ES2788870T3 - Formulación de factor VIII - Google Patents

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Abstract

Una composición acuosa del factor de coagulación VIII, que comprende: a. una molécula de FVIII; b. de 40 a 195 mM de una sal de sodio; c. histidina; d. al menos 1 mM de una sal de calcio; y e. un tensioactivo; en la que [His] >= 180 mM - 20*[Ca2+], en la que [Ca 2+] es la concentración de iones de calcio en la composición acuosa en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en la composición acuosa en milimoles por litro, con la condición de que [His] > 0; y en la que la osmolaridad de la composición es 600 mOsmol/l o menor.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación de factor VIII
Antecedentes de la invención
El factor VIII (FVIII) es una proteína que se encuentra en el plasma sanguíneo, que actúa como cofactor en la cascada de reacciones que conducen a la coagulación sanguínea. Una deficiencia en la cantidad de actividad de FVIII en la sangre da lugar al trastorno de coagulación conocido como hemofilia A, una afección hereditaria que afecta principalmente a los hombres. La hemofilia A se trata en la actualidad con preparaciones terapéuticas de FVIII procedentes de plasma humano o fabricadas usando tecnología de ADN recombinante. Dichas preparaciones se administran en respuesta a un episodio de hemorragia (terapia a demanda) o a intervalos regulares, frecuentes, para prevenir hemorragia incontrolada (profilaxis).
Se sabe que el FVIII es relativamente inestable en preparaciones terapéuticas. En plasma sanguíneo, FVIII está habitualmente en complejo con otra proteína plasmática, factor de von Willebrand (vWF), que está presente en el plasma en un gran exceso molar de la subunidad de VWF con respecto a FVIII y se cree que protege el FVIII de la degradación prematura. Otra proteína plasmática en circulación, la albúmina, también puede desempeñar un papel en la estabilización del FVIII in vivo. Las preparaciones de FVIII comercializadas en la actualidad dependen, por lo tanto, con frecuencia del uso de albúmina y/o vWF para estabilizar el FVIII durante el procedimiento de fabricación y durante el almacenamiento.
La albúmina y el vWF usados en preparaciones de FVIII comercializadas en la actualidad preparativos se obtienen de plasma sanguíneo humano, sin embargo, y el uso de dicho material tiene determinados inconvenientes. Normalmente se añade un gran exceso molar de albúmina en comparación con FVIII para aumentar la estabilidad del FVIII en dichas preparaciones, y esto hace más difícil caracterizar la proteína FVIII en sí misma en estas preparaciones. La adición de albúmina procedente de seres humanos a FVIII también se percibe como una desventaja con respecto a preparaciones de FVIII producidas de manera recombinante. Esto se debe a que, en ausencia de dicha albúmina añadida, el riesgo teórico de transmitir un virus se reduciría en preparaciones de FVIII obtenidas de manera recombinante.
Se han descrito varios intentos de formular FVIII sin albúmina o vWF (o con niveles relativamente bajos de estos excipientes). Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 5.565.427 (documento EP 508 194) describe preparaciones de FVIII que contienen combinaciones particulares de detergente y aminoácidos, específicamente arginina y glicina, además de excipientes, tales como cloruro de sodio y sacarosa.
La patente de los Estados Unidos n.° 5.763.401 (documento EP 818204) también describe una formulación terapéutica de FVIII sin albúmina, que comprende sacarosa 15-60 mM, NaCI hasta 50 mM, cloruro de calcio hasta 5 mM, glicina 65-400 mM e histidina hasta 50 mM.
La patente de los Estados Unidos n.° 5.733.873 (documento EP 627 924) de Osterberg (asignado a Pharmacia & Upjohn) desvela formulaciones que incluyen entre 0,01 y 1 mg/ml de un tensioactivo.
También se han descrito otros intentos de usar concentraciones bajas o altas de cloruro de sodio. La patente de los Estados Unidos n.° 4.877.608 (documento EP 315 968) desvela formulaciones con concentraciones relativamente bajas de cloruro de sodio, en concreto, NaCl de 0,5 mM a 15 mM.
Por otro lado, la patente de los Estados Unidos n.° 5.605.884 (documento EP 0 314 095) enseña el uso de formulaciones con concentraciones relativamente altas de cloruro de sodio.
Se desvelan formulaciones adicionales de FVIII en los documentos WO 2010/054238, EP 1712223, WO 2000/48635, WO 96/30041, WO 96/22107, WO 2011/027152, EP 2361 613, EP 0410207, EP 0511 234, US 5565427, EP 0638 091, EP 0 871 476, EP 0 819 010, US 5874408, US 2005/0256038, US 2008/0064856, WO 2005/058283, WO 2012/037530 y WO 2014/026954. El documento EP 1712223 A1 desvela composiciones de FVIII que comprenden histidina y CaCh, pero las concentraciones combinadas de histidina y Ca2+ en las composiciones del documento EP 1 712223 A1 son demasiado bajas para conferir la estabilidad deseada de FVIII en solución acuosa.
Otras formulaciones terapéuticas de FVIII de la técnica anterior incluyen en general albúmina y/o vWF con el fin de estabilizar FVIII y, por lo tanto, no son relevantes para la presente divulgación.
Un problema en la preparación de composiciones de FVIII es proporcionar una solución que sea adecuada para liofilización y uso después de la reconstitución posterior. Un criterio importante a este respecto es que la solución de FVIII debería mostrar una actividad de FVIII estable y no debería mostrar turbidez antes de la liofilización. Si una solución acuosa de FVIII es turbia antes de la liofilización, esta es una clara señal de que una o más sustancias en la solución, incluyendo el propio FVIII, se han agregado. Esto es muy indeseable, ya que normalmente es una indicación de proteína desnaturalizada, lo que conduce a reducción de la actividad. Un segundo problema importante con las formulaciones de FVIII es su estabilidad después de la liofilización. Los signos de mala estabilidad incluyen una actividad restante reducida de FVIII después de la liofilización, el almacenamiento y la reconstitución y la presencia de complejos de alto peso molecular de FVIII.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de composiciones que comprenden FVIII que no muestran turbidez u otro deterioro relevante de la calidad como, p. ej., pérdida significativa de actividad antes de la liofilización y poseen estabilidad a largo plazo después de la liofilización al mismo tiempo. Ya que los requisitos de una solución estable antes de la liofilización y un liofilizado estable en términos de composición pueden diferir significativamente, ambas condiciones deben tenerse en cuenta al desarrollar una formulación estable de este tipo.
Ahora se ha descubierto sorprendentemente que esto se puede lograr mediante composiciones según la presente invención, que comprenden histidina y calcio a determinadas concentraciones mínimas. Los inventores descubrieron en particular que, con respecto a la estabilidad de FVIII, una concentración menor de histidina puede equilibrarse con concentraciones mayores de calcio y viceversa. Esto, por ejemplo, no se desvela en el documento EP 1712223 A1 y, en consecuencia, las composiciones descritas en el mismo no anticipan la materia objeto reivindicada en la presente invención. Específicamente, las concentraciones de histidina de las composiciones del documento EP 1712223 A1 son menores que las requeridas por la reivindicación 1 de la presente solicitud. Las composiciones de la presente invención tienen una ventaja adicional porque están cerca de las condiciones fisiológicas con respecto a osmolaridad. Esto evita irritaciones u otros efectos locales que podrían ser provocados por composiciones significativamente hiperosmolares que están presentes en muchas formulaciones de factor Vlll de la técnica anterior.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una composición acuosa de FVlll, pudiendo usarse dicha composición para tratar a un sujeto con hemofilia A.
Los siguientes artículos (1) a (93) describen diversos aspectos y realizaciones de la presente invención:
(1) Una composición acuosa del factor de coagulación Vlll, que comprende:
a. una molécula de FVlll;
b. de 40 a 195 mM de una sal de sodio;
c. histidina;
d. al menos 1 mM de una sal de calcio; y
e. un tensioactivo;
en la que [His] > 180 mM - 20*[Ca2+], en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en la composición acuosa en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en la composición acuosa en milimoles por litro; y
en la que la osmolaridad de la composición es 600 mOsmol/l o menos.
(2) Una composición acuosa del factor de coagulación Vlll, que comprende:
a. una molécula de FVlll;
b. de 40 a 95 mM de una sal de sodio;
c. histidina;
d. al menos 1 mM de una sal de calcio; y
e. un tensioactivo;
en la que [His] > 180 mM - 20*[Ca2+], en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en la composición acuosa en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en la composición acuosa en milimoles por litro, y
en la que la osmolaridad de la composición es preferentemente 600 mOsmol/l o menos.
(3) Una composición acuosa del factor de coagulación Vlll, que comprende:
a. una molécula de FVlll;
b. al menos 40 mM de una sal de sodio;
c. histidina;
d. sacarosa
e. al menos 1 mM de una sal de calcio; y
f. un tensioactivo;
en la que [His] > 180 mM - 20*[Ca2+], en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en la composición acuosa en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en la composición acuosa en milimoles por litro, y
en la que la osmolaridad de la composición es preferentemente 600 mOsmol/l o menos.
(4) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que las fórmulas están sujetas a la condición de que [His] > 0.
(5) La composición acuosa según el artículo (1) o (3), en la que la concentración de la sal de sodio es de 50 a 150 mM.
(6) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de la sal de sodio es de 50 a 95 mM.
(7) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de la sal de sodio es de 50 a 75 mM.
(8) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de la sal de sodio es de 60 a 70 mM.
(9) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de la sal de sodio es de aproximadamente 65 mM.
(10) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 5 mM.
(11) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 10 mM.
(12) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 20 mM.
(13) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 30 mM.
(14) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 40 mM.
(15) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es al menos 50 mM.
(16) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es de 50 a 150 mM.
(17) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración de histidina es de aproximadamente 100 mM.
(18) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene un pH de 5 a 9.
(19) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene un pH de 6 a 8.
(20) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene un pH de 6,5 a 7,5.
(21) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene un pH de 6,8 a 7,2.
(22) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene un pH de aproximadamente 7.
