CN109504682A - 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用 - Google Patents

一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109504682A
CN109504682A CN201811331026.9A CN201811331026A CN109504682A CN 109504682 A CN109504682 A CN 109504682A CN 201811331026 A CN201811331026 A CN 201811331026A CN 109504682 A CN109504682 A CN 109504682A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
rankl
lentivirus vector
recombined lentivirus
slow virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811331026.9A
Other languages
English (en)
Inventor
叶才果
陆慧娟
何婉玲
邓新宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ampo Biotechnology Inc
Original Assignee
Ampo Biotechnology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ampo Biotechnology Inc filed Critical Ampo Biotechnology Inc
Priority to CN201811331026.9A priority Critical patent/CN109504682A/zh
Publication of CN109504682A publication Critical patent/CN109504682A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了包括该DNA分子的重组慢病毒载体，以及包括该重组慢病毒载体的细胞株。本发明能应用于准确、简单易行、快速地检测NF‑κB转录因子的活化情况，特别是RANKL靶向治疗药物的生物学活性。

Description

一种DNA分子、慢病毒载体、细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种DNA分子、包括该DNA分子的慢病毒载体、包括该慢病毒载体的细胞株及其应用。
背景技术
细胞表面有各种膜蛋白，又称为膜蛋白受体。细胞通过这些膜蛋白受体感受外界刺激信号，这些信号通过“第二信使”的方式向细胞内进行信号转导。转录因子NF-κB是众多信号转导的中间信号分子，其p65和p50亚基二聚体经过上游磷酸激酶磷酸化后，可以迁移转入细胞核内。磷酸化的p65p50二聚体与基因组中的顺式作用元件结合，从而成为基因转录关键因素导致基因转录。上述的各种细胞外信号包括细胞因子，例如TNF-α、RANKL和白介素类等，细菌或病毒等等。虽然上述刺激因素多种多样，最后都会导致NF-κB激活，并引起受其调控的基因的转录。TNF-α和RANKL已经被证明是引起NF-κB激活的重要因子之一。TNF-α又称为肿瘤坏死因子1,其作用于细胞可以引起细胞死亡，是抗肿瘤治疗的重要作用因子。RANKL是诱导破骨细胞形成和增加破骨能力的关键细胞因子，主要调控破骨细胞成熟和增加破骨活性殖。可以认为NF-κB转录因子的活化是许多重要生理或病理过程的关键分子。
现有的检测转录因子NF-κB活性的检测主要包括pGL系列荧光素酶报告基因***(Promega公司产品)。该质粒整合了NF-κB结合位点序列、荧光素酶基因及人PEST序列，该序列的作用是加快荧光素酶蛋白的降解。该载体的优点是在转染成功后，能在6小时内检测NF-κB的转录活化情况，而且信噪比可以达到数十到数千倍；缺点是：(1)质粒进入细胞的方式为瞬时转染，比较难整合进入哺乳动物细胞的基因组中，随着细胞传代的增多，细胞内的质粒数量会减少，从而导致荧光信号递减；(2)难以建立稳定的细胞株，对药品生产质量检测来说，稳定性较差。
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。慢病毒载体(Lentiviral vector)是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶，将自身的RNA转变为DNA整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。在研究RNAi方面，慢病毒技术是最为有效的一种解决方案。慢病毒载体(Lentiviralvector)可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
现有的慢病毒***，主要包括pLV载体系列、pCDH载体系列(SBI公司产品)。这些载体的优点是能够进行慢病毒包装，产生高滴度的慢病毒；也可以进行瞬时转染后用于稳定细胞株的筛选。缺点也是比较明显的，这些载体的荧光素酶基因在哺乳动物细胞内表达量较低，从而导致信噪比较低，约为数倍到数十倍左右。另外，这些载体的荧光素酶基因后面没有降解序列，表达出来的荧光素酶难以降解，也导致信号太强，信噪比降低。
发明内容
为解决上述问题，本发明的一个目的是构建一种能准确、简单易行、快速检测地NF-κB转录因子活性的载体。
本发明的另一个目的是上述载体的构建方法。
本发明的再一个目的是利用上述载体检测NF-κB转录因子活性的方法。
为此，本发明提供了以下技术方案：
一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种重组慢病毒载体，其包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
作为一种优选的实施方式，通过将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到慢病毒通用载体中，从而获得所述重组慢病毒载体。所述慢病毒通用载体优选但不限于为pLV-MCS-puro通用载体。
本发明还提供了一种细胞株，其包括上述重组慢病毒载体。
本发明还提供了一种构建上述重组慢病毒载体的方法，其包括：
将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到慢病毒通用载体中，从而获得所述重组慢病毒载体。所述慢病毒通用载体优选但不限于为pLV-MCS-puro通用载体。
在该重新合成的重组慢病毒载体中，NF-κB结合序列作为启动子的主要组成部分，将引导荧光素酶的转录。
本发明还提供了上述重组慢病毒载体用于检测NF-κB转录因子活性的用途。
