JP7027502B2 - チカグレロルに対する抗体および使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年10月1日に作成され、33,900バイトのサイズを有する「Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT」という名称のテキストファイルとしての、コンピューター可読形式(CRF)で本出願と共に提出される配列表を援用するものとする。
R1が、C1~C6アルコキシおよびC1~C6アルキルチオからなる群から選択され;
R2が、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、および置換C3~C6シクロアルキルからなる群から選択され;および
R3が、H、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、およびC1~C6アルカノールからなる群から選択される)
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体に関する。
として括弧で識別される化合物の部分内でエピトープに結合する。
一般的な意味で、本開示は、式(Ia):
R1が、C1~C6アルコキシおよびC1~C6アルキルチオからなる群から選択され;
R2が、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、および置換C3~C6シクロアルキルからなる群から選択され;および
R3が、H、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、およびC1~C6アルカノールからなる群から選択される)
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に結合する新規な抗体を提供する。
本開示の抗体は、診断および他のアッセイを目的として標識にコンジュゲートしてもよく、抗体および/またはその標的を検出することができる。標識には、以下に限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位元素がある。
本開示は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。本開示の一態様は、本明細書に具体的に記載される抗体のいずれかをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、抗体の重鎖および/または軽鎖の可変領域をコードし得る。
本開示は、本明細書に記載の抗体およびそのフラグメントを産生するための方法を提供する。いくつかの態様では、チカグレロルならびに本明細書に開示されるチカグレロルおよび/またはTAMの特定のエピトープを認識する抗体の抗原結合フラグメントは、当業者に公知の任意の技術によって生成され得る。たとえば、FabおよびF(ab’)2フラグメントは、パパインなどの酵素(Fabフラグメントを産生するため)またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを産生するため)を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって抗体から産生され得る。さらに、本明細書に記載のscFvおよびFabを含む抗体は、当該技術分野において公知の様々なファージディスプレイ方法を用いて生成され得る。
ある態様では、本開示は医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、抗体をコードする核酸分子を含む組成物であってもよい。また、こうした医薬組成物は、抗体または抗体の組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であってもよい。ある態様では、本開示の医薬組成物は薬物として使用される。
本明細書に開示される抗体は、血小板活性化、凝集および脱顆粒の阻害剤、血小板脱凝集の促進剤、および抗血栓剤の活性を中和するための、併用療法を含む治療方法に有用である。このため、本明細書に記載の抗体は、チカグレロルの投与(併用方法(companion method)を含む)に関連するいくつかの用途があり、チカグレロルおよび/またはチカグレロルの1つまたは複数の代謝産物の効果を中和するのに好適に有用である。このような方法では、抗体は、任意に可逆的に、チカグレロルの活性を低下させ、中和し、なくし、または阻害し、チカグレロル投与に関連し、および/またはチカグレロルを含む治療から生じるいくつもの作用、障害および/または症状を治療または予防することができる。
本開示の別の態様はキットである。一態様では、キットは、上述の核酸、抗体、発現ベクターまたは宿主細胞の組成物または医薬組成物のいずれか、および適切な使用または投与を指示する説明書またはラベルを含む。任意に、キットは、1つまたは複数の容器および/もしくはシリンジ、または送達もしくは使用を容易にする他の装置をさらに含んでもよい。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを行うための、および/または治療有効量の投与を行うための要素の全サブセットまたは任意のサブセットがキットに入れられていてもよいことを意図している。同様に、キットは、たとえば本開示の抗体をコードする核酸を好適な条件下で発現する宿主細胞を培養して、抗体を作製するための説明書を含んでもよい。別の例として、本開示の抗体の治療投与用のキットは、抗体の医薬製剤を含む溶液または抗体の凍結乾燥調製物と、組成物の投与を必要とする患者に組成物を投与するための説明書および/または凍結乾燥物を再溶解するための説明書とを含んでもよい。特定の実施形態では、キットは、被検体への投与に適した製剤(たとえば、BRILINTA(商標)、BRILIQUE(商標))中でチカグレロルをさらに含む。このような実施形態では、キットは、抗体、チカグレロル、または抗体およびチカグレロルの両方による治療を必要とする患者への、抗体およびチカグレロル製剤の両方の投与についての説明書をさらに含み得る。
