ES2665851T3

ES2665851T3 - Nuevo anticuerpo anti-CTGF humano

Info

Publication number: ES2665851T3
Application number: ES12860742.1T
Authority: ES
Inventors: Shoji Iwasaki; Ryuichi Moriya; Masayasu Yoshino; Koji TAKAKURA
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2032-12-21
Also published as: JP6040943B2; CN104011206A; EA201491240A1; EA029290B1; CA2859627A1; JPWO2013094723A1; EP2796550B1; CN104011206B; EP2796550A1; KR20140107507A; EP2796550A4; BR112014015405A2; AR089425A1; MX2014007681A; PL2796550T3; IN2014CN04615A; US9587015B2; PT2796550T; TW201333034A; US20140343258A1

Abstract

Un anticuerpo anti-CTGF humano o un fragmento del anticuerpo anti-CTGF humano que comprende: una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 4.

Description

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DESCRIPCIÓN

Nuevo anticuerpo anti-CTGF humano Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo anti-CTGF humano. Específicamente, el nuevo anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención es un anticuerpo anti-CTGF humano que tiene una actividad de unión y/o actividad neutralizante excelentes, en comparación con los anticuerpos anti-CTGF humano convencionales.

Técnica antecedente

El CTGF (factor de crecimiento de tejido conjuntivo) es una proteína secretada rica en restos de cisteína con un peso molecular de aproximadamente 36 a 38 kDa, que pertenece a una familia CCN (Documento no Patente 1), y que se ha sabido convencionalmente que está inducido por el TGF-p que puede considerarse como el factor de crecimiento más importante en la fibrosis (Documento no Patente 2). Por lo tanto, se sugiere que el TGF-p induce el CTGF y el CTGF inducido promueve la fibrosis de órganos o tejidos, y se cree que el CTGF tiene un importante papel en la fibrosis, la proliferación celular, metabolismo de la matriz extracelular, angiogénesis, arteriosclerosis, y similares (Documento no Patente 3).

Se ha llegado a saber que hay muchos dominios presentes en el CTGF, que interactúan con otros factores. Entre ellos se sabe que el CTGF se acopla directamente con el TGF-p o BMP4 mediante el dominio C de Willebrand, y produce la promoción de la señalización de TGF-p o la inhibición de la señalización de BMP (Documento no Patente 4).

Se ha llegado a saber que la expresión de CTGF aumenta en distintas enfermedades renales (por ejemplo, enfermedad renal crónica, nefropatía diabética, nefropatía con IgA, glomeruloesclerosis segmentaria, nefritis relacionada con ANC, glomerulonefritis progresiva aguda, nefropatía crónica por trasplante, síndrome nefrótico, nefritis del lupus, y glomerulonefritis membranosa proliferativa (Documento no Patente 5), y se ha informado que el CTGF está implicado profundamente en la fibrosis (Documento no Patente 6).

Además, se ha informado de que el CTGF está implicado en distintos tipos de fibrosis (escleroderma, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedades con fibrosis intestinal tal como fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis producida por hepatitis B o C crónica, fibrosis inducida por radiación, fibrosis producida por cicatrización de heridas, e hipertrofia y fibrosis cardíaca), enfermedades vasculares proliferativas, retinopatía diabética, cáncer, y similares, y por lo tanto se puede pensar que el CTGF podría ser una nueva diana terapéutica (Documentos no patente 7 y 8).

Por lo tanto, se puede desarrollar un anticuerpo monoclonal que se una específicamente al CTGF y que tiene actividad de inhibición de distintas acciones del CTGF, el anticuerpo monoclonal se espera que sea útil para el diagnóstico, prevención o tratamiento de distintas enfermedades en las que está envuelto el CTGF en su patogénesis.

Como anticuerpos que presentan una función inhibidora contra el CTGF humano, que se habían estudiado hasta ahora, se han comunicado los anticuerpos monoclonales humanos M84 y M320 (Documento de Patente 1), CLN1 (Documento de patente 2), un anticuerpo monoclonal de ratón CTGF-m2-1 (Documento de Patente 3), y similares. Entre ellos, el CLN1 se ha investigado con más detalle, y su efecto se ha identificado en un modelo de fibrosis pulmonar intersticial o un modelo de fibrosis intersticial por ligadura ureteral unilateral. El CLN1 se estudió en un ensayo clínico (de Fase II) como FG-3019.

Sin embargo, no se puede decir que los anticuerpos convencionales tengan una actividad de unión con el CTGF, ni tenga una actividad neutralizante suficientemente fuerte para el CTGF desde el punto de vista de eficacia terapéutica.

En general, los ejemplos de los factores principales que definen la dosis eficaz de los anticuerpos farmacéuticos incluyen la actividad de unión o actividad neutralizante que tiene el anticuerpo para un antígeno, y la cantidad de un antígeno presente en el cuerpo. Sin embargo, se puede decir que la mejora de la actividad de unión o actividad neutralizante da lugar directamente a la reducción de la dosis, y como resultado, es una mejora muy útil, que da lugar a la reducción de la carga económica de un paciente o costes médicos.

Por estas razones, es esencial adquirir un anticuerpo anti-CTGF humano que tiene una actividad de unión o actividad neutralizante más fuerte que los anticuerpos convencionales con el fin de utilizarlos en la prevención o tratamiento de distintas enfermedades, en las que el CTGF está implicado en la patogénesis.

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Técnica relacionada

Documentos de Patente

[Documento de Patente 1] JP-A-2000-232884 (que se corresponde con el documento EP1043335A1)

[Documento de Patente 2] WO 2004/108764 (que se corresponde con el documento US20040248206A1) [Documento de Patente 3] WO 2007/066823

Documentos no Patentes

[Documento no Patente 1] D.M. Bradham et al., J. Cell Biol. 114:1285-1294 (1991)

[Documento no Patente 2] A. Igarashi et al., Mol. Biol. Cell 4:637-645 (1993)

[Documento no Patente 3] Blom IE et al., Matrix Biol. 21(6):473-82 (2002)

[Documento no Patente 4] Abreu, et al., Nat. Cell. Biol. 4, 599-604 (2002)

[Documento no Patente 5] Ito Y et al., Kidney Int. 53(4) 853-61 (1998)

[Documento no Patente 6] Phanish MK et al., Nephron Exp Nephrol. 114(3) e83-92(2010)

[Documento no Patente 7] Shi-Wen X et al., Cytokine Growth Factor Rev. 19(2):133-44 (2008)

[Documento no Patente 8] Jun JI et al., Nat Rev Drug Discov. 10(12):945-63 (2011)

Divulgación de la invención

Problema que resolver mediante la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos anti-CTGF humano que tienen una actividad de unión y/o actividad neutralizante excelentes, en comparación con los anticuerpos anti-CTGF humano convencionales.

Medios para resolver los problemas

La presente invención incluye las siguientes invenciones como sustancias y métodos médica o industrialmente útiles.

[1] Un anticuerpo anti-CTGF humano o un fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano, que comprende:

una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10; y

una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4.

[2] El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con [1], en el que una región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgY1 humana.[3] El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con [1], en el que una región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humana.

[4] El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con [1]. en el que una región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgY1 humana, y una región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humana.

[5] El fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con [1], en el que el fragmento es un fragmento de cadena sencilla de la región variable, Fab, Fab', o F(ab')2.

[6] El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [4] o el fragmento de anticuerpo anti- CTGF humano de acuerdo con [1] o [5], en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo está fusionado con otro péptido o proteína, o está modificado con un agente de modificación.

[7] El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con [1], que comprende:

una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12; y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8.

[8] Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1] y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1].

[9] Una célula huésped que se selecciona de entre el grupo que consiste en las siguientes (a) y (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1] y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1]; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que

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comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1] y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con [1].

[10] Una célula huésped que se selecciona de entre el grupo que consiste en las siguientes (a) y (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende

un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con [7] y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con [7]; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con [7] y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con [7].

