CN112912132A - 纳米孔膜装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于将生物分子递送到细胞中的装置和方法。本公开的递送装置包括第一储存器、第二储存器、包含纳米孔的多孔膜，以及两个或更多个电极，所述两个或更多个电极被配置为产生跨越多孔膜的电场，用于将所述第二储存器中存在的生物分子递送通过多孔膜的纳米孔并进入所述第一储存器中存在的细胞中。

Description

纳米孔膜装置及其使用方法

交叉引用

本申请要求2018年9月28日提交的美国临时专利申请号62/738,920的权益，所述申请通过引用整体并入本文。

引言

已经使用了几种化学、物理和生物学技术将大分子递送到活细胞中。将生物分子递送到活细胞内对于生物医学研究，药物开发以及基因组编辑来说至关重要。然而，生物分子的常规递送方法如病毒载体、细胞穿透肽、阳离子脂质、带正电的聚合物、批量电穿孔和显微注射提出了若干挑战。这些挑战包括安全问题、毒性、细胞损伤、有限的负载能力、低递送效率、低细胞活力、低细胞通量、高细胞扰动和高成本。

在本领域中需要允许细胞膜透化以促进向细胞内递送生物分子的递送装置和方法。

发明内容

本公开提供了用于将生物分子递送到细胞中的装置和方法。本公开的递送装置包括第一储存器、第二储存器、包含纳米孔的多孔膜，以及两个或更多个电极，所述两个或更多个电极被配置为产生跨越多孔膜的电场，用于将第二储存器中存在的生物分子递送通过多孔膜的纳米孔并进入第一储存器中存在的细胞中。

在一个方面，本文提供了一种用于将生物分子递送到真核细胞中的装置，该装置包括：第一储存器，其包括近端和远端；第二储存器，其包括近端和远端；多孔膜，其包含孔径为约50nm至约150nm的至少一个纳米孔，其中所述至少一个纳米孔将第一储存器和第二储存器流体连接；以及两个或更多个电极，它们被配置为产生从第二储存器到第一储存器的电场。

附图说明

图1A-1C示出了本公开的递送装置的示意图。

图2A-2C示出了使用本公开的递送装置在不同电压强度下进行的HEK293(图2A)、HeLa(图2B)和3T3(图2C)细胞的mRNA转染。

图3A-3C示出了使用本公开的递送装置在不同电压强度下进行的HEK293(图3A)、HeLa(图3B)和3T3(图3C)细胞的DNA质粒转染。

图4示出了与Lipofectamine(LFN)介导的递送相比，本公开的递送装置在不同电压强度下的DNA质粒转染效率。

图5A-5B示出了使用本公开的递送装置在不同电压强度下进行的mRNA(图5A)和DNA质粒(图5B)转染。

图6示出了与Lipofectamine介导的递送相比，本公开的递送装置在不同电压强度下的DNA质粒转染效率。

图7示出了本公开的递送装置将带有mCherry标签的STIM1蛋白递送到HEK293细胞中。

图8示出了使用本公开的递送装置转染Cas9 RNP的HEK293细胞的T7E1测定。

图9A-9B示出了本公开的递送装置与Lipofectamine 2000之间的毒性比较。

图10提供了本公开的递送装置的示意图。

定义

如本文所用，术语“纳米孔”是液体、空气、离子流、生物分子等可以流过的膜中的纳米级通道。

如本文所用，术语“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可以具有至少10个、至少100个、至少10³个、至少10⁴个、至少10⁵个、至少10⁶个、至少10⁷个、至少10⁸个或至少10⁹个或更多个成员。

如本文所用，适用于核酸、多肽、细胞或生物体的术语“天然存在的”或“未修饰的”是指存在于自然中的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，可从自然中的来源分离并且未经人类在实验室中有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸(其可包括编码和非编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽主链的多肽)的聚合形式。

