ES2709048T3 - Anticuerpos y vacunas para su uso en métodos terapéuticos y diagnósticos para trastornos relacionados con alfasinucleína - Google Patents

Anticuerpos y vacunas para su uso en métodos terapéuticos y diagnósticos para trastornos relacionados con alfasinucleína Download PDF

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Abstract

Un medicamento para su uso en el tratamiento de y/o para retrasar la aparición de un trastorno relacionado con α- sinucleína en un individuo, en donde el trastorno relacionado con α-sinucleína se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, atrofia sistémica múltiple (ASM), otras enfermedades con patología de cuerpos de Lewy, síndrome de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad priónica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad, síndromes psiquiátricos, esquizofrenia y enfermedades tipo esquizofrenia, comprendiendo el medicamento un anticuerpo producido a partir de un oligómero de α-sinucleína soluble estabilizado, y capaz de unirse a un oligómero de α- sinucleína soluble estabilizado, teniendo el oligómero de α-sinucleína soluble estabilizado una tasa de formación a una forma agregada no soluble inferior que un oligómero soluble no estabilizado de la α-sinucleína, en donde el oligómero de α-sinucleína comprende α-sinucleína de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligómero de α-sinucleína soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o uniéndose a un agente estabilizante.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos y vacunas para su uso en metodos terapeuticos y diagnosticos para trastornos relacionados con alfasinuclema
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos y su uso en los metodos terapeuticos y diagnosticos para trastornos relacionados con a-sinuclema, es decir, a -sinucleinopatfas en donde la acumulacion de a-sinuclema insoluble agregada en la forma de cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy esta presente en el cerebro. T ales trastornos incluyen, pero no se limitan a, trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, atrofia sistemica multiple y otros trastornos neurodegenerativos con patologfa de a-sinuclema.
Mas espedficamente, la invencion se refiere a anticuerpos que se unen a a-sinuclema soluble estabilizada. Los oligomeros de a-sinuclema solubles estabilizados tienen una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero no estabilizado de la a -sinuclema. El oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado puede estar en forma de, por ejemplo, un oligomero mayor, referido como protofibrilla.
La invencion tambien esta dirigida a metodos in vitro de deteccion de a-sinuclema, y a metodos para retrasar una aparicion de, tratamiento, o prevencion de un trastorno relacionado con a-sinuclema tal como, pero no limitado a, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, y atrofia sistemica multiple.
Antecedentes de la invencion
La enfermedad de Parkinson (EP) y la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) son los dos ejemplos mas dominantes de los trastornos neurodegenerativos con patologfa cerebral de a-sinuclema.
La EP es el trastorno de movimiento mas comun y se caracteriza por rigidez, hipoquinesia, temblor e inestabilidad postural. Se cree que EP afecta a aproximadamente cuatro a seis millones de personas en todo el mundo.
DCL representa el 5 a 15 % de toda la demencia. Ademas de los olvidos y otros smtomas de demencia que con frecuencia fluctuan, los pacientes con DCL generalmente sufren de cafdas recurrentes y alucinaciones visuales.
La acumulacion intraneuronal de a-sinuclema da como resultado o bien la formacion de cuerpos de Lewy, inclusiones de hialina eosinofilas largas de alrededor de 10 a 20 pm, o neuritas de Lewy, axones y dendritas distroficas tipo hilo alargadas. En el cerebro con EP, la deposicion de los cuerpos de Lewy y las neuritas de Lewy se limita a las neuronas que conectan el estriato con la sustancia negra. Estas celulas son cruciales para la ejecucion del movimiento y las funciones posturales, explicando la naturaleza de los smtomas de EP. En el cerebro con DCL, se encuentran deposiciones extendidas de cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy tanto en areas del mesencefalo como corticales.
La alfa-sinuclema es una protema que principalmente se encuentra intraneuronalmente. Dentro de la neurona, la asinuclema esta de manera predominante localizada presinapticamente y por lo tanto se ha especulado que juega un papel en la regulacion de la actividad sinaptica. Se han identificado tres isoformas principales de a -sinuclema, de las cuales la forma mas larga y la mas comun comprende 140 aminoacidos.
Ademas de a-sinuclema, los cuerpos de Lewy consisten en un amplio rango de moleculas, una de las cuales es el 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), un hidroxialquenal a ,p-insaturado (Qin y col., 2007). Se ha demostrado in vitro que HNE puede modificar a-sinuclema y de ese modo facilitar la oligomerizacion de a -sinuclema. En particular, se ha demostrado que HNE incrementa y estabiliza la formacion de protofibrillas, es decir, formas oligomericas mas largas solubles de a -sinuclema (Qin y col., 2007). Igualmente, se ha demostrado tambien que el alquenal a ,p-insaturado 4-oxo-2-nonenal (ONE) modifica la a-sinuclema y de ese modo induce la oligomerizacion de la a-sinuclema (Nasstrom y col., 2009). Trostchansky y col., Biochem. J. 393:343-349, 2006, incubaron a-sinuclema con el 4-HNE y concluyeron que la asociacion de a-sinuclema con membranas biologicas protege la protema de la oxidacion y la nitracion y por tanto disminuye la formacion de moleculas proteicas capaces de formar agregados. Trostchansky y col. tambien concluyeron que los productos de peroxidacion de lfpido tambien pueden modificar la a-sinuclema, generando nuevos aductos proteicos que podnan servir como biomarcadores para documentar los procesos oxidativos en seres humanos asf como modelos animales y celulares de la agregacion y patologfa de a-sinuclema. Tambien se ha demostrado in vitro que los agentes de nitracion pueden facilitar la oligomerizacion de a -sinuclema induciendo el entrecruzamiento de la ditirosina, lo cual puede tener relevancia in vivo (Souza y col., J. Biol. Chem. 275(4):18.344-18.349, 2000).
HNE reacciona y modifica las cadenas laterales de la cistema, histidina y lisina, mientras que ONE reacciona y modifica las cadenas laterales de la cistema, histidina, lisina y arginina. Tanto HNE como ONE alteran sustancialmente la estructura y las propiedades ffsicas de estas cadenas laterales. Por lo tanto, HNE y ONE pueden reaccionar o bien con el carbono C-3 o con el grupo aldehfdo o por combinaciones de los mismos. Por lo tanto, HNE puede modificar covalentemente las protemas, o bien inter- o intramolecularmente.
El estres oxidativo ha estado implicado en un numero de trastornos neurodegenerativos caracterizados por la acumulacion patologica de a-sinuclema mal plegada. Diversas especies de oxfgeno reactivo pueden inducir la peroxidacion de lfpidos tales como membranas celular o lipoprotemas y tambien dan como resultado la generacion de aldetndos altamente reactivos a partir de acidos grasos poliinsaturados (Yoritaka y col., 1996).
La patologfa cerebral indicativa de la enfermedad de Alzheimer (EA), es decir, placas amiloides y ovillos neurofibrilares, se ven en aproximadamente el 50 % de los casos con DCL. No esta claro si la existencia de patologfas paralelas implica dos enfermedades diferentes o representa una variante de cada respectivo trastorno. Algunos de los casos con tal copatologfa se describen como que tienen una variante de cuerpo de Lewy de la EA (Hansen y col., 1990).
Formas heredadas de manera dominante raras de EP y DCL pueden estar causadas por mutaciones puntuales o duplicaciones del gen a-sinuclefna. Se ha descrito que las mutaciones patogenicas A30P y A53T (Kruger y col., 1998) (Polymeropoulos y col., 1998) y la duplicacion del gen (Chartier-Harlin y col., 2004) causan EP hereditario, mientras que se ha informado que otra mutacion mas de a-sinuclefna, E46K (Zarranz y col., 2004) asf como la triplicacion del gen a-sinuclefna (Singleton y col., 2003) causan o bien EP o DCL.
Las consecuencias patogenas de las mutaciones de a-sinuclefna solamente se entienden de manera parcial. Sin embargo, los datos in vitro han demostrado que las mutaciones A30P y A53T incrementan la tasa de agregacion (Conway y col., 2000). Un amplio rango de especies de a-sinuclema diferentemente compuestas se forman en el proceso de agregacion, todas las cuales pueden tener diferentes propiedades toxicas. Aparte de los cambios neuropatologicos en las a-sinucleinopatias, los niveles de la protema a-sinuclema en general se incrementan en las regiones cerebrales afectadas (Klucken y col., 2006).
Hay una necesidad de herramientas y metodos diagnosticos mejorados para identificar un riesgo de y/o fases tempranas de una enfermedad neurodegenerativa con patologfa de a-sinuclema. Actualmente, no hay un metodo bioqmmico para ayudar a un diagnostico medico de un paciente antes de que sea evidente una fase de enfermedad sintomatica mas avanzada, cuando el dano importante al cerebro ya ha ocurrido. La importancia de pruebas diagnosticas precisas llegara a ser incluso mayor a medida que surjan nuevas posibilidades terapeuticas de fase temprana. Actualmente, solamente el tratamiento sintomatico (por ejemplo, sustituyendo la perdida de dopamina activa en el cerebro) esta disponible para pacientes con EP. Para DCL, estan disponibles incluso menos opciones terapeuticas. Sin embargo, los medicos frecuentemente estan evaluando posibles efectos beneficiosos sobre los pacientes con DCL con el tratamiento estandar para EA, es decir, inhibidores de colinesterasas, pero comunmente no se puede ver mejora sustancial. Ninguna de las estrategias de tratamiento existentes para las a-sinucleinopatias estan dirigidas a los respectivos procesos subyacentes de la enfermedad. Ademas, tambien hay una necesidad de hacer un seguimiento del progreso de la enfermedad y de los efectos del tratamiento. Los documentos WO 2004/041067 y WO 2006/020581 ensenan el uso de la vacunacion con a -sinuclema o un fragmento de la misma, o inmunizacion pasiva usando un anticuerpo para a-sinuclema, en el tratamiento de trastornos con patologfa cerebral de a-sinuclema. Los documentos WO 2004/041067 y WO 2006/020581 tambien ensenan que los trastornos con patologfa cerebral de asinuclema alternativamente se pueden tratar por vacunacion con amiloide-p o un fragmento del mismo, o inmunizacion pasiva usando un anticuerpo para amiloide-p. El documento WO 2005/047860 proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a a-sinuclema, y se puede usar en la deteccion de a-sinuclema en una muestra, por ejemplo, por ELISA. El documento WO 00/02053 ensena el uso de anticuerpos que se unen a a-sinuclema en el diagnostico de enfermedades con patologfa cerebral de a-sinuclema usando los anticuerpos para detectar la presencia de asinuclema en el fluido cerebroespinal. Sin embargo, como se describe mas adelante, los anticuerpos producidos a partir de a-sinuclema estabilizada son particularmente ventajosos para el tratamiento de trastornos con patologfa cerebral de a-sinuclema y no se han descrito previamente.