[11] Un método para la producción de un anticuerpo anti-CTGF humano o fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano comprendiendo el método la expresión de un anticuerpo anti-CTGF humano o fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano cultivando la célula huésped de acuerdo con [9].

[12] Un método para la producción de una anticuerpo anti-CTGF humano, comprendiendo el método la expresión de un anticuerpo anti-CTGF humano cultivando la célula huésped de acuerdo con [10].

Efectos de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-CTGF humano que tienen una actividad de unión y/o actividad neutralizante excelentes, en comparación con los anticuerpos anti-CTGF humano convencionales. El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención tiene una potente acción antifibrótica inhibiendo la función del CTGF humano, y es útil para la prevención o tratamiento de distintas enfermedades, en las que está implicado el CTGF humano en su patogénesis. Además, el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención proporciona mejoras significativas en las aplicaciones clínicas tales como la reducción de la dosificación, extensión del intervalo de administración, mejora del modo de administración (por ejemplo, una inyección subcutánea), y similares, y, por lo tanto, contribuye enormemente a la mejora de la eficacia del tratamiento y la aceptación del paciente.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

De aquí en adelante se describirá la presente invención con detalle.

Los presentes inventores hicieron extensos estudios sobre la preparación de anticuerpos anti-CTGF humano, y como resultado, tuvieron éxito en la producción de anticuerpos anti-CTGF humano que tienen una actividad de unión mejorada y una actividad neutralizante excelente en comparación con anticuerpos anti-CTGF humano convencionales.

La estructura básica de una molécula de anticuerpo se comparte por todas las clases de anticuerpo, y está configurada con una cadena pesada que tiene un peso molecular de 50000 a 70000 y una cadena ligera que tiene un peso molecular de 20000 a 30000. La cadena pesada consiste habitualmente en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 440 aminoácidos. Las cadenas pesadas tienen estructuras características de diferentes clases que se llaman las cadenas y, H, a, ó y £ que corresponden a la IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Además, la IgG existe como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, y las cadenas correspondientes se llaman y1, y2, y3 y Y4, respectivamente. Una cadena ligera consiste habitualmente en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 220 aminoácidos, de los que se conocen dos tipos, tipo L y tipo K, y que se llaman las cadenas A y k, respectivamente. Con respecto a la configuración peptídica de la estructura básica de una molécula de anticuerpo, dos cadenas pesadas homologas y dos cadenas ligeras homologas se unen mediante enlaces disulfuro (enlaces S-S) y enlaces no covalentes, y el peso molecular es de 15000 a 190000. Los dos tipos de cadenas ligeras son capaces de emparejarse con cada cadena pesada. Cada molécula de anticuerpo siempre consiste en dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Hay cuatro enlaces S-S intracatenarios en una cadena pesada (cinco enlaces para las cadenas H y £) y dos en una cadena ligera; se forma un bucle por 2100 a 100 restos de aminoácidos, y esta estructura estérica es similar entre los bucles, y se llama una unidad estructural o dominio. Para ambas cadenas pesadas y cadenas ligeras, la secuencia de aminoácidos del domino localizado en el extremo N por lo tanto no es constante, incluso en una referencia convencional de la misma clase (subclase) de la misma especie animal, y este domino se llama región variable. Cada uno de los dominios se denomina región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), respectivamente. La secuencia de aminoácidos del lado del extremo C por eso es casi constante en cada clase o subclase, y se llama región constante (cada uno de los dominios se llaman CH1, CH2, CH3 y CL, respectivamente).

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El sitio del determinante antigénico del anticuerpo se configura con VH y VL, y la especificidad de unión depende de la secuencia de aminoácidos de este sitio. Por otra parte, las actividades biológicas tales como la unión a los complementos o las distintas células reflejan la diferencia en la estructura de la región constante entre las distintas clases de Ig. La variabilidad en las regiones variables de la cadena ligera y cadenas pesadas se limita principalmente a tres regiones hipervariables que existen en ambas cadenas, y estas regiones se llama regiones determinantes de complementariedad (CDR; CDR1, CDR2, y CDR3 comenzando desde el lado del extremo N). La parte restante de la región variable se llama región marco conservada (FR) y es relativamente constante.

El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención que han preparado los presentes inventores satisfactoriamente es un anticuerpo anti-CTGF humano que tiene las siguientes características.

Un anticuerpo anti-CTGF humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4.

Específicamente, los presentes inventores construyeron anticuerpos que utilizan una tecnología de anticuerpos monoclonales humanos, “VelocImmune” de ratón [tecnología de anticuerpos VelocImmune; Regeneron Inc. (Patente de EE. UU. N.° 6596541)], y se exploran los anticuerpos utilizando ensayos de distintas actividades biológicas y propiedades físicas, de esta manera identificando satisfactoriamente el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención. En la tecnología VelocImmune, los ratones transgénicos en los que se remplazan la cadena pesada de inmunoglobulina endógena y las regiones variables de cadena ligera con las regiones variables humanas correspondientes, se inmunizan con el antígeno de interés (por ejemplo, el CTGF humano), y se recuperan las células linfáticas de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas se fusionan con las células de mieloma de ratón para preparar hibridomas. Las células de hibridoma se exploran para identificar las células de hibridoma que producen los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés. Los anticuerpos que se producen en el presente documento son anticuerpos que tienen regiones variables de anticuerpos humanos y las regiones constantes de anticuerpos de ratón (a los que también se hace referencia como anticuerpos quiméricos). Entonces, si se identifica el anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés, se aíslan los ADN que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo de las células de hibridoma y se unen con los ADN que codifican las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de una clase deseada del anticuerpo humano, respectivamente. El gen resultante que codifica la cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo se expresa en células (por ejemplo, células CHO) para producir una molécula de anticuerpo. La cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo producidas por el método anterior son la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo “humano completo” derivado de un gen de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención se puede preparar fácilmente, basándose en la información de la secuencia de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera como se desvela en la presente memoria descriptiva, utilizando métodos conocidos en la técnica, por un experto en la técnica. Preferentemente, el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención se puede preparar como un anticuerpo humano completo uniendo la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera a una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera de un anticuerpo humano, respectivamente. Específicamente, se prepara un fragmento genético de la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) del anticuerpo de la presente invención y un fragmento genético de la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de bases que codifica los aminoácidos de la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) del anticuerpo de la presente invención. Además, estos genes de la región variable están unidos a una clase adecuada de genes de la región constante de un anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo completamente humano. Posteriormente, este gen de anticuerpo se une a un vector de expresión adecuado y se introduce en las células cultivadas. Finalmente, las células cultivadas se cultivan y se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir del sobrenadante del cultivo.

Los fragmentos genéticos que codifican los aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención se pueden sintetizar utilizando un método de síntesis genética conocido en la técnica, basándose en, por ejemplo, secuencias de bases diseñadas basándose en las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera. Como tales métodos de síntesis, se pueden utilizar distintos métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como el método de síntesis genética de anticuerpos descrito en el documento WO 90/07861.

Después, los fragmentos genéticos variables descritos anteriormente se unen a los genes de las regiones constantes del anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo completamente humano. Aunque se pueden escoger cualquiera de las subclases de la región constante (por ejemplo, la región constante de una cadena pesada tal como las cadenas y1, y2, y3 o y4, y la región constante de una cadena ligera tal como las cadenas A o k) como la región constante del anticuerpo humano que se utiliza, se puede utilizar preferentemente la IgYl humana como la región constante de cadena pesada, y la Igk humana como la región constante de cadena ligera.

Posteriormente a la preparación de este gen de anticuerpo completamente humano, se puede llevar a cabo la

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introducción del gen de anticuerpo en un vector de expresión, la introducción del vector de expresión en células cultivadas, el cultivo de las células cultivadas, la purificación del anticuerpo y similares utilizando distintos métodos conocidos en la técnica.