在本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5个至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度不存在上限。寡核苷酸又称“低聚物”或“寡聚物”并且可以从基因中分离或通过本领域中已知的方法化学合成。术语“多核苷酸”和“核酸”应被理解为包括适用于所描述的实施方案的单链(如有义或反义)和双链多核苷酸。

如本文所用，术语“聚合物”是指由两个或更多个彼此共价键合的单体单元组成的任何化合物，其中单体单元可以相同或不同，使得聚合物可以是均聚物或杂聚物。代表性的聚合物包括肽、多糖、核酸等，其中聚合物可以是天然存在的或合成的。

如本文所用，术语“生物聚合物”是指一种或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物通常存在于生物***中，并且特别包括多糖(例如碳水化合物)和肽(该术语用于包括多肽和蛋白质)和多核苷酸及其类似物，例如那些由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成或包含氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团的化合物。这包括其中常规主链已被非天然存在或合成的主链替代的多核苷酸，以及其中一个或多个常规碱基已被能够参与Watson-Crick型氢键相互作用的基团(天然或合成的)替代的核酸(或者合成或天然存在的类似物)。

如本文所用，术语“荧光团”是指当被来自外部源的能量激发时表现出特定荧光发射的分子。术语“发荧光染料”、“荧光染料”和“荧光团”可以互换使用。

如本文所用，术语“染料”或“染色剂”是指具有大吸收率或高荧光量子产率并且显示出对某些材料或细胞结构的亲和力的分子。

如本文所用，术语“标记的”是指携带允许对其进行检测的一个或多个部分的手段。如本文所用，术语“标记”、“可检测部分”和“标记物”可以互换使用。

如本文所用，术语“发光染料”是指在发生化学或生化反应时发光的每个分子。

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所述的特定实例，因而当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实例的目的，而无意具有限制性，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

在提供值的范围时，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则介于该范围的上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)以及该规定范围内的任何其他规定值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提到“一种真核细胞”包括多种这样的真核细胞并且提到“所述生物分子”包括提到一个或多个生物分子及本领域技术人员已知的其等效物，等等。还应该注意的是，权利要求可以撰写成排除任何可选的要素。同样地，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述一起使用诸如“只”、“仅”等排他性术语或使用“否定性”限制的前提基础。

应当理解，为了清楚起见而在不同实例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为简洁起见而在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实例的所有组合明确地涵盖于本发明中，并且在本文中公开，就如同单独地和明确地公开了每个组合一样。另外，各种实例及其要素的所有子组合也明确地涵盖于本发明中，并且在本文中公开，就如同每个此类子组合单独地和明确地在本文中公开一样。

本文所讨论的出版物仅提供其在本申请的提交日期之前的公开内容。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立地确认。

具体实施方式

本公开提供了用于将生物分子递送到细胞中的装置和方法。本公开的递送装置包括第一储存器、第二储存器、包含纳米孔的多孔膜，以及两个或更多个电极，所述两个或更多个电极被配置为产生跨越多孔膜的电场，用于将第二储存器中存在的生物分子递送通过多孔膜的纳米孔并进入第一储存器中存在的细胞中。

递送装置

本公开的方面包括用于将生物分子跨质膜转运到细胞中的递送装置。

参考图10，本公开的递送装置包括第一储存器100，其包括近端101和远端102；第二储存器200，其包括近端201和远端202；多孔膜300，其包含至少一个纳米孔301；和至少两个电极400。

在一些情况下，第一储存器由细胞培养皿、细胞培养板和/或细胞培养瓶形成。在一些情况下，第一储存器由选自以下的材料形成：聚苯乙烯(PS)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、硅橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、聚二甲基硅氧烷(PDMS))、聚酰亚胺、聚氨酯、SU-8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氯乙烯(PVC))、聚己内酯(PCL)或它们的任何组合。SU-8配制物包含含有环氧部分的单体、溶剂和光酸引发剂。在一些情况下，SU-8配制物中的溶剂是环戊酮。在一些情况下，SU-8配制物中的光酸引发剂是六氟锑酸三芳基锍。在暴露于紫外线辐射后，会产生光酸，它使环氧部分质子化，然后环氧部分在加热时与中性环氧基反应，从而形成具有高机械强度和热稳定性的交联聚合物网络。参见例如Nemani等，2013，Mater SciEng C Mater Biol Appl.33(7):10.1016，其全部内容通过引用合并于此。