Sumario de la invencion
Por consiguiente, es un objetivo de la presente invencion proporcionar anticuerpos para su uso en los metodos terapeuticos y/o diagnosticos para los trastornos relacionados con a-sinuclema, es decir, a-sinucleinopatfas en donde la acumulacion de a-sinuclema insoluble agregada en forma de cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy esta presente en el cerebro. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, uno o mas trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, atrofia sistemica multiple y otros trastornos neurodegenerativos con patologfa de asinuclema.
En una realizacion, la invencion esta dirigida a un medicamento para su uso en el tratamiento de y/o para retrasar la aparicion de un trastorno relacionado con a -sinuclema en un individuo, en donde el trastorno relacionado con asinuclema se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, atrofia sistemica multiple (ASM), otras enfermedades con patologfa de cuerpos de Lewy, smdrome de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y enfermedades tipo esquizofrenia, comprendiendo el medicamento un anticuerpo producido a partir de un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, y capaz de unirse a un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a-sinuclema, en donde el oligomero de a-sinuclema comprende a-sinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o uniendose a un agente estabilizante.
En otra realizacion, la invencion esta dirigida a un anticuerpo capaz de unirse a un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de a -sinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a-sinuclema, en donde el anticuerpo se produce a partir del oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado comprende a-sinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de asinuclema soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o por un agente estabilizante.
En otra realizacion, la invencion esta dirigida a un metodo de produccion de un anticuerpo para retrasar una aparicion de o para el tratamiento de un trastorno relacionado con a-sinuclema en un individuo, en donde el trastorno relacionado con a-sinuclema se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, atrofia sistemica multiple (ASM), otras enfermedades con patologfa de cuerpos de Lewy, smdrome de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y enfermedades tipo esquizofrenia, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un oligomero de a -sinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de a -sinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a -sinuclema. El metodo comprende administrar un antfgeno a un animal no humano; y recoger el anticuerpo formado frente al antfgeno, comprendiendo el antfgeno un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado que tiene una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero no estabilizado de la a-sinuclema, en donde el oligomero de a-sinuclema comprende asinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o uniendose a un agente estabilizante.
El anticuerpo de la invencion se puede proporcionar en forma de una composicion de anticuerpo, que comprende un anticuerpo segun la invencion y uno o mas excipientes seleccionados del grupo que consiste en agentes antibacterianos, adyuvantes, tampones, sales, reguladores del pH, detergentes, y cualquier combinacion de los mismos, que son farmaceuticamente aceptables para seres humanos y/o uso veterinario.
Los anticuerpos de la invencion se pueden usar en los metodos de deteccion. En una realizacion, la invencion proporciona un metodo de deteccion de a-sinuclema in vitro, que comprende anadir un anticuerpo segun la invencion a una muestra biologica que comprende o se sospecha que comprende a-sinuclema soluble; y detectar y medir una concentracion de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y la a-sinuclema soluble. Los oligomeros de asinuclema se pueden detectar in vivo administrando a un individuo sospechoso de portar a-sinuclema soluble un anticuerpo segun la invencion, estando el anticuerpo marcado con un marcador detectable; y detectando la presencia de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y la a-sinuclema soluble mediante deteccion del marcador.
Los anticuerpos y los metodos de la invencion son ventajosos para tecnicas diagnosticas y terapeuticas dirigidas a trastornos relacionados con a -sinuclema. Realizaciones y aspectos adicionales de la invencion se exponen en la “Descripcion detallada”, y a partir de los mismos estaran claras las ventajas adicionales de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La presente invencion se describe ademas con referencia a los dibujos, en los que:
La Figura 1 muestra una comparacion de las tasas de agregacion de las formas tipo silvestre y mutadas de asinuclema medidas por un ensayo de ThT (Tioflavina T), como se describe en el Ejemplo 1. La Tioflavina T es un reactivo que se une a formas agregadas de a -sinuclema, es decir, a estructuras de p-lamina. Las diferentes especies de a-sinuclema describen la siguiente tendencia de agregacion: E46K>A30P/A53T>A53T>wt (tipo silvestre)>A30P. Las especies de a-sinuclema de agregacion mas rapida es por tanto EK, mientras que el mutante A30P presenta una tasa de agregacion incluso mas lenta que para la a-sinuclema tipo silvestre.
La Figura 2A muestra una supervivencia disminuida entre celulas de rinon embrionario humano (HEK-293) que se han tratado con preparaciones de a -sinuclema E46K incubadas durante 24 y 41 horas. La preparacion de asinuclema E46K incubada durante aproximadamente 24 horas mostro la mayor toxicidad. Cuando se anadio asinuclema no incubada (tiempo cero) a celulas HEK293, no se observo efecto toxico. La Figura 2B muestra que la preparacion de a-sinuclema E46K presentaba senales de ThT moderadas despues de 24 horas de incubacion, es decir, el grado de formacion de fibrillas es moderada. Por el contrario, las muestras incubadas durante 41 horas que conteman formas fibrilares de a -sinuclema y que presentaban una alta senal de ThT, casi no mostraron efecto toxico.
La Figura 3 muestra una supervivencia disminuida entre celulas de rinon embrionario humano (HEK-293) que se han tratado con protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema wt estabilizados con ONE y HNE que se anadieron exogenamente a las celulas y se incubaron durante 48 h. Como porcentaje de controles, se detecto un descenso significativo en la supervivencia celular para celulas tratadas con a -sinuclema modificada con ONE 3 pM (p<0,001) y celulas tratadas con a-sinuclema modificada con HNE 3 pM (p<0,0001). Los datos se expresan como porcentaje del vehmulo control y representan el valor medio ± EEM para tres experimentos separados.
La Figura 4 muestra un cromatograma de SEC-HPLC de una preparacion de a-sinuclema modificada con HNE incubada a 37 °C durante 20 horas usando una estequiometna entre HNE y a-sinuclema de 30:1. El pico principal, eluyendo a 19 min (P/O), corresponde a protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema solubles. El segundo pico, eluyendo a 37 min (M), corresponde a a-sinuclema monomerica.
La Figura 5 muestra un cromatograma de SEC-HPLC de a-sinuclema tipo silvestre modificada con ONE incubada a 37 °C durante 20 horas usando una estequiometna entre ONE y a-sinuclema de 30:1. Se observa un pico principal (P/O) a 19 min y corresponde a protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema solubles. Se observa un pico adicional, eluyendo a 37 min (M) y que corresponde a monomeros de a-sinuclema.
La Figura 6 muestra una imagen por microscopia de fuerza atomica (AFM) de protofibrilla/oligomero de asinuclema soluble aislado modificado con HNE. Por ejemplo, se observan protofibrillas/oligomeros que presentan una estructura tipo anillo que tiene un centro hueco y un diametro de aproximadamente 50 a 300 nm. La barra de escala representa 100 nm.
La Figura 7 muestra un analisis por AFM de protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema solubles aislados modificados con ONE. En una muestra tfpica, se observan protofibrillas/oligomeros con una apariencia amorfa y un diametro de aproximadamente 30 a 150 nm. La barra de escala representa 100 nm.
La Figura 8 muestra un ELISA sobre el suero (dilucion 1/10.000-1/270.000) de un raton inmunizado con una preparacion de protofibrilla/oligomero soluble de a-sinuclema humana tipo silvestre modificada con HNE. Los anticuerpos que reconocen las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema modificada con HNE se detectan en el suero.
La Figura 9 muestra un ELISA indirecto sobre suero (dilucion 1/10.000-1/300.000) de un raton inmunizado con protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema humana tipo silvestre modificada con ONE solubles. Los anticuerpos que reconocen las protofibrillas/oligomeros de a -sinuclema se detectan en el suero.
La Figura 10 muestra un ELISA de un anticuerpo monoclonal reactivo a protofibrilla de a-sinuclema. Se obtuvo una senal positiva con todas las tres diluciones (1/9, 1/27 y 1/82) del medio celular de hibridoma 40:2 cuando las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema tipo silvestre modificada con ONE se usaron como antfgeno. La senal fondo se ha deducido a partir de los valores de DO.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos (inmunizacion pasiva) para su uso en diversos metodos para diagnosticar y combatir (incluyendo retrasar la aparicion de, tratamiento de y/o prevencion de) trastornos relacionados con a-sinuclema tales como uno o mas de la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, atrofia sistemica multiple (ASM) y otros trastornos neurodegenerativos con patologfa de a -sinuclema. Ademas, se pueden usar los anticuerpos en el retraso de la aparicion de, tratamiento y/o prevencion de otros trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y/o trastornos tipo esquizofrenia. Los anticuerpos tambien se pueden usar en metodos de deteccion para, entre otros, fines diagnosticos, de seguimiento o terapia.