本发明还提供了一种检测NF-κB转录因子活性的方法，其包括：
步骤一：将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到慢病毒通用载体中，获得重组慢病毒载体；
步骤二：用所述重组慢病毒载体转染细胞(优选293F细胞)，获得稳定细胞株；
步骤三：接种细胞后，同时加入RANKL和RANKL拮抗剂，然后继续培养细胞；
步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定KF-κB转录因子的活性。
如果荧光强度(或相对荧光强度)越高，则表明激活NF-κB的作用越强。如果荧光强度(或相对荧光强度)越低，则表明激活NF-κB的作用越弱。
所述RANKL拮抗剂包括但不限于RANKL靶向治疗药物，例如地诺单抗。
优选地，步骤三中培养细胞的时间为至少3小时。
优选地，在步骤三中，加入荧光素酶的底物之后，静置至少5分钟后再进行检测。
优选地，RANKL的加入量为10ng/ml至2000ng/ml。
优选地，RANKL拮抗剂的加入量为0.1nM-10nM。
本发明还提供了上述重组慢病毒载体用于检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的用途。该RANKL靶向治疗药物包括但不限于地诺单抗。
与现有的检测方法相比，本发明的方法简单易行，没有繁琐的中间操作过程，可在短时间(例如4小时)内简便、准确、快速地检测NF-κB转录因子的活化情况，特别适用于检测RANKL靶向治疗药物(如地诺单抗等)的生物学活性及质量控制。
附图说明
图1是重组慢病毒载体pLV-NFκB-Luc2P的示意图。
图2是转染pLV-NFκB-Luc2P质粒后，经过嘌呤霉素毒性筛选后，形成稳定克隆后的单克隆细胞株293F-pLV-NFκB-Luc2P-05(以下简称293F-05)的测序结果序列。
图3是293F-05细胞在BSA蛋白、TNF-α、RANKL和浓度梯度RANKL抗刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。
图4是293F-05细胞在BSA蛋白、TNF-α、RANKL和RANKL+地诺单抗刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不对本发明的保护范围构成限制。如未特别指出，以下实施例中所使用的试剂和仪器均可通过商业渠道获得。为简便起见，以下实施例中的部分常规技术操作的细节并未予以描述，但可以理解的是，其属于本领域技术人员可知晓并实施的范围内。
合成NF-κB结合序列及后面的minP、Kozad、荧光素酶和人PEST序列
设计如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，委托商业公司合成。该核苷酸序列包括NF-κB结合序列及minP序列、Kozad序列、荧光素酶和人PEST序列。
构建重组慢病毒载体
通过常规操作将上述合成的序列连接到慢病毒通用载体pLV-MCS-puro中，获得含有NF-κB结合序列和荧光素酶报告基因的重组慢病毒载体pLV-NFκB-Luc2P。
pPL-MCS-Puro慢病毒载体框架结构包括以下元件(序列信息来自数据库)：5’UTR、HIV-1ψ、cPTT/CTS、PGK promoter-Puromycin、WPRE、3’UTR、ori、AmpR基因及启动子。
序列由金斯瑞生物科技公司进行全长测序，重组后的载体示意图如图1所示。
筛选含NF-κB结合序列-荧光素酶(Luciferase)报告基因的阳性细胞株
用含有NF-κB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒pLV-NFκB-Luc2P和对照质粒pLV-MCS-Puro按常规程序转染293F细胞。
对照质粒的启动子区域***的为随机DNA序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该随机DNA序列含有已知的NF-κB转录因子结合序列。
用pLV-NFκB-Luc2P重组慢病毒载体转染293F细胞后，加入嘌呤霉素(2μg/ml)进行药物筛选，形成转染阳性的总细胞库。对该细胞库用有限稀释法进行单克隆稳定细胞株的筛选，最后形成稳定克隆后的单克隆细胞株293F-pLV-NFκB-Luc2P-05(以下简称293F-05)。
用序列特异性引物对单克隆细胞株293F-05进行PCR扩增后测序分析，测序结果序列如图2所示，显示NF-κB结合序列及荧光素酶基因已经整合入293F-05细胞基因组中。如图2所示，转录因子NF-κB的特异结合序列为GGGAATTTCC(SEQ ID NO.5)。
上述序列特异性引物如下：
正向引物：TACAGGGACAGCAGAGATCCAG(SEQ ID NO.3)；
反向引物：CACTCGAAGACGGGACCG(SEQ ID NO.4)。
PCR反应条件：95℃15s，58℃30s，72℃30s，30个循环反应。
反应体系如下：
H2O：12.5μl；
10×反应缓冲液：2μl；
10μM正向引物：2μl；
10μM反向引物：2ul；
Taq酶：0.5μl；
DNA模板：1μl；总反应体系为20μl。
在目的质粒和对照质粒转染293F细胞后的第二天加入2μg/ml的嘌呤霉素，以杀死没有转染成功的细胞。
激活NF-κB细胞因子的生物学活性的检测
在进行检测蛋白的生物学活性时，提前24小时接种293-F05细胞于96孔板中，2×104/孔，每个剂量处理组4个复孔。按实验要求设计阴性对照组、阳性对照组和实验处理组(包括单抗活性检测组)。同时按照实验设计加入各处理因素，阴性对照为BSA蛋白(阿拉丁#A104912)浓度2μg/ml。阳性对照组为10ng/ml的TNF-α(Peprotech，货号：300-01A)，实验组为10ng/ml至2000ng/ml RANKL(R&D System，货号：390-TN)刺激，另外的实验组为RANKL和不同浓度(1nM至10nM)地诺单抗共同刺激。
加样完成后，将细胞培养板置于37℃，5％CO2，100％湿度细胞培养箱中培养3小时。3小时后，整块板离心去除上清，细胞用40μl裂解液(Tris-HCl 50m m pH 7.4，NonidetP-401％(v/v)，SDS 0.1％(w/w))裂解，然后加入荧光素酶的底物100μl(15mg/ml荧光素钠盐于PBS(磷酸缓冲盐溶液，0.1M)中)。
室温孵育5分钟后进行信号检测(BioTek H1仪器)，读数时间为2s，中间间隔1s。
检测结果如图3和图4所示。
图3是293F-05细胞在BSA、TNF-α和RANKL刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。结果表明，TNF-α和RANKL均能增加细胞NF-κB的转录活性，后者转录活性的增加呈剂量依赖性。