(23) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 6 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(24) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 12 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(25) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 18 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(26) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 24 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(27) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 36 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(28) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 40 °C y una humedad relativa de 60 % durante un periodo de 6 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(29) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 40 °C y una humedad relativa de 60 % durante un periodo de 12 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(30) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 40 °C y una humedad relativa de 60 % durante un periodo de 18 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(31) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 40 °C y una humedad relativa de 60 % durante un periodo de 24 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
(32) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 12 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, tiene una turbidez de 18 UTN o menos.
(33) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la sal de calcio es cloruro de calcio.
(34) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la sal de sodio es cloruro de sodio.
(35) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición comprende además un hidrato de carbono.
(36) La composición acuosa según la (35) anterior, en la que el hidrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa y rafinosa.
(37) La composición acuosa según las (35) o (36) anteriores, en la que el hidrato de carbono es sacarosa.
(38) La composición acuosa según una cualquiera de las (35) a (37) anteriores, en la que la concentración del hidrato de carbono es de 1 a 20 % p/p.
(39) La composición acuosa según una cualquiera de las (35) a (37) anteriores, en la que la concentración del hidrato de carbono es de 2 a 10 % p/p.
(40) La composición acuosa según una cualquiera de las (35) a (37) anteriores, en la que la concentración del hidrato de carbono es de 3 a 8 % p/p.
(41) La composición acuosa según una cualquiera de las (35) a (37) anteriores, en la que la concentración del hidrato de carbono es de 4 a 6 % p/p.
(42) La composición acuosa según una cualquiera de las (35) a (37) anteriores, en la que la concentración del hidrato de carbono es de aproximadamente 5 % p/p.
(43) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración del tensioactivo es de al menos 0,001 % v/v.
(44) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración del tensioactivo es de 0,001 a 0,1 % v/v.
(45) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración del tensioactivo es de 0,002 a 0,2 % v/v.
(46) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la concentración del tensioactivo es de 0,005 % v/v.
(47) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que el tensioactivo es un tensioactivo de origen no natural.
(48) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que el tensioactivo es polisorbato 80. (49) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que el tensioactivo es polisorbato 20. (50) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición comprende además al menos un aminoácido distinto de histidina.
(51) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina se selecciona del grupo que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, leucina, isoleucina y combinaciones de los mismos.
(52) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es arginina.
(53) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es asparagina.
(54) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es ácido aspártico.
(55) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es ácido glutámico.
(56) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es glutamina.
(57) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es lisina.
(58) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es metionina.
(59) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es fenilalanina.
(60) La composición acuosa según la (50) anterior, en la que el al menos un aminoácido distinto de histidina es isoleucina.
(61) La composición acuosa según una cualquiera de las (50) a (60) anteriores, en la que la concentración del al menos un aminoácido distinto de histidina es de al menos 0,1 mM.
(62) La composición acuosa según una cualquiera de las (50) a (60) anteriores, en la que la concentración del al menos un aminoácido distinto de histidina es de al menos 1 mM.
(63) La composición acuosa según una cualquiera de las (50) a (60) anteriores, en la que la concentración del al menos un aminoácido distinto de histidina es de 5 a 300 mM.
(64) La composición acuosa según una cualquiera de las (50) a (60) anteriores, en la que la concentración del al menos un aminoácido distinto de histidina es de 10 a 200 mM.
(65) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición comprende además al menos un antioxidante.
(66) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante se selecciona del grupo que consiste en glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y combinaciones de los mismos.
(67) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es glutatión reducido. (68) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es metionina.
(69) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es cisteína.
(70) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es sulfito de sodio. (71) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es vitamina A.
(72) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es vitamina E.
(73) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es ácido ascórbico. (74) La composición acuosa según la (65) anterior, en la que el al menos un antioxidante es ascorbato de sodio (75) La composición acuosa según una cualquiera de las (65) a (74) anteriores, en la que la concentración del al menos un antioxidante es de al menos 0,05 mM.
(76) La composición acuosa según una cualquiera de las (65) a (74) anteriores, en la que la concentración del al menos un antioxidante es de 0,05 a 100 mM.
(77) La composición acuosa según una cualquiera de las (65) a (74) anteriores, en la que la concentración del al menos un antioxidante es de 0,1 a 20 mM.
(78) La composición acuosa según una cualquiera de las (65) a (74) anteriores, en la que la concentración del al menos un antioxidante es de 0,25 a 5 mM.
(79) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la molécula del factor VIII es una molécula de FVIII de origen no natural.
(80) La composición acuosa según (79), en la que la molécula del factor VIII se ha producido de manera recombinante.
(81) La composición acuosa según la (79) u (80), en la que la molécula del factor VIII tiene un patrón de glucosilación diferente de el del FVIII procedente de plasma humano.
(82) La composición acuosa según una cualquiera de las (79) a (81) anteriores, en la que la molécula de FVIII tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la SEQ ID NO: 1.
(83) La composición acuosa según una cualquiera de las (79) a (82) anteriores, en la que la molécula de FVIII se selecciona del grupo que consiste en (i) moléculas de FVIII con supresión o truncamiento del dominio B, (ii) moléculas de FVIII de cadena sencilla, (iii) moléculas de FVIII que tienen grupos protectores o restos extensores de la semivida, (iv) proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos de FVIII fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga y (v) combinaciones de las mismas.
(84) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la molécula del factor VIII tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2.
(85) La composición acuosa según una cualquiera de las anteriores, en la que la composición tiene una turbidez de 18 UTN o menos, preferentemente de 6 u Tn o menos, más preferentemente de 3 UTN o menos.
(86) La composición acuosa según la (85) anterior, en la que la composición, antes de la liofilización, tiene una turbidez de 18 UTN o menos, preferentemente de 6 UTN o menos, más preferentemente de 3 UTN o menos. (87) La composición acuosa según la (85) anterior, en la que la composición, tras liofilización y reconstitución en agua destilada, tiene una turbidez de 18 UTN o menos, preferentemente de 6 UTN o menos, más preferentemente de 3 UTN o menos.
(88) Una composición que puede obtenerse liofilizando la composición acuosa según una cualquiera de los anteriores.
(89) Una composición acuosa que puede obtenerse reconstituyendo la composición acuosa liofilizada según la (88) anterior con una solución acuosa.
(90) La composición acuosa de (89), en la que la solución acuosa se selecciona de agua destilada, una solución salina y una solución que comprende histidina.
(91) Un procedimiento para estabilizar una molécula de FVIII, que comprende mezclar los componentes definidos en una cualquiera de las (1) a (3) anteriores para obtener una composición acuosa y liofilizar la composición acuosa.
(92) El procedimiento de (91), en el que la composición acuosa obtenida es una composición según una cualquiera de las (1) a (87) anteriores.
(93) Un procedimiento para tratar un trastorno de la coagulación de la sangre, que comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición de las (89) o (90) anteriores.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa la relación entre las concentraciones de histidina e iones de calcio en la composición de la presente invención. La figura resume los resultados de un estudio de formulación líquida (ejemplo 7) con diversas concentraciones de histidina y cloruro de calcio, mientras que los otros excipientes se mantuvieron constantes (cloruro de sodio 65 mmol/l, sacarosa al 5 %, Tween® 80 al 0,005 %). Los puntos representan una turbidez por encima de un nivel umbral de 18 UTN, los rombos representan una solución transparente (turbidez menor o igual a 18 UTN). El gráfico ilustra que si se aplican determinadas concentraciones de histidina e iones de calcio, se obtiene una solución transparente. El requisito de una solución transparente está representado por una fórmula proporcionada posteriormente.
Descripción detallada de la invención
Moléculas del factor VIII
Como se usa en el presente documento, la expresión "factor VIII" o "FVIII" se refiere a moléculas que tienen al menos parte de la actividad de coagulación del factor VIII nativo humano. El FVIII humano consiste en 2351 aminoácidos (incluyendo un péptido señal) y 2332 aminoácidos (sin el péptido señal). "FVIII nativo humano" es la molécula de FVIII procedente de plasma humano que tiene la secuencia de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-2332). La estructura de dominio detallada, A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2 tiene los restos de aminoácidos correspondientes (en referencia a la SEQ ID NO 1): A1 (1-336), a1 (337-372), A2 (373-710), a2 (711-740), B (741­ 1648), a3 (1649-1689), A3 (1690-2020), C1 (2021-2173) y C2 (2174-2332).
La actividad de coagulación de la molécula de FVIII se puede determinar usando un ensayo de coagulación de una etapa (p. ej., como se describe en Lee y col., Thrombosis Research 30, 511 519 (1983)) o un ensayo de sustrato cromógeno (p. ej., el equipo de prueba de FVIII coamatic del Chromogenix-lnstrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milán, Italia). Se describen posteriormente detalles adicionales de estos ensayos de actividad.
Preferentemente, las moléculas de FVlll usadas de acuerdo con la presente invención tienen al menos 10% de la actividad molar específica de FVlll nativo humano. La expresión "actividad molar específica" se refiere a la actividad de coagulación por mol de FVlll y se indica en "Ul/mol de FVlll.
En una realización preferida, la molécula de FVlll es una molécula de FVlll de origen no natural. Preferentemente, la molécula de FVlll de origen no natural se ha producido de manera recombinante. En otra realización, la molécula de FVlll se ha producida en cultivo celular. En otra realización preferida, la molécula de FVlll de origen no natural tiene un patrón de glucosilación diferente al de FVlll procedente de plasma. En otra realización más, la molécula de FVlll se selecciona del grupo que consiste en (i) moléculas de FVlll con supresión o truncamiento del dominio B, (ii) moléculas de FVlll de cadena sencilla, (iii) moléculas de FVlll de dos cadenas producidas de manera recombinante, (iv) Moléculas de FVlll que tienen grupos protectores o restos extensores de la semivida, (v) proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos de FVlll fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga y (vi) combinaciones de las mismas.
