ES2687422T3 - Cartucho desechable para electroporación - Google Patents

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Eiad Kabaha
Jan Boddenberg
Stefan Miltenyi
Ralf-Peter Peters
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Abstract

Un desechable para la electroporación de células, que comprende un compartimento de fluido en un interior del desechable; un primer puerto de fluido para proporcionar la suspensión de células al compartimento de fluido, y un segundo puerto de fluido para suministrar un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las células al compartimento de fluido; un primer electrodo y un segundo electrodo dispuestos en el compartimento de fluido; al menos un puerto de salida que suministra el fluido desde el compartimento de fluido donde el primer y segundo puerto de fluido tienen una comunicación de fluido a un canal de mezcla que tiene una comunicación de fluido al compartimento de fluido caracterizado porque el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido son provisto de canales con diferente resistencia microfluídica a los fluidos.

Description

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DESCRIPCION
Cartucho desechable para electroporacion Antecedentes
Esta invencion se refiere a un dispositivo desechable para efectuar la electroporacion de las celulas, un proceso para electroporacion de celulas que utiliza el sistema desechable y cerrado que comprende el desechable.
La electroporacion, o electropermeabilizacion, es una tecnica de biolog^a molecular en la que se aplica un campo electrico a las celulas para aumentar la permeabilidad de la membrana celular, permitiendo que los acidos nucleicos se introduzcan en la celula.
La electroporacion se usa para introducir acidos nucleicos en las celulas, especialmente en las celulas de mairnferos. Los acidos nucleicos transferidos se pueden usar para la expresion transitoria de protemas. Especialmente la electroporacion de ARNm se usa para expresar transitoriamente protemas de interes. El plasmido se puede usar para expresion transitoria, asf como para integracion estable. La integracion del plasmido en el genoma puede mejorarse introduciendo roturas de doble cadena y secuencias homologas que reemplazaran el segmento del genoma roto por recombinacion homologa. Otra posibilidad es usar transposasas para integrar informacion genetica flanqueada por motivos de transposasa en el genoma. Los acidos nucleicos transferidos tambien pueden codificar paranucleasas. Las nucleasas espedficas de sitio son una herramienta comun para eliminar genes mediante la union final no homologa.
De ese modo, la electroporacion se puede usar en el proceso de produccion de celulas transgenicas o inactivadas. Usando celulas embrionarias animales, las celulas transgenicas o inactivadas tambien se pueden usar para desarrollar animales transgenicos o inactivados. Las celulas modificadas mediante electroporacion de acido nucleico se utilizan para el tratamiento de tumores, la terapia genica u otras terapias basadas en celulas.
La electroporacion se realiza con electroporadores, dispositivos especialmente disenados que crean un campo electrico aplicado a una suspension celular que contiene los acidos nucleicos para ser transferidos a las celulas. Por lo general, la suspension celular se pipetea en una cubeta de vidrio o plastico que tiene dos electrodos en sus lados. Antes de la electroporacion, la suspension celular se mezcla con los acidos nucleicos a transformar. La mezcla se pipetea en la cubeta, se ajustan el voltaje y la capacitancia, y la cubeta se inserta en el electroporador. El electroporador aplicara un campo electrico. El campo electrico se define por la intensidad de campo, por ejemplo, el voltaje aplicada por distancia de los electrodos, el tiempo y la capacitancia. Para los pulsos de decaimiento exponencial, el voltaje y la capacitancia se establecen y el campo electrico decae debido a la corriente que pasa la suspension de la celda. Para pulsos de onda cuadrada, se usa una alta capacitancia y se aplica un campo electrico por un tiempo dado. Debido a la alta capacitancia, el decaimiento del campo electrico por la corriente que pasa la suspension celular debe ser minima. Durante la electroporacion, los campos electricos generan agujeros en la membrana celular que permiten que moleculas mas grandes, como los acidos nucleicos, pasen por la membrana celular. Las membranas lipfdicas de bicapa, como las membranas celulares, pueden alterarse por un intenso potencial electrico transmembrana como lo divulgo Tsong, T. Y., “Electroporation of cell membranes”, Biophys J, 1991. 60(2): pag. 297-306. Si un campo electrico transmembrana excede la resistencia dielectrica de una membrana celular, la conductancia de la membrana aumenta drasticamente. Este potencial de ruptura ha sido reportado por Tsong et al. entre 150 y 500 mV para duraciones de campo de |js a ms para bicapas lipfdicas de 5 nm de grosor. Esto se traduce en una resistencia dielectrica de 300-1000 V/cm. La penetracion de moleculas de bajo peso molecular se ha detectado para la intensidad del campo electrico >0.3-0.4 kV/cm por Rols, M. P. y J. Teissie, “Electropermeabilizacion de celulas de marnffero a macromoleculas: control por duracion del pulso”. Biophys J, 1998. 75(3): p. 1415-23. La intensidad del campo umbral para la permeabilizacion de la membrana ha sido descrita por Wolf, H., et al., “Control mediante parametros de pulso de transferencia genica mediada por campo electrico en celulas de nam^ero”, Biophys J, 1994. 66(2 Pt 1): p. 524-31 para ser 580 V/cm.
La diferencia de potencial electrico que encuentra una membrana celular ha sido descrita mediante:
= — Ear
Por lo tanto, la diferencia de potencial es proporcional a la intensidad inicial del campo electrico E0 y al radio r de la celula (Neumann, E., et al., Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo J, 1982. 1(7): p. 841-5).
Para un radio de celda tfpico de 5 jm, el umbral de permeabilizacion de, por ejemplo, 300 mV se puede lograr con una intensidad de campo electrico >400 V/cm. Para una celda mas pequena (r=1 jm), la intensidad de campo requerida se puede estimar en al menos 2000 V/cm.
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Ademas de la difusion pasiva de los acidos nucleicos en las celulas, se puede aplicar electroforesis adicional de los acidos nucleicos en un campo electrico. Los campos electricos necesarios para la electroforesis son mas pequenos que para la electroporacion. Los pulsos de decaimiento exponencial probablemente permeabilicen la membrana celular con el campo electrico alto al comienzo y el campo en decaimiento transporta posteriormente los acidos nucleicos a las celulas. Para pulsos de onda cuadrada, se pueden generar dos o mas pulsos para combinar la electroporacion y la electroforesis.
