semivida de la inmunoglobulina humanizada producida en el sistema procariota según la invención se puede aumentar uniendo la inmunoglobulina humanizada con polietilenglicol (PEG). Se pueden usar para la expresión otros organismos unicelulares, tales como levaduras. El hospedante elegido es Saccharomyces, y se usa un portador apropiado para proporcionar secuencias de control de expresión, terminación e inicio de replicación. También se pueden usar cultivos de células de insectos para producir la inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la invención, típicamente células de Drosophila S2 transfectadas de manera estable o células de Spodoptera frugiperda con un sistema de expresión basado en baculovirus (Putlitz et al., 1990). Pueden usarse plantas y cultivos de células vegetales para expresar la inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la invención (Larrick y Fry, 1991; Benvenuto, et al., 1991; Durin, et al., 1990; Hiatt et al., 1989).

De acuerdo con otra realización, la modificación de extender el período de semivida del polipéptido de acuerdo con la presente descripción (que también reduce la inmunogenicidad del polipéptido modificado) incluye conectar un polímero farmacéuticamente aceptable adecuado, tal como un polietilenglicol lineal o ramificado (PEG) o derivados del mismo (p. ej., metoxi-polietilenglicol o mPEG). Generalmente, se puede usar cualquier forma adecuada de pegilación, p. ej., una pegilación para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (que incluyen, pero no se limitan a un dominio de anticuerpo y fragmentos scFv) en la técnica. Se hace referencia, por ejemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol, 54, 531 -545 (2002); Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); y documento WO2004/060965. Se encuentran disponibles en el mercado varios reactivos para pegilar polipéptidos. Preferiblemente, se usa pegilación de punto fijo (particularmente a través de restos de cisteína) (véase, p. ej., Yang et al., Protein Engineering16, 761 -770 (2003)). Por ejemplo, para este propósito, el PEG puede conectarse a restos de cisteína de origen natural en el polipéptido de acuerdo con la invención, el polipéptido de acuerdo con la invención se puede modificar con el fin de introducir adecuadamente uno o más restos de cisteína para conectar PEG, o se puede fusionar una secuencia de aminoácidos que contiene uno o más restos de cisteína para conectar el PEG al N-terminal y/o C-terminal del polipéptido según la invención. Las operaciones descritas anteriormente se logran utilizando la tecnología de ingeniería de proteínas conocida por los expertos en la técnica.

Según algunas realizaciones, los anticuerpos según la invención pueden usarse para detectar RANKL en muestras biológicas. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden identificar una célula o tejido para producir una proteína. En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen con RANK y bloquean la interacción con otros compuestos de unión tienen un uso terapéutico en la regulación de la diferenciación de osteoclastos y la absorción ósea. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano puede bloquear la unión de RANKL y ODAR, lo que puede conducir al bloqueo de la cascada de transducción de señales y la pérdida de la activación transcripcional mediada por NF-kB. Es bien sabido por los expertos en la técnica que el ensayo de activación de la transcripción mediada por NF-kB se mide utilizando un indicador de luciferasa.

En un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-RANKL humano según la invención, el anticuerpo anti-RANKL humano comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde a) la cadena pesada comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 6, y b) la cadena ligera comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y el anticuerpo se une con RANKL para bloquear una interacción entre RANK y RANKL.

Se describe, pero fuera del alcance de la invención, una región variable en una cadena pesada de un anticuerpo anti-RANKL humano que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2-5, 7-9; y una región variable en una cadena ligera de un anticuerpo anti-RANKL humano que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10-13, 15-17.

En algunas realizaciones, la invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-RANKL humano y a células hospedantes que contienen los ácidos nucleicos.

La invención se refiere además a una producción o composición que comprende al menos el anticuerpo anti-RANKL humano según la invención y uno o más de otros componentes de la composición.

La invención se refiere además a un método para preparar o producir el anticuerpo anti-RANKL humano, los ácidos nucleicos, las células hospedantes, la producción y la composición descritas en la invención.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un anticuerpo humanizado para un anticuerpo anti-RANKL humano de acuerdo con la invención, el anticuerpo humanizado es capaz de unirse específicamente con RANKL humano, una región variable en una cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, NO: 23, NO: 25, NO: 27 o NO: 29, y una región variable en una cadena ligera del anticuerpo humanizado se selecciona de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, NO: 31, NO: 33, NO: 35, NO: 37 o NO: 39.

En algunas realizaciones, una región constante en la cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona de IgG2 humana, y una región constante en la cadena ligera del anticuerpo humanizado se selecciona de Kappa humana; o, una región constante en la cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, y una región constante en la cadena ligera del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado es un segmento de unión al antígeno seleccionado de scFv, (scFv)2, Fab, Fab' o F (ab')2.

En algunas realizaciones, una cadena pesada completa del anticuerpo anti-RANKL humano tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y/o una cadena ligera completa del anticuerpo anti-RANKL humano tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que la cadena pesada completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, la cadena ligera completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, NO: 53, NO: 54 o NO: 55; o, la cadena pesada completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, la cadena ligera completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, NO: 53, NO: 54 o NO: 55; o, la cadena pesada completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, la cadena ligera completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, NO: 53, NO: 54 o NO: 55; o, la cadena pesada completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, la cadena ligera completa del anticuerpo humanizado se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.

En algunas realizaciones, la región variable en la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la región constante en la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y la región constante en la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; o, la región variable en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, la región constante en la cadena pesada se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y la región constante en la cadena ligera se selecciona de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43;

En un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, y los ingredientes activos de la composición farmacéutica incluyen el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado.

La invención se refiere además al anticuerpo anti-RANKL humano para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de pérdida ósea.

En algunas realizaciones, las enfermedades de pérdida ósea se seleccionan de osteoporosis, destrucción ósea de la articulación ósea debido a artritis reumatoide, destrucción ósea debida a metástasis ósea de un tumor, destrucción ósea debida al crecimiento de un tumor óseo de células gigantes y otros cambios patológicos tales como pérdida ósea o destrucción ósea debida a la hiperfunción de los osteoclastos inducida por RANKL.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para mejorar las afecciones de pacientes con enfermedades de pérdida ósea o para tratar pacientes con enfermedades de pérdida ósea de acuerdo con la invención, y el método incluye dar a los pacientes una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, las enfermedades de pérdida ósea se seleccionan de osteoporosis, destrucción ósea de la articulación ósea debido a artritis reumatoide, destrucción ósea debida a metástasis ósea de un tumor, destrucción ósea debido al crecimiento de un tumor óseo de células gigantes y otros cambios patológicos tales como pérdida ósea o destrucción ósea debido a la hiperfunción de los osteoclastos inducida por RANKL. Las enfermedades óseas mencionadas anteriormente se refieren principalmente a enfermedades de pérdida ósea.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para tratar enfermedades de osteopenia, que incluye: administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o la composición farmacéutica.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para tratar pacientes con estados inflamatorios asociados con la pérdida ósea, que incluye: administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o el composición farmacéutica.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para tratar pacientes con enfermedades autoinmunitarias asociadas con pérdida ósea, que incluye: administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o el composición farmacéutica.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para tratar pacientes con artritis reumatoide asociada con pérdida ósea, que incluye: administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano, el anticuerpo humanizado o el composición farmacéutica.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para detectar el nivel de RANKL humano en muestras biológicas, que incluye: poner en contacto las muestras con un anticuerpo.

También se describe, pero fuera del alcance de la invención, que se proporciona un método para tratar enfermedades óseas, que incluye: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo. En algunas realizaciones, se proporciona un método para tratar enfermedades óseas, que incluye: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo y administrar un agente terapéutico adicional. En dichas algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, las enfermedades óseas se caracterizan por enfermedades de pérdida ósea, que incluyen, pero no se limitan a osteopenia y osteólisis. En algunas realizaciones, el uso del anticuerpo anti-RANKL humano o del anticuerpo terapéutico humanizado puede inhibir una tasa de absorción ósea. Por lo tanto, en algunas realizaciones, para compensar la formación de hueso por debajo del nivel normal, se reduce la tasa de absorción ósea más alta que la tasa normal de absorción ósea o se reduce la tasa de absorción ósea para que esté por debajo del nivel normal durante el tratamiento. En algunas realizaciones, se mide la capacidad del anticuerpo de unirse con RANKL en ausencia o presencia de OPG, y se puede comprobar la capacidad del anticuerpo de inhibir la producción de osteoclastos mediada por RANKL y/o la absorción ósea.

También se describe, pero no dentro del alcance de la invención, que las afecciones que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan al grupo que consiste en:

osteoporosis, que incluye, pero no se limita a osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (que incluye, pero no se limita a hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing y acromegalia), osteoporosis genética y autóloga (que incluye, pero no se limita a osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, Síndrome de Ryan-Dai) y osteoporosis debido a la fijación de extremidades;

enfermedad de Paget ósea para adultos y jóvenes (osteítis deformante);

osteomielitis, es decir, lesiones por infección ósea que conducen a pérdida ósea;

hipercalcemia que incluye, pero no se limita a hipercalcemia causada por tumores sólidos (que incluyen, pero no se limitan a mama, pulmón y riñón) y lesiones malignas en sangre (que incluyen, pero no se limitan a mieloma múltiple, linfoma y leucemia), hipercalcemia idiopática e hipercalcemia relacionada con hipertireosis y disfunción renal;

osteopenia que incluye, pero no se limita a osteopenia después de cirugía, osteopenia inducida por fármacos, osteopenia asociada con el intestino delgado y grueso y osteopenia asociada con enfermedades crónicas del hígado y del riñón; y necrosis ósea, es decir, muerte de células óseas, que incluye, pero no se limita a necrosis ósea asociada con lesión traumática, necrosis ósea asociada con enfermedad de Gaucher, necrosis ósea asociada con anemia de células falciformes, necrosis ósea asociada con lupus eritematoso sistémico, necrosis ósea asociada con artritis reumatoide, necrosis ósea asociada con enfermedad periodontal, necrosis ósea asociada con metástasis osteolítica, necrosis ósea asociada con otras afecciones; y pérdida de cartílago y erosión articular asociada con la artritis reumatoide.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo se puede usar solo o se puede usar con al menos un agente terapéutico adicional para tratar la enfermedad ósea. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente terapéutico se usa junto con el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo. Ejemplos de agentes terapéuticos administrados junto con el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo incluyen, pero no se limitan a factor de aparición morfogénica ósea designado como BMP-1 a BMP BMP-12, factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) y miembros de la familia de TGF-p; inhibidor U de interleuquina-1 (IL-1), que incluye pero no se limita a IL-1 ra y derivados de la misma y Kineret™, anakinra; Inhibidores de TNF-a, que incluyen pero no se limitan a, receptores de TNF-a solubles, Enbre I™, etanercept, un anticuerpo anti-TNF-a, Remicade™, infliximab y anticuerpo D2E7; hormona paratiroidea y análogos; proteína relacionada con la hormona paratiroidea y análogos; prostaglandinas de la serie E; bisfosfonato (tal como alendronato y otros); minerales que mejoran los huesos tales como el fluoruro y calcio; medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), que incluyen, pero no se limitan a inhibidores de COX-2 tales como Celebrex™, celecoxib y Vioxx™, Luo Alexis; inmunosupresores tales como metotrexato o leflunomida; inhibidores de serina proteasa, que incluyen, pero no se limitan a inhibidor de proteasa de leucocitos secretores (SLPI); Inhibidores de IL-6 (que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos anti-IL-6), inhibidores de IL-8 (que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos anti-IL-8), inhibidores de IL-18 (que incluyen, pero no se limitan a proteína de unión a IL-18 y anticuerpo anti-IL-18), moduladores de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE); factores de crecimiento de fibroblastos FGF-1 a FGF-10 y moduladores de FGF; antagonistas de PAF; factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), moléculas relacionadas con KGF y moduladores de KGF; moduladores de proteasa de matriz metálica (MMP); moduladores de óxido nítrico sintasa (NOS), que incluyen, pero no se limitan a moduladores de NOS inducibles; moduladores del receptor de glucocorticoides; moduladores del receptor de glutamato; moduladores de nivel de lipopolisacáridos (LPS); y noradrenalina, moduladores y análogos de noradrenalina.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo se utilizan con agentes terapéuticos particulares para tratar diversas afecciones inflamatorias, afecciones autoinmunitarias u otras afecciones asociadas con la pérdida ósea. En algunas realizaciones, se pueden administrar dos, tres o más agentes dependiendo de las condiciones y los niveles terapéuticos deseados. En algunas realizaciones, se proporcionan dichos agentes que están contenidos en la misma formulación. En algunas realizaciones, dichos agentes se proporcionan junto con el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, que están contenidos en la misma formulación. En algunas realizaciones, se proporcionan dichos agentes que están contenidos en un kit para el tratamiento. En algunas realizaciones, dichos agentes se proporcionan junto con el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, que están contenidos en un kit para el tratamiento. En algunas realizaciones, dichos agentes se pueden proporcionar por separado. En algunas realizaciones, los genes que codifican un agente proteico y/o el anticuerpo anti-RANKL humano pueden incluirse en el mismo vector en un caso de administración de fármacos mediante terapia génica. En algunas realizaciones, los genes que codifican un agente proteico y/o el anticuerpo anti-RANKL humano pueden estar controlados por la misma región promotora. En algunas realizaciones, los genes que codifican un agente proteico y/o el anticuerpo anti-RANKL humano se pueden transportar en vectores separados.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un plan terapéutico que incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo y al menos un inhibidor de interleuquina-1 (IL-1) y un método terapéutico que aplica el plan terapéutico. En algunas realizaciones, el plan terapéutico incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, un inhibidor de IL-1 y al menos una molécula adicional descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el método terapéutico incluye usar el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo en combinación con un inhibidor de IL-1 y/o un inhibidor de TNF-a. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo y el inhibidor de IL-1 y/o el inhibidor de TNF-a pueden usarse juntos en el tratamiento del asma, artritis reumatoide y esclerosis múltiple.

La interleuquina-1 (IL-1) es una citoquina antiinflamatoria. En algunos casos, la IL-1 es un mediador en muchas enfermedades y afecciones médicas. En algunos casos, las células macrófagos/células de línea unicelular producen IL-1. En algunos casos, la IL-1 se produce en dos formas de IL-1 a e IL-1 p.

Si una enfermedad o afección médica espontánea o experimental está relacionada con un nivel elevado de IL-1 en los líquidos o tejidos corporales, o si las células o tejidos del cuerpo producen un nivel elevado de IL-1 en cultivos, se considera que la enfermedad o afección médica es una "enfermedad mediada por interleuquina-1". En algunas realizaciones, dicha enfermedad mediada por interleuquina-1 puede identificarse mediante las siguientes dos condiciones adicionales: (I) el hallazgo patológico asociado con la enfermedad o afección médica se simula con un animal en experimentos administrando IL-1 o regulando por aumento la expresión de IL-1; y (II) la patología inducida en el modelo animal experimental para la enfermedad o afección médica puede inhibirse o eliminarse mediante el tratamiento con un agente que inhibe el efecto de la IL-1. En algunas realizaciones, una o más de las afecciones descritas anteriormente son compatibles con enfermedades mediadas por IL-1. En algunas realizaciones, las tres condiciones son compatibles con enfermedades mediadas por IL-1. Las enfermedades agudas y crónicas mediadas por interleuquina-1 (IL-1) incluyen, pero no se limitan al grupo de: pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrófica (ELA o enfermedad de Lou Gehrig); enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, que incluye pero no se limita a caquexia inducida por SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmunitaria; síndrome de fatiga crónica; enfermedades relacionadas con clostridium, que incluyen, pero no se limitan a diarrea relacionada con clostridium; afecciones e indicaciones coronarias, que incluyen, pero no se limitan a insuficiencia cardíaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción miocárdica (por ejemplo, relacionada con septicemia) e injerto de derivación de arteria coronaria; cánceres, que incluyen pero no se limitan a leucemia que incluye, pero no se limita a mieloma múltiple y leucemia mieloide (tal como AML y CML), y metástasis tumoral; diabetes (que incluye, pero no se limita a, diabetes insulinodependiente); endometriosis; fiebre; fibromialgia tumor; glomerulonefritis; enfermedad de injerto contra huésped y/o rechazo de injerto; choque hemorrágico; hiperalgesia; enfermedad inflamatoria intestinal; afecciones de artritis, que incluyen pero no se limitan a osteoartritis, artritis psoriásica y artritis reumatoide; enfermedad ocular inflamatoria, que incluye, pero no se limita a las relacionadas con el trasplante de córnea; isquemia, que incluye, pero no se limita a la isquemia cerebral (que incluye pero no se limita a daño cerebral debido a traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración); enfermedad de Kawasaki; dificultades de aprendizaje; enfermedad pulmonar (que incluye, pero no se limita a síndrome de dificultad respiratoria aguda o SDRA); esclerosis múltiple; miopatía (p. ej., metabolismo de proteínas musculares, que incluye, pero no se limita a metabolismo de proteínas musculares en la septicemia); neurotoxicidad (que incluye, pero no se limita a neurotoxicidad inducida por VIH); osteoporosis; dolores, que incluyen, pero no se limitan a dolor asociado con el cáncer; enfermedad de Parkinson; enfermedad periodontal; nacimiento prematuro; psoriasis; lesión por reperfusión; choque séptico; efectos secundarios de la radioterapia; enfermedad de la articulación temporomandibular; trastornos del sueño; uveítis; inflamaciones provocadas por luxación, esguince, daño del cartílago, traumatismo, cirugía ortopédica, infección u otros procesos patológicos.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a un plan terapéutico que incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo y al menos un inhibidor de TNF-a, y a un método terapéutico que aplica el plan terapéutico. En algunas realizaciones, el plan terapéutico incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, un inhibidor de TNF-a y al menos una molécula adicional descrita en el presente documento. Varias enfermedades y afecciones médicas son mediadas por TNF-a y se clasifican como afecciones inflamatorias. "Enfermedad mediada por TNF-a" usada en el presente documento incluye, pero no se limita a, enfermedades o afecciones médicas asociadas con un nivel elevado de IL-1 en fluidos corporales o tejidos o enfermedades o afecciones médicas en las que las células o tejidos del cuerpo producen un nivel elevado de IL-1 en cultivos. En algunas realizaciones, si (I) el hallazgo patológico asociado con la enfermedad o afección médica se simula con un animal en experimentos administrando IL-1 o regulando por aumento la expresión de IL-1; y/o (II) la patología inducida en el modelo animal experimental para la enfermedad o afección médica puede inhibirse o eliminarse mediante el tratamiento con un agente que inhibe el efecto de la IL-1, se considera que la enfermedad es una "enfermedad mediada por interleuquina-1 ". Varias enfermedades y afecciones médicas son mediadas por TNF-a y se clasifican como afecciones inflamatorias. Las "enfermedades mediadas por TNF-a" utilizadas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: caquexia y anorexia; cáncer, que incluye pero no se limita a leucemia; síndrome de fatiga crónica; afecciones y/o indicaciones coronarias, que incluyen pero no se limitan a, insuficiencia cardíaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción miocárdica (que incluye, pero no se limita a dicha situación asociada con septicemia), e injerto de derivación de arteria coronaria; depresión; diabetes, que incluye, pero no se limita a diabetes de tipo I de aparición juvenil, diabetes y resistencia a la insulina (que incluye, pero no se limita a resistencia a la insulina relacionada con la obesidad); endometriosis, endometritis y afecciones relacionadas; fibroma y analgesia; rechazo por injerto contra huésped; hiperalgesia; enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Crohn y diarrea relacionada con Clostridium difficile; isquemia, que incluye pero no se limita a daño cerebral debido a traumatismos, epilepsia, hemorragia y/o accidente cerebrovascular, resultados de lesiones cerebrales; enfermedad pulmonar, que incluye pero no se limita a síndrome de dificultad respiratoria del adulto, asma, fibrosis pulmonar; esclerosis múltiple; enfermedades neuroinflamatorias; enfermedades y afecciones oculares, que incluyen pero no se limitan a trasplante de córnea, degeneración ocular y uveítis; dolores, que incluyen pero no se limitan a dolores asociados con el cáncer; pancreatitis, enfermedad periodontal; pitiriasis rubra pilaris (PRP); prostatitis, incluyendo prostatitis bacteriana y no bacteriana, y afecciones relacionadas; psoriasis y afecciones relacionadas; fibrosis pulmonar; lesión por reperfusión; reumatismo, que incluye, pero no se limita a artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil (que incluye, pero no se limita a artritis reumatoide juvenil), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriásica, artritis por enfermedad intestinal, polimiositis, dermatomiositis, esclerodermia, esclerosis sistémica, vasculitis (tal como enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de raismes, artritis inducida por Staphylococcus aureus ("séptica"), síndrome de Sjogren, fiebre reumática, policondritis, polimialgia reumática y miopatía por arteritis de células gigantes); choque séptico; efectos secundarios de la radioterapia; lupus eritematoso sistémico (LES); enfermedad de la articulación temporomandibular; tiroiditis; y trasplante de tejido y/o inflamaciones provocadas por luxación, esguince, daño del cartílago, traumatismo, cirugía ortopédica, infecciones (tales como VIH, Clostridium difficile y especies asociadas) u otros procesos patológicos.