在一些情况下，第一储存器由选自生物相容性聚合物的材料形成。生物相容性聚合物包括天然或合成聚合物。生物相容性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚(α-酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯和聚酸酐及其共聚物、聚乙醇酸和聚乳酸-羟基乙酸(polyglactin)、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚类化合物、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚***、聚氨酯、聚乙烯基、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、脲醛、聚乳酸-羟基乙酸或这些材料的共聚物或组合。

在一些情况下，第一储存器是圆柱形、圆形、正方形、球形、圆柱形或矩形。在一些情况下，第一储存器包括形成第一储存器的侧边界的壁。在一些情况下，第一储存器是第一腔室。在一些情况下，第一储存器与多孔膜形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第一储存器与第二储存器形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第一储存器与第二储存器和多孔膜形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第一储存器与第二储存器分离，例如能够可逆地分开或分离。在一些情况下，第二储存器与多孔膜和/或第一储存器能够可逆地分开或分离(例如，可逆地分离)。在一些情况下，第一储存器流体连接至多孔膜。在一些情况下，多孔膜包含至少一个纳米孔，其中该至少一个纳米孔与第一储存器和/或第二储存器流体连通以将生物分子递送通过纳米孔。在一些情况下，第一储存器包括盖子。在一些情况下，盖子可以保护第一储存器中的样品不受污染，例如在离心过程中。

在一些情况下，第一储存器的长度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约95mm、约95mm至约100mm、约100mm至约105mm、约105mm至约110mm、约110mm至约115mm、约115mm至约120mm、约120mm至约125mm、约125mm至约130mm、约130mm至约135mm、约135mm至约140mm、约140mm至约145mm或约145mm至约150mm。在一些情况下，第一储存器的宽度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。在一些情况下，第一储存器的高度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm或约45mm至约50mm。

在一些情况下，第一储存器的深度在约0.01mm至约10mm的范围内。在一些情况下，第一储存器的深度范围为约0.01mm至约0.1mm、0.1mm至约0.5mm、0.5mm至约1mm、约1mm至约1.5mm、1.5mm至约2mm、2mm至约2.5mm、2.5mm至约3mm、3mm至约3.5mm、3.5mm至约4mm、4mm至约4.5mm或4.5mm至约5mm。

在一些情况下，第一储存器的面积为0.5×0.5cm²至20×20cm²。在一些情况下，第一储存器的面积为0.5×0.5cm²至5×5cm²、5×5cm²至10×10cm²、10×10cm²至15×15cm²或15×15cm²至20×20cm²。

在一些情况下，第一储存器是圆形的。在一些情况下，第一储存器的直径范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约55mm至约60mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。

第一储存器不限于本文所述的形状和/或尺寸，并且可以是根据针对其预期用途的特定条件所需的任何形状和/或尺寸。

本公开的方面包括一种递送装置，该递送装置包括第二储存器，该第二储存器包括近端和远端。在一些情况下，第二储存器是第二腔室。

在一些情况下，第二储存器由细胞培养皿、细胞培养板和/或细胞培养瓶形成。在一些情况下，第二储存器由选自以下的材料形成：PS、聚乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、PTFE、硅橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、PDMS、聚酰亚胺、聚氨酯、SU-8、PMMA、PET、PVC、PCL或它们的任何组合。