Las expresiones "factor Vlll" y "FVlll" se usan como sinónimos en el presente documento. Las "composiciones de factor Vlll" en el sentido de la presente invención incluyen composiciones que comprenden FVlll y FVllla. FVlIIa puede estar normalmente presente en pequeñas cantidades, p. ej., de aproximadamente 1 a 2% de FVllla, en referencia a la cantidad total de proteína FVlll en la composición. "FVlll" incluye variaciones alélicas naturales de FVlll que pueden existir y aparecer de un individuo a otro. El FVlll puede proceder de plasma o producirse de manera recombinante, utilizando procedimientos bien conocidos de producción y purificación. El grado y la ubicación de glucosilación, sulfatación de tirosina y otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar, dependiendo de la célula huésped elegida y sus condiciones de cultivo.
El término FVlll incluye análogos de FVlll. La expresión "análogo de FVlll", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de FVlll (de longitud completa o con truncamiento/supresión del dominio B) en la que uno o más aminoácidos se han sustituido o eliminado en comparación con la SEQ ID NO: 1 o, para moléculas de FVll con truncamiento/supresión del dominio B, la parte correspondiente de la SEQ ID NO: 1. Los análogos de FVlll no aparecen en la naturaleza sino que se obtienen mediante manipulación humana.
Las moléculas del factor Vlll incluidas en las composiciones de la presente invención también pueden ser moléculas de FVlll con truncamiento/supresión del dominio B en las que los dominios restantes corresponden a las secuencias expuestas en los números de aminoácidos 1-740 y 1649-2332 de la SEQ ID NO: 1. Otras formas de moléculas de FVlll con supresión del dominio B tienen adicionalmente una supresión parcial en su dominio a3, lo que conduce a moléculas de FVlll de cadena sencilla.
Se deduce que estas moléculas de FVlll son moléculas recombinantes producidas en células huésped transformadas, preferentemente de origen mamífero. Sin embargo, los dominios restantes en un FVlll con supresión del dominio B, (es decir, los tres dominios A, los dos dominios C y las regiones a1, a2 y a3) pueden diferir ligeramente, p. ej., aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % de la secuencia de aminoácidos respectiva expuesta en la SEQ ID n O: 1 (aminoácidos 1-740 y 1649-2332).
Las moléculas de FVlll incluidas en la composición de la presente invención pueden ser moléculas de FVlll de dos cadenas o moléculas de FVlll de cadena sencilla. Las moléculas de FVlll incluidas en la composición de la presente invención también pueden ser fragmentos biológicamente activos de FVlll, es decir, FVlll en el que uno o más dominios distintos del dominio B se han suprimido o truncado, pero en el que la molécula de FVlll en la forma con supresión/truncamiento conserva su capacidad para apoyar la formación de un coágulo sanguíneo. La actividad de FVlll se puede evaluar in vitro usando técnicas bien conocidas en este campo. Una prueba preferida para determinar la actividad de FVlll según la presente invención es el ensayo de sustrato cromógeno o el ensayo de una etapa (véase posteriormente). Pueden introducirse modificaciones de aminoácidos (sustituciones, supresiones, etc.) en los dominios restantes, p. ej., para modificar la capacidad de unión del factor Vlll con diversos otros componentes, tales como, p. ej., factor de Von Willebrand (vWF), proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LPR), diversos receptores, otros factores de coagulación, superficies celulares, etc. o para introducir y/o suprimir sitios de glucosilación, etc. Otras mutaciones que no suprimen la actividad de FVlll también pueden alojarse en una molécula/análogo de FVlll para su uso en una composición de la presente invención.
Los análogos de FVlll también incluyen moléculas de FVlll, en las que uno o más de los restos de aminoácidos del polipéptido original se han suprimido o sustituido con otros restos de aminoácidos y/o en las que se han añadido restos de aminoácidos adicionales al polipéptido de FVlll original.
Asimismo, las moléculas/análogos del factor Vlll pueden comprender otras modificaciones, p. ej., en el dominio B truncado y/o en uno o más de los otros dominios de las moléculas ("derivados de FVlll"). Estas otras modificaciones pueden ser en forma de diversas moléculas conjugadas con la molécula del factor Vlll, tales como, p. ej., compuestos poliméricos, compuestos peptídicos, compuestos derivados de ácidos grasos, etc.
El término FVlll incluye FVlll glucopegilado. En el presente contexto, se entiende que la expresión "FVlll glucopegilado" designa una molécula del factor Vlll (incluyendo FVlll de longitud completa y FVlll con truncamiento/supresión del dominio B) en la que uno o más grupos de PEG se han unido con el polipéptido de FVlll a través de la o las cadenas laterales de polisacáridos (glucano o glucanos) del polipéptido.
El término FVIII incluye moléculas de FVIII que tienen grupos protectores o restos extensores de la semivida. Se entiende en el presente documento que las expresiones "grupos protectores"/"restos extensores de la semivida" se refieren a uno o más grupos químicos unidos a una o más funcionalidades de la cadena del sitio de aminoácidos tales como -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2 o una o más estructuras de N- y/u O-glucano y que pueden aumentar la semivida circulatoria in vivo de varias proteínas/péptidos terapéuticos cuando se conjugan con estas proteínas/péptidos. Los ejemplos de grupos protectores/restos extensores de la semivida incluyen: ácidos grasos biocompatibles y derivados de los mismos, almidón de hidroxialquilo (HAS), p. ej., almidón de hidroxietilo (HES), poli (GlyX-Sery)n (polímero de homoaminoácidos (HAP)), ácido hialurónico (Ha ), polímeros de heparosano (HEP), polímeros a base de fosforilcolina (polímero de PC), polímeros Fleximer® (Mersana Therapeutics, MA, Estados Unidos), dextrano, ácidos polisiálicos (PSA), polietilenglicol (PEG), un dominio Fc, transferrina, albúmina, péptidos de tipo elastina, polímeros XTEN® (Amunix, CA, Estados Unidos), péptidos de unión a albúmina, un fragmento del factor von Willebrand (fragmento de vWF), un péptido carboxilo terminal (péptido CTP, Prolor Biotech, IL) y cualquier combinación de los mismos (véase, por ejemplo, McCormick, C.L., A.B. Lowe y N. Ayres, Water-Soluble Polymers, en Encyclopedia of Polymer Science and Technology. 2002, John Wiley & Sons, Inc.). La forma de derivatización no es crítica y se puede dilucidar a partir de lo anterior.
Las moléculas de FVIII que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos de FVIII fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga, preferentemente una secuencia de aminoácidos extensora de la semivida. Son proteínas de fusión preferidas las proteínas de fusión de Fc y proteínas de fusión de albúmina. Se entiende en el presente documento que la expresión "proteína de fusión de Fc" abarca FVIII fusionado con un dominio Fc que puede obtenerse de cualquier isotipo de anticuerpo. Con frecuencia se preferirá un dominio Fc IgG debido a la semivida circulatoria relativamente larga de los anticuerpos IgG. El dominio Fc puede modificarse asimismo para modular determinadas funciones efectoras tales como, p. ej., unión al complemento y/o unión a determinados receptores de Fc. La fusión de FVIII con un dominio Fc, que tiene la capacidad de unirse a los receptores FcRn, dará como resultado, en general, una semivida circulatoria prolongada de la proteína de fusión en comparación con la semivida del FVIII ts. Se deduce que una molécula de FVIII para su uso en la presente invención también puede ser un derivado de un análogo de FVIII, tal como, por ejemplo, una proteína de fusión de un análogo de FVIII, un análogo de FVIII PEGilado o glucoPEGilado o un análogo de FVIII conjugado con un polímero de heparosano. Se entiende en el presente documento que la expresión "proteína de fusión de albúmina" abarca FVIII fusionado con una secuencia de aminoácidos de albúmina o un fragmento o derivado de la misma. La secuencia de aminoácidos heteróloga puede fusionarse con el extremo N o C del FVIII o puede insertarse de manera interna dentro de la secuencia de aminoácidos del FVIII. La secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser cualquier "polipéptido extensor de la semivida" descrito en el documento WO 2008/077616 A1.
Los ejemplos de moléculas de FVIII para su uso en composiciones de la presente invención comprenden, por ejemplo, las moléculas de FVIII descritas en los documentos WO 2010/045568, WO 2009/062100, WO 2010/014708, WO 2008/082669, WO 2007/126808, US 2010/0173831, US 2010/0173830, US 2010/0168391, US 2010/0113365, US 2010/0113364, WO 2003/031464, WO 2009/108806, WO 2010/102886, WO 2010/115866, WO 2011/101242, WO 2011/101284, WO 2011/101277, WO 2011/131510, WO 2012/007324, WO 2011/101267, WO 2013/083858 y WO 2004/067566.
Los ejemplos de moléculas de FVIII, que pueden usarse en una composición de la presente invención, incluyen el principio activo de Advate®, Helixate®, Kogenate®, Xyntha® así como la molécula de FVIII descrita en los documentos WO 2008/135501, WO 2009/007451 y la construcción designada "dBN(64-53)" del documento WO 2004/067566. Esta construcción tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 2.
La concentración de factor VIII en la composición de la presente invención está normalmente en el intervalo de 10­ 10.000 UI/ml. En diferentes realizaciones, la concentración de moléculas de FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10-8.000 UI/ml, o 10-5.000 UI/ml, o 20-3.000 UI/ml, o 50-1.500 UI/ml, o 3.000 UI/ml, o 2.500 UI/ml, o 2.000 UI/ml, o 1.500 UI/ml, o 1.200 UI/ml, 1.000 UI/ml, u 800 UI/ml, o 600 UI/ml, o 500 UI/ml, o 400 UI/ml, o 300 UI/ml, o 250 UI/ml, o 200 UI/ml, o 150 UI/ml o 100 UI/ml.
La "unidad internacional", o "UI", es una unidad de medida de la actividad de coagulación sanguínea (potencia) de FVIII medida por un ensayo de actividad de FVIII como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno usando un patrón calibrado frente a una preparación de patrón internacional calibrada en "UI". Son conocidos en la técnica ensayos de coagulación de una etapa, tal como el descrito en N Lee, Martin L y col., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación de plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de factores del sistema de coagulación intrínseco. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo de formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se ejecuta en presencia de plasma deficiente en factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el factor de coagulación VIII incluido en la muestra para analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de factor VIII presente en la muestra. La actividad del factor de coagulación VIII se cuantifica por comparación directa con una preparación convencional con una actividad conocida del factor VIII en unidades internacionales.
