ES2691080T3 - Variantes de la lipasa de humicola lanuginosa estabilizada en películas hidrosolubles - Google Patents

Abstract

Película hidrosoluble que comprende una variante de una lipasa parental, en la que la variante presenta actividad lipásica, tiene al menos un 90% pero menos del 100% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 2, y comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R; y D27R; y al menos una o más de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de SEQ ID N.º: 2; donde la variante presenta una estabilidad aumentada en comparación con la lipasa parental.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de la lipasa de humicola lanuginosa estabilizada en películas hidrosolubles Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador. La forma legible por 5 ordenador se incorpora aquí como referencia.

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a películas hidrosolubles y bolsas de detergente que comprenden una lipasa estabilizada.

Antecedentes

10 [0003] El uso de paquetes de película hidrosoluble para entregar cantidades de dosis unitaria de productos

detergentes para, por ejemplo, lavado de ropa y lavado automático de vajilla es bien conocido (véase por ejemplo, WO 2009/098660 o WO 2010/141301). Detergentes tanto granulosos como líquidos han estado en el mercado en esta forma durante varios años. Es también bien conocido desde hace décadas el uso de enzimas en los detergentes de ropa. Más y más tipos diferentes de enzimas se usan en detergentes, y las dosis de las 15 enzimas van también en aumento, entre otros debido a los beneficios provenientes de las enzimas y los beneficios medioambientales del uso de principios activos biológicos en vez de, por ejemplo, productos químicos a base de aceite como la mayoría de tensioactivos.

[0004] Un posible problema cuando se usan enzimas en detergentes es la estabilidad de almacenamiento de las enzimas. Las enzimas son grandes moléculas biológicas que pueden sufrir varias formas de degradación. Para

20 superar este problema se han sugerido numerosas soluciones.

[0005] WO 2013/138288 divulga una película hidrosoluble que comprende una resina hidrosoluble, una enzima y un sustrato enzimático.

[0006] WO 2009/109500 divulga variantes de lipasa de la lipasa de Thermomyces lanuginosus, que tiene una proporción mejorada entre efecto de lavado y generación de olor.

25 [0007] La presente invención proporciona una solución para aumentar la estabilidad de almacenamiento de

lipasas en películas hidrosolubles y productos de bolsa de detergente (dosis unitaria) mediante la incorporación de las variantes de lipasa como se describe en WO 2014/184164.

Resumen

[0008] En un primer aspecto, la presente invención proporciona una película hidrosoluble que comprende una 30 variante de una lipasa parental, en la que la variante presenta actividad lipásica, presenta al menos un 90% pero menos del 100% de identidad de secuencia con SEQ ID N.°: 2 y comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y D27R, y al menos una o más (por ejemplo, varias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de SEQ ID N.°: 2; donde la variante en comparación con la lipasa parental tiene mayor estabilidad.

35 [0009] Varios otros aspectos y formas de realización son evidentes a partir de la descripción detallada, los

ejemplos y las reivindicaciones.

Definiciones

[0010] Lipasa: los términos "lipasa", "enzima lipasa", "enzima lipolítica", "esterasa de lípidos", "polipéptido lipolítico" y "proteína lipolítica" se refieren a una enzima de la clase EC3.1.1 tal y como se define en la 40 nomeclatura de las enzimas. Puede tener actividad lipásica (triacilglicerol lipasa, EC3.1.1.3), actividad de cutinasa (EC3.1.1.74), actividad de esterol esterasa (EC3.1.1.13) y/o actividad de hidrolasa de éster ceroso (EC3.1.1.50). Para los fines de la presente invención, la actividad lipásica se determina según el procedimiento descrito en los ejemplos. En un aspecto, las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o el 100% de la actividad lipásica del polipéptido de SEQ ID N.°: 2.

[0011] Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0012] ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y empalmada, obtenida a partir de una célula eucariótica o procariótica. El ADNc carece de secuencias de intrones que puedan estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

[0013] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

[0014] Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica la variante o nativa o exógena entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia guía, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

[0015] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de una variante incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

[0016] Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente enlazado a secuencias de control que proveen a su expresión.

[0017] Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido con uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes desde el extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido; donde el fragmento presenta actividad lipásica. En un aspecto, un fragmento contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95%, pero menos del 100% del número de aminoácidos 1 al 369 de SEQ ID N.°: 2.

[0018] Condiciones de astringencia alta: el término "condiciones de astringencia alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SdS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65°C.

[0019] Célula hospedadora: el término "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

[0020] Propiedad mejorada: el término "propiedad mejorada" significa una característica asociada a una variante que se ha mejorado en comparación con la lipasa parental. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, estabilidad del detergente, estabilidad en el detergente con proteasa presente, estabilidad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

de proteasa, estabilidad química, estabilidad de oxidación, estabilidad de pH, estabilidad en condiciones de almacenamiento y termoestabilidad.

[0021] Aislado: el término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no ocurra de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero de forma no limitativa, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor apartados, al menos parcialmente, de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los cuales se asocian en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia en relación a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

[0022] Condiciones de astringencia baja: el término "condiciones de astringencia baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDSal 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 50°C.

[0023] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tales como procesado del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro equivale a los aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID N.°: 2. En la técnica se conoce que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleótido.

[0024] Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que presenta actividad lipásica. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro equivale a los nucleótidos 1 a 807 de la sEq ID N.°: 1.

[0025] Condiciones de astringencia media: el término "condiciones de astringencia media" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 55°C.

[0026] Condiciones de astringencia media-alta: el término "condiciones de astringencia media-alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 60°C.

[0027] Mutante: el término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

[0028] Constructo de ácido nucleico: el término "constructo de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, mono- o bicatenario, que está aislado de un gen de origen natural o está modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o más secuencias de control.

[0029] Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

[0030] Progenitor o lipasa parental: el término "progenitor" o "lipasa parental" significa una lipasa a la que se le produce una alteración para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. La lipasa parental puede ser un polipéptido de origen natural (tipo salvaje) o una variante o fragmento del mismo.

[0031] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad de secuencia".

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0032] Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)

[0033] Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNaFuLL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el

alineamiento).

[0034] Estabilidad: la estabilidad de una lipasa se puede expresar como la actividad residual o el rendimiento residual de dicha lipasa durante o tras la exposición a varias condiciones de prueba tales como, por ejemplo, almacenamiento en una composición detergente, a varias temperaturas, a varios pH, en presencia de diferentes componentes tales como proteasa, productos químicos y/o sustancias oxidantes (condiciones de estrés). La estabilidad de una variante de lipasa se puede medir con relación a una actividad o rendimiento conocido de una lipasa parental o, alternativamente, a una actividad o rendimiento conocido de la variante de lipasa cuando se añade inicialmente a la composición detergente opcionalmente almacenada en frío o congelada o con relación a la variante de lipasa almacenada en frío o congelada (condiciones sin estrés).

[0035] Subsecuencia: el término "subsecuencia" significa un polinucleótido con uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que presenta actividad lipásica. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95%, pero menos del 100% del número de nucleótidos 1 a 807 de SEQ ID N.°: 1.

[0036] Variante: el término "variante" significa un polipéptido con actividad lipásica que incluye una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir un aminoácido adyacente e inmediatamente posterior al aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos el 100% de la actividad lipásica del polipéptido de SEQ ID N.°: 2.

[0037] Condiciones de astringencia muy alta: el término "condiciones de astringencia muy alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSpE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 70°C.

[0038] Condiciones de astringencia muy baja: el término "condiciones de astringencia muy baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 45°C.

[0039] Lipasa de tipo salvaje: el término lipasa de "tipo salvaje" significa una lipasa expresada por un microorganismo de origen natural, tales como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrados en la naturaleza.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Convenciones para la designación de variantes

[0040] Para los fines de la presente invención, el polipéptido descrito en SEQ ID N.°: 2 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otra lipasa. La secuencia de aminoácidos de otra lipasa se alinea con SEQ ID N.°: 2, y, basado en el alineamiento, el número de posición del aminoácido que se corresponde con cualquier residuo de aminoácido del polipéptido descrito en SEQ ID N.°: 2 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62).

[0041] La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra lipasa se puede determinar mediante un alineamiento de múltiples secuencias polipeptídicas usando diferentes programas informáticos incluyendo, pero de forma no limitativa, MUSCLE (comparación de secuencia múltiple por log-expectativa; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFfT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) y EMBOSS EMMA utilzando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando sus respectivos parámetros por defecto.

[0042] Cuando la otra enzima ha divergido desde el polipéptido de SEQ ID N.°: 2 de manera que la comparación tradicional basada en la secuencia no logra detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencia por pares. Se puede conseguir una sensibilidad superior en la búsqueda basada en secuencia utilizando programas de búsqueda que utilicen representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda reiterativa en base de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede conseguir incluso una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información a partir de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De manera similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de la superfamilia presentes en la base de datos de SCOP. Estos alineamientos pueden usarse sucesivamente para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos se pueden evaluar para determinar su exactitud utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.

[0043] Para proteínas de estructura conocida, diferentes herramientas y recursos están disponibles para recuperar y generar alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas de SCOP han sido alineadas estructuralmente, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Dos o más estructuras de proteínas se pueden alinear utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineamiento de distancias (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos puede ser utilizada adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0044] Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de una o tres letras de los aminoácidos aceptadas por la IUPAC.

[0045] Sustituciones. Para una sustitución aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 por alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y de serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0046] Deleciones. Para una deleción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* + Ser411*" o "G195* + S411*".

[0047] Inserciones. Para una inserción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n.° 1, aminoácido insertado n.°

5 2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como

"Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0048] En tales casos, el/los residuo(s) del aminoácido insertado se numera(n) mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al/a los residuo(s) de aminoácido insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:

Progenitor:

Variante:

195

195 195a 195b

G

G - K - A

10 [0049] Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden alteraciones múltiples se separan con signos de

suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" representa una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

[0050] Alteraciones diferentes. Cuando se pueden introducir diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones se separan con una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de 15 arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. Así, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Descripción detallada de la invención

20 [0051] La presente invención se refiere a composiciones de película hidrosoluble que comprenden una variante

de lipasa, como se describe en WO 2014/184164, en las cuales la variante comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y D27R, y al menos una o más (por ejemplo, varias) del polipéptido de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de la SEQ ID N.°: 2, donde la variante presenta actividad lipásica. Las composiciones de película hidrosoluble se pueden utilizar para preparar una 25 bolsa de detergente, tal como un producto de dosis unitaria de detergente.

[0052] Hemos descubierto que incorporar las lipasas descritas en WO 2014/184164 en una película hidrosoluble proporciona una película hidrosoluble con excelente estabilidad de almacenamiento de la lipasa.

[0053] Por lo tanto, la invención proporciona una película hidrosoluble y una bolsa de detergente que comprende una lipasa como se describe en WO 2014/184164, que tiene una estabilidad lipolítica mejorada. Las

30 composiciones de la invención se pueden utilizar en composiciones y aplicaciones de lavado de ropa y de vajilla.

[0054] En una forma de realización, la película hidrosoluble comprende una enzima (detergente) adicional seleccionada del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, ADNasa, perhidrolasa y oxidasa.

[0055] La estabilidad de almacenamiento de las variantes de lipasa en la película hidrosoluble de la invención se 35 puede mejorar mediante la inclusión de la lipasa como partículas de lipasa. Esto hace que la lipasa sea menos

propensa a la inactivación por los constituyentes del detergente como blanqueador, tensioactivos, queladores, etc.

[0056] No solo son las variantes de lipasa más resistentes a los constituyentes del detergente en una bolsa de detergente formada por la película hidrosoluble, sino que la pérdida de actividad enzimática durante la

40 producción de la película hidrosoluble también puede reducirse. Durante la producción, la película se prepara a partir de una composición de líquido caliente filmógeno que contiene las variantes de lipasa. Tanto la etapa de calentamiento como la posible proteólisis por proteasas (si se incluyen) inactivarán alguna de las variantes de lipasa en el líquido caliente. Usando partículas de lipasa en vez de lipasa disuelta, la lipasa se vuelve más resistente a la inactivación.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Variantes

[0057] Las variantes de lipasa (también referidas como "variantes") usadas en la presente invención, comprenden sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y D27R, y al menos una o más (por ejemplo, varias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de la SEQ ID N.°: 2, donde la variante presenta actividad lipásica.

[0058] En un aspecto, la variante tiene identidad de secuencia de al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipasa parental. En otro aspecto, la variante tiene al menos un 90%, por ejemplo, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID N.°: 2.

[0059] En un aspecto, el número de sustituciones en las variantes de la presente invención es 1-40, por ejemplo, 1-30,1-20,1-10 y 1-5, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 sustituciones.