在一些情况下，第二储存器由选自生物相容性聚合物的材料形成。生物相容性聚合物包括天然或合成聚合物。生物相容性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚(α-酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯和聚酸酐及其共聚物、聚乙醇酸和聚乳酸-羟基乙酸、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚类化合物、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚***、聚氨酯、聚乙烯基、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、脲醛、聚乳酸-羟基乙酸或这些材料的共聚物或组合。SU-8配制物包含含有环氧部分的单体、溶剂和光酸引发剂。在一些情况下，SU-8配制物中的溶剂是环戊酮。在一些情况下，SU-8配制物中的光酸引发剂是六氟锑酸三芳基锍。在暴露于紫外线辐射后，会产生光酸，它使环氧部分质子化，然后环氧部分在加热时与中性环氧基反应，从而形成具有高机械强度和热稳定性的交联聚合物网络。参见例如Nemani等，2013，Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.33(7):10.1016，其全部内容通过引用合并于此。

在一些情况下，第二储存器是圆柱形、圆形、正方形、球形、圆柱形或矩形。在一些情况下，第二储存器的尺寸和/或形状被设置成用于接收样品，例如液体介质中的生物分子。第二储存器可以具有一个或多个、两个或更多个，或三个或更多个开口端，并且可以包括例如在第一末端用于接收流体的开口和/或在第二末端用于排出流体的开口。在一些情况下，第二储存器包括形成第二储存器的侧边界的壁。在一些情况下，第一储存器包括形成第二储存器的侧边界的壁。在一些情况下，第二储存器与多孔膜形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第二储存器与第一储存器形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第二储存器与第一储存器和多孔膜形成一体和/或包括在一起。在一些情况下，第二储存器与多孔膜分离，例如能够可逆地分开。在一些情况下，第二储存器能够可逆地连接至多孔膜和/或第一储存器。在一些情况下，第二储存器能够可逆地与多孔膜分离。在一些情况下，第二储存器流体耦合和/或连接至多孔膜。在一些情况下，第二储存器流体耦合和/或连接至第一储存器。在一些情况下，第二储存器是第二腔室。在一些情况下，第二储存器是电极。在一些情况下，第二储存器是第二电极。

在一些情况下，第二储存器的长度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约95mm、约95mm至约100mm、约100mm至约105mm、约105mm至约110mm、约110mm至约115mm、约115mm至约120mm、约120mm至约125mm、约125mm至约130mm、约130mm至约135mm、约135mm至约140mm、约140mm至约145mm或约145mm至约150mm。在一些情况下，第二储存器的宽度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。在一些情况下，第二储存器的高度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm或约45mm至约50mm。

在一些情况下，第二储存器的深度在约0.01mm至约10mm的范围内。在一些情况下，第二储存器的深度范围为约0.01mm至约0.1mm、0.1mm至约0.5mm、0.5mm至约1mm、约1mm至约1.5mm、1.5mm至约2mm、2mm至约2.5mm、2.5mm至约3mm、3mm至约3.5mm、3.5mm至约4mm、4mm至约4.5mm或4.5mm至约5mm。

在一些情况下，第二储存器的面积为0.5×0.5cm²至20×20cm²。在一些情况下，第二储存器的面积为0.5×0.5cm²至5×5cm²、5×5cm²至10×10cm²、10×10cm²至15×15cm²或15×15cm²至20×20cm²。

在一些情况下，第二储存器是圆形的。在一些情况下，第二储存器的直径范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约55mm至约60mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。

第二储存器不限于本文所述的形状和/或尺寸，并且可以是根据针对其预期用途的特定条件所需的任何形状和/或尺寸。

本公开的方面包括一种包括多孔膜的递送装置。在一些情况下，多孔膜位于第一储存器和第二储存器之间。在一些情况下，多孔膜位于第一储存器和第二电极之间，其中第二电极位于多孔膜的远端。在一些情况下，多孔膜包括耦合和/或连接至第一储存器和第二储存器的至少一个纳米孔。在一些情况下，多孔膜包括流体耦合至第一储存器和第二储存器的至少一个纳米孔。在一些情况下，多孔膜将第一储存器与第二储存器分开。在一些情况下，多孔膜与第一储存器和/或第二储存器形成一体。在一些情况下，第二储存器是第二电极。

