SI22368A - Konicasta komora z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo manjsega volumna, za elektrofuzijo in gensko transfekcijo - Google Patents

Abstract

Predmet tega izuma je aparat za elektroporacijo spipetrom, priprava z vec elektrodami z minimiziranim nehomogenim elektricnim poljem in kompaktnim polnilcem za elektrodne komore za minimiziranje nehomogenega elektricnega polja. Konicasta komora z vgrajenimi elektrodami je oznacena s tem, da je odprtina (5) pozicionirana v sredini ohisja (1) in vzdolzni smeri skozi ohisje (1) in da je od dveh do sest elektrod (2) namescenih paralelno in simetricno v notranjost povrsine ohisja (1) in vzdolzno k odprtini (5)in da delno segajo v navedeno odprtino (5) ter daimata navedeni elektrodi (2) konektorje (3) za povezavo z zunanjostjo. Opisana je tudi konicasta komora z vgrajenimi elektrodami, pri kateri je kompaktni polnilec (6) vstavljen v navedeno odprtino (5) z luknjo (7), in je v vzdolzni smeri ohisja (1) in kompaktnega filtra (6) namescenih od dveh do sest elektrod (2) paralelno in simetricno v notranjost sticisca povrsin ohisja (1) in kompaktnega polnilca (6) ter imata navedeni elektrodi (2) konektorje (3) zapovezavo z zunanjostjo.

Description

Predmet tega izuma je aparat za elektroporacijo s pipetrom, priprava z več elektrodami z minimiziranim nehomogenim električnim poljem in kompaktnim polnilcem za komore z vgrajenimi elektrodami za minimiziranje nehomogenega električnega polja.

Ta izum se nanaša na koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo manjšega volumna, za elektrofuzijo in gensko transfekcijo. Izum spada na področje elektroporacije bioloških celic v suspenziji in, natančneje, na področje tehnik ter priprav za elektroporacijo s ciljem, električno permeabilizirati celično membrano ter, posledično, vstaviti z elektriko katerokoli aktivno farmacevtsko - kemično ali biološko aktivno - substanco, in ciljem genske transfekcije ter celične fuzije. Rezultat izuma so elektrode za hitro in učinkovito elektroporacijo majhnih in kontroliranih volumnov celičnih suspenzij, ki obdržijo svojo visoko sposobnost rasti zaradi minimalnih mehanskih ukrepov in možnosti uporabe električnih impulzov v različnih smereh, s čimer se poveča membransko območje elektroporirane celice in s tem učinkovitost elektroporacije brez bistvene izgube glede preživetja celice.

OZADJE IZUMA

Uporaba elektroporacije

Elektroporacija (imenovana tudi elektropermeabilizacija) celic se aplicira za različne namene, ki uporabljajo permeabilizirano stanje celične membrane.

Električna vsaditev ali električna ekstrakcija predstavljata uvedbo ali ekstrakcijo različnih molekul, kot so zdravila, proteini ali geni, v celice. Vsaditevmajhnih molekul se učinkovito

-2doseže z uporabo nekaj kratkih pravokotnih impulzov visoke napetosti. Ta način se sedaj učinkovito uporablja v elektrokemoterapiji za uvajanje zdravil v celice tumorja in situ pacientov. Elektroekstrakcija se uporablja za ekstrakcijo izdelkov iz kvasa pri postopkih, ki potekajo v nasprotni smeri toka.

Genska elektrotransfekcija in vitro ter in vivo predstavlja vsaditev plazmidov, ki vsebujejo ustrezni genski material, v celice. DNK je velika molekula, za katero je bilo ugotovljeno, da se jo lahko uspešno vsadi z uporabo eksponencialno razpadajočih impulzov ali kombinacijo krajših impulzov visoke napetosti in daljših impulzov nizke napetosti.

Drugi sorodni postopek je elektrofuzija celic. Sestoji iz dveh stopenj . Ena stopnja povzroči fuzogenizacijo membran s pomočjo elektroporacije, s pomočjo druge pa dosežemo tesne kontakte med celicami. Le-te lahko zagotovimo ali pred elektroporacijo ali kmalu po le-tej (v prvih nekaj minutah), dokler so membrane še v fuzogenem stanju

Mehanska obdelava

Pri veliki večini obstoječih metod za elektroporacijo celic v suspenziji se uporabljata ali komora ali ki veta ali pretočni sistem z enim parom ali več pari ploščatih elektrod. Celična suspenzija ali celice, gojene na podlagi, položimo med elektrodi in čez njiju spustimo napetostni impulz. Celice v suspenziji se ponavadi pipetirajo v elektrodnih komorah ali kivetah ali zunaj enih izmed njih.