Otro ensayo convencional es un ensayo de sustrato cromógeno. Los ensayos de sustrato cromógeno se pueden obtener comercialmente, tal como el equipo de prueba de FVIII coamatic (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338-20128 Milán, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el factor X es activado por el factor IXa a factor Xa. Esta reacción es estimulada por el factor VIIIa como cofactor. El FVllla está formado por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción del FVIII en la muestra para medir. Cuando se usan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y factor IXa y una cantidad excesiva de factor X, la activación del factor X es proporcional a la potencia del factor VIII. El factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromógeno S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es, por lo tanto, proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del factor VIII de la muestra.
Se usará criodesecación o liofilización, a menos que el contexto en el que aparece indique lo contrario, para designar un procedimiento de secado en el que una solución de materiales (es decir, un ingrediente farmacéutico activo y diversos aditivos de formulación o "excipientes") se convierte en un sólido. Un procedimiento de liofilización habitual consiste en tres etapas, "congelación", "secado primario" y "secado secundario". En la etapa de congelación, casi todo el agua contenida se convierte en hielo y los solutos en sólidos (cristalinos o amorfos). En la etapa de secado primario, el hielo se elimina del producto mediante sublimación directa, lo que se logra manteniendo un gradiente de presión favorable entre las moléculas de agua (hielo) y la atmósfera circundante. En la etapa de secado secundario, la humedad residual se elimina del producto mediante desorción.
Si se proporcionan concentraciones (p/v) para composiciones liofilizadas, se refieren al volumen directamente antes de la liofilización.
A menos que se indique lo contrario, los términos porcentuales expresan porcentajes en peso/peso y las temperaturas están en la escala Celsius.
Osmolaridad
La composición de factor VIII de la presente invención tiene normalmente una osmolaridad de menos de 0,6 Osm/l. Esta es más cercana a las condiciones fisiológicas que las osmolaridades en muchas formulaciones de la técnica anterior que contienen altas concentraciones de cloruro de sodio. En diferentes realizaciones de la invención, la formulación tiene una osmolaridad inferior a 0,55 Osm/l, inferior a 0,5 Osm/l, inferior a 0,45 Osm/l o inferior a 0,4 Osm/l. Las expresiones "osmolaridad" y "concentración osmótica" se usan indistintamente en el presente documento.
La osmolaridad, o concentración osmótica, es la medida de la concentración de soluto, definida como el número de osmoles (Osm) de soluto por litro (l) de solución (osmol/l u Osm/l). Mientras que la molaridad mide el número de moles de soluto por unidad de volumen de solución, la osmolaridad mide el número de osmoles de partículas de soluto por unidad de volumen de solución.
El cálculo teórico de la osmolaridad es bien conocido por el experto en la materia. En resumen, se calcula para cada componente de la solución el producto del coeficiente osmótico f, el número de partículas n en las que la molécula se disocia en agua y la concentración molar, y se suma el resultado sobre todos los componentes. La osmolaridad de una solución se puede calcular a partir de la siguiente expresión: Osm/l = £¡ fi ni Ci, donde el índice i representa la identidad de un componente en particular; f, es el coeficiente osmótico para un componente particular; n es el número de partículas en las que la molécula se disocia en agua; C es la concentración molar del componente. La concentración molar tiene cierta dependencia de la temperatura; para el presente fin hace referencia a las concentraciones a 25 °C.
Una manera alternativa de evaluar la presión osmótica que puede ejercer una solución después de la inyección es evaluando la osmolalidad, en la que se evalúa el contenido de los componentes en relación con la masa de disolvente. La osmolalidad y la osmolaridad se pueden interconvertir fácilmente si se conoce la densidad de la solución y la masa seca de los componentes disueltos. La osmolalidad se puede medir por varios procedimientos, más habitualmente descenso del punto de congelación.
Por ejemplo, para el agua, 1 Osmol de un soluto añadido a 1 kg de agua reduce el punto de congelación en 1,86 °C. Se describen procedimientos para medir la osmolalidad de una solución por descenso del punto de congelación, por ejemplo, en la farmacopea europea 2.2.35 y el capítulo 785 de la farmacopea de los Estados Unidos.
La siguiente tabla enumera los coeficientes osmóticos y el número de partículas n para algunos excipientes importantes. Para otros componentes, un valor de f = 1 proporciona una aproximación suficientemente buena para fines prácticos y el valor de n es bien conocido para esencialmente todos los compuestos relevantes para preparaciones farmacéuticas para uso parenteral.
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Sales
La composición según la presente invención comprende una sal de sodio.
En una realización, la composición de la presente invención contiene al menos 40 mM de una sal de sodio (p. ej., NaCl). En una serie de realizaciones, la composición comprende de 40 a 195 mM de una sal de sodio (p. ej., NaCl), o de 45 a 180 mM, o de 45 a 150 mM, o de 50 a 125 mM, o de 50 a 100 mM, o de 60 a 95 mM o de 60 a 75 mM, p. ej., aproximadamente 65 mM. En otra realización más, la concentración de sal de sodio (p. ej., NaCl) es 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95 mM.
Preferentemente, la sal de sodio es cloruro de sodio; en otra realización, la sal es acetato de sodio. En una tercera realización, la composición de la invención contiene una mezcla de cloruro de sodio y acetato de sodio.
La composición según la presente invención comprende además una sal de calcio. La sal de calcio usada de acuerdo con la presente invención es normalmente soluble en agua de modo que se disocia en uno o más iones y contraaniones de calcio tras su disolución en una solución acuosa. El término "Ca2+" es sinónimo del término "ion de calcio".
En una realización, la concentración de calcio se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[Ca2+] > 9 mM - 0,05*[His]
En otra realización, la concentración de calcio se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[Ca2+] > 9,5 mM - 0,05*[His]
En otra realización, la concentración de calcio se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[Ca2+] > 10 mM - 0,05*[His]
En otra realización, la concentración de calcio se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[Ca2+] > 10,5 mM - 0,05*[His]
Las fórmulas anteriores están sujetas a la condición de que [Ca2+] > 0. Normalmente, la composición contiene al menos 1 mM, preferentemente al menos 2 mM, más preferentemente al menos 4 mM, más preferentemente al menos 5 mM de una sal de calcio. En otra realización, la composición contiene hasta 100 mM de una sal de calcio. En otra realización, la composición comprende 1-50 mM de una sal de calcio, o 2-40 mM, o 3-30 mM o 4-20 mM. En una realización particular, la composición contiene aproximadamente 10 mM de una sal de calcio.
La sal de calcio puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo de cloruro de calcio, acetato de calcio, gluconato de calcio, lactato de calcio, benzoato de calcio y mezclas de los mismos, y otras sales de calcio solubles bien conocidas por las personas expertas en la materia. En una realización preferida, la sal de calcio es cloruro de calcio.
Histidina
La composición según la presente invención comprende histidina, preferentemente L-histidina.
En una realización, la concentración de histidina se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[His] > 180 mM - 20*[Ca2+]
En otra realización, la concentración de histidina se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[His] > 190 mM - 20*[Ca2+]
En otra realización, la concentración de histidina se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[His] > 200 mM - 20*[Ca2+]
En otra realización, la concentración de histidina se define mediante la siguiente fórmula, en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en milimoles por litro:
[His] > 210 mM - 20*[Ca2+]
Las fórmulas anteriores están sujetas a la condición de que [His] > 0. Normalmente, la concentración de histidina es al menos 5 mM, preferentemente al menos 10 mM, preferentemente al menos 20 mM, preferentemente 20-400 mM, preferentemente al menos 25 mM, preferentemente 25-200 mM, preferentemente al menos 50 mM, preferentemente 50-300 mM, preferentemente 55-170 mM, preferentemente 60-150 mM, preferentemente 65-120 mM, más preferentemente 50-100 mM, p. ej., aproximadamente 100 mM. En otra realización más, la concentración de histidina es 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 o 400 mM.
Tensioactivo
La composición según la presente invención comprende un tensioactivo. Como se usa en el presente documento, "tensioactivos" se refiere a agentes que protegen la sustancia activa de la interfase de aire-solución o la tensión o el daño inducidos por la interfase de solución-superficie. Preferentemente, el tensioactivo es un tensioactivo de origen no natural.
Son tensioactivos habituales de origen no natural (con ejemplos de nombres comerciales proporcionados entre corchetes [ ]) los ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilenado tales como monolaurato de sorbitano polioxietilenado (20) [Tween® 20], monopalmitato de sorbitano polioxietilenado (20) [Tween® 40] o monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [Tween® 80], poloxámeros tales como el copolímero en bloque de polioxipropilenopolioxietileno [Pluronic® F68/poloxámero 188], éter octilfenílico de polietilenglicol [Triton® X-100] o éter dodecílico de polioxietilenglicol [Brij® 35]. El uso de un tensioactivo en composiciones acuosas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995. En una realización de la invención, la composición comprende monooleato de sorbitano [Tween® 80]. En determinadas realizaciones, la composición de la presente invención comprende un tensioactivo que no es sensible a la oxidación, p. ej., sacáridos de alquilo. En otra realización, el tensioactivo es un tensioactivo procedente de vegetales, y/o carece de productos petroquímicos y/o se ha producido sin usar productos petroquímicos.
En una realización, la concentración del tensioactivo es al menos 0,001 % v/v, preferentemente 0,001 - 0,1 % v/v, preferentemente 0,002 - 0,3 % v/v, más preferentemente de 0,003 a 0,1% v/v y lo más preferentemente aproximadamente 0,005% v/v. En otra realización más, la concentración del tensioactivo es 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 % v/v. En una realización, la concentración de monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [Tween® 80] es al menos 0,001 % v/v, preferentemente 0,001 - 0,1 % v/v, preferentemente 0,002 - 0,3 % v/v, más preferentemente de 0,003 a 0,1 % v/v y lo más preferentemente aproximadamente 0,005 % v/v.