Un vector de expresión que se une al gen de anticuerpo obtenido de esta manera incluye un vector pEE6.4 o pEE12.4 (Lonza Biologics), pero no está limitado específicamente, a condición de que pueda expresar dicho gen de anticuerpo. También, se puede utilizar un vector de expresión que ya tiene un gen de región constante de Ig humana tal como AG-y1 o AG-K (por ejemplo, véase el documento WO 94/20632).

El vector de expresión escrito anteriormente se introduce en células cultivadas, por ejemplo, mediante un método de fosfato cálcico o un método de electroporación y similares.

Como las células cultivadas en las que se introduce el vector de expresión, se pueden utilizar células cultivadas tales como células CHO-K1SV, CHO-DG44 y células 293, y estas células se pueden cultivar por un método convencional.

Después del cultivo descrito anteriormente, el anticuerpo acumulado en el sobrenadante del cultivo se puede purificar mediante distintas columnas de cromatografía, por ejemplo, distintos procesos cromatográficos utilizando una columna de Proteína A o Proteína G.

El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención es un anticuerpo que se une al CTGF humano. Ejemplos de un método para medir la actividad de unión del anticuerpo anti-CTGF humano que se obtiene para el CTGF humano incluye un método de ELISA y un método de análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Por ejemplo, cuando se utiliza un ELISA, el CTGF humano (SEQ ID NO: 14) se inmoviliza en una placa de ELISA, y se añade el anticuerpo anti-CTGF humano al mismo y se permite que reaccione con él. Después, el resultado se deja reaccionar con un anticuerpo secundario tal como un anticuerpo anti-IgG marcado con una enzima tal como la peroxidasa de rábano rusticano (HRP), y se lava. Después se mide la absorbancia añadiendo un sustrato cromogénico (por ejemplo, un reactivo TMB en el caso de marcado con HRP). Además, la actividad de unión con el CTGF humano se puede medir con más detalle utilizando el análisis SPR. Cuando se lleva a cabo el análisis SPR, por ejemplo, se puede utilizar un sistema Biacore para medir la constante de la velocidad de asociación (ka) y la constante de velocidad de disociación (kd) entre el anticuerpo anti-CTGF humano y el CTGF humano, y de esta manera, se puede calcular una constante de disociación (Kd) a partir de la relación de las dos constantes. El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención también incluye un anticuerpo que también se une a un derivado del CTGF derivado de otros animales (por ejemplo, el CTGF de ratón), y también se puede medir la actividad de unión de los mismos por la proteína.

Adicionalmente, el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención tiene una actividad neutralizante contra el CTGF humano. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la “actividad neutralizante” del anticuerpo significa una actividad para inhibir cualquier actividad biológica resultante del CTGF por la unión con el CTGF, y se puede evaluar en una o más actividades biológicas del CTGF como un índice. Ejemplos de dicha actividad neutralizante incluye una acción inhibidora contra la síntesis de colágeno en los fibroblastos derivados del riñón (inhibición de fibrosis), y se puede evaluar la actividad neutralizante utilizando un método que se describe posteriormente en el Ejemplo.

Con el fin de evaluar los efectos del anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención con más detalle, también puede utilizarse un ensayo de la eficacia del anticuerpo in vivo. Por ejemplo, mediante la evaluación de la función del riñón utilizando un modelo de ratón con enfermedad renal crónica o un modelo de rata con nefritis como se describe en los Ejemplos posteriormente, se puede evaluar la eficacia del anticuerpo in vivo.

Además, los métodos para la evaluación de distintos tipos de estabilidad (por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad en almacenamiento a largo plazo y estabilidad a alta concentración) del anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención incluye la exploración calorimétrica diferencial y un método de medición de la formación de agregados durante el almacenamiento.

Preferentemente, el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención se puede adquirir fácilmente sintetizando un ADN que comprenda la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO: 10 y el ADN que comprende una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO: 4, y uniendo estos ADN a una clase adecuada de genes de región constante de anticuerpo humano, preferentemente un gen de la región constante IgYl humana para la cadena pesada y un gen de la región constante de IgK humana para la cadena ligera, de manera que se construye un gen de anticuerpo humano completo utilizando un método conocido en la técnica, e introduciendo el gen de anticuerpo humano completo en un vector de expresión, introduciendo el vector de expresión en una célula cultivada, cultivando la célula cultivada, y purificando un anticuerpo a partir del cultivo obtenido utilizando distintos métodos conocidos en la técnica. Preferentemente, el ADN que comprende la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO: 10 comprende la secuencia de bases que se muestra mediante la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, el ADN que comprende la secuencia de bases que codifica la secuencia de

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aminoácidos de la región variable de cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO: 4 comprende la secuencia de bases que se muestra mediante la SEQ ID NO: 3.

Una cadena pesada preferida del anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención, que comprende la región variable de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 10 y una región constante Ig y1 humana, es una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. Una cadena ligera preferida de un anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención, que comprende la región variable de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4 y una región constante Igk humana, es una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-CTGF humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sEq ID NO: 12 comprende la secuencia de bases que se muestra en la SEQ ID NO: 11. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo anti-CTGF humano que se muestra en la SEQ ID NO: 8 comprende la secuencia de bases que se muestra en la SEQ ID NO: 7. Un anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 8, incluye un 37-45-MH1 humano completo como se describe posteriormente en los Ejemplos.

La presente invención también comprende un anticuerpo anti-CTGF humano que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición desde 31 a 35 de la SEQ ID NO: 10, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición desde 50 a 66 de la SEQ ID NO: 10, y una CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición desde 99 a 108 de la SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición desde 24 a 35 de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 que consiste la secuencia de aminoácidos en la posición desde 51 a 57 de la SEQ ID NO: 4, y una CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición desde 90 a 98 de la SEQ ID NO: 4. El anticuerpo anti-CTGF humano también se puede preparar por los expertos en la técnica de acuerdo con procedimientos tales como los que se han descrito anteriormente.

La presente invención también comprende fragmentos del anticuerpo anti-CTGF humano tales como un fragmento de la región variable de cadena sencilla (scFv), Fab, Fab' y F(ab')2, que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención y mantienen la actividad del anticuerpo. Cualquier experto en la técnica puede construir un anticuerpo de fusión del anticuerpo anti-CTGF humano o fragmento del anticuerpo y otro péptido o proteína y también se puede construir un anticuerpo modificado que tenga un agente de modificación unido al mismo, basándose en la presente invención. El otro péptido o proteína utilizando para la fusión no está específicamente limitado, a condición de que no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; ejemplos de los mismos incluyen la seroalbúmina humana, distintos marcadores peptídicos, un péptido de motivo helicoidal artificial, proteínas de unión a maltosa, glutatión S transferasa, distintas toxinas, otros péptidos o proteínas capaces de promover la multimerización, y similares. El agente de modificación que se utiliza para la modificación no se limita específicamente, a condición de que no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; ejemplos de los cuales incluyen el polietilenglicol, cadenas de azúcares, fosfolípidos, liposomas, compuestos de bajo peso molecular y similares.

El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención obtenido de esta manera se puede purificar adicionalmente como sea necesario, y se puede formular entonces de acuerdo con un método habitual, y de esta manera se puede utilizar para la prevención o tratamiento de enfermedades en las que el CTGF está implicado en la patogénesis, tales como enfermedades renales tal como la enfermedad renal crónica y nefropatía diabética, enfermedades vasculares proliferativas, cardiomiopatía, enfermedad fibroplástica hepática, fibrosis pulmonar, enfermedad de fibrosis cutánea, retinopatía diabética y cáncer.

El anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención puede utilizarse preferentemente como como agente terapéutico de enfermedades renales, y más preferentemente un agente terapéutico para enfermedades renales crónicas o nefropatía diabética. Ejemplos de las formulaciones para estos agentes terapéuticos o similares incluyen agentes parenterales tales como un agente de inyección y un agente de infusión, y se puede prefiere la administración de los mismos utilizando la administración intravenosa, administración subcutánea, o similar. Además, para la formulación, con un intervalo farmacéuticamente aceptable se puede utilizar un aditivo o vehículo de acuerdo con estas formulaciones.