Te navedbe predstavljajo mehansko obdelavo, ki je povezana z dvema problemoma. Prvi je občutna izguba volumna, drugi pa, da je pipetiranje škodljivo za celice in bi bilo lahko celo smrtno za določene celične tipe, ki so bolj občutljivi, posebej potem, ko so bili izpostavljeni elektroporaciji.

Elektroporirane celice imajo poškodovane membrane in so bistveno bolj občutljive za pipetiranje, ki na celice pritiska samo s silo. To se pojavlja kot problem npr. pri elektrofuzijskih protokolih, kjer dosežemo medcelični stik po elektroporaciji. Celice je potrebno premikati iz komore k cevi centrifuge z mikropipeto takoj po elektroporaciji.

-3Maihen volumen

Drug problem je velikost obstoječih komor. Molekule (barvila, plazmidi), uporabljeni pri poskusih, so pogosto dragi in na voljo le v majhnih količinah. Dodatno so celice, ki naj bi jih povezali ali transfektirali, pogosto dragocene in na voljo le v majhnih količinah. Potrebno je torej omogočiti delo z majhnim volumnom.

Za elektroporacijo je pomembno lokalno električno polje. Za nekatere celice, npr. majhne celice, potrebujemo visoko napetost do distančnega kvocienta. To se lahko doseže samo z majhno razdaljo med elektrodama, ker so generatorji elektičnih impulzov omejeni pri napetosti, ki jo lahko generirajo. Problem majhnih distančnih komor ali ki vet je raba le-teh brez občutne izgube volumna vzorca. Težko je napolniti takšne komore brez zračnih mehurčkov, ki v znatni meri spremenijo električno razporeditev polja v vzorcu. Napolniti komoro ali kiveto s celično suspenzijo brez zračnih mehurčkov in dobiti ven celično suspenzijo po elektroporaciji je težko, če ne nemogoče. Tudi čiščenje je težavno. Potrebno je omogočiti učinkovito praznjenje, napolnitev in čiščenje majhnega prostora med elektrodama.

Po ameriškem patentnem spisu US6492175 obstaja pretočni sistem, ki omogoča delo z majhnimi volumni in zmanjšuje mehanske manipulacije, vendar omogoča samo obdelavo celic z impulzi v eni ali dveh nasprotnih smereh.

Različne smeri impulzov

Večina obstoječih elektrodnih sistemov dovoljuje uporabo impulzov samo v eni ali večinoma v dveh nasprotnih smereh. Bipolarni impulzi so opisani v mednarodni patentni prijavi WO92/06185. V zadnjih nekaj letih je bilo dokazano, da uporaba impulzov v različnih smereh povzroči učinkovitejšo permeabilizacijo in gensko elektrotransfekcijo. To je pomembno tudi pri celični elektrofuziji in vsaditvi proteinov v membrano. Razlog za to je večja površina elektroporirane membrane, ki se jo lahko doseže s takšnimi impulzi brez bistvene izgube glede celičnega preživetja.

Standardna možnost za povečanje površine elektroporirane membrane celic je povečanje električne moči, kar nezadržno vodi do precejšnjega zmanjšanja celičnega preživetja. Različne

-4smeri impulzov pa povečujejo območje permeabilizirane membrane, ne da bi znatno vplivale na celično preživetje. Treba je zagotoviti možnost elektrofuzije celične suspenzije, ki bi jo lahko elektroporirali v različnih smereh. Možnost elektroporacije mora biti dana, potem ko zagotovimo celični kontakt ali pred tem.

Patent US6746441 opisuje pretok skozi aparat s komorami z vrtljivimi električnimi polji, kijih generirata dve ali več kot dve (štiri ali šest) elektrodi. Vendar je to pretok skozi sistem za ex vivo gensko terapijo, ki ne dopušča operacij majhnega volumna. Patent US2005048651 opisuje koničaste elektrode, ki vsebujejo tudi različne vrste prevodnih površinskih elektrod. Le-te so predvidene za prehajanje različnih substanc iz notranjosti konice do tarč (celic itd.), ki so zunaj konice in so sinhronizirane na način, da uporabimo električne impulze. Vendar pa ni predvideno, da bi celice vsadili v lumen koničastih elektrod in jih le-tam električno obdelali.