La patologfa principal en a-sinucleinopatfas es intracelular, lo cual representa un reto al planteamiento terapeutico inmune. Sin embargo, es probable que una fraccion de anticuerpos activamente inducidos o pasivamente administrados se puedan unir a sus antfgenos diana tambien intraneuronalmente. Ademas, la identificacion de asinuclema en tanto plasma como fluido cerebroespinal (El-Agnaf y col., 2006) ilustra que la protema no se encuentra exclusivamente dentro de las neuronas. Sin estar unido a teona alguna, reducir a-sinuclema extracelular puede mover el equilibrio entre los grupos proteicos intracelulares y extracelulares y da como resultado tambien a-sinuclema intracelular disminuida. La evidencia sugiere que la a-sinuclema en solucion pueda penetrar las bicapas lipfdicas en las membranas celulares y de ese modo llegar a estar internalizada o exportada fuera de la celula. Finalmente, no se puede descartar que la a-sinuclema tambien pueda ejercer efectos toxicos en el espacio extracelular.
La presente invencion se basa en el uso de oligomeros solubles estabilizados de a-sinuclema. El peso molecular de los monomeros de a-sinuclema humana es de 14 kDa. Dos o mas monomeros de a-sinuclema pueden agregarse y formar protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema solubles con un amplio intervalo de pesos moleculares. Un oligomero dominante tiene un peso molecular alrededor de 2.000 kD y se refiere como protofibrilla. Sin embargo estas formas de a-sinuclema solubles son inestables y se polimerizan espontaneamente a fibrillas insolubles. La presente invencion estabiliza formas oligomericas solubles de a-sinuclema y afsla los oligomeros solubles estabilizados, preferiblemente en forma altamente purificada, para el desarrollo el anticuerpo. Los oligomeros de a-sinuclema solubles estabilizados segun la presente invencion presentan una tasa de formacion a una forma agregada no soluble, es decir, fibrillas, inferior que un oligomero no estabilizado de la a-sinuclema. Estas formas son de particular interes puesto que presentan una alta toxicidad.
La invencion usa diversas formas de a-sinuclema. Los oligomeros de a-sinuclema usados en la invencion comprenden o bien a-sinuclema humana sintetica o de tipo silvestre (SEQ ID NO:1), o su(s) forma(s) mutada(s) cuyas secuencias se exponen en las SEQ ID NO:2 a 8. Estas formas mutadas de a-sinuclema humana tienen las respectivas mutaciones A30P (SEQ ID NO:2), E46K (SEQ ID NO:3), A53T (SEQ ID NO:4), A30P/E46K (SEQ ID NO:5), A30P/A53T (SEQ ID NO:6), E46K /A53T (SEQ ID NO:7) y A30P/ E46K /A53T (SEQ ID NO:8).
SEQ ID NO:1
MDVFMKGLSK AKEGW AAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEG W H GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:2
MDVFMKGLSK AK EGW AAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:3
MDVFMKGLSK A K E G W A A A E KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKKGVVII GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:4
MDVFMKGLSK A K E G W A A A E K'TKQGVAIiAA GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH
GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA A TGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:5
MDVFMKGLSK AK EGW AAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:6
MDVFMKGLSK AK EGW AAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKEGVVII GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NOT MDVFMKGLSK AKEGW AAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA SEQ ID NO:8
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQE GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
Ademas, se pueden utilizar otras formas de a-sinuclema, con secuencias que se desvfan de la secuencia tipo silvestre. Por ejemplo, una a-sinuclema tipo silvestre se puede modificar reemplazando Ser/Ala con Cys, por ejemplo, por mutagenesis dirigida a sitio. Un ejemplo de tales es expuesto por Chang, documento US 2006/0018918 A1.
Ademas, los fragmentos, del terminal N, parte media y/o terminal C de la protema a-sinuclema, se pueden usar para producir tambien los oligomeros de a-sinuclema estabilizados. Ademas, los fragmentos de a-sinuclema tipo silvestre o mutante, con una longitud de 1-10, 1-25, 1-35, 1-45, 1-79 o 1-95 aminoacidos se pueden usar en cualquier combinacion para producir los oligomeros. Tales peptidos pueden corresponder, pero no se limitan, a la siguiente secuencia de numero de aminoacidos 1-95, 61-140, 95-140, 95-130, 95-120, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130 y 130-140. Los fragmentos tambien se pueden combinar con a-sinuclema de longitud completa. Los fragmentos tambien se pueden ramificar o hacer circulares antes de producir los oligomeros.
Ademas de usar protema recombinante o peptidos sinteticos, la a-sinuclema puede ser derivada directamente de cuerpos de Lewy presentes en el tejido cerebral humano de autopsia post mortem de casos con a-sinucleinopatfas. Se purifican tanto fracciones de a-sinuclema solubles (es decir, preparaciones solubles en solucion salina tamponada con T ris) e insolubles (es decir, preparaciones insolubles en solucion salina tamponada con T ris). Estas preparaciones muestras o bien se inyectan tal cual en ratones, o se separan en fracciones por metodos cromatograficos antes de la inyeccion. Los anticuerpos generados se usan para el tratamiento de pacientes en un esquema de vacunacion pasiva o en inmunoensayos diagnosticos como se describen a mas detalle en el presente documento.
Alternativamente, la a-sinuclema se puede aislar mediante la combinacion de inmunohistoqmmica y microscopfa de captura por laser por las cuales los cuerpos de Lewy se visualizan y se dirigen. Por ejemplo, las neuronas que contienen cuerpo de Lewy se adquieren de tejido cerebral post mortem que contiene a-sinuclema mediante el uso combinado de microscopfa de captura por laser y sistemas de gel no desnaturalizantes. Para esta aplicacion, las especies de a-sinuclema se extraen del gel de poliacrilamida (vease Ejemplo 3). Mas esped ficamente, usando metodos cromatograficos y sistemas de gel no desnaturalizantes, la a-sinuclema se purifica del material de tejido capturado y se usa como preparaciones antigenicas que se inyectan en ratones para la produccion de anticuerpos monoclonales. Con este planteamiento, se obtiene una respuesta inmunogenica muy diversa en los ratones, generando anticuerpos con muchas diferentes afinidades y especificidades a antfgeno. A pesar de la respuesta diversa cuando se usa el ultimo metodo, este planteamiento puede ser ventajoso cuando se dirige una conformacion de oligomero de a -sinuclema que existe en el cerebro de pacientes con Parkinson (cuerpos de Lewy), el cual no sena tan probable de dirigir con anticuerpos dirigidos frente a a-sinuclema sintetica. Estos ratones se pueden usar para obtener anticuerpos monoclonales esped ficos a a-sinuclema oligomerica.
Ademas, la a-sinuclema a usar para la inmunizacion de ratones y el desarrollo de anticuerpo monoclonal tambien se puede aislar de tejidos biologicos o fluidos tales como sangre, el fluido cerebroespinal, la orina o la saliva de individuos sanos o pacientes con a-sinucleinopatfas.
La estabilizacion de a-sinuclema en forma oligomerica soluble se consigue por modificacion estructural, o bien por entrecruzamiento del oligomero de a-sinuclema con un agente de entrecruzamiento proteico o uniendo el oligomero de a -sinuclema a un agente estabilizante. El agente estabilizante estabiliza la forma oligomerica soluble de modo que se previene la agregacion adicional a la conformacion de fibrilla no soluble. En una realizacion esped fica, el oligomero soluble es una protofibrilla, y en una realizacion mas esped fica, la protofibrilla tiene un peso molecular de aproximadamente 2.000 kD o mas.
En una realizacion esped fica, el agente estabilizante es un agente organico hidrofobo. En diversas realizaciones, el agente organico hidrofobo comprende un acido graso saturado, insaturado, o poliinsaturado, o sus derivados, o cualquier combinacion de los mismos, es decir, una combinacion de dos cualquiera o mas de los mismos. En realizaciones adicionales, el agente organico hidrofobo comprende un aldehfdo reactivo. El aldehfdo puede ser, por ejemplo, un alquenal, tal como un aldetndo a ,p-insaturado. Los aldetndos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 4-hidroxi-2-nonenal, 4-oxo-2-nonenal (ONE), malondialdetndo y acrolema. El aldetndo tambien puede ser un dialdehndo que tiene una cadena de carbono mono o poliinsaturada de 2 a 25 atomos de carbono que conectan los grupos aldetndo. El agente organico hidrofobo estabiliza la conformacion de oligomero soluble, de modo que se previene la agregacion adicional a la conformacion de fibrilla no soluble.
En una realizacion adicional, la a-sinuclema se puede modificar por detergentes hidrofobos tales como, pero no se limitan a, detergentes no ionicos y zwitterionicos. Ejemplos de tales detergentes incluyen, pero no se limitan a, detergentes no ionicos tales como Triton X-100 (polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenileter), Tween-20 (monolaurato de sorbitan polioxietilenado (20)), Tween-80 (monooleato de sorbitan polioxietilenado (20)), y detergentes Brij (eteres de polioxietileno de alcoholes grasos), y detergentes zwitterionicos tales como CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato).
Otros agentes estabilizantes adecuados incluyen derivados de acidos biliares, ejemplos de los cuales incluyen pero no se limitan a, colato, deoxicolato y taurocolato, y cualquier combinacion de los mismos.