La cantidad de un anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención añadido a la formulación descrita anteriormente varía dependiendo de la gravedad de síntomas del paciente o la edad, la forma de dosificación de la formulación utilizada o el título de unión del anticuerpo y similares, por ejemplo, se pueden utilizar, aproximadamente de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg el anticuerpo.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención. La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que

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codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención, y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti- CTGF humano de la presente invención. El vector de expresión de la presente invención no se limita específicamente, a condición de que pueda expresar un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención de su región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera en distintas células huésped de células procariotas y/o células eucariotas y producen estos polipéptidos. Ejemplos de los mismos incluyen vectores plasmídicos, vectores víricos (por ejemplo, adenovirus, retrovirus) y similares. Preferentemente, el vector de expresó de la presente invención comprende un polinucleótido que comprende tanto un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención.

El vector de la presente invención puede comprometer un promotor unido operativamente a un gen que codifica el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención o su región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera. Un promotor para la expresión de un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o su región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera en una bacteria incluye, por ejemplo, el promotor Trp, promotor Iac, promotor recA, promotor APL, promotor Ipp, promotor tac, y similares, cuando el huésped es una bacteria del género Escherichia. Un promotor para la expresión en levaduras incluye, por ejemplo, PH05, promotor PGK, promotor GAP y promotor ADH, y algunos ejemplos de un promotor para la expresión en el género Bacillus incluye el promotor SL01, promotor SP02, promotor penP y similares. Cuando el huésped es una célula eucariota tal como una célula de mamífero, un promotor incluye el promotor derivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico y similares.

Cuando se utiliza una bacteria, particularmente Escherichia coli, como célula huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender adicionalmente un codón de inicio, una región terminadora y una unidad replicable. Cuando se utilizan una levadura, una célula animal o de insecto como el huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender un codón de inicio y un codón de parada. En este caso, puede comprender una secuencia amplificadora, regiones no codificantes en el lado 5' y el lado 3' de un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o su región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera, una secuencia de señal de la secreción una unión de corte y empalme, una región de poliadenilación, una unidad replicable o similares. También, pueden comprender un indicador genético que es de uso común (por ejemplo, un gen resistente a la tetraciclina, un gen resistente a ampicilina, un gen resistente a la kanamicina, un gen resistente a la neomicina, gen de ácido dihidrofólico reductasa) de acuerdo con el uso pretendido.

La presente invención también proporciona un transformante en el que se ha introducido un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o su región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera. Dicho transformante se puede preparar, por ejemplo, transformando una célula huésped con el vector de expresión de la presente invención. Una célula huésped que se utiliza para preparar el transformante no se limita específicamente , a condición de que sea adecuado para el vector de expresión mencionado anteriormente y que se puede transformar; ejemplos de los mismos incluyen distintas células tales como células naturales o células establecidas artificialmente que se utilizan comúnmente en el campo de la técnica de la presente invención (por ejemplo, bacterias (bacterias del género Escherichia, bacterias del género Bacillus), levaduras (del género Saccharomyces, el género Pichia y similares), células de animales o células de insecto (por ejemplo, Sf9) y similares. La transformación se puede llevar a cabo por cualquier método conocido per se.

Preferentemente, el transformante de la presente invención es una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que codifica una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención, o una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención. Más preferentemente, el transformante de la presente invención es una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención como se ha descrito anteriormente y un polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención, o una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención como se ha descrito anteriormente y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención.

La presente invención proporciona además un método para la producción de un anticuerpo anti-CTGF humano, que comprende la expresión de un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o la región variable de cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del mismo en una célula huésped, es decir, utilizando dicho transformante. Preferentemente, la célula huésped utilizada en el método es una célula huésped transformada con el vector de expresión de la presente invención como se ha descrito anteriormente, y el vector de expresión puede comprender un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que comprende la región

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variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención, por separado o simultáneamente.

Cuando se produce el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención, el transformante se puede cultivar en un medio nutriente. El medo nutriente contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno inorgánico o fuente de nitrógeno orgánico, que son necesarios para el crecimiento del transformante. Ejemplos de la fuente de carbono incluye la glucosa, dextrano, almidón soluble, sacarosa y similares; ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico y nitrógeno orgánico incluye sales de amonio, nitratos, aminoácidos, agua de maceración de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, aglomerado de soja, extracto de patatas y similares, si se desea, puede contener otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro cálcico, fosfato dihidrógeno sódico, cloruro magnésico), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, kanamicina y similares) y similares).

El cultivo del transformante se lleva a cabo por un método conocido per se. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, la temperatura, pH del medio, y tiempo de cultivo se seleccionan adecuadamente. Por ejemplo, cuando el huésped es una célula animal, se puede utilizar un medio MEM (Science, Vol.122, p.501,1952), medio DMEM (Virology, Vol.8, p.396,1959), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) y similares que contengan aproximadamente de un 5 % a un 20 % de suero fetal bovino como medio. El pH del medio es preferentemente aproximadamente de 6 a 8, el cultivo se lleva a cabo a aproximadamente 30 °C a 40 °C durante aproximadamente 15 a 72 horas, y se puede llevar a cabo la aireación o agitado si es necesario. Cuando el huésped es una célula de insecto, por ejemplo, se puede mencionar un medio de Grace (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) y similares que contengan suero bovino fetal, y el pH del mismo es preferentemente aproximadamente de 5 a 8. El cultivo se lleva a cabo normalmente a aproximadamente 20 °C a 40 °C durante 15 a 100 horas, y se puede llevar a cabo la aireación o agitado si es necesario. Cuando el huésped es una bacteria, un actinomices, una levadura o un hongo filamentoso, por ejemplo, sería apropiado un medio líquido que contenga las fuentes de nutrientes descritas anteriormente. Un medio que tenga un pH de 5 a 8 es preferible. Cuando el huésped es E. coli, los ejemplos preferidos del medio incluyen, el medio LB, medio M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) y similares. En este caso, el cultivo se puede llevar a cabo normalmente de 14 °C a 43 °C durante aproximadamente 3 a 24 horas, mientras que se lleva a cabo la aireación o el agitado si es necesario. Cuando el huésped es una bacteria del género Bacillus, el cultivo puede llevarse a cabo normalmente de 30 °C a 40 °C durante aproximadamente 16 a 96 horas, mientras que se lleva a cabo la aireación o el agitado si es necesario. Cuando el huésped es una levadura, los ejemplos de medio incluyen el medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980), y el pH del medio es deseablemente de 5 a 8. El cultivo se lleva a cabo normalmente de aproximadamente 20 ° a 35 °C durante aproximadamente 14 a 144 horas, y se puede llevar a cabo la aireación o el agitado si es necesario.

Cultivando un transformante como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo anti-CTGF humano de la presente invención se puede recuperar, preferentemente aislado y purificado a partir del transformante. Ejemplos del método de aislamiento y purificación incluyen métodos basados en las diferencias de solubilidad, tal como precipitación proteica por adición de sal, y precipitación en disolventes; métodos basados en las diferencias de peso molecular, tal como diálisis, ultrafiltración, filtración en gel, y electroforesis en gel de poliacrilamida sulfato de dodecil sódico; métodos basados en la carga eléctrica, tal como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía en hidroxil apatita; métodos basados en la afinidad específica, tal como cromatografía de afinidad; métodos basados en las diferencias de hidrofobia, tal como cromatografía líquida de altas prestaciones de fase inversa; métodos basados en las diferencias del punto isoeléctrico, tales como foco isoeléctrico; y similares.