Sočasna elektroporaciia za elektrofuziio

Precejšen problem predstavlja postopek za fuzijo dveh različnih celičnih vrst. To se npr. dogaja pri hibridoma tehnologiji za pridobivanje monoklonalnih protiteles, pri kateri se morajo limfociti B združiti s fuzijskimi partnerji mieloma. Slednji je lahko dvakrat tako velik kot limfociti. Skupna električna obdelava katerekoli od obeh celičnih vrst v tem primeru ni optimalna. Ločena elektroporacija in celično kontaktiranje, ki sledita elektroporaciji, pa sta potrebna za optimalen rezultat fuzijskega postopka. Isti problem je prisoten pri kateremkoli celičnem paru, ki je različno občutljiv za električno polje iz kateregakoli razloga razen različne velikosti.

Kiveta po mednarodni patentni prijavi W003/050232 vsebuje vsadke podporne strukture, ki drži porozno membrano in omogoča lažjo celično fuzijo na membranski osnovi. V takšni ki veti se obe celični vrsti elektroporirata hkrati. V tem primeru se celice manjše velikosti ali suboptimalno permeabilizirajo ali pa se večje celice poškodujejo. Enak je položaj s sistemoma v skladu z DE10359189 in DE10359190. Tudi v US4882281 in US513470 sta opisani aparaturi za elektroporacijo, s katerima se izognemo mehanski obdelavi, ker celice obdelujemo v posodah s kulturami, čeprav je za nadaljnjo fuzijo ločeno elektroporiranih celic prenos celic še vedno potrebno izvesti s pipetiranjem.

-5Narava fuzijskega postopka zahteva, da se mora celični kontakt vzpostaviti v kratkem času po elektroporaciji, ko so celične membrane še vedno v tako imenovanem fuzogenem stanju. Pipetiranje celic iz dveh ločenih komor je dodatno k temu, da se inducira mehanski stres, zaradi česar se celice poškodujejo, tudi počasno in predstavlja precejšen problem pri doseganju celičnega kontakta v kratkem času, kije potreben za učinkovito celično elektrofuzijo.

Polprevodniška notranjost elektrodne koničaste komore

Pred kratkim je bilo dokazano, daje celično preživetje najnižje blizu elektrod. Razlog za to so elektrokemične reakcije, ki nastanejo na meji med elektrodo in medijem. V DE20302861U1 je bilo zato predlagano, da bi elektrode pokrili s tankim slojem prevleke, ki bi bila biološko ustrezna, tako da bi obdržali celice stran od te meje.

Pojavlja pa se drug problem, ki zadeva homogenost in porazdelitev električnega polja med elektrodama. Uporabljeno električno polje (z določenimi električnimi impulzi) ni homogeno na celotnem prostoru med elektrodama, ampak le v srednjem delu tega prostora. Samo celice v srednjem delu so izpostavljene želenemu električnemu polju.

Problem, ki še ni rešen, je elektroporacija vnaprej definiranih majhnih volumnov celic v suspenziji. To bo zmanjšalo stroške ali omogočilo poskuse genske transfekcije, vsaditve proteinov in celične fuzije, kadar je količina proteinov, plazmidov ali celic omejena.

Predmet pričujočega izuma leži v uspešni elektroporaciji celic z impulzi, ki dosežejo celico v različnih smereh, s čimer je hkrati z možnostjo hitre obdelave celic dosežena minimalna mehanska obremenjenost celic.

Nadaljnji predmet sedanjega izuma je, da zgradimo aparaturo za elektroporacijo, ki bi omogočala celično fuzijo, in vitro. Nadalje je predmet sedanjega izuma postopek za fuzijo dveh različnih vrst celic, ki ga omogoča ločena ektroporacija z različnimi vrednostmi električnih parametrov.

-6Po pričujočem izumu je možno predvideti tudi načrt notranjosti koničaste komore z vgrajenimi elektrodami s prevodnostjo, ki je primerljiva s prevodnostjo medija celične suspenzije. To zagotavlja zadrževanje celic na centralnem področju komore in dosego želenega homogenega električnega polja na tem področju.

POVZETEK IZUMA

Po sedanjem izumu je možno celice zadržati v osrednjem predelu lumna z uporabo npr. polprevodniškega materiala ali sestavljenega materiala prevodnosti, ki je primerljiv s prevodnostjo medija celične suspenzije v lumnu komore z vgrajenimi elektrodami. Na ta način zagotovimo homogenost polja zaradi prevodnosti, ki je podobna prevodnosti medija celične suspenzije.. Torej je prvi cilj sedanjega izuma, da bi po le-tem pripravili komoro z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo majhnih kontroliranih volumnov celic z minimalno mehansko obdelavo in posledično minimalno mehansko obremenitvijo.

Opisani izum omogoča hitro obdelavo različnih vrst celic na različne načine z elektriko, t.j. z različnimi vrednostmi parametrov električnega polja. Izum nadalje daje možnost uporabe električnih impulzov v več smereh, s čimer se poveča membransko področje elektroporiranih celičnih membran.