在一些情况下，多孔膜包括至少一个纳米孔。在一些情况下，多孔膜包括多个纳米孔。

在一些情况下，多孔膜的面积为约1mm²至1000mm²。在一些情况下，多孔膜的面积为约1cm²至500cm²。在一些情况下，多孔膜的面积为约1cm²至约50cm²、约50cm²至约100cm²、约100cm²至约150cm²、约150cm²至约200cm²、约200cm²至约250cm²、约250cm²至约300cm²、约300cm²至约350cm²、约350cm²至约400cm²、约400cm²至约450cm²、约450cm²至约500cm²或约500cm²至约550cm²。

在一些情况下，多孔膜的表面积为约1mm²至1000mm²。在一些情况下，多孔膜的表面积为约1cm²至500cm²。在一些情况下，多孔膜的表面积为约1cm²至约50cm²、约50cm²至约100cm²、约100cm²至约150cm²、约150cm²至约200cm²、约200cm²至约250cm²、约250cm²至约300cm²、约300cm²至约350cm²、约350cm²至约400cm²、约400cm²至约450cm²、约450cm²至约500cm²或约500cm²至约550cm²。

在一些情况下，多孔膜的厚度为约1μm至约10μm、约10μm至约20μm、约20μm至约30μm，或约30μm至约40μm，或约40μm至约50μm。

在一些情况下，多孔膜的长度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约95mm、约95mm至约100mm、约100mm至约105mm、约105mm至约110mm、约110mm至约115mm、约115mm至约120mm、约120mm至约125mm、约125mm至约130mm、约130mm至约135mm、约135mm至约140mm、约140mm至约145mm或约145mm至约150mm。在一些情况下，第一储存器的宽度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。在一些情况下，多孔膜的高度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm或约45mm至约50mm。

在一些情况下，多孔膜的深度在约0.01mm至约10mm的范围内。在一些情况下，第一储存器的深度范围为约0.01mm至约0.1mm、0.1mm至约0.5mm、0.5mm至约1mm、约1mm至约1.5mm、1.5mm至约2mm、2mm至约2.5mm、2.5mm至约3mm、3mm至约3.5mm、3.5mm至约4mm、4mm至约4.5mm或4.5mm至约5mm。

在一些情况下，多孔膜的面积为0.5×0.5cm²至20×20cm²。在一些情况下，多孔膜的面积为0.5×0.5cm²至5×5cm²、5×5cm²至10×10cm²、10×10cm²至15×15cm²或15×15cm²至20×20cm²。

在一些情况下，多孔膜储存器是圆形的。在一些情况下，多孔膜的直径范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约55mm至约60mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。

多孔膜不限于本文所述的形状和/或尺寸，并且可以是根据针对其预期用途的特定条件所需的任何形状和/或尺寸。

在一些情况下，多孔膜包括多个纳米孔。在一些情况下，纳米孔的形状包括线状、正方形、矩形(狭缝形)、圆形、卵形、椭圆形、圆柱形或其他形状。在一些情况下，纳米孔包括单个形状或形状的组合。如本文所用，纳米孔的宽度是指当孔为圆形、圆柱形、卵形或椭圆形时的直径。在一些情况下，纳米孔是圆柱形的。在一些情况下，纳米孔的大小是高度均匀的。在一些情况下，对孔进行微加工，以使纳米孔的尺寸之间的大小差异小于20％、大小差异小于10％、大小差异小于5％、大小差异小于2％或大小差异小于1％。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的数量足以允许将生物分子递送通过纳米孔并进入真核细胞。多孔膜的纳米孔可以使用任何已知的多孔膜制造技术(例如径迹蚀刻法)来制造。常规意义上描述的径迹蚀刻方法是基于用高能离子照射聚合物材料，以使得在被照射的聚合物层或膜上形成线性受损径迹。然后，使用已知的湿法化学蚀刻技术将这些径迹显露在孔隙中。“径迹”的加工与其后续蚀刻的组合被称为“径迹蚀刻”。