略語 説明
ACN アセトニトリル
br ブロード
BSA ウシ血清アルブミン
CV カラム体積
d 二重項
dd 二重項の二重項
DCM ジクロロメタン
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
DPBS ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EDC 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)EtOAc 酢酸エチル
FA ギ酸
HOAc 酢酸
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HRMS 高分解能質量分析法
HTS ハイスループットスクリーニング
HTRF(登録商標) 均一性時間分解蛍光法
HYFLO(登録商標) 炭酸ナトリウムで処理され、フラックス焼成された濾過助剤
Hz ヘルツ
J 結合定数
LC 液体クロマトグラフィー
m 多重項
MS 質量スペクトル
NMR 核磁気共鳴
OAc アセテート
Pd/C パラジウム炭素
pM ピコモル
PK/PD 薬物動態/薬力学
KF フッ化カリウム
q 四重項
r.t. 室温
s 一重項
sat. 飽和
scFv 単鎖可変フラグメント
t 三重項
TFA トリフルオロ酢酸
TEA トリエチルアミン
TBME tert-ブチルメチルエーテル
THF テトラヒドロフラン
TIM チカグレロル不活性代謝産物
TLC 薄層クロマトグラフィー
TR-FRET 時間分解蛍光共鳴エネルギー移動
この実施例は、本明細書に記載の例示的な抗体を生成するのに使用したいくつかのハプテンの合成、最適化、単離、および特性評価の方法を記載する。ハプテンは、チカグレロル、チカグレロル代謝産物(TAMおよびTIM)、ビオチン化チカグレロル、およびビオチン化アデノシンを含む(たとえば、非ビオチン化形態の化学的ハプテン構造については図2を参照されたい)。チカグレロルを、国際特許公報国際公開第2000/034283号パンフレット(Guile,et al.,2000)に記載されるように合成し、TAMを、国際特許公報国際公開第1999/005143号パンフレット(Guile,et al.,1999)に記載されるように合成し、これらの文献はそれぞれ、全体が参照により援用される。
N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-ジフルオロフェニル)シクロプロピル)アミノ)-5-(プロピルチオ)-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル)-2,3-ジヒドロキシシクロペンチル)オキシ)エチル)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド(1.1)
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ヘキサノエート(21.77mg、0.04mmol)を、乾燥DMF(1.0mL)中の(1S,2S,3S,5R)-3-(2-アミノエトキシ)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-ジフルオロフェニル)シクロプロピル)アミノ)-5-(プロピルチオ)-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール(20mg、0.04mmol)の溶液に加え、混合物を窒素雰囲気下に置き、室温で6時間撹拌した。溶媒を、40℃で、減圧下で除去した。化合物を、19mL/分の流量で20分間にわたって、H2O/ACN/FA 95/5/0.2緩衝液中20~60%のACNの勾配を用いたKromasil C18カラム(10μm 250×20 ID mm)における分取HPLCによって精製した。化合物を298nmでUVによって検出した。ピーク画分を収集し、濃縮し、凍結乾燥させたところ、表題化合物(1.1)(21.4mg、57.3%)が得られた。
N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド(1.2)
TFA(1.8ml、23.36mmol)と水(0.2mL、11.10mmol)との混合物を、粗N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)メチル)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド(1.e)(76mg、0.1mmol)に加え、反応混合物を0℃で1時間25分間にわたって撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をDMSOに溶解させた。化合物を、19mL/分の流量で20分間にわたってH2O/ACN/NH3 95/5/0.2緩衝液中5~45%のACNの勾配を用いたXBridge C18カラム(10μm 250×19 ID mm)における分取HPLCによって精製した。化合物を259nmでUVによって検出した。ピーク画分を濃縮し、凍結乾燥させたところ、表題化合物(1.2)(50mg、69.6%)が白色のふんわりした固体として得られた。
この実施例は、チカグレロルおよびその代謝産物に対する抗体、ATPに対する構造的類似性を有し、アデノシンのようなコアを含む化合物の産生に使用され得る手法および技術を例示する(Springthorpe et al 2007 Bioorg Med Chem Lett.17:6013-6018)。チカグレロル、チカグレロル活性代謝産物(TAM)およびチカグレロル不活性代謝産物(TIM)の化学構造が、図2に示される。上述されるように、本明細書において開示され、生成される抗体は、チカグレロルおよびTAMに結合し、それを中和することができ、TIMに結合し得るが、アデノシンなどの他の構造的に関連する化合物に結合せず、または実質的に阻害しない。TIMに対する結合活性が、本明細書に開示される抗体の任意選択の特徴である一方、TIMが、典型的に、チカグレロル代謝産物の少ないまたはわずかな画分であるため、TIMに対する結合活性を示す抗体は、必要とされる抗体/解毒剤の用量に影響を与えることが予測されていない。