KRATEK OPIS SLIK

Sl. 1 je shematski prikaz prečnega prereza skozi koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami, na pipetru 4.; elektrodi 2 sta nameščeni na notranjo stran ohišja 1 in električno povezani z zunanjostjo 3;

Sl. 2 predstavlja pogled prečnega prereza koničaste komore z vgrajenimi elektrodami;

Sl. 3 prikazuje možne smeri električnega polja v lumnu komore z vgrajenimi elektrodami v eni legi elektrod;

-7Sl. 4 prikazuje koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami, delno napolnjene z materialom 6 in prevodnostjo, kije primerljiva s prevodnostjo medija celične suspenzije.

PODROBEN OPIS IZUMA

Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami sestoji iz ohišja 1, elektrod 2 in električnih konektorjev 3 za povezavo z zunanjostjo. Ohišje 1 je izdelanoiz neprevodnega materiala, kot je polimetil-metakril (PMMA), ali plastičnih materialov. Elektrodi 2 in električni konektorji 3 so izdelani iz električno prevodnega materiala, kot so kovine ali njihove zlitine, ali npr. grafita.

Gornji del la ohišja 1 koničaste komore z vgrajenimi elektrodami je zasnovan tako, da se prilega pipetru 4. Pipeter 4 navadno posrka 1 μΐ to 100 μΐ tekočine. Vendar pipeter 4 ni predmet tega izuma. Zunanja oblika spodnjega dela lb ohišja 1 je koničen, tako da se ga laže uporablja s standardno laboratorijsko opremo, kot so centrifugalne cevi. Po vsem ohišju 1 je po sredini odprtina 5. Skozi to odprtino 5 se celična suspenzija posesa v komoro igelne elektrode in se po opravljeni elektroporaciji izpiha iz koničaste komore z vgrajenimi elektrodami s pipetrom 4. Ko se celična suspenzija posesa, se le-to da v odprtino, kjer sta nameščeni elektrodi 2. Odprtina 5 med elektrodama določa največji volumen enakomerno obdelanih celic. Maksimalni volumen celične suspenzije, ki se ga da vstaviti, tako leži v razmerju, ki je omejeno s konstrukcijskimi možnostmi. Konstrukcija dovoljuje maksimalno prostornino od 10 μΐ do 2500 μΐ, večinoma od 10 μΐ do 1000 μΐ. Vendar lahko realno prostornino enakomerno obdelanih celic izberemo ustrezno za vsak poskus preprosto z nastavitvijo pipetra.

Oblika prereza odprtine 5 med elektrodama je predvsem odvisna od števila elektrod 2. Če se uporabita dve elektrodi 2, je prečni prerez odprtine 5 načelno pravokoten. Če se uporabijo tri ali več elektrod 2, je prerez odprtine 5 načeloma enakostranične oblike s številom stranic, kakršno je število elektrod 2. Torej, če se uporabljajo tri elektrode, je oblika prečnega prereza odprtine 5 načeloma enakostranični trikotnik; če se uporabijo štiri elektrode 2, je oblika prečnega prereza odprtine 5 načeloma enakostranični četverokotnik oz. kvadrat, itd. Če se uporabijo tri elektrode ali več, so stranice odprtine 5 rahlo konkavne zaradi minimizacije nehomogenosti električnega polja v odprtini 5. Ta konkavnost lahko znaša do 20 % dolžine stranice.

-8Več elektrod 2 je nameščenih paralelno in simetrično na notranjo površino ohišja 1 in vzdolžno na odprtino 5. Konstrukcija dovoljuje dolžino elektrod 2 od 5 mm do 60 mm, večinoma od 10 mm do 40 mm. Število elektrod 2 lahko variira med dvema do šest elektrod; to število je lahko liho ali sodo. Število elektrod 2 vpliva na število različnih smeri električnega polja, ki ga uporabimo. Npr., štiri elektrode 2, nameščene v kotih kvadranta, dovoljujejo uporabo impulzov v osem različnih smereh (IB in ET, BI in IE, IT, TI, BE, EB, IE in BT, El in TB). Smeri so razvidne s sl. 3a, 3b in 3c. S številom elektrod se povečuje število različnih smeri električnega polja.