在一些情况下，纳米孔的孔径为约5nm至约150nm。在一些情况下，纳米孔的孔径为约50nm至约200nm。在一些情况下，纳米孔的孔径范围为约5至200nm，例如约10nm至约200nm，包括约20nm至约100nm，或约30nm至约80nm。在一些情况下，纳米孔的孔径为约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、约160nm、约170nm、约180nm、约190nm或约200nm。在一些情况下，纳米孔的孔径范围为约1nm至约10nm、约10nm至约20nm、约20nm至约30nm、约30nm至约40nm、约40nm至约50nm、约50nm至约60nm、约60nm至约70nm、约70nm至约80nm、约80nm至约90nm、约90nm至约100nm、约100nm至约110nm、约110nm至约120nm、约120nm至约130nm、约130nm至约140nm、约140nm至约150nm、约150nm至约160nm、约160nm至约170nm、约170nm至约180nm、约180nm至约190nm或约190nm至约200nm。在一些情况下，纳米孔的孔径为约50nm至约100nm。在一些情况下，纳米孔的孔径为约100nm至约150nm。在一些情况下，纳米孔的孔径为约150nm至约200nm。

在一些情况下，纳米孔的尺寸小于真核细胞的直径。在一些情况下，多个纳米孔与单个细胞物理接触。在一些情况下，至少约40个纳米孔、至少约60个纳米孔、至少约80个纳米孔、至少约100个纳米孔、至少约120个纳米孔、至少约140个纳米孔、至少约160个纳米孔、约180个纳米孔或约200个纳米孔与真核细胞物理接触。在一些情况下，与细胞物理接触的纳米孔的数量为每个细胞约1个纳米孔至每个细胞约100个纳米孔、每个细胞约100个纳米孔至每个细胞约500个纳米孔、每个细胞约500个纳米孔至每个细胞约1000个纳米孔、每个细胞约1000个纳米孔至每个细胞约1500个纳米孔或每个细胞约1500个纳米孔至每个细胞约2000个纳米孔。在一些情况下，与细胞物理接触的纳米孔的数量为每个细胞约10个纳米孔至每个细胞约20个纳米孔。在一些情况下，与细胞物理接触的纳米孔的数量为每个细胞约20个纳米孔至每个细胞约30个纳米孔。