En algunas realizaciones, los inhibidores de TNF-a se producen regulando por disminución o inhibiendo el TNF-a . Los inhibidores de TNF-a se unen con el THF libre, interfieren en la unión de TNF-a y su receptor e interfieren al menos en un factor en la regulación de la transmisión de señales después de que el TNF-a se une a su receptor. La expresión "inhibidor de TNF-a" incluye, pero no se limita a un receptor de TNF-a soluble que incluye, pero no se limita a receptor del factor de necrosis tumoral tipo I soluble (Stnf-a-RI; también conocido como receptor p55), receptor del factor de necrosis tumoral tipo II soluble (también conocido como receptor p75) y Enbrel™, etanercept; anticuerpo anti-TNF-a , que incluye pero no se limita a, Remicade™, infliximab y D2E7 (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6090382 y 6258562); anticuerpos anti-receptor de TNF-a ; sTNF-a-RI (véase, por ejemplo, el documento WO98/24463), Etanercept (Enbrel™); inhibidores de la enzima convertidora de TNF-a (TACE); y otras moléculas que afectan a la actividad de TNF-a .

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo se puede administrar junto con al menos un agente terapéutico para la inflamación. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo se puede administrar junto con al menos un agente terapéutico para enfermedades inmunitarias. Los agentes terapéuticos de ejemplo para la inflamación y los trastornos inmunitarios incluyen, pero no se limitan a corticosteroides, que incluyen, pero no se limitan a prednisolona; fármacos antiinflamatorios no aromáticos dejados (AINE), que incluyen, pero no se limitan a inhibidores de ciclooxigenasa tipo I (COX-1) e inhibidores de ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2); fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME), que incluyen, pero no se limitan a metotrexato, hidroxicloroquina, cloroquina, ciclosporina, compuestos de oro (por ejemplo, vinagre portugués-sulfuro de oro, sal de succinato-sulfuro de oro y glucosa-sulfuro de oro), leflunomida; inhibidores de la fosfodiesterasa IV, que incluyen, pero no se limitan a rolipram y pentoxifilina base; tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); ácido micofenólico; inhibidores de la 5-lipoxigenasa, que incluyen pero no se limitan a zileuton; moduladores de interleuquina-6 (IL-6); un modulador de molécula pequeña para la proteína quinasa activada por mitógenos de 38 kDa (P38-MAPK); moduladores de moléculas pequeñas para moléculas intracelulares implicadas en rutas inflamatorias, en donde dichas moléculas intracelulares incluyen, pero no se limitan a, Jnk, IKK, NF-kB, ZAP70 y Lck. Algunos ejemplos de agentes terapéuticos para la inflamación se describen, por ejemplo, en CA Dinarello y Ll Moldawer Proinflammatorv y Ant1-1nflammatorv Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians, tercera edición (2001) Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. Agentes terapéuticos de ejemplo para la inflamación y las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a moduladores de interferón-y (IFN-Y); moduladores de OX40/OX40L (incluido OX40 de formas solubles); moduladores de ligando 4-1BB/4-1BB (incluyendo 4-1BB de formas solubles); moduladores en las rutas de coestimulación de células B y células T.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpos humanizados se pueden usar para tratar la pérdida ósea que incluye, pero no se limita a pérdida ósea causada por daño osteolítico debido a tumores malignos o metastásicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo puede usarse para tratar la pérdida ósea asociada con el cáncer. Los cánceres de ejemplo incluyen, pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de hígado y cáncer gastrointestinal. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo se puede usar para tratar la pérdida ósea asociada con algunas enfermedades malas de la sangre, que incluyen pero no se limitan a mieloma múltiple y linfoma, incluida la enfermedad de Hodgkin.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo se puede administrar por separado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo se puede administrar junto con al menos otro agente terapéutico, que incluye, pero no se limita a al menos otro agente terapéutico contra el cáncer. Los agentes de terapia del cáncer de ejemplo incluyen, pero no se limitan a radioterapia y quimioterapia. En algunas realizaciones, la quimioterapia puede ser un tratamiento que usa uno o más de los siguientes fármacos: antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, 5-fluorouracilo y otros fármacos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el agente terapéutico contra el cáncer es un antagonista de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH).

La composición farmacéutica

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo y un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional y diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona de: un factor morfogénico óseo, un factor de crecimiento transformante-p (TGF-p), inhibidores de interleuquina-1 (IL-1) que incluyen, pero no se limitan a IL-1 ra y sus derivados y Kineret™, anakinra; Inhibidores de TNF-a que incluyen, pero no se limitan a un receptor de TNF-a soluble, Enbrel™, etanercept, un anticuerpo anti-TNF-a, Remicade™, infliximab y anticuerpo D2E7; hormona paratiroidea tiroidea y análogos; proteína relacionada con la hormona paratiroidea y análogos; prostaglandinas de la serie E; bisfosfonatos (tales como alendronato y otros); minerales que mejoran los huesos tales como fluoruro y calcio; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), que incluyen, pero no se limitan a inhibidores de COX-2 tales como Celebrex™, celecoxib y Vioxx™, Luo Alexis; inmunosupresores tales como metotrexato o leflunomida; inhibidores de serina proteasa, que incluyen, pero no se limitan a inhibidor de proteasa de leucocitos secretores (SLPI); Inhibidores de IL-6 (que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos anti-IL-6), inhibidores de IL-8 (que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos anti-IL-8), inhibidores de IL-18 (que incluyen, pero no se limitan a proteínas de unión a IL-18 y anticuerpo anti-IL-18), moduladores de la enzima convertidora de interleuquina-1 (ICE); factor de crecimiento de fibroblastos de FGF-1 a FGF-10 y moduladores del FGF; antagonista de PAF; factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), moléculas relacionadas con KGF y moduladores de KGF; moduladores de metaloproteinasas de la matriz (MMP); moduladores de óxido nítrico sintasa (NOS), que incluyen, pero no se limitan a moduladores de NOS inducible; moduladores del receptor de glucocorticoides; moduladores del receptor de glutamato; moduladores de nivel de lipopolisacáridos (LPS); y noradrenalina y moduladores de noradrenalina y análogos.

En algunas realizaciones, las sustancias de formulación aceptables se usan preferiblemente en dosis y concentración que no son tóxicas para el receptor. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener sustancias de formulación para cambiar, mantener o retener tales como el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, absorción o penetración de la composición. En algunas realizaciones, las sustancias de formulación adecuadas incluyen, pero no se limitan a aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, sulfito de sodio o bisulfato de sodio); tampones (p. ej., borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); cargas (p. ej., manitol o glicina); agentes quelantes (p. ej., ácido etilentetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, ciclodextrina o hidroxipropilciclodextrina); carga; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (p. ej., glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (p. ej., albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, agentes de sabor y diluyentes; agentes emulsionantes; polímero hidrófilo (p. ej., polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como sodio); conservantes (p. ej., cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o también peróxido de hidrógeno); disolventes (p. ej., glicerol, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (p. ej., manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (p. ej., pluronics, PEG, ésteres de azúcar de sorbitán, polisorbatos, tales como polisorbato20, polisorbato80, lecitina, colesterol, tiloxapol), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (p. ej., haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o cloruro de potasio, manitol, sorbitol); excipientes de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (Remington's Pharmaceutical Science, Edición 18, AR Gennaro ed., Mack Publish Company (1990)).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo y/o las moléculas terapéuticas están conectados a un excipiente que prolonga el período de semivida, lo que es bien conocido en la técnica. Dichos excipientes incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol y dextrano. Dichos excipientes se describen, por ejemplo, en el número de registro de solicitud de EE.UU. n° 09/428082 y una solicitud PCT publicada n° WO99/25044,

En algunas realizaciones, los expertos en la técnica pueden determinar una composición farmacéutica óptima según, por ejemplo, la vía de administración deseada, los métodos de administración y la dosis deseada. Por ejemplo, se hace referencia a Remington's Pharmaceutical Science, Edición 18, AR Gennaro et al., Mack Publish Company (1990). En algunas realizaciones, dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del anticuerpo según la presente descripción.

En algunas realizaciones, las propiedades de los principales excipientes o vehículos en la composición farmacéutica pueden ser acuosas o no acuosas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un excipiente o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente incluyendo otras sustancias comúnmente utilizadas para composiciones de administración parenteral. En algunas realizaciones, la solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son otros ejemplos de los excipientes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene tampón Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5 o tampón acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, y la composición farmacéutica puede contener además sorbitol o sustitutos adecuados. En algunas realizaciones, la composición que contiene el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se puede preparar mezclando la composición seleccionada de una pureza deseada con cualquier reactivo de formulación opcional. Además, en algunas realizaciones, la composición que contiene el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se puede transformar en un liofilizador usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente descripción se pueden usar para administración parenteral. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para inhalación o a través del tracto digestivo, tal como la administración oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables es conocida en la técnica.

En algunas realizaciones, en un caso de administración parenteral, la composición terapéutica puede ser un excipiente farmacéuticamente aceptable exento de pirógenos, aceptable por vía parenteral y contener el anticuerpo anti-RANKL humano deseado o un anticuerpo humanizado del mismo, con o sin agente terapéutico adicional en un forma de una solución acuosa. En algunas realizaciones, los excipientes para inyección parenteral son agua destilada estéril, con la que el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formulan como una solución isotónica estéril y se conserva adecuadamente. En algunas realizaciones, las moléculas y reactivos deseados están involucrados en la preparación, tales como microesferas inyectables, partículas biodegradables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que pueden permitir controlar la producción o la liberación sostenida, y después se administran a través de la inyección de acción prolongada. En algunas realizaciones, también se puede usar ácido hialurónico, que puede desempeñar un papel de promoción y mantenimiento de la circulación. En algunas realizaciones, se puede usar un dispositivo de administración de fármacos implantable para introducir la molécula deseada.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular en formulaciones para inhalación. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se puede formular como un polvo seco para inhalación. En algunas realizaciones, se puede formular una solución de inhalación que comprende el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, usando un propulsor usado para la administración de aerosol. En algunas realizaciones, la solución se puede pulverizar.

En algunas realizaciones, las formulaciones para administración oral están relacionadas. En algunas realizaciones, los vehículos usados convencionalmente en formas farmacéuticas sólidas tales como comprimidos y cápsulas se pueden usar o no, y el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se pueden formular de dicha manera. En algunas realizaciones, puede diseñarse una cápsula para un resto activo de una formulación de liberación puntual en el tracto digestivo, considerando la máxima biodisponibilidad y la mínima degradación presistémica. En algunas realizaciones, puede contener al menos un reactivo adicional para facilitar la absorción del anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo y/o cualquier agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, también se pueden usar diluyentes, agentes de sabor, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener una cantidad eficaz del anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional en una mezcla de excipientes no tóxicos adecuados para la preparación de comprimidos. En algunas realizaciones, se puede preparar una solución en una forma farmacéutica única disolviendo los comprimidos en agua esterilizada u otros excipientes adecuados. En algunas realizaciones, los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato o bicarbonato sódico, lactosa o fosfato cálcico; o aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o un lubricante como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Otra composición farmacéutica es evidente para los expertos en la técnica, la cual incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una formulación de administración de liberación sostenida o controlada. En algunas realizaciones, los expertos en la técnica conocen bien una variedad de técnicas de formulación en otro modo de administración de liberación sostenida o controlada, tales como portadores liposomas, micropartículas biodegradables o perlas porosas e inyección de acción prolongada.

En algunas realizaciones, las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de un producto tangible, tales como películas o microcápsulas. La matriz de liberación sostenida puede incluir poliésteres, hidrogeles, polilactida (documentos US3773919 y EP058481), copolímero de L-glutamato y ácido Y-etil-L-glutámico (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(2-etil-ligero - metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech, 12: 98-105 (1982)), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., el descrito anteriormente) o poli(ácido D(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP133988). En algunas realizaciones, las composiciones de liberación sostenida pueden incluir además liposomas preparados mediante varios métodos, que son bien conocidos en la técnica. Se hace referencia a, por ejemplo, Eppstein et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82: 3688-3692 (1985); EP036676; EP088046 y EP143949.

Generalmente, la composición farmacéutica administrada in vivo es estéril. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica administrada in vivo puede filtrarse mediante una filtración por membrana estéril. En algunas realizaciones, en el caso de que la composición esté liofilizada, la composición puede esterilizarse usando este método antes o después de la liofilización y reconfiguración de la composición. En algunas realizaciones, las composiciones administradas por vía parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en forma de solución. En algunas realizaciones, las composiciones parenterales generalmente se almacenan en un recipiente que tiene una abertura de esterilización, por ejemplo, bolsas o viales de fluido intravenoso que tienen una cubierta perforada por agujas hipodérmicas.

En algunas realizaciones, una vez que se ha formulado una composición farmacéutica, la composición farmacéutica se puede almacenar como una solución, suspensión, gel, emulsión o sólido en un vial estéril, o almacenar como polvos deshidratados o liofilizados en viales estériles. En algunas realizaciones, dichas formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para usar o en una forma para su reconstitución antes de la administración (p. ej., liofilizada).

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a la preparación de kits en una unidad de administración de dosis única. En algunas realizaciones, el kit puede incluir un primer recipiente lleno de proteínas secas y un segundo recipiente lleno de una formulación acuosa. Según algunas realizaciones de la presente descripción, se proporcionan kits que comprenden jeringas precargadas con una cámara única o cámaras múltiples (p. ej., jeringas de líquido y jeringa para disolver).

En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de composición farmacéutica que incluye el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, depende del tratamiento y del sujeto. Los expertos en la técnica pueden entender que, de acuerdo con algunas realizaciones, los niveles de dosificación apropiados son diferentes parcialmente dependiendo de la molécula administrada, las indicaciones del anticuerpo anti-RANKL humano o un anticuerpo humanizado del mismo (con o sin al menos un agente terapéutico adicional), la vía de administración y el tamaño del paciente (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o condiciones (la edad y el estado general de salud). En algunas realizaciones, el médico puede ajustar la dosis y cambiar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En algunas realizaciones, considerando los factores mencionados anteriormente, la dosis general puede estar en un intervalo de aproximadamente 0.1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más. En algunas realizaciones, la dosis puede estar en un intervalo de 0.1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; la dosis puede estar en el intervalo de 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o la dosis puede estar en el intervalo de 5 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

En algunas realizaciones, deben tenerse en cuenta los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo y/o cualquier agente terapéutico adicional en la formulación, para determinar la frecuencia de administración. En algunas realizaciones, el médico administra la composición en una dosis hasta que se logra el efecto deseado. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente descripción se pueden administrar en una sola dosis, o dos o más dosis a lo largo del tiempo (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada), o una infusión continua usando un dispositivo de implantación o catéter. Los expertos en la técnica determinan rutinariamente la dosis exacta correcta, que son sus tareas rutinarias habituales. En algunas realizaciones, la dosis apropiada se puede determinar mediante la aplicación de datos de dosis-respuesta apropiados.