Aunque la presente invención se ha descrito en general anteriormente, se proporcionan en el presente documento ejemplos específicos solo para un mejor entendimiento de la presente invención, Estos ejemplos tienen fines solamente ilustrativos y no limitan al alcance de la presente invención.

Ejemplos

Los procedimientos que implican el uso de un kit o reactivo y similares se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo adjunto a menos de que se establezca otra cosa.

Ejemplo 1: Adquisición de la proteína CTGF derivada de distintas fuentes

Los presentes inventores adquirieron una proteína CTGF humana como antígeno para preparar el anticuerpo anti- CTGF humano. El gen de longitud completa (SEQ ID NO: 13) del CTGF se ligó en un vector de expresión (pcDNA3.1; Invitrogen), y el vector preparado de esta manera se introdujo genéticamente en una célula 293 FreeStyle (Invitrogen) utilizando el reactivo MAX FreeStyle (Invitrogen) como reactivo introductor del gen. Esta célula se cultivó en un sistema de cultivo libre de suero utilizando un Medio de Expresión 293 FreeStyle (Invitrogen), y entonces se consiguió un sobrenadante del cultivo que incluía la proteína CTGF humana. La proteína se purificó del sobrenadante del cultivo así adquirido, utilizando una columna de heparina HiTrap y una columna CM (GE Healthcare, Japón), y se utilizó en el experimento de la siguiente manera. Las proteínas CTGF de rata y mono se adquirieron utilizando el mismo método.

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Ejemplo 2: Inmunización del ratón VelocImmune

Un anticuerpo para el CTGF humano se adquirió por inmunización para un ratón VelocImmune. Con el fin de aumentar la diversidad de un anticuerpo que se va a obtener, los presentes inventores han investigado una pluralidad de métodos de inmunización, vías de administración, adyuvante, periodos de inmunidad, y similares. Como inmunógeno se utilizó CTGF humano purificado y mezclado con un adyuvante para llevar a cabo la inmunización. Como vía de administración, la administración en la almohadilla plantar y la administración intraperitoneal se investigó. Como adyuvante se investigaron TiterMax Gold (CytRx Corporation), un adyuvante completo de Freund (Sigma) y un adyuvante incompleto de Freund (Sigma). Además, como estimulante que se añadió, se investigaron el oligonucleótido CpG y gel de fosfato de aluminio (fabricado por BRENNTAG). Como periodo de inmunización, se llevó a cabo la inmunización durante 3 semanas a 14 semanas. Después de llevar a cabo la inmunización varias veces, los ratones se sometieron a extracción de sangre a partir de la vena caudal para controlar el título, y de esta manera se escogieron los ratones que producían anticuerpos que se unían el CTGF humano.

La titulación se midió utilizando el método de ELISA posterior. Se añadieron 20 pl de solución salina de tampón de fosfato (PBS) con CTGF humano (1 pg/ml) a una placa Maxisorp 384 (Nunc Inc.), y se inmovilizó incubándolo durante una noche a 4 °C. Al día siguiente, la placa se lavó una vez con 100 pl de solución de lavado (TBST: 0,05 % de tampón Tris que contiene Tween-20), y después se añadieron 100 pl de agente bloqueante (PCS que contenía un 1 % de BSA) al mismo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar una vez con 100 pl de solución de lavado TBST, se preparó una serie de diluciones de plasma en la muestra de sangre y se añadieron al mismo. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, y un lavado con 100 pl de una solución de lavado de TBST, se añadió al mismo un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con una peroxidasa de rábano rusticano (HRP-anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón; Zymed Laboratories Inc.) que se han diluido 5000 veces con un 0,1 % de solución de lavado de TBST que contenía BSA (20 pl). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se llevó a cabo un lavado con solución de lavado de TBST tres veces. Después de añadir 40 pl de reactivo cromogénico TMB (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) al mismo y dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadió 40 pl de solución de parada (2 mol/l de ácido sulfúrico) para parar la reacción, y se midió la absorbancia a 450 nm.

Ejemplo 3: Preparación de hibridoma productor de anticuerpo anti-CTGF humano

La inmunización final (administración intravenosa o intraperitoneal de un antígeno) se llevó a cabo para un ratón escogido comprobando el aumento del título de anticuerpo. Se preparó un hibridoma por recolección de linfocitos retirando el bazo y ganglios linfáticos o ratones inmunizados de acuerdo con un método convencional, y se fusionaron celularmente con una célula de mieloma SP2/0 de ratón. El hibridoma se sometió a dilución limitante y monoclonación, y entonces se purificó el anticuerpo a partir del sobrenadante utilizando una columna de proteína A y proteína G (GE Healthcare, Japón).

Ejemplo 4: Ensayo de ELISA

Los presentes inventores evaluaron la especificidad de unión del anticuerpo para CTGF utilizando un método de ELISA. Se añadieron 20 pl de solución PBS con CTGF humano (1 pg/ml) a una placa Maxisorp 384 (Nunc, Inc.), y se inmovilizó incubándolo durante una noche a 4 °C. Al día siguiente la placa se lavó una vez con 100 pl de solución de lavado (TPBS: un 0,05 % de PBS que contenía Tween-20, y después se añadieron 100 pl de agente de bloqueo (un 1 % de PBS que contenía BSA) al mismo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar una vez con 100 pl de la solución de lavado TBST, se prepararon series de diluciones apropiadas de la muestra de anticuerpo purificado y se añadieron a la placa. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, la placa se lavó tres veces con 100 pl de solución de lavado TBST, y se añadió al mismo un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón, marcado con una peroxidasa de rábano rusticano (HRP-anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón; Zymed Laboratories, Inc.) que se había diluido 5000 veces con una solución de lavado TBST que contenía un 0,1 % de BSA (20 pl)). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, la placa se lavó tres veces con 100 pl de solución de lavado TBST. Después de añadir 40 pl del reactivo cromogénico TMB (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) al mismo y dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron 40 pl de solución de parada (2 mol/l de ácido sulfúrico) para parar la reacción, y se midió la absorbancia a 450 nm. Cada uno de los anticuerpos se ensayó por duplicado, y se analizó la CE50 por ajuste a la curva.

Como resultado, se confirmó que un anticuerpo al que se hace referencia como 37-45 tenía una alta actividad de unión (CE50: 1,6 ng/ml).

Ejemplo 5: Secuenciación del anticuerpo

Para el anticuerpo identificado 37-45, los presentes inventores clonaron un gen que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo a partir del hibridoma. Se extrajo el ARN del hibridoma, y se preparó un ADNc utilizando el kit de amplificación de ADNc (SMARTer RACE cDNA Amplification kit; Clontech). Posteriormente, las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera se alargaron y amplificaron utilizando PCR. Los productos de la PCR se recombinaron con un vector para subclonar los productos de la PCR tal como pCR3.1-TOPO (Invitrogen), y

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entonces se secuenció el gen utilizando un secuenciador (ABI-PRISM 3100; Applied Biosystems).

La secuencia de bases determinada de la región variable de cadena pesada del 37-45 se muestra mediante la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO: 2, y la secuencia de terminada de la región variable de cadena ligera del 37-45 se muestra mediante la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO: 4.

Ejemplo 6. Preparación de un anticuerpo completamente humano

Para el anticuerpo descrito anteriormente, la región variable se deriva de un ser humano y la región constante se deriva de un ratón. Por lo tanto, los presentes inventores sustituyeron la región constante derivada de un ratón por la región constante derivada de un ser humano para preparar un anticuerpo completamente humano (el 37-45 completamente humano). Específicamente, se unió una secuencia de señal en el lado 5' del gen de la región variable de cadena pesada del anticuerpo y se unió el gen de la región constante de la IgY1 humana (Man Sung Co., etc. (1992) J Immunol. Vol. 148 (4): 1149-1154) en el lado 3' del gen de la región variable de cadena pesada del anticuerpo. El gen de cadena pesada se insertó en un vector GS (Lonza Biologics) pEE6.4. Al insertarlo, un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BbvCI del gen se convirtió en una secuencia de ADN que no afecta a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Además, se unió una secuencia de señal en el lado 5' del gen de la región variable de cadena ligera del anticuerpo y se unió el gen de la región constante de la cadena k humana (Man Sung Co., etc., supra) al lado 3' del gen de la región variable de cadena ligera del anticuerpo. El gen de cadena ligera se insertó en un vector GS pEE12.4.