Podrobna zasnova odprtine 5 in elektrod 2 je v veliki meri odvisna od oblike prečnega prereza elektrod 2. Obstajajo tri glavne opcije oblike prečnega prereza elektrod 2: pravokotna, krožna oblika ali na eni strani eliptična, parabolična oz. hiperbolična oblika, in na drugi strani poljubna oblika. Če se uporabita samo dve elektrodi, je oblika prednostno pravokotna za dosego najbolj homogenega električnega polja v odprtini 5, uporabijo pa se lahko tudi druge oblike, omenjene pred tem. Če se uporabita dve elektrodi, je oblika elektrod navadno v obliki kroga, ker jih je laže proizvesti; lahko pa se uporabljajo tudi eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani. Za več kot dve elektrodi pa se lahko uporabi tudi pravokotna oblika, le da je pri tem homogenost električnega polja zelo nizka.

Večino površine omenjenih elektrod 2 navadno vdelamo v material ohišja 1, toda manjši del elektrod 2 po navadi gleda iz materiala ohišja 1. Omenjeni manjši deli so v direktnem kontaktu s celično suspenzijo, ko jo posesamo v odprtino 5 ohišja 1. Kadar uporabimo pravokotni obliki elektrod 2, prednostno vdelamo tri od štirih ravnih presekov elektrode 2 v material ohišja 1 in prednostno eno od štirih ravnin štrli ven iz materiala ohišja 1. Elektrodi 2 pravokotne oblike lahko namestimo simetrično v centre ali prednostno lahko tri ali več elektrod 2 namestimo v kotne točke roba enakostranične oblike odprtine 5. Kadar uporabimo druge oblike elektrod 2, omenjene zgoraj, del površine, vdelane v material ohišja 1, zavisi od števila elektrod 2. Kadar apliciramo dve elektrodi 2 krožne oblike, ležijo njuni centri simetrično s centrom roba oblike prečnega prereza odprtine 5, in prednostno je 180° elektrod 2 vdelanih v material ohišja 1 ter prednostno 180° elektrod 2 gleda ven iz materiala ohišja 1. Kadar so uporabljene tri ali je uporabljenih več elektrod 2 krožne oblike, so njihovi centri pozicionirani na kotnih točkah prečnega prereza oblike odprtine 5, pri čemer so njihovi deli, ki štrlijo iz materiala ohišja 1, prednostno isti kot notranji koti enakostraničnega načrta odprtine 5. Torej, če se uporabijo tri

-9elektrode 2 krožne oblike, 60° elektrod 2 prednostno gleda ven iz materiala ohišja 1 in je prednostno 300° elektrod 2 vdelanih v material ohišja 1; če so uporabljene štiri elektrode krožne oblike, gleda prednostno 90° elektrod 2 iz ohišja 1 in je prednostno 270° elektrod 2 vdelanih v material ohišja 1, itd. Kadar uporabimo eliptično, parabolično ali hiperbolično enostranično obliko elektrod 2, morajo biti te specifične oblike usmerjene v center prečnega prereza oblike odprtine 5. Poljubna forma enostranične eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike elektrod 2 je prednostno popolnoma vdelana v material ohišja 1. Tako je ta poljubna oblika navadno profil v obliki črke T za dosego močnega kontakta med elektrodama 2 in ohišjem 1. Eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani elektrod 2 prednostno vse gledajo ven iz materiala ohišja 1. Kadar sta uporabljeni dve eliptični, parabolični ali hiperbolični enostranični obliki elektrod 2, sta navadno pozicionirani v center roba prečne oblike odprtine 5. Če so uporabljene tri oblike ene strani elektrod 2 ali je uporabljenih več eliptičnih, paraboličnih ali hiperboličnih enostraničnih oblik elektrod 2, so prve navadno pozicionirane v kotnih točkah prečne oblike odprtine 5.

Premer elektrod 2 in razdalja med njima vplivajo na homogenost električnega polja odprtine 5. Ta vpliv ni tako očiten, kadar uporabimo dve elektrodi 2 pravokotne oblike. Torej je pri dveh elektrodah pravokotne oblike razmeije med premerom in razdaljo med elektrodama 2 poljubno. Premer lahko variira od 0,5 do 7 mm in razdalja med njima lahko variira od 0,5 do 6 mm. Izbira je odvisna od največjega volumna enakomerno obdelanih celic in želenem razmerju med napetostjo in razdaljo. Kot je omenjeno zgoraj, se največji volumen enakomerno obdelanih celic definira kot volumen odprtin 5 med elektrodama in je posledično odvisen od dolžine, premera in razdalje med elektrodama 2. Pri dveh elektrodah pravokotne oblike je naj večji volumen enakomerno obdelanih celic zmnožek dolžine, premera in razdalje med elektrodama 2. Zeleno razmeije med napetostjo in razdaljo je predvsem odvisno od vrste celice in cilja elektroporacije in se določi eksperimentalno. Želeno razmeije med napetostjo in razdaljo variira od 200V/cm do 4000 V/cm, večinoma od 500 V/cm do 1500 V/cm. Generatorji za elektroporacijo običajno generirajo električne impulze do 100 V. Torej mora biti razdalja med elektrodama 2 tako zasnovana, da lahko dosežemo želeno razmerje med napetostjo in razdaljo. Kot primer, če uporabljeni generator za elektroporacijo generira impulze do 200 V in znaša zaželeno razmerje med napetostjo ter razdaljo 1000 V/cm, razdalja med elektrodama 2 ne sme biti večja kot 2 mm. Generator pa ni predmet izuma. Za dve elektrodi 2 krožne oblik lahko premer variira od 0,5 do 5 mm in razdalja med njima lahko variira od 0,5 do 6 mm. Razmerje med premerom in razdaljo