En algunas realizaciones, la vía de administración de las composiciones farmacéuticas es bien conocida, p. ej., vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, portal hepática o una vía de lesiones internas; o mediante sistemas de liberación sostenida o dispositivos de implantación. En algunas realizaciones, la composición puede administrarse mediante inyección en bolo o infusión continua, o por medio de un dispositivo de implantación.

En algunas realizaciones, la composición se puede administrar localmente mediante la implantación de membrana, esponja u otras sustancias adecuadas sobre las que se unen las moléculas deseadas o mediante las cuales se encapsulan las moléculas deseadas. En algunas realizaciones, se puede implantar un dispositivo de implantación en cualquier tejido u órgano adecuado en el caso de que se utilice el dispositivo de implantación, y las moléculas deseadas se pueden administrar por difusión, liberación de bolo con el tiempo o administración continua.

En algunas realizaciones, es deseable usar in vitro la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-RANKL humano o el anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional. En este caso, las células, tejidos y/u órganos extraídos del paciente entran en contacto con la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, y luego las células, tejidos y/o los órganos se trasplantan de nuevo al paciente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-RANKL humano o anticuerpo humanizado del mismo y/o cualquier agente terapéutico adicional pueden administrarse implantando las células modificadas genéticamente con el método descrito en el presente documento para expresar y secretar polipéptidos. En algunas realizaciones, dichas células pueden ser células animales o células humanas y pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas. En algunas realizaciones, las células pueden ser inmortalizadas. En algunas realizaciones, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración del tejido circundante, con el fin de reducir las oportunidades de respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, las sustancias encapsulantes incluyen típicamente una membrana o envoltura de polímero semipermeable biocompatible, que permite la liberación de productos proteicos, pero evita que el sistema inmunitario del paciente o los factores dañinos de los tejidos circundantes dañen las células.

La invención se expone además con ejemplos específicos a continuación. Estos ejemplos pretenden ilustrar la presente descripción y no pretenden limitar el alcance de la invención. Las condiciones específicas para los métodos experimentales no se indican en los siguientes ejemplos, y los métodos experimentales se llevan a cabo generalmente de acuerdo con las condiciones convencionales o de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. A menos que se defina lo contrario, toda la terminología científica y profesional utilizada en el presente documento tiene los mismos significados que conocen los expertos en la técnica. La realización preferida y las sustancias descritas en el presente documento son solo para fines de demostración.

Ejemplo 1 La preparación de un RANKL humano

Se construye un vector de expresión para el RANKL humano, las células CHO se transfectan de manera estable, y luego se criban las líneas celulares capaces de expresión alta estable del RANKL humano. La línea celular se cultiva a gran escala, se recogen los líquidos sobrenadantes celulares y la proteína RANKL humana se purifica mediante una columna de níquel para preparar la proteína RANKL humana, que se usa para la inmunización de ratones, cribado e identificación de clones en los Ejemplos 2, 3, 4, 5, 6 y 7.

Las células CHO se compran en Invitrogen, las células RAW264.7 se compran en el Cell Bank of Shanghai Institute, los vectores de expresión los proporciona la empresa de los autores de la invención, la ADN ligasa T4, el marcador estándar de peso molecular de proteína y las enzimas de restricción se compran en NEB; los kits de extracción en gel se adquieren de Invitrogen; el medio 302, tripsina y FBS se adquieren de Invitrogen; el gel de Phenyl Sepharose 6 FF -baja sustitución, SP-Sepharose FF, Ni-NTA Sepharose FF se adquieren en GE; el hidrogenofosfato disódico, dihidrogenofosfato sódico, cloruro de sodio, T ris, ácido cítrico, citrato trisódico, imidazol y MTX se adquieren en Sigma, los anticuerpos de cabra anti-IgG humana-HRP se adquieren en Jackson, los sustratos TMB se adquieren en Cell Signaling Technology, RANK- Fc, TRANC, M-CSF y TGF-p se adquieren en R & D Systems, el sistema de color TRAP se adquiere en Sigma, el medio DMEM, medio a-MEM y suero fetal bovino se adquieren en Invitrogen.

El instrumento de PCR (Hangzhou Michelangelo Scientific Instruments Biology Co., Ltd.), agitador CLIMO-SHAKER 1SFS-X (Suiza Kuhner). El lector de microplacas multifuncional es el lector de microplacas multimodo SpectraMax M5 de Molecular Devices, la lavadora es TECAN HydroFlex Plate Washer, Super Clean Bench pertenece a una marca de Sujing con especificaciones SW-CJ-2F/T, la incubadora de dióxido de carbono pertenece a una marca de Thermo con especificaciones de Forma 311.

(1) Construcción de vector de expresión para RANKL humano

En primer lugar, la secuencia diana de RANKL humano (Fig.1) se sintetiza mediante ingeniería genética, la secuencia diana incluye 182 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) desde Gly en la posición 136 hasta Asp en la posición 317 de un RANKL humano natural, se añaden 10 His en el N-terminal, que pueden unirse con el cloruro de níquel en la columna de níquel y, por lo tanto, la secuencia diana de RANKL humano puede purificarse por cromatografía de afinidad iónica, y se añaden sitios de restricción tanto NotI como PmeI en ambos extremos. El RANKL humano sintético y los vectores de expresión son cortados por las dos enzimas NotI y PmeI, los fragmentos diana de RANKL humano y los fragmentos del vector de expresión se recuperan, conectan y transforman, se identifican los clones positivos por PCR y digestión enzimática y, finalmente, la corrección del vector de expresión se verifica mediante secuenciación. Los plásmidos se extraen usando un kit de extracción de plásmidos para una transfección estable.

(2) Transfección estable de células CHO y cribado de colonias

Durante las 48 horas antes de la transfección, las células CHO se subcultivan en medio 302 sin suero, con una densidad de siembra de 3 x 105/ ml. El día de la transfección, el número total de células debe ser superior a 1,5 x 107, con una viabilidad celular superior a 95%. Se usa el electroporador Bio-Rad para llevar a cabo la transformación, con un voltaje de transfección de 300 V y una capacitancia de 900 pF. Las células se subcultivan una vez cada 2 a 3 días, se reemplaza medio de nueva aportación para cultivar las células hasta que las células crecen normalmente. Cuando la viabilidad celular es superior a 90%, se realiza un cribado por presión con MTX. La concentración de MTX se aumenta gradualmente a 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM. La división de la placa se lleva a cabo de acuerdo con el método de dilución límite cuando la presión del MTX alcanza 500 nM. Una vez producidos los clones, se realiza la detección por transferencia en mancha de los clones. Se toman 5 pl de líquido sobrenadante de las células de la placa de 96 pocillos para aplicar en gotas sobre una membrana de nitrocelulosa. Después de secar al aire, la membrana de nitrocelulosa se coloca en leche desnatada al 5% y se cierra a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añade una dilución 1:1000 de RANK-Fc y se somete a choque a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se lava en TBST 3 veces, durante 5 minutos cada vez. Las muestras se ponen en una dilución de 10000 de anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc humana marcado con HRP (comprada de Sigma), y se someten a choque a temperatura ambiente durante 1 hora, y se colorean usando el sistema de color DAB. Se criban los clones de mayor nivel de expresión, se criban un total de 120 clones por primera vez y se subclona el clon de mayor nivel de expresión, con el fin de asegurar que el clon obtenido que expresa RANKL humano sea un clon monoclonal.

(3) Purificación de RANKL humano

Se recogió el líquido sobrenadante de células cultivadas en masa. Después de centrifugación, la muestra se purifica usando una columna de níquel. Los cloruros de níquel en la columna de níquel pueden unirse con His y también pueden unirse con imidazol. En primer lugar, la muestra fluye a través de la columna de níquel con un cierto caudal, de modo que el RANKL humano en la muestra se une a la columna de níquel, y luego se añaden diferentes concentraciones de imidazol para unirse a la columna de níquel de manera competitiva con el RANKL humano, de modo que el RANKL humano fuera eluido. Se usa una columna de cromatografía de 2 ml de Ni2+ Sepharose 6 FF y se lava con 10 a 20 volúmenes de columna usando tampón de unión (PB 20 mM NaCl 0.15 M, pH 7.4). Los líquidos sobrenadantes celulares se añaden a la columna de níquel con un caudal de 30 ml/h, la columna de níquel se lava con 10-20 volúmenes de columna de tampón de unión, la proteína híbrida se separa por lavado con imidazol 10 mM y después se usa imidazol 70 mM, 100 mM y 500 mM en la elución respectivamente. Se recoge el eluyente y el pico de elución principal de RANKL humano aparece en condiciones de elución con imidazol 70 mM. La proteína RANKL humana purificada se identifica mediante una electroforesis SDS-PAGE reductora, con un peso molecular de aproximadamente 34 KDa, que es coherente con el peso molecular teórico, y una pureza superior a 90%.

(4) Identificación de RANKL humano

El RANKL humano preparado y el hRANKL de referencia comercial se aplican como recubrimiento sobre placas ELISA. Las muestras se diluyen a 1 pg/ml, se añaden 100 pl/pocillo y se incuban durante la noche a 4°C. Se añade gradiente de RANK-Fc diluido desde 10 pg/ml, dilución 1:20000 de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc humana), la muestra se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, se colorea usando el sistema de color de TMB cromogénico. El valor de absorbancia para cada pocillo de la placa de 96 pocillos se mide en el lector de microplacas multifunción con una longitud de onda de medición de 450 nm, una longitud de onda de referencia de 630 nm, valor de absorbancia para cada pocillo (OD) = OD450 nm-OD630 nm. Se identifica la actividad de unión de RANKL humano y RANK-Fc . Los resultados muestran que, el RANKL humano recombinante en recubrimiento sobre placas de ELISA se une con su receptor RANK-Fc, que depende de la concentración de RANK-Fc y puede alcanzar el punto de saturación, alcanza 50% de la unión máxima con una concentración de RANK-Fc de 10.9 ng/ml. La unión del RANKL humano es coherente con la del RANKL de referencia disponible en el mercado de R & D Systems, y este último alcanza 50% de la unión máxima con una concentración de RANK-Fc de 5.6 ng/ml.

Las células RAW264.7 se cultivan usando DMEM medio FBS al 10%, se subcultivan una vez cada 3-4 días. Para la detección de la actividad de la muestra el medio de cultivo de células en fase logarítmica se reemplaza con medio a-MEM FBS al 10%. La suspensión de células se siembra en una placa de 96 pocillos con 2000 células/100 pl, se pone en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante 1 hora. Se añade el RANKL humano diluido dos veces desde 800 ng/m, se añade el hRANKL de referencia disponible en el mercado diluido dos veces desde 200 ng/m, y se añade una concentración fija de M-CSF y TGF p. La muestra se pone en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante 5 días, se descarta el líquido sobrenadante celular, se añaden 100 pl de tampón de lisis celular (tampón de citrato pH 5.0 Triton X-100 al 0.5%) a cada pocillo y la muestra se lisa en frigorífico a 4°C durante 10 min. Se añaden 100 pl de líquido de color pNPP a cada pocillo y la muestra se incuba a 37°C durante 30 min. Luego, se añaden 50 pl de solución de parada (NaOH 0.5 M) a cada pocillo y la muestra se identifica en el lector de microplacas multifunción a 450/570 nm. A través de la identificación experimental de la actividad del RANKL humano que induce la identificación de células RAW264.7, el RANKL humano recombinante puede inducir la diferenciación de las células RAW264.7 en osteoclastos, y tiene una clara dependencia de la dosis, para la cual la actividad celular es similar a la del producto de R & D Systems. La CE50 para el RANKL humano recombinante es 113.4 ng/ml y la CE50 para el hRANKL de referencia comercial es 35.7 ng/ml.

Este ejemplo muestra que el RANKL humano recombinante y purificado no solo mantiene la capacidad de unión con el receptor RANK-Fc correspondiente, sino que también puede estimular la diferenciación en osteoclastos a través del receptor y tiene actividad biológica. El RANKL humano recombinante como antígeno se usa para los procedimientos de inmunización descritos en el presente documento, y se usa como proteína de recubrimiento para el cribado de clones positivos por ELISA y el material para la identificación de características inmunológicas y citológicas de anticuerpos.

Ejemplo 2 Inmunización de ratones y titulación

El antígeno para inmunización (el RANKL humano recombinante) se obtiene del Ejemplo 1, los ratones BALB/c se adquieren de Beijing Wei Tong Li Hua Laboratory Animal Technology Limited Corporation. Los anticuerpos monoclonales anti-RANKL se obtienen inmunizando repetidamente ratones BALB/c. La inmunización se realiza por inyección subcutánea en una almohadilla del pie, la dosis de inmunización es de 10 g/50 pl/ratón, 25 pl inyectados en cada almohadilla del pie. Se inmunizan un total de 10 ratones.

En la primera inmunización, se mezclan 10 pg de RANKL humano con un volumen igual de TiterMax Gold® (Sigma, Oakville, ON). Se mezclan 10 pg de RANKL humano con un volumen igual de 100 pg de alumbre (Sigma, Oakville, ON) y 10 pl de D-PBS libre de pirógenos que contiene CpG, sin adyuvante en las siguientes 10 inmunizaciones múltiples. Se inmunizan ratones BALB/c a los 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 y 44 días, se combinan cuatro ratones con el título en suero más alto a los 44 días.

Se extraen muestras de sangre por punción posocular de 10 ratones después de la quinta inmunización (día 20) y la novena inmunización (día 40). El título de anticuerpos anti-RANKL humano en el suero de ratones inmunizados se mide por el método ELISA. En primer lugar, el RANKL humano se diluye con un tampón de recubrimiento (tampón de recubrimiento 0.1 M, pH 9.6 NaHCO38.4 g/l) a 1 pg/ml, se recubre con este una placa ELISA de 96 pocillos con 100 pl/pocillo (Corning, Acton, MA), a 4°C durante la noche. Al día siguiente, la placa se lava tres veces con 1 x PBST (Tween 20 al 0.05% en 1 x PBS), se añade una solución de bloqueo (BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.1%, timerosal al 0.01% en 1 x PBS) con 200 pl/pocillo y la placa se cierra a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lava tres veces, el suero de los ratones se diluye 3 veces desde 1:100 con BSA/PBS al 0.5%, se añade BSA/PBS al 0.5% en un pocillo de blanco, el suero de ratones diluido se añade en la placa ELISA en 100 pl/pocillo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lava tres veces. Se añade una concentración final de 1 pg/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG-Fc de ratón-HRP y la muestra se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lava tres veces, se añade líquido de color de TMB cromogénico (BioFx BSTP-0100-01) a temperatura ambiente durante 10-20 minutos, se añade la solución de parada, la muestra se identifica en el lector de microplacas multifunción con lecturas a 450 nm. El valor de OD es mayor que 2 veces el de los pocillos del blanco, lo que se define como un clon positivo. El valor de OD más alto es en un caso en que el suero se diluya en los momentos más altos, lo que indica que la respuesta inmunitaria para el RANKL humano es más fuerte. Los datos del ensayo de títulos del suero se muestran en la Tabla 1. Después de la quinta inmunización, los títulos del suero de los ratones son hasta 1:312500, además del n° 4 y n° 8 con 1:62500. Después de la novena inmunización, los títulos del suero para ratones son de hasta 1:1562500, además del n° 1 y n° 4 con 1:312500.

Tabla 1

Ejemplo 3 Producción de anticuerpo monoclonal de ratón anti-RANKL humano

Los ratones inmunizados se sacrifican con CO2 y se dislocan las vértebras del cuello, se separan los ganglios linfáticos y se mezclan los ganglios linfáticos de diferentes ratones y se trituran en medio DMEM, se recoge el líquido sobrenadante y se centrifuga para obtener linfocitos, y se cuentan los linfocitos usando un hemocitómetro.

Las células B obtenidas anteriormente se lavan y se mezclan con células de mieloma no secretoras P3X63Ag8.653 (ATCC, n° cat. CRL1580) en 1:1. La mezcla de células se centrifuga a 800 g, el líquido sobrenadante se retira con cuidado. Se añaden 2-4 ml de solución de Pronase (CalBiochem, n° cat. 53702; 0.5 mg/ml en PBS), en reacción durante no más de dos minutos. Se añaden 3-5 ml de FBS para detener la reacción enzimática, se añade solución de electrofusión celular ECFS (sacarosa 0.3 M, Sigma, n° cat. S7903, acetato de magnesio 0.1 mM, Sigma, n° cat. M2545, acetato de calcio 0.1 mM, Sigma, n° cat. C4705) para ajustar el volumen de la muestra para que sea 40 ml. La muestra se centrifuga, se retira el líquido sobrenadante y las células se resuspenden en 40 ml de ECFS para lavarlas una vez, se añade ECFS para ajustar la densidad celular para que sea 2 x 106 células/ml. La muestra se fusiona usando un dispositivo de electrofusión (ECM2001, BTX, Harvard Apparatus, Holliston, MA). Se selecciona una cámara de fusión de 2.0 ml y los parámetros se establecen de la siguiente manera:

Condición de alineación: voltaje: 50 V, tiempo: 50 s

Rotura de membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 gs

Tiempo de mantenimiento posterior a la fusión: 3 s

Después de la electrofusión, el líquido sobrenadante se retira con cuidado y la muestra se transfiere a un tubo de centrífuga estéril que contiene un volumen igual de medio de hibridoma (DMEM (JRH Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), complementado con L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim)), se incuba a 37°C durante 15-30 min y luego se centrifuga a 400 g (1000 rpm) durante 5 minutos. Las células se resuspenden con cuidado en una pequeña cantidad de medio de cribado de hibridomas (medio de cultivo de hibridoma complementado con 0.5x HA (Sigma, n° cat. A9666)) para ajustar la densidad celular y se mezclan con cuidado. Se siembran 5 x 106 células B en cada placa de cultivo celular de 96 pocillos, con cada pocillo de 200 gl/pocillo. A los 7 o 10 días, el líquido sobrenadante del cultivo se retira a la mitad y se añaden 100 gl de medio de cribado a cada pocillo.