图4是293F-05细胞在BSA、TNF-α、RANKL和“RANKL+地诺单抗”刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。结果表明，地诺单抗可以拮抗RANKL活性，从而阻断NF-κB的转录活性。
由此可见，本发明的方法可以用于检测RANKL靶向治疗药物生物学活性，特别是地诺类抗体对RANKL拮抗效果的生物学活性检测。
序列表
<110> 佛山安普泽生物医药股份有限公司
<120> 一种DNA分子、慢病毒载体、细胞株及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2009
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcgggaattt ccggggactt tccgggaatt 60
tccggggact ttccgggaat ttccagatct ggcctcggcg gccaagctta gacactagag 120
ggtatataat ggaagctcga cttccagctt ggcaatccgg tactgttggt aaagccacca 180
tggaagatgc caaaaacatt aagaagggcc cagcgccatt ctacccactc gaagacggga 240
ccgccggcga gcagctgcac aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg 300
cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg 360
ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt 420
gcagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg 480
ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca 540
gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa 600
agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct 660
tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact 720
tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca 780
gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc 840
atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctcagcgtgg 900
tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc 960
gggtcgtgct catgtaccgc ttcgaggagg agctattctt gcgcagcttg caagactata 1020
agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag agcactctca 1080
tcgacaagta cgacctaagc aacttgcacg agatcgccag cggcggggcg ccgctcagca 1140
aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc cagggctacg 1200
gcctgacaga aacaaccagc gccattctga tcacccccga aggggacgac aagcctggcg 1260
cagtaggcaa ggtggtgccc ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac accggtaaga 1320
cactgggtgt gaaccagcgc ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct 1380
acgttaacaa ccccgaggct acaaacgctc tcatcgacaa ggacggctgg ctgcacagcg 1440
gcgacatcgc ctactgggac gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc 1500
tgatcaaata caagggctac caggtagccc cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac 1560
accccaacat cttcgacgcc ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc 1620
ccgccgcagt cgtcgtgctg gaacacggta aaaccatgac cgagaaggag atcgtggact 1680
atgtggccag ccaggttaca accgccaaga agctgcgcgg tggtgttgtg ttcgtggacg 1740
aggtgcctaa aggactgacc ggcaagttgg acgcccgcaa gatccgcgag attctcatta 1800
aggccaagaa gggcggcaag atcgccgtga attctcacgg cttccctccc gaggtggagg 1860
agcaggccgc cggcaccctg cccatgagct gcgcccagga gagcggcatg gatagacacc 1920
ctgctgcttg cgccagcgcc aggatcaacg tctaaggccg cgactctaga gtcggggcgg 1980
ccggccgctt cgagcagaca tgatgataa 2009
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttattattat ggcaaagtct ccactagtgc gctctgggca actcaggcgg gatagggcta 60
t 61
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacagggaca gcagagatcc ag 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactcgaaga cgggaccg 18
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaatttcc 10