Los acidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Como el ADN es mas estable, mezclando el ADN, por ejemplo, los plasmidos junto con las suspensiones celulares por lo general no danan el ADN. Por el contrario, el ARN es propenso a la degradacion, por ejemplo, por RNasas secretadas por celulas o por tampones contaminados. Por lo tanto, el ARN generalmente se agrega antes del paso de electroporacion para minimizar el riesgo de degradacion del ARN antes de que el ARN pueda ingresar a la celula. Dentro de la celula, el ARN queda protegido por las protemas de union a acidos nucleicos y la maquinaria de traduccion.
Para un dispositivo de electroporacion automatizado, los acidos nucleicos, especialmente el ARN, tambien deben mezclarse con la suspension celular justo antes de la electroporacion. Actualmente, la mezcla de acidos nucleicos y la suspension celular seguida de una etapa de electroporacion no puede realizarse automaticamente. Mientras que hay muchos dispositivos para la electroporacion semiautomatizada o automatizada, la preparacion de muestra, por ejemplo, la mezcla de acidos nucleicos y la suspension celular tiene que efectuar de antemano el proceso de electroporacion. El proceso de mezcla comprende agregar las dos soluciones, por ejemplo, suspension celular y solucion de acido nucleico, en una proporcion constante para producir una mezcla homogenea.
La concentracion de acidos nucleicos durante el proceso de electroporacion es crucial y, para obtener resultados reproducibles, la relacion definida debe mantenerse durante el proceso. Lo mismo es cierto para la homogeneidad de la mezcla. Para la electroporacion celular homogenea, la concentracion de acido nucleico local debe ser la misma para todas las celulas. En la mezcla homogenea dara lugar a una mezcla de celulas sin acidos nucleicos, cantidades bajas y cantidades elevadas. Como las celulas electroporadas usualmente se cultivaran despues de la electroporacion o incluso se administraran a pacientes, el proceso de mezclado y electroporacion debe realizarse en un ambiente esteril.
Por consiguiente, existe una necesidad en la tecnica de un dispositivo que permita la mezcla de acidos nucleicos y celulas y que permita la electroporacion de las celulas en condiciones esteriles.
Resumen
La presente invencion esta dirigida a un dispositivo desechable para la electroporacion de celulas, que comprende un compartimento de fluido en un interior del desechable;
un primer puerto de fluido para proporcionar la suspension de celulas al compartimento de fluido, y un segundo puerto de fluido para suministrar un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas al compartimento de fluido;
un primer electrodo y un segundo electrodo dispuestos en el compartimento de fluido;
al menos un puerto de salida que libera el fluido desde el compartimento de fluido en el que el primer y el segundo puerto de fluido tienen una comunicacion de fluido a un canal de mezcla que tiene una comunicacion fluida con el compartimento de fluido, caracterizado porque el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido se proporcionan con canales que tienen diferente resistencia microflmdica a los fluidos.
El cartucho desechable permite la mezcla de al menos dos fluidos en una relacion dada para lograr un fluido combinado homogeneo. Esta mezcla se lleva a cabo mediante un dispositivo microflmdico que define la relacion de mezcla volumetrica y permite una mezcla de fluidos homogenea. El cartucho puede montarse en un conjunto de tubos que permite el manejo de celulas esteriles. Se usa una bomba peristaltica o una bomba de vacfo para mover fluidos dentro y fuera del conjunto de electroporacion, minimizando asf el riesgo de fugas o defectos. El conjunto de tubos tambien se puede combinar con otros pasos de procesamiento de celulas como la separacion de celulas o el cultivo de celulas.
Breve descripcion de los dibujos
Se describen diversos detalles a modo de ejemplo con referencia a las siguientes figuras, en las que:
La Fig. 1 es una vista en perspectiva de una realizacion generica de un conjunto de cartucho de electroporacion desechable;
La Fig. 2 es una vista lateral del conjunto de cartucho de electroporacion desechable;
La Fig. 3 es una vista en perspectiva desde arriba de un conjunto de cartucho de electroporacion desechable;
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La Fig. 4a es una vista en planta de la superficie exterior de la mitad inferior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 3;
La fig. 4b es una vista en planta de la superficie interna de la mitad inferior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 1;
La Fig. 5a es una vista en planta de la superficie exterior de la mitad superior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 3;
La fig. 5b es una vista en planta de la superficie interna de la mitad superior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 3;
La Fig. 6a es una vista en planta de la superficie inferior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 1;
La fig. 6b es una vista en planta de la superficie superior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 1; y
La Fig. 7 es una vista en perspectiva de la superficie inferior del conjunto de cartucho de electroporacion desechable de la FIG. 3.
La Fig. 8 muestra la dependencia de la relacion de mezcla y el vado dentro de la cubeta de electroporacion
La Fig. 9 muestra el resultado de la electroporacion de celulas Jurkat con la eficacia de transfeccion monitorizada por la expresion de mCherry/eGFP.
Debe entenderse que los dibujos no son necesariamente a escala, y que los mismos numeros pueden referirse a caractensticas similares.
Descripcion detallada
El dispositivo de la invencion permite la transfeccion de celulas mediante la mezcla de al menos dos fluidos que comprenden celulas y al menos un compuesto para ser electroporada en las celulas con una relacion de mezcla volumetrica predefinida y aplicar un campo electrico a los fluidos mezclados.
El compuesto que se va a electroporar en las celulas puede ser cualquier compuesto conocido en la tecnica que sea util para la electroporacion, como acidos nucleicos, oligonucleotidos, polinucleotidos, ADN, ARN, peptidos, protemas y moleculas pequenas como hormonas, citoquinas, quimiocinas, farmaco, o precursores de farmacos. En lo que sigue, el termino “acidos nucleicos” como compuesto que se va a electroporar se utiliza como sinonimo de todos los compuestos que se van a electroporar, como oligonucleotidos, polinucleotidos, ADN, ARN, peptidos, protemas y moleculas pequenas como hormonas, citoquinas y quimiocinas, farmacos o precursores de farmacos.