El agente estabilizante tambien se puede seleccionar del grupo de moleculas biologicas naturales, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a, trigliceridos, fosfolfpidos, esfingolfpidos, gangliosidos, colesterol, esteres de colesterol, alcoholes de cadena larga (por ejemplo, que contienen aproximadamente 6 a 30 atomos de carbono), y cualquier combinacion de los anteriores agentes.
La estabilizacion tambien se puede conseguir usando agentes de entrecruzamiento proteico tales como, pero no se limitan a, tartrato de disuccinimidilo, suberimidato de bis-sulfosuccinimidilo, propionato de 3,3-ditiobissulfosuccinimidilo, y cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion, el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado comprende 1-alfa-hidroxi-secosterol como agente estabilizante.
Los agentes estabilizantes se pueden unir a, incluyendo por entrecruzamiento, monomeros y/u oligomeros de asinuclema, o combinaciones de los mismos, para formar los oligomeros solubles estabilizados. Por ejemplo, un aldetndo reactivo tal como HNE y/o ONE, puede unirse a los oligomeros por medio del grupo de aldetndo o un enlace doble, o ambos. Lo ultimo entonces da como resultado entrecruzamiento de los oligomeros. HNE, por ejemplo, puede unirse covalentemente a histidinas y lisinas de los oligomeros. Igualmente, ONE se puede unir covalentemente a histidinas y lisinas. Los aldehndos se pueden unir a lisina por una base Shiff, o una histidina se puede unir por un ataque nucleofflico sobre el atomo de carbono de un enlace doble en una cadena de carbono insaturada. La estequiometna entre el agente estabilizante, por ejemplo, un aldetndo reactivo, tal como HNE y ONE, y la a-sinuclema se puede variar dentro de un intervalo amplio de 2:1 a 50:1 o mayor. En una realizacion espedfica, los valores de modificacion de HNE por encima de 20:1, por ejemplo, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, e incluso mayores, proporcionan un producto con deseablemente alta formacion de protofibrilla. Ademas, con ONE, se puede usar una relacion incluso menor, por ejemplo, de 5:1, por ejemplo, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, e incluso mayor.
Si no se indica lo contrario, todos los agentes estabilizantes anteriormente mencionados imparten su efecto estabilizante uniendose a a -sinuclema y se puede conducir la reaccion estabilizante, por ejemplo, por incubacion, como se ilustra en los ejemplos. Los agentes estabilizantes tambien se pueden usar en combinaciones de dos o mas como se desee.
En otra realizacion mas de la invencion, los oligomeros de a-sinuclema solubles estabilizados pueden incluir uno o mas de p-amiloide (Ap), tau o fosfo-tau. Estos oligomeros de a-sinuclema se pueden producir combinando oligomeros de a-sinuclema con oligomeros de p-amiloide (Ap), por ejemplo, protofibrillas, producidos a partir de Ap40 y/o Ap42. En otra realizacion mas de la invencion, estos oligomeros de a-sinuclema se pueden producir combinando oligomeros de a-sinuclema con protofibrillas de p-amiloide y tau y/o fosfo-tau en cualquier combinacion. En otra realizacion, estos oligomeros de a-sinuclema se producen combinando cualquier combinacion de los monomeros individuales de asinuclema, Ap40, Ap42, tau y/o fosfo-tau, combinando estas protemas en sus formas de oligomero en cualquier combinacion, o combinando cualquier oligomero con monomeros. Estas mezclas son ventajosas ya que los componentes adicionales se encuentran en pacientes con demencia, por ejemplo, pero no se limitan a, la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, y por lo tanto proporcionaran neo-epftopos terapeuticamente importantes para el tratamiento con anticuerpo o vacuna de estos trastornos (Tsigelny y col., 2008). Otra ventaja es que los componentes adicionales incrementaran la estabilidad de las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema.
El termino aislado como se usa en el presente documento se refiere al oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado que se ha separado de los medios de preparacion, reactivos y similares, incluyendo el monomero de a-sinuclema y el agente estabilizante no reaccionado.
La invencion se dirige a anticuerpos que se unen a oligomeros de a-sinuclema solubles estabilizados. El oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se usa como antfgeno para producir tales anticuerpos y optimizar el desarrollo de anticuerpos esped ficos frente a formas toxicas de a-sinuclema. En estos metodos, el antfgeno se administra a un animal no humano y se recogen los anticuerpos producidos frente a dicho antfgeno. Para maximizar el efecto terapeutico, los anticuerpos generados frente el antfgeno de a-sinuclema estabilizada segun la presente invencion tienen ventajosamente una alta reactividad frente a las formas naturales de a-sinuclema soluble presentes en el cuerpo, en particular las formas solubles agregadas, incluyendo protofibrillas, pero tambien frente al monomero de a -sinuclema soluble. Un modo de seleccionar tales anticuerpos es primero cribar los anticuerpos que se unen bien a asinuclema modificada y estabilizada (en particular oligomeros y espedficamente protofibrillas) y, posteriormente, cribar entre estos anticuerpos los anticuerpos que se unen bien a a-sinuclema tipo silvestre.
Los anticuerpos resultantes pueden ser anticuerpos monoclonales y policlonales, o sus fragmentos activos, que se unen a oligomeros de a-sinuclema solubles estabilizados, y particularmente a a-sinuclema soluble antes de que la asinuclema se pueda agregar a fibrillas. En realizaciones espedficas, el antigeno de oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se puede usar en metodos tales como tecnolog^a de hibridoma, presentacion en fago, presentacion en ribosoma, presentacion en celula mam^era, presentacion bacteriana, para producir y/o evolucionar anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmented activos de los mismos. Mas espedficamente, para la generacion de anticuerpos de a-sinuclema monoclonales, se puede emplear una tecnica convencional, tal como la tecnica de hibridoma y/o presentacion en fago, presentacion en ribosoma, presentacion en celula mairnfera o presentacion bacteriana. Tales anticuerpos se pueden producir en roedores tales como raton, hamster o rata. Una vez generados, los clones se afslan y se criban por su respectiva especificidad a antfgeno. Para el cribado, se usan dos principios. Primero, los anticuerpos se investigan frente a monomeros de a-sinuclema purificados, protofibrillas/oligomeros y fibrillas. Estas diferentes formas conformacionales de a-sinuclema se pueden producir incubando oligomero de asinuclema soluble estabilizado, por ejemplo, a-sinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE, y posteriormente separado en fracciones por HPLC o usando un dispositivo de filtro centnfugo. Las fibrillas se pueden aislar por centrifugacion de la mezcla de incubacion a por encima de 5.000xg (vease Ejemplo 1). El cribado se puede hacer por un ensayo de inmunoabsorbancia ligada a enzima (ELISA) o por metodos similares. Segundo, los anticuerpos se evaluan sobre lonchas de tejido de animales transgenicos de a-sinuclema y/o secciones de tejido cerebral humano patologico, que contienen cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy.
En realizaciones adicionales, los anticuerpos reaccionan con a-sinuclema tanto modificada como estabilizada, asf como no modificada, en forma mutada o tipo silvestre de a-sinuclema soluble monomerica o agregada, o cualquier combinacion de las mismas.
En una realizacion, el anticuerpo segun la invencion tiene mayor fuerza de union a oligomeros de a-sinuclema solubles, y, en una realizacion mas espedfica, a protofibrillas de a-sinuclema, particularmente en comparacion con la fuerza de union a monomeros de a-sinuclema y fibrillas insolubles. En una realizacion mas espedfica, la fuerza de union (IC50) para protofibrillas de alfa-sinuclema comparadas con monomeros de a-sinuclema esta, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1:50 a 2.000. En otra realizacion espedfica, la fuerza de union (IC50) para las protofibrillas de asinuclema comparadas con las fibrillas de alfa-sinuclema esta, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1:2 a 2.000.
El anticuerpo puede ser humano, humanizado, o modificado para reducir la antigenicidad en pacientes humanos. La reduccion de la antigenicidad se puede producir, por ejemplo, modificando o eliminando los epftopos de linfocito T del anticuerpo. En una realizacion, el anticuerpo se selecciona de la clase de IgG, o mas preferiblemente de la subclase de IgG1 o IgG4 (anticuerpo humano).
En realizaciones adicionales, el anticuerpo tambien puede tener la actividad complemento reducida y/o las propiedades de union al receptor de Fc alteradas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mutando la parte Fc del anticuerpo en las posiciones 297, 322 o 331 de la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada (humana), o los correspondientes aminoacidos en, por ejemplo, IgG de raton. La actividad complemento reducida tambien se puede conseguir por desglucosilacion del anticuerpo enzimaticamente o por otros medios, de acuerdo con las tecnicas conocidas en la tecnica. Las propiedades de union a receptor Fc alteradas del anticuerpo se pueden conseguir alterando las estructuras de oligosacarido unidas a la glucoprotema (Jeffries, Nature, 2009, 8:226-234). El anticuerpo puede ser un fragmento Fab, por ejemplo, seleccionado de F(ab), F(ab)2, y DiFabody, o un anticuerpo de cadena unica, por ejemplo, seleccionado de scFv-Fc y scFab, por ejemplo, para mejorar la penetrancia de la barrera cerebral sangumea y la absorcion celular neuronal. Por lo tanto esta claro que el anticuerpo como se usa en el presente documento se refiere a una protema de longitud completa generada por el antfgeno o un fragmento activo del mismo.