Claims (10)

1.一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组慢病毒载体，其包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组慢病毒载体，其特征在于，通过将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到慢病毒通用载体中，从而获得所述重组慢病毒载体。
4.根据权利要求2或3所述的重组慢病毒载体用于检测NF-κB转录因子活性的用途。
5.根据权利要求2或3所述的重组慢病毒载体用于检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的用途。
6.一种细胞株，其包括权利要求2或3所述的重组慢病毒载体。
7.一种检测NF-κB转录因子活性的方法，其包括：
步骤一：将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到慢病毒通用载体中，获得重组慢病毒载体；
步骤二：用所述重组慢病毒载体转染细胞，获得稳定细胞株；
步骤三：接种细胞后，同时加入RANKL和RANKL拮抗剂，然后继续培养细胞；
步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定KF-κB转录因子的活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RANKL拮抗剂为RANKL靶向治疗药物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RANKL的加入量为10ng/ml至2000ng/ml。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RANKL拮抗剂的加入量为0.1nM-10nM。
CN201811331026.9A 2018-11-09 2018-11-09 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用 Pending CN109504682A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811331026.9A CN109504682A (zh) 2018-11-09 2018-11-09 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811331026.9A CN109504682A (zh) 2018-11-09 2018-11-09 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109504682A true CN109504682A (zh) 2019-03-22