ユウロピウムクリプテートストレプトアビジン:ビオチン化チカグレロル:scFv-His:抗His-XL665
デルタF(%)={((サンプル665/620比)-(陰性665/620比))/(陰性665/620比)}×100
ユウロピウムクリプテートストレプトアビジン:ビオチン化アデノシン:scFv-His:抗His-XL665
別個のHCおよびLC発現プラスミドを、Persic et al.1997によって記載される発現ベクターに基づいて、一過性トランスフェクションに使用した。ベクターを、EBV複製起点(OriP)を含むように修飾した。Fab(HC)ベクターは、定常領域1(CH1)およびヒンジ領域のみを含み、CH2およびCH3を除去した。HCおよびLC DNAを、製造業者の推奨に従って、150mMのNaClおよび25-kDaの線形PEIに加えた(Polysciences Europe,Germany 23966)。次に、DNA-PEI複合体を、懸濁培養に適合されたCHOK1細胞株(ECACC No:85051005)に由来するチャイニーズハムスターの卵巣野生型(CHO wt)細胞に加えた(Daramola O,et al 2014)。7日後、細胞を遠心分離によって収集し、上清を濾過した。Fabタンパク質を含有する細胞培養上清を、Aekta Purifier(GE Healthcare)を用いて5mL/分の流量で5mlのCaptureSelect IgG-CH1(Life Technologies,Carlsbad,USA)を備えたクロマトグラフィーカラムに直接充填した。カラムを平衡化し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2で洗浄し、樹脂製造業者の説明書に従って、20mMのクエン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH3.5(CaptureSelect IgG-CH1)で溶離した。溶離されたFabをpH5.5に調整し、分析前に濾過した(0.22μm Steriflip,Millipore EMD,Bethdesa,USA)。タンパク質濃度を、DU520 UV/vis分光光度計(Beckman Coulter,Brea,USA)を用いて280nmにおける吸光度によって決定した。サンプル純度を、TSKgel G3000SWxlカラム(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)および1.0ml/分で動作する1100 HPLCシステム(Agilent Technologies,Santa Clara,USA)を用いて決定した。
チカグレロルに対するいくらかの構造類似性を有する分子を同定するために、市販の薬剤を含有する構造データベース(「DrugsDB」、参照により本明細書に援用されるOprea T.I et al 2011 Mol.Inform.30(2-3),100-111)を調べた。同定されたら、これらの構造的に類似した分子を用いて、アデノシンおよびそのリン酸化形態(たとえば、ADPおよびATP)を超えるFabの結合特異性を試験した。データベースを、チカグレロルx線およびNMR構造に基づいて、チカグレロルに対する2Dフィンガープリント類似性、3D形状、および静電的類似性を有する分子について調べた。このインシリコ分析から、6つの潜在的なコメディケーション(co-medication)を含む12の化合物のパネルを選択した。これらの化合物の構造が、図4に示される。
ユウロピウムクリプテート抗His抗体:試験His-Fab:ビオチン化チカグレロル:XL665標識ストレプトアビジン。
特異的結合(%)={(サンプルデルタF-陰性結合デルタF)/(全結合デルタF-陰性結合デルタF)}×100
上で生成された抗チカグレロルFabの親和性を、Octet Red384においてBiolayer Interferometryを用いて決定した。親和性測定のために、抗チカグレロルFab抗体を、アッセイ緩衝液(PBS、Tween20 0.05%、BSA 0.02%)、たとえば200nM中の2×最終アッセイ濃度の濃度になるまで希釈した。チカグレロルの10.2倍連続希釈を、Greinerポリプロピレン96-ウェルプレートにおいて調製した。次に、等体積(たとえば70μLおよび70μL)の希釈された抗体および遊離チカグレロルを、第2のGreinerポリプロピレンプレートに移した。サンプルをピペット操作によって混合し、プレートシールで被覆し、室温で3~5日間にわたって平衡化した。平衡化後、60μLの抗体/チカグレロル滴定を、デュプリケートで、384ウェル黒色傾斜底ポリプロピレンプレートに移した。ビオチン化チカグレロルを、アッセイ緩衝液中で250nMに希釈し、384ウェルアッセイプレートの最初の2つのカラムの別のウェルに加え、残りのウェルは、アッセイ緩衝液のみを含有していた。ストレプトアビジンバイオセンサを、少なくとも10分間にわたってアッセイ緩衝液に予め浸漬させた。次に、サンプルプレートおよびバイオセンサを、OctetRed384の段に充填した。
抗体TICA0072を、親和性に基づくファージ選択を用いて最適化した。リードscFv配列に由来する大きいscFvライブラリーを、記載される標準的な分子生物学技術を用いて、可変重鎖(VH)相補性決定領域(CDR)1、2または3または可変軽(VL)鎖CDR1、2または3のオリゴヌクレオチド特異的突然変異によって作成した(Clackson and Lowman 2004 Practical Approach Series 266)。チカグレロルおよびTAMに対してより高い親和性を有する変異体を選択するために、ライブラリーを、親和性に基づくファージディスプレイの選択に供した。簡潔には、scFv-ファージ粒子を、実質的に以前に記載されているように(Thompson et al 1996 J Mol Biol.256(1):77-88)、ビオチン化チカグレロルの減少する濃度(典型例は、4回の選択にわたって20nM~20pMであり得る)の溶液中でインキュベートした。粗scFv含有ペリプラズム抽出物を、CDR標的化選択アウトプットからの代表的な数の個々のscFvのために調製し、TICA072と比べた親和性の向上のためのスクリーニングするように設計されたHTRF(登録商標)エピトープ競合アッセイフォーマットにおいてスクリーニングした。