Con el fin de realizar la electroporacion sobre un fluido mezclado homogeneamente y evitar el flujo laminar en los canales, el canal de mezcla del desechable tiene una forma de serpentina y/o comprende elementos agitadores y/o una camara de mezclado. Despues de mezclar la suspension celular y la solucion de acido nucleico, se aplica un campo electrico, que induce los poros en las membranas celulares. Los acidos nucleicos pueden entrar en las celulas a traves de los poros por difusion o electroforesis.
En una realizacion del dispositivo, la relacion de mezcla volumetrica de al menos dos fluidos esta definida por al menos dos canales microflmdicos que tienen diferente resistencia microflmdica, es decir, el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido de puerto de fluido estan provistos de canales que tienen diferente resistencia microflmdica a los fluidos.
El flujo de cada fluido depende de la resistencia del canal respectivo, por ejemplo, el canal 112 y 122 en la FIG. 4a. Menos fluido pasara por el canal con mayor resistencia en comparacion con al menos otro canal que tenga una menor resistencia. De ese modo, la relacion de mezcla puede definirse por la relacion de resistencias de al menos dos canales de entrada. Preferiblemente, el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido de puerto de fluido estan provistos de canales que tienen una resistencia microflmdica para mantener una relacion de mezcla de 1:5 a 1:10 del primer fluido al segundo fluido. El uso de diferentes volumenes produce cambios en la presion hidrostatica de cada solucion. De este modo, las diferencias de presion hidrostatica deterioraron la relacion de mezcla definida por las resistencias de los canales microflmdicos.
Los fluidos pueden ser bombeados o absorbidos en el dispositivo. Por consiguiente, el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido de puerto de fluido del desechable estan en comunicacion fluida con al menos una bomba
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que suministra fluidos al compartimento de fluido y/o al menos un puerto de salida esta en comunicacion de fluido con al menos una fuente de vado absorbiendo fluidos hacia el compartimento de fluido.
La bomba o fuente de vado debe proporcionar una diferencia de presion de al menos 100 mbar entre el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido en un lado y el al menos un puerto de salida en fluido en el otro lado. Preferible, la diferencia de presion esta entre 100 y 800 mbar, especialmente entre 200 y 500 mbar.
Los fluidos mezclados son forzados por la diferencia de presion en el compartimento de fluido entre las dos placas de electrodos del dispositivo. El proceso de llenado, es decir, el nivel de llenado del compartimento de fluido puede controlarse y/o automatizarse midiendo la capacitancia entre el primer y el segundo electrodo. El llenado puede continuar hasta, por ejemplo, que se alcance la capacidad maxima entre el primer y el segundo electrodo. Como alternativa, la resistencia electrica entre los electrodos de conexion a tierra (como se explica mas adelante) se puede usar para determinar el nivel de llenado del compartimento de fluido. En alternativa, el nivel de llenado puede determinarse controlando la diferencia de presion aplicada al compartimento de fluido. Al controlar el nivel de llenado del compartimento de fluido, el dispositivo puede operarse en un modo semicontinuo.
Despues de llenar el volumen entre las placas de electrodos, se aplica un campo electrico. El campo electrico generalmente se da como pulso electrico. La forma del pulso puede ser decaimiento exponencial, onda cuadrada o diferentes combinaciones. Es importante destacar que la intensidad del campo electrico debe ser suficiente para crear poros en las membranas celulares. Los acidos nucleicos pueden entrar en las celulas por difusion o electroforesis. Despues, las celulas electroporadas se eliminan del dispositivo, opcionalmente para un procesamiento adicional como, deteccion, enriquecimiento y/o agotamiento de ciertos subconjuntos de celulas y/o cultivo celular. Para electroporar mas celulas (cantidades mas altas de celulas o un mayor volumen de suspension celular), se puede repetir el proceso de llenado, mezclado, electroporacion y eliminacion. Ademas, el propio proceso de electroporacion se puede repetir en la misma muestra de celulas, con o sin etapa de lavado, cultivo o separacion.
El campo electrico aplicado puede destruir electrodos hechos de metales como el aluminio. Para permitir multiples secuencias de electroporacion del dispositivo usando las mismas placas de electrodos, las placas pueden recubrirse con metales resistentes a la corrosion electroqmmica. Revestimientos conductivos como metales nobles, por ejemplo, el oro puede usarse para proteger las placas de los electrodos. En una variante, el desechable de la invencion comprende un primer electrodo de metal y el segundo electrodo de metal fabricado de titanio cubierto con una capa de oro. Para evitar diferentes intensidades de campo entre los electrodos, los electrodos deben estar dispuestos en paralelo con una distancia constante entre sf sobre toda la superficie de los electrodos. Preferiblemente, el primer electrodo de metal y el segundo electrodo de metal estan separados por una distancia de 2-4 mm en una disposicion paralela con variaciones de distancia menores que +-20 pm. Ademas, la superficie de los electrodos debe ser lo mas suave posible sin poros ni picos. Se prefieren los electrodos que tienen una rugosidad Rz de 1 a 10 pm.
La Fig. 1 es una vista en perspectiva de un cartucho de electroporacion desechable simplificado. Los elementos en el cartucho son un puerto 11 de entrada y un segundo puerto 12 de entrada, y ellos mezclan la columna 13. En el puerto 11 de entrada, el segundo puerto 12 de entrada y la columna 13 de mezcla comprenden los elementos de entrada al cartucho 10 desechable. Al salir de la columna 13 de mezcla, el fluido de muestra entra luego en una cavidad que incluye el primer electrodo 21 y el segundo electrodo 23. Los electrodos 21 y 23 pueden ser condensadores de plano paralelo, de modo que los elementos 21 y 23 son planos o estructuras conductoras separadas por un pequeno espacio. El voltaje se aplica a la placa 21 y 23 mediante las pestanas 20 y 22 y el fluido sale del cartucho desechable a traves del puerto 15 de salida.
Puede introducirse una muestra de fluido a traves del puerto 11 de entrada, elementos adicionales tales como, por ejemplo, ARN, entran a traves del puerto 12 de entrada secundario. Por ejemplo, se puede introducir una suspension de celulas a traves del puerto 11 de entrada y se puede llenar una solucion de acido nucleico a traves del segundo puerto 12 de entrada. La suspension celular y la solucion de acido nucleico se mezclan en el canal 13 de mezcla y se introducen en una cavidad que contiene las placas electrostaticas de 21 y 23.