[0060] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y una de D27R+G38A; D27R+G91T; D27R+D96E; D27R+D111A; D27R+G163K; D27R+D254S; o D27R+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0061] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y una de D27R+N33Q+G38A; D27R+N33Q+G91T; D27R+N33Q+D96E; D27R+N33Q+D111A; D27R+N33Q+G163K; D27R+N33Q+D254S; D27R+N33Q+P256T; D27R+G38A+G91T; D27R+G38A+D96E; D27R+G38A+D111A; D27R+G38A+G163K; D27R+G38A+D254S; D27R+G38A+P256T; D27R+G91T+D96E; D27R+G91T+D111A; D27R+G91T+G163K; D27R+G91T+D254S; D27R+G91T+P256T; D27R+D96E+D111A; D27R+D96E+G163K; D27R+D96E+D254S; D27R+D96E+P256T; D27R+D111A+G163K; D27R+D111A+D254S; D27R+D111A+P256T; D27R+G163K+D254S; D27R+G163K+P256T; o D27R+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0062] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y una de D27R+N33Q+G38A+G91T; D27R+N33Q+G38A+D96E; D27R+N33Q+G38A+D111A:

D27R+N33Q+G38A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E; D27R+N33Q+G91T+D254S; D27R+N33Q+D96E+G163K; D27R+N33Q+D111A+G163K; D27R+N33Q+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E; D27R+G38A+G91T+D254S; D27R+G38A+D96E+G163K; D27R+G38A+D111A+G163K; D27R+G38A+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+D111A; D27R+G91T+D96E+P256T; D27R+G91T+D111A+P256T: D27R+G91T+D254S+P256T D27R+D96E+D111A+P256T D27R+D96E+D254S+P256T

D27R+N33Q+G38A+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A; D27R+N33Q+G91T+P256T; D27R+N33Q+D96E+D254S; D27R+N33Q+D111A+D254S; D27R+N33Q+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A; D27R+G38A+G91T+P256T; D27R+G38A+D96E+D254S; D27R+G38A+D111A+D254S; D27R+G38A+G163K+P256T; D27R+G91T+D96E+G163K; D27R+G91T+D111A+G163K; D27R+G91T+G163K+D254S; D27R+D96E+D111A+G163K; D27R+D96E+G163K+D254S; D27R+D111A+G163K+D254S;

D27R+N33Q+G38A+P256T D27R+N33Q+G91T+G163K D27R+N33Q+D96E+D111A D27R+N33Q+D96E+P256T D27R+N33Q+D111A+P256T D27R+N33Q+D254S+P256T D27R+G38A+G91T+G163K D27R+G38A+D96E+D111A D27R+G38A+D96E+P256T D27R+G38A+D111A+P256T D27R+G38A+D254S+P256T D27R+G91T+D96E+D254S D27R+G91T+D111A+D254S D27R+G91T+G163K+P256T D27R+D96E+D111A+D254S D27R+D96E+G163K+P256T D27R+D111A+G163K+P256T

D27R+D111A+D254S+P256T; o D27R+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0063] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes

a T231R+N233R y una de D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+D96E+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S;

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E; D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G91T+D96E+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+P256T;

D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A D27R+N33Q+G38A+G91T+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S D27R+N33Q+G38A+G163K+P256T D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

D27R+N33Q+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+P256T: D27R+N33Q+G163K+D254S+P256T: D27R+G38A+G91T+D96E+D254S; D27R+G38A+G91T+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+G163K+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+D96E+G163K+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K+P256T: D27R+G91T+G163K+D254S+P256T D27R+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+D96E+G163K+D254S+P256T

D27R+N33Q+G91T+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K D27R+N33Q+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S D27R+N33Q+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S

D27R+N33Q+D111A+D254S+P256T

D27R+G38A+G91T+D96E+D111A; D27R+G38A+G91T+D96E+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+P256T: D27R+G38A+G91T+D254S+P256T D27R+G38A+D96E+D111A+P256T

D27R+G38A+G91T+D96E+G163K D27R+G38A+G91T+D111A+G163K D27R+G38A+G91T+G163K+D254S D27R+G38A+D96E+D111A+G163K D27R+G38A+D96E+G163K+D254S

D27R+G38A+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+D254S

D27R+G38A+D111A+D254S+P256T D27R+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S D27R+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+G163K+P256T

D27R+G91T+D111A+G163K+D254S D27R+G91T+D111A+D254S+P256T D27R+D96E+D111A+G163K+D254S D27R+D96E+D111A+D254S+P256T o D27R+D111A+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0064] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y una de D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T;

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+P256T D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S+P256T D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S+P256T D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S D27R+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S D27R+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T D27R+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T

D27R+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; o D27R+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.° 2.

[0065] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes

a T231R+N233R y una

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T: D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T +D111A+G163K+D254S+P256T;

D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T;

de D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; o

D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0066] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y una de

D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T: D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T: D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; o D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0067] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones en las posiciones correspondientes a T231 R+N233R y D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T de la SEQ ID N.°: 2.

[0068] En otro aspecto, las variantes comprenden o consisten en sustituciones en las posiciones correspondientes a las siguientes de la SEQ ID N.°: 2:

D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G163K+T231R+N233R+D254S;

D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;

D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+D96E+G163K+T231R+N233R;

D27R+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

D27R+D96E+D111A+G163D+T231R+N233R+D254S+P256T;

D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S;

D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+P256T;

D27R+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R;

D27R+D96E+D111A+T231R+N233R;

D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+E210Q+T231R+N233R+D254S+P256T; o D27R+T231R+N233R+D254S+P256T.

[0069] Las variantes pueden comprender además una o más sustituciones adicionales en una o más (por ejemplo, varias) posiciones distintas.

[0070] Los cambios aminoacídicos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones del extremo amino o carboxilo, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tales como una región de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0071] Ejemplos de sustituciones conservadoras son las que se dan dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y

5 metionina). Las sustituciones aminoacídicas que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Son sustituciones comunes Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0072] Alternativamente, los cambios aminoacídicos son de tal naturaleza que alteran las propiedades 10 fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios aminoacídicos pueden mejorar la termoestabilidad

del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

[0073] Los aminoácidos esenciales de un polipéptido se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada

15 residuo de la molécula y se determina la actividad lipásica de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos aminoacídicos que son críticos para la actividad de la molécula. Veáse también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos 20 del posible sitio de contacto. Veáse, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

[0074] Las variantes pueden consistir o contener al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al

25 menos un 95% del número de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2.

[0075] En una forma de realización, la variante tiene una mejor estabilidad en el detergente en presencia de proteasa en comparación con la lipasa parental.

[0076] En una forma de realización, la variante tiene una mejor estabilidad detergente en comparación con la lipasa parental.

30 [0077] En una forma de realización, la variante tiene una mejor estabilidad proteásica en comparación con la

lipasa parental.

[0078] En una forma de realización, la variante tiene mejor estabilidad química en comparación con la lipasa parental.

[0079] En una forma de realización, la variante tiene mejor estabilidad a la oxidación en comparación con la 35 lipasa parental.

[0080] En una forma de realización, la variante tiene mejor estabilidad al pH en comparación con la lipasa parental.

[0081] En una forma de realización, la variante tiene mejor estabilidad en condiciones de almacenamiento en comparación con la lipasa parental.

40 [0082] En una forma de realización, la variante tiene mejor termoestabilidad en comparación con la lipasa

parental.

Lipasas parentales

[0083] La lipasa parental puede ser (a) un polipéptido con al menos 60% de identidad de secuencia respecto al polipéptido de sEq ID N.°: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de 45 astringencia baja con (i) la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1, (ii) la secuencia complementaria en toda su longitud de (i); o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 60% de identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0084] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.°: 2 de al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, el cual presenta actividad lipásica. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en hasta 40 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 del polipéptido de SEQ ID N.°: 2.

[0085] En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 2.

[0086] En otro aspecto, el progenitor es un fragmento del polipéptido de SEQ ID N.°: 2 que contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% del número de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2.

[0087] En otra forma de realización, el progenitor es una variante alélica del polipéptido de SEQ ID N.°: 2.

[0088] En otro aspecto, el progenitor es codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia baja, condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta, o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1, (ii) la secuencia complementaria en toda su longitud de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).

[0089] El polinucleótido de SEQ ID N.°: 1 o una subsecuencia de la misma, al igual que el polipéptido de SEQ ID N.°: 2 o un fragmento del mismo, se pueden utilizar para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica un progenitor de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándares de transferencia Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente en la misma. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es de al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas se marcan típicamente para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). La presente invención abarca tales sondas.

[0090] Se puede cribar una genoteca de ADN genómico o ADNc obtenida a partir de tales otras cepas para seleccionar ADN que hibride con las sondas anteriormente descritas y que codifique un progenitor. El ADN genómico o de otro tipo de tales otras cepas se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que hibride con la SEQ ID N.°: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una transferencia Southern.

[0091] Para los fines de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada que corresponde con (i) la SEQ ID N.°: 1; (ii) la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1; (iii) la secuencia complementaria de la misma en toda su longitud; o (iv) una subsecuencia de la misma; bajo condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Las moléculas con las que la sonda de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualesquiera de los otros medios de detección conocidos en la técnica.

[0092] En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es de al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% del número de nucleótidos de la SEQ ID N.°: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID N.°: 2; el polipéptido derivado del mismo; o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID N.°: 1.

[0093] En otra forma de realización, el progenitor está codificado por un polinucleótido con una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificante del polipéptido de SEQ ID N.°: 1 de al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0094] El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido donde una región de un polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido.

[0095] El progenitor puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible donde otro polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estas estén en marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo control del/de los mismo(s) promotor(es) y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología de inteína en la cual los polipéptidos de fusión se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776779).

[0096] Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. En la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0097] El progenitor puede ser obtenido de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" tal como se utiliza en este caso en relación con una fuente dada significará que el progenitor codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el progenitor se secreta extracelularmente.

[0098] El progenitor puede ser una lipasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido de una bacteria grampositiva tal como una lipasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces o Thermobifida, o un polipéptido de una bacteria gramnegativa tal como una lipasa de Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, helicobacteria, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma.

[0099] En un aspecto, el progenitor es una lipasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.

[0100] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.

[0101] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans.

[0102] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Thermobifida alba o Thermobifida fusca (conocida anteriormente como Thermomonaspora fusca).

[0103] El progenitor puede ser una lipasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una lipasa de levadura tal como una lipasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia; o una lipasa de un hongo filamentoso tal como una lipasa de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolipocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.

[0104] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0105] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0106] En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Thermomyces lanuginosus, por ejemplo, la lipasa de SEQ ID N.°: 2.

[0107] Se entiende que, para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

[0108] Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0109] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes, que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, el suelo, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, el suelo, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. Un polinucleótido que codifica un progenitor puede obtenerse entonces cribando de forma similar una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez ha sido detectado con la sonda(s) un polinucleótido que codifica un progenitor, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que conocen los expertos en la materia (veáse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Partículas de lipasa

[0110] Las variantes de lipasa comprendidas en la película hidrosoluble de la invención pueden estar presentes como partículas de lipasa. Las partículas de lipasa pueden contener incluso una o más Enzimas adicionales, como se describe más adelante.

[0111] Las partículas de lipasa son cualquier forma de variante de lipasa en una forma sólida particulada. Esta puede ser como cristales de lipasa, precipitado de lipasa, lipasa pulverizada o liofilizada o cualquier forma de lipasa granulada, bien como un polvo o bien una suspensión en líquido. Típicamente, el tamaño de partícula, medido como el diámetro esférico equivalente (tamaño de partícula promedio basado en el volumen), de las partículas de lipasa es inferior a 2 mm, preferiblemente inferior a 1 mm, inferior a 0,5 mm, inferior a 0,25 mm o inferior a 0,1 mm; y por encima de 0,05 jm, preferiblemente superior a 0,1 jm, superior a 0,5 jm, superior a 1 |_im, superior a 5 jm o superior a 10 jm.

[0112] En una forma de realización preferida, el tamaño de partícula de las partículas de lipasa es de 0,5 jm a 100 |jm.

[0113] Las partículas de lipasa contienen al menos un 1% p/p de proteína lipasa, preferiblemente al menos un 5% p/p de proteína lipasa, al menos un 10% p/p de proteína lipasa, al menos un 20% p/p de proteína lipasa, al menos un 30% p/p de proteína lipasa, al menos un 40% p/p de proteína lipasa, al menos un 50% p/p de proteína lipasa, al menos un 60% p/p de proteína lipasa, al menos un 70% p/p de proteína lipasa, al menos un 80% p/p de proteína lipasa o al menos un 90% p/p de proteína lipasa.

[0114] En una forma de realización preferida, las partículas de lipasa son cristales de lipasa o la proteína lipasa está en una forma cristalina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0115] La cristalización de la enzima se puede realizar de varias formas, tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, como se describe en WO 91/09943 o WO 94/22903).

[0116] La lipasa puede formularse en la partícula de lipasa tal como se conoce en la técnica para formulaciones enzimáticas sólidas, tales como formulaciones para reducir el polvo, mejorar la estabilidad y/o modificar la velocidad de liberación de la enzima. La partícula de lipasa también se puede formular en una matriz o recubrir con agentes que inhiben la disolución de la partícula enzimática en la solución de PVOH/película usada para preparar la película hidrosoluble.

[0117] Las moléculas de lipasa en la superficie de las partículas de lipasa también pueden ser reticuladas, como CLEC (cristales de enzima reticulados) o CLEA (agregado de enzima reticulado).

Película hidrosoluble

[0118] Las películas hidrosolubles, los constituyentes opcionales para uso en estas y los métodos de producción de las mismas son bien conocidos en la técnica. En una clase de formas de realización, la película hidrosoluble incluye PVOH. El PVOH es una resina sintética preparada generalmente por la alcoholisis, denominada normalmente hidrólisis o saponificación, de acetato de polivinilo. El PVOH completamente hidrolizado, en el que prácticamente todos los grupos de acetato se han convertido en grupos alcohol, es un polímero fuertemente enlazado por puentes de hidrógeno y altamente cristalino que se disuelve solo en agua caliente - a más de aproximadamente 140°F (60°C). Si se permite que un número suficiente de grupos de acetato permanezcan tras la hidrólisis de acetato de polivinilo, el polímero PVOH entonces conocido como parcialmente hidrolizado, se enlaza por puentes de hidrógeno de manera más débil y es menos cristalino y es soluble en agua fría - a menos de aproximadamente 50°F (10°C). Una película intermedia soluble en agua fría/caliente puede incluir, por ejemplo, PVOH sometido a una hidrólisis parcial intermedia (por ejemplo, con grados de hidrólisis de aproximadamente un 94% a aproximadamente un 98%), y es fácilmente soluble solo en agua templada - por ejemplo, disolución rápida a temperaturas de aproximadamente 40°C y superiores. Tanto el PVOH hidrolizado completamente como el hidrolizado parcialmente se conocen comúnmente como homopolímeros de PVOH, aunque el tipo parcialmente hidrolizado es técnicamente un copolímero de alcohol de vinilo y acetato de vinilo.