-10med elektrodama 2 krožne oblike naj bo tako velika, kot je le možno, da bi dosegli najbolj homogeno električno polje v odprtini 5.

Kadar uporabimo tri ali več elektrod 2, naj bo za dosego najbolj homogenega električnega polja linearna prevodnost najkrajše linije sile med električno nasprotnima elektrodama 2 enaka kot linearna prevodnost linije sile med električno nasprotnima elektrodama 2, ki teče skozi center prečnega preseka oblike odprtine 5. Linearna prevodnost je integral gostote toka, ki je razdeljena z električnim poljem nad linijo, ki je v tem primeru linija sile. Električno nasprotni elektrodi sta elektrodi 2, ki sta med elektroporacijo nabiti z različnim električnim potencialom. Elektrodi 2 sta navadno simetrično nabiti z različnim električnim potencialom. Za tri elektrode pravokotne oblike naj bi bilo razmerje med premerom in razdaljo med naj bližjima elektrodama 2 približno 0,3. Razdalja med najbližjima elektrodama 2 lahko variira med 0,25 do 3 mm. Za štiri elektrode 2 pravokotne oblike naj bi bilo razmerje med premerom in razdaljo med nasprotnima elektrodama 2 približno 0,3. Razdalja med nasprotnima elektrodama 2 lahko variira med 0,5 do 6 mm. Za pet elektrod 2 pravokotne oblike naj bi bilo razmerje med premerom in razdaljo med najbližjim elektrodama 2 približno 0,5. Razdalja med najbližjima elektrodama 2 lahko variira od 0,25 do 3 mm. Za šest elektrod 2 pravokotne oblike naj bi bilo razmeije med premerom in razdaljo med nasprotnima elektrodama 2 približno 0,2. Razdalja med nasprotnima elektrodama 2 lahko variira med 0,5 do 6 mm. Za tri elektrode 2 krožne oblike naj bi bilo razmerje med premerom in naj bližjima elektrodama 2 približno 1,2. Razdalja med naj bližjima elektrodama lahko variira od 0,25 do 2,5 mm. Za štiri elektrode krožne oblike naj bi razmeije med premerom in razdaljo med nasprotnim elektrodama 2 znašalo približno 0,7. Razdalja med nasprotnima elektrodama 2 lahko variira od 0,5 do 5 mm. Za pet elektrod 2 krožne oblike naj bi razmerje med premerom in razdaljo med najbližjima elektrodama 2 znašalo 1. Razdalja med najbližjima elektrodama lahko variira od 0,25 do 2,5 mm. Za šest elektrod 2 krožne oblike naj bi razmerje med premerom in razdaljo med nasprotnim elektrodama 2 znašalo približno 0,3. Razdalja med nasprotnima elektrodama 2 lahko variira od 0,5 do 5 mm.

Kadar se uporabijo eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani elektrod 2, se razmerje med parametri oblike ene strani in razdaljo med elektrodama 2 določi numerično. Krožna oblika elektrod 2 se uporabi kot baza v numeričnem modelu. Eliptična, parabolična ali hiperbolična enostranična oblika se potem doda krožni obliki numeričnega modela, tako da je integral razdalje Manhattan med dvema oblikama v polarnih koordinatah nad obliko, ki bo v

-11direktnem kontaktu s celično suspenzijo, najmanjši. Ohišje 1 in odprtina 5 s celično suspenzijo sta na osnovi materialne prevodnosti dodana v numerični model. Nadalje se električno polje med elektrodama 2 eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani izračuna po metodi končnih elementov ( FEM). Ocenitev homogenosti električnega polja je izračunana po integralu absolutne napake (IAE) med srednjo vrednostjo električnega polja v odprtini 5 in dejansko vrednostjo električnega polja na določeni točki celotne odprtine 5. Parametre eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani nato iterativno spremenimo, tako da je ocena homogenosti električnega polja minimizirana. Parametri eliptične oblike ene strani so glavna os, krajša os in premik, parametri parabolične oblike ene strani so fokus in premik in parametri hiperbolične oblike ene strani so polovična glavna os, polovična krajša os in premik. Parameter premika je enak premiku oblike iz začetne lege oblike pred minimizacijo ocene homogenosti električnega polja. Na tak način se dobljene oblike potem uporabijo za izdelavo elektrod 2.