在一些情况下，多孔膜的孔密度为约1个纳米孔/cm²、约10个纳米孔/cm²、约10²个纳米孔/cm²、约10⁴个纳米孔/cm²、约10⁵个纳米孔/cm²、约10⁶个纳米孔/cm²、约10⁷个纳米孔/cm²、约10⁸个纳米孔/cm²、约10⁹个纳米孔/cm²或约10¹⁰个纳米孔/cm²。在一些情况下，多孔膜的孔密度为约1个纳米孔/cm²至约5×10¹⁰个纳米孔/cm²。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约10⁶个至约10¹⁰个纳米孔/cm²的范围内，例如，约1×10⁶个至约1×10¹⁰个、约1×10⁶个至约1×10⁹个、约1×10⁶个至约1×10⁸个、约1×10⁶个至约1×10⁷个、约2×10⁶个至约2×10¹⁰个、约2×10⁶个至约2×10⁹个、约2×10⁶个至约2×10⁸个、约2×10⁶个至约2×10⁷个、约3×10⁶个至约3×10¹⁰个、约3×10⁶个至约3×10⁹个、约3×10⁶个至约3×10⁸个、约3×10⁶个至约3×10⁷个、约4×10⁶个至约4×10¹⁰个、约4×10⁶个至约4×10⁹个、约4×10⁶个至约4×10⁸个、约1×10⁶个至约4×10⁷个、约5×10⁶至约5×10¹⁰个、约5×10⁶个至约5×10⁹个、约5×10⁶个至约5×10⁸个或约5×10⁶个至约5×10⁷个。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约10⁶个至约10¹⁰个纳米孔/cm²的范围内，例如，约3×10⁶个至约3×10⁸个纳米孔/cm²、约10⁷个至约3×10⁸个纳米孔/cm²、约3×10⁷个至约3×10⁸个纳米孔/cm²或约3×10⁸个至约3×10¹⁰个。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约10⁶个至约10¹⁰个纳米孔/cm²的范围内，例如，约4×10⁶个至约4×10⁸个纳米孔/cm²、约10⁷个至约4×10⁸个纳米孔/cm²、约4x10⁷个至约4×10⁸个纳米孔/cm²或约4×10⁸个至4×10¹⁰个。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约10⁶个至约10¹⁰个纳米孔/cm²的范围内，例如，约5×10⁶个至约5×10⁸个纳米孔/cm²、约10⁷个至约5×10⁸个纳米孔/cm²、约5×10⁷个至5×10⁸个纳米孔/cm²或约5×10⁸个至约5×10¹⁰个纳米孔/cm²。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约1×10²个至约2×10⁸个纳米孔/cm²、约1×10⁸个至约2×10¹⁰个纳米孔/cm²、约2×10⁶个至约2×10⁸个纳米孔/cm²、约2×10⁴个至约2×10⁶个或约2×10²个至约2×10⁴个的范围内。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约1×10²个至约3×10⁸个纳米孔/cm²、约1×10⁸个至约3×10¹⁰个纳米孔/cm²、约3×10⁶个至约3×10⁸个纳米孔/cm²、约3×10⁴个至约3×10⁶个或约3×10²个至约3×10⁴个的范围内。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约1×10²个至约4×10⁸个纳米孔/cm²、约1×10⁸个至约4×10¹⁰个纳米孔/cm²、约4×10⁶个至约4×10⁸个纳米孔/cm²、约4×10⁴个至约4×10⁶个或约4×10²个至约4×10⁴个的范围内。在一些情况下，多孔膜上的纳米孔的密度可以在约1×10²个至约5×10⁸个纳米孔/cm²、约1×10⁸个至约5×10¹⁰个纳米孔/cm²、约5×10⁶个至约5×10⁸个纳米孔/cm²、约5×10⁴个至约5×10⁶个或约5×10²个至约5×10⁴个的范围内。

纳米孔不限于本文所述的形状和/或尺寸，并且可以是根据针对其预期用途的特定条件所需的任何形状和/或尺寸。

在一些情况下，多孔膜由选自细胞培养皿、细胞培养板和/或细胞培养瓶的材料形成。在一些情况下，多孔膜由选自以下的材料形成：PS、聚乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、PTFE、硅橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、PDMS、聚酰亚胺、聚氨酯、SU-8、PMMA、PET、PVC、PCL或它们的任何组合。SU-8配制物包含含有环氧部分的单体、溶剂和光酸引发剂。在一些情况下，SU-8配制物中的溶剂是环戊酮。在一些情况下，SU-8配制物中的光酸引发剂是六氟锑酸三芳基锍。在暴露于紫外线辐射后，会产生光酸，它使环氧部分质子化，然后环氧部分在加热时与中性环氧基反应，从而形成具有高机械强度和热稳定性的交联聚合物网络。参见例如Nemani等，2013，Mater Sci Eng C Mater BiolAppl.33(7):10.1016，其全部内容通过引用合并于此。

在一些情况下，多孔膜由选自生物相容性聚合物的材料形成。生物相容性聚合物包括天然或合成聚合物。生物相容性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚(α-酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯和聚酸酐及其共聚物、聚乙醇酸和聚乳酸-羟基乙酸、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚类化合物、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚***、聚氨酯、聚乙烯基、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、脲醛、聚乳酸-羟基乙酸或这些材料的共聚物或组合。