En realizaciones mas espedficas, el antfgeno de oligomero de a-sinuclema se separa en fracciones y se afsla por SEC-HPLC. Las fracciones se valoran para su respectiva toxicidad en modelos de cultivo celular y las fracciones de antfgeno con la toxicidad mas fuerte se seleccionan como antfgenos para la produccion de anticuerpo o como antfgenos para la inmunizacion activa. Las preparaciones muestras tambien se pueden usar directamente para valorar la toxicidad y las muestras que muestran la toxicidad mas pronunciada se pueden usar ventajosamente como antfgeno para la seleccion y/o produccion de anticuerpo o como antfgenos para la inmunizacion activa.
Los anticuerpos de a-sinuclema se pueden formar como respuesta a la administracion del oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado segun la presente invencion a un roedor, por ejemplo, un raton o un conejo, para generar los anticuerpos monoclonales o policlonales frente al antfgeno, los cuales se aplican en un protocolo de inmunizacion pasiva para tratar los trastornos neurodegenerativos con patologfa de a-sinuclema, por ejemplo, EP y DCL, por mencionar algunos. Los anticuerpos se pueden humanizar antes de administrarse a un paciente humano.
La toxicidad de las formas agregadas de a-sinuclema se pueden determinar por diversos ensayos de toxicidad celular (vease las Figuras 2 a 3 y el Ejemplo 5). En resumen, un modelo de cultivo celular se basa en la valoracion de MTT, una medida de la disfuncion mitocondrial. Tambien se pueden usar otros ensayos de toxicidad, por ejemplo, medir la muerte celular o los marcadores apoptoticos. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, analisis de adenilato quinasa, analisis de lactato deshidrogenasa, tincion con anexina-V, actividad de la caspasa, escision de PARP y escalonamiento de ADN.
Despues de un protocolo de inmunizacion pasiva, los anticuerpos monoclonales o policlonales frente a especies de asinuclema con toxicidad pronunciada, en particular a -sinuclema protofibrilar soluble y otra oligomerica y monomero de a-sinuclema, ejercen su efecto sobre las inyecciones repetidas de los anticuerpos.
En una realizacion alterna, el anticuerpo que se une a a-sinuclema soluble puede ser anticuerpos monoclonales antia-sinuclema humanos derivados de globulos blancos de sujetos humanos control o pacientes con a-sinucleinopatfas. Los hibridomas se pueden producir a partir de globulos blancos segun las tecnicas establecidas y cribados para aglutinantes a a -sinuclema y a-sinuclema estabilizada (por ejemplo, oligomeros solubles). Los anticuerpos monoclonales anti-a-sinuclema humanos tambien se pueden obtener por cribado de una genoteca de anticuerpo humano para la union a a-sinuclema estabilizada (por ejemplo, oligomeros solubles). Los autoanticuerpos frente a a -sinuclema soluble o protofibrillas/oligomeros de a -sinuclema presentes en la sangre de sujetos control humanos o pacientes con a-sinucleinopatfas tambien se pueden aislar para su uso. Estos autoanticuerpos se pueden secuenciar y producir por tecnologfa de ADN recombinante en, por ejemplo, celulas CHO para mejorar la produccion y la economfa.
En una realizacion espedfica, el anticuerpo descrito se proporciona en una composicion, por ejemplo, adecuada para la administracion. Tales composiciones pueden comprender un anticuerpo como se describe en el presente documento y uno o mas excipientes convencionalmente empleados en las composiciones farmaceuticas. El anticuerpo se incluira en una cantidad terapeuticamente eficaz. En una realizacion espedfica, las composiciones comprenden el anticuerpo en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg, o mas espedficamente, aproximadamente 0,5 a 2 mg/kg, de peso corporal del receptor deseado.
Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas agentes antibacterianos, adyuvantes, tampones, sales, reguladores de pH, detergentes, o cualquier combinacion de los mismos, siempre y cuando tales excipientes sean farmaceuticamente aceptables para uso humano y/o veterinario, dependiendo del receptor deseado. La composicion se puede liofilizar, por ejemplo, solo o junto con un excipiente para incrementar la estabilidad del anticuerpo durante y/o despues de la liofilizacion. El manitol y/o la trehalosa son ejemplos no limitantes de excipientes adecuados para la liofilizacion.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar en uno o mas metodos para prevenir, retrasar una aparicion de, o tratar un trastorno relacionado con a-sinuclema en un individuo. Tales metodos comprenden administrar un anticuerpo o vacuna como se describe en el presente documento al individuo. El individuo es, por ejemplo, un sujeto sospechoso de haber adquirido o tener un riesgo incrementado de adquirir un trastorno relacionado con a-sinuclema. Un sujeto podna ser sospechoso de tener tal trastorno al presentar cualquiera de las siguientes caractensticas: smtomas de enfermedad prematuros, resultados de escaneo cerebral positivos, y/o niveles incrementados de a-sinuclema u oligomeros de a-sinuclema (por ejemplo, determinado utilizando los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, en un metodo de deteccion como se describe en el presente documento). Ejemplos de metodos de escaneo cerebral incluyen, pero no se limitan a, DaTscan (123I-ioflupano), o escaneo por tomograffa de emision de positron (PET) usando un anticuerpo monoclonal como se describe en el presente documento.
Al identificar los sujetos en riesgo de o sospechosos de tener un trastorno relacionado con a-sinuclema, se previene el desarrollo adicional del trastorno o se retrasa la aparicion o progresion mediante los tratamientos inventivos descritos en el presente documento, es decir, usando inmunizacion pasiva con los anticuerpos de la invencion. El trastorno relacionado con a-sinuclema puede ser la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, atrofia sistemica multiple (ASM) u otro trastorno neurodegenerativo con patologfa de a -sinuclema, incluyendo otros trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y trastornos tipo esquizofrenia.
Los anticuerpos de la invencion descritos en el presente documento tambien se pueden usar en metodos de deteccion, un ejemplo espedfico de los cuales incluye inmunoensayos diagnosticos en los que los anticuerpos se usan para detectar niveles alterados de las especies de a -sinuclema in vitro o in vivo. Los niveles de las formas dirigidas de asinuclema se pueden cambiar espedficamente en diferentes tejidos y fluidos corporales de pacientes con diferentes a-sinucleinopatfas u otros trastornos neurodegenerativos y asf servir como marcadores bioqmmicos prematuros para la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer, atrofia sistemica multiple (ASM) u otros trastornos neurodegenerativos con patologfa de asinuclema.
Mas espedficamente, un metodo de deteccion de oligomeros de a-sinuclema in vitro comprende anadir el anticuerpo segun la invencion a una muestra biologica que comprende o se sospecha que comprende a-sinuclema soluble, y detectar y medir una concentracion de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y la a -sinuclema soluble. La muestra biologica puede ser, por ejemplo, plasma, fluido cerebroespinal (FCE) o una biopsia de cerebro. Un metodo de deteccion de oligomeros de a -sinuclema in vivo comprende administrar un anticuerpo segun la presente invencion, estando dicho anticuerpo marcado con un marcador detectable, a un individuo sospechoso de portar niveles oligomericos o especies de a-sinuclema solubles enfermos en el cerebro, y detectar la presencia de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y la a-sinuclema soluble mediante la deteccion del marcador.
Para la marcacion del anticuerpo espedfico a oligomero, un experto en la tecnica reconocera que se pueden usar diversas tecnicas alternativas, dependiendo de la eleccion del metodo de deteccion, por ejemplo, ligandos radioactivos tales como 131I, 14C, 3H o 58Ga, por mencionar algunos. En particular, se cree que p Et con un anticuerpo espedfico a oligomero radiomarcado es de mayor importancia para diagnostico, seguimiento de terapia, y/o similares. Por consiguiente, la invencion proporciona anticuerpos que se marcan facilmente por un experto en la tecnica usando tecnicas convencionales, para su uso en diversos metodos para diagnostico y seguimiento de terapia.
De acuerdo con los metodos y las tecnicas descritas, se pueden evaluar el potencial terapeutico de los antfgenos y los anticuerpos descritos en el presente documento en modelos de cultivo celular y/o modelos de animal transgenico para patologfa de a-sinuclema. Se pueden usar ejemplos de dos modelos de cultivo celular para a -sinucleinopatia. En primer lugar, las formas tipo silvestre o mutantes del ADN de a-sinuclema se someten a transfeccion a celulas de neuroblastoma o neuroglioma. Las transfecciones tanto transitorias como estables ser realizan sobre celulas que estan diferenciadas a una morfologfa tipo neurona por acido retinoico. De este modo, es posible inducir la formacion de agregados de a-sinuclema intracelulares. En segundo lugar, un virus lenti- y/o adenoasociado (VAA) que porta vector de ADN de a-sinuclema se somete a transduccion sobre cultivos de neuroblastoma, neuroglioma y/o cultivos de celula de rinon embrionario. La transduccion con vectores vmcos es ventajosa para las tecnicas de transfeccion tradicionales ya que es generalmente mas eficaz, permitiendo que mas celulas formen agregados de a-sinuclema.
Los anticuerpos de a-sinuclema generados tambien se pueden utilizar en ensayos inmunobasados para la medicion de los niveles de a-sinuclema (en particular protofibrilla/oligomero) en muestras de paciente para diagnosticar EP, DCL u otras a-sinucleinopatfas. Los metodos de deteccion aplicados en la prueba diagnostica se basan principalmente en inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorbancia ligada a enzima (ELISA) y/o transferencia Western. Se investigan los niveles de protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema, u otras formas de a-sinuclema soluble conformacionalmente alterada en un amplio rango de tejidos de pacientes con senales prematuras de a -sinucleinopatia o individuos con un alto riesgo de desarrollar estos trastornos. Tales tejidos incluyen, pero no se limitan a, plasma, fluido cerebroespinal (FCE) y biopsias cerebrales.