Family

ID=65747992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811331026.9A Pending CN109504682A (zh) 2018-11-09 2018-11-09 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109504682A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008074731A (ja) * 2006-09-19 2008-04-03 Seikagaku Kogyo Co Ltd 新規なｒａｎｋｌ−グリコサミノグリカン結合体、及び該活性調節剤。
CN103965357A (zh) * 2013-12-31 2014-08-06 嘉和生物药业有限公司 一种抗人rankl抗体
CN108753920A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 佛山安普泽生物医药股份有限公司 一种检测rankl靶向治疗药物生物学活性的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008074731A (ja) * 2006-09-19 2008-04-03 Seikagaku Kogyo Co Ltd 新規なｒａｎｋｌ−グリコサミノグリカン結合体、及び該活性調節剤。
CN103965357A (zh) * 2013-12-31 2014-08-06 嘉和生物药业有限公司 一种抗人rankl抗体
CN108753920A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 佛山安普泽生物医药股份有限公司 一种检测rankl靶向治疗药物生物学活性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROUETTE,C.等: "Firefly luciferase reporter vector pGL4.32[luc2P/NFkB-RE/Hygro], complete sequence，Accession ID: EU581860.1", 《GENBANK数据库》 *
DORIANMELL: "pLV-NFKB-RE-Luci", 《豆丁网》 *
MARIE-THERES ZEUNER等: "Development and Characterisation of a Novel NF-kappa B Reporter Cell Line for Investigation of Neuroinflammation", 《MEDIATORS OF INFLAMMATION》 *
郭金海等: "NF-κB报告基因重组腺病毒的构建及活性分析", 《北京大学学报（医学版）》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105705645B (zh) 逆转录病毒载体
JP7162895B2 (ja) Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
KR102663972B1 (ko) 예비-면역화 단계가 없는 hiv 면역요법
CN109097402B (zh) 一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法
Matz et al. Polyplex exposure inhibits cell cycle, increases inflammatory response, and can cause protein expression without cell division
CN109055430A (zh) 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
WO2018028157A1 (zh) 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN108753920A (zh) 一种检测rankl靶向治疗药物生物学活性的方法
Falkowska-Hansen et al. An inducible Tet-Off-H2B-GFP lentiviral reporter vector for detection and in vivo isolation of label-retaining cells
Simmons et al. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors
Ruetz et al. In vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screens reveal drivers of aging in neural stem cells of the brain
WO2021259334A1 (zh) 自我调节型嵌合抗原受体及其在肿瘤免疫中的应用
CN107858449A (zh) 一种犬干扰素α生物学活性检测方法
EP2578236B1 (en) PREPARATION OF MICROVESICLE-siRNA COMPLEXES AND USE THEREOF IN AIDS TREATMENT
CN109504682A (zh) 一种dna分子、慢病毒载体、细胞株及其应用
CN104711240B (zh) 禽呼肠孤病毒σA蛋白及其相关生物材料的应用
CN113226336A (zh) 一种在细胞中递送基因的方法
CN105586344B (zh) 抑制流感病毒相关基因的siRNA及其应用
CN111117967A (zh) 制备过表达外源基因的细胞的方法
CN104762274B (zh) 禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用
Gu et al. The enhancement of RNAi against HIV in vitro and in vivo using H-2Kk protein as a sorting method
Sperber et al. The hypoxia-regulated ectonucleotidase CD73 is a host determinant of HIV latency
CN107502610A (zh) 一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用
CN104630221B (zh) 抑制肿瘤细胞生长的shRNA及其重组载体与应用
CN100503833C (zh) rep基因表达质粒，RBE顺式元件定点整合体系及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 303, No.23 Jinzhong Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: Guangdong anpuze biomedical Co.,Ltd.

Address before: 528231, Guangdong Province, Nanhai District, Foshan Province, 321 National Road, immortal Creek, Guangdong biological medicine industry base, B building, building six

Applicant before: AMPO BIOTECHNOLOGY Inc.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190322