Después de cultivar las células durante 14 días, se miden los hibridomas con cribado positivo de anticuerpos que se unen específicamente a RANKL en los líquidos sobrenadantes de hibridoma usando el ensayo ELISA. El RANKL humano se diluye a 1 gg/ml con un tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 0.1 M, pH 9.6, NaHCO38.4 g/l), se recubre con el mismo la placa ELISA con 50 gl/pocillo, a 4°C durante la noche. Al día siguiente, la placa se lava tres veces con una solución de lavado (Tween 20 al 0.05% en PBS), se añade una solución de bloqueo (BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.1%, timerosal al 0.01% en 1xPBS) con 200 gl/pocillo. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora y luego la placa se lava tres veces, se añaden 50 gl de líquido sobrenadante de hibridoma a cada pocillo o se preparan controles positivos y negativos (el control positivo incluye suero de ratón inmunizado con RANKL humano, el control negativo incluye el suero de ratón BALB/c preinmunización). La muestra se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente y la placa se lava tres veces. Luego, se añade una dilución 1:2000 de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Jackson Lab, n° cat. 115-035-062) a cada pocillo, la muestra se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente y la placa se lava tres veces. Se añaden 100 gl de reactivo de color TMB (BioFX Lab. n° cat. TMSK-0100-01) a cada pocillo, la muestra se colorea a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añaden 50 gl de solución de parada a cada pocillo y la muestra se lee a 450 nm. Como resultado, después de la primera ronda de cribado, para un total de 190 placas de cultivo celular de 96 pocillos, se criban 435 clones positivos capaces de unirse con el RANKL humano (valor de OD superior a 0.5).

Para los clones positivos para el anticuerpo de RANKL en el primer cribado de ELISA, se retira el medio para los clones positivos y se añade medio de cultivo de hibridoma de nueva aportación, los clones se transfieren a placas de clones de 24 pocillos y se cultivan durante 2 días. Se lleva a cabo una segunda ronda de experimentos de verificación de cribado de placas ELISA para los clones en las placas de 24 pocillos, que incluye una detección ELISA directa, un experimento de inhibición competitiva y reactividad cruzada inmunológica con RANKL de ratón. En la reactividad cruzada inmunológica con RANKL de ratón, el paquete de proteína se reemplaza por RANKL de ratón con una concentración de 1 gg/ml, la muestra detectada es la concentración original de líquido sobrenadante celular, es decir, un punto de concentración, y el resto de las condiciones experimentales son coherente con las del primer método experimental de cribado por ELISA. Los resultados muestran que nueve clones tienen reactividad cruzada inmunológica con RANKL de ratón. El ensayo de inhibición competitiva es una prueba de un solo punto, RANK-Fc se diluye a 1 gg/ml con un tampón de recubrimiento, a 4°C durante la noche. La concentración original de líquido sobrenadante se mezcla con un volumen igual de RANKL humano 600 ng/ml y luego se añade a la placa ELISA, se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente, la placa se lava tres veces, se añade dilución 1:10000 de anticuerpo de conejo anti-His humana-HRP (disponible en el mercado en Abcam), la muestra se incuba durante una hora a temperatura ambiente, la placa se lava 4 veces. La muestra se colorea usando el sistema de TMB cromogénico, durante 15 minutos a temperatura ambiente, se añade H2SO41 M para terminar la coloración. Se miden el valor de absorbancia de cada pocillo en placas de 96 pocillos en el lector de microplacas multifuncional (lector de microplacas multimodo de Molecular Devices SpectraMax M5) con una longitud de onda de medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm, y el valor de absorbancia de cada pocillo (OD) = OD450 nm-OD 630 nm. Se criban los clones con actividad competitiva, para lo cual el líquido sobrenadante celular se diluye 3 veces para repetir el experimento. Los clones con una actividad competitiva relativamente fuerte se seleccionan para ser subclonados en una nueva ronda, las líneas celulares se amplifican y congelan, y el líquido sobrenadante celular se purifica para obtener una cantidad del anticuerpo para identificación funcional.

Los resultados de ELISA de la segunda ronda muestran que, 249 clones tienen valores de OD superiores a 0.5, 41 clones tienen la actividad de inhibir la unión de RANKL humano y RANK-Fc, 9 clones tienen reactividad cruzada inmunológica con RANKL de ratón. Los 50 clones mencionados anteriormente se subclonan, las líneas celulares se congelan y el líquido sobrenadante celular se purifica para obtener el anticuerpo para la identificación funcional en los Ejemplos 4, 5, 6 y 7.

Ejemplo 4 Reactividad inmunológica entre el anticuerpo monoclonal murino purificado y el RANKL humano

Los 41 clones que tienen actividad neutralizante y los 9 clones que tienen reactividad cruzada inmunológica con RANKL de ratón mencionados anteriormente se cultivan para amplificación. Se añaden 100 ml de medio de cultivo de hibridoma en una botella cuadrada T125, las muestras se cultivan en una incubadora a 372C, 5% de CO2 durante 10 días, el líquido sobrenadante celular se recoge y se purifica usando Proteína A para obtener el anticuerpo. Las muestras se eluyen con tampón de ácido cítrico a pH 3.0 para recoger las muestras, el pH se ajusta a aproximadamente 6.0. Se realiza una medición de la concentración de anticuerpos en A280 y se obtiene un nivel de proteínas en mg para cada anticuerpo. La capacidad de unión entre los 50 anticuerpos monoclonales de ratón anti-RANKL humano y el inmunógeno RANKL humano se detecta mediante ELISA directo. La proteína RANKL humana se diluye a 1 pg/ml con tampón de carbonato 0.05 M a pH 9.6 y se añaden 100 pl por pocillo en la placa ELISA de 96 pocillos a 4°C durante la noche. La placa se lava tres veces con PBST y se cierra con PBST BSA al 2% durante 1 hora, y luego la placa se lava tres veces con PBST. Los anticuerpos a ensayar se diluyen 10 veces con PBST desde 10 pg/ml hasta 1 x 105 pg/ml. Se añaden 100 pl por pocillo en la placa ELISA, las muestras se ponen en pocillos dobles, se ponen 5 muestras en cada placa ELISA de 96 pocillos y se preparan 10 placas ELISA de 96 pocillos. Después de incubar el antígeno-anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente, las muestras se lavan tres veces con PBST. Se añade una dilución 1:10000 de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con HRP (disponible en Jackson Labs) a los pocillos de anticuerpos que se van a analizar, con 100 pl cada pocillo, y las muestras se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente, la placa se lava cuatro veces con solución de lavado PBST. Se añaden 100 pl de reactivo de color TMB (adquirido en Cell Signaling) a cada pocillo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 7 minutos. Se añaden 50 pl de H2SO41 M a cada pocillo para terminar la reacción de color. El valor de absorbancia de cada pocillo en las placas de 96 pocillos se mide en el lector de microplacas multifuncional (lector de microplacas multimodo de Molecular Devices SpectraMax M5) con una longitud de onda de medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm, y el valor de absorbancia de cada pocillo (OD) = OD450 nm-OD630 nm.

Se obtiene una curva de unión antígeno-anticuerpo (Fig. 2) usando el método de encapsulado (pendiente variable) de dosis-respuesta sigmoide con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). Los resultados muestran que la mayoría de los anticuerpos monoclonales murinos anti-RANKL pueden unirse de manera dependiente de la concentración con el RANKL humano que recubre la superficie de la fase sólida de la placa ELISA, y la unión puede alcanzar el punto de saturación, con una CE50 entre 10-20 ng/ml, y los datos detallados se dan en la Tabla 2.

Tabla 2: Comparación de CE50 y otros datos sobre la unión del anticuerpo monoclonal murino y RANKL humano

Ejemplo 5 Reactividad cruzada de especies entre el anticuerpo monoclonal de ratón purificado con RANKL de mono y RANKL de ratón

La reactividad cruzada de especies entre el anticuerpo monoclonal de ratón anti-RANKL humano con RANKL de macaco cangrejero y RANKL de ratón se detecta con el método de ELISA directo. El método experimental es idéntico al del Ejemplo 4. El RANKL humano, RANKL de mono y RANKL de ratón se aplican como recubrimiento respectivamente, y el RANKL de mono y RANKL de ratón se adquieren en R & D Systems.

Se obtiene una curva de unión antígeno-anticuerpo (Fig. 3) usando el método de encapsulado (pendiente variable) de dosis-respuesta sigmoide con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). Los resultados muestran que, todos los anticuerpos monoclonales murinos capaces de unirse con el RANKL humano pueden unirse de forma dependiente de la concentración con el RANKL de mono, y la unión puede alcanzar el punto de saturación, con una CE50 entre 10-20 ng/ml (Tabla 3). 9 anticuerpos en los anticuerpos detectados tienen reactividad cruzada con RANKL de ratón, para los cuales la unión depende de la concentración y puede alcanzar la saturación, con una CE50 entre 10-20 ng/ml. Los experimentos continuos muestran que los 9 anticuerpos no pueden inhibir la unión entre RANKL y RANK-Fc.

Tabla 3: comparación de CE50 y otros datos sobre la unión del anticuerpo monoclonal murino y RANKL de mono

Ejemplo 6 Anticuerpo monoclonal murino purificado que inhibe la actividad de unión del RANKL humano con RANK-Fc

Se evalúa si el anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano tiene una actividad neutralizante para inhibir la unión del RANKL humano con RANK-Fc con experimentos ELISA competitivos, y el anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano se compara con productos disponibles en el mercado, Denosumab. La proteína RANK-Fc se diluye a 1 pg/ml con tampón de carbonato 0.05 M a pH 9.6 y se añaden 100 pl por pocillo en la placa ELISA de 96 pocillos a 4°C durante la noche. La placa se lava tres veces con PBST y se cierra con PBST BSA al 2% durante 1 hora, y luego la placa se lava tres veces con PBST. Los anticuerpos a ensayar y el Denosumab se diluyen respectivamente 4 veces con PBST desde 20 pg/ml a 0,0024 pg/ml y se mezclan con un volumen igual de RANKL humano (con una concentración de 0.6 pg/ml) respectivamente. Se añaden 100 pl por pocillo en una placa ELISA, las muestras se ponen en pocillos dobles, se ponen 5 muestras y una muestra de control de Denosumab en cada placa ELISA de 96 pocillos, y se preparan 10 placas ELISA de 96 pocillos. Después de incubar las muestras durante 2 horas a temperatura ambiente, las muestras se lavan tres veces con PBST. Se añade una dilución 1:10000 de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con HRP (disponible en Jackson Labs) a la placa ELISA, con 100 pl cada pocillo, y las muestras se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente, la placa se lava cuatro veces con solución de lavado PBST. Se añaden 100 pl de reactivo de color TMB (adquirido en Cell Signaling) a cada pocillo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Se añaden 50 pl de H2SO41 M a cada pocillo para terminar la reacción de color. El valor de absorbancia de cada pocillo en las placas de 96 pocillos se mide en el lector de microplacas multifuncional con una longitud de onda de medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 570 nm, y el valor de absorbancia de cada pocillo (OD) = OD450 nm-OD570 nm.

Se obtiene una curva del anticuerpo que inhibe competitivamente la unión entre el receptor y el ligando utilizando el método de encapsulado (pendiente variable) de dosis-respuesta sigmoide con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). Los 9 anticuerpos que tienen reactividad cruzada con RANKL de ratón no tienen actividad de inhibición de la unión entre el receptor y el ligando; entre los 41 anticuerpos restantes, 8 anticuerpos pierden la actividad neutralizante y los 33 anticuerpos adicionales tienen una actividad neutralizante significativa, pueden inhibir la unión entre RANKL y RANKL-Fc y de forma dependiente de la concentración. Se mide experimentalmente que el Denosumab tiene una CE50 de 0.67 pg/ml, mientras que los valores de CE50 de 8 anticuerpos medidos en las mismas condiciones experimentales se encuentran en un intervalo de 0.2-1.0 pg/ml. Los valores de CE50 más pequeños para los anticuerpos indican que la actividad de los anticuerpos para bloquear la unión entre RANKL y RANK-Fc es más fuerte, y 5 anticuerpos de los 8 anticuerpos tienen una actividad significativamente mejor que el Denosumab. La Figura 4 muestra los resultados de inhibición de la unión entre RANKL y RANK-Fc para 8 muestras, y los detalles se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Comparación de CE50 y otros datos sobre el anticuerpo monoclonal murino que inhibe la unión de RANKL y RANK-Fc

Ejemplo 7 Experimentos en los que el anticuerpo monoclonal murino inhibe la diferenciación celular de RAW264.7 inducida por RANKL humano

RANKL humano puede inducir la diferenciación de células RAW264.7 (adquiridas en Cell Bank ofdel Shanghai Institute) en osteoclastos. El objeto del experimento es evaluar si el anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano capaz de inhibir la unión de RANKL y RANK-Fc, tiene la actividad de inhibición de la diferenciación celular de RAW264.7 (células de leucemia de monocitos-macrófagos de ratón, adquiridas en Cell Bank of Shanghai Institute) inducida por RANKL humano, y el anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano se compara con productos disponibles en el mercado, Denosumab. Los osteoclastos tienen una enzima característica, es decir, la fosfatasa ácida resistente al tartrato, el grado de diferenciación de las células RAW264.7 en osteoclastos puede reflejarse por la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato que se indica por las lecturas a 450/570 nm usando el sistema cromogénico pNPP. Las células RAW264.7 se cultivan con medio DMEM FBS al 10% (adquirido en Invitrogen Company), se subcultivan una vez cada 3-4 días. Para la detección de la actividad celular, las células en la fase logarítmica se resuspenden con medio a-MEM FBS al 10% (adquirido en Invitrogen Companay). La suspensión celular se siembra en placas de 96 pocillos con 2000 células/100 pl, se pone en una incubadora (adquirida en Thermo Fisher, especificaciones Forma 311) a 37°C con 5% de CO2 durante 1 hora. Se añaden las muestras a ensayar que se diluyen dos veces, y Denosumab así como RANKL humano y MCSF, TGF-p (adquiridos en R & D Systems) (un total de 22 anticuerpos, 7 placas de cultivo celular de 96 pocillos). Las concentraciones finales de anticuerpos que se analizarán son 2000, 1000, 500, 250, 125 y 62.5 ng/ml respectivamente, la concentración final de RANKL humano es 150 ng/ml, las concentraciones finales de MCSF y TGF-p son 20 ng/ml y 2 ng/ml respectivamente. Las muestras se ponen en una incubadora a 37°C, 5% de CO2 durante 5 días, se descarta el líquido sobrenadante celular, se añaden 100 |ul de tampón de lisis celular (tampón de citrato a pH 5.0 Triton X-100 al 0.5%) en cada pocillo, las muestras se lisan en un frigorífico a 4°C durante 10 minutos, se añaden 100 |ul de solución cromogénica de pNPP (adquirida en Sigma) a cada pocillo, las muestras se incuban a 37°C durante 30 min, luego se añaden 50 |ul de solución de parada (NaOH 0.5 M) a cada pocillo, y las muestras se identifican en el lector de microplacas multifunción a 450/570 nm.

Se obtiene una curva del anticuerpo que inhibe la diferenciación de células RAW264.7 en osteoclastos utilizando el método de encapsulado (pendiente variable) de dosis-respuesta sigmoide con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). El anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL es capaz de inhibir completamente las diferenciación de las células RAW264.7 inducida por RANKL humano en osteoclastos, y depende de la dosis. Excepto las muestras 114-6.6.7/114-6.6.18/114-6.6.29 con baja inhibición, los 19 anticuerpos restantes en los anticuerpos probados tienen una fuerte actividad de inhibición, con valores de CE50 muy bajos. El producto disponible en el mercado Denosumab tiene una CE50 de 334.4 ng/ml, mientras que los valores de CE50 para 8 anticuerpos medidos en las mismas condiciones experimentales están en un intervalo de 200-800 ng/ml. Los valores de CE50 más pequeños para los anticuerpos indican que la actividad de los anticuerpos para inhibir la diferenciación celular de RAW264.7 inducida por RANKL humano es más fuerte, 3 anticuerpos de los 8 anticuerpos obtenidos tienen la actividad significativamente mejor que el Denosumab y 2 anticuerpos son equivalentes a Denosumab. La Fig. 5 muestra los resultados de la inhibición de la diferenciación de RAW264.7 inducida por RANKL humano en osteoclastos para 8 muestras, y los detalles se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: CE50 y otros datos sobre el anticuerpo monoclonal murino que inhibe la diferenciación celular de RAW264.7 inducida por RANKL humano

Ejemplo 8 Determinación de secuencias de ácido nucleico en regiones CDR del anticuerpo monoclonal murino anti-RANKL humano

Basándose en el resultado experimental del anticuerpo monoclonal murino que inhibe la unión de RANKL y RANK-Fc y el resultado experimental del anticuerpo monoclonal murino que inhibe la diferenciación celular de RAW264.7, se seleccionan los anticuerpos que tienen actividad neutralizante para determinar las secuencias de ácido nucleico en regiones CDR. Se seleccionan 22 muestras, se cultivan con medio de hibridoma, se recogen 1 x 106 células y se centrifugan a 850 rpm durante 5 minutos, se retira el líquido sobrenadante y las muestras se resuspenden añadiendo 450 |ul de RNAlater (adquirido en Sigma) y se congelan en un frigorífico a -80°C. La información de ID específica para las muestras se da a continuación:

Las 22 muestras recogidas se envían a Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd. para determinar las secuencias de ácido nucleico en las regiones CDR. En primer lugar, se extrae el ARN total utilizando el sistema de purificación de ARN TRIzol® Plus (Invitrogen, n° cat.: 15596-026), y luego se obtiene el ADNc mediante transcripción inversa mediante tecnología de RT-PCR. Tomando el ADNc como molde, las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera se amplifican con el método RACE, las secuencias de la región variable obtenidas se construyen en un vector de secuenciación y la determinación de la secuencia de ácido nucleico se realiza en cinco clones positivos seleccionados de cada una de las secuencias de regiones variables. Las secuencias de ácido nucleico se traducen en secuencias de aminoácidos. Mediante el alineamiento de secuencias, finalmente las cadenas pesada y ligera tienen 8 secuencias CDR únicas respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de 9 muestras de 114­ 5.7.11, 114-5.7.14, 114-5.7.29, 114-5.16.15, 114-5.16.3, 114-5.16.21, 114-5.17.12, 114 -5.17.11 y 114 -5.17.3 son exactamente idénticas, las secuencias de aminoácidos de 3 muestras de 114-6.6.29, 114-6.6.18 y 114-6.6.7 son exactamente idénticas, las secuencias de aminoácidos de 3 muestras de 114 -7.38.7, 114-7.38-29 y 114-7.38.48 son exactamente idénticas, las secuencias de aminoácidos de las muestras 114-7.37.36 y 114-7.37.26 son exactamente idénticas, y las secuencias de aminoácidos de las muestras 114-7.19.12 y 114-7.19.17 son exactamente idénticas. La información específica de las secuencias de aminoácidos se da en la Tabla 6.