Diversos aspectos de la invencion se ilustran en los siguientes Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Cineticas de agregacion de formas tipo silvestre y mutadas de a -sinuclema
El efecto de las diferentes mutaciones de a-sinuclema se investiga in vitro. Ademas de la a -sinuclema tipo silvestre, se estudian los siguientes mutantes: A30P, E46K, A53T y A30P/A53T, A30P/E46K, E46K/A53T y A30P/E46K/A53T. La a-sinuclema recombinante se expresa usando el sistema IMPACT (Purificacion mediada por interna con un marcador de union a quitina por afinidad, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), segun las instrucciones del fabricante. Todas las protemas recombinantes se disuelven en tampon Tris, o tampon fosfato, oscilando en concentracion entre 10 mM y 50 mM con o sin NaCl oscilando en concentracion entre 0,05 M y 0,3 M. Todas las protemas de a-sinuclema recombinantes se almacenan a -80 °C antes de su uso.
Para estudios adicionales, las protemas recombinantes se disuelven en tampon de acetato de sodio o de citrato dentro del intervalo de pH de 3 a 6, con o sin NaCl en la concentracion entre 0,05 M y 0,3 M. Las concentraciones proteicas iniciales vanan de 35 pM a 750 pM y son similares para todos los tipos de especies de a-sinuclema en cada experimento. En algunos experimentos, se anade tioflavina T (5 a 20 pM) a la mezcla de reaccion inicial con una concentracion de a-sinuclema final de 10 pM.
Cuando se estudia las cineticas de agregacion, las preparaciones de a-sinuclema se guardan en una placa de 96 pocillos de polipropileno de fondo plano o redondo (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania), o una placa de 96 pocillos de poliestireno de no union de fondo plano (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) y se incuban entre 4 °C y 65 °C con o sin agitacion. En los mismos experimentos, los microtubos de polipropileno (500 a 2.000 pl), no cubiertos o cubiertos con silicio, se incuban entre 4 °C y 65 °C con o sin agitacion. Para estudios cuando se usa agitacion, se incuban o bien una placa de 96 pocillos de polipropileno, o un microtubo colocado horizontalmente (500 a 2.000 |jl) en un agitador orbital P4 Labnet (Labnet, Edison, Nj , USA) o un Titramax 101 (Heidolph Instruments GMBH & Co.k G, Schwabach, Alemania) con la velocidad que vana entre 300 rpm y 900 rpm. En todos los estudios de agregacion se usa un volumen final de 100 a 300 j l por pocillo. En los experimentos de agregacion en los que se usa un microtubo, el volumen final oscila de 100 a 2.000 jl. Para las mediciones de ThT, la placas de 96 pocillos de poliestireno o polipropileno se leen en un Wallac Victor 2 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), equipado con un filtro de excitacion de 445 nm y un filtro de emision de 485 nm. Los resultados de a-sinuclema que presentan algunas de estas mutaciones se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 2. Smtesis de protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema
Para producir antfgeno protofibrilar/oligomerico de a-sinuclema (es decir, protofibrillas y otros oligomeros que contienen el antfgeno), se usa la respectiva a -sinuclema tipo silvestre, mutada o fragmentada, como se describio anteriormente, en una concentracion de 35 a 750 jM . En muestras en las que la a-sinuclema se ha conjugado con HNE y/o ONE (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), estos compuestos se usan a una concentracion de 0,01 a 65 nM. En un experimento tfpico, la relacion molar entre HNE y/o ONE y a-sinuclema oscila entre 1:1 y 100:1, pero la proporcion de los respectivos compuestos no esta limitada a esta estequiometna. En ciertos experimentos, el borohidruro de sodio (NaBH4) se usa a concentracion de 0,1 a 100 mM para reducir las muestras modificadas con HNE y/o modificadas con ONE. En algunos casos, el aminoacido de a-sinuclema puede contener aminoacidos (tales como lisina) que durante las modificacion con HNE forman una base Shiff inestable y reversible que se une con HNE. En otro caso, el aminoacido de a-sinuclema puede contener aminoacidos (tales como lisina) que durante la modificacion con ONE forman una base Shiff inestable y reversible que se une con ONE. La reduccion de borohidruro de sodio estabiliza la union de la base Shiff. Las muestras se incuban a 37 °C con o sin agitacion durante 30 minutos hasta 30 dfas. Para verificar la composicion molecular de las muestras, se utilizan varios metodos. La a -sinuclema no modificada o la a-sinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE o a-sinuclema modificada con otros aldehfdos reactivos, se centrifugan a 16.900xg durante cinco min a 21 °C para separar cualquier fibrilla insoluble. Posteriormente el sobrenadante se separa en fracciones usando un sistema de SEC-HPLC con deteccion UV entre 214 nm y 280 nm (descrito en detalle mas adelante) para aislar los oligomeros y monomeros de protofibrilla de asinuclema. En otro experimento, las protofibrillas/oligomeros y monomeros de a-sinuclema se separan usando un dispositivo de filtro centnfugo con un corte molecular entre 5 a 1.000 kDa. En un experimento tfpico, las muestras, 500 j l de a-sinuclema modificada con HNE y/o ONE, se centrifugan usando o bien un dispositivo de filtro centnfugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) o un dispositivo centnfugo Vivaspin500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) con un valor de corte de 100 kDa. Las muestras se centrifugan a una velocidad que vana entre 1.000 a 15.000xg durante 5 a 30 min y se recoge el retenido y contiene la mayona de las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema.
a-sinuclefna modificada con HNE
En un experimento tfpico se incuba a-sinuclema tipo silvestre humana 140 jM con HNE 5,6 mM (es decir, con una relacion de 40:1 entre HNE y a-sinuclema) durante 20 horas a 37 °C despues de lo cual el exceso de HNE no unido se separa usando o bien columnas de centrifugacion desalinizacion Zeba (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), dispositivo centnfugo Vivaspin500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centnfugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) segun las instrucciones del fabricante. Despues de esta etapa de modificacion con HNE inicial, las muestras se analizan directamente. Antes del analisis con SEC-HPLC, todas las muestras se someten a centrifugacion a 16.900xg durante 5 min a 22 °C y solamente la fraccion soluble se analiza por SEC-HPLC usando una columna Superose 6 PC3.2/30. Las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema eluyen en un pico a 19 min mientras que los monomeros de a -sinuclema eluyen a 37 min. (Figura 4).
a-sinuclefna modificada con ONE
En un experimento tfpico se incuba a-sinuclema tipo silvestre humana (140 jM ) con ONE 4,2 mM (es decir, con una relacion de 40:1 entre ONE y a-sinuclema) durante 20 horas a 37 °C y el exceso de ONE no unido se separa usando o bien columnas de centrifugacion desalacion Zeba (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), dispositivo centnfugo Vivaspin500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centnfugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) segun las instrucciones del fabricante. Antes del analisis con SEC-HPLC, todas las muestras se someten a centrifugacion a 16.900xg durante 5 min a 22 °C y solamente la fraccion soluble se analiza por SEC-HPLC usando una columna Superose 6 PC3.2/30. Las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema eluyen como el pico principal a 20 min mientras que los monomeros de a -sinuclema eluyen a 37 min. (Figura 5).
a-sinuclefna modificada con HNE y ONE
En un experimento tfpico se incuba a-sinuclema tipo silvestre humana (140 jM ) con HNE 4,2 mM y ONE 4,2 mM durante 20 horas a 37 °C y el exceso de HNE y ONE no unido se separa usando columnas de centrifugacion desalacion Zeba (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), dispositivo centnfugo Vivaspin500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centnfugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) segun las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se someten a centrifugacion a 16.900xg durante 5 min a 22 °C y solamente la fraccion soluble se analiza por SEC-HPLC usando una columna Superose 6 PC3.2/30.
Ejemplo 3. Separacion por HPLC de especies de a-sinuclema
Para aislar las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema, monomeros y fibrillas, la a-sinuclema se incuba como se describio anteriormente. Se usa un sistema de HPLC Merck Hitachi D-7000 LaChrom, que tiene un modelo detector de matriz de diodo L-7455, un automuestreador modelo L-7200 y una bomba modelo L-7100, acoplado a una columna Superdex 75 PC3.2/30, Superdex 200 PC3.2/30 o Superose 6 PC3.2/30 (GE Healthcare, Uppsala, Suiza), para la separacion cromatografica y analisis de pureza. Las muestras se eluyen a caudales que vanan entre 0,02 ml/min y 0,08 ml/min usando o bien Tris 20 a 50 mM pH 6,0 a 8,0, NaCl 0,15 M o fosfato de sodio 20 a 50 mM pH 6,0 a 8,0, NaCl 0,15 M. Alternativamente, se usa un sistema de HPLC Hitachi LaChrome Elite, que tiene una bomba modelo L-2130, un detector de matriz de diodo modelo L-7450, un automuestreador L-2200, acoplado a una Superose 610/300 GL, una Superdex 200 100/300 GL o una Superdex 75 100/300 GL. Las muestras se eluyen a caudales que vanan entre 0,1 ml/min y 0,5 ml/min usando o bien Tris 20 a 50 mM pH 6,0 a 8,0, NaCl 0,15 M o fosfato de sodio 20 a 50 mM pH 6,0 a 8,0, NaCl 0,15 M. Ademas, las muestras se pueden eluir con un tampon de acetato de sodio o tampon de citrato de sodio con un pH entre 3 y 6 con NaCl 0,15 M. En algunos analisis por SEC-HPLC, se anade Tween-20 al 0,1 % a 2,0 % o Tween-80 al tampon de elucion para reducir la adherencia no espedfica de oligomeros de protofibrilla de a-sinuclema a la matriz de la columna. Los cromatogramas se obtienen midiendo la absorbancia de UV entre 214 nm y 280 nm. Las fracciones de 20 a 100 pl se recogen sobre un Advantec SF-3120 (Advantec, Kashiwa, Japon), colector de fraccion. Las fracciones de 50 a 500 pl tambien se pueden recoger sobre un colector de fraccion Bio-Rad modelo 2128 (Bio-Rad, Hercules, CA). Los patrones de peso molecular globular se usan para obtener una curva patron, a partir de la cual se correlacionan los tiempos de retencion de las diversas especies de a-sinuclema con el peso molecular.