[0119] El grado de hidrólisis del PVOH incluido en las películas hidrosolubles de la presente descripción puede ser de aproximadamente un 75% a aproximadamente un 99%. A medida que el grado de hidrólisis se reduce, una película hecha de la resina tendrá menor resistencia mecánica pero solubilidad más rápida a temperaturas inferiores a aproximadamente 20°C. A medida que el grado de hidrólisis aumenta, una película hecha de la resina tenderá a ser más resistente mecánicamente y la termoformabilidad tenderá a reducirse. El grado de hidrólisis del PVOH se puede elegir de manera que la hidrosolubilidad de la resina sea dependiente de la temperatura, y así también se influye sobre la solubilidad de una película hecha de la resina, agente compatibilizante y constituyentes adicionales. En una clase de formas de realización, la película es soluble en agua fría. Una película soluble en agua fría, soluble en agua a una temperatura inferior a 10°C, puede incluir PVOH con un grado de hidrólisis en un intervalo de aproximadamente un 75% a aproximadamente un 90%, o en un intervalo de aproximadamente un 80% a aproximadamente un 90%, o en un intervalo de aproximadamente un 85% a aproximadamente un 90%. En otra clase de formas de realización la película es soluble en agua caliente. Una película soluble en agua caliente, soluble en agua a una temperatura de al menos aproximadamente 60°C, puede incluir PVOH con un grado de hidrólisis de al menos aproximadamente un 98%.

[0120] Otras resinas filmógenas para ser usadas además de o como alternativa al PVOH pueden incluir, pero de forma no limitativa, alcoholes de polivinilo modificados, poliacrilatos, copolímeros de acrilato hidrosoluble, poliacrilatos, poliacrilamidas, polivinilpirrolidona, pululano, polímeros naturales hidrosolubles que incluyen, pero de forma no limitativa, goma guar, goma xantana, carragenano y almidón, derivados de polímero hidrosoluble que incluyen, pero de forma no limitativa, almidón etoxilado y almidón hidroxipropilado, poli(acrilamido-2- metilpropanosulfonato de sodio), polimonometilmaleato, copolímeros de los mismos, y combinaciones de cualquiera de los anteriormente mencionados. En una clase de formas de realización, la resina filmógena es un terpolímero consistente en alcohol vinílico, acetato de vinilo y acrilamido-2-metilpropanosulfonato de sodio. De forma imprevista, las películas hidrosolubles basadas en un terpolímero de alcohol vinílico, acetato de vinilo y acrilamido-2-metilpropanosulfonato de sodio han demostrado un alto porcentaje de recuperación de enzima.

[0121] La resina hidrosoluble se puede incluir en la película hidrosoluble en cualquier cantidad adecuada, por ejemplo, una cantidad en un intervalo de aproximadamente un 35% en peso a aproximadamente un 90% en peso. La proporción en peso preferida de la cantidad de la resina hidrosoluble en comparación con la cantidad combinada de todas las enzimas, estabilizadores de enzimas y aditivos secundarios puede ser cualquier proporción adecuada, por ejemplo, una proporción en un intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a 3, o aproximadamente 1 a 2.

[0122] Las resinas hidrosolubles para uso en las películas descritas en la presente (incluyendo, pero de forma no limitativa, resinas PVOH) pueden estar caracterizadas por cualquier viscosidad adecuada para las propiedades de película deseadas, opcionalmente una viscosidad en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 30,0 cP, o aproximadamente 10,0 cP a aproximadamente 25 cP. La viscosidad de una resina 5 PVOH se determina midiendo una solución recién preparada utilizando un viscosímetro de tipo Brookfield LV con adaptador UL como se describe en el estándar británico EN ISO 15023-2:2006, anexo E, método de ensayo de Brookfield. Es práctica internacional establecer la viscosidad de soluciones acuosas de alcohol polivinílico al 4% a 20°C. Todas las viscosidades de PVOH especificadas en la presente en cP deberían entenderse referidas a la viscosidad de una solución acuosa de alcohol polivinílico al 4% a 20°C, a menos que se especifique lo contrario.

10 [0123] Es bien sabido en la técnica que la viscosidad de una resina PVOH está correlacionada con el peso

molecular (PM) promedio de la misma resina PVOH, y frecuentemente la viscosidad se usa como una represantación del PM. Así, el peso molecular promedio de la resina hidrosoluble puede estar opcionalmente en un intervalo de aproximadamente 35.000 a aproximadamente 190.000, o de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 160.000. El peso molecular de la resina solo necesita ser suficiente para permitir que esta sea 15 moldeada por técnicas adecuadas para formar una fina película plástica.

[0124] Las películas hidrosolubles según la presente descripción pueden incluir otros constituyentes aditivos opcionales que incluyen, pero de forma no limitativa, plastificantes, tensioactivos, antiespumantes, formadores de película, agentes antibloqueo, agentes de liberación interna, agentes antiamarilleo y otros constituyentes funcionales, por ejemplo, en cantidades adecuadas para su finalidad prevista.

20 [0125] El agua es reconocida como un plastificante muy eficaz para el PVOH y otros polímeros; sin embargo, la

volatilidad del agua limita su utilidad, ya que las películas poliméricas necesitan tener al menos alguna resistencia (robustez) a una variedad de condiciones ambientales que incluyen humedades relativas altas y bajas. La glicerina es mucho menos volátil que el agua y se ha establecido como un plastificante eficaz para el PVOH y otros polímeros. La glicerina u otros plastificantes líquidos de este tipo pueden causar por sí mismos 25 "sudado" y grasitud superficiales si la proporción usada en la formulación de la película es demasiado alta. Esto puede crear problemas en una película, tales como sensación inaceptable a la mano del consumidor e incluso el bloqueo de la película en el rollo o en pilas de láminas si el sudado no se mitiga de alguna manera, como, por ejemplo, empolvando la superficie. Esto podría caracterizarse como sobreplastificación. Sin embargo, si se añade demasiado poco plastificante a la película, la película puede carecer de ductilidad y flexibilidad suficientes 30 para muchos usos finales, por ejemplo, para transformarse en un formato de uso final tal como bolsas.

[0126] Los plastificantes para uso en películas hidrosolubles de la presente descripción incluyen, pero de forma no limitativa, sorbitol, glicerol, diglicerol, propilenglicol, etilenglicol, dietilenglicol, trietilenglicol, tetraetilenglicol, glicoles de politileno de hasta PM 400, 2-metil-1,3-propanodiol, ácido láctico, monoacetina, triacetina, citrato de trietilo, 1,3-butanediol, trimetilolpropano (TMP), triol de poliéter y combinaciones de los mismos. Los polioles, 35 como se ha descrito anteriormente, son generalmente útiles como plastificantes. A medida que se usa menos plastificante, la película puede volverse más frágil, mientras que a medida que se usa más plastificante, la película puede perder resistencia a la tracción. Los plastificantes se pueden incluir en las películas hidrosolubles en una cantidad en un intervalo de aproximadamente 25 phr a aproximadamente 50 phr, o de aproximadamente 30 phr a aproximadamente 45 phr, o de aproximadamente 32 phr a aproximadamente 42 phr, por ejemplo.

40 [0127] Los tensioactivos para uso en películas hidrosolubles son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente,

los tensioactivos se incluyen para ayudar en la dispersión de la solución de resina tras el fundido. Los tensioactivos adecuados para las películas hidrosolubles de la presente descripción incluyen, pero de forma no limitativa, sulfosuccinatos de dialquilo, ésteres de ácidos grasos lactilados de glicerol y propilenglicol, ésteres lactílicos de ácidos grasos, alquilsulfatos de sodio, polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, 45 alquiléteres de polietilenglicol, lecitina, ésteres de ácidos grasos acetilados de glicerol y propilenglicol, lauril sulfato de sodio, ésteres acetilados de ácidos grasos, óxido de miristildimetilamina, cloruro amónico de alquilo de sebo de trimetil, compuestos de amonio cuaternario, sales derivadas y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Así, los tensioactivos se pueden incluir en las películas hidrosolubles en una cantidad inferior a aproximadamente 2 phr, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 phr, o menos de aproximadamente 0,5 phr, 50 por ejemplo.

[0128] Un tipo de componente secundario contemplado para su uso es un antiespumante. Los antiespumantes pueden ayudar a la fusión de burbujas de espuma. Los antiespumantes adecuados para uso en películas hidrosolubles según la presente descripción incluyen, pero de forma no limitativa, sílices hidrofóbicas, por ejemplo, dióxido de silicio o sílice pirógena en tamaños de partícula fina, incluyendo antiespumantes Foam 55 Blast® disponibles en Emerald Performance Materials, incluyendo Foam Blast® 327, Foam Blast® Blast® UVD 163, Foam Blast® 269, Foam Blast® 338, Foam Blast® 290, Foam Blast® 332, Foam Blast® 349, Foam Blast® 550 y Foam Blast® 339, que son antiespumantes de aceite no mineral patentados. En formas de realización, los antiespumantes se pueden usar en una cantidad de 0,5 phr, o menos, por ejemplo, 0,05 phr, 0,04 phr, 0,03 phr,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

0,02 phr o 0,01 phr. Preferiblemente, se evitarán cantidades significativas de dióxido de silicio para evitar el blanqueamiento por estrés.

[0129] Los procesos para fabricar artículos hidrosolubles, incluidas películas, incluyen fusión, moldeo por soplado, extrusión y extrusión-soplado, como se conoce en la técnica. Una clase contemplada de formas de realización se caracteriza por la película hidrosoluble descrita en la presente que se forma por fusión, por ejemplo, por incorporación de los constituyentes descritos en la presente en agua para crear una mezcla acuosa, por ejemplo, una solución con sólidos opcionalmente dispersos, aplicando la mezcla a una superficie y secando el agua para crear una película. De forma similar, se pueden formar otras composiciones por secado de la mezcla mientras está confinada en una forma deseada.

[0130] En una clase contemplada de formas de realización, la película hidrosoluble se forma fundiendo una mezcla hidrosoluble donde la mezcla hidrosoluble se prepara según los pasos siguientes:

a) se proporciona una mezcla de resina hidrosoluble, agua y cualquier aditivo opcional a excepción de los plastificantes;

b) se hierve la mezcla durante 30 minutos;

c) se desgasifica la mezcla en un horno a una temperatura de al menos 40°C; opcionalmente en un intervalo de 40°C a 70°C, por ejemplo, aproximadamente 65°C;

d) se añaden una o más enzimas, plastificante y más agua a la mezcla a una temperatura de 65°C o menos; y

e) se agita la mezcla sin vórtice hasta que la mezcla sea sustancialmente uniforme en color y consistencia; opcionalmente durante un período de tiempo en un intervalo de 30 a 90 minutos, opcionalmente al menos 1 hora; y

f) se funde la mezcla rápidamente después del período de tiempo de agitación (por ejemplo, dentro de 4 horas o 2 horas o 1 hora).

[0131] Si la enzima se añade a la mezcla demasiado pronto, por ejemplo, con los aditivos secundarios o la resina, la actividad de la enzima puede disminuir. Sin pretensión de adherirse a ninguna teoría particular, se cree que la ebullición de la mezcla con la enzima lleva a la desnaturalización de la enzima y el almacenamiento en la solución durante largos períodos de tiempo también lleva a una reducción en la actividad enzimática.

[0132] En una clase de formas de realización, se mantiene una actividad enzimática elevada en la película hidrosoluble según la presente descripción mediante el secado rápido de las películas en condiciones de moderadas a suaves. Como se utiliza en la presente, el secado rápido se refiere a un tiempo de secado inferior a 24 horas, opcionalmente inferior a 12 horas, opcionalmente inferior a 8 horas, opcionalmente inferior a 2 horas, opcionalmente inferior a 1 hora, opcionalmente inferior a 45 minutos, opcionalmente inferior a 30 minutos, opcionalmente inferior a 20 minutos, opcionalmente inferior a 10 minutos, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente 6 minutos a aproximadamente 10 minutos, u 8 minutos. Como se utiliza en la presente, condiciones de moderadas a suaves se refieren a temperaturas de secado inferiores a 170°F (77°C), opcionalmente en un intervalo de aproximadamente 150°F a aproximadamente 170°F (aproximadamente 66°C a aproximadamente 77°C), por ejemplo, 165°F (74°C). A medida que la temperatura de secado aumenta, las enzimas tienden a desnaturalizarse más rápido, mientras que a medida que la temperatura de secado disminuye, el tiempo de secado aumenta, exponiendo así las enzimas a la solución durante un largo periodo de tiempo.

[0133] La película es útil para crear un paquete que contenga una composición, por ejemplo, composiciones de lavado de ropa o lavavajillas, formando así una bolsa. La película descrita en la presente también puede usarse para fabricar un paquete con dos o más compartimentos hechos de la misma película o en combinación con películas de otros materiales poliméricos. Por ejemplo, se pueden obtener películas adicionales por fusión, moldeo por soplado, extrusión o extrusión-soplado del mismo o de distinto material polimérico, como se conoce en la técnica. En un tipo de forma de realización, los polímeros, copolímeros o derivados de los mismos adecuados para uso como película adicional se seleccionan de alcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidona, óxidos de polialquileno, ácido poliacrílico, celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa, acetatos de polivinilo, ácidos y sales policarboxílicos, poliaminoácidos o péptidos, poliamidas, poliacrilamida, copolímeros de ácidos maleico/acrílico, polisacáridos incluidos almidón y gelatina, gomas naturales tales como xantana, y carragenanos. Por ejemplo, los polímeros se pueden seleccionar de poliacrilatos y copolímeros de acrilato hidrosolubles, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, dextrina, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos, y combinaciones de los mismos, o se pueden seleccionar de alcoholes polivinílicos, copolímeros de alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), y combinaciones de los mismos.

[0134] Las bolsas y/o paquetes de la presente descripción comprenden al menos un compartimento sellado. Así, las bolsas pueden comprender un compartimento único o compartimentos múltiples. Las bolsas pueden tener

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

zonas con y sin enzimas. En formas de realización con compartimentos múltiples, cada compartimento puede contener composiciones idénticas y/o diferentes. Sucesivamente, las composiciones pueden tomar cualquier forma adecuada incluidas, pero de forma no limitativa, líquido, sólido y combinaciones de los mismos (por ejemplo, un sólido suspendido en un líquido). En algunas formas de realización, las bolsas comprenden un primer, un segundo y un tercer compartimento, cada uno de los cuales contiene respectivamente una primera, una segunda y una tercera composición diferente. En algunas formas de realización, las composiciones pueden ser visualmente distintas, como se describe en EP 2258820.