Tabla 6: Secuencia de aminoácidos de CDR Secuencia de CDR en la cadena pesada

Ejemplo 9 Construcción del plásmido recombinante scFv (fragmento de anticuerpo monocatenario) 7.19.12

Se inmunizan ratones con RANKL humano recombinante (hRANKL), se obtiene una serie de anticuerpos monoclonales de ratón anti-RANKL humano mediante tecnología de hibridoma. Los anticuerpos que tienen actividad neutralizante se criban mediante experimentos de ELISA competitivos y experimentos de citología, que pueden bloquear la unión de RANKL y su receptor RANK-Fc, inhibir la diferenciación de las células RAW264.7 en osteoclastos. El anticuerpo monoclonal 7.19.12 es uno de los anticuerpos con alta capacidad de unión y actividad neutralizante, las secuencias de aminoácidos en la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) para 7.19.12 se han publicado en la patente de China (Patente N° CN201310753972.3). El scFv de 7.19.12 se construye utilizando tecnología de PCR. La VH (SEQ ID NO: 6) y VL (SEQ ID NO: 14) 7.19.12 están conectadas con una región conectora (Gly4Ser) 3 para formar un gen de anticuerpo monocatenario (scFv), y luego se unen al vector T mediante T4 ligasa para obtener el plásmido recombinante scFv 7.19.12 (SEQ ID NO: 21).

En primer lugar, los segmentos del gen de VH que contienen sitios de restricción Ncol, Xhol y secuencias del conector parciales se obtienen mediante amplificación por PCR, utilizando ADN polimerasa pfu (adquirida en Beijing Whole Style Gold Biotech) con conexión VH5'NcoI y VH3'XhoI como cebadores, el plásmido de VH de 7.19.12 como molde; luego, los fragmentos del gen de VL que contienen la secuencia del conector parcial, los sitios de restricción SacI y NotI se obtienen mediante amplificación por PCR, utilizando ADN polimerasa pfu con cebadores VL5'linkSacI-K y VL3'NotI-K, el plásmido de VL de 7.19.12 como molde. Los fragmentos del gen de scFv 7.19.12 se obtienen mediante amplificación por PCR, usando ADN polimerasa pfu con los fragmentos de genes de VH y VL obtenidos como molde, y VH5'NcoI y VL3'NotI-K como cebadores. Los productos de scFv 7.19.12 obtenidos se extienden usando una polimerasa rTaq (disponible en TAKARA) a 72°C durante 1 hora, para añadir A en el extremo 3' del producto scFv. Después de añadir A, el producto scFv se recupera y se purifica a través de gel, el producto scFv purificado se conecta al vector pMD®18-T bajo la influencia de la ADN ligasa T4 (disponible en NEB) (16°C, 1 hora). E. coli se transforma con el método de choque térmico (42°C, 90 segundos), con el líquido bacteriano se recubren placas (medio LB Amp) y se incuban durante la noche a 37°C. Los clones se seleccionan para la identificación y el cribado por PCR de colonias (cebadores universales M13-47 y M13-48), se secuencian los clones positivos verificados por PCR, y se criban los plásmidos recombinantes de scFv 7.19.12. Los cebadores para construir scFV 7.19.12 se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: cebadores para construir scFv 7.19.12

Secuencias de ADN de 7.19.12 (SEQ ID NO: 18) de una región variable en la cadena pesada

CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCGAGTCCTGGGGCTTCAG

TGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGCTGCAG

T GGGTAAAGC AGAGGCCTGGAC AGGGTCTGGAAT GGATTGGGGCTATTTAT C

CTGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATT

GACTGCAGATAAATCCGCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCTTGACA

TCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGCGCAAGGAGGGGATCACGACGGGGGA

TTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Secuencias de ADN de 7.19.12 (SEQ ID NO: 19) de una región variable en la cadena ligera

AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGCCAGAG GGCCACCATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGT TTTATGCACTGGTACCAGCAGAGACCAGGACAGCCACCCACACTCCTCATCTA TCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGTCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCA ACCTATTACTGT C AGC AAGATAAT GAGGATCCGTAC ACGTTCGGAGGGGGGA CC AAGCTGGAAATAAAA

Secuencias de ADN de scFv 7.19.12 (SEQ ID NO: 20)

CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCGAGTCCTGGGGCTTCAG TGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGCTGCAG TGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATC CTGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATT GACTGCAGATAAATCCGCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCTTGACA TCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGCGCAAGGAGGGGATCACGACGGGGGA TTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCTCGAGTGG TGGTGGCGGTTCAGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGGAGCTCTAACATT GTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGCCAGAGGGCCAC CATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGTTTTATGC ACTGGTACCAGCAGAGACCAGGACAGCCACCCACACTCCTCATCTATCTTGC ATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGTCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGG ACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTA TTACTGTCAGCAAGATAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG CTGGAAATAAAA

Secuencia de aminoácidos de scFv 7.19.12 (SEQ ID NO: 21)

QVQLQQSGAELASPGASVKLSCKASGYTFTTYW LQW VKQRPGQGLEW IGAIYP GPGNTKYTQKFKDKATLTADKSASTAYM QLNSLTSEDSAVYYCARRGSRRGIAY W GQGTLYTYSAASSGGGGSGGGGSGGGGSSNIYLTQSPASLAVSLGQRATISCRA SESVDSYGRSFM HW YQQRPGQPPTLLIYLASNLESGVPVRFSGSGSRTDFTLTIDP VE A D D A AT Y YCQ QDNEDP YTF GGGTKLEIK

Ejemplo 10 Construcción del fagémido scFv 7.19.12 de tipo natural

Nanjing GenScript proporciona el vector fagémido pFL249, se utilizan NcoI y NotI como sitios de inserción del gen de scFv, pelB es el péptido señal (para guiar la secreción de scFv en el espacio periplásmico), gIII249 es el área de reconocimiento de fagos, se utiliza el gen de resistencia a ampicilina para cribar y mantener fagémidos. El marcador c-myc y el marcador his están conectadas a través del gen de scFv, el marcador his se usa en la purificación por afinidad y el marcador c-myc puede ser identificado por el anticuerpo de c-myc en la detección. El terminador succínico (TAG) existe entre su marcador y gIII. El ADN de fagémido tiene una función de inhibición parcial en la inhibición de E. coli tipo TG1 (disponible de Lucigen, n° cat. 60502-1) y puede presentar scFv en la superficie del fago ayudando al fago. El plásmido de scFv pMD18-7.19.12 se digiere doblemente con las enzimas de restricción NcoI y NotI (disponibles en NEB), para obtener fragmentos del gen de scFv 7.19.12 con extremos cohesivos, y los fragmentos del gen de scFv 7.19.12 se conectan con el vector pFL249 sometido al mismo proceso de doble digestión. En el Ejemplo 9 se describen métodos específicos de conexión, transformación e identificación, y el fago de scFv pFL249-7.19.12 de tipo natural se obtiene secuenciando los clones (véase la Fig. 6).

Ejemplo 11 Diseño de biblioteca de scFv 7.19.12 humanizado

Las secuencias de genes de VH y VL humanos que tienen la mayor homología con la región armazón del anticuerpo 7.19.12 (Regiones armazón, FR) se determinan mediante la base de datos de búsqueda IgBlast (genes V humanos IMGT (F ORF+ en marco P)). Las secuencias de FR se comprueban para determinar restos de aminoácidos diferentes entre las secuencias humanas y las secuencias de ratón, y se evalúa la importancia de cada resto en la unión del antígeno. Finalmente, las secuencias humanizadas y las secuencias murinas que tienen restos de aminoácidos diferentes, para los cuales no se puede determinar la importancia en la unión del antígeno, se indexan en secuencias de anticuerpos humanizados. Las mutaciones de la biblioteca de VH 7.19.12 humanizada del anticuerpo monoclonal murino (VL 7.19.12 está mutado de forma fija para las regiones FR de VH 7.19.12) se muestran en la Tabla 8, las mutaciones de la biblioteca de VL 7.19.12 humanizada del anticuerpo monoclonal murino (VH 7.19.12 está mutado de forma fija para regiones FR de VL 7.19.12) se muestran en la Tabla 9. La diversidad de diseño teórica de VH humanizada es 1x105, y la diversidad de diseño teórica de VL humanizada es 9216. La biblioteca de scFv 7.19.12 humanizado se sintetiza en una forma de bases degeneradas (la representación de bases degeneradas es la siguiente: N representa A/G/T/C, W representa A/T , B representa G/T/C, D representa G/A/T, R representa A/G, Y representa C/T, V representa A/G/C, M representa A/C, S representa G/C, H representa A/C/T, K representa G/T).

Tabla 8: Estrategia de mutación de biblioteca de VH humanizada de anticuerpos 7.19.12 de ratón

Tabla 9: Estrategia de mutación de la biblioteca de VL 7.19.12 humanizada de anticuerpos de ratón

Ejemplo 12 Construcción de la biblioteca de scFv 7.19.12 humanizado

La construcción de la biblioteca de scFv 7.19.12 del anticuerpo monoclonal de ratón anti-hRANKL se subcontrata a Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd. Ideas para la síntesis de la biblioteca: dividir respectivamente VH y VL en cuatro fragmentos de secuencias de oligonucleótidos de aproximadamente 60 ~ 75 pb con aproximadamente 20 pb que se solapan entre fragmentos, sintetizar la biblioteca de mutaciones de VH fijada para VL y la biblioteca de mutaciones de VL fijada para VH con el método de PCR de extensión solapada. Según los procedimientos operativos estándar de GenScript, los cebadores de V^h y cebadores de V^l sintetizados (véase la Tabla 10) se mezclan en cantidad equimolar, se hibridan, extienden y amplifican para obtener los fragmentos completos de VH, VL. Los fragmentos completos de V^h, V^l se purifican mediante gel y se clonan en vectores de secuenciación, se miden 15, 20 clones al azar para analizar la diversidad de productos de la PCR. Finalmente, se seleccionan el producto de la PCR purificado de V^h con porcentaje de clones de ORF normales de 60% y 66% en dos lotes y el producto de la PCR purificado de V^l con porcentaje de clones de ORF normales de 75%. El producto de la PCR purificado de VH se digiere doblemente con Sfi I y Xho I, y se conecta a un portador pFL249-7.19.12 scFv digerido doblemente con Sfi I y Xho I, TG1 se electrotransforma, y se construye la biblioteca de mutaciones de VH fijada para VL. El producto de la PCR purificado de VL se digiere doblemente con Sac I y Not I, y se conecta a un portador pFL249-7.19.12 scFv digerido doblemente con Sac I y Not I, TG1 se electrotransforma y se construye la biblioteca de mutaciones de VL fijada para VH. Se llevan a cabo ensayos de conexión y transformación eléctrica en la construcción de la biblioteca, y se llevan a cabo un gran número de conexiones y transformaciones eléctricas de acuerdo con las condiciones optimizadas. Se diluyen en gradiente 10 veces 100 gl de bacterias de recuperación de bibliotecas transformadas. Con 100 gl de cada una de las tres diluciones de 10-3 a 10-5 de suspensión bacteriana se recubren placas 2 x YT que contienen 100 gg/ml de ampicilina y se cultivan a 37°C durante la noche. Al día siguiente, la capacidad de la biblioteca se calcula mediante recuento de colonias y las bacterias de recuperación de biblioteca restantes se aplican como recubrimiento sobre placas 2 xYT (015 cm) que contienen 100 gg/ml de ampicilina y glucosa al 2% y se cultivan a 37°C durante la noche.

Al día siguiente, se raspa la colonia de la placa y se recogen las bacterias de la biblioteca, se resuspenden las bacterias de la biblioteca con glicerol hasta una concentración final de 40% (V/V) y las bacterias en glicerol de la biblioteca se almacenan -80°C.

El análisis estadístico muestra que la capacidad de la biblioteca de mutaciones de VH del primer lote es 1,35x107 (Tabla 11). Se seleccionan 144 transformantes aleatoriamente usando los cebadores M13R (-48) y M13F (-47) mediante cribado de colonias por PCR. Los transformantes de las bandas de ADN de aproximadamente 1500 pb (indicados por flechas) que aparecen en la electroforesis indican que el fragmento de inserción de VH está contenido, y los transformantes que no contienen bandas de ADN son ruido de fondo de vectores digeridos. Los resultados muestran que la tasa positiva es de 98.6% (142/144, figura 7). La capacidad de la biblioteca de mutaciones de VH del segundo lote es 1.04x107 (Tabla 12), se seleccionan aleatoriamente 96 transformantes usando los cebadores M13R (-48) y M13F (-47) mediante cribado de colonias por PCR, y los resultados del cribado de colonias por PCR muestran que la tasa positiva es de 99% (95/96, Fig. 8). La capacidad total de la biblioteca de mutaciones de VH es de aproximadamente 2,04x107. La concentración de bacterias después de la fusión de bacterias en dos lotes es de 6.7x109 ufc/ml. La capacidad de la biblioteca de mutaciones de VL es de 2.8x108, y la concentración de bacterias es 2 1011 ufc/ml (Tabla 12). Se seleccionan 144 transformantes aleatoriamente usando los cebadores M13R (-48) y M13F (-47) mediante cribado de colonias por PCR. Los transformantes de las bandas de ADN de aproximadamente 1500 pb (indicados por flechas) que aparecen en la electroforesis indican que el fragmento de inserción de VH está contenido, y los transformantes que no contienen bandas de ADN son ruido de fondo de vectores digeridos. Los resultados del cribado de colonias por PCR muestran que la tasa positiva es de 96.5% (139/144, Fig. 9). Se seleccionan aleatoriamente 100 colonias positivas mediante cribado de colonias por PCR de la biblioteca de mutaciones de VH/VL, respectivamente, y se secuencian. Los resultados de la secuenciación muestran que 58/70 clones pueden traducirse normalmente y ajustarse al diseño de la mutación, y la diversidad es equivalente al resultado del ensayo.

Tabla 10: Cebadores de VH, VL para la biblioteca de scFv humanizado 7.19.12 de anticuerpo de ratón para hRANKL

Nombre del cebador información de secuencia 5'-3 ' longitud (pb) P1455_Genor0012_VHFR1 F GGCCAT GGCCCAGGTT C AGCT C S WGCAGT CT GGGGCT G 67

(SEQ ID NO: 61) AACT GRHSMRKCCT GGGGCTT C AGT GAAG P1456_Genor0012_VHFR1 R CCAGTAGGT AGT AAAGGT GT AGCCAGAAGCCTT GCAGG 60

(SEQ ID NO: 62) ACAACTTCACTGAAGCCCCAGG

P1457_Genor0012_VHFR2F ACCTTT ACTACCT ACT GGCT GCAGT GGGT AMRRCAGRS 60

(SEQ ID NO: 63) BCCT GGACAGGGT CT GGAAT GG

P1458_Genor0012_VHFR2R GTCCTT GAACTTCTGAGT GT ATTT AGT ATT ACCAGGT CC 75

(SEQ ID NO: 64) AGGATAAATAGCCCCMAYCCATTCCAGACCCT

GTCC

P1459_Genor0012_VHFR3F ACT CAGAAGTT CAAGGACARRKY C ACAWTKACT GCAG 66

(SEC NO: 65) ATAMDT CCRMS AGCACAGCCTACAT GCAA P1460_Genor0012_VHFR3R GCAGT AAT AGACCGCAGAGT CTT CAGAYBT CAAGCT GT 60

(SEQ ID NO: 66) TGAGTT GCAT GT AGGCT GT GCT

P1461_Genor0012_VHFR4F T CT GCGGT CT ATT ACT GCGCAAGGAGGGGAT CACGACG 60

(SEQ ID NO: 67) GGGGATT GCTT ACT GGGGCCAA

P1462_Genor0012_VHFR4R CCGCCACCACCACTCGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAG 62

(SEQ ID NO: 68) AGTCCCTT GGCCCCAGT AAGCAAT

P1463_Genor0012_VHF ATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGG 44

(SEQ ID NO: 69) TTCAGC

P1464_Genor0012_VHR CCGCCACCACCACTCGAGGCTGCAGAG 27

(SEQ ID NO: 70)

P1465_Genor0012_VLFR1 F T GGGAGCT CT AACATT GT GCT GACCCAAT CT CCAGCTT C 64

(SEQ ID NO: 71) TTT GKCT GT GT CT CT AGGCC AGAGG

P1466_Genor0012_VLFR1 R ACT AT CAACACTTT C ACT GGCT CT GCAGGAAAT GGT GG 57

(SEQ ID NO: 72) CCCTCT GGCCT AGAGACAC

P1467_Genor0012_VLFR2F GCCAGT GAAAGT GTT GAT AGTT AT GGCAGAAGTTTTAT 54

(SEQ ID NO: 73) GCACT GGT ACCAGCAG

P1468_Genor0012_VLFR2R AGATTCTAGGTT GGAT GCAAGATAGAT GAGGAGYHBG 72 (SEQ ID NO: 74) GGDGV CTGTCCT GGT YT CT GCT GGT ACCAGT GCAT P1469_Genor0012_VLFR3F GCAT CCAACCT AGAAT CT GGGGT CCCTKYMAGGTT CAG 72 (SEQ ID NO: 75) T GGCAGT GGGT CTAGGACAGACTT CACCCTCACC P1470_Genor0012_VLFR3R CT GACAGT AAT AGGTT GCMDMAT C WT CAGCCT CCACN 63 (SEQ ID NO: 76) SBRYY AAT GGT GAGGGT GAAGT CTGT P1471_Genor0012_VLFR4F GCAACCT ATT ACT GT CAGCAAGAT AAT GAGGATCCGT A 54 (SEQ ID NO: 77) CACGTTCGGAGGGGGG

P1472_Genor0012_VLFR4R TTTTTGTTCT GCGGCCGCTTTT ATTTCCAGCTT GGT CCCC 54 (SEQ ID NO: 78) CCT CCGAACGT GT A

P1473_Genor0012_VLF GT GGCGGT GGGAGCT CT AACATT GT GCT GACC 32 (SEQ ID NO: 79)

P1474_Genor0012_VLR TTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATT 255*10 (SEQ ID NO: 80)

Tabla 11: Resultados estadísticos de la capacidad de la biblioteca de mutaciones de VH

Nota: Se obtienen 1.5x106 transformantes mediante una única electrotransformación de la biblioteca de mutaciones de VH del primer lote, se obtienen 1.3x106 transformantes mediante una única electrotransformación de la biblioteca de mutaciones de VH del segundo lote, se realizan 9 electrotransformaciones y 8 electrotransformaciones en la biblioteca de mutaciones de VH del primer lote y del segundo lote respectivamente, y la capacidad total de la biblioteca es de aproximadamente 2.4x107 transformantes.