Po drugem izvedbenem primeru se zasnova treh elektrod 2 lahko uporabi tudi pri katerikoli komori elektrode za minimizacijo nehomogenega električnega polja med elektrodama. V tem primeru naj bi bilo razmerje med premerom in razdaljo med najbližjima ali nasprotnima elektrodama enako, kot je bilo prej opisano za pravokotno oz. krožno obliko elektrod. Za eliptične, parabolične ali hiperbolične oblike ene strani elektrod naj bi uporabili enake postopke za določitev najprimernejše oblike elektrod glede homogenosti električnega polja med elektrodama v skladu s prejšnjim opisom.

Elektrode so zgoraj povezane z zunanjostjo elektrodne koničaste komore, tako da jih lahko priključimo na generator električnih impulzov. Generatorji navadno generirajo kvadrataste, sinusoidalne in/ali eksponencialne električne impulze do 1000 V s trajanjem do 10 s. Kot je omenjeno zgoraj, generator ni predmet izuma. Električne povezave z zunanjostjo so izvedene z elektrodami v obliki krivulje in/ali dodatno žico 3.

Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo po izumu je označena s tem, da je odprtina 5 pozicionirana v sredini ohišja 5 in v vzdolžni smeri skozi ohišje 1 in daje od dveh do šest elektrod nameščenih paralelno in simetrično na notranjo površino ohišja 1 in vzdolžno z odprtino 5 ter delno sega do omenjene odprtine 5, in da imata omenjeni elektrodi 2 konektoije 3 za povezavo z zunanjostjo.

-12V nadaljnjem izvedbenem primeru lahko za minimiziranje električnega polja v celični suspenziji kompaktni polnilec 6 vsadimo v koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami ali katerekoli drugo komoro z vgrajenimi elektrodami, kot je prikazano na sl. 4. Kompaktni polnilec 6 sestoji iz prevodnega materiala, ki ima prevodnost, primerljivo prevodnosti medija celične suspenzije (0.001 S/cm do 10 S/cm) tako kot npr. določeni polprevodniški elementi (Si, Ge) in njihove spojine ali zlitine ali spojine s kovinami ali zlitine s kovinami ali katerikoli drugi materiali v trdnem stanju s prevodnostjo v določenem razponu. Dolžina trdnega polnilca 6 je prednostno enaka kot dolžina elektrod. Oblika prečnega prereza trdnega polnilca 6 je prednostno enaka kot oblika prečnega prereza odprtine, tako da kompaktni polnilec 6 sede v odprtino in ima dober stik z elektrodami. Kompaktni polnilec 6 vstavimo v odprtino in pozicioniramo med elektrode. Največji volumen celične suspenzije, ki ga lahko vstavimo, je tako manjši kot odprtina med elektrodami inje enak kot volumen luknje 7, opisane spodaj. Kompaktni polnilec 6 mora biti zasnovan tako natančno, da ga je potrebno hladiti pred vstavljanjem. Posledično mora imeti dober stik z elektrodami, da ne izpade, potem ko se je ogrel. Da bi preprečili izpad trdnega polnilca 6, lahko le-tega tudi prilepimo na ohišje 1. Vzdolžno skozi celotni kompaktni polnilec 6 je v sredini luknja 7, ki je z navedenim materialom ločena od elektrod. Premer luknje 7 lahko variira od 1 mm do premera kroga, ki ga vnesemo v obliko prečnega prereza trdnega polnilca 6, zmanjšanega za 2 mm. V tem primeru je električno polje v luknji 7 skoraj popolnoma homogeno, ker je skoraj celotna nehomogenost porazdeljena znotraj trdnega polnilca 6, ki se nahaja na zunanjih delih prostora med elektrodama. Za koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami ali katerokoli drugo komoro z vgrajenimi elektrodami in s kompaktnim polnilcem se prednostno uporablja pravokotna oblika elektrod za dosego dobrega električnega stika med elektrodami in kompaktnim polnilcem.

Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po izumu je označena s tem, da je odprtina 5 pozicionirana v sredini ohišja 1, medtem ko je kompaktni polnilec 6 vstavljen v omenjeno odprtino 5 z luknjo 7 v vzdolžni smeri ohišja 1 in je dve do šest elektrod 2 nameščenih vzporedno in simetrično v stik s površinami ohišja 1 ter trdnega polnilca 6, in imata elektrodi 2 električne elemente 3 za stičišče z zunanjostjo.

Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami se preprosto pripne na pipeter 4 ali odpne od le-tega na enak način kot igle, uporabljene za pipetiranje. Po namestitvi koničaste komore z vgrajenimi elektrodami se celična suspenzija vsrka v koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami in

-13priključi se generator za generiranje električnih impulzov. Med pulziranjem se vzpostavi elektroporacija. Po končani pulzaciji se celična suspenzija s pipetrom izpiha iz koničaste komore z vgrajenimi elektrodami. Sedanji izum omogoča elektroporacijo za dosego električne fuzije celic, genske transfekcije celic in elektroporacijo celic.

Čas postopka za pulziranje enega volumna celične suspenzije z omenjeno koničasto komoro z vgrajenimi elektrodami je minimiziran, ker je potrebno precej manj pipetiranja kot pri pulziranju celic v komorah, ki jih je potrebno napolniti z ločenim pipetrom. Polnitev koničaste komore z vgrajenimi elektrodami je enostavna, pri čemer ne nastanejo mehurčki v suspenziji. Minimizirana je torej tudi mehanska obdelava. Čiščenje komore z vgrajenimi elektrodami se tudi enostavno izvede s potiskom čistilne raztopine nekajkrat navzgor in navzdol. Konico lahko steriliziramo z avtoklavom ali drugimi sredstvi v odvisnosti od uporabljenega materiala.

Claims (14)

1. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo za namene električne fuzije celic v suspenziji, genske transfekcije celic v suspenziji ali elektroporacije celic v suspenziji, pri kateri je predvidena komora za natančno vstavitev v pipeter, označena s tem, da je odprtina (5) pozicionirana v sredini ohišja (1) in v vzdolžni smeri skozi ohišje (1) in daje od dveh do šest elektrod (2) nameščenih paralelno in simetrično na notranjo površino ohišja (1) in vzdolžno z odprtinio (5) ter delno sega v navedeno odprtino (5), in da imajo omenjene elektrode (2) konektorje (3) za povezavo z zunanjostjo.

2. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, da ima ohišje (1) gornji del (la) cilindrične oblike in spodnji del (lb) konične oblike, pri čemer je v osi omenjenega ohišja (1) predvidena odprtina (5), ki je na zgornji strani zasnovana tako, da se prilega pipetru.

3. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, daje ohišje (1) izdelano iz neprevodnega materiala.

4. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, da so elektrode (2) vstavljene v material ohišja (1).

5. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, daje oblika elektrod pravokotna, krožna ali z ene strani eliptična, parabolična ali hiperbolična.

6. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, da sta navedeni elektrodi (2) izdelani iz prevodnega materiala.

7. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 1, označena s tem, da so konektoiji (3) za povezavo z zunanjostjo predvideni na zgornjem delu elektrod (2).

8. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami za elektroporacijo za dosego električne fuzije celic v suspenziji, genske transfekcije celic v suspenziji ali elektroporacije celic v suspenziji, pri čemer je predvidena komora za namestitev, prilegajočo se pipetru (4 ), označena s tem, da je odprtina (5) pozicionirana v sredini ohišja (1) in da je kompaktni polnilec (6) vstavljen v navedeno odprtino (5) z luknjo (7) in je v vzdolžni smeri ohišja (1) in kompaktnega filtra (6) nameščenih od dveh do šest elektrod (2) paralelno in simetrično v notranjost stičišča površin ohišja (1) in kompaktnega polnilca (6) ter da imata navedeni elektrodi (2) konektorje (3) za povezavo z zunanjostjo.

-159. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem,da ima ohišje (1) gornji del (la) cilindrične oblike in spodnji del (lb) konične oblike, pri čemer je v osi omenjenega ohišja (1) odprtina (5), predvidena na gornji strani tako, da se prilega pipetru (4).

10. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da je ohišje (1) izdelano iz neprevodnega materiala.

11. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da je kompaktni polnilec iz prevodnega materiala, ki je primerljiv prevodnosti medija celične suspenzije.

12. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da sta elektrodi (2) vstavljeni v material ohišja (1) v stičišču površin ohišja (1) in kompaktnega polnilca (6).

13. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da je oblika elektrod pravokotna, krožna ali z ene strani eliptična, parabolična ali hiperbolična.

14. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da sta omenjeni elektrodi (2) izdelani iz prevodnega materiala.

15. Koničasta komora z vgrajenimi elektrodami po zahtevku 8, označena s tem, da so električni kontakti (3) za povezavo z zunanjostjo izdelani na vrhu elektrod (2).