La suspension celular, habiendose mezclado con la solucion de acido nucleico, fluye a traves del espacio entre las placas 21 y 23 y se somete al campo electrico aplicado entre las dos placas. Como es bien sabido en la tecnica, este campo electrico genera poros en las membranas celulares, permitiendo que el acido nucleico se difunda dentro de la celula. Despues de la electroporacion, las celulas modificadas pueden ser retiradas del desechable por el puerto 15 de salida.
El desechable de acuerdo con la invencion se forma preferiblemente uniendo dos mitades del desechable, comprendiendo las mitades respectivamente el primer o el segundo electrodo. Esta realizacion se muestra con mas detalle en la FIG. 2 en vista lateral. El cartucho 10 desechable de electroporacion puede estar compuesto de dos partes, una superficie 100 superior y una parte 200 inferior. Estas dos partes pueden estar hechas de plastico moldeado y soldarse juntas mediante radiacion laser o un campo de HF. El cartucho 10 desechable de electroporacion puede incluir ademas un puerto 160 adicional y dos puertos 140 y 150, de salida cuya funcion se describira a continuacion. Finalmente, el cartucho 100 de electroporacion desechable tambien puede incluir las dos placas 210 y 220, de electrodo que estan separadas por un espacio. La distancia entre los dos electrodos (espacio) se elegira segun
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el voltaje aplicado y el campo electrico requerido. Las distancias comunes de los electrodos son de 2 a 4 mm. Los espacios mas pequenos podnan ser favorables para permitir campos electricos altos de mas de 2 kV/cm, por ejemplo, 100 pm. Ademas, el espacio debe ser suficiente para permitir el flujo del fluido de entrada y no debe danar las celulas, por ejemplo, por el estres de cizallamiento. En algunas realizaciones, el campo electrico puede ser del orden de 2 kV/cm.
La fig. 3 es una vista en perspectiva de un cartucho 10 de electroporacion desechable ensamblado. La vista ensamblada incluye la superficie 100 superior y la superficie 200 inferior que se muestran juntas y la FIG. 3 tambien muestra los dos puertos 110 y 120 de entrada en esta superficie 100 inferior, junto con la primera placa 210 de electrodo tambien en la superficie 100 inferior.
En la superficie 200 superior estan los dos puertos 140 y 150 de salida, junto con la segunda placa 220 de electrodo. Debe entenderse que los terminos superior e inferior, son arbitrarios, y el cartucho 10 puede verse en cualquier orientacion arbitraria. La fig. 3 tambien muestra los puertos 140 y 150 de salida, que estan en la superficie 200 superior. Por ultimo, la superficie 200 superior tambien puede incluir, como puede verse en la FIG. 3, el canal 130 de mezcla conectado al primer canal 110 de entrada, y el canal 120 de entrada secundario. El canal de mezcla esta destinado a mezclar el contenido de los dos canales de entrada. El canal 130 de mezcla puede tener forma de serpentina o cualquier otra estructura que soporte los dos fluidos para fusionarse. El canal 130 de mezcla introduce el fluido mezclado en la cavidad que contiene las placas 210 y 220 de electrodo. El canal 130 de mezcla puede incluir entre cinco y 15 vueltas de serpentina. Las vueltas de serpentina provocan la mezcla caotica de los dos componentes, la suspension celular y la solucion de acido nucleico.
El compartimento de fluido tiene una forma preferible para permitir el llenado y el drenaje sin burbujas. Por lo tanto, el canal de mezcla y al menos un puerto de salida pueden estar ubicados en los lados mas opuestos del compartimento de fluido, es decir, en el punto mas alto y mas bajo del compartimento de fluido. Ademas, el compartimento de fluido y las placas 220 y 230 de electrodo pueden tener una forma particular que evita el espacio muerto, como angulos obtusos y/o angulo agudo. Como se ilustra en la figura. 3, el compartimento de fluido y las placas opcionales pueden tener una forma de paralelogramo o trapezoidal.
Se debe entender que este paralelogramo es una realizacion a modo de ejemplo, y que la forma del compartimento de fluido y los electrodos puede tener cualquier forma arbitraria, incluyendo rectangular, circular, trapezoidal o cualquier otra forma de acuerdo con los requisitos de llenado sin burbujas del dispositivo.
En otra realizacion de la invencion, el desechable comprende adicionalmente al menos un electrodo adicional que aplica un potencial de tierra a al menos uno del primer puerto de fluido, el segundo puerto de fluido o el puerto de salida. Esta realizacion se muestra en las Figs. 3-5 con lenguetas 230 y 240 de conexion a tierra. Estas lenguetas se pueden usar para aplicar un potencial de tierra al fluido de entrada en el canal 112 y 122 y a los canales 140 y 150 de salida en consecuencia. La entrada y salida de fluido de la cavidad que contiene las placas de electrodos puede ser potencial de tierra.
Las Figuras. 4A y 4B ilustran con mayor detalle algunas de las caractensticas de la superficie 100 superior, que se mostro en la figura. 3. La figura 4A muestra la superficie exterior de la pieza 100 superior, y la figura 4B muestra la superficie interna de la porcion 100 superior. Como se muestra en la figura 4A, la porcion 100 superior puede incluir los dos puertos 110 y 120 de entrada, junto con la placa 210 de electrodo. Finalmente, la porcion superior tambien puede incluir la lengueta 240 de conexion a tierra.
La Figura 4B tiene topograffa que esta asociada con esas estructuras. Por ejemplo, la superficie interna de la estructura 100 superior puede tener un canal 112 que esta asociado con el puerto 110 de entrada. Este canal 112 puede servir para suministrar el fluido desde el puerto 110 de entrada al canal 130 de mezcla. De forma similar, la superficie interna de la porcion 100 superior tambien puede tener otro canal 122 asociado con el puerto 120 de entrada secundario. El canal 122 sirve para entregar el material adicional que se introduce a traves del segundo puerto 120 al canal 130 de mezcla. El diametro y la longitud del canal 112 y 122 definen una resistencia a los microfluidos. La proporcion de la resistencia a los microfluidos se usa para definir la proporcion de los dos fluidos entregados a traves del puerto 110 y 120 de entrada respectivamente. En el conjunto representado, el canal 112 comprende una parte estrecha mas larga en comparacion con el canal 110 para el cual la parte estrecha es mas corta.