Tabla 12: Resultados estadísticos de la capacidad de la biblioteca de mutaciones de VL

Nota: Se obtienen 2.8x107 transformantes mediante una única electrotransformación de la biblioteca de mutaciones de VL, se realizan 10 electrotransformaciones en la biblioteca de mutaciones de VL y la capacidad total de la biblioteca es de aproximadamente 2.8x108 transformantes.

Ejemplo 13 Selección de bibliotecas de presentación en fagos

En primer lugar, se amplifican las bibliotecas, se pone una cierta cantidad de líquido bacteriano en glicerol de la biblioteca de mutación de VH en 370 ml de medio 2xYT que contiene 100 gg/ml Amp y 2% de glucosa (en lo sucesivo, denominado 2xYT-AG), de modo que la OD600 esté en un intervalo de 0.05 a 0.1. El líquido bacteriano se cultiva con agitación a 200 rpm/min a 37°C, hasta que la OD600 alcanza un intervalo de 0.3 a 0.4. Se añade el fago auxiliar M13KO7 (disponible en NEB, n° cat. N0315S) en 20 veces el número total de células bacterianas al líquido bacteriano cultivado. Después de mezclar, el líquido bacteriano se infecta en reposo a 37°C durante 30 minutos, y luego se cultiva con agitación a 200 rpm a 37°C durante 1 hora. El líquido bacteriano se centrifuga a 2000 g durante 10 min, se retira el líquido sobrenadante y luego las bacterias se resuspenden en 370 ml de medio 2xYT que contiene 100 gg/ml de Amp y 50 gg/ml de kanamicina (en lo sucesivo denominado 2xYT-AK), se cultivan con agitación a 200 rpm/min a 30°C durante la noche (durante al menos 15 horas). Luego, el líquido bacteriano cultivado se transfiere a una botella de centrífuga de 500 ml, se centrifuga a 10000 g durante 15 min a 4°C, se obtiene el líquido sobrenadante y se añade a una solución de PEG/NaCl (de polietilenglicol (PEG) 8000 al 20% (P/V), NaCl 2.5 M) 1/4 de volumen del líquido sobrenadante, y se mezcla completamente y se deposita sobre hielo durante 1 hora. La solución mezclada se centrifuga a 8000 rpm durante 30 minutos a 4°C, se retira el líquido sobrenadante, la precipitación se resuspendió en 2.2 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO41,8 mM, pH 7,2 ~ 7,4). La suspensión se centrifuga a 10000 g durante 2 minutos a 4°C, el líquido sobrenadante (que muestra la biblioteca de fagos de scFv recombinante) se guarda como reserva a 4°C (se recogen 10 gl de líquido sobrenadante y se diluyen en gradiente de 10-2 a 10-10 para la determinación del título).

Se cultivan cepas de células CHO (C219) para expresar hRANKL de manera estable, se recoge el líquido sobrenadante celular, la proteína hRANKL se purifica con columna de Ni+ (véase la patente CN201310753972.3). El hRANKL se diluye con PBS a 10 gg/ml y se añade a tubos Immuno™ (adquiridos en NUNC, n° cat.470319) de acuerdo con 1 ml/tubo, recubiertos a 4°C durante la noche. Los tubos se lavan 3 veces con 5 ml de PBST (que contiene Tween 20 en PBS al 0.05% (V/V)), se añaden 5 ml de solución de bloqueo (solución de PBS que contiene 10% (P/V) de leche descremada) a los tubos y los tubos se cierran a temperatura ambiente (20~ 25°C) durante 2 horas (se cierra otro nuevo tubo Immuno™ con la solución de bloqueo como control negativo). Los tubos Immuno™ se lavan 3 veces con 5 ml de PBST. Los fagos recombinantes preparados se añaden a tubos Immuno™, se ponen en un agitador horizontal de baja velocidad a 60 rpm y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. Los tubos Immuno™ se lavan 10 veces con 5 ml de PBST y PBS respectivamente (el número de lavados aumenta a 15, 25 y 35 veces en la segunda, tercera y cuarta ronda, respectivamente). Después de lavar, se añade 1 ml en E. coli TG1 con OD600 de 0.3 a los tubos Immuno™, se dejan reposar a 37°C durante 1 hora. Se diluyen en gradiente 10 veces 20 gl de bacterias TG1 infestadas. 100 gl de las bacterias TG1 infestadas de cada uno de los tres gradientes de dilución de 10-2 a 10-4 se aplican como recubrimiento sobre placas SOB (09 cm) que contienen 100 gg/ml de ampicilina y glucosa al 2% (en lo sucesivo, SOBAG), y se incuban a 37°C durante la noche. Al día siguiente, la capacidad después de cada ronda de selección se calcula mediante el recuento de colonias. Las bacterias TG1 infestadas restantes se aplican como recubrimiento sobre placas SOBAG (09 cm) y se incuban a 37°C durante la noche. Al día siguiente, se raspa la colonia de la placa y se recogen las bacterias de la biblioteca, las bacterias de la biblioteca se resuspenden con glicerol hasta una concentración final de 20% (V/V). Las bacterias de la biblioteca se amplifican con el método de amplificación de bibliotecas descrito anteriormente para la selección de la siguiente ronda (el método de selección es el mismo que el anterior, la cantidad de antígeno hRANKL en el recubrimiento se reduce gradualmente para ser 10, 1, 0.05 y 0.01 gg/ml desde la primera ronda a la cuarta ronda). La selección de enriquecimiento para la biblioteca de mutaciones de VL es la misma que para la biblioteca de VH. La Tabla 13 muestra la cantidad introducida de fagos recombinantes y el número total de clones por ronda de selección. Como puede verse a partir de los datos, el número total de clones para el anticuerpo scFv se reduce a medida que la cantidad de antígeno disminuye gradualmente, es decir, los clones de scFv de unión no específica se reducen y los clones de scFv de unión específica se enriquecen.

Tabla 13. Cantidad introducida de fagos recombinantes y número total de clones por ronda de selección

Ejemplo 14 Cribado de la unión específica de scFv con hRANKL usando el método ELISA

Para cribar clones positivos capaces de unirse específicamente con hRANKL, los clones cribados en el ejemplo 13 son inducidos mediante IPTG para expresar scFv, y luego el scFv expresado se detecta con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (denominado ELISA). Para las bibliotecas de VH, VL, 5x96 clones seleccionados aleatoriamente de las placas de clonación de SOBAG obtenidas en la tercera ronda y la cuarta ronda se inoculan en placas de 96 pocillos profundos respectivamente, cada pocillo contiene 400 gl de medio 2xYT-AG, el líquido bacteriano se cultiva con agitación, a 30°C, 200 rpm durante la noche. Al día siguiente, el líquido bacteriano de la placa de pocillos profundos se transfiere 1:50 a una nueva placa de 96 pocillos profundos que contiene 400 gl de medio de nueva aportación 2xYT-AG. El líquido bacteriano se cultiva con agitación a 37°C, 200 rpm hasta que la OD600 es de aproximadamente 0.8 (durante aproximadamente 3 horas). Las bacterias se recogen mediante centrifugación a 1500 g durante 10 minutos, se retira el líquido sobrenadante y las bacterias se resuspenden con 400 gl de medio de cultivo 2xYT-AI estéril (I se refiere a IPTG, con una concentración final de 100 mM) de nueva aportación, la suspensión se cultiva con agitación a 30°C, 200 rpm durante la noche (es decir, se induce la expresión de scFv durante la noche). El líquido sobrenadante de scFv expresado inductivamente en la placa de pocillos profundos se centrifuga a 3000 g durante 20 min, se transfieren 300 gl de líquido sobrenadante a una placa de células de 96 pocillos limpia para reserva.

El hRANKL se diluye con 1 xPBS (pH 7.4) a 1 pg/ml, se añade a una placa de microtitulación de 96 pocilios (disponible en NUNC, n° cat. 442404) de acuerdo con 50 pl/pocillo, con un total de 10 placas. El hRANKL forma recubrimiento a 4°C durante la noche. Las placas se lavan tres veces con PBST (que contiene Tween 20 al 0.05%). Las placas se cierran con solución de bloqueo (solución de PBS que contiene BSA al 2% (p/v)) durante 1 ~ 1.5 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan tres veces con PBST y luego el líquido sobrenadante de scFv inducido se transfiere a una placa de microtitulación cerrada, con 50 pl/pocillo, y se usa un pocillo que contiene solo medio 2xYT-AI como control negativo, y un pocillo que contiene líquido sobrenadante scFv de 7.19.12 de tipo natural se utiliza como control positivo. La placa de microtitulación cerrada se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente, se lava tres veces con PBST. A continuación, se añade una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario anti-c-myc marcado con HRP (adquirido de Bethyl, número de artículo A190-104P) y la placa de microtitulación se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa de microtitulación seis veces con PBST, se añade el sustrato TMB (adquirido en Cell Signaling Technology, n° cat. 7004) y las muestras se colorean a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añaden 50 pl de HCl 2 M a cada pocillo para terminar el color, y la lectura de la OD450 nm se detecta utilizando el equipo M5.

Si la OD450> 0.4, se considera una coloración positiva. Los resultados muestran que se obtienen 534 clones positivos capaces de unirse con hRANKL en bibliotecas de VH, y la tasa positiva es de 94% (véase Fig.10), se seleccionan un total de 179 clones para los cuales la OD450> 1.2 y se envían a organismos de Shanghai Megiddo utilizando cebadores M13R (-48) para la secuenciación. Mediante el análisis de secuencia, tres secuencias de VH tienen mayor grado de mutación humanizada, que incluyen 11 mutaciones, que cumplen los requisitos de grado humanizado, los tres clones se numeran pFL249-H16, pFL249-H16u y pFL249-H114; se obtienen 486 clones positivos capaces de unirse con hRANKL en bibliotecas de VL, y la tasa positiva es de 86% (véase la Fig.11), 33 clones para los cuales OD450> 1.0 en la tercera ronda y 114 clones para los cuales OD450> 1.5 en la cuarta ronda son seleccionados y enviados a organismos de Shanghai Megiddo utilizando los cebadores M13R (-48) para la secuenciación. Mediante el análisis de secuencia, cuatro secuencias de VL tienen mayor grado de mutación humanizada, que incluyen 9 mutaciones, que cumplen los requisitos de grado humanizado, los cuatro clones se numeran pFL249-L10, pFL249-L10u, pFL249-L37 y pFL249-L37u.

Ejemplo 15 Construcción de vectores de expresión para la cadena pesada y ligera en el anticuerpo anti-hRANKL humanizado

Se construyen tres regiones variables de cadena pesada H16 (SEQ ID NO: 23), H16u (SEQ ID NO: 25) y H114 (SEQ ID NO: 27) obtenidas mediante la plataforma de cribado de fagos para que sean cadenas pesadas de longitud completa de tipo IgG2, respectivamente, y se construyen cuatro regiones variables de cadena ligera L10 (SEQ ID NO: 31), L10u (SeQ ID NO: 33), L37 (SEQ ID NO: 35) y L37u (SEQ ID NO: 37) para que sean cadenas ligeras de longitud completa de tipo Kappa respectivamente. Las cadenas pesadas de longitud completa y las cadenas ligeras de longitud completa se construyen en el vector de expresión eucariota pCDNA3.1. De acuerdo con las secuencias determinadas de clones positivos obtenidas por cribado de fagos, las regiones armazón (armazón, en los sucesivo denominadas FR) FR1, FR2, FR3 y FR4 en la región variable de la cadena ligera y pesada se comparan a través de la base de datos de búsqueda IgBlast (Genes V humanos IMGT (F ORF en el marco P)), para obtener una región FR humana con la mayor homología, y la región FR humana se combina con la región FR humana de tipo natural CDR 7.19.12 para obtener una nueva VH (secuencia denominada H16 (hFR), SEQ ID NO: 29) y VL (denominada WT-VL (hFR), SEQ ID NO: 39). Los genes de la región variable se obtienen mediante síntesis génica completa, y las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa se construyen con el método anterior y se conectan a un vector de expresión pCDNA3.1. La tabla 14 muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de la región variable en la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-hRANKL, la tabla 15 muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de la región variable en la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-hRANKL, y 7.19.12 representa la secuencia de ratón original.

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 22) de una región variable en la cadena pesada H16

C AGGTT C AGCTCGT GC AGT CTGGGGCTGAACTGAAGAAGCCTGGGGCTTC AG

TGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGCTGCAG

T GGGTAAGGC AGGCTCCTGGAC AGGGTCTGGAAT GGAT GGGGGCTATTTATCC

TGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAGATTCACAATTA

CTGCAGATAAGTCCAAGAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCTTGAAGTC

TGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGCGCAAGGAGGGGATCACGACGGGGGATT

GCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de una región variable en la cadena pesada H16 QYQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYTFTTYWLQWVRQAPGQGLEWMGAIY PGPGNTKYTQKFKDRFTITADKSKSTAYMQLN SLKSEDS AVYY CARRGSRRGIA YWGQGTLVTV S A

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 24) de una región variable en la cadena pesada H16u C AGGTT C AGCTCGT GC AGT CTGGGGCTGAACTGAAGAAGCCTGGGGCTTC AG TGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGCTGCAG TGGGTAAGGCAGGCTCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATGGGGGCTATTTATCC TGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAGATTCACAATTA CTGCAGATACGTCCAAGAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCTTGAAGTC TGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGCGCAAGGAGGGGATCACGACGGGGGATT GCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una región variable en la cadena pesada H16u QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYTFTTYWLQWVRQAPGQGLEWMGAIY PGPGNTKYTQKFKDRFTITADTSKSTAYMQLN SLKSEDS AVYY CARRGSRRGIAY WGQGTLVTV S A

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 26) de una región variable en la cadena pesada H114 CAGGTTCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGCAGCCTGGGGCTTCAG TGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGCTGCAG T GGGTAAGGC AGACTCCTGGAC AGGGTCTGGAAT GGAT GGGGGCTATTTATCC TGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAGGGTCACAATTA CTGCAGATACATCCACCAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCTTGAGATCT GAAGACTCTGCGGTCTATTACTGCGC AAGGAGGGGAT C ACGACGGGGGATTG CTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) de una región variable en la cadena pesada H114 QVQLVQSGAELVQPGASVKLSCKASGYTFTTYWLQWVRQTPGQGLEWMGAIY PGPGNTKYTQKFKDRVTITADTSTSTAYMQLNSLRSEDSAVYYCARRGSRRGIAY WGQGTLVTV S A

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 28) de una región variable en la cadena pesada H16(hFR) CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCACCTACTGGCTGCA GT GGGTAAGGC AGGCTCCTGGAC AGGGTCTGGAAT GGAT GGGGGCTATTTAT CCTGGACCTGGTAATACTAAATACACTCAGAAGTTCAAGGACAGAGTCACGA TTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGT GTATTACTGT GCGAGAAGGGGAT C ACGACGGGGG ATTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) de una región variable en la cadena pesada H16(hFR) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWLQWVRQAPGQGLEWMGAI YPGPGNTKYTQKFKDRYTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAYYYCARRGSRRGIA YWGQGTLVTV S A

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 30) de una región variable en la cadena ligera L10 AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGTCTGTGTCTCTAGGCCAGAG GGCCACCATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGT TTTATGCACTGGTACCAGCAGAGACCAGGACAGGCTCCCAGACTCCTCATCTA TCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGAGGC AACCTATTACTGT C AGC AAGATAAT GAGGATCCGTAC ACGTTCGGAGGGGGG ACC AAGCTGGAAATAAAA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 31) de una región variable en la cadena ligera L10 NIVLTQSPASLSVSLGQRATISCRASESYDSYGRSFMHWYQQRPGQAPRLLIYLA SNLESGVPARF SGSGSRTDFTLTIS S VEAEDEAT YY CQQDNEDP YTF GGGTKLEIK