Ejemplo 4. Caracterizacion de protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema
Para caracterizar mas la morfologfa de las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema aislados, se realizan microscopfa de crioelectrones y microscopfa de fuerza atomica (AFM). Las almuotas proteicas de 1 a 100 pl se diluyen a una concentracion final que vana entre 10 pM y 350 pM, se anaden a una superficie de mica o una superficie HOPG (Veeco instruments SAS, Dourdan cedex, Francia) y se analizan segun los protocolos estandar. El analisis por AFM de las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema modifica con HNE revela una poblacion heterogenea de estructuras tanto de tipo anillo como mas lineales y redondas que vanan en diametro entre 50 a 300 nm. Por ejemplo, se pueden observar especies moleculares anulares con una estructura tipo anillo con un diametro entre 50 a 300 nm (Figura 6). El analisis por AFM de a-sinuclema modificada con ONE revela estructuras amorfas con un diametro de aproximadamente 30 a 150 nm de ancho (Figura 7).
Ejemplo 5. Evaluacion de toxicidad de a-sinuclema
El efecto de la a -sinuclema no modificada agregada in vitro y el oligomero de a-sinuclema modificada con HNE y/o ONE se analiza sobre un modelo de cultivo celular utilizando el ensayo de viabilidad por MTT comunmente usado (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Los tipos celulares usados en el estudio incluyen celulas HEK-293, SH-SY5Y y celulas H4. Otros ensayos que miden la muerte celular y los marcadores apoptoticos usados en el estudio incluyen ToxiLight (Lonza, Basel, Suiza) y el ensayo de lactato deshidrogenasa (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). La a-sinuclema tipo silvestre se compara con los siguientes mutantes: A30P, E46K, A53T, A30P/E46K, A30P/A53T, A30P/E46K y A30P/E46K/A53T. Las celulas se cultivan en DMEM (Invitrogen, La Jolla, CA, USA) complementado con 10 % de suero bovino fetal (Cambrex, Charles City, IA, USA). En un tipo de experimento, las celulas se guardan en una incubadora a 37 °C y CO2 al 5 %. El dfa antes de empezar el ensayo de toxicidad, se siembran las celulas HEK-293 en placas cubiertas con poliestireno de 96 pocillos (Sarstedt, NC, USA) con una densidad de 10.000 celulas/pocillo. A continuacion, los medios celulares se separan y las celulas se tratan con formas agregadas de asinuclema no modificada diluida en medios acondicionados frescos a una concentracion final que oscila de 3 pM a 6 pM. En otro conjunto de experimentos el oligomero de a-sinuclema modificada con ONE y/o HNE se diluye en medios acondicionados frescos a una concentracion final que oscila de 3 pM a 6 pM. Despues de 48 horas de incubacion, MTT, diluido en solucion salina tamponada con fosfato (Invitrogen, La Jolla, CA, USA), se anade a celulas a una concentracion final de 35 pM. Despues de 4,5 horas de incubacion, las celulas se tratan con una mezcla de DMF al 50 % y SDS al 20 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y la mezcla se incuba durante unas 24 horas adicionales. Finalmente, para la medicion del sustrato metabolizado, se usa un espectrofotometro Spectra Max 190 (Molecular Devices Corporation, CA, USA) y la deteccion se lleva a cabo a 570 nm.
Ejemplo 6. Anticuerpos de a-sinuclema en ratones inmunizados con protofibrillas/oligomeros de a -sinuclema
Inmunizacidn/Anticuerpos policlonales
En el esquema de inmunizacion se utilizan ratones Balb/C. Para la primera inmunizacion, los ratones se inyectan con 50 pl de adyuvante completo de Freunds y 50 pl de preparaciones protofibrilares/de oligomero de a-sinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE (concentracion final 35 j M). Para las inmunizaciones iniciales (por ejemplo, 3 a 6 veces) los ratones se inyectan con 50 j l de adyuvante incomplete de Freunds y 50 j l de preparaciones protofibrilares/de oligomero de a-sinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE (concentracion final de 35 j M). Para posteriores inmunizaciones (por ejemplo, 1 a 3 veces) los ratones se inyectan con 50 j l de preparaciones protofibrilares/de oligomero de a-sinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE (concentracion final 35 j M) diluidas en solucion salina tamponada con T ris o solucion salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Dos inyecciones de refuerzo, que contienen 50 j l de preparaciones protofibrilares/oligomericas de asinuclema modificada con HNE y/o modificada con ONE (concentracion final 70 j M), se llevan a cabo antes de que se sacrifiquen los ratones.
Se analiza la reactividad hacia protofibrillas/oligomeros de a -sinuclema modificada con HNE (Figura 8) y modificada con ONE (Figura 9) en la sangre de los ratones inmunizados. La especificidad de la respuesta del anticuerpo policlonal se analiza por ELISA. En un experimento tfpico, se cubre una placa de microtitulacion de poliestireno de 96 pocillos de alta union de fondo plano con a -sinuclema monomerica (no modificada o modificada con HNE y/o ONE, u otros aldelddos), a-sinuclema protofibrilar/oligomerica (no modificada o modificada con HNE y/o ONE, u otros aldelddos) o a-sinuclema fibrilar a una concentracion final de 400 ng/pocillo. Los pocillos se bloquean con BSA al 2 %, se lavan con Tween-20 /PBS al 0,05 % y los sobrenadantes de los medios celulares (no diluidos o diluidos 1:1 con solucion salina tamponada con fosfato) de los anticuerpos policlonales investigados se anaden a los pocillos como anticuerpos primarios. Se usa anticuerpo de cabra anti-IgG/IgM de raton conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) como el anticuerpo secundario a una dilucion de 1/1.000. La inmunoreactividad se visualiza usando p-nitrofenil-fosfato (Sigma-Aldrich, Mo , USA).
En el suero, se detectan los anticuerpos que reconocen espedficamente las protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema (Figuras 8 y 9).
Hibridoma/anticuerpos monoclonales
Se afslan celulas de bazo y se muelen en solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS) y se centrifugan a 1.200xg durante 10 min para recoger un sedimento rico en celula. Ademas las celulas se lavan con PBS y se centrifugan a 1.200xg durante 10 min. El sedimento celular se resuspende en medio esencial mmimo de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, La Jolla, CA, USA) complementado con antibioticos al 1 %. Las celulas de bazo se mezclan a una relacion de 1:1 con celulas Sp2/0 (lmea celular de mieloma de raton) en DMEM. Para facilitar la fusion celular, se anade 1 ml de polietilenglicol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a la mezcla celular y la reaccion se para con la adicion de DMEM. Las celulas se recogen y el sedimento se resuspende en DMEM complementado con suero fetal bovino al 10 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, USA) y que tambien que contiene piruvato de sodio al 1 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, USA), antibioticos al 1 % (v/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y L-glutamina al 1 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, USA). Despues de la centrifugacion, se resuspende el sedimento celular final. Para investigar los anticuerpos producidos por los hibridomas generados, se usa un protocolo ELISA. En un experimento tfpico, se cubre una placa de microtitulacion de poliestireno de 96 pocillos de alta union de fondo plano con a-sinuclema monomerica (no modificada o modificada con HNE y/o ONE, u otros aldehfdos), a-sinuclema oligomerica/protofibrilar (no modificada o modificada con HNE y/o ONE, u otros aldehfdos) o a-sinuclema fibrilar a una concentracion final de 400 ng/pocillo. Los pocillos se bloquean con BSA al 2 %, se lavan con Tween-20/PBS al 0,05 % y los sobrenadantes de los medios celulares (no diluidos o diluidos 1:1 con solucion salina tamponada con fosfato) del hibridoma investigado se anaden a los pocillos como anticuerpos primarios. Se usa anticuerpo de cabra anti-IgG/IgM de raton conjugado con peroxidasa de rabano picante (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, u Sa ) como el anticuerpo secundario a una dilucion de 1/5.000. La inmunoreactividad se visualiza usando un sustrato K-Blue® aumentado (TMB) y la reaccion se para con H2SO4 2 M. El DMEM complementado con suero fetal bovino al 10 % y que tambien contiene medios de la condicion BM al 5 % (v/v) (Roche Diagnostics Scandinavia, Bromma, Suecia) y complemento de medios HAT al 2 % (v/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y las celulas se colocan en placas de cultivo celular de 96 pocillos.
Los hibridomas se generaron inyectando preparaciones protofibrilares/de oligomero de a-sinuclema modifica con ONE como se describio previamente. Espedficamente, el hibridoma 40:2 reconocio una preparacion protofibrilar/de oligomero de a-sinuclema modificada con ONE en un protocolo de ELISA. Se diluyo el sobrenadante de los medios celulares del hibridoma 40:2 a 1/9, 1/27 y 1/82 y se analizo como se describio anteriormente sobre una placa de microtitulacion de poliestireno de 96 pocillos de alta union de fondo plano cubierta con 400 ng/pocillo de protofibrillas/oligomeros de a-sinuclema modificada con ONE (Figura 10).