[0135] Los compartimentos de bolsas y/o paquetes multicompartimentales pueden ser del mismo o de diferente tamaño(s) y/o volumen(es). Los compartimentos de las presentes bolsas multicompartimentales pueden separarse o unirse de cualquier manera adecuada. En algunas formas de realización, el segundo y/o el tercero y/o los subsiguientes compartimentos están superpuestos al primer compartimento. En una forma de realización, el tercer compartimento puede superponerse al segundo compartimento, que se superpone a su vez al primer compartimento en una configuración de sándwich. Alternativamente, los compartimentos segundo y tercero pueden superponerse al primer compartimento. Sin embargo, también se prevee igualmente que el primer, el segundo y, opcionalmente, el tercero y los subsiguientes compartimentos se puedan unir uno a otro en una relación lateral contigua. Los compartimentos se pueden envasar en una cadena, siendo cada compartimento individualmente separable por una línea de perforación. Por lo tanto, cada compartimento puede rasgarse de manera individual del resto de la cadena por el usuario final.

[0136] En algunas formas de realización, las bolsas y/o paquetes multicompartimentales incluyen tres compartimentos consistentes en un primer compartimento grande y dos compartimentos menores. Los compartimentos menores segundo y tercero se superponen al primer compartimento más grande. El tamaño y la geometría de los compartimentos se eligen de manera que se pueda conseguir esta disposición. La geometría de los compartimentos puede ser igual o diferente. En algunas formas de realización, el segundo y, opcionalmente, el tercer compartimento, tienen cada uno una geometría y forma diferentes en comparación con el primer compartimento. En estas formas de realización, el segundo y, opcionalmente, el tercer compartimento, están dispuestos con un diseño sobre el primer compartimento. El diseño puede ser decorativo, educativo o ilustrativo, por ejemplo, para ilustrar un concepto o instrucción, y/o usarse para indicar el origen del producto. En algunas formas de realización, el primer compartimento es el más grande y tiene dos caras grandes selladas alrededor del perímetro, y el segundo compartimento es menor y cubre menos de aproximadamente un 75% o menos de aproximadamente un 50% del área superficial de una cara del primer compartimento. En formas de realización donde hay un tercer compartimento, la estructura mencionada anteriormente puede ser igual, pero los compartimentos segundo y tercero cubren menos de aproximadamente un 60%, o menos de aproximadamente un 50% o menos de aproximadamente un 45% del área superficial de una cara del primer compartimento.

[0137] Las bolsas y/o paquetes de la presente descripción pueden comprender una o más películas diferentes. Por ejemplo, en las formas de realización de compartimento único, el paquete puede estar hecho de una pared que se pliega sobre sí misma y está sellada en los bordes, o alternativamente, de dos paredes que se sellan juntas en los bordes. En las formas de realización de compartimento múltiple, el paquete puede estar hecho de una o más películas de manera que cualquier compartimento de paquete dado puede comprender paredes hechas de una única película o de múltiples películas de composiciones diferentes. En una forma de realización, una bolsa multicompartimental comprende al menos tres paredes: una pared superior externa; una pared inferior externa; y una pared divisoria. La pared superior externa y la pared inferior externa están generalmente opuestas y forman el exterior de la bolsa. La pared divisoria está en el interior de la bolsa y se fija a las paredes externas generalmente opuestas a lo largo de una línea de sellado. La pared divisoria separa el interior de la bolsa multicompartimental en, al menos, un primer compartimento y un segundo compartimento. En una clase de formas de realización, la pared divisoria puede ser la única película que contiene enzima, minimizando así la exposición del consumidor a las enzimas.

[0138] Las bolsas y los paquetes pueden fabricarse utilizando cualquier equipo y método adecuados. Por ejemplo, las bolsas de compartimento único pueden fabricarse utilizando llenado vertical de molde, llenado horizontal de molde o técnicas de llenado de tambor giratorio comúnmente conocidas en la técnica. Tales procesos pueden ser continuos o intermitentes. La película puede humedecerse y/o calentarse para aumentar su maleabilidad. El método también puede implicar el uso de vacío para atraer la película a un molde adecuado. El vacío usado para atraer la película al molde se puede aplicar durante aproximadamente 0,2 a aproximadamente 5 segundos, o aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 segundos, o aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 segundos, una vez que la película está sobre la porción horizontal de la superficie. Este vacío puede ser tal que proporcione una infrapresión en un intervalo de 10 a 1000 mbar, o en un intervalo de 100 a 600 mbar, por ejemplo.

[0139] Los moldes, en los que pueden fabricarse los paquetes, pueden tener cualquier forma, longitud, anchura y profundidad, dependiendo de las dimensiones requeridas de las bolsas. Los moldes también pueden variar de uno a otro en tamaño y forma, si se desea. Por ejemplo, el volumen de las bolsas finales puede ser de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

aproximadamente 5 a aproximadamente 300 ml, o aproximadamente 10 a 150 ml, o aproximadamente 20 a aproximadamente 100 ml, y los tamaños de molde se ajustan de manera correspondiente.

[0140] En una forma de realización, el paquete incluye un primer y un segundo compartimento sellados. El segundo compartimento está en una relación generalmente superpuesta con el primer compartimento sellado, de manera que el segundo compartimento sellado y el primer compartimento sellado comparten una pared divisoria interior a la bolsa.

[0141] En una forma de realización, el paquete con un primer y un segundo compartimento incluye además un tercer compartimento sellado. El tercer compartimento sellado está en una relación generalmente superpuesta con el primer compartimento sellado, de manera que el tercer compartimento sellado y el primer compartimento sellado comparten una pared divisoria interior a la bolsa.

[0142] En varias formas de realización, la primera composición y la segunda composición se seleccionan de entre una de las siguientes combinaciones: líquido, líquido; líquido, polvo; polvo, polvo; y polvo, líquido.

[0143] En varias formas de realización, las composiciones primera, segunda y tercera se seleccionan de entre una de las siguientes combinaciones: sólido, líquido, líquido y líquido, líquido, líquido.

[0144] En una forma de realización, el compartimento único o la pluralidad de compartimentos sellados contiene una composición. La pluralidad de compartimentos puede contener cada uno la misma composición o una diferente. La composición se selecciona de un líquido, un sólido o una combinación de los mismos.

[0145] El calor se puede aplicar a la película en el proceso comúnmente conocido como termoformado. El calor se puede aplicar utilizando cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la película se puede calentar directamente pasándola bajo un elemento calefactor o a través de aire caliente, antes de alimentarla sobre una superficie o una vez esté en una superficie. Alternativamente, se puede calentar de manera indirecta, por ejemplo, calentando la superficie o aplicando un elemento caliente sobre la película. La película se puede calentar utilizando una luz infrarroja. La película se puede calentar a una temperatura de al menos 50°C, por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150°C, de aproximadamente 50 a aproximadamente 120°C, de aproximadamente 60 a aproximadamente 130°C, de aproximadamente 70 a aproximadamente 120°C o de aproximadamente 60 a aproximadamente 90°C.

[0146] Alternativamente, la película se puede humectar por cualquiera de los medios adecuados, por ejemplo directamente mediante la pulverización de un agente humectante (incluidos agua, una solución de la composición de la película, un plastificante para la composición de la película o cualquier combinación de los anteriores) sobre la película, antes de alimentarla sobre la superficie o una vez esté en la superficie, o indirectamente humectando la superficie o aplicando un elemento humédo sobre la película.

[0147] Una vez que una película ha sido calentada y/o humectada, se puede estirar en un molde apropiado, preferiblemente utilizando vacío. La película se puede termoformar con una relación de estiramiento de, al menos, aproximadamente 1,5, por ejemplo, y opcionalmente hasta una relación de estiramiento de 2, por ejemplo. El relleno de la película moldeada se puede realizar utilizando cualquier medio adecuado. En algunas formas de realización, el método preferido dependerá de la forma del producto y la velocidad de relleno requerida. En algunas formas de realización, la película moldeada se rellena mediante técnicas de relleno en línea. Los paquetes rellenos abiertos se cierran entonces formando las bolsas, utilizando una segunda película, por cualquier método adecuado. Esto se puede realizar mientras están en posición horizontal y en movimiento continuo constante. El cierre se puede realizar alimentando continuamente una segunda película, preferiblemente hidrosoluble, sobre los paquetes abiertos y, preferiblemente, sellando la primera y la segunda película juntas, típicamente en la zona entre los moldes y, así, entre los paquetes.

[0148] Puede utilizarse cualquier método adecuado de sellado del paquete y/o los compartimentos individuales del mismo. Los ejemplos no limitativos de tales medios incluyen termosellado, soldadura por disolvente, sellado con disolvente o húmedo y combinaciones de los mismos. El paquete hidrosoluble y/o los compartimentos individuales del mismo pueden ser termosellados a una temperatura de al menos 200°F (93°C), por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente 220°F (aproximadamente 105°C) a aproximadamente 290°F (aproximadamente 145°C), o de aproximadamente 230°F (aproximadamente 110°C) a aproximadamente 280°F (aproximadamente 140°C). Típicamente, solo el área que va a formar el sellado se trata con calor o disolvente. El calor o disolvente se pueden aplicar por cualquier método, típicamente en el material de cierre y, típicamente, solo en las áreas que van a formar el sellado. Si es usa la soldadura o el sellado con disolvente o húmedo, puede preferirse aplicar también calor. Los métodos preferidos de soldadura/sellado con disolvente o húmedo incluyen aplicar disolvente selectivamente sobre el área entre los moldes o en el material de cierre, por ejemplo, pulverizándolo o imprimiéndolo sobre estas áreas y luego aplicando presión sobre las mismas para formar el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

sellado. Pueden usarse, por ejemplo, rodillos y cintas de sellado como se ha descrito anteriormente (opcionalmente proporcionando también calor).

[0149] Las bolsas formadas pueden cortarse luego con un dispositivo de corte. El corte se puede realizar utilizando cualquier método conocido. Puede preferirse que el corte se haga también de manera continua, y, preferiblemente, con velocidad constante y, preferiblemente, mientras está en posición horizontal. El dispositivo de corte puede, por ejemplo, ser un elemento agudo o un elemento caliente o un láser, donde, en los últimos casos, el elemento caliente o láser “quema” a través de la película/área de sellado.

[0150] Los compartimentos diferentes de bolsas multicompartimentales pueden fabricarse juntas de manera contigua, donde las bolsas unidas resultantes pueden o no separarse mediante corte. Alternativamente, los compartimentos pueden fabricarse separadamente.

[0151] En algunas formas de realización, las bolsas pueden fabricarse de acuerdo con un proceso que incluye los siguientes pasos:

a) formación de un primer compartimento (como se ha descrito anteriormente);

b) formación de un entrante dentro de parte o de todo el compartimento cerrado formado en el paso a), para generar un segundo compartimento moldeado superpuesto sobre el primer compartimento;

c) relleno y cerrado de los segundos compartimentos mediante una tercera película;

d) sellado de las películas primera, segunda y tercera; y

e) corte de las películas para producir una bolsa multicompartimental.

[0152] El entrante formado en el paso b) se puede conseguir aplicando vacío al compartimento preparado en el paso a).

[0153] En algunas formas de realización, el segundo y/o tercer compartimento(s) puede fabricarse en un paso separado y luego combinarse con el primer compartimento como se describe en EP 2088187 o WO 2009/152031.

[0154] En otras formas de realización, las bolsas pueden fabricarse de acuerdo con un proceso que incluye los siguientes pasos:

a) formación de un primer compartimento, opcionalmente utilizando calor y/o vacío, utilizando una primera película en una primera máquina conformadora;

b) relleno del primer compartimento con una primera composición;

c) en una segunda máquina conformadora, deformado de una segunda película, utilizando opcionalmente calor y vacío, para hacer un segundo y, opcionalmente, un tercer compartimento moldeado;

d) relleno del segundo y, opcionalmente, el tercer compartimento;

e) sellado del segundo y, opcionalmente, el tercer compartimento utilizando una tercera película;

f) colocación del segundo y, opcionalmente, el tercer compartimento, sellados, sobre el primer compartimento;

g) sellado del primer, segundo y, opcionalmente, tercer compartimento; y

h) corte de las películas para producir una bolsa multicompartimental.

[0155] Las máquinas conformadoras primera y segunda se pueden seleccionar en función de su idoneidad para ejecutar el proceso anterior. En algunas formas de realización, la primera máquina conformadora es preferiblemente una máquina conformadora horizontal, y la segunda máquina conformadora es preferiblemente una máquina conformadora de tambor giratorio, preferiblemente localizada encima de la primera máquina conformadora.

[0156] Se debe entender que, mediante el uso de estaciones de alimentación apropiadas, es posible producir bolsas multicompartimentales que incorporan varias composiciones diferentes o distintivas y/o composiciones líquidas, en gel o en pasta diferentes o distintivas.

Composición del detergente

[0157] La película hidrosoluble con lipasa de la invención se puede utilizar para formar un compartimento que comprende una composición detergente, encapsulando así la composición detergente.

[0158] La composición detergente puede ser una composición detergente sólida o líquida. Preferiblemente, la composición detergente es una composición detergente líquida con un estado físico, que no es sólido (o gaseoso). Puede ser un líquido colable, un gel colable o un gel no colable. Puede ser isotrópico o estructurado, preferiblemente isotrópico. Puede ser una formulación útil para lavado en lavadoras automáticas o para lavado a

5 mano.

[0159] Los líquidos, incluyendo sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles se pueden incluir en un detergente líquido. Un detergente líquido puede contener 0-30% de disolvente orgánico. Un detergente líquido puede incluso ser no acuoso, o sustancialmente no acuoso, donde el contenido de agua es inferior al 15%, preferiblemente inferior al 10%, más preferiblemente inferior al 6%, más preferiblemente inferior al 4%, más

10 preferiblemente inferior al 2% y, de la forma más preferible, inferior al 1 %.

[0160] Los constituyentes del detergente se pueden separar físicamente entre sí mediante compartimentos en bolsas hidrosolubles. Así puede evitarse la interacción negativa entre componentes en el almacenamiento. Los diferentes perfiles de disolución de cada compartimento también pueden dar lugar a la disolución retardada de componentes seleccionados en la solución de lavado.