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 32) de una región variable en la cadena ligera L10u AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGTCTGTGTCTCTAGGCCAGAG GGCCACCATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGT TTTATGCACTGGTACCAGCAGAGACCAGGACAGGCTCCCAAACTCCTCATCTA TCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGAGGC AACCTATTACTGT C AGC AAGATAAT GAGGATCCGTAC ACGTTCGGAGGGGGG ACC AAGCTGGAAATAAAA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 33) de una región variable en la cadena ligera L10u NIVLTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDSYGRSFMHWYQQRPGQAPKLLIYLA SNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTISSVEAEDEATYYCQQDNEDPYTFGGGTKLEIK

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 34) de una región variable en la cadena ligera L37 AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGTCTGTGTCTCTAGGCCAGAG GGCCACCATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGT TTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGGCACCCAAGCTCCTCATCTA TCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAGCGCAGTGGAGGCTGAAGATGCGGC AACCTATTACTGT C AGC AAGATAAT GAGGATCCGTAC ACGTTCGGAGGGGGG ACC AAGCTGGAAATAAAA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 35) de una región variable en la cadena ligera L37 NIVLTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDSYGRSFMHWYQQKPGQAPKLLIYLA SNLE S GVP SRF S GS GSRTDF TLTIS AVE AED A AT Y Y CQQDNEDP YTF GGGTKLEIK Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 36) de una región variable en la cadena ligera L37u AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGTCTGTGTCTCTAGGCCAGAG GGCCACCATTTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAGAAGT TTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGGCACCCAAGCTCCTCATCTA

C TAGGAC AGAC TTCACCCTCACCAT TAGC AGAGT GGAGGC T GA AGAT GC GGC A AC C TATTAC T GTC AGC A AGATA AT GAGG AT C C GTAC AC GTTC GG AGGGGGG AC C A AGC T GGA A ATA A A A

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 37) de una región variable en la cadena ligera L37u NIVLTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDSYGRSFMHWYQQKPGQAPKLLIYLA SNLE S GVP SRF S GS GSRTDF TLTISRVE AED A AT Y Y C QQDNEDP YTF GGGTKLEIK

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 38) de una región variable en la cadena ligera de WT-VL(hFR) GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGA GGGC C AC C ATC AAC TGC AGAGCC AGT GAAAGT GTTGATAGTTAT GGC AGAAG TTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCT ATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGA TCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCTGAAGATGCTGC AAC GTATTAC T GTC AGC A AGATA AT GAGGAT C C GTAC AC GTTC GG AGGGGGG AC C A AGC T GGA A ATA A A A

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 39) de una región variable en la cadena ligera de WT-VL(hFR) DIYMT Q SPD SL AVSLGERATINCRASE S VD S Y GRSFMHW Y QQKPGQ APRLLIYL ASNLES GVP SRF S GS GS GTDF TLTIN SLE AED A AT Y Y C QQDNEDP YTF GGGTKLEIK

Tabla 14. Alineamientos la secuencias de aminoácidos de la región variable en la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-rRANKL

nombre

_anticuerpo FUI C O ftl FR2 COR2 FR3 CDR5 FR4 7.19.12 QVQLQQSGAELAS PG AS VKLSCKAS GYTF7TYWLQ WVKQRPGQGLEW3G A1YPGPGNTKYTQKFKD KATLTADKSASTAYMQLNSL7SE0SAVYYCAS RGSRRGÍAY WGQGTLVTVSA H16 GVQLVQSGAfUKPGASVKtSCKAS GYTFTTYWLQ WVRQAPGQGLEWMG AIYPGPGNTKTTQKFKQ RFTFFADKSKSTAYMQLNSLKSEDSAVYYCAR RGSRRG5AY WGQGTLVTVSA H16lí ClVQtVQS GAELKKPGASVKLSCKAS GYTFTTYWLQ WVRQAPGQGLEWMG A1YPGPGNTKYTQKFKD RFTITADTSKSTAYMQLNSLKSEOSAWYCAR RGSRRGáAY WGQGTLVTVSA H114 aVQLVQSGAELVQPGASVKtSCKAS GYTFTTYWLQ WVRQTPGQGLEWMG A1YPGPGNTKYTQKEKD RVT1TADTST5TA YMQLN5 LR SE DSAVYYCAR RG5RRGIAY WGQGTLVTVSA H16(hFR) QVQIVQSGAEVK KP6A5VRVSCKAS GYTFTTYWLQ WVRQAPGQGLEWMG A1YPGPGNTKYTQKFKO RVT1TAOESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RGSRRGíAY WGQGTLVTVSA

Tabla 15. Alineamientos de secuencias de aminoácidos de la región variable en la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-hRANKL

nombre

anticuerpo FR1 C D ft l FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

7.19.12 NIVLTQSPASIAVSLGQRAT1SC RASESVDSYGRSFMH WYQQRPGQPPTLL1Y LASNLES GVPVRFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC QQDNEDPYT F GGGTKLEIK

t lO PilVLTQSPASLSVSLGafiATIS-C RASESVDSYGRSFMH WYQQRPGQAPSLUY LASNLES GVPARFSG5GSRTDFTLTISSVEAEDEATYYC GQDNEOPYT FGGGTKLE1K U O u NiVLTQSPASLSVSIGQRATISC RASESVDSYGRSFMH WYQQRPGQAPKLUY LASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTtSSVEAEOEAFYYC Q Q DNEDPYr FGGGTKLEIK 137 NiVLTQS PASES VSLGQRATISC RASES VDSYGRSF M H WYQQKPGQAPKLLÍY LASNLES GVPSRFSGSGSRTDFTLT1SAVEAEQAATYYC QQDNEDPYT FGGGTKLEIK 137b NIVLTQS PASLSVSLGQRATISC RASESVDSYGRSFMH WYQQKPGQAPKLUY LASNLES GVPSRFSG5GSRTDFTLTISRVEAEDAATYYC QQDNEDPYT EGGGTtLEtK W T V I (hFR) PtVMTQSPDSLAVSLGERATiNC RASESVDSYGRSFMH WYQQKPGQAPRELIY LASNLES GVPSRF5G5GSGTDFTLTINSLEAEDAA7YYC QQDNEDPYT FGGGTKLEIK Construcción del vector de expresión para la cadena pesada de longitud completa H16

La región variable VH de la cadena pesada H16 se obtiene mediante amplificación por PCR, tomando el plásmido pFL249-H16 como molde; tomando el plásmido de la región constante de la cadena pesada de tipo IgG2 humana sintetizado genéticamente como molde, se obtienen fragmentos de gen de la región constante de la cadena pesada de tipo IgG2 humana (SEQ ID NO: 41) mediante amplificación por PCR; el gen de la cadena pesada H16 de VH-CH (Se Q ID NO: 47) que contiene el péptido señal de expresión de mamífero (SEQ ID NO: 45) se amplifica mediante la técnica de PCR solapada; los genes de la cadena pesada de longitud completa H16 se construyen en vectores pCDNA3.1 (+) (disponible en el mercado en Invitrogen, n° cat. V790-20) para obtener vectores de expresión de la cadena pesada de longitud completa H16.

Los fragmentos del gen de CH de tipo IgG2 y VH H16 se amplifican con ADN polimerasa pfu (adquirida de Beijing Whole Style Gold Biotech). Los fragmentos de gen de VH que contienen una parte del péptido señal eucariota se obtienen mediante amplificación por PCR, con Whole-1 H-F y Whole-1 H-R como cebadores, y el plásmido pFL249-H16 como molde; los fragmentos de gen de CH que contienen el codón de terminación TAG y los sitios de restricción NotI se obtienen mediante amplificación por PCR, con IgG2-CH-F e IgG2-CH-R como cebadores y el plásmido de IgG2 humana como molde. Hay secuencias solapadas de al menos 20 pb entre los fragmentos de gen de VH y los fragmentos de gen de CH. Las condiciones para la PCR son: 95°C X 2 min, [95°C X 20 segundos, 55°C X 20 segundos, 72°C X 40 segundos] durante 30 ciclos, 72°C X 5 min.

Los genes de la cadena pesada H16 se amplifican usando ADN polimerasa pfu. Los genes de la cadena pesada H16 que contienen sitios de restricción EcoRI y NotI, y la secuencia del péptido señal eucariota se obtienen mediante amplificación por PCR, con los fragmentos de los genes de VH y CH obtenidos mediante la PCR antes mencionada como molde, Whole-SP-F e IgG2-CH-R como cebadores. Las condiciones para la PCR son: 95°C X 2 min, [95°C X 20 segundos, 55°C X 20 segundos, 72°C X 100 segundos] durante 35 ciclos, 72°C X 5 min.

Los genes de la cadena pesada H16 obtenidos anteriormente se procesan con el método de adición de A del Ejemplo 9, se recuperan después del gel y se purifican, y se conectan al vector simple pMD®19-T bajo la influencia de la ADN ligasa T4 (disponible en NEB Inc.) (16°C, 1 hora) y E. coli se transforma por choque térmico (42°C, 90 segundos). Las muestras se aplican como recubrimiento sobre placas (medio LB Amp), se cultivan a 37°C durante la noche. Se seleccionan los clones para la identificación y cribado de colonias por PCR (cebadores comunes M13-47 y M13- 48). Los plásmidos se extraen de los clones positivos mediante identificación por PCR. Los clones positivos se digieren doblemente con EcoRI y NotI, y se recuperan aproximadamente 1500 pb del fragmento de la cadena pesada H16 después del gel y se conectan al vector pCDNA3.1 (+) recuperado después del gel después del mismo proceso de doble digestión. La secuenciación de los clones de la cadena pesada de IgG2 H16 muestra que la longitud completa del plásmido recombinante es de 6800 pb, que contiene la región variable de la cadena pesada H16 y la región constante de la cadena pesada de IgG2 humana (la figura 12 muestra un mapa del plásmido de la cadena pesada H16).

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 40) de una región constante en la cadena pesada de IgG2

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCA

CCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGA

ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACAC

CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA

CCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCA

C AAGCCC AGC AATACC AAGGT GGAC AAGAC AGTTGAGCGC A AAT GTTGT GT C

GAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCT

TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC

GT GCGT GGTGGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCCGAGGT CC AGTTC AACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGA GCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAG GACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGG TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCAT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 41) de una región constante en la cadena pesada de IgG2

AS TKGP S VFPL APC SRS T SE S TA ALGCLVKD YFPEP VT V S WN SG ALT SGVHTFPA VLQ S S GLY SL S S V VT VP S SNF GTQT YT CN VDHKP SNTK VDKT VERKC C VECPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRVV S VLT VVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPAPIEKTISKT KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 44) de la expresión de péptidos señal para mamíferos ATGGAGTTGGGACTGTCTTGGATTTTCCTGTTGGCTATTCTGAAAGGTGTGCA GTGT

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 45) de la expresión de péptidos señal para mamíferos MELGLSWIFLLAILKGVQC

Construcción de vectores de expresión para la cadena ligera L10

La región variable de la cadena ligera VL L10 se obtiene mediante amplificación por PCR, con el plásmido pFL249-L10 como molde; el fragmento de gen de la región constante de la cadena ligera Kappa humana (SEQ ID n O: 43) se obtiene mediante amplificación por PCR, con el plásmido de la región constante de la cadena ligera Kappa humana genéticamente sintetizado como molde; los genes de la cadena ligera L10 VL-CL (SEQ ID NO: 52) que contienen el péptido señal de expresión de mamífero (SEQ ID NO: 45) se amplifican mediante la técnica de PCR solapada; los genes de la cadena ligera L10 se construyen en el vector pCDNA3.1 (+) para obtener el vector de expresión de la cadena ligera L10.

Los fragmentos del gen de VL L10 y CL de cadena ligera Kappa se amplifican con ADN polimerasa pfu (adquirida en Beijing Whole Style Gold Biotech). Los fragmentos del gen de VL que contienen una parte del péptido señal eucariota se obtienen mediante amplificación por PCR, con Whole-1 L-F y Whole-1 L-R como cebadores y el plásmido pFL249-L10 como molde; los fragmentos de gen de CL que contienen el codón de terminación TAG y los sitios de restricción NotI se obtienen mediante amplificación por PCR, con CL-F y CL-R como cebadores y el plásmido de la cadena ligera Kappa humana como molde. Hay secuencias solapadas de al menos 20 pb entre los fragmentos del gen de VL y los fragmentos del gen de CL. Las condiciones para la PCR son: 95°C X 2 min, [95°C X 20 segundos, 55°C X 20 segundos, 72°C X 40 segundos] durante 30 ciclos, 72°C X 5 min.

Los genes de la cadena ligera L10 se amplifican usando ADN polimerasa pfu. Los genes de la cadena ligera L10 que contienen sitios de restricción EcoRI y NotI, y la secuencia del péptido señal eucariota se obtienen mediante amplificación por PCR, con los fragmentos de genes de VL y CL obtenidos mediante la PCR mencionada anteriormente como molde, Whole-1L-F y CL-R como cebadores. Las condiciones para la PCR son: 95°C X 2 min, [95°C X 20 segundos, 55°C X 20 segundos, 72°C X 100 segundos] durante 35 ciclos, 72°C X 5 min.

Los genes de la cadena ligera L10 obtenidos anteriormente se procesan con el método de adición de A del Ejemplo 9, se recuperan después del gel y se purifican, y se conectan al vector simple pMD®19-T bajo la influencia de la ADN ligasa T4 (disponible en NEB Inc.) (16°C, 1 hora), y E. coli se transforma por choque térmico (42°C, 90 segundos). Las muestras se aplican como recubrimiento sobre placas (medio LB Amp), se cultivan a 37°C durante la noche. Los clones se seleccionan para la identificación y cribado de colonias por p Cr (cebadores comunes M13-47 y M13-48). Los plásmidos se extraen de los clones positivos mediante identificación por PCR. Los clones positivos se digieren doblemente con EcoRI y Notl, y se recuperan aproximadamente 750 pb del fragmento de cadena ligera L10 después del gel y se conectan al vector pCDNA3.1 (+) recuperado después del gel después del mismo proceso de doble digestión. La secuenciación de los clones de la cadena ligera L10 muestra que la longitud completa del plásmido recombinante es 61223 pb, que contiene la región variable de la cadena ligera L10 y una región constante de la cadena ligera Kappa humana (la Fig. 13 muestra el mapa del plásmido de la cadena ligera Kappa L10). La Tabla 16 muestra una lista de cebadores para construir portadores para una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-hRANKL. Los plásmidos restantes de las tres cadenas pesadas (H16u, H114 y H16 (hFR)) y las cuatro cadenas ligeras (L10u, L37, L37u y WT-VL (hFR) similares) se construyen con el mismo método, que no se describe en detalle en el presente documento.

Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 42) de una región constante en la cadena ligera Kappa

GGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGT

Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 43) de una región constante en la cadena ligera Kappa

GTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE S YTEQD SKD ST YSL S S TLTL SK AD YEKHK Y YACE YTHQGL S SP VTK SFNRGEC

Tabla 16. Lista de cebadores para construir portadores de una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-hRANKL

Ejemplo 16 Expresión y purificación del anticuerpo humanizado anti-hRNAKL

Los anticuerpos anti-hRNAKL recombinantes son producidos por células FreeStyle™ 293-F (adquiridas en Invitrogen, n° cat. R790-07). Las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera completas se han clonado en un vector de expresión de mamífero, como se detalla en el Ejemplo 15. Los vectores que expresan una cadena pesada completa y una cadena ligera completa se cotransfectan en células 293F bajo la mediación del polímero catiónico PEI (disponible en Polysciences, n° cat.23966-2) para producir los anticuerpos anti-hRNAKL. Por ejemplo, los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G1; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G2; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 53) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G3; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID n O: 47) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G4; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 55) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G5; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G6; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 53) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G7; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID n O: 48) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G8; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 55) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G9; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G10; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 53) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G11; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G12; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 55) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G13; los vectores que expresan la cadena pesada completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50) y la cadena ligera completa (número de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56) se cotransfectan en células 293F para producir anticuerpos G14. La Tabla 17 muestra una lista de combinaciones de cadena pesada y cadena ligera para el anticuerpo anti-hRANKL.

Tabla 17. Lista de combinaciones de cadena pesada y cadena ligera para el anticuerpo anti-hRANKL

Durante las 24 horas previas a la transfección, las células 293-F se subcultivan a una densidad de 6 ~ 7x105 células/ml, cultivadas en condiciones de 8% de CO2, 135 rpm a 37°C. Al día siguiente, se determina la densidad y viabilidad de las células utilizando un hemocitómetro, para asegurar que la viabilidad sea superior a 95%. La densidad de las células se ajustó a 1x106/ ml para experimentos de transferencia instantánea. Se añaden 15 pg de cada uno de los plásmidos de cadena ligera y los plásmidos de cadena pesada en OptiPRO SFM (adquirido en Invitrogen) con un tubo de centrífuga (tubo A), con un volumen final de 600 pl, y se mezclan suavemente; se añaden 90 pg de reactivo de transfección PEI en OptiPRO SFM con un nuevo tubo de centrífuga (tubo B), con un volumen final de 600 pl, y se mezcla suavemente. Al instante, el líquido del tubo B se introduce en el tubo A y se mezcla suavemente. La mezcla de A y B se pone a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añade gota a gota a 30 ml de células 293-F. Las células son transfectadas y luego se cultivan en un agitador a 372C, 8% de CO2, 135 rpm. De 6 a 7 días después de la transfección, se mide la viabilidad de las células transfectadas, se recogen y purifican los líquidos sobrenadantes celulares en el caso de que la viabilidad celular sea inferior a 50%.