Para la cadena pesada del 37-45 totalmente humano que se prepara, la secuencia de bases se muestra mediante la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos se muestra mediante la SEQ ID NO: 6, y para la cadena ligera del anticuerpo, la secuencia de bases se muestra mediante la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos se muestra mediante la SEQ ID NO: 8.

Ejemplo 7: Preparación de una variante del sitio de glicosilación de la región variable

El aminoácido de la región variable de cadena pesada del 37-45 completamente humano que se ha descrito anteriormente, incluye una secuencia de un motivo de glicosilación tipo N de N-X(T/S). Específicamente, en la región variable de cadena pasada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, el Asn de la posición 58 de acuerdo con la numeración de Kabat se corresponde con el sitio de glicosilación. Si el sitio de glicosilación está presente, la adición de cadenas de azúcares al anticuerpo se produce durante el cultivo celular, pero se sabe que la adición de cadenas de azúcares depende de las condiciones de cultivo o los huéspedes de expresión. Es decir, incluso con las mismas células productoras de anticuerpo así establecidas, es posible que haya una variación en el grado de adición de cadenas de azúcares según las condiciones de cultivo (un medio, concentración celular, y similares), y también existe la posibilidad de que sea difícil adquirir un producto de anticuerpo médico que tenga una calidad uniforme. Por lo tanto, los presentes inventores prepararon un anticuerpo completamente humano (37-45-MH1 completamente humano) en el que se habían introducido mutaciones en la región variable de cadena pesada del 37-45 completamente humano.

Para la región variable de cadena pesada del 37-45-MH1 completamente humano preparado, la secuencia de bases se muestra mediante la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos se muestra mediante la SEQ ID NO: 10. Para la cadena pesada del 37-45-MH1 completamente humano preparado, la secuencia de bases se muestra mediante la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos se presenta mediante la SEQ ID NO: 12. La cadena ligera del 37-45- MH1 completamente humano es la misma que la cadena ligera del 37-45 completamente humano.

Las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 37-45-MH1 completamente humano están en una región en las posiciones de la 31 a 35, 50 a 65 y 95 a 102 de la región variable de cadena pesada basándose en la numeración de Kabat, respectivamente, que consiste en la secuencia de aminoácidos de las posiciones 31 a 35, 50 a 66, y 99 a 108 de la SEQ ID NO: 10, respectivamente. Las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 37-45-MH1 completamente humano es una región de las posiciones del 24 a 34, 50 a 56, y 89 a 97 de la región variable de cadena ligera basándose en la numeración de Kabat, respectivamente, que consiste en la secuencia de aminoácidos de las posiciones de la 24 a 35, 51 a 57, y 90 a 98 de la SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Ejemplo 8: Expresión y purificación del anticuerpo completamente humano

El vector GS en el que se habían insertado los genes de la cadena pesada y cadena ligera de cada anticuerpo como se ha descrito anteriormente, el 37-45 completamente humano y el 37-45-MH1 completamente humano, se escindió con enzimas de restricción, NotI y PvuI, y se ligaron utilizando el Kit Ligation-Convenience (NIPPONGENE) o un Ligation-high (TOYOBO) para construir un vector GS en el que ambos genes de la cadena pesada y la cadena ligera, se habían insertado. Este vector codifica las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa y una glutamina sintetasa, y se transfectó en células CHO-K1SV para expresar el anticuerpo. El sobrenadante del cultivo se purificó con una columna de Proteína A o Proteína G (GE Healthcare, Japón) para obtener un anticuerpo purificado de cada

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anticuerpo completamente humano.

Ejemplo 9: Ensayo de ELISA del anticuerpo completamente humano

Los presentes inventores evaluaron la especificidad de unión del 37-45 completamente humano y el 37-45-MH1 completamente humano preparados en los ejemplos anteriores parra el CTGF de ser humano, ratón, rata y mono utilizando un método ELISA. Aquí, se utilizó el mismo método descrito en el Ejemplo 4, excepto que se utilizó un anticuerpo de conejo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP-anticuerpo de conejo anti- IgG humano; DAKO) que estaba diluido 500 veces con una solución de lavado TBST que contenía un 0,1 % de BSA como anticuerpo secundario. El ensayo de cada anticuerpo se llevó a cabo por duplicado y se analizó la CE50 por ajuste a la curva.

Como resultado se descubrió que todos los anticuerpos completamente humanos tenían los mismos grados de capacidad de unión para el CTGF humano, de ratón, rata y mono.

Tabla 1: Actividad de unión del anticuerpo completamente humano para distintos CTGF

[Tabla 1]

: EC50 (ng/ml) de 37-45 completamente humano EC50 (ng/ml) de 37-45-MH1 completamente humano

CTGF humano: 13,2 10,4

CTGF de ratón: 12,4 9,2

CTGF de rata: 13,1 9,2

CTGF de mono: 12,5 8,6

Ejemplo 10: Evaluación de la actividad de unión por análisis SPR

Con el fin de medir la actividad de unión específica de antígeno del 37-45-MH1 completamente humano con más detalle, los presentes inventores llevaron a cabo un análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR). En el presente ejemplo, se utilizó un anticuerpo CLN1 (Documento de Patente 2) anti-CTGF humano como anticuerpo de comparación.

En el análisis SPR, se utilizó un Biacore 2000 (GE Healthcare, Japón) para llevar a cabo el análisis. Se inmovilizó un anticuerpo anti-CTGF en la superficie de un Chip Sensor CM5 utilizando un kit de captura de anticuerpo humano y un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare, Japón). Se hizo una dilución en serie del CTGF humano adquirido en el Ejemplo 1 mediante solución en HBS-EP (GE Healthcare, Japón). Se añadieron 100 pl de la dilución a la vía de flujo a un caudal de 50 pl/min. Mediante este sistema de medición, se calcularon la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd), y la constante de disociación (KD) de la proteína CTGF humana y el anticuerpo anti-CTGF utilizando un software de análisis de datos (BIA Evaluation).

Tabla 2: Actividad de unión del CTGF humano del 37-45-MH1 completamente humano mediante análisis SPR

[Tabla 2]

: KD (M) Kd (1/s)

37-45-MH1 completamente humano: 3,7310-11 1,6310-4

CLN1: 4,6310-10 3,7310-3

Como resultado, se descubrió que el 37-45-MH1 completamente humano tiene aproximadamente 12 veces o más de actividad de unión por el CTGf humano que el anticuerpo CLN1.

Ejemplo 11: Acción inhibidora de la síntesis de colágeno en células derivadas de riñón de rata

Los presentes inventores investigaron el efecto inhibidor de la síntesis de colágeno inducida por TGFp en el fibroblasto NRK-49F de rata con el fin de medir la acción neutralizante específica de antígeno del 37-45-MH1 completamente humano. En el presente ejemplo, se utilizó el CLN1 como anticuerpo de comparación.

Las células NRK-49F (disponibles en la ATCC) producen CTGF por la adición de TGFp. Las células NRK-49F se sembraron en una palca de 24 pocillos en un medio MDM que contenía un 10 % de FCS (5 x 104 células), y después de 24 horas, se remplazó el medio con un DMEM que contenía un 0,01 % de FCS (500 pl). Además, después de 24 horas, se añadió TGFp (R&D Systems; 1 ng/ml) al medio. 1 hora antes de la adición de TGFp, se añadieron los anticuerpos anti-CTGF humano, el 37-45-MH1 completamente humano o el CLN1, (a tres grupos a 1 pg/ml, 3 pg/ml

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y 10 |jg/ml). Después de 72 horas, se recuperó el sobrenadante y se sometió a SDS-PAGE, y se llevó a cabo el análisis de transferencia de Western de acuerdo con un método ordinario utilizando un anticuerpo anti-colágeno I (Abcam plc). Como resultado, se descubrió que el 37-45-MH1 completamente humano tenía una fuerte capacidad para la inhibición de la síntesis de colágeno, en comparación con el CLN1 en una manera dependiente de la concentración.