リード最適化キャンペーンの終了時に非常に高い親和性の精製されたFabを有効に区別するために、さらなるHTRF(登録商標)エピトープ競合アッセイを実施したが、この場合、アッセイは、親TICA0072 IgGではなくビオチン化チカグレロルに結合する中親和性最適化TICA0072系統IgG(TICA0159)の競合的阻害に基づくものであった。このアッセイを、(HTSフォーマットではなく)多点IC50プロファイリングフォーマットのみで使用し、親TICA0072 IgGに基づくエピトープ競合アッセイにおける精製されたFab変異体の多点IC50プロファイリングのためのアッセイ5(上記)において示される方法と実質的に同じように行った。TICA0159 IgG(唯一の相違である)を、アッセイ設定の適切な時点で、ただし同じ16nMの最終アッセイ濃度で、TICA0072 IgGの代わりに使用した。全ての他の点で、このアッセイを、精製されたFabの多点二次プロファイリングバージョンにおいてまさに上述されるとおりに行った。
実施例5において生成された抗チカグレロル/TAM Fabの親和性を、KinExA3200を用いて決定した。KinExA親和性測定のために、ビーズ(600mgのアズラクトンビーズ)を、それらを50mMのNaHCO3中の1mgのストレプトアビジンと一晩反応させることによってまず調製した。トリス緩衝液(1MのトリスpH8.7、10mg/mLのBSA)の2回の交換でブロッキングした後、ストレプトアビジンで被覆されたビーズを、8mLの総体積中で再懸濁させた。ビーズ(1.33mL、100mgの元の乾燥アズラクトンビーズに相当する)を、PBSで完全に洗浄し、次に、時折撹拌しながら10分間にわたって、1mLのPBS中の約2.5μgのビオチン-チカグレロルに結合させた。得られたビオチン-チカグレロルで被覆されたビーズをPBSで洗浄し、次に、0.1%のBSAおよび0.02%のNaN3を含有する50mLのPBS中で再懸濁させ、KinExAビーズバイアルに移すまで室温で貯蔵した。
Fab、TICA0162およびTICA0212の特異性を、実施例3において試験し、DMSOに対して正規化した。TICA0162およびTICA0212のための全ての利用可能な選択性データの概要の表が、表7に含まれる。さらに、図4に列挙される12の化合物のうちの5つがチカグレロル、TAM、TIMおよびいくつかのアデノシンファミリー化合物と並行して試験される実験からの実施例のプロットされたデータが図7に示される。
C末端his-タグを有するTICA0072を、PBS中で9mg/mlに濃縮した。複合体形成を、DMSOに溶解された1mMのチカグレロルの添加によって行った。複合体を室温で2時間インキュベートしてから、結晶化試験を、シッティングドロップによる蒸気拡散方法を用いて設定した。広範なスクリーニングを、3つの市販のスクリーニングを用いて行い、いくつかのヒットが得られた。最良の回折結晶が、Morpheus(登録商標)(Molecular Dimensions,UK)ヒットのグリッド最適化(grid optimization)から得られた。等体積のTICA0072-チカグレロル複合体および12.8%のPEG 3350、12.8%のPEG 1000、12.8%のMPD、1.7%の1,6-ヘキサンジオール、1.7%の1-ブタノール、1.7%の1,2-プロパンジオール、1.7%の2-プロパノール、1.7%の1,4ブタンジオール、1.7%の1,3-プロパンジオール、25mMのイミダゾール、25mMのカコジル酸ナトリウム、25mMのMESおよび25mMのビス-トリスpH6.5のリザーバ溶液(reservoir solution)を混合することによって、構造決定に使用される結晶を、20℃で成長させた。抗凍結剤を添加せずに、結晶を液体窒素中で急速冷凍した。
ADP誘導性血小板凝集のチカグレロルまたはTAM媒介性阻害を拮抗するTICA0212/MEDI2452の程度および有効性を、光透過凝集測定を用いて、ヒト多血小板血漿(PRP)中で決定した。
TICA0212/MEDI2452がチカグレロルまたはTAMに拮抗する発現時間を、実施例8と同様に光透過凝集測定を用いてヒト多血小板血漿(PRP)において決定した。PRPを、1時間にわたって1μMのチカグレロルまたはTAMと共に予めインキュベートしてから、1μMのTICA0212/MEDI2452を加え、5、10、15、30および60分間にわたって共インキュベートし、または30分間にわたってアイソタイプ対照Fabを加えた。血小板凝集を、20μMのADPの添加によって開始し、6分間にわたって連続して記録した。6分間の時点での最終凝集(FA)程度のデータを分析した。
全血中のADP誘導性血小板凝集のチカグレロル媒介性阻害のTICA0212/MEDI2452に媒介される拮抗の発現速度および程度(インピーダンス凝集測定)を、マウスへのチカグレロルの静脈内(i.v.)投与後に生体外で決定した。5分間にわたる1200μg/kgのボーラス投与、続いて30μg/kg/分の15分間の持続注入として、マウスにチカグレロルを静脈内で与えた。チカグレロル注入の停止後、チカグレロルの血漿中曝露量が、平均1.4μMであると測定されたとき、マウスに、250mg/kgのTICA0212/MEDI2452の静脈内ボーラス投与を与えた。TICA0212/MEDI2452投与の5、30、および60分後の時点で、マウスを殺処分し、血液サンプルを収集した。この試験において、ADP誘導性凝集応答を、6分間測定し、データを、時間の経過と共に記録される凝集単位(AU)(AU*分)の曲線下の平均面積として表した。
TICA0212/MEDI2452の意図される適応の1つが、緊急手術を必要とする患者へのチカグレロルの解毒剤としての適応であるため、TICA0212/MEDI2452を、完全な拮抗が手術の開始前に達成されるべきである臨床状況を模倣するように設計されたマウス出血実験において評価した。