15 [0161] La composición detergente puede tomar la forma de un producto de dosis unitaria. Un producto de dosis

unitaria es el envasado de una dosis individual en un contenedor no reutilizable. Su uso en detergentes para lavado de ropa y lavavajillas va en aumento. Un producto de dosis unitaria de detergente es el envasado (por ejemplo, en una bolsa hecha de una película hidrosoluble) de la cantidad de detergente usada para un único lavado.

20 [0162] Las bolsas pueden estar en cualquier estado y ser de cualquier forma y material que sean adecuados

para la retención de la composición, por ejemplo, sin permitir la liberación de la composición desde la bolsa antes del contacto con el agua. La bolsa está hecha de película hidrosoluble que incluye un volumen interno. Dicho volumen interno se puede dividir en los compartimentos de la bolsa. Las películas preferidas son materiales poliméricos, preferiblemente polímeros que se forman en una película o lámina. Los polímeros, copolímeros o

25 derivados de los mismos preferidos son poliacrilatos seleccionados y copolímeros de acrilato hidrosoluble, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina de sodio, etilcelulosa, celulosa de hidroxietilo, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilato, de la forma más preferible, copolímeros de alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Preferiblemente, la proporción de polímero en la película, por ejemplo, PVA, es de al menos aproximadamente el 60%. El peso molecular medio preferido será típicamente de

30 aproximadamente 20.000 a aproximadamente 150.000. Las películas también pueden tener composiciones de mezcla que comprenden mezclas degradables hidrolíticamente e hidrosolubles de polímeros tales como polilactida y alcohol polivinílico con plastificantes como glicerol, etilenglicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos. Las bolsas pueden comprender una composición de limpieza de ropa o parte de sus componentes en estado sólido y/o una composición de limpieza o parte de sus componentes en estado líquido separados por

35 la película hidrosoluble. La composición del compartimento para componentes líquidos puede diferir de la de los compartimentos que contienen sólidos (veáse por ejemplo, US 2009/0011970).

[0163] La elección de los componentes del detergente puede incluir, para cuidado textil, la consideración del tipo de tejido que va a lavarse, el tipo y/o grado de suciedad, la temperatura a la que la se va a lavar y la formulación del producto detergente. Aunque los componentes mencionados a continuación se categorizan mediante un

40 encabezado general según una funcionalidad particular, esto no ha de interpretarse como una limitación, ya que un componente puede comprender funcionalidades adicionales, como apreciará un experto en la materia.

[0164] La elección de componentes adicionales depende de la habilidad del experto e incluye constituyentes convencionales, incluidos los componentes ilustrativos no limitativos expuestos a continuación.

Tensioactivos

45 [0165] La composición detergente puede comprender uno o más tensioactivos, que pueden ser aniónicos y/o

catiónicos y/o no iónicos y/o semipolares y/o zwitteriónicos, o una mezcla de los mismos. En una forma de realización particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioactivos aniónicos. El/los tensioactivo(s) está(n) presente(s= típicamente en una proporción de aproximadamente un 0,1% a un 60% en peso, tal como aproximadamente de un 1% a aproximadamente un

50 40%, o aproximadamente de un 3% a aproximadamente un 20%, o aproximadamente de un 3% a

aproximadamente e un 10%. El/los tensioactivo(s) se elige(n) en función de la aplicación de limpieza deseada, e incluye cualquier tensioactivo(s) convencional conocido en la técnica. Puede usarse cualquier tensioactivo conocido en la técnica para uso en detergentes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0166] Cuando se incluya en el mismo, el detergente normalmente contendrá de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 40% en peso, tal como de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 30%, incluido de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15%, o de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 25% de un tensioactivo aniónico. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos aniónicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS), isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanosulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, alquilsulfatos (AS) tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfatos de alcohol graso (FAS), sulfatos de alcohol primario (PAS), éter sulfatos de alcohol (AES o AEOS o FES, conocidos también como etoxisulfatos alcohólicos o sulfatos de éter de alcohol graso), alcanosulfonatos secundarios (SAS), sulfonatos de parafina (PS), sulfonatos de éster, ésteres de glicerol de ácido graso sulfonatado, ésteres metílicos de ácido alfa-sulfo graso (alfa-SFMe o SES) incluyendo metiléster sulfonato (MES), ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil succínico (DTSA), derivados de ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres de ácido sulfosuccínico o jabón, y combinaciones de los mismos.

[0167] Cuando se incluya en el mismo, el detergente normalmente contendrá de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 10% en peso de un tensioactivo catiónico. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos catiónicos incluyen alquildimetiletanolamina cuaternaria (ADMEAQ), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de amonio cuaternario alcoxilado (AQA) y combinaciones de los mismos.

[0168] Cuando se incluya en el mismo, el detergente normalmente contendrá de aproximadamente un 0,2% a aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 30%, en particular de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 20%, de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 10%, tal como de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 5%, o de aproximadamente un 8% a aproximadamente un 12%. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos no iónicos incluyen etoxilatos de alcohol (AE o AEO), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos propoxilados (PFA), ésteres alquílicos de ácido graso alcoxilado, tales como ésteres alquílicos de ácido graso etoxilado y/o propoxilado, etoxilatos de alquilfenol (APE), etoxilatos de nonilfenol (NPE), alquilpoliglucósidos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graso (FAM), dietanolamidas de ácido graso (FADA), monoetanolamidas de ácido graso etoxilado (EFAM), monoetanolamidas de ácido graso propoxilado (PFAM), alquil polihidroxiamidas de ácido graso, o derivados N-alquílicos y N-acílicos de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácido graso, FAGA), así como productos disponibles bajo los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos.

[0169] Cuando se incluya en el mismo, el detergente normalmente contendrá de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 20% en peso de un tensioactivo semipolar. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos semipolares incluyen óxidos de amina (AO) tales como óxido de alquildimetilamina, N-(alquilo de coco)-N,N- dimetilamina y óxido de N-(alquilo de sebo)-N,N-bis(2-hidroxietil)amina, alcanolamidas de ácidos grasos y alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, y combinaciones de los mismos.

[0170] Cuando se incluyan en el mismo, el detergente normalmente contenerá de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 10% en peso de un surfactante zwitteriónico. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos zwitteriónicos incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína y combinaciones de los mismos.

Hidrótropos

[0171] Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofóbicos en soluciones acuosas (o, por el contrario, sustancias polares en un ambiente no polar). Típicamente, los hidrótropos tienen carácter tanto hidrofílico como hidrofóbico (denominadas propiedades anfifílicas, como se conoce de los tensioactivos); sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea, véase por ejemplo la revisión de Hodgdon y Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121128. Los hidrótropos no muestran una concentración crítica por encima de la cual tenga lugar la autoagregación, como ocurre con los tensioactivos y los lípidos que forman mesofases micelares, laminares u otras mesofases bien definidas. En cambio, muchos hidrótropos muestran un proceso de agregación de tipo continuo, donde los tamaños de los agregados crecen a medida que la concentración aumenta. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fases, la estabilidad y las propiedades coloidales de los sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótropos se usan clásicamente en las industrias farmacéutica, de cuidado personal y alimentaria, hasta para aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones detergentes permiten, por ejemplo, formulaciones más concentradas en tensioactivos (como en el proceso de compactación de detergentes líquidos por eliminación de agua) sin inducir fenómenos no deseados tales como separación de fases o alta viscosidad.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0172] El detergente puede contener 0-5% en peso, tal como de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 5%, o de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 5%, de un hidrótropo. Se puede utilizar cualquier hidrótropo conocido en la técnica para uso en detergentes. Los ejemplos no limitativos de hidrótropos incluyen bencenosulfonato de sodio, p-toluenosulfonato de sodio (STS), xilenosulfonato de sodio (SXS), cumenosulfonato de sodio (SCS), cimenosulfonato de sodio, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sodio, hidroxinaftalenosulfonato de sodio, sulfato de etilhexilo de sodio, y combinaciones de los mismos.

Adyuvantes y coadyuvantes

[0173] La composición detergente puede contener aproximadamente 0-65% en peso, por ejemplo, de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 50% de un adyuvante o coadyuvante de detergencia, o una mezcla de estos. En un detergente de lavavajillas, la proporción de adyuvante es típicamente 40-65%, particularmente 50-65%. El adyuvante y/o coadyuvante puede ser en particular un agente quelante que forme complejos hidrosolubles con iones de Ca y Mg. Puede usarse cualquier adyuvante y/o coadyuvante conocido en la técnica para uso en detergentes de lavado de ropa. Los ejemplos no limitativos de adyuvantes incluyen citratos, zeolitas, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tales como el trifosfato de sodio (STP o STPP), carbonatos tales como el carbonato de sodio, silicatos solubles tales como el metasilicato de sodio, silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst), etanolaminas tales como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, conocida también como iminodietanol), trietanolamina (TEA, conocida también como 2,2',2"-nitrilotrietanol), e carboximetil inulina (CMI), y combinaciones de los mismos.

[0174] La composición detergente también puede contener 0-50% en peso, por ejemplo, de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 30%, de un coadyuvante de detergencia, o una mezcla de estos. La composición detergente puede incluir un coadyuvante solo, o en combinación con un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante de citrato. Los ejemplos no limitativos de coadyuvantes incluyen homopolímeros de poliacrilatos o copolímeros de los mismos, tales como ácido poliacrílico (PAA) o copolímero de ácido acrílico y ácido maleico (PAA/PMA). Otros ejemplos no limitativos incluyen citrato, queladores tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico. Los ejemplos específicos adicionales incluyen ácido 2,2',2"- nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilendiamino-N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metilglicinodiacético (MGDA), ácido glutámico-N,N-ácido diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico (HEDP), ácido etilenediaminotetra(metilenefosfónico) (EDTMPA), ácido dietilentriaminopentakis(metilenfosfónico) (DTMPA o DTPMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-N-ácido monoacético (ASMA), ácido aspártico-N,N-ácido diacético (ASDA), ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), N-(2-sulfometil)-ácido aspártico (SMAS), N-(2-sulfoetil)-ácido aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil)- glutámico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil)-glutámico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), a-alanina-N,N- ácido diacético (a-ALDA), serina-N,N- ácido diacético (SEDA), isoserina-N,N-ácido diacético (ISDA), fenilalanina- N,N-ácido diacético (PHDA), ácido antranílico-N,N-ácido diacético (ANDA), ácido sulfanílico-N,N-ácido diacético (SLDA), taurina-N,N- ácido diacético (TUDA) y sulfometil-N,N-ácido diacético (SMDA), N-(2-hidroxietil)- etilidendiamina-N,N',N'-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), ácido dietilentriaminopenta(metilenfosfónico) (DTPMP), ácido aminotris(metilenefosfónico) (ATMP), y combinaciones y sales derivadas. Otros adyuvantes y/o coadyuvantes ilustrativos se describen en, por ejemplo, WO 09/102854, US 5977053.

Polímeros

[0175] El detergente puede contener 0-10% en peso, por ejemplo 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% o 0,2-1% de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido en la técnica para uso en detergentes. El polímero puede funcionar como un coadyuvante, como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar antirredeposición, protección de fibra, liberación de suciedad, inhibición de transferencia de tinte, limpieza de grasa y/o propiedades antiespumantes. Algunos polímeros pueden tener más de una de las propiedades mencionadas anteriormente y/o más de uno de los motivos mencionados a continuación. Algunos polímeros incluyen, a modo de ejemplo, carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietileneglicol u óxido de polietileno (PEG), polietilenimina etoxilada, carboximetil inulina (CMI), y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, CMC modificada hidrofóbicamente (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) y poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, polivinilimidazol (PVI), N-óxido de polivinilpiridina (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-polivinilimidazol (PVPVI). Otros polímeros ilustrativos incluyen policarboxilatos sulfonatados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y etoxi sulfato diquaternium. Otros polímeros ilustrativos se describen en, por ejemplo, WO 2006/130575 y US 5,955,415. También se consideran las sales de los polímeros anteriormente mencionados.

Agentes de matizado textil

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0176] Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir agentes de matizado textil tales como colorantes o pigmentos, que cuando se formulan en composiciones detergentes pueden depositarse sobre un tejido cuando dicho tejido contacta con una solución de lavado que comprende dichas composiciones detergentes, alterando así el tono de dicho tejido a través de la absorción/reflexión de luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten al menos alguna luz visible. En cambio, los agentes de matizado textil alteran el tono de una superficie al absorber al menos una porción del espectro de luz visible. Los agentes de matizado textil adecuados incluyen colorantes y conjugados de colorante-arcilla y también pueden incluir pigmentos. Los colorantes adecuados incluyen colorantes de molécula pequeña y colorantes poliméricos. Los colorantes de molécula pequeña adecuados incluyen colorantes de molécula pequeña seleccionados del grupo consistente en colorantes incluidos en las clasificaciones de índice de color (C.I.) de azul directo, rojo directo, violeta directo, azul ácido, rojo ácido, violeta ácido, azul básico, violeta básico y rojo básico, o mezclas de los mismos, por ejemplo, como se describe en WO 2005/03274, WO 2005/03275, WO 2005/03276 y EP 1876226 (incorporadas en la presente como referencia). La composición detergente comprende preferiblemente de aproximadamente un 0,00003% en peso a aproximadamente un 0,2% en peso, de aproximadamente un 0,00008% en peso a aproximadamente un 0,05% en peso, o incluso de aproximadamente un 0,0001% en peso a aproximadamente un 0,04% en peso de agente de matizado textil. La composición puede comprender de un 0,0001% en peso a un 0,2% en peso de agente de matizado textil, esto puede preferirse especialmente cuando la composición está en forma de bolsa de dosis unitaria. Los agentes de matizado adecuados se describen también en, por ejemplo, WO 2007/087257 y WO 2007/087243.

Enzimas (adicionales)

[0177] La(s) enzima(s) que puede(n) estar comprendida(s) en la composición detergente incluye(n) una o más enzimas tales como proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, DNasa, perhidrolasa, oxidasa, por ejemplo, lacasa, y/o peroxidasa.