Tampón
La composición según la invención puede comprender un agente tamponante. Como se usa en el presente documento, "agentes tamponantes" o "tampones" se refieren a agentes que mantienen el pH de la preparación en un intervalo en el que la administración de la preparación (p. ej., intravenosa o subcutánea) normalmente se tolera bien (p. ej., pH de 5 a 9) y, asimismo, evita los cambios de pH y protege la sustancia activa de la tensión o el daño inducido por pH durante la liofilización. Son ejemplos habituales de sustancias usadas como sustancias tamponantes, p. ej., carbonato, fosfato, citrato, borato, 2-amino-2-hidroximetil-1,-3-propanodiol [=TRIS], histidina, glicina.
El tampón (o agentes tamponantes) puede seleccionarse del grupo que consiste en acetato, benzoato, carbonato, citrato, glicilglicina, Hepes, histidina, glicina y TRIS, bicina, tricina, succinato, ácido aspártico, ácido glutámico o mezclas de los mismos. En una realización de la invención, la concentración de la sustancia tamponante es de 1 a 200 mM, tal como, p. ej., de 1 a 150 mM o de 1 a 50 mM o de 1 a 25 mM o de 5 a 20 mM o de 5 a 15 mM.
La composición de la invención tiene normalmente un pH de 4 a 10. En otra realización, la composición tiene un pH de 5,0 a 9,0 o de 6,0 a 8,0 o de 6,5 a 7,5 o de 6,8 a 7,2 o aproximadamente 7. En otras realizaciones, el pH de la composición es 5,5 ± 0,2, 5,6 ± 0,2, 5,7 ± 0,2, 5,8 ± 0,2, 5,9 ± 0,2, 6,0 ± 0,2, 6,1 ± 0,2, 6,2 ± 0,2, 6,3 ± 0,2, 6,4 ± 0,2, 6,5 ± 0,2, 6,6 ± 0,2, 6,7 ± 0,2, 6,8 ± 0,2, 6,9 ± 0,2, 7,0 ± 0,2, 7,1 ± 0,2, 7,2 ± 0,2, 7,3 ± 0,2, 7,4 ± 0,2 o 7,5 ± 0,2. En otras realizaciones, el pH de la composición es 5,5 ± 0,1, 5,6 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,8 ± 0,1, 5,9 ± 0,1,6,0 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,2 ± 0,1, 6,3 ± 0,1, 6,4 ± 0,1, 6,5 ± 0,1, 6,6 ± 0,1,6,7 ± 0,1, 6,8 ± 0,1,6,9 ± 0,1, 7,0 ± 0,1, 7,1 ± 0,1, 7,2 ± 0,1, 7,3 ± 0,1, 7,4 ± 0,1 o 7,5 ± 0,1. En otras realizaciones más, el pH de la formulación estabilizadora es 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0.
Hidratos de carbono
La composición de la invención puede comprender además un hidrato de carbono. Como se usa en el presente documento, "hidratos de carbono" se refiere a azúcares, tales como mono, di o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, manitol, sorbosa, sorbita, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, dextrano, trehalosa, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, almidón de hidroxietilo y carboximetilcelulosa.
El hidrato de carbono puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo de mono, di o polisacáridos (incluyendo, por ejemplo, los monosacáridos fructosa, glucosa, manosa, galactosa, los disacáridos lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa y los polisacáridos dextrano, rafinosa, estaquiosa).
En una realización de la invención, la composición de FVIII comprende uno o más hidratos de carbono del grupo de: sacarosa, rafinosa, trehalosa o mezclas de los mismos. En una realización, la composición de FVIII comprende un hidrato de carbono en una concentración de 2 a 10 % p/p, preferentemente de 3 a 8 % p/p, preferentemente de 4 a 6 % p/p y lo más preferentemente 5 % p/p. En otra realización más, la concentración del hidrato de carbono es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% p/p.
En realizaciones específicas, el hidrato de carbono es sacarosa. En una realización, la composición de FVIII comprende sacarosa en una concentración de 2 -10 % p/p, preferentemente 3 - 8 % p/p, preferentemente 4 - 6 % p/p y lo más preferentemente 5 % p/p. En otra realización más, la concentración de sacarosa es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o En realizaciones específicas, el hidrato de carbono es trehalosa. En una realización, la composición de FVIII comprende trehalosa en una concentración de 2 a 10 % p/p, preferentemente de 3 a 8 % p/p, preferentemente de 4 a 6 % p/p y lo más preferentemente 5 % p/p. En otra realización más, la concentración de trehalosa es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 % p/p.
En realizaciones específicas, el hidrato de carbono es rafinosa. En una realización, la composición de FVIII comprende rafinosa en una concentración de 2 a 10 % p/p, preferentemente de 3 a 8 % p/p, preferentemente de 4 a 6 % p/p y lo más preferentemente 5 % p/p. En otra realización más, la concentración de rafinosa es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 % p/p.
Aminoácidos
En una realización, la composición de la invención comprende además uno o más aminoácidos distintos de histidina. Como se usa en el presente documento, "aminoácidos" se refiere a cualquier aminoácido farmacéuticamente aceptable natural o no natural. Los ejemplos no limitantes de aminoácidos incluyen, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, cisteína, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, arginina, histidina, ornitina, taurina y similares. El aminoácido distinto de histidina se selecciona preferentemente del grupo que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina, leucina y combinaciones de los mismos.
En una realización, la composición acuosa comprende arginina e isoleucina.
En una realización, la composición acuosa comprende arginina, ácido glutámico y fenilalanina.
En una realización, la composición acuosa comprende arginina, ácido glutámico, fenilalanina y metionina.
En una realización, la composición acuosa comprende arginina, isoleucina y metionina.
En una realización, la composición acuosa comprende glutamina, ácido glutámico, isoleucina y metionina.
En una realización, la concentración del aminoácido distinto de histidina es al menos 0,2 mM, preferentemente de 1 a 300 mM, preferentemente de 5 a 300 mM, preferentemente de 10 a 200 mM, preferentemente de 55 a 150 mM, preferentemente de 25 a 100 mM, preferentemente de 40 a 180 mM, preferentemente de 50 a 90 mM. En otra realización más, la concentración del aminoácido distinto de histidina es 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 mM.
En una realización, la concentración de la arginina es al menos 1 mM, preferentemente de 5 a 300 mM, preferentemente de 10 a 200 mM, preferentemente de 55 a 150 mM, preferentemente de 25 a 100 mM, preferentemente de 40 a 180 mM, preferentemente de 50 a 90 mM. En otra realización más, la concentración de la arginina es 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 mM.
En una realización, la concentración de la isoleucina es al menos 1 mM, preferentemente de 5 a 300 mM, preferentemente de 10 a 200 mM, preferentemente de 55 a 150 mM, preferentemente de 25 a 100 mM, preferentemente de 40 a 180 mM, preferentemente de 50 a 90 mM. En otra realización más, la concentración de la isoleucina es 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 mM.
En una realización, la concentración del ácido glutámico es al menos 1 mM, preferentemente de 5 a 300 mM, preferentemente de 10 a 200 mM, preferentemente de 55 a 150 mM, preferentemente de 25 a 100 mM, preferentemente de 40 a 180 mM, preferentemente de 50 a 90 mM. En otra realización más, la concentración del ácido glutámico es 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 mM.
En una realización, la concentración de la fenilalanina es al menos 1 mM, preferentemente de 5 a 200 mM, preferentemente de 10 a 160 mM, preferentemente de 55 a 150 mM, preferentemente de 25 a 100 mM, preferentemente de 40 a 180 mM, preferentemente de 50 a 90 mM. En otra realización más, la concentración de la fenilalanina es 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 mM.
Antioxidantes
La composición de la presente invención puede contener además uno o más antioxidantes. Un "antioxidante" en el sentido de la presente invención es un compuesto o una composición farmacéuticamente compatible que desacelera, inhibe, interrumpe y/o detiene los procesos de oxidación. Los antioxidantes incluyen, en particular, las siguientes sustancias: tocoferoles y los ésteres de los mismos, glutatión reducido, metionina, monotioglicerol, cisteína, homocisteína, cistationina, vitamina A, sesamol de aceite de sésamo, benzoato de coniferilo de resina de benzoína, resina nordihidroguaiarética y ácido nordihidroguaiarético (NDGA), galatos (entre otros, galatos de metilo, etilo, propilo, amilo, butilo, laurilo), hidroxianisol butilado (BHAIBHT, también butil-p-cresol); ácido ascórbico y sales y ésteres del mismo (por ejemplo, palmitato de acorbilo), ácido eritorbínico (ácido isoascorbínico) y sales y ésteres del mismo,
monotioglicerol, sulfoxilato de formaldehído de sodio, metabisulfito de sodio, bisulfito de sodio, sulfito de sodio,
metabisulfito de potasio, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido propiónico. Son antioxidantes
habituales el tocoferol, tal como, por ejemplo, a-tocoferol y los ésteres del mismo, hidroxitolueno butilado e hidroxianisol
butilado. El término "tocoferol" también incluye ésteres de tocoferol. Un tocoferol conocido es a-tocoferol. La expresión
"a-tocoferol" incluye ésteres de a-tocoferol (por ejemplo, acetato de a-tocoferol). En una realización de la invención, el
antioxidante es metionina, p. ej., L-metionina.
En una realización, la concentración del antioxidante es al menos 0,05 mM, preferentemente de 0,05 a 100 mM,
preferentemente de 0,1 a 80 mM, preferentemente de 0,2 a 50 mM, preferentemente de 0,5 a 70 mM, preferentemente
de 1 a 25 mM, preferentemente de 0,1 a 20 mM, preferentemente de 0,25 a 1 mM. En otra realización más, la
concentración del antioxidante es 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,
6.0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0,
60.0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 o 100,0 mM.