血液サンプルを、EDTA抗凝固剤を含むチューブに収集し、室温で、10000×gで5分間遠心分離して、血漿を調製した。チカグレロルおよびTAMの血漿濃度を、以下の差異を含む、公開された方法に記載されるタンデム質量分析法(LC-MS/MS)[Sillen H.,et al.,J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2010;878:2299-306]を用いて、タンパク質沈殿および液体クロマトグラフィーによって決定した。血漿、50μLは、アセトニトリル中の180μlの内部標準(D7-ZD6140)を用いて沈殿されたタンパク質であった。液体クロマトグラフシステムおよび質量分析計は、Waters製のXevo TQ-S質量分析計に結合されたAcquity Ultra Performance LCであった。クロマトグラフ分離を、Aquity UPLC(登録商標)BEH C18カラム(2.1×50mm、粒度1.7μm)において行った。陰性エレクトロスプレーイオン化を用いた。溶離剤Aは、10mmol/Lの酢酸アンモニウム、pH5を含む水であり、溶離剤Bは、10mmol/Lの酢酸アンモニウムを含むアセトニトリルであった。注入量は1~5μLであり、分析勾配は4%のBから開始し、1.5分で95%に増加し、2.3分まで保持してから、2.4分以内に初期条件に戻した後、0.3分の再平衡化が続いた。品質管理(quality control)サンプルを分析に使用しなかった。定量化の下限(LLOQ)は0.005μmol/Lであり、較正範囲は、0.005~15.0μMであった。
本方法を、以前に公開された方法[Sillen H.,et al.,J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2011 Aug 1;879(23):2315-22]に基づいて最適化した。6~8kDa未満の質量の分子を通過させる透析膜(Spectrum Laboratories,Inc)を、10~15分間にわたってELGA水に浸漬させ、透析プレート半部(社内で作製された)の間に入れた。血漿、130μLを、透析プレートの片側に加え、130μLのリン酸緩衝液、pH7.0を、反対側に加えた。ウェルの両側を蓋で密封し、アルミニウム板をプレートの各側の上に置いて、漏れを防いだ。次に、プレートを、24時間にわたって37℃で、100rpm/分でオービタルシェーカーに垂直に置いた。血漿側からの50μLの濃縮液(retentate)および緩衝液側からの75μLの透析液を、150μLの、アセトニトリル中のそれぞれの75μLの内部標準(D7-ZD6140)を含むタンパク質LoBind PCR透明96ディープ-ウェルプレートに移すことによって、透析を終了した。プレートを1分間混合し、次に、4℃で、1500×gで20分間にわたって遠心分離した。遠心分離後、沈殿された濃縮液から50μLの上清を移し、LC-MS/MS(Xevo TQ-S質量分析計に結合されたAcquity Ultra Performance LC(Waters))分析の前に50μLのELGA H2Oで希釈した。品質管理サンプルを分析に使用しなかった。濃縮液の較正範囲は、0.4~1000nmol/Lであり、透析液の較正範囲は、0.003~50nmol/Lであった。透析液中のチカグレロルのLLOQは、0.03nmol/Lであった。
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[1] 式(Ia):
R 1 が、C 1 ~C 6 アルコキシおよびC 1 ~C 6 アルキルチオからなる群から選択され;
R 2 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、置換C 1 ~C 6 アルキル、C 3 ~C 6 シクロアルキル、および置換C 3 ~C 6 シクロアルキルからなる群から選択され;および
R 3 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、C 1 ~C 6 アルコキシ、およびC 1 ~C 6 アルカノールからなる群から選択される)
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体。
[2] 式(IIa)
[3] 式(IIIa)
として括弧で識別される前記化合物の部分内でエピトープにおいて前記式(Ia)の前記シクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に結合する、[1]に記載の抗体。
[4] 式(Ib):
[5] R 1 がC 1 ~C 6 アルキルチオである、[4]に記載の抗体。
[6] 式(Ib)の前記化合物が、チカグレロル((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-ジフルオロフェニル)シクロプロピル]アミノ}-5-(プロピルチオ)-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル]-5-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロペンタン-1,2-ジオール)またはその代謝産物もしくは誘導体である、[4]に記載の抗体。
[7] 式(Ib)の前記化合物が、
[8] ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、Fab、F(ab’) 2 、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、および抗体可変ドメインから選択される、[1]~[7]のいずれか一に記載の抗体。
[9] scFvを含む、[8]に記載の抗体。
[10] Fabを含む、[8]に記載の抗体。