[0178] Una combinación típica de enzimas comprende, por ejemplo, una proteasa y una lipasa junto con una amilasa. En caso de existir en una composición, las enzimas adicionales anteriormente mencionadas pueden estar presentes en proporciones de un 0,00001 a un 2% en peso, de un 0,0001 a un 1% en peso o de un 0,001 a un 0,5% en peso de proteína enzimática por peso de la composición.

[0179] En general las propiedades de la enzima(s) seleccionada deberían ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros componentes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la enzima(s) debería estar presente en cantidades efectivas.

[0180] Celulasas: las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o creados por ingeniería de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas por Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.

[0181] Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutrales con beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO99/001544.

[0182] Otras celulasas son la enzima endo-beta-1,4-glucanasa con una secuencia de al menos un 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de la SEQ ID N°: 2 de WO 2002/099091 o una xiloglucanasa de la familia 44, esta enzima xiloglucanasa con una secuencia de al menos un 60% de identidad con las posiciones 40-559 de la SEQ ID N.°: 2 de WO 2001/062903.

[0183] Las celulasas disponibles comercialmente incluyen Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S) Carezyme Premium™ (Novozymes A/S), Celluclean™ (Novozymes A/S), Celluclean Classic™ (Novozymes A/S), Cellusoft™ (Novozymes A/S), Whitezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor internacional Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[0184] Liasas: la liasa puede ser una pectato liasa derivada de Bacillus, particularmente B. licherniformis o B. agaradhaerens, o una variante derivada de cualquiera de estas, por ejemplo, como se describe en US 6124127, WO 99/027083, WO 99/027084, WO 02/006442, WO 02/092741, WO 03/095638. Las pectato liasas disponibles comercialmente son XPect™; Pectawash™ y Pectaway™ (Novozymes A/S).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0185] Mananasas: las mananasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados química o genéticamente. La mananasa puede ser una mananasa alcalina de la familia 5 o 26. Puede ser una de tipo salvaje de Bacillus o Humicola, particularmente B. agaradhaerens, B. licheniformis, B. halodurans, B. clausii, o H. insolens. Se describen mananasas adecuadas en WO 1999/064619. Una mananasa disponible comercialmente es Mannaway™ (Novozymes A/S).

[0186] Proteasas: las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano, fúngico, de plantas, vírico o animal, por ejemplo, de origen vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes químicamente modificados o creados por ingeniería de proteínas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serinproteasa o una metaloproteasa. Una serinproteasa puede, por ejemplo, ser de la familia S1, tal como la tripsina, o de la familia S8, tal como la subtilisina. Una proteasa de las metaloproteasas puede ser, por ejemplo, una termolisina de, por ejemplo, la familia M4 u otra metaloproteasa tal como las de las familias M5, M7 o M8.

[0187] El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de serinproteasas según Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serinproteasas son un subgrupo de proteasas caracterizadas por tener una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas se pueden dividir en 6 subdivisiones, es decir, la familia de subtilisinas, la familia de termitasas, la familia de proteinasas K, la familia de peptidasas de lantibióticos, la familia de kexinas y la familia de pirolisinas.

[0188] Ejemplos de subtilasas son aquellas derivadas de Bacillus tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii descritas en US7262042 y WO09/021867, y subtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 descritas en WO89/06279 y la proteasa PD138 descrita en WO93/18140. Otras proteasas útiles pueden ser aquellas descritas en WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 y WO02/016547. Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO89/06270, WO94/25583 y WO05/040372, y las proteasas quimotripsina derivadas de Cellumonas descritas en WO05/052161 y WO05/052146.

[0189] Otra proteasa preferida es la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como se describe, por ejemplo, en WO95/23221, y variantes de la misma que se describen en WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 y EP1921148.

[0190] Ejemplos de metaloproteasas son las metaloproteasas neutrales como se describe en WO07/044993 (Genencor Int.) tales como las derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

[0191] Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración BPN'. De manera más preferente, las variantes de subtilasa pueden comprender las mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (usando la numeración BPN').

[0192] Las enzimas proteásicas disponibles comercialmente adecuadas incluyen aquellas vendidas bajo los nombres comerciales de Alcalase™, Duralase™, Durazym™, Relase™, Relase™ Ultra, Savinase™, Savinase™ Ultra, Primase™, Polarzyme™, Kannase™, Liquanase™, Liquanase™ Ultra, Ovozyme™, Coronase™, Coronase™ Ultra, Neutrase™, Everlase™ y Esperase™ (Novozymes A/S), aquellos vendidas bajo el nombre comercial de Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Purafect™, Purafect Prime™, Preferenz™, Purafect MA™, Purafect Ox™, Purafect OxP™, Puramax™, Properase™, Effectenz™, FN2™, FN3™, FN4™, Excellase™, Opticlean™ y Optimase™ (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP (secuencia mostrada en la figura 29 de US5352604) y variantes de la misma (Henkel AG) y KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) de KAP.

[0193] Lipasas y cutinasas: las lipasas y cutinasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes modificadas químicamente o por ingeniería de proteínas. Los ejemplos incluyen lipasas de Thermomyces, por ejemplo de T. lanuginosus (previamente denominado Humicola lanuginosa) como se describe en EP258068 y EP305216, cutinasa de Humicola, por ejemplo H. insolens (WO96/13580), lipasa de cepas de Pseudomonas (algunas de estas ahora renombradas como Burkholderia), por ejemplo P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), cepa SD705 de P. sp. (WO95/06720 y WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipasas de tipo Streptomyces GDSL (WO10/065455), cutinasa de Magnaporthe

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

grísea (WO10/107560), cutinasa de Pseudomonas mendocina (US5,389,536), lipasa de Thermobifida fusca (WO11/084412), lipasa de Geobacillus stearothermophilus (WO11/0844l7), lipasa de Bacillus subtilis (WO11/084599) y lipasa de Streptomyces griseus (WO11/150157) y S. pristinaespiralis (WO12/137147).

[0194] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como las descritas en EP407225, WO92/05249,

WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292,

WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 y WO09/109500.

[0195] Los productos de lipasa comercial preferidos incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast™ (originalmente de Genencor) y Lipomax™ (originalmente de Gist-Brocades).

[0196] Además, otros ejemplos son lipasas a veces referidas como aciltransferasas o perhidrolasas, por ejemplo, aciltransferasas con homología a la lipasa A de Candida antarctica (WO10/111143), aciltransferasa de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolasas de la familia CE 7 (WO09/67279) y variantes de la perhidrolasa de M. smegmatis, en particular la variante S54V usada en el producto comercial Gentle Power Bleach™ de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).

[0197] Amilasas: las amilasas adecuadas incluyen alfa-amilasas y/o glucoamilasas y pueden ser de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o creados por ingeniería de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839.

[0198] Las amilasas adecuadas incluyen amilasas con SEQ ID N.°: 2 en WO 95/10603 o variantes de la misma con un 90% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID N.°: 3. Las variantes preferidas se describen en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 y SEQ ID N.°: 4 de WO 99/019467, tales como variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201,202, 207, 208, 209, 211,243, 264, 304, 305, 391,408 y 444.

[0199] Otras amilasas adecuadas incluyen amilasas con la SEQ ID N.°: 6 en WO 02/010355 o variantes de la misma con un 90% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID N.°: 6. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 6 son aquellas que tienen una deleción en las posiciones 181 y 182 y una sustitución en la posición 193. Otras amilasas adecuadas son alfa-amilasas híbridas que comprenden los residuos 1-33 de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEQ ID N.°: 6 de WO 2006/066594 y los residuos 36-483 de la alfa-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEQ ID N.°: 4 de WO 2006/066594 o variantes de las mismas con un 90% de identidad de secuencia. Las variantes preferidas de esta alfa-amilasa híbrida son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197,1201, A209 y Q264. Las variantes de la alfa-amilasa híbrida con la máxima preferencia que comprende los residuos 1-33 de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEQ ID N.°: 6 de Wo 2006/066594 y los residuos 36-483 de la SEQ ID N.°: 4 son aquellas con las sustituciones:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; o

G48A+T491I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

[0200] Otras amilasas que son adecuadas son amilasas con la SEQ ID N.°: 6 en WO 99/019467 o variantes de la misma con un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 6. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 6 son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: R181; G182; H183; G184; N195; I206; E212; E216 y K269. Amilasas preferidas particularmente son aquellas con deleciones en las posiciones R181 y G182, o las posiciones H183 y G184.

[0201] Amilasas adicionales que se pueden usar son aquellas que tienen SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 2 o SEQ ID N.°: 7 de wO 96/023873 o variantes de las mismas con un 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 7. Las variantes preferidas de las SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 7 son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 y 476, utilizando la SEQ ID N°: 2 de WO 96/023873 para la numeración. Variantes con mayor preferencia son aquellas con una deleción en dos posiciones seleccionadas de 181, 182, 183 y 184, tales como 181 y 182, 182 y 183, o las posiciones 183 y 184. Las variantes de amilasa de las SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2 o SEQ ID N.°: 7 con la máxima preferencia son aquellas con una deleción en las posiciones 183 y 184 y una sustitución en una o más de las posiciones 140, 195, 206, 243, 260, 304 y 476.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0202] Otras amilasas que se pueden usar son amilasas con la SEQ ID N.°: 2 de WO 08/153815, SEQ ID N.°: 10 de wO 01/66712 o variantes de las mismas con un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 2 de WO 08/153815 o un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 10 de WO 01/66712. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 10 de WO 01/66712 son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: 176, 177, 178, 179, 190, 201,207, 211 y 264.

[0203] Otras amilasas adecuadas son amilasas con la SEQ ID N.°: 2 de WO 09/061380 o variantes de la misma con el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 2. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 2 son aquellas con un truncamiento del extremo C-terminal y/o una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 y G475. Variantes más preferidas de la SEQ ID N.°: 2 son aquellas con sustitución en una o más de las siguientes posiciones: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E y G475K y/o deleción en la posición R180 y/o S181 o de T182 y/o G183. Las variantes de la amilasa de SEQ ID N.°: 2 con máxima preferencia son aquellas con las sustituciones:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; o S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K

donde las variantes están truncadas en el extremo C-terminal y, opcionalmente, comprenden además una sustitución en la posición 243 y/o una deleción en la posición 180 y/o la posición 181.

[0204] Otras amilasas adecuadas son amilasas con la SEQ ID N.°: 1 de WO13184577 o variantes de la misma con el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 1. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 1 son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: K176; R178; G179; T180; G181; E187; N192; M199; I203; S241; R458; T459; D460; G476 y G477. Variantes más preferidas de la SEQ ID N.°: 1 son aquellas con sustitución en una o más de las siguientes posiciones: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K y G477K y/o deleción en la posición R178 y/o S179 o de T180 y/o G181. Las variantes de amilasa de SEQ ID N.°: 1 con máxima preferencia son aquellas con las sustituciones:

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

donde las variantes opcionalmente comprenden además una sustitución en la posición 241 y/o una deleción en la posición 178 y/o la posición 179.

[0205] Otras amilasas adecuadas son amilasas con la SEQ ID N.°: 1 de WO10104675 o variantes de la misma con un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 1. Las variantes preferidas de la SEQ ID N.°: 1 son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: N21, D97, V128, K177, R179, S180, 1181, G182, M200, L204, E242, G477 y G478. Variantes de la SEQ ID N.°: 1 más preferidas son aquellas con sustitución en una o más de las siguientes posiciones: N21D, D97N, V128I, K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K y G478K y/o deleción en la posición R179 y/o S180 o de 1181 y/o G182. Las variantes de amilasa de SEQ ID N.°: 1 con máxima preferencia son aquellas con las sustituciones:

N21D+D97N+V128I

donde las variantes opcionalmente comprenden además una sustitución en la posición 200 y/o una deleción en la posición 180 y/o la posición 181.

[0206] Otras amilasas adecuadas son la alfa-amilasa con la SEQ ID N.°: 12 en WO01/66712 o una variante con al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 12. Las variantes de amilasa preferidas son aquellas con una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones de la SEQ ID N.°: 12 de WO01/66712: R28, R118, N174, R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314, R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Las amilasas preferidas de manera particular incluyen variantes con una deleción de D183 y G184 y con las sustituciones R118K, N195F, R320K y R458K, y una variante con sustituciones adicionales en una o más posiciones seleccionadas del grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 y A339, con máxima preferencia, una variante que adicionalmente tenga sustituciones en todas estas posiciones.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[0207] Otros ejemplos son variantes de amilasa tales como las descritas en WO2011/098531; WO2013/001078 y WO2013/001087.

[0208] Las amilasas disponibles comercialmente son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X™ y BAN™ (de Novozymes A/S), y Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase™, Preferenz S1000™, Preferenz S100™ y Preferenz S110™ (de Genencor internacional Inc./DuPont).

[0209] Desoxirribonucleasa (DNasa): son desoxirribonucleasas (DNasas) adecuadas cualquier enzima que catalice la escisión hidrolítica de enlaces fosfodiéster en la cadena principal de ADN, degradando así el aDn. Según la invención, se prefiere una DNasa que se pueda obtener de una bacteria; en particular se prefiere una DNasa que se pueda obtener de un Bacillus; en particular se prefiere una DNasa que se pueda obtener de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis. Los ejemplos de tales DNasas se describen en la solicitud de patente WO 2011/098579 o en PCT/EP2013/075922.

[0210] Perhidrolasas: las perhidrolasas adecuadas son capaces de catalizar una reacción de perhidrólisis que resulta en la producción de un perácido a partir de un sustrato de éster de ácido carboxílico (acilo) en presencia de una fuente de peroxígeno (por ejemplo, peróxido de hidrógeno). Mientras que muchas enzimas realizan esta reacción a niveles bajos, las perhidrolasas muestran una alta proporción perhidrólisis:hidrólisis, frecuentemente mayor de 1. Las perhidrolasas adecuadas pueden ser de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes químicamente modificados o creados por ingeniería de proteínas.