Ejemplo 12: Ensayo de evaluación de la función renal mediante un modelo renal remanente en ratón

La glomeruloesclerosis y degeneración renal tubular son un hallazgo, que aparece comúnmente en varios trastornos renales que producen enfermedades crónicas. Estas enfermedades renales crónicas se pueden investigar en el modelo de riñón remanente de ratón que presenta trastornos renales progresivos. En este modelo, se aplica una carga al riñón residual por una nefrectomía unilateral de 2/3 de un riñón y nefrectomía total contralateral (5/6 de nefrectomía), induciendo de esta manera una proteinuria y reducción significativa de las funciones del riñón, y se presenta una esclerosis glomerular histopatológica o degeneración tubular renal y se presenta una fibrosis intestinal leve (véase, por ejemplo, Kidney International, 64, 350-355,2003).

Se llevó a cabo una nefrectomía 5/6 en referencia a un método de Zhang, et al. (Kidney International, 56, 549-558, 1999). Se anestesió un ratón ICR (Japan SLC, Inc., Hamamatsu-shi, Shizuoka-ken) macho de 9 semanas de edad mediante administración intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg/kg), y se extirpó 1/3 de la cabeza y 1/3 caudal del riñón izquierdo. Una semana después de la primera cirugía, se anestesió el ratón mediante administración intra- peritoneal de pentobarbital (50 mg/kg), y el riñón derecho se retiró completamente para completar la nefrectomía 5/6.

Se llevó a cabo la recolección de muestras de orina y de sangre una semana después de la nefrectomía 5/6, y se midieron la excreción de proteína urinaria y los parámetros de la función renal (concentración de creatinina en el suero y aclaramiento de creatinina). La medición de la concentración proteica se llevó a cabo por un método Bradford (Bio-Rad Laboratories). La concentración de creatinina se midió utilizando CRE-EN Kainos (Kainos Laboratories, Inc.). La tasa de excreción proteína urinaria se calculó corrigiendo la concentración de proteína en orina (en mg/ml) con la concentración de creatinina (en mg/dl) La tasa de excreción de proteína urinaria, la concentración de creatinina en el suero, y el aclaramiento de creatinina se tomaron como indicadores, y de esta manera, se dividieron los grupo en el grupo tratado con disolvente (administración de un tampón de fosfato con un pH 7,4) y el grupo de administración de anticuerpo (15 ratones por grupo). Los ensayos comenzaron ajustando las dosis de anticuerpos en tres grupos, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg y 2 mg/kg. El tampón de fosfato y el 37-45-MH1 completamente humano se inyectaron por vía subcutánea en el dorso una vez a la semana (seis dosis en total) Al inicio del ensayo, las semanas 4 y 6 dl inicio del ensayo, se recolectaron las muestras de orina y las muestras de sangre, y se midió la tasa de excreción de proteína urinaria, la concentración de creatinina en el suero, y el aclaramiento de creatinina.

Para la tasa de excreción de proteína urinaria, en el momento del inicio del ensayo, en el grupo tratado con disolvente, la tasa de proteína urinaria aumentaba, en comparación con el grupo normal (grupo normal 5,1 ± 0,4; grupo tratado con disolvente 9,7 ± 0,7 (P<0,01)). También, a la semana 4 y 6 desde el inicio del ensayo, en el grupo tratado con disolvente, la tasa de excreción de proteína urinaria aumentaba, en comparación con el grupo normal. Por otra parte, en los grupos tratados con anticuerpo (grupo de 1 mg/kg y grupo de 2 mg/kg), aunque no había una diferencia estadísticamente significativa, la tasa de excreción de proteína urinaria disminuía de una manera dependiente de la dosis, en comparación con el grupo tratado con disolvente.

Para la concentración de creatinina en el suero, en el momento del inicio del ensayo, en el grupo tratado con disolvente, la concentración de creatinina en el suero aumentaba, en comparación con el grupo normal (grupo normal 0,36 ± 0,013 mg/dl; el grupo tratado con disolvente 0,53 ± 0,016 mg/dl (P<,01), la semana 6: grupo normal 0,31 ± 0,016 mg/kd; grupo tratado con disolvente 0,81 ± 0,126 mg/dl (P<0,05)). En los grupos tratados con anticuerpo, para el grupo de 0,5 mg/kg, aunque no había diferencia significativa, la concentración de creatinina en el suero disminuía las semanas 4 y 6, en comparación con el grupo tratado con disolvente. Además, en el grupo de 1 mg/kg y el grupo de 2 mg/kg, el aumento de la concentración de creatinina en el suero estaba inhibido significativamente, en comparación con el grupo tratado con disolvente (semana 4: grupo de 1 mg/kg 0,51 ± 0,022 mg/dl (P<0,05); grupo de 2 mg/kg 0,51 ± 0,015 mg/dl (P<0,05), semana 6: grupo de 1 mg/kg 0,55 ± 0,043 mg/dl (P<0,05); grupo de 2 mg/kg 0,49 ± 0,024 mg/dl (P<0,01)).

Para el aclaramiento de creatinina (concentración de creatinina urinaria x cantidad de orina durante 2 horas/concentración de creatinina en el suero), en el momento del inicio del ensayo, en el grupo tratado con disolvente, la disminución del aclaramiento de creatinina se confirmó en comparación con el grupo normal (grupo normal 1,8 ± 0,18; grupo tratado con disolvente 1,3 ± 0,08 (P<0,01)). A continuación, también las semanas 4 y 6, en el grupo tratado con disolvente, el aclaramiento de creatinina disminuía en comparación con el grupo normal (semana 4: grupo normal 2,1 ± 0,16; grupo tratado con disolvente 1,6 ± 0,16, semana 6: grupo normal 2,8 ± 0,29; grupo tratado con disolvente 1,4 ± 0,17 (P<0,001)). Para los grupos tratados con anticuerpo, en el grupo de 0,5 mg/kg, la inhibición de la disminución del aclaramiento de creatinina no se confirmó en comparación con el grupo tratado con disolvente. Por otra parte, en el grupo de 1 mg/kg, las semanas 4 y 6, la disminución del aclaramiento de creatinina estaba significativamente inhibido, en comparación con el grupo tratado con disolvente (semana 4: grupo

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tratado con disolvente 1,6 ± 0,16, semana 6: grupo normal 2,8 ± 0,29; grupo tratado con disolvente 1,4 ± 0,17 (P<0,001)). Para los grupos tratados con anticuerpo, en el grupo de 0,5 mg/kg, la inhibición del aclaramiento de creatinina no se confirmó en comparación con el grupo tratado con disolvente. Por otra parte, en el grupo de 1 mg/kg, las semanas 4 y 6, la disminución del aclaramiento de creatinina estaba significativamente inhibido, en comparación con el grupo tratado con disolvente (semana 4: grupo tratado con disolvente 1,6 ± 0,16; grupo de 1 mg/kg 2,1 ± 0,11 (P<0,05), semana 6: grupo tratado con disolvente 1,4 ± 0,17; grupo de 1 mg/kg 2,0 ± 0,18 (P<0,05)). Además, en el grupo de 2 mg/kg, la semana 6, la disminución del aclaramiento de creatinina estaba significativamente inhibida, en comparación con el grupo tratado con disolvente (semana 4: grupo tratado con disolvente 1,6 ± 0,16; grupo de 1 mg/kg 2,1 ± 0,11 (P<0,05), semana 6: grupo tratado con disolvente 1,4 ± 0,17; grupo de 1 mg/kg 2,0 ± 0,18 (P<0,05)). Además, en el grupo de 2 mg/kg, la semana 6, la disminución del aclaramiento de creatinina estaba significativamente inhibida, en comparación con el grupo tratado con disolvente (semana 6: grupo tratado con disolvente 1,4 ± 0,17; grupo de 2 mg/kg 1,9 ± 0,14 (P<0,05)).