[11] 約200nM以下のIC 50 を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[12] 約100nM~約1nMの範囲のIC 50 を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[13] 約10nM~約1nMの範囲のIC 50 を有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[14] 約50nM以下のKdを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[15] 約250pM~約1pMの範囲のKdを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[16] 約100pM~約1pMの範囲のKdを有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[17] フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、2-MeSアデノシン二リン酸、および2-MeSアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物について約50μM以下のIC 50 を示す、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[18] 約12時間の生体内半減期を有する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[19] チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[20] 投与から約30分以内にチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[21] チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ADP誘導性血小板凝集を修復する、[1]~[10]のいずれか一に記載の抗体。
[22] 式(Ia):
R 1 が、C 1 ~C 6 アルコキシおよびC 1 ~C 6 アルキルチオからなる群から選択され;
R 2 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、置換C 1 ~C 6 アルキル、C 3 ~C 6 シクロアルキル、および置換C 3 ~C 6 シクロアルキルからなる群から選択され;および
R 3 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、C 1 ~C 6 アルコキシ、およびC 1 ~C 6 アルカノールからなる群から選択される)
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、
配列番号2、配列番号12、配列番号22、配列番号32、配列番号42、配列番号52、配列番号62、および配列番号72からなる群から選択される重鎖可変領域(VH)配列;ならびに
配列番号7、配列番号17、配列番号27、配列番号37、配列番号47、配列番号57、配列番号67、および配列番号77からなる群から選択される軽鎖可変領域(VL)配列
を含む抗体またはそのフラグメント。
[23] 配列番号2および配列番号7;配列番号12および配列番号17;配列番号22および配列番号27;配列番号32および配列番号37;配列番号42および配列番号47;配列番号52および配列番号57;配列番号62および配列番号67;ならびに配列番号72および配列番号77からなる群から選択されるVHおよびVL配列の組み合わせを含む、[22]に記載の抗体。
[24] 配列番号52および配列番号57;配列番号62および配列番号67;ならびに配列番号72および配列番号77からなる群から選択されるVHおよびVLの組み合わせを含む、[23]に記載の抗体。
[25] 式(Ia):
R 1 が、C 1 ~C 6 アルコキシおよびC 1 ~C 6 アルキルチオからなる群から選択され;
R 2 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、置換C 1 ~C 6 アルキル、C 3 ~C 6 シクロアルキル、および置換C 3 ~C 6 シクロアルキルからなる群から選択され;および
R 3 が、H、C 1 ~C 6 アルキル、C 1 ~C 6 アルコキシ、およびC 1 ~C 6 アルカノールからなる群から選択される)
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域(FR)および相補性決定領域(CDR)1、2、および3を含み、ここで、前記重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3配列が、
配列番号3(CDR1)、配列番号4(CDR2)、および配列番号5(CDR3); 配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3);
配列番号23(CDR1)、配列番号24(CDR2)、および配列番号25(CDR3);
配列番号33(CDR1)、配列番号34(CDR2)、および配列番号35(CDR3);
配列番号43(CDR1)、配列番号44(CDR2)、および配列番号45(CDR3);
配列番号53(CDR1)、配列番号54(CDR2)、および配列番号55(CDR3);
配列番号63(CDR1)、配列番号64(CDR2)、および配列番号65(CDR3);または
配列番号73(CDR1)、配列番号74(CDR2)、および配列番号75(CDR3)
を含み;
前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3配列が、
配列番号8(CDR1)、配列番号9(CDR2)、および配列番号10(CDR3);
配列番号18(CDR1)、配列番号19(CDR2)、および配列番号20(CDR3);
配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3);