[0211] Los ejemplos de perhidrolasas útiles incluyen enzimas perhidrolasa de origen natural de Mycobacterium o variantes de las mismas. A modo de ejemplo, una enzima deriva de Mycobacterium smegmatis. Tal enzima, sus propiedades enzimáticas, su estructura y las variantes de la misma, se describen en WO 2005/056782, WO 2008/063400, US 2008/145353 y US2007167344.

[0212] Peroxidasas/oxidasas: las peroxidasas adecuadas están comprendidas en la clasificación enzimática EC 1.11.1.7, como establece el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB, por sus siglas en inglés), o cualquier fragmento derivado de las mismas, que muestre actividad de peroxidasa.

[0213] Las peroxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes químicamente modificados o creados por ingeniería de proteínas. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinopsis, por ejemplo, de C. cinerea (Ep 179,486), y variantes de las mismas, como las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257.

[0214] Una peroxidasa según la invención también incluye una enzima haloperoxidasa, tales como cloroperoxidasa, bromoperoxidasa y compuestos que muestren actividad cloroperoxidasa o bromoperoxidasa. Las haloperoxidasas se clasifican según su especificidad por iones haluro. Las cloroperoxidasas (E.C. 1.11.1.10) catalizan la formación de hipoclorito a partir de iones cloruro.

[0215] En una forma de realización, la haloperoxidasa de la invención es una cloroperoxidasa. Preferiblemente, la haloperoxidasa es una vanadio-haloperoxidasa, es decir, una haloperoxidasa que contiene vanadato. En un método preferido de la presente invención, la haloperoxidasa que contiene vanadato se combina con una fuente de ion cloruro.

[0216] Las haloperoxidasas se han aislado de muchos hongos diferentes, en particular del grupo de hongos hifomicetos dematiáceos, tales como Caldariomyces, por ejemplo, C. fumago, Alternaria, Curvularia, por ejemplo, C. verruculosa y C. inaequalis, Drechslera, Ulocladium y Botrytis.

[0217] Las haloperoxidasas también se han aislado de bacterias tales como Pseudomonas, por ejemplo, P. pyrrocinia y Streptomyces, por ejemplo, S. aureofaciens.

[0218] En una forma de realización preferida, la haloperoxidasa puede derivar de Curvularia sp., en particular de Curvularia verruculosa o Curvularia inaequalis, tales como C. inaequalis CBS 102.42, como se describe en WO 95/27046; o C. verruculosa CBS 147.63 o C. verruculosa CBS 444.70, como se describe en WO 97/04102; o de Drechslera hartlebii, como se describe en WO 01/79459, Dendryphiella salina, como se describe en WO 01/79458, Phaeotrichoconis crotalarie, como se describe en WO 01/79461, o Geniculosporium sp., como se describe en WO 01/79460.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0219] Una oxidasa según la invención incluye, en particular, cualquier enzima lacasa comprendida en la clasificación enzimática EC 1.10.3.2, o cualquier fragmento derivado de las mismas que muestre actividad lacasa, o un compuesto que muestre una actividad similar, tales como una catecol oxidasa (EC 1.10.3.1), una o- aminofenol oxidasa (EC 1.10.3.4), o una bilirrubina oxidasa (EC 1.3.3.5).

[0220] Las enzimas lacasa preferidas son las enzimas de origen microbiano. Las enzimas se pueden derivar de plantas, bacterias u hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras).

[0221] Los ejemplos adecuados de hongos incluyen una lacasa que pueda derivar de una cepa de Aspergillus, Neurospora, por ejemplo, N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, por ejemplo, T. villosa y T. versicolor, Rhizoctonia, por ejemplo, R. solani, Coprinopsis, por ejemplo, C. cinerea, C. comatus, C. friesii y C. plicatilis, Psathyrella, por ejemplo, P. condelleana, Panaeolus, por ejemplo, P. papilionaceus, Myceliophthora, por ejemplo, M. thermophila, Schyitalidium, por ejemplo, S. thermophilum, Polyporus, por ejemplo, P. pinsitus, Phlebia, por ejemplo, P. radiata (WO 92/01046), o Coriolus, por ejemplo, C. hirsutus (JP 2238885).

[0222] Los ejemplos adecuados de bacterias incluyen una lacasa derivable a partir de una cepa de Bacillus. Se prefiere una lacasa derivada de Coprinopsis o Myceliophthora; en particular una lacasa derivada de Coprinopsis cinerea, como se describe en WO 97/08325; o de Myceliophthora thermophila, como se describe en WO 95/33836.

[0223] Si se filtran cantidades pequeñas de lipasa desde la película hidrosoluble de la invención, la lipasa(s) comprendida en la película hidrosoluble puede reducir la estabilidad de determinados componentes del detergente (por ejemplo, polímeros con enlaces estéricos, aceite de ricino hidrogenado, perfume, tensioactivos de metiléster sulfonato). Por lo tanto, puede ser una ventaja añadir una proteasa a la composición detergente, que se usa luego como un depurador para degradar la lipasa filtrada y evitar así la degradación de componentes sensibles del detergente.

[0224] La(s) enzima(s) del detergente se puede(n) incluir en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un líquido, lechada, o incluso un granulado, etc.

Estabilizadores enzimáticos

[0225] Las enzimas para uso en composiciones se pueden estabilizar por varias técnicas. Las enzimas empleadas en la presente se pueden estabilizar con la presencia de fuentes hidrosolubles de iones de calcio y/o magnesio. Los ejemplos de agentes estabilizantes convencionales son, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, un aldehído peptídico, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster aromático de borato, o un derivado de ácido fenilborónico tal como ácido 4-formilfenilborónico, y la composición se puede formular como se describe en, por ejemplo, WO92/19709 y WO92/19708. En caso de composiciones acuosas que comprenden proteasa, un inhibidor de proteasa reversible, tal como un compuesto de boro, incluidos borato, ácido 4-formilfenilborónico, ácido fenilborónico y derivados de los mismos, o compuestos tales como formiato de calcio, formiato de sodio y 1,2- propanodiol pueden añadirse para mejorar aun más la estabilidad. El aldehído peptídico puede ser de fórmula B2-B1-B0-R, donde: R es hidrógeno, CH3, CX3, CHX2 o CH2X, donde X es un átomo de halógeno; B0 es un residuo de fenilalanina con un sustituyente OH en la posición p y/o en la posición m; B1 es un único residuo aminoacídico; y B2 consiste en uno o más residuos aminoacídicos, opcionalmente con grupo de protección N- terminal. Los aldehídos peptídicos preferidos incluyen, pero de forma no limitativa: Z-RAY-H, Ac-GAY-H, Z-GAY- H, Z-GAL-H, Z-GAF-H, Z-GAV-H, Z-RVY-H, Z-LVY-H, Ac-LGAY-H, Ac-FGAY-H, Ac-YGAY-H, Ac-FGVY-H o Ac- WLVY-H, donde Z es benciloxicarbonil y Ac es acetilo.

Materiales complementarios

[0226] También puede utilizarse cualquier componente de detergentes conocido en la técnica para uso en detergentes de lavado de ropa. Otros componentes de detergente opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes antiencogimiento, agentes antirredeposición de suciedad, agentes antiarrugas, bactericidas, ligantes, inhibidores de corrosión, agentes desintegrantes/de desintegración, colorantes, estabilizadores enzimáticos (incluyendo ácido bórico, boratos, CMC y/o polioles tales como el propilenglicol), acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, auxiliares de relleno/procesado, agentes blanqueadores fluorescentes/abrillantadores ópticos, potenciadores de espuma, reguladores de espuma (agua jabonosa), perfumes, agentes suspensores de suciedad, suavizantes, supresores de espuma, inhibidores de decoloración y agentes de mecha, bien de manera

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aislada o en combinación. Puede utilizarse cualquier componente conocido en la técnica para uso en detergentes de lavado de ropa. La elección de tales componentes depende de la habilidad del experto.

[0227] Dispersantes: las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener dispersantes. En particular los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen ácidos homo- o co-poliméricos o sus sales, donde el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

[0228] Agentes de inhibición de transferencia de tinte: las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir también uno o más agentes de inhibición de transferencia de tinte. Los agentes poliméricos inhibidores de transferencia de tinte adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazol o mezclas derivadas. En caso de estar presentes en una composición de la invención, los agentes de inhibición de transferencia de tinte pueden estar presentes en proporciones de aproximadamente un 0,0001% a aproximadamente un 10%, de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 5% o incluso de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 3% en peso de la composición.

[0229] Agente blanqueador fluorescente: las composiciones detergentes de la presente invención también contendrán, preferiblemente, componentes adicionales que pueden teñir los artículos que se van a limpiar, tales como agentes blanqueadores fluorescentes o abrillantadores ópticos. En el caso de estar presente, el abrillantador estará preferiblemente en una proporción de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,5%. Cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para uso en una composición detergente para lavado de ropa se puede utilizar en la composición de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes usados más frecuentemente son aquellos pertenecientes a las clases de derivados del ácido diaminoestilbeno-sulfónico, derivados de la diarilpirazolina y derivados del bisfenil-diestirilo. Los ejemplos de agentes blanqueadores fluorescentes de tipo derivado de ácido diaminoestilbeno-sulfónico incluyen las sales sódicas de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-il-amino) estilbeno-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(2,4- dianilino-s-triazin-6-il-amino) estilbeno-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxi-etilamino)-s- triazin-6-il-amino) estilbeno-2,2'-disulfonato 4,4'-bis-(4-fenil-1,2,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-disulfonato y 5-(2h- nafto[1,2-d][1,2,3]triazol-2-il)-2-[(E)-2-fenilvinil]benzenosulfonato de sodio. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, disponibles en Ciba-Geigy AG, Basel, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica de 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-il-amino) estilbeno-2,2'-disulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica de 2,2'-bis-(fenilestiril)-disulfonato. También se prefiere el agente blanqueador fluorescente disponible comercialmente Parawhite KX, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Bombay, India. Otros fluorescentes adecuados para uso en la invención incluyen las 1-3-diarilpirazolinas y las 7- alquilaminocumarinas.

[0230] Las proporciones adecuadas de abrillantador fluorescente incluyen proporciones inferiores, de aproximadamente un 0,01, de un 0,05, de aproximadamente un 0,1 o incluso de aproximadamente un 0,2% en peso, hasta proporciones superiores, de un 0,5 o incluso de un 0,75% en peso.

[0231] Polímeros de liberación de suciedad: las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir también uno o más polímeros de liberación de suciedad que ayuden a la eliminación de suciedad de tejidos tales como algodón y tejidos a base de poliéster, en particular la eliminación de suciedad hidrófoba de tejidos a base de poliéster. Los polímeros de liberación de suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros a base de tereftalato no iónicos o aniónicos, polivinil caprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros de injerto de vinilo, poliamidas de poliéster, veáse por ejemplo el capítulo 7 en Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros de liberación de suciedad son polímeros alcoxilados anfifílicos de limpieza de grasa que comprenden una estructura nuclear y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a dicha estructura nuclear. La estructura nuclear puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina, como se describe en detalle en WO 2009/087523 (incorporada en la presente como referencia). Además, los copolímeros de injerto aleatorios son polímeros de liberación de suciedad adecuados. Los copolímeros de injerto adecuados se describen con más detalle en WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (incorporada en la presente como referencia). Otros polímeros de liberación de suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, especialmente estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificada, tales como las descritas en EP 1867808 o WO 2003/040279 (ambas incorporadas en la presente como referencia). Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de los mismos. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwitteriónicamente y mezclas de las mismas. Lo polímeros celulósicos adecuados incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, éster de carboximetilcelulosa y mezclas de las mismas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0232] Agentes de antirredeposición: las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir también uno o más agentes de antirredeposición, tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros a base de celulosa descritos dentro de los polímeros de liberación de suciedad anteriores también pueden funcionar como agentes de antirredeposición.

[0233] Los modificadores reológicos son estructurantes o espesantes, distintos de los agentes reductores de la viscosidad. Los modificadores reológicos se seleccionan del grupo consistente en materiales cristalinos no poliméricos, hidroxifuncionales, modificadores reológicos poliméricos que imparten características de dilución por cizalladura a la matriz líquida acuosa de una composición detergente líquida. La reología y viscosidad del detergente se puede modificar y ajustar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se muestra en EP 2169040.

[0234] Otros materiales complementarios adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, colorantes, estabilizadores enzimáticos, suavizantes, productos de relleno, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, inhibidores de césped, disolventes y estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastificantes de estructura.

Sistemas blanqueantes

[0235] Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir un sistema blanqueante. Debido a la incompatibilidad de los componentes de momento existen solo pocos ejemplos de detergentes líquidos que combinen blanqueador y enzimas (por ejemplo, US 5,275,753 o WO 99/00478). La película hidrosoluble con lipasa descrita en esta invención puede utilizarse para separar el blanqueador de la lipasa en detergentes líquidos. El detergente puede contener 0-50% de un sistema blanqueante. Puede utilizarse cualquier sistema blanqueante conocido en la técnica para uso en los detergentes para lavado de ropa. Los componentes adecuados de un sistema blanqueante incluyen catalizadores de blanqueo, fotoblanqueadores, activadores de blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato de sodio y perboratos de sodio, perácidos preformados y mezclas de los mismos. Los perácidos preformados adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, ácidos y sales peroxicarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, por ejemplo, Oxone (R), y mezclas de los mismos. Los ejemplos no limitativos de sistemas blanqueantes incluyen sistemas blanqueantes basados en peróxido, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, incluyendo sales de metal alcalino tales como sales sódicas de perborato (normalmente mono- o, tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato, en combinación con un activador de blanqueo formador de perácido. El término activador de blanqueo se entiende aquí como un compuesto que reacciona con un blanqueador de peroxígeno como el peróxido de hidrógeno para formar un perácido. El perácido así formado constituye el blanqueador activado. Los activadores de blanqueo adecuados para uso en la presente incluyen aquellos pertenecientes a la clase de ésteres, amidas, imidas o anhídridos. Ejemplos adecuados son tetraacetiletilendiamina (TAED), 4-[(3,5,5-trimetilhexanoil)oxi]benzenosulfonato (ISONOBS) de sodio, ácido diperoxidodecanoico, 4-(dodecanoiloxi)bencenosulfonato (LOBS), 4- (decanoiloxi)bencenosulfonato, 4-(decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoiloxi)-bencenosulfonato (NOBS) y/o aquellos descritos en WO 98/17767. Una familia particular de activadores de blanqueo de interés se describió en EP624154 y particularmente preferido en esa familia es el acetilcitrato de trietilo (ATC). El ATC o un triglicérido de cadena corta como la triacetina tienen la ventaja de ser respetuosos con el medioambiente, ya que al final se degrada en ácido cítrico y alcohol. Además, el acetilcitrato de trietilo y la triacetina tienen una buena estabilidad hidrolítica en el producto durante el almacenamiento y es un activador de blanqueo eficaz. Finalmente, el ATC proporciona una buena capacidad adyuvante a los aditivos para lavado de ropa. Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos, por ejemplo, de tipo amida, imida o sulfona. El sistema blanqueante también puede comprender perácidos tales como el ácido 6-(ftalimido)peroxihexanoico (PAP). El sistema blanqueante también puede incluir un catalizador de blanqueo. En algunas formas de realización, el componente blanqueador puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo consistente en catalizadores orgánicos con las fórmulas siguientes:

imagen1

imagen2

y mezclas de los mismos; donde cada R1 es, de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos, preferiblempendiente cada R1 es, 5 de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos, más preferiblemente cada R1, de manera independiente, se selecciona del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, N-dodecilo, N-tetradecilo, N- hexadecilo, N-octadecil, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo. Otros sistemas blanqueantes ilustrativos se describen, por ejemplo, en WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 y WO

10 2007/087242. Un fotoblanqueador adecuado puede, por ejemplo, ser ftalocianina de zinc sulfonatada.