Los líquidos sobrenadantes celulares se recogen después de centrifugación a 9000 rpm durante 30 minutos y los anticuerpos se purifican usando una columna de gravedad de rProteína A (disponible en GE, Best Chrom). Se utilizan 5-10 volúmenes de columna de solución de equilibrado (Tris-HCl 20 mM NaCl 0.15 M pH 7.4) para el equilibrado, y el caudal de las muestras se controla para que sea menor o igual a 1 ml/min. Una vez terminadas las muestras, se utilizan 5-10 volúmenes de columna de solución de equilibrado para el equilibrado. Los anticuerpos se eluyen con ácido cítrico 100 mM (pH 3,0), el eluyente recogido se neutraliza con Tris-HCl 1 M (pH 9.0) y se ajusta para tener un pH de aproximadamente 6.0. La solución de anticuerpo se concentra por centrifugación con un tubo de ultrafiltración de 10 KD (disponible en Millipore Corporation, n° cat. UFC901008) y se resuspende con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM, pH 7.2 ~ 7.4). La concentración de proteínas de la suspensión de anticuerpos se determina usando el kit de ensayo de concentración de proteína BCA modificado (adquirido en Shanghai Sangon), y la suspensión de anticuerpos se filtra y esteriliza usando una membrana 0.22 pM (disponible en Millipore Corporation, n° cat. SLGP033RB), y se guarda en envases a -80°C.

Ejemplo 17 Detección de la capacidad de unión entre el anticuerpo humanizado y hRNAKL mediante el método ELISA

El hRANKL se diluye a 1 pg/ml con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO41.8 mM, pH 7.2 ~ 7.4), se añade a una placa de microtitulación de 96 pocillos (disponible en NUNC) de acuerdo con 100 pl/pocillo. Se forma recubrimiento sobre la placa de microtitulación a 4°C durante la noche. Las placas se lavan tres veces con PBST (solución de PBS que contiene Tween20 al 0.05%). Las placas se cierran con solución de bloqueo (solución de PBS que contiene BSA al 2% (P/V), abreviado como PBS-BSA 2%) durante 1 ~ 1,5 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo humanizado G2-G14, anticuerpo murino G1 y un control positivo Prolia (disponible en el mercado en Amgen Corporation, número de lote 1021139) se diluyen respectivamente 3 veces desde 1 pg/ml hasta 0.0002 pg/ml con un líquido de dilución de muestra (PBS-BSA al 1 %), se añaden a la placa de microtitulación con 100 pl/pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavan tres veces con PBST y el anticuerpo de cabra anti-IgG Fc humana marcado con HRP (Jackson, artículo n° 109-035-098) se diluye a 1:10000 con PBS-Bs A al 1%, se añade a la placa de microtitulación con 100 pl/pocillo, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar las placas seis veces con PBST, se añade sustrato TMB (Cell Signalling, artículo n° 7004) a la placa de microtitulación y la muestra se colorea a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añaden 100 pl de HCl 2 M a cada pocillo para terminar el color, y se detecta la lectura de OD450 nm usando el equipo M5.

Se obtiene una curva de unión de anticuerpos y hRANKL (Fig.14A/14B/14C) usando log (agonista) frente a respuesta - método de encapsulamiento de pendiente variable, con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). Los resultados muestran que, 13 anticuerpos humanizados son capaces de unirse con hRANKL de forma dependiente de la concentración y pueden alcanzar la saturación, alcanzan 50% del grado máximo de unión cuando la concentración de anticuerpo está entre 1-4 ng/ml, tienen una capacidad de unión considerable en comparación con G1 y Prolia. Las concentraciones de anticuerpos cuando se alcanza 50% del grado máximo de unión se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Comparación de concentraciones de anticuerpos en un caso en que el anticuerpo humanizado se une a hRANKL hasta un nivel de 50% de Bmáx

Ejemplo 18 Detección de la capacidad de inhibición de anticuerpos humanizados para la unión de RANK-Fc y hRANKL mediante el método de ELISA competitivo

Se llevan a cabo experimentos de ELISA competitivos para evaluar la capacidad de los anticuerpos humanizados de hRANKL para inhibir la unión del receptor RANK-Fc y el ligando hRANKL, en comparación con Prolia. RANK-Fc se diluye con PBS a 2 pg/ml, se añade a la placa de microtitulación con 100 pl/pocillo, se forma recubrimiento sobre la placa de microtitulación a 4°C durante la noche. El anticuerpo humanizado (G2-G14), anticuerpo de ratón (G1) y el control positivo Prolia se diluyen con diluyente de muestra (PBS-BSA al 1%). El anticuerpo mencionado anteriormente con las concentraciones finales de 30, 10, 3.3, 1.1,0.37, 0.12, 0.04, 0.01,0.005, 0.0015, 0.0005 pg/ml respectivamente se mezcla con 0.25 pg/ml de hRANKL, y la mezcla se preincuba a 4°C durante la noche. La placa se lava tres veces con PBST (solución de PBS que contiene Tween20 al 0.05%), la placa se cierra con solución de bloqueo (PBS-BSA 2%) durante 1 ~ 1,5 horas a temperatura ambiente, y luego la placa se lava tres veces con PBST. La mezcla preincubada se añade a la placa de microtitulación cerrada con 100 pl/pocillo, se usa un pocilio con PBS-BSA al 1% como control negativo y un pocillo que contiene solo 0.25 pg/ml de hRANKL se usa como control positivo. Reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lava tres veces con PBST, el anticuerpo anti-marcador His marcado con HRP (adquirido en Abcam, n° cat. Ab1187) se diluye a 1:5000 con una solución de PBS que contiene BSA al 1% y Tween al 0.05% y se añade a una placa de microtitulación con 100 pl/pocillo, y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa seis veces con PBST, se añade sustrato TMB (Cell Signaling, artículo N° 7004) a la placa de microtitulación y la muestra se colorea a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añaden 100 pl de HCl 2 M a cada pocillo para terminar el color, y se detecta la lectura de OD450 nm usando el equipo M5.

Se obtiene una curva de anticuerpos que inhiben competitivamente la unión del receptor y ligando (véase FIG.

15A/15B/15C) usando log (agonista) frente a respuesta, método de encapsulación de pendiente variable con la concentración de anticuerpo en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo en ordenadas (GraphPad Prism Software). Los resultados muestran que 13 anticuerpos humanizados tienen una actividad de inhibición significativa y son capaces de inhibir la unión de RANK-Fc y hRANKL de forma dependiente de la concentración. Los valores de CI50 medidos para Prolia son 0.13 pg/ml, los valores de CI50 para 13 anticuerpos humanizados están en un intervalo de 0.1-0.4 pg/ml, que son equivalentes a la actividad de inhibición de G1 y Prolia. Los valores de CI50 para el anticuerpo humanizado que inhibe competitivamente la unión de RANK-Fc y hRANKL se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Comparación de los valores de CI50 para el anticuerpo humanizado que inhibe competitivamente la unión de RANK-Fc y hRANKL

Ejemplo 19 El anticuerpo humanizado hRANKL inhibe el experimento de la diferenciación celular inducida de RAW264.7

El hRANKL puede inducir la diferenciación de células RAW264.7 células de leucemia macrófagos mononucleares de ratón (adquiridas en el Cell Bank of Shanghai Institute) en osteoclastos in vitro. El objeto del experimento es evaluar la actividad del anticuerpo anti-hRANKL humanizado en la inhibición de la diferenciación celular de RAW264.7 inducida por hRANKL in vitro, en comparación con Prolia. Los osteoclastos tienen una enzima característica, es decir, la fosfatasa ácida resistente al tartrato; el grado de diferenciación de células RAW264.7 en osteoclastos puede reflejarse en la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato, que se indica mediante las lecturas de OD405 nm utilizando el sistema cromogénico pNPP. Las células RAW264.7 se cultivan con medio DMEM FBS al 10% (adquirido en Invitrogen), se subcultivan una vez cada 3-4 días. Para la detección de la actividad celular, las células en la fase logarítmica se resuspenden con medio a-MEM FBS al 10% (adquirido en Invitrogen). La suspensión celular se siembra en placas de 96 pocillos con 2000 células/100 pl, se pone en una incubadora (adquirida en Thermo Fisher, especificaciones Forma 311) a 37°C con 5% de CO2 durante 1 hora. El anticuerpo humanizado (G2 ~ G14), anticuerpo de ratón (G1) y un control positivo de Prolia se diluyen con medio a-MEM sin suero y se mezclan con un volumen igual de medio a-MEM que contiene hRANKL y M-CSF, TGF- p. La mezcla se siembra en las placas de cultivo celular en 100 pl/pocillo. La concentración final de anticuerpos es 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 pg/ml respectivamente, las concentraciones finales de hRANKL, M-CSF, TGF-p son 150, 20 y 2 ng/ml respectivamente. Un pocillo que contiene solo una mezcla de 20 ng/ml de M-CSF 2 ng/ml de TGF-p se utiliza como pocillo de control negativo, y un pocillo que contiene una mezcla de 20 ng/ml de M-CSF 2 ng/ml de TGF-p 150 ng/ml de hRANKL se usa como pocillo de control positivo. Las muestras se preparan con tres pocillos y se colocan en una incubadora a 37°C, 5% de CO2 durante 5 días, se desecha el líquido sobrenadante celular, se añaden 100 pl de tampón de lisis celular (tampón de citrato a pH 5.0 Triton X-100 al 0.5%) a cada pocillo, las muestras se lisan en un frigorífico a 4°C durante 10 min, el lisado celular se diluyó 10 veces, se añaden 100 pl de solución cromogénica de pNPP (adquirida en Sigma) a cada pocillo, las muestras se incuban a 37°C durante 30 min, luego se añaden 50 pl de solución de parada (NaOH 0.5 M) a cada pocillo, y la lectura de OD405 nm se detecta utilizando el equipo M5.

Se obtiene una curva (Fig. 16) de anticuerpos que inhiben la diferenciación de las células RAW264.7 en osteoclastos utilizando el método de encapsulado "log (inhibidor) frente a respuesta - pendiente variable" con la concentración de anticuerpos en abscisas y el valor de absorbancia de cada pocillo como ordenadas (software GraphPad Prism). A partir del gráfico de la FIG. 16A, G9 y G13 tienen una actividad de inhibición débil, G8 y G12 tienen una buena actividad de inhibición, que está cerca de la actividad de inhibición de Prolia; a partir del gráfico de la FIG. 16B, G4 y G10 tienen una buena actividad de inhibición, que se acerca a la actividad de inhibición de Prolia; a partir del gráfico de la FIG.

16C, G14 tiene una buena actividad de inhibición, que está cerca de la actividad de inhibición de Prolia. Basándose en tres grupos de datos experimentales en la Fig. 16A, 16B y 16C, se seleccionan 5 anticuerpos humanizados con mejor actividad de inhibición, es decir, G4, G8, G10, G12 y G14. Los 5 anticuerpos humanizados anteriores se comparan con Prolia en las mismas condiciones experimentales. Los resultados muestran que el valor de CI50 para Prolia es de 635 ng/ml, los valores de CI50 para los 5 anticuerpos humanizados están en un intervalo de 500-1100 ng/ml y la actividad de inhibición de tres anticuerpos G8, G10 y G14 está cerca de la actividad inhibidora de Prolia. La Fig. 16D muestra los resultados de 5 anticuerpos humanizados que inhiben la diferenciación en osteoclastos de RAW264.7 inducida por RANKL. La actividad de inhibición de los anticuerpos humanizados se compara en la Tabla 20.

Tabla 20. Comparación del valor de CI50 para los anticuerpos humanizados en células RAW264.7

Ejemplo 20 Efecto de inhibición del anticuerpo humanizado sobre la fosforilación de ERK1/2 de células RAW264.7 inducida por hRANKL

Las células RAW264.7 en la fase logarítmica de la digestión con tripsina se resuspenden con medio DMEM FBS al 10% (adquirido en Invitrogen) y se ajusta la densidad celular, la suspensión se siembra en placas de cultivo celular de 6 pocillos con 3,0x105 células/pocillo, y se cultivan en una incubadora a 37°C, 5% de CO2. Una vez que las células se unen a la pared, el medio se reemplaza con a-MEM FBS al 0,1% (adquirido en Invitrogen) y se cultiva durante 24 horas. El anticuerpo y hRANKL se diluyen con a-MEM FBS al 0,1%. Los anticuerpos (G4, G8, G10, G12, G14) con una concentración final de 250 ng/ml se premezclan con 150 ng/ml de hRANKL y se incuban a 37°C durante 2 horas, se descarta el líquido sobrenadante en 6 pocillos de la placa de cultivo celular, la solución premezclada se añade a la placa de cultivo celular con 1 ml/pocillo, se usa un pocillo que contiene solo Prolia como pocillo de control positivo, un pocillo que contiene solo a-MEM FBS al 0.1% se usa como pocillo de control negativo. Las muestras se incuban en una incubadora a 37°C 5% de CO2 durante 30 minutos. Se retira la solución de cultivo, se lavan las muestras una vez con PBS a 4°C preenfriado (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41.8 mM, pH 7.4) y luego se termina la reacción. Se añaden 120 pl de LDS (adquirido en Invitrogen Corporation, número de producto: NP0007), las muestras se ponen sobre hielo, el lisado celular se recoge rápidamente y se guarda a -80°C para su uso.

Se lleva a cabo la electroforesis en el lisado celular recogido bajo el efecto reductor de ditiotreitol con una concentración final de 50 mM (D0281 adquirido en Sangon, N°: D0281). El gel después de la electroforesis se transfiere a una membrana NC (disponible en Pall Corporation, artículo N°: S80209) con un método de electrotransferencia. Las muestras se cierran con leche en polvo descremada al 5% (adquirida en Sangon, N°: NB0669), y se añaden dilución 1:1000 de anticuerpo de conejo anti-p-ERK1/2 (adquirida en Cell Signaling Technology, artículo n° 4370), una dilución 1:1000 de anticuerpo de conejo anti-ERK1/2 (adquirido en Cell Signaling Technology, artículo n° 4695) y una dilución 1:5000 de anticuerpo de conejo anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, artículo n° 5174). Las muestras se incuban durante la noche a 4°C. La membrana se lava tres veces con 1xTBST, luego se añade una dilución 1:10000 de anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con HRP (disponible en el mercado en MERCK, Número: 401315), la membrana se lava tres veces con 1 xTBST, y se añade ECL (disponible en Perkin Elmer, N°: NEL104001EA) para el revelado. Las señales se registran con una película (disponible en Kodak, número de catálogo: FF057). Se analiza el efecto del anticuerpo sobre la fosforilación de ERK1/2 de células RAW264.7 inducida por hRANKL.

Los resultados de la Fig.17 muestran que, en comparación con el grupo de control sin hRANKL, hRANKL induce un aumento de la fosforilación de ERK1/2 en las células RAW264.7, G4, G8, G10, G12, G14 pueden inhibir el efecto de regulación por aumento de hRANKL en la fosforilación de ERK1/2 en células RAW264.7, que es compatible con el efecto inhibidor de Prolia.

Los anticuerpos murinos 7.19.12 se humanizan con técnicas de humanización de acuerdo con la presente descripción, con el fin de obtener anticuerpos humanizados con un mayor grado de humanización y afinidad antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos murinos 7.19.12 se humanizan con técnicas de humanización de acuerdo con la presente descripción y se obtienen una serie de anticuerpos humanizados mediante una serie de cribados, y las propiedades de unión de los anticuerpos humanizados están de acuerdo con las de anticuerpos murinos mediante experimentos inmunológicos y citológicos. Los anticuerpos humanizados tienen actividad neutralizante que puede inhibir la unión competitiva de RANKL y los receptores RANK, e inhibir eficazmente la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL in vitro. Por lo tanto, se infiere que estos anticuerpos monoclonales deberían inhibir eficazmente la absorción ósea y la osteoporosis in vivo. Estos anticuerpos humanizados se preparan usando células de mamífero o sistema procariota, pueden convertirse en fármacos de anticuerpos monoclonales terapéuticos de farmacología clínica adecuados y pueden usarse para tratar la osteoporosis, destrucción ósea de la articulación ósea causada por artritis reumatoide, destrucción ósea causada por metástasis ósea de tumor, destrucción ósea causada por el crecimiento de un tumor de células gigantes y otros cambios patológicos tales como la pérdida ósea o la destrucción ósea debido a la hiperfunción de los osteoclastos inducida por RANKL, por administración intravenosa o subcutánea.

Los anticuerpos según la invención son anticuerpos humanizados, para los cuales las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos en sus regiones variables y regiones constantes no tienen similitudes en comparación

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-RANKL humano que es capaz de unirse específicamente con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

2. El anticuerpo anti-RANKL humano según la reivindicación 1, en donde una región constante en la cadena pesada del anticuerpo es IgG2 humana y una región constante en la cadena ligera del anticuerpo es Kappa humana; o, una región constante en la cadena pesada del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, y una región constante en la cadena ligera del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

3. El anticuerpo anti-RANKL humano según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un segmento de unión al antígeno seleccionado de scFv, (scFv)2, Fab, Fab' o F(ab')2.

4. El anticuerpo anti-RANKL humano según la reivindicación 1 a 3, en donde una cadena pesada completa del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y/o una cadena ligera completa del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

5. El anticuerpo anti-RANKL humano según la reivindicación 1 a 3, en donde la región variable en la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la región constante en la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, la región variable en la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y la región constante en la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

6. Una composición farmacéutica, en donde los ingredientes activos de la composición farmacéutica comprenden el anticuerpo anti-RANKL humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El anticuerpo anti-RANKL humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para usar en el tratamiento de enfermedades de pérdida ósea.

8. El anticuerpo anti-RANKL humano para usar según la reivindicación 7, en donde las enfermedades de pérdida ósea comprenden osteoporosis, destrucción ósea de la articulación ósea debida a artritis reumatoide, destrucción ósea debida a metástasis ósea de tumor, destrucción ósea debida al crecimiento de tumor de células gigantes óseo y otros cambios patológicos tales como pérdida ósea o destrucción ósea debido a la hiperfunción de los osteoclastos inducida por RANKL.