配列番号38(CDR1)、配列番号39(CDR2)、および配列番号40(CDR3);
配列番号48(CDR1)、配列番号49(CDR2)、および配列番号50(CDR3);
配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3);
配列番号68(CDR1)、配列番号69(CDR2)、および配列番号70(CDR3);または
配列番号78(CDR1)、配列番号79(CDR2)、および配列番号80(CDR3)
を含む、抗体またはそのフラグメント。
[26] 配列番号53(VH CDR1)、配列番号54(VH CDR2)、配列番号55(VH CDR3)、配列番号58(VL CDR1)、配列番号59(VL CDR2)、および配列番号60(VL CDR3);
配列番号63(VH CDR1)、配列番号64(VH CDR2)、配列番号65(VH CDR3)、配列番号68(VL CDR1)、配列番号69(VL CDR2)、および配列番号70(VL CDR3);ならびに
配列番号73(VH CDR1)、配列番号74(VH CDR2)、配列番号75(VH CDR3)、配列番号78(VL CDR1)、配列番号79(VL CDR2)、および配列番号80(VL CDR3)
からなる群から選択されるCDR領域の組み合わせを含む、[25]に記載の抗体。
[27] ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、Fab、F(ab’) 2 、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、および抗体可変ドメインから選択される、[22]~[26]のいずれか一に記載の抗体。
[28] scFvを含む、[27]に記載の抗体。
[29] Fabを含む、[27]に記載の抗体。
[30] 約100nM以下のIC 50 を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[31] 約100nM~約1nMの範囲のIC 50 を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[32] 約100nM~約1nMの範囲のIC 50 を有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[33] 約50nM以下のKdを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[34] 約250pM~約1pMの範囲のKdを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[35] 約100pM~約1pMの範囲のKdを有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[36] フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、2-MeSアデノシン二リン酸、および2-MeSアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物について約50μM以下のIC 50 を示す、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[37] 約12時間の生体内半減期を有する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[38] チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[39] 投与から約30分以内にチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[40] チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ADP誘導性血小板凝集を修復する、[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[41] チカグレロルを投与された患者の急な出血を治療する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[42] 外科手術を受けたか、または受けており、かつチカグレロルを投与された患者の重度の出血を治療する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[43] チカグレロルを投与された患者の出血を予防する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[44] 患者における(P2Y 12 )受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の影響を阻害する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[45] 患者におけるP2Y 12 受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の結合を阻害する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[46] チカグレロルを投与された患者におけるADP誘導性血小板凝集を活性化する方法であって、有効量の[1]~[40]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
[47] 前記患者が外科手術を受ける予定である、[43]~[46]のいずれか一に記載の方法。
[48] [22]~[26]のいずれか一に記載の抗体をコードする配列を含む核酸分子を含む組成物。
[49] 前記核酸分子が、配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号16、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76を含む、[48]に記載の組成物。