El canal 130 de mezcla como se describio anteriormente, puede tener una forma de serpentina que sirve para mezclar los contenidos del canal 122 con los contenidos del canal 112. En esta variante del desechable, los contenidos del canal 122 con los contenidos del canal 112 se mejoran adicionalmente mediante la camara 114 de mezcla. La camara 114 de mezcla proporciona un volumen en el que un posible flujo laminar de los fluidos se convierte en flujo turbulento.
En una realizacion de ejemplo, el canal 110 de entrada secundario sirve para suministrar acido nucleico a una suspension de celulas que se introduce en el canal 112 de entrada. La solucion de acido nucleico se mezcla con las celulas diana que se incluyen en el fluido de entrada que se introdujo en el puerto 120 de entrada. En el canal 130 de mezcla, el acido nucleico se mezcla con las celulas diana de manera que el fluido que entra en la cavidad tiene esos elementos combinados.
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La huella de la placa de electrodo a 210 tambien se muestra en la figura 4B. En esta vista, puede mostrarse que la esquina inferior de la placa 210 de electrodo puede mostrarse por estar acoplada al puerto 160 de salida.
Tambien se muestra en la figura 4B la pestana 240 metalica. Esta pestana puede usarse para aplicar un potencial de tierra a los puertos 140 y 150 de salida en consecuencia. El fluido que sale de la cavidad que contiene placas de electrodos puede tener potencial de tierra.
Las figuras 5A y 5B muestran las superficies interna y externa de la porcion 200 inferior Como las Figuras 4A y 4B, incluidos en la ilustracion son los electrodos y la salida y los puertos. Y en particular, la porcion 200 inferior puede incluir un electrodo 220 y su lengueta 220 metalica asociada, a lo largo de la lengueta 230 metalica. Como se describio previamente, la placa 220 de electrodo puede servir para ser la placa opuesta de un condensador de placa paralela, que esta formado por una placa de electrodo a 210 y una placa 220 de electrodo.
Finalmente, la superficie 200 inferior tambien puede contener los puertos 140 y 150 de salida. Como se muestra en la figura 5A, el puerto 150 de salida puede acoplarse al hombro ascendente de la cavidad, mientras que el puerto 140 de salida puede acoplarse al hombro inferior de la cavidad. De esta manera, la salida 150 puede servir para evacuar aire, por ejemplo, burbujas de la cavidad.
Las figuras 6A y 6B son vistas en planta del conjunto de cartucho completo. La figura 6A muestra desde abajo, mientras que la figura 6B muestra una vista desde arriba. Una vez mas, debe entenderse que los terminos “debajo” y “arriba” son arbitrarios, y el cartucho puede mantenerse para facilitar la claridad, sin embargo, la figura 6A se menciona como unos pocos desde abajo, y la figura 6B se conoce como una vista desde arriba. En cualquier caso, los cartuchos se muestran como ensamblados, con la porcion 100 superior unida a la porcion 200 inferior. Incluidos en el conjunto estan, una vez mas, los dos puertos 110 y 120 de entrada y los puertos 140, 150 y 160 de salida. Tambien se muestran las tomas 230 y 240 de puesta a tierra, asf como las placas 220 y 210 de electrodo.
Como se describio con brevedad anteriormente, el conjunto 10 de cartucho desechable puede construirse a partir de plastico moldeado por inyeccion como poliestireno, polietileno, polipropileno o policarbonato. Los contornos de las diversas estructuras, que incluyen las placas 210 y 220 electrostaticas, pueden formarse en el material plastico. Ademas, ubicando areas para las lenguetas de puesta a tierra. Como con la figura 6, los dos puertos 110 y 120 de entrada se muestran fijados a la porcion 100 superior, y la salida hacia 140 y 150 o se muestran como pareja a la porcion 200 inferior. Ademas, las lenguetas de conexion 230 y 240 a tierra se muestran mejor desde abajo. Los orificios 110, 120, 140, 150 y 160 de fluido pueden formarse en el material plastico moldeado por inyeccion. Al mismo tiempo, la estructura de serpentina y/o los elementos agitadores del canal de mezcla y la camara de mezclado opcional tambien pueden formarse en la parte apropiada del desechable. Pueden formarse areas de ubicacion para todos los componentes metalicos, que incluyen las cintas 230 y 240 de puesta a tierra, y las placas 220 y 210 de electrodo en los elementos apropiados. El plastico moldeado por inyeccion se puede encontrar con el area de asiento para cada uno de estos componentes. Las partes metalicas pueden moldearse directamente en las partes. Alternativamente, se puede aplicar pegamento al material plastico y las estructuras metalicas se pueden pegar en su lugar. Una vez que la placa de electrodo 220 se forma en la porcion 200 inferior, y la placa 210 de electrodo se forma en la porcion 100 superior, las porciones superior e inferior se pueden ensamblar juntas. El ensamblaje puede ser fijado mediante soldadura laser, soldadura de HF, union por plasma, encolado o cualquier otra tecnica adecuada para fijar dos piezas de plastico juntas.
Despues de la fabricacion, otros elementos de fluido como tubos pueden unirse a los dos puertos 110 y 120 de entrada, asf como a los puertos 140, 150 y 160 de salida. Una fuente neumatica puede estar acoplada al puerto 160 de escape. El elemento neumatico puede servir para absorber lfquidos en el espacio entre los electrodos.