Formulación de productos detergentes

[0236] La composición detergente de la invención puede presentarse en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una pastilla homogénea, una pastilla con dos o más capas, una bolsa con uno o más compartimentos, un polvo regular o compacto, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o

15 concentrado.

[0237] La bolsa de detergente de la presente invención se configura con un único compartimento o con mútliples compartimentos (véase, por ejemplo, WO 2009/098660 o WO 2010/141301). Pueden estar en cualquier estado y ser de cualquier forma y material que sean adecuados para la retención de la composición detergente, por ejemplo, sin permitir la liberación de la composición desde la bolsa antes del contacto con el agua. La bolsa está

20 hecha de la película hidrosoluble que incluye el volumen interno (composición detergente). Dicho volumen interno se puede dividir en compartimentos de la bolsa. La película hidrosoluble se describe en lo que antecede bajo "Película hidrosoluble". La bolsa puede comprender una composición de limpieza de ropa (detergente) o componentes seleccionados de la misma en forma sólida, y/o una composición de limpieza o componentes seleccionados de la misma en forma líquida, separados por la película hidrosoluble. La bolsa puede incluir

25 compartimentos con cualquier combinación de sólidos y líquidos, tanto en uno o más compartimentos separados como en compartimentos compartidos que contienen componentes tanto sólidos como líquidos. La bolsa puede incluir zonas o compartimentos formados por películas hidrosolubles diferentes, que pueden tener o no tener enzimas. Por consiguiente, los constituyentes del detergente se pueden separar físicamente entre sí en compartimentos diferentes o en capas diferentes de una pastilla si el detergente está en ese estado físico. Así,

30 se pueden evitar interacciones negativas entre componentes durante el almacenamiento. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimentos también pueden dar lugar a la disolución retardada de componentes seleccionados en la solución de lavado.

[0238] Un detergente líquido o en gel, que no sea de dosis unitaria, puede ser acuoso, típicamente conteniendo al menos un 20% en peso y hasta un 95% de agua, por ejemplo, hasta aproximadamente un 70% de agua, hasta

35 aproximadamente un 65% de agua, hasta aproximadamente un 55% de agua, hasta aproximadamente un 45% de agua, hasta aproximadamente un 35% de agua. Otros tipos de líquidos, incluyendo sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles, se pueden incluir en un líquido acuoso o un gel. Un detergente líquido o en gel puede contener 0-30% de disolvente orgánico. Un detergente líquido o en gel puede ser no acuoso.

Composiciones, métodos y usos

40 [0239] En un primer aspecto, la presente invención proporciona una película hidrosoluble que comprende una

variante de una lipasa parental, dicha variante presenta actividad lipásica, tiene al menos un 90% pero menos del 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 2 y comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R y D27R, y al menos una o más (por ejemplo; varias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de la SEQ ID N.°: 2.

45 [0240] En una forma de realización, la variante comprende sustituciones de la SEQ ID N.°: 2 seleccionadas del

grupo que consiste en:

a) D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

b) D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+P256T;

c) D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

d) D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

e) D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

f) D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

g) D27R+G163K+T231R+N233R+D254S;

h) D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S;

i) D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

j) D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T:

k) D27R+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;

l) D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

m) D27R+G38A+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

n) D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R;

o) D27R+D96E+D111A+T231R+N233R;

p) D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

q) D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;

r) D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+E210Q+T231R+N233R+D254S+P256T; y

s) D27R+T231R+N233R+D254S+P256T.

[0241] La variante tiene una mayor estabilidad cuando se compara con la lipasa parental, en las mismas condiciones. Preferiblemente, la estabilidad es la estabilidad en condiciones de almacenamiento, estabilidad en presencia de tensioactivos; estabilidad en presencia de proteasa, estabilidad en presencia de proteasa y tensioactivos; estabilidad en presencia de componentes detergentes; estabilidad química, estabilidad a la oxidación, estabilidad al pH y/o termoestabilidad.

[0242] En una forma de realización, la variante es un polipéptido con al menos un 90%, al menos un 95% de identidad, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 2.

[0243] En una forma de realización, la variante está en una forma particulada sólida, como partículas de lipasa. Preferiblemente, el tamaño de las partículas de lipasa es de 0,5 |_im a 100 |_im. Preferiblemente, las partículas de lipasa son cristales de enzima. Preferiblemente, las partículas de lipasa contienen al menos un 1% p/p de proteína lipasa.

[0244] En una forma de realización, la película hidrosoluble comprende una enzima (detergente) adicional seleccionada del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, DNasa, perhidrolasa y oxidasa.

[0245] En una forma de realización, la película hidrosoluble comprende de un 35% a un 90% de PVOH que tiene un grado de hidrólisis de un 75% a un 99%.

[0246] En una forma de realización, la película hidrosoluble comprende de un 10% a un 50% de polioles.

[0247] En una forma de realización, el grosor de la película hidrosoluble es de 10 |_im a 500 |_im, preferiblemente de 10 |_im a 300 |_im, más preferiblemente de 20 |_im a 200 |_im y, de la forma más preferible, de 25 |_im a 150 |_im.

[0248] En una forma de realización, la película hidrosoluble cubre un área de al menos 1 cm2, preferiblemente 2 cm2, más preferiblemente 5 cm2 y, de la forma más preferible, 10 cm2.

[0249] La película hidrosoluble de la invención es útil para encapsular una composición detergente. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona una bolsa de detergente, que comprende un compartimento formado por la película hidrosoluble de la invención (como se describe en lo que antecede) y una composición detergente con un tensioactivo y/o un adyuvante de detergencia.

[0250] En una forma de realización, la composición detergente es una composición detergente de lavado de ropa o lavavajillas.

[0251] En una forma de realización, la composición detergente es una composición detergente líquida.

[0252] En una forma de realización, la composición detergente líquida es sustancialmente no acuosa.

10

15

20

25

30

35

40

45

[0253] En una forma de realización, la bolsa de detergente comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, DNasa, perhidrolasa y oxidasa.

[0254] En otro aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de la bolsa de detergente de la invención, que comprende encapsular una composición detergente con la película hidrosoluble de la invención.

[0255] La invención también proporciona para su uso los métodos y las composiciones anteriores para mejorar la estabilidad de almacenamiento de lipasa y/o mejorar la actividad lipásica residual (recuperación de actividad enzimática) después de la preparación de la película hidrosoluble anteriormente descrita.

[0256] La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

[0257] Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de, al menos, calidad reactiva.

Ejemplo 1

Estabilidad de almacenamiento mejorada de película hidrosoluble que contiene lipasa

[0258] Dos películas hidrosolubles se prepararon como se describe en WO2013/138288, Ejemplo 1 (sin proteasa, amilasa ni sustrato de proteasa) de la siguiente manera:

Película A:

0,25% p/p de enzima lipasa activa con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 con las sustituciones T231R+N233R (lipasa de referencia). La secuencia de aminoácidos también se muestra como SEQ ID N.°: 3.

Película B:

0,25% p/p de enzima de lipasa activa con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 con las sustituciones D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T (variante de lipasa de la invención). La secuencia de aminoácidos se muestra también como SEQ ID N.°: 4.

[0259] Un gramo de película hidrosoluble se sumergió en 20 g de un detergente de dosis unitaria (la fase de líquido blanco extraída de la cámara más grande de Tide Pods, comercialmente comprado en los Estados Unidos en 2012) y posteriormente almacenado en recipientes de vidrio cerrados a 22, 30 y 37°C durante hasta 4 semanas. Las películas se extrajeron del detergente y se analizaron para determinar la actividad lipásica mediante análisis de lipasa estándar (hidrólisis de palmitato de p-nitrofenilo a 37°C, pH=8,0) y comparado con la actividad de muestras almacenadas a -18°C (referencia).

Tabla 1. Estabilidad de almacenamiento de lipasa en la película hidrosoluble.

Ta de almacenamiento

Tiempo Actividad lipásica residual

Película A

Película B

30°C

2 semanas 59% 67%

4 semanas

37% 57%

37°C

2 semanas 14% 55%

4 semanas

0% 47%

[0260] Los datos de la Tabla 1 muestran que la película B (con la variante de lipasa de la invención) tiene una actividad lipásica residual considerablemente superior que la película A (con la lipasa de referencia), especialmente a temperatura elevada.

Ejemplo 2

Estabilidad de almacenamiento de detergente de la película hidrosoluble que contiene lipasa

5

10

15

20

25

30

35

40

[0261] Las películas se prepararon con soluciones de película como en el Ejemplo 1 (pero sin adición de plastificantes) con adición de dos variantes de lipasa de la invención, y una lipasa de referencia:

La lipasa 1 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 con las sustituciones T231R+N233R (lipasa de referencia).

La lipasa 2 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 con las sustituciones

D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+I238C+A243T+T244Y+G246C+D254S+P 256T.

La lipasa 3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2 con las sustituciones

D27R+G38A+K46R+S54T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T.

[0262] Cinco ml de una solución de película con lipasa de aproximadamente un 8% de sólidos se añadió a una

placa de Petri de plástico de 50 mm de diámetro, y se dejó secar la solución en el laboratorio durante toda la noche. Posteriormente, la película se secó finalmente durante 3 horas a 50°C. La película final contenía

aproximadamente 15 mg/g de proteína lipasa. Para cada lipasa, dos recipientes de vidrio con aproximadamente

0,2 g de película se sumergieron en 10 g de detergente Tide Pods (como en el Ejemplo 1) - un recipiente de vidrio se almacenó a 37°C durante 7 días, el otro recipiente de vidrio se almacenó a -18°C (referencia).

LISTADO DE SECUENCIAS

[0263]

<110> Novozymes A/S

<120> Lipasa estabilizada en películas hidrosolubles <130> 12936-WO-PCT <160> 4

<170> Versión de PatentIn 3.5

<210> 1 <211 > 807 <212>ADN

<213> Thermomyces lanuginosus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(807)

<220>

<221> mat_peptide <222> (1)..()

<400> 1

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Película hidrosoluble que comprende una variante de una lipasa parental, en la que la variante presenta actividad lipásica, tiene al menos un 90% pero menos del 100% de identidad de secuencia con SEQ ID N.°: 2, y comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a T231R+N233R; y D27R; y al menos una o más de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T y G38A de SEQ ID N.°: 2;

   donde la variante presenta una estabilidad aumentada en comparación con la lipasa parental.
2. 2. Película hidrosoluble según la reivindicación 1, donde la variante comprende sustituciones de SEQ ID N.°: 2 seleccionadas del grupo que consiste en:

   D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S;

   D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+G163K+T231R+N233R+D254S;

   D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T:

   D27R+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;

   D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R;

   D27R+D96E+D111A+T231R+N233R;

   D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;

   D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+E210Q+T231R+N233R+D254S+P256T; y D27R+T231R+N233R+D254S+P256T.
3. 3. Película hidrosoluble según la reivindicación 1 o 2, donde la estabilidad es la estabilidad bajo condiciones de almacenamiento, la estabilidad en presencia de tensioactivos; la estabilidad en presencia de proteasa, la estabilidad en presencia de proteasa y tensioactivos; la estabilidad en presencia de componentes detergentes; la estabilidad química, la estabilidad a la oxidación, la estabilidad al pH y/o la termoestabilidad.
4. 4. Película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la variante es un polipéptido que presenta al menos un 95% de identidad, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con SEQ ID N.°: 2.
5. 5. Película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la variante está en una forma sólida particulada.
6. 6. Película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la película hidrosoluble comprende de un 35% a un 90% de PVOH que tiene un grado de hidrólisis de un 75% a un 99%.
7. 7. Película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la película hidrosoluble comprende de un 10% a un 50% de polioles.
8. 8. Película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el grosor de la película hidrosoluble es de 10 |_im a 500 |_im.
9. 9. Bolsa de detergente, que comprende un compartimento formado por la película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y una composición de detergente que contiene un tensioactivo y/o un adyuvante de detergencia.
10. 10. Bolsa de detergente según la reivindicación 9, donde la composición detergente es una composición detergente de lavado de ropa o de vajilla.
11. 11. Bolsa de detergente según la reivindicación 9 o 10, donde la composición detergente es una composición detergente líquida.
12. 12. Bolsa de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde la composición detergente líquida es sustancialmente no acuosa.
13. 13. Bolsa de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, DNasa, perhidrolasa y oxidasa.

    5 14. Método para la preparación de la bolsa de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que

    comprende la encapsulación de una composición detergente con la película hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.