[50] 配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号16、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76を含む核酸分子を含むベクター。
[51] [50]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[52] チカグレロルのシクロペンチル環上のヒドロキシエチル基を含むエピトープに結合しない、[1]~[10]または[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[53] チカグレロルのシクロプロピル-ジフルオロフェニル基を含むエピトープに結合する、[1]~[10]または[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
[54] チカグレロルのシクロプロピル-ジフルオロフェニル基を含むエピトープに結合するが、チカグレロルのシクロペンチル環上のヒドロキシエチル基を含むエピトープに結合しない、[1]~[10]または[22]~[29]のいずれか一に記載の抗体。
Claims (14)
- 配列番号32に対し少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するVHおよび配列番号37に対し少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するVLを含む、チカグレロル((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-ジフルオロフェニル)シクロプロピル]アミノ}-5-(プロピルチオ)-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル]-5-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロペンタン-1,2-ジオール)またはその代謝産物に結合する抗体またはそのフラグメント。
- モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Fab、およびF(ab’)2から選択される、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- チカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 患者への投与から60分以内にチカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項4に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 患者への投与から30分以内にチカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。
- チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ADP誘導性血小板凝集を修復する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- P2Y12受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の影響を阻害する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- P2Y12受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の結合を阻害する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 抗体またはそのフラグメントの生体内半減期が、4~24時間、4~12時間、12時間、または7時間である、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- チカグレロルを投与された患者の急な出血の治療に使用するための、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 患者が、チカグレロルが治療可能な、および/もしくは適応とされる適応症について、治療をされているか、または治療もしくは予防の必要がある、請求項11に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 適応症が、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症の主要な動脈血栓性合併症;血栓性又は塞栓性脳卒中;一過性脳虚血発作;末梢血管疾患;血栓溶解を伴うかまたは伴わない心筋梗塞;アテローム性動脈硬化症への介入に起因する動脈合併症(arterial complication);血管形成術;冠動脈血管形成術(PTCA);動脈内膜切除術;ステント留置術;冠動脈および他の血管移植手術;手術の損傷または機械的損傷の血栓性合併症;事故による外傷または手術による外傷の後の組織サルベージ;再建手術;びまん性血栓症/血小板消費構成要素を伴う病態;播種性血管内凝固;血栓性血小板減少性紫斑病;溶血性***症候群;敗血症の血栓性合併症;成人呼吸窮迫症候群;抗リン脂質抗体症候群;ヘパリン起因性血小板減少症;子癇前症/子癇;静脈血栓症;深部静脈血栓症;静脈閉塞性疾患;血液疾患;骨髄増殖性疾患;血小板血症;鎌状赤血球病;機械的に誘発されるインビボの血小板活性化の予防;心肺バイパス;体外式膜型人工肺;微小血栓の予防;機械的に誘発されるインビトロの血小板活性化;血管損傷/炎症に続発する血栓症;脈管炎;動脈炎;糸球体腎炎;炎症性腸疾患;臓器移植拒絶;および片頭痛からなる群から選択される、請求項12に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、チカグレロルを投与された患者の急な出血の治療に使用するための、医薬組成物。
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