Los ejemplos espedficos y realizaciones descritos en el presente documento son solamente ilustrativos de por sf y no pretenden ser limitantes de la invencion definida por las reivindicaciones. Realizaciones y ejemplos adicionales, y ventajas de los mismos, seran aparentes para un experto en la tecnica en vista de esta memoria y estan dentro del alcance de la invencion reivindicada.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un medicamento para su uso en el tratamiento de y/o para retrasar la aparicion de un trastorno relacionado con asinuclema en un individuo, en donde el trastorno relacionado con a-sinuclema se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, atrofia sistemica multiple (ASM), otras enfermedades con patologfa de cuerpos de Lewy, smdrome de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y enfermedades tipo esquizofrenia, comprendiendo el medicamento un anticuerpo producido a partir de un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, y capaz de unirse a un oligomero de asinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a-sinuclema, en donde el oligomero de a-sinuclema comprende a -sinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o uniendose a un agente estabilizante.
2. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 1, en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado comprende protofibrilla de a-sinuclema soluble estabilizada.
3. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el trastorno relacionado con a -sinuclema se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, atrofia sistemica multiple (ASM), otras enfermedades con patologfa de cuerpos de Lewy, y smdrome de enfermedad de Alzheimer.
4. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el trastorno relacionado con a-sinuclema es la enfermedad de Parkinson.
5. El medicamento para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es capaz de unirse a oligomeros de a -sinuclema solubles tipo silvestre.
6. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 5, en donde el anticuerpo tiene mayor fuerza de union a oligomeros de a-sinuclema solubles en comparacion con la fuerza de union a monomeros de a-sinuclema y fibrillas insolubles.
7. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo se ha recogido de un animal no humano al cual se ha administrado el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado.
8. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo se ha producido por tecnologfa de hibridoma, presentacion en fago, presentacion en ribosoma, presentacion en celula mairnfera o presentacion bacteriana.
9. El medicamento para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es monoclonal.
10. El medicamento para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el anticuerpo es humano, humanizado o modificado para reducir antigenicidad en seres humanos.
11. El medicamento para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el oligomero de asinuclema soluble estabilizado comprende una protofibrilla de a-sinuclema modificada con un agente organico hidrofobo que comprende un aldetudo, un acido graso saturado, insaturado o poliinsaturado, o una combinacion de los mismos, un detergente no ionico o un detergente zwitterionico, o cualquier combinacion de los mismos, al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en trigliceridos, fosfolfpidos, esfingolfpidos, gangliosidos, colesterol, esteres de colesterol, alcoholes de cadena larga, y cualquier combinacion de los mismos, o un derivado de acido biliar seleccionado del grupo que consiste en deoxicolato, colato y taurocolato, y cualquier combinacion de los mismos, o la protofibrilla de a-sinuclema estabilizada comprende una protofibrilla de a-sinuclema modificada con 1-ahidroxi-secosterol o entrecruzada con al menos un agente de entrecruzamiento proteico seleccionado del grupo que consiste en tartrato de disuccinimidilo, suberimidato de bis-sulfosuccinimidilo y propionato de 3,3-ditiobissulfosuccinimidilo, y cualquier combinacion de los mismos.
12. Un anticuerpo, capaz de unirse a un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de asinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a -sinuclema, en donde el anticuerpo se produce del oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado comprende a-sinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se estabiliza por entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o por union a un agente estabilizante.
13. El medicamento para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el anticuerpo de la reivindicacion 12, en donde el anticuerpo es capaz de unirse a una protofibrilla de a-sinuclema estabilizada que tiene un peso molecular de 2.000 Da.
14. El medicamento para su uso segun la reivindicacion 11 o la reivindicacion 13, o el anticuerpo segun la reivindicacion 12 o la reivindicacion 13, en donde la protofibrilla de a-sinuclema estabilizada comprende una protofibrilla de asinuclema modificada con un agente organico hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en 4-hidroxi-2-nonenal, malondialdehfdo, 4-oxo-2-nonenal y acrolema, y cualquier combinacion de los mismos.
15. Un metodo de deteccion de a -sinuclema soluble in vitro, que comprende anadir el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 a una muestra biologica que comprende o se sospecha que comprende a-sinuclema soluble; y detectar y medir una concentracion de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y la a-sinuclema soluble.
16. Un metodo de produccion de un anticuerpo para retrasar una aparicion de o para el tratamiento de un trastorno relacionado con a-sinuclema en un individuo, en donde el trastorno relacionado con a -sinuclema se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y/o neuritas de Lewy, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down, atrofia sistemica multiple (ASM), otras enfermedades con patologfa de cuerpos de Lewy, smdrome de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington, enfermedad prionica, enfermedad de Creutzfeldt Jakob, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, kuru, insomnio hereditario mortal, amiloidosis cerebrovascular, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, smdromes psiquiatricos, esquizofrenia y trastornos tipo esquizofrenia, y en donde el anticuerpo o su fragmento se une a un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado, teniendo el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la asinuclema, comprendiendo el metodo administrar un antfgeno a un animal no humano; y recoger el anticuerpo formado frente al antfgeno, comprendiendo el antfgeno un oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado que tiene una tasa de formacion a una forma agregada no soluble inferior que un oligomero soluble no estabilizado de la a -sinuclema, en donde el oligomero de a-sinuclema comprende a-sinuclema de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:1 a 8, y en donde el oligomero de a-sinuclema soluble estabilizado se estabiliza mediante entrecruzamiento con un agente de entrecruzamiento proteico o uniendose a un agente estabilizante.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
WO2009128948A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Peptimmune, Inc. Design and synthesis of directed sequence polymer compositions and antibodies thereof for the treatment of protein conformational disorders
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
DK2448968T3 (da) * 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER
JP5894939B2 (ja) 2010-02-26 2016-03-30 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー プロトフィブリル結合抗体ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイノパチーの治療および診断方法におけるこれらの使用
EP2366714A1 (en) * 2010-03-03 2011-09-21 Dr. Rentschler Holding GmbH & Co. KG Naturally occuring autoantibodies against alpha-synuclein that inhibit the aggregation and cytotoxicity of alpha-synuclein
AU2012272790B2 (en) 2011-06-23 2016-10-06 Biogen International Neuroscience Gmbh Anti-alpha synuclein binding molecules
EP3378535B1 (en) * 2011-10-28 2023-01-04 Prothena Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
CN107091931A (zh) * 2011-11-02 2017-08-25 生物国际神经***科学公司 抗α‑共核蛋白抗体诊断脑中的α‑共核蛋白的升高水平的用途
CA2863953A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
EP2659906A1 (en) * 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
US10562973B2 (en) 2014-04-08 2020-02-18 Prothena Bioscience Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
KR102564384B1 (ko) 2014-07-10 2023-08-07 바이오악틱 에이비 개선된 Aβ 프로토피브릴 결합 항체
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
AU2017272804B2 (en) 2016-06-02 2023-11-23 Medimmune Limited Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
WO2018011353A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Bioarctic Ab Brain delivery protein
WO2018091444A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
US11325968B2 (en) 2016-12-16 2022-05-10 H. Lundbeck A/S Alpha-synuclein antibodies
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
EP3661961A4 (en) * 2017-08-02 2021-04-14 Stressmarq Biosciences Inc. ANTIBODIES BINDING TO ACTIVE ALPHA-SYNUCLEIN
FI3672631T3 (fi) 2017-08-22 2023-06-29 Biogen Ma Inc Beeta-amyloidin vasta-aineita sisältäviä lääkekoostumuksia
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
EP3728567B1 (en) 2017-12-19 2023-07-05 Chase Therapeutics Corporation Method for assessing a synucleinopathy
EP3773692A4 (en) * 2018-04-04 2022-03-16 University of Florida Research Foundation, Inc. SUBSTANCES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF LEWY BODY DISORDERS
WO2019230558A1 (ja) * 2018-06-01 2019-12-05 国立大学法人 岡山大学 抗炎症作用を有する新規単クローン抗体
WO2020009482A1 (ko) * 2018-07-03 2020-01-09 에이비엘바이오 주식회사 항 알파-시누클레인 항체 및 그 용도
CN114341343A (zh) * 2019-04-30 2022-04-12 才思治疗公司 α-突触核蛋白测定
US11339212B2 (en) 2020-06-26 2022-05-24 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
CN112125832B (zh) * 2020-08-12 2022-09-20 北京大学 刺突蛋白受体结合结构域纳米凝胶及其制备方法与应用
BR112023016627A2 (pt) * 2021-03-08 2023-09-26 Akershus Univ Hf Ensaio de depuração
WO2023210405A1 (ja) * 2022-04-25 2023-11-02 公益財団法人東京都医学総合研究所 変異型の神経変性疾患関連タンパク質

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE312349T1 (de) * 1998-07-03 2005-12-15 Innogenetics Nv Differentielle diagnose von neurodegeneration
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
US20060018918A1 (en) 2000-12-27 2006-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Production of stabilized conformational isomers of disease associated proteins
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
HUE034320T2 (en) * 2003-05-19 2018-02-28 Prothena Biosciences Ltd Truncated fragments of alpha-synuclein in lewy-body disease
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
US20050203010A1 (en) * 2003-11-14 2005-09-15 Atgen Co., Ltd. Novel peptides conferring environmental stress resistance and fusion proteins including said peptides
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
CA2657953A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
EP1989330A4 (en) 2006-01-31 2009-10-21 Elan Pharm Inc ALPHA-SYNUCLEINE KINASE
NZ567888A (en) 2006-03-23 2010-08-27 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
PL2118300T3 (pl) 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
JP5894939B2 (ja) 2010-02-26 2016-03-30 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー プロトフィブリル結合抗体ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイノパチーの治療および診断方法におけるこれらの使用

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