El suministro de voltaje 300 puede estar acoplado a las lenguetas metalicas 210 y 220, para aplicar un potencial de voltaje entre las dos placas 210 y 220 de electrodo. Luego se aplica vado al puerto 140 o 150 de salida y por lo tanto tambien al canal 130 y al puerto 110 de entrada, asf como tambien al puerto 120 de entrada secundario. Los extremos del fluido se mezclan en el canal 130 de mezcla, y se permite que el fluido pase a traves de la cavidad, y entre los electrodos 210 y 220. Despues de que el espacio entre los electrodos se haya llenado, se puede aplicar un campo electrico. El campo electrico induce poros en las membranas celulares, permitiendo que los acidos nucleicos entren en las celulas diana por difusion o electroforesis. Al salir a traves del puerto 160 de salida, la corriente de fluido incluye celulas diana cargadas con los acidos nucleicos. El tiempo total para que esto suceda dependera de la aplicacion, pero quizas del orden de 10 a 20 minutos. El volumen total de la cavidad puede ser del orden de 0.05 a 5 ml.
Otro objeto de la invencion es un proceso para la electroporacion de celulas en el desechable como ya se ha divulgado, en el que se proporciona una suspension celular a un primer puerto de fluido como primer fluido y se proporciona un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas al segundo puerto de fluido como segundo fluido; los fluidos primero y segundo se proporcionan al compartimento de fluido en una proporcion de mezcla predefinida aplicando una diferencia de presion entre el primer y el segundo puerto de fluido y al menos un puerto de salida; aplicar un campo electrico entre el primer y el segundo electrodo, electroporando asf las celulas con al menos un compuesto; y retirando los fluidos del compartimento de fluido.
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El proceso de la invencion puede realizarse en varias variantes. Para permitir el procesamiento automatico continuo o semicontinuo, el primer y el segundo fluido se proporcionan al compartimento de fluido a un nivel de llenado predefinido. El nivel de llenado del compartimento de fluido se puede determinar midiendo la capacitancia entre el primer y el segundo electrodo, por ejemplo, midiendo la capacidad hasta que se alcanza la capacidad maxima. En otra variante, el nivel de llenado se determina midiendo la resistencia entre los electrodos de puesta a tierra (230 y 240 en la figura 3). Ademas, el nivel de llenado podna controlarse mediante la diferencia de presion aplicada al desechable.
En otra variante del proceso, despues de retirar los fluidos del compartimento de fluido, las celulas electroporadas se detectan y agotan de los fluidos. Las celulas electroporadas asf concentradas podnan procesarse y/o cultivarse adicionalmente. La deteccion de las celulas electroporadas y su agotamiento se puede lograr por metodos conocidos por una persona experta en la tecnica para la clasificacion celular como FACS o clasificacion magnetica. Por otro lado, las celulas no electroporadas (agotadas de las celulas electroporadas) se pueden proporcionar a otro paso del proceso de electroporacion para mejorar el rendimiento global de la electroporacion.
En otra variante mas del proceso, las celulas electroporadas se cultivan despues de eliminar los fluidos del compartimento de fluido. Cualquier metodo conocido por una persona experta en la tecnica se puede usar para el cultivo. En una realizacion preferida, el cultivo se realiza en una camara centnfuga como se divulgo, por ejemplo, en los documentos WO2009072003A2 y/o WO2013072288 A1. Para esta variante de la invencion, se pueden usar diversos lfquidos (medios) de cultivo celular conocidos en la tecnica de cultivo celular, que incluyen uno o mas de los siguientes medios DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, medio de Iscove, X-VIVO™, cada uno opcionalmente complementado, por ejemplo, con suero de ternera fetal, suero humano o sustitutos de suero u otros nutrientes o estfmulos celulares como citoquinas. Los medios pueden ser medios celulares estandar como los medios mencionados anteriormente o medios especiales para, por ejemplo, cultivo de celulas humanas primarias (por ejemplo, para celulas endoteliales, hepatocitos o queratinocitos) o celulas madre (por ejemplo, maduracion de celulas dendnticas, expansion hematopoyetica, queratonocitos, celulas madre mesenquimales o expansion de celulas T). Los medios pueden tener suplementos o reactivos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, albuminas y protemas de transporte, aminoacidos y vitaminas, antibioticos, factores de fijacion, factores de crecimiento y citoquinas, hormonas o agentes solubilizantes. Varios medios estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de LifeTechnologies o Sigma-Aldrich.
La temperatura durante el proceso de cultivo puede controlarse y ajustarse segun corresponda para los tipos de celulas que han sido electroporadas. Ademas, las celulas pueden suministrarse con gases tales como O2, N2 y CO2 segun sea apropiado y conocidos por los expertos en la tecnica. Si la etapa de cultivo de celulas se realiza en una camara de centnfuga, las celulas pueden suministrarse con lfquidos y gases de cultivo celular durante la rotacion de la camara de centnfuga.
El tipo de celula a electroporar no esta particularmente limitado. Con el metodo de la invencion, se pueden procesar especialmente celulas eucariotas, que pueden originarse de cualquier fuente de mairnfero o humano, tal como tumor, sangre, tejido, medula osea o lmeas celulares. Son adecuados, por ejemplo, los tipos celulares seleccionados del grupo que consiste en celulas humanas, fibroblastos, celulas madre embrionarias, celulas pluripotentes inducidas, queratinocitos, melanocitos, celulas madre mesenquimales, celulas epiteliales, celulas T, celulas T reguladoras, celulas B, Celulas NK, celulas neuronales, celulas dendnticas, celulas madre (adultas, embrionarias, hematopoyeticas), celulas procedentes del epitelio, ectodermo, endodermo, endotelio, mesodermo, tejido epitelial, lamina basal, vasculatura, tejido conjuntivo, tejidos fibrosos, tejido muscular, musculo visceral o liso, musculo esqueletico, musculo cardfaco, tejido nervioso, cerebro, medula espinal, nervios craneales, nervios espinales o neuronas motoras.
El dispositivo y el metodo de la invencion se pueden usar en un proceso de electroporacion continuo o semicontinuo de celulas, seguido opcionalmente por una etapa de cultivo (expansion) de las celulas electroporadas. Para reducir las perdidas y/o la contaminacion de las celulas, se propone un sistema cerrado (en cuanto al medio ambiente). Por consiguiente, un objeto adicional de la invencion es un sistema para la electroporacion de celulas que comprende el desechable como se divulgo, un primer recipiente de almacenamiento que contiene una suspension celular; un segundo contenedor de almacenamiento que contiene un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas; un tercer contenedor de almacenamiento para celulas electroporadas; una bomba y/o una fuente de vacfo; y un conjunto de tubos que proporciona comunicacion fluida entre los contenedores de almacenamiento y el desechable, en el que el sistema esta cerrado a la atmosfera exterior. Preferible, el tercer contenedor de almacenamiento se configura como camara de cultivo. Si es necesario, pueden proporcionarse recipientes de almacenamiento adicionales para fracciones de celulas empobrecidas/enriquecidas, fluidos de lavado, medios de cultivo o desechos.