En una realización, la concentración de metionina es al menos 0,05 mM, preferentemente de 0,05 a 100 mM,
preferentemente de 0,1 a 80 mM, preferentemente de 0,2 a 50 mM, preferentemente de 0,5 a 70 mM, preferentemente
de 1 a 25 mM, preferentemente de 0,1 a 20 mM, preferentemente de 0,25 a 5 mM. En otra realización más, la
concentración de metionina es 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,
6.0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0,
60.0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 o 100,0 mM.
En una realización, la concentración de glutatión es al menos 0,05 mM, preferentemente de 0,05 a 100 mM,
preferentemente de 0,1 a 80 mM, preferentemente de 0,2 a 50 mM, preferentemente de 0,5 a 70 mM, preferentemente
de 1 a 25 mM, preferentemente de 0,1 a 20 mM, preferentemente de 0,25 a 1 mM. En otra realización más, la
concentración de glutatión es 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0,
7.0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0,
60.0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 o 100,0 mM.
Agentes estabilizantes
La composición de la presente invención puede comprender un agente estabilizante. Como se usa en el presente
documento, un "agente estabilizante" se refiere a una sustancia química (otros sinónimos son, p. ej., "codisolvente",
"co-soluto", "aditivo químico"; "excipiente") que ayuda a la estabilización de un agente terapéutico lábil en una
formulación acuosa en estado de solución o durante congelación-descongelación, así como liofilización y posterior
almacenamiento del liofilizado deshidratado. Los ejemplos de agentes estabilizantes adecuados para las
formulaciones y los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, sin limitación, agentes
tamponantes (p. ej., TRIS, HEPES, aminoácidos, etc.), osmolitos (p. ej., azúcares, alcoholes de azúcares, etc.),
crioprotectores/lioprotectores (p. ej., alcoholes tales como glicerol, metanol, isopropanol; azúcares tales como
sacarosa, xilitol, dextrosa, trehalosa; ácidos carboxílicos y carboxilatos tales como ácido láctico y lactatos, ácido málico
y maleatos; PEG tales como etilenglicol, PEG 200, PEG 2000, PEG 20000; polímeros tales como polivinilpirrolidonas,
PVP 12, PVP 17, PVP 30; agentes de carga (p. ej., aminoácidos, polioles tales como manitol, etc.), sales, polímeros,
tensioactivos, antioxidantes y similares.
La concentración del agente estabilizante depende de la naturaleza química del agente y puede elegirse de acuerdo
con la divulgación anterior del presente documento.
Estabilidad
En una realización específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición es estable. El
término "estable" como se usa en el presente documento significa que la potencia de la composición, medida mediante
un ensayo de actividad de FVIII, después de almacenamiento durante un periodo de tiempo, es al menos 80 % de la
potencia antes del almacenamiento. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la prueba de
estabilidad se lleva a cabo como se describe en el documento CPMP/ICH/2736/99 de la Agencia Europea de
Medicamentos titulado "NOTE FOR GUIDANCE ON STABILITY TESTING: STABILITY TESTING OF NEW DRUG
SUBSTANCES AND PRODUCTS" a fecha de agosto de 2003.
En una serie de realizaciones, la composición proporcionada en el presente documento tras la liofilización será estable
durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o más meses (25 °C; 40 % de humedad relativa
[HR]). En una realización preferida, la composición liofilizada será estable durante al menos 6 meses (25 °C; 40 % de
HR). En una realización más preferida, la composición liofilizada será estable durante al menos 12 meses (25 °C; 40 %
de HR). En otra realización preferida, la composición liofilizada será estable durante al menos 18 meses (25 °C; 4 otra realización preferida, la composición liofilizada será estable durante al menos 24 meses (25 °C; 4 otra realización preferida, la composición liofilizada será estable durante al menos 36 meses (25 °C; 4 de HR).
En una realización específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable
durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 25 °C/40 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 30 °C/40 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses cuando se almacena a 40 °C/40 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 25 °C/60 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 30 °C/60 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses cuando se almacena a 40 °C/60 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 25 °C/65 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 30 °C/65 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses cuando se almacena a 40 °C/65 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 25 °C/75 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 30 °C/75 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses cuando se almacena a 40 °C/75 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 25 °C/25 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses, aún más preferentemente durante al menos 36 meses cuando se almacena a 30 °C/25 % de HR.
En otra realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición liofilizada es estable durante al menos 6 meses, preferentemente durante al menos 12 meses, más preferentemente durante al menos 24 meses cuando se almacena a 40 °C/25 % de HR.
Preferentemente, la cantidad de componentes de alto peso molecular, según lo determinado mediante SE-HPLC, después de almacenamiento de la composición liofilizada en una de las condiciones definidas anteriormente es 3 % o menos. La cantidad de componentes de alto peso molecular, según lo determinado mediante SE-HPLC como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.
En una realización, la composición es estable durante al menos 48 horas, preferentemente durante al menos 72 horas, más preferentemente durante al menos 96 horas, más preferentemente durante al menos una semana, cuando se almacena en estado líquido a 4 °C. La composición acuosa conserva normalmente al menos 80 % de su actividad de factor VIII durante al menos 48 horas, preferentemente durante al menos 72 horas, más preferentemente durante al menos 96 horas, más preferentemente durante al menos una semana, cuando se almacena en estado líquido a de 2 a 8 °C. Esto se aplica a la composición acuosa antes de la liofilización y/o a la composición acuosa después de la liofilización y la reconstitución en una solución acuosa, p. ej., en agua destilada.
En una realización específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición conserva al menos 85 % de su actividad de factor VIII durante al menos 48 horas, preferentemente durante al menos 72 horas, más preferentemente durante al menos 96 horas, más preferentemente durante al menos una semana, cuando se almacena en estado líquido a 4 °C. Esto se aplica a la composición acuosa antes de la liofilización y/o a la composición acuosa después de la liofilización y la reconstitución en una solución acuosa, p. ej., en agua destilada.
En una realización específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición conserva al menos 90 % de su actividad de factor VIII durante al menos 48 horas, preferentemente durante al menos 72 horas, más preferentemente durante al menos 96 horas, más preferentemente durante al menos una semana, cuando se almacena en estado líquido a 4 °C. Esto se aplica a la composición acuosa antes de la liofilización y/o a la composición acuosa después de la liofilización y la reconstitución en una solución acuosa, p. ej., en agua destilada.
En una realización específica de la invención, la composición muestra poca o ninguna turbidez, p. ej., antes de la liofilización o tras la liofilización y reconstitución en agua. Como se usa en el presente documento, el término "turbidez" se refiere a la opalescencia de una solución. La turbidez se puede determinar visual o instrumentalmente, como se describe en Pharm. Eur. 8.0, sección 22. l "Clarity and degree of opalescence of liquids". Cualquier referencia a la turbidez en la presente solicitud se refiere a los procedimientos descritos en Pharm. Eur. 8.0, sección 22.l "Clarity and degree of opalescence of liquids".
En una realización, la composición de la presente invención tiene una turbidez de 18 UTN o menos. En otra realización, la composición de la presente invención tiene una turbidez de 6 UTN o menos. En otra realización más, la composición de la presente invención tiene una turbidez de 3 UTN o menos. Estos valores de turbidez se cumplen antes de la liofilización y después de la liofilización y reconstitución en agua destilada.
En otra realización más, la composición de la presente invención es transparente. En la presente solicitud, una composición o solución se considera "transparente" cuando su opalescencia no es más pronunciada que la de la "suspensión de referencia III" descrita en Pharm. Eur. 8.0, sección 2.2.1. "Clarity and degree of opalescence of liquids". Cuando se hace referencia en el presente documento a una composición que no tiene "turbidez" o que "carece de turbidez", debe entenderse que la composición es "transparente" de acuerdo con esta definición.
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 1) que comprenden:
Figure imgf000017_0001
Se prefieren además las siguientes composiciones (tabla 2) que comprenden:
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
Se prefieren además las siguientes composiciones (tabla 3) que comprenden:
Figure imgf000018_0002
Se prefieren además las siguientes composiciones (tabla 4) que comprenden:
Figure imgf000018_0003
continuación
Figure imgf000019_0001
Se prefieren además las siguientes composiciones (tabla 5) que comprenden:
Figure imgf000019_0002
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 6) que comprenden:
Figure imgf000019_0003
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 7 ) que comprenden:
Figure imgf000020_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 8) que comprenden:
Figure imgf000021_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 9) que comprenden:
Figure imgf000023_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 10) que comprenden:
Figure imgf000025_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 11) que comprenden:
Figure imgf000027_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 12) que comprenden:
Figure imgf000029_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 13) que comprenden:
Figure imgf000031_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 14) que comprenden:
Figure imgf000033_0001
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 15) que comprenden:
Figure imgf000034_0001
continuación
Figure imgf000035_0001
En otra realización, las composiciones 170-233 comprenden además un tensioactivo, p. ej., monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80], preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p.
En otra realización, las composiciones 170-233 comprenden además uno o más aminoácidos distintos de histidina. El otro aminoácido se selecciona de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM.
En otra realización, las composiciones 170-233 comprenden además un antioxidante, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero sin limitación, glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos. En una realización de la invención, el antioxidante es metionina, p. ej., L-metionina.
En otra realización, las composiciones 170-233 tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
En otra realización, las composiciones 170-233 comprenden además
a. Monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80] como tensioactivo, preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p,
b. uno o más aminoácidos distintos de histidina seleccionados de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM,
c. un antioxidante seleccionado de la lista que consiste en glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM y
d. las composiciones tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 16) que comprenden:
Figure imgf000035_0002
continuación
Figure imgf000036_0001
continuación
Figure imgf000037_0002
En otra realización, las composiciones 234-297 comprenden además un tensioactivo, p. ej., monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80], preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p.
En otra realización, las composiciones 234-297 comprenden además uno o más aminoácidos distintos de histidina. El otro aminoácido se selecciona de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM.
En otra realización, las composiciones 234-297 comprenden además un antioxidante, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero sin limitación, glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos. En una realización de la invención, el antioxidante es metionina, p. ej., L-metionina.