A partir de estos resultados, se confirmó que el 37-45-MH1 completamente humano inhibe la reducción de las funciones renales en un modelo de enfermedad renal crónica.

Ejemplo 13: Ensayo de evaluación farmacológica en modelos de nefritis en ratas

Los modelos anti-Thy 1.1 de rata se establecieron como modelos de glomerulonefritis proliferativa mesangial, con las condiciones patológicas expresadas por la inyección de anticuerpo contra los antígenos Thy en la superficie de las células mesangiales del glomérulo renal (véase, por ejemplo, Yamamoto y Wilson, 1987 Kidney Int. 32:514-25, Morita, et al., 1998 Am J Kidney Dis 31:559-73). En los presentes modelos, después de la lisis de las células mesangiales, aumenta la proliferación celular mesangial y aumentan las matrices extracelulares, y el nivel de proteína urinaria aumenta (véase, por ejemplo, Floege, et al., 1991 Kidney Int. 40:477-88, Ito, et al., 2001 J Am Soc Nephrol. 12:472-84). Los modelos anti-Thy 1.1 son similares a la nefropatía por IgA o púrpura de Henoch-Schonlein en seres humanos, y el progreso de las condiciones patológicas se pueden predecir utilizando los modelos con proteinuria como un indicador (véase, por ejemplo, Kasuga, et al., 2001 Kidney Int. 60:1745-55, Liu, et al., 2007 Nephron Exp Nephrol. 105:e65-74).

Una solución de anticuerpo anti-Thy 1.1 (anticuerpo monoclonal anti-CD90 de rata (Thy 1.1 )-ascitis; CEDARLANE) se preparó mediante solución salina fisiológica a 0,1 g/ml. Se expresó la nefritis mediante la administración intravenosa de la solución de anticuerpo a las ratas (200 pl por 100 g de peso corporal). Después de 4 horas de la administración de la solución de anticuerpos anti-Thy 1.1, se administraron por vía intravenosa el 37-45-MH1 completamente humano (0,5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg) o disolvente (PBS). Se llevó a cabo la recolección de orina durante 24 después de 3 a 4 días de la inducción de la patogénesis, y se midieron la cantidad de excreción proteica urinaria en 24 horas (UP) y la tasa de expresión proteica urinaria (UP/uCr. La concentración proteica urinaria (mg/ml) se corrigió con la concentración de creatinina urinaria (mg/dl). Los resultados se muestran en la Tabla 3 (UP) y la Tabla 4 (UP/uCr).

Tabla 3: UP

[Tabla 3]

: UP (mg/día) Tasa inhibidora ( %) vs grupo administrado con disolvente Valor de p

Grupo de animales normales: 1,9 100,0

Grupo administrado con disolvente (PBS): 114,3 0,0 P<0,001 #

37-45-MH1 completamente humano 0.5 mg/kg: 115,2 -0,8

37-45-MH1 completamente humano 1 mg/kg: 95,5 16,8

37-45-MH1 completamente humano 2 mg/kg: 83,8 27,2 p=0,029 *

#: vs el grupo de animales normales por el ensayo t *: vs el grupo administrado con disolvente por el ensayo de Dunnett

Tabla 4: UP/uCr

[Tabla 4]

: UP/uCr (mg/mg) Tasa inhibidora ( %) vs grupo administrado con disolvente Valor de p

Grupo de animales normales: 0.315 100.0

Grupo administrado con disolvente (PBS): 33.865 0.0 p<0.001 #

37-45-MH1 completamente humano 0.5 mg/kg: 26.280 22.6

37-45-MH1 completamente humano 1 mg/kg: 22.487 33.9 p=0.037 *

37-45-MH1 completamente humano 2 mg/kg: 18.427 46.0 p=0.0039 *

Como resultado, el 37-45-MH1 completamente humano inhibía la proteinuria de una manera dependiente de la dosis, y las tasas inhibidoras eran en el grupo de 2 mg/kg del 27,2 % y 46,0 % frente al grupo al que se administró disolvente, respectivamente, con los índices de UP y UP/uCr.

5

A continuación, con el fin de identificar la diferencia con CLN1 en la fuerza de acción, se utilizaron los mismos modelos para la evaluación. El procedimiento de evaluación era el mismo que anteriormente. Para la evaluación, con referencia a las dosis que eran eficaces anteriormente, se utilizó el 37-45-MH1 completamente humano a 2 mg/kg, como control positivo, y se utilizaron 2 mg/kg y una dosis de 10 veces el mismo, 20 mg/kg, de CLN1. 10 Además, con el fin de investigar la implicación de una reacción inmunitaria no específica por el tratamiento con anticuerpos heterogéneos, se utilizaron como controles 2 mg/kg y 20 mg/kg de anticuerpos IgG humana (anticuerpo anti-KLH (hemocianina de lapa californiana): se obtuvo inmunizando un ratón VelocImmnune con KLH y preparándolos como una IgG1 completamente humana de la misma manera que el 37-45-MH1 completamente humano). Los resultados se muestran en la Tabla 5 (UP) y Tabla 6 (UP/uCr).

15

Tabla 5: UP

[Tabla 5]

: UP (mg/día) Tasa inhibidora ( %) vs grupo administrado con disolvente Valor de p Tasa inhibidora ( %) vs grupo administrado con IgG Valor de p

Grupo de animales normales: 0,8 100,0 100,0

Grupo administrado con disolvente (PBS): 111,1 0,0 p<0,001 #

Control IgG 2 mg/kg: 114,5 -3,1 0,0 p<0,001 #

Control IgG 20 mg/kg: 113,4 -2,1 0,0 p<0,001 #

CLN1 2 mg/kg: 97,2 12,6 p=0,45 * 15,2 p=0,22 &

CLN1 20 mg/kg: 107,3 3,5 p=0,79 * 5,4 p=0,53 $

37-45-MH1 completamente humano 2 mg/kg: 79,0 29,1 p=0,044 * 31,2 p=0,0011 &

#: vs el grupo de animales normales por el ensayo t *: vs el grupo administrado con disolvente por el ensayo t &: vs el grupo de control IgG 2 mg/kg por el ensayo t $: vs el grupo de control IgG 20 mg/kg por el ensayo t

20 Tabla 6: UP/uCr

[Tabla 6]

Grupo de animales normales: 0,3 100,0 100,0

Claims

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40

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REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CTGF humano o un fragmento del anticuerpo anti-CTGF humano que comprende:

una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 10; y

una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 4.
2. El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante IgY1 humana.
3. El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante IgK humana.
4. El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante IgYl humana, y una región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante IgK humana.
5. El fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento de región variable de cadena sencilla, Fab, Fab' o F(ab')2.
6. El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 5, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se fusionan con otro péptido u otra proteína, o esta modificado con un agente modificante.
7. El anticuerpo anti-CTGF humano de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 12; y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 8.
8. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.
9. Una célula huésped que se selecciona de entre el grupo que consiste en las siguientes (a) y (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 y

un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que

comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de

anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Una célula huésped que se selecciona de entre el grupo que consiste en las siguientes (a) y (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que

comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 y

un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7.
11. Un método para la producción de un anticuerpo anti-CTGF humano o un fragmento de anticuerpo anti-CTGF humano, comprendiendo el método expresar un anticuerpo anti-CTGF humano o un fragmento de anticuerpo anti- CTGF humano cultivando la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9.
12. Un método para la producción de un anticuerpo anti-CTGF humano, comprendiendo el método expresar un anticuerpo anti-CTGF humano cultivando la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10.