El termino “cerrado a la atmosfera exterior” se refiere a un sistema que esta configurado para excluir cualquier intercambio flrndico o gaseoso en el sistema, por ejemplo, utilizando contenedores cerrados como bolsas de plastico como contenedor de almacenamiento provisto de conectores mecanicos al conjunto de tubos (como conectores Luer) y si es necesario, filtros esteriles apropiados. En vista del proceso, el termino “cerrado a la atmosfera exterior” se refiere a un sistema que esta configurado para mantener la esterilidad durante todo el proceso de electroporacion.
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Aunque se han descrito varios detalles junto con las implementaciones de ejemplo, descritas anteriormente, diversas alternativas, modificaciones, variaciones, mejoras y/o equivalentes sustanciales, ya sean conocidos o que sean o puedan ser actualmente imprevistos, pueden ser evidentes tras revisar la divulgacion anterior. Ademas, los detalles relacionados con los metodos espedficos, dimensiones, usos de materiales, formas, tecnicas de fabricacion, etc. estan destinados a ser solo ilustrativos, y la invencion no se limita a tales formas de realizacion. Los descriptores como arriba, abajo, izquierda, derecha, atras, etc. son arbitrarios, ya que se debe entender que los sistemas y metodos se pueden realizar en cualquier orientacion. En consecuencia, las implementaciones ejemplares expuestas anteriormente, tienen la intencion de ser ilustrativas, no limitativas.
Ejemplos
Proporcion de mezcla definida por los canales de resistencia
Para determinar la proporcion de mezcla usando los canales microflmdicos, se uso una solucion tamponada con fosfato para imitar la suspension celular y una solucion de tinta para imitar la solucion de acido nucleico. Un cartucho de electroporacion como se muestra en las Figs. 1-7 se presento con estas soluciones conectandose a una lmea de vado y la solucion asf mezclada se retiro nuevamente del cartucho. Para varios pasos de llenado, la solucion mezclada se ha recogido y la relacion de mezcla se determino de acuerdo con valores estandar determinados mezclando diferentes proporciones de tampon y tinta.
Para determinar la relacion de mezcla de las muestras y los patrones, se midio la absorcion de la tinta usando un fotometro optico. Se llenaron 15 a 20 ml de solucion tamponada con fosfato en una bolsa conectada al puerto 120 de entrada del cartucho de electroporacion mediante un tubo corto. Una segunda bolsa llena con aproximadamente 3 a 4 ml de solucion de tinta se conecto al segundo puerto 110 de entrada del cartucho de electroporacion por otro tubo corto. El fluido de cada tubo era controlado por una valvula de perforacion. Una bomba peristaltica se conecto al puerto 140 de salida a traves de otro tubo. La conexion de la bomba al cartucho de electroporacion tambien podna controlarse con otra valvula de perforacion. Se conecto un cuarto tubo en el puerto 160 de salida para recoger la mezcla de las dos soluciones. El fluido de salida tambien fue controlado por una valvula de perforacion. Se cargo aproximadamente 1 ml en el cartucho de electroporacion y se midio la absorbancia de cada mezcla eliminada.
Como se muestra en la FIG. 8, la relacion de mezcla aumenta de aproximadamente 1:7 a mas de 1:60 si dos valvulas de entrada y la valvula 140 de salida se abren simultaneamente cuando se arrancan las bombas peristalticas. A medida que el nivel de fluido en las bolsas y tubos de entrada disminuye, la diferencia de presion hidrostatica cambia y, por lo tanto, la proporcion de mezcla de microfluidos se deteriora (lmea punteada). Cuando la bomba peristaltica genera un vado bajo por adelantado y luego las valvulas se abren, observamos un aumento en la relacion de mezcla, pero menos dramatico. Incrementando aun mas el vado a menos de -100 mbar dio una relacion de mezcla constante de 1:5.1.
Electroporacion
Con el fin de probar la fiabilidad del dispositivo de la invencion, se sometio a electroporacion una suspension de celulas Jurkat y, despues de la electroporacion, las celulas se analizaron mediante un citometro de flujo. Los resultados se muestran en la fig. 9a-g, con a) Electroporacion de control sin plasmidos, b) Electroporacion de control con solo plasmido mCherry. c) Electroporacion de control con solo plasmido eGFP. d) Electroporacion de control con plasmido mCherry y eGFP se mezcla manualmente antes de la electroporacion. e) Celulas de electroporacion premezcladas con plasmido mCherry y posteriormente anadido plasmido eGFP sin mezcla de microfluidos. f) Celulas de electroporacion premezcladas con plasmido mCherry y plasmido eGFP anadido mediante mezcla de microfluidos. Lo siguiente se refiere a la FIG. 9:
Sin ningun acido nucleico, no se detecto fluorescencia (a). Mezclando manualmente las celulas con un plasmido que codifica la protema roja fluorescente mCherry, aproximadamente el 35% de las celulas expresan la protema fluorescente roja como puede detectarse mediante la fluorescencia roja. Mezclando las celulas con un plasmido que codifica la protema fluorescente verde GFP, aproximadamente el 44% de las celulas expresan la protema verde fluorescente como puede detectarse mediante la fluorescencia verde. Cuando ambos plasmidos se mezclan manualmente con la suspension celular, las celulas electroporadas presentan fluorescencia en rojo y verde. Las celulas con el plasmido que codifica la protema roja fluorescente mCherry se mezclaron manualmente y se aplicaron a la bolsa conectada al puerto 120 de entrada del cartucho de electroporacion mediante un tubo corto. Una segunda bolsa llena con una solucion que contiene un plasmido que codifica la protema fluorescente verde GFP se conecto al segundo puerto 110 de entrada del cartucho de electroporacion mediante otro tubo corto. El fluido de cada tubo fue controlado por una valvula de perforacion. Una bomba peristaltica se conecto al puerto 140 de salida a traves de otro tubo. La conexion de la bomba al cartucho de electroporacion tambien podna controlarse con otra valvula de perforacion. Se utilizo un cuarto tubo conectado en el puerto 160 de salida para recoger la mezcla de las dos soluciones. El fluido de salida tambien fue controlado por una valvula de perforacion. Se llenaron aproximadamente 0.8 ml de suspension celular en el cartucho de electroporacion seguido de aproximadamente 0.2 ml de solucion de acido nucleico. Luego se aplico un pulso electrico. Despues de la electroporacion, se recogio la suspension celular y las celulas se analizaron mediante citometna de flujo.