En otra realización, las composiciones 234-297 tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
En otra realización, las composiciones 234-297 comprenden además
e. Monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80] como tensioactivo, preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p,
f. uno o más aminoácidos distintos de histidina seleccionados de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM,
g. un antioxidante seleccionado de la lista que consiste en glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM y
h. las composiciones tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
Se prefieren las siguientes composiciones (tabla 17) que comprenden:
Figure imgf000037_0001
continuación
Figure imgf000038_0001
continuación
Figure imgf000039_0001
En otra realización, las composiciones 298-361 comprenden además un tensioactivo, p. ej., monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80], preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p.
En otra realización, las composiciones 298-361 comprenden además uno o más aminoácidos distintos de histidina. El otro aminoácido se selecciona de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM.
En otra realización, las composiciones 298-361 comprenden además un antioxidante, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero sin limitación, glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos. En una realización de la invención, el antioxidante es metionina, p. ej., L-metionina.
En otra realización, las composiciones 298-361 tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
En otra realización, las composiciones 298-361 comprenden además
i. Monooleato de sorbitano polioxietilenado (20) [p. ej., Tween® 80] como tensioactivo, preferentemente a una concentración de al menos 0,001 % p/p,
j. uno o más aminoácidos distintos de histidina seleccionados de la lista que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, isoleucina o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 1 mM,
k. un antioxidante seleccionado de la lista que consiste en glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración de al menos 0,05 mM y
l. las composiciones tienen un pH de 6,0-8,0 o 6,5-7,5 o 6,8-7,2 o 7.
En una realización específica, la invención se refiere a una composición que se puede obtener liofilizando la composición acuosa descrita anteriormente. En otra realización, la invención se refiere a una composición obtenida liofilizando la composición acuosa descrita anteriormente.
En una realización específica, la invención se refiere a una composición que puede obtenerse reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con un disolvente adecuado.
En una realización específica, se puede obtener una composición reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con un disolvente adecuado, en la que el disolvente adecuado es una solución acuosa.
En una realización específica, se puede obtener una composición reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con una solución acuosa, en la que la solución acuosa se selecciona del grupo que comprende solución de Ringer, solución de lactato de Ringer y cualquier otra solución adecuada para aplicación parenteral.
En una realización específica, se puede obtener una composición reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con una solución acuosa, en la que la solución acuosa es agua, preferentemente "agua para inyección".
En una realización específica, se puede obtener una composición reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con una solución acuosa, en la que la solución acuosa es una solución de cloruro de sodio.
En una realización específica, se puede obtener una composición reconstituyendo la composición acuosa liofilizada como se ha descrito anteriormente con una solución acuosa, en la que la solución acuosa es una solución de histidina.
Otro aspecto de la invención es el uso de una composición descrita en el presente documento en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, p. ej., hemofilia A.
En una realización específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición se formula para administración subcutánea y/o intramuscular.
Las composiciones se administran por vía oral, vía tópica, vía transdérmica, vía parenteral, por pulverización de inhalación, vía vaginal, vía rectal o por inyección intracraneal, preferentemente por vía parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. En general, las composiciones carecen esencialmente de pirógenos (véase, p. ej., Ph. Eur.
7.0/2.06.08.00), así como otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se llevaron a cabo usando una molécula de FVIII (SEQ ID NO: 2; construcción de dBN(64-53) descrita en el documento WO 2004/067566). Esta molécula de FVIII se denominará "CSL627" a continuación.
Ensayo cromogénico de FVIII.C
El ensayo cromogénico de FVIII:C se realizó usando el equipo de prueba de FVIII Coamatic (Chromogenixlnstrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milán, Italia).
Principio del ensayo: En presencia de calcio y fosfolípidos, el factor X es activado por el factor IXa a factor Xa. Esta reacción es estimulada por el factor VIIIa como cofactor. El FVIIIa está formado por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción del FVIII en la muestra para medir. Cuando se usan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y factor IXa y una cantidad excesiva de factor X, la activación del factor X es proporcional a la potencia del factor VIII. El factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromógeno S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es, por lo tanto, proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del factor VIII de la muestra. El ensayo se adaptó para que se realice en analizadores de la coagulación automáticos, ya sea el temporizador de coagulación Behring (BCT) o el sistema de coagulación Behring (BCS), ambos de Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Ludwig-Erhard-StralJe 12, 65760 Eschborn, Alemania.
Ensayo de coagulación en una etapa
El ensayo de coagulación en una etapa de FVIII:C se realizó usando el reactivo Pathromtin SL y plasma deficiente en FVIII, ambos de Siemens Healthcare Diagnostics products GmbH, Emilvon-Behring -Str. 76, 35041 Marburg, Alemania.
Principio del ensayo: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación de plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de factores del sistema de coagulación intrínseco. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se mide el tiempo de formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se ejecuta en presencia de plasma deficiente en factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el factor de coagulación VIII incluido en la muestra para analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de factor VIII presente en la muestra. La actividad del factor de coagulación VIII se cuantifica por comparación directa con una preparación convencional con una actividad conocida del factor VIII en unidades internacionales.
El ensayo se adaptó para que se realice en analizadores de la coagulación automáticos, ya sea el temporizador de coagulación Behring (BCT) o el sistema de coagulación Behring (BCS), ambos de Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Ludwig-Erhard- StralJe 12, 65760 Eschborn, Alemania.
Componentes de alto peso molecular (CAPM) por HPLC de exclusión por tamaño
La HPLC de exclusión por tamaño se realizó usando una columna COSMOSIL Diol-300-lI de 7,5 x 600 mm (Nacalai Tesque, Kioto, Japón) y detección de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 280 nm y una longitud de onda de emisión de 340 nm. La composición de la fase móvil fue NaCI 300 mM, HEPES 20 mM, CaCh * 2 H2O 10 mM, Tween® 80 al 0,005 %, isopropanol al 10 %, pH 7,0. La elución fue isocrática a un caudal de 0,5 ml/min a temperatura ambiente durante 75 minutos.
Ejemplo 1:
Preparación de formulaciones de FVlll y evaluación de las propiedades de la solución después de intercambio de tampón a través de columnas de desalación
Se formuló CSL627 purificado a una actividad de FVlll:C (procedimiento de sustrato cromógeno) de 9500 Ul/ml en las composiciones deseadas mediante intercambio de tampón a través de columnas de desalación NAP-25 (GE Healthcare Sephadex™ G 25; cat. n.° 17-0852-01) según las instrucciones del proveedor. Este intercambio de tampón dio como resultado un factor de dilución de 1,4.
Las diferentes composiciones se investigaron después con respecto a su apariencia (turbidez) y rendimiento en actividad de FVlll:C.
El rendimiento de FVlll:C se calculó como el porcentaje de la cantidad de FVlll:C en la composición obtenida después del intercambio de tampón dividido por la cantidad de FVlll:C en la solución antes del intercambio de tampón con ajuste adecuado para dilución por el intercambio de tampón (factor de dilución 1,4).
Tabla 18.
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 2:
Preparación de formulaciones de FVIII y evaluación de las propiedades de la solución después de intercambio de tampón a través de columnas de desalación
Las diferentes composiciones se obtuvieron mediante intercambio de tampón como se ha descrito en el ejemplo 1 (la actividad de FVIII:C en el material de partida fue de 9733 UI/ml). Las composiciones se evaluaron con respecto a su apariencia después del intercambio de tampón. Además, después las composiciones se esterilizaron por filtrado (0,22 |jm) y se analizaron para determinar su actividad de FVIII:C directamente tras la filtración (tiempo 0) y después del almacenamiento a 2 - 8 °C durante 1, 2, 3, 15, 30 y 60 días y almacenamiento a 25 °C y 40 °C durante 1,2 y 3 días.
La recuperación (estabilidad) se calculó como el porcentaje de FVIII:C (ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno) después del almacenamiento dividido por la actividad de FVIII:C en el tiempo 0. La actividad de FVIII:C en el tiempo 0 (después de una filtración de 0,22 jm ) se definió como 100 %.
Figure imgf000042_0001
Tabla 20
Figure imgf000043_0001
Tabla 21
Figure imgf000043_0002
Ejemplo 3:
Aspecto de la solución después del intercambio de tampón a través de columnas de desalación
Las diferentes composiciones se obtuvieron mediante intercambio de tampón como se describe en el ejemplo 1 (la actividad de FVIII:C por ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno en el material de partida fue de 8317 UI/ml). Las composiciones se evaluaron con respecto a su apariencia después del intercambio de tampón.
Tabla 22
Figure imgf000043_0003
continuación
Figure imgf000044_0001
Ejemplo 4:
Rendimiento en la actividad de FVIII:C y aspecto de la solución después del intercambio de tampón a través de columnas de desalación y recuperación de la actividad de FVIII:C tras el almacenamiento.
Las diferentes composiciones se obtuvieron mediante intercambio de tampón como se ha descrito en el ejemplo 1 (la actividad de FVIII:C en el material de partida fue de 4780 UI/ml).
Las composiciones se evaluaron con respecto a su apariencia después del intercambio de tampón. Además, las composiciones se esterilizaron por filtrado (0,22 pm) y se analizaron para determinar su actividad de FVIII:C (ensayo de sustrato cromógeno) directamente tras la filtración (tiempo 0) y después del almacenamiento a 2 - 8 °C durante 1, 2 y 3 días y almacenamiento a 25 °C y 40 °C durante 3 días.
El rendimiento del procedimiento de formulación en la actividad de FVIII:C se calculó como el porcentaje de FVIII:C en la composición obtenida después del intercambio de tampón dividido por el FVIII:C en la solución antes del intercambio de tampón con el ajuste adecuado para las diluciones. La recuperación (estabilidad) tras almacenamiento se calculó como el porcentaje de FVIII:C después de almacenamiento dividido por la actividad de FVIII:C en el tiempo 0. La actividad de FVIII:C en el tiempo 0 (después de una filtración de 0,22 pm) se definió como 100 %.