Como se puede ver en la FIG. 9e, ademas de la expresion de las celulas de ambas protemas fluorescentes, aproximadamente el 7% expresa solo la protema fluorescente roja. Estas celulas no se mezclaron bien con el plasmido que codifica la protema fluorescente verde. A continuacion, las celulas usadas se mezclaron manualmente con el plasmido que codifica la protema roja fluorescente mCherry y esta mezcla se aplico en una bolsa conectada al puerto 5 120 de entrada del cartucho de electroporacion mediante un tubo corto. Una segunda bolsa llena con una solucion
que contiene un plasmido que codifica la protema fluorescente verde GFP se conecto al segundo puerto 110 de entrada del cartucho de electroporacion mediante otro tubo corto. El fluido de cada tubo fue controlado por una valvula de perforacion. Una bomba peristaltica se conecto al puerto 140 de salida a traves de otro tubo. La conexion de la bomba al cartucho de electroporacion tambien podna controlarse con otra valvula de perforacion. Se utilizo un cuarto 10 tubo conectado en el puerto 160 de salida para recoger la mezcla de las dos soluciones. El fluido de salida tambien fue controlado por una valvula de perforacion. Se cargo aproximadamente 1 ml en el cartucho de electroporacion usando los canales de mezcla de microfluidos y el elemento 130 de mezcla de microfluidos. Luego se aplico un pulso electrico. Despues de la electroporacion, se recogio la suspension celular y las celulas se analizaron mediante citometna de flujo. La fig. 9f) muestra que las celulas electroporadas expresan ambas protemas fluorescentes que 15 muestran la mezcla homogenea de las celulas con la solucion de acido nucleico del plasmido que codifica la protema fluorescente verde.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un desechable para la electroporacion de celulas, que comprende un compartimento de fluido en un interior del desechable; un primer puerto de fluido para proporcionar la suspension de celulas al compartimento de fluido, y un segundo puerto de fluido para suministrar un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas al compartimento de fluido; un primer electrodo y un segundo electrodo dispuestos en el compartimento de fluido;
    al menos un puerto de salida que suministra el fluido desde el compartimento de fluido donde el primer y segundo puerto de fluido tienen una comunicacion de fluido a un canal de mezcla que tiene una comunicacion de fluido al compartimento de fluido caracterizado porque el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido son provisto de canales con diferente resistencia microflmdica a los fluidos.
  2. 2. El desechable de la reivindicacion 1, en el que el canal de mezcla tiene una forma de serpentina y/o comprende elementos agitadores o una camara de mezcla.
  3. 3. El desechable de la reivindicacion 1, en el que el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido estan provistos de canales que tienen una resistencia microflmdica para mantener una relacion de mezcla de 1:5 a 1:10 del primer fluido al segundo fluido.
  4. 4. El desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido estan en comunicacion fluida con al menos una bomba que suministra fluidos desde el primer puerto de fluido y el segundo fluido al compartimento de fluido.
  5. 5. El desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos un puerto de salida esta en comunicacion fluida con al menos una fuente de vado absorbiendo de esta manera fluidos desde el primer puerto de fluido y el segundo puerto de fluido al compartimento de fluido.
  6. 6. El desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el canal de mezcla y al menos un puerto de salida estan situados en los lados mas opuestos del compartimento de fluido para permitir el llenado sin burbujas del compartimento de fluido con fluido.
  7. 7. El desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas al menos un electrodo adicional que aplica un potencial de tierra a al menos uno del primer puerto de fluido, segundo puerto de fluido o puerto de salida.
  8. 8. El desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el primer electrodo de metal y el segundo electrodo de metal comprenden titanio cubierto con una capa de oro.
  9. 9. Procedimiento para la electroporacion de celulas en un dispositivo desechable segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se proporciona una suspension celular a un primer puerto de fluido como primer fluido y se proporciona un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas al segundo puerto de fluido como segundo fluido; los fluidos primero y segundo se proporcionan al compartimento de fluido en una proporcion de mezcla predefinida aplicando una diferencia de presion entre el primer y el segundo puerto de fluido y al menos un puerto de salida; aplicar un campo electrico entre el primer y el segundo electrodo, electroporando asf las celulas con al menos un compuesto; y retirar los fluidos del compartimento de fluido.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que los fluidos primero y segundo se proporcionan al compartimento de fluido a un nivel de llenado predefinido; y en el que el nivel de llenado del compartimento de fluido se determina midiendo la capacitancia entre el primer y el segundo electrodo.
  11. 11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en el que despues de retirar los fluidos del compartimento de fluido, las celulas sometidas a electroporacion se detectan y agotan de los fluidos.
  12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 9 o 10, en el que despues de eliminar los fluidos del compartimento de fluido, se cultivan las celulas electroporadas.
  13. 13. Sistema para la electroporacion de celulas que comprende un desechable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un primer contenedor de almacenamiento que contiene una suspension de celulas; un segundo contenedor de almacenamiento que contiene un fluido que comprende al menos un compuesto para ser electroporado en las celulas; un tercer contenedor de almacenamiento para celdas electroporadas; una bomba y/o una fuente de vacfo; y un conjunto de tubos que proporciona comunicacion fluida entre los recipientes de almacenamiento y el desechable, en el que el sistema esta cerrado a la atmosfera exterior.
  14. 14. Sistema segun la reivindicacion 13, en el que el tercer contenedor de almacenamiento esta configurado como camara de cultivo.
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