Figure imgf000045_0001
Ejemplo 5:
Formación de CAPM (SE-HPLC) en preparaciones liofilizadas tras almacenamiento a temperatura elevada.
La actividad de FVIII:C y la concentración de los excipientes de las formulaciones de este ejemplo se ajustaron diluyendo un concentrado de FVIII con soluciones tamponantes adecuadas. Las formulaciones obtenidas mostraron concentraciones de FVIII:C de 430 - 480 UI/ml. Después las soluciones se distribuyeron (2,5 ml) y se liofilizaron. Los liofilizados obtenidos se almacenaron a 40 °C y se tomaron muestras después de 1, 3, 6 y 12 meses. Se tomaron muestras de las soluciones reconstituidas antes y después del almacenamiento de los liofilizados y se congelaron a -70 °C. Los CAPM se determinaron mediante SE-HPLC en las muestras después de descongelar en un baño de agua (+37 °C).
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 6 :
Ensayo de actividad de sustrato cromógeno FVIII:C y formación de CAPM (SE-HPLC) en preparaciones liofilizadas tras almacenamiento a temperatura elevada
La actividad de FVIII:C y la concentración de los excipientes se ajustaron diluyendo un concentrado de FVIII con soluciones tamponantes adecuadas. Después las soluciones se distribuyeron (2,5 ml) y se liofilizaron. Los liofilizados obtenidos se almacenaron a 40 °C y se tomaron muestras después de 1, 3, 6, 12, 18 y 24 meses. Se tomaron muestras de las soluciones reconstituidas antes y después del almacenamiento de los liofilizados y se congelaron a -70 °C. Los CAPM se determinaron en las muestras almacenadas congeladas después de descongelar en un baño de agua (+37 °C).
La actividad de FVIII:C (ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno) se determinó en las soluciones nuevas antes de la liofilización y en los liofilizados recién reconstituidos directamente después de la liofilización o después de almacenamiento. La recuperación (estabilidad) se calculó como el porcentaje de FVIII:C después de almacenamiento dividido por la actividad de FVIII:C en el tiempo 0. La actividad de FVIII: C en el tiempo 0 (después de liofilización) se definió como 100 %.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 7:
Preparación de formulaciones de FVIII y evaluación de las propiedades de la solución después de intercambio de tampón a través de columnas de desalación.
El CSL627 purificado se formuló en las composiciones deseadas mediante intercambio de tampón a través de columnas de desalación NAP-25 (GE Healthcare Sephadex™ G 25; cat. n.° 17-0852-01) según las instrucciones del proveedor y como se ha descrito en el ejemplo 1. Posteriormente, las diferentes composiciones se diluyeron en función del ensayo de actividad cromógena para obtener una actividad (potencia) de FVIII:C usando un ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno de aproximadamente 7000 Ul/ml. Las diferentes composiciones se investigaron después con respecto a su apariencia (turbidez).
Tabla 27
Figure imgf000051_0001
Los resultados se muestran gráficamente en la figura 1. Los puntos representan una turbidez por encima de un nivel umbral de 18 UTN, los rombos representan una solución transparente (turbidez menor o igual a 18 UTN).
Ejemplo 8
Formación de CAPM (SE-HPLC) en preparaciones liofilizadas tras almacenamiento a temperatura elevada
La actividad de FVIII:C y la concentración de los excipientes de las formulaciones de este ejemplo se ajustaron diluyendo un concentrado de FVIII (CSL627) con soluciones tamponantes adecuadas. Las formulaciones obtenidas mostraron concentraciones de FVIII:C de aproximadamente 390 - 435 UI/ml. Después las soluciones se distribuyeron (2,5 ml) y se liofilizaron. Los liofilizados obtenidos se almacenaron a 40 °C y se tomaron muestras después de 1, 3, 6, 9 y 12 meses. Se tomaron muestras de las soluciones reconstituidas antes y después del almacenamiento de los liofilizados y se congelaron a -70 °C. Los CAPM se determinaron mediante SE-HPLC en las muestras después de descongelar en un baño de agua (+37 °C).
Figure imgf000052_0001
Ejemplo 9
Ensayo de actividad de sustrato cromógeno FVIII:C y formación de CAPM (SE-HPLC) en preparaciones liofilizadas tras almacenamiento a temperatura elevada
La actividad de FVIII:C y la concentración de los excipientes se ajustaron diluyendo un concentrado de FVIII (CSL627) con soluciones tamponantes adecuadas. Después las soluciones se distribuyeron (2,5 ml) y se liofilizaron. Los liofilizados obtenidos se almacenaron a 40 °C y se tomaron muestras después de 1, 3, 6, 9 y 12 meses. Se tomaron muestras de las soluciones reconstituidas antes y después del almacenamiento de los liofilizados y se congelaron a -70 °C. Los CAPM se determinaron en las muestras almacenadas congeladas después de descongelar en un baño de agua (+37 °C).
La actividad de FVIII:C (ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno) se determinó en las soluciones nuevas antes de la liofilización y en los liofilizados recién reconstituidos directamente después de la liofilización o después de almacenamiento. La recuperación (estabilidad) se calculó como el porcentaje de FVIII:C después de almacenamiento dividido por la actividad de FVIII:C en el tiempo 0. La actividad de FVIII: C en el tiempo 0 (después de liofilización) se definió como 100 %.
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 10
Ensayo de actividad de sustrato cromógeno FVIII:C y formación de CAPM (SE-HPLC) en preparaciones liofilizadas tras almacenamiento a temperatura elevada.
La actividad de FVIII:C y la concentración de los excipientes se ajustaron diluyendo un concentrado de FVIII (CSL627) con soluciones tamponantes adecuadas. Después las soluciones se distribuyeron (2,5 ml) y se liofilizaron. Los liofilizados obtenidos se almacenaron a 40 °C y se tomaron muestras después de 3, 6 y 9 meses. Se tomaron muestras de las soluciones reconstituidas antes y después del almacenamiento de los liofilizados y se congelaron a -70 °C. Los CAPM se determinaron en las muestras almacenadas congeladas después de descongelar en un baño de agua (+37 °C).
La actividad de FVIII:C (ensayo de actividad de FVIII de sustrato cromógeno) se determinó en las soluciones nuevas antes de la liofilización y en los liofilizados recién reconstituidos directamente después de la liofilización o después de almacenamiento. La recuperación (estabilidad) se calculó como el porcentaje de FVIII:C después de almacenamiento dividido por la actividad de FVIII:C en el tiempo 0. La actividad de FVIII: C en el tiempo 0 (después de liofilización) se definió como 100 %.
Figure imgf000057_0001
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Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una composición acuosa del factor de coagulación VIII, que comprende:
a. una molécula de FVIII;
b. de 40 a 195 mM de una sal de sodio;
c. histidina;
d. al menos 1 mM de una sal de calcio; y
e. un tensioactivo;
en la que [His] > 180 mM - 20*[Ca2+], en la que [Ca2+] es la concentración de iones de calcio en la composición acuosa en milimoles por litro e [His] es la concentración de histidina en la composición acuosa en milimoles por litro, con la condición de que [His] > 0; y en la que la osmolaridad de la composición es 600 mOsmol/l o menor.
2. La composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que la concentración de la sal de sodio en la composición acuosa es de 45 a 95 mM.
3. La composición acuosa según las reivindicaciones 1 y 2, en la que [His] es de 5 a 200 mM.
4. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que [Ca2+] es de 5 a 100 mM.
5. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el pH de la composición acuosa es de 5 a 9.
6. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición, tras (i) liofilización, (ii) almacenamiento de la composición liofilizada a una temperatura de 25 °C y una humedad relativa de 40 % durante un periodo de 12 meses y (iii) posterior reconstitución de la composición liofilizada en agua destilada, muestra una recuperación de la actividad de FVIII:C de al menos 80 %, en relación con la misma composición tras (i) liofilización y, sin almacenamiento de la composición liofilizada, (ii) posterior reconstitución inmediata en agua destilada.
7. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición conserva al menos 80 % de su actividad de factor VIII durante al menos 48 horas, cuando se almacena en estado líquido a 4 °C.
8. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sal de calcio es cloruro de calcio.
9. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sal de sodio es cloruro de sodio.
10. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende además un hidrato de carbono.
11. La composición inmunógena según la reivindicación 10, en la que el hidrato de carbono es sacarosa.
12. La composición acuosa según la reivindicación 10 u 11, en la que la concentración del hidrato de carbono es de 1 a 20 % (p/p).
13. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración del tensioactivo es de 0,001 a 0,2 % (v/v).
14. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tensioactivo es un tensioactivo de origen no natural.
15. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende además al menos un aminoácido distinto de histidina.
16. La composición inmunógena según la reivindicación 15, en la que dicho al menos un aminoácido distinto de histidina es seleccionado del grupo que consiste en arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, lisina, metionina, fenilalanina, leucina, isoleucina y combinaciones de los mismos.
17. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende además al menos un antioxidante.
18. La composición inmunógena según la reivindicación 17, en la que dicho al menos un antioxidante es seleccionado del grupo que consiste en glutatión reducido, metionina, cisteína, sulfito de sodio, vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico, ascorbato de sodio y combinaciones de los mismos.
19. La composición acuosa según la reivindicación 17 o 18, en la que la concentración de dicho al menos un antioxidante es 0,05 - 100 mM.
20. La composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molécula de FVIII es una molécula de FVIII de origen no natural, preferentemente una molécula de FVIII producida de manera recombinante, p. ej., (i) una molécula de FVIII con supresión o truncamiento de dominio B, (ii) una molécula de FVIII de dos cadenas producida de manera recombinante o (iii) una molécula de FVIII de cadena sencilla.
21. Una composición que puede obtenerse liofilizando la composición acuosa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
22. Una composición acuosa del factor de coagulación VIII, que puede obtenerse reconstituyendo la composición liofilizada según la reivindicación 21 con una solución acuosa.
23. Un procedimiento para estabilizar una molécula de FVIII, que comprende mezclar los componentes definidos en la reivindicación 1 para obtener una composición acuosa y liofilizar la composición acuosa.
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