在一些情况下，递送装置的总面积为约0.001cm²至约30cm²。在一些情况下，递送装置的总面积为约0.01cm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的总面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的总面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的总面积为0.5×0.5cm²至20×20cm²。在一些情况下，递送装置的总面积为0.5×0.5cm²至5×5cm²、5×5cm²至10×10cm²、10×10cm²至15×15cm²或15×15cm²至20×20cm²。

在一些情况下，递送装置的总面积为约0.01mm²至约5mm²、约0.01mm²至约10mm²、约0.01mm²至约15mm²、约0.01mm²至约20mm²。在一些情况下，递送装置的总面积为约0.05mm²至约1mm²、约0.1mm²至约0.5mm²、约0.5mm²至约1mm²、约1mm²至约5mm²、约5mm²至约10mm²、约10mm²至约20mm²、约20mm²至约30mm²、约30mm²至约40mm²、约40mm²至约50mm²、约50mm²至约60mm²、约60mm²至约70mm²、约70mm²至约80mm²、约80mm²至约90mm²或约90mm²至约100mm²。在一些情况下，递送装置的总面积为约1mm²至约50mm²或约50mm²至约100mm²。

在一些情况下，递送装置的表面积为约0.001cm²至约30cm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约0.01cm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约0.01mm²至约5mm²、约0.01mm²至约10mm²、约0.01mm²至约15mm²、约0.01mm²至约20mm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约0.05mm²至约1mm²、约0.1mm²至约0.5mm²、约0.5mm²至约1mm²、约1mm²至约5mm²、约5mm²至约10mm²、约10mm²至约20mm²、约20mm²至约30mm²、约30mm²至约40mm²、约40mm²至约50mm²、约50mm²至约60mm²、约60mm²至约70mm²、约70mm²至约80mm²、约80mm²至约90mm²、约90mm²至约100mm²、约100mm²至约120mm²、约120mm²至约130mm²、约130mm²至约140mm²、约140mm²至约150mm²、约150mm²至约160mm²、约160mm²至约170mm²、约180mm²至约190mm²或约190mm²至约200mm²。在一些情况下，递送装置的表面积为约1mm²至约50mm²、约50mm²至约100mm²、约100mm²至约200mm²、约200mm²至约250mm²或约250mm²至约300mm²。

本公开的方面包括一种包含电极的递送装置。在一些情况下，递送装置包括至少一个电极。在一些情况下，递送装置包括至少两个或更多个电极。在一些情况下，递送装置包括至少两个或更多个、至少三个或更多个、至少四个或更多个、至少五个或更多个、至少六个或更多个、至少七个或更多个、至少八个或更多个、至少九个或更多个，或至少十个或更多个电极。在一些情况下，递送装置包括多个电极。

在一些情况下，至少两个或更多个电极具有被制造用于产生电场的形状或几何形状。可以使用任何合适的微制造、微加工或其他已知方法来制造至少两个或更多个电极。电极几何形状的非限制性实例包括叉指状电极、线上圆形电极、线上菱形电极、槽形电极、正弦形电极或它们的组合。在一些情况下，电极为圆形、正方形、球形、圆盘形、卵形、椭圆形、L形、U形、Z形、v形、镊子形或矩形。在一些情况下，电极是板状电极或线状电极。

在一些情况下，至少两个或更多个电极是针状电极。在一些情况下，针状电极包括用于***注射器的内腔和/或通道。在一些情况下，针状电极是20号针状电极、21号针状电极、22号针状电极、23号针状电极、25号针状电极、27号针状电极、30号针状电极、31号针状电极或32号针状电极。在一些情况下，至少两个或更多个电极是平直尖头电极、平行固定的针状电极、筷状电极或在电极的尖端处弯曲的电极。在一些情况下，至少两个电极具有相同的形状和/或几何形状。在一些情况下，至少两个电极具有不同的形状和/或几何形状。

在一些情况下，电极的长度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约95mm、约95mm至约100mm、约100mm至约105mm、约105mm至约110mm、约110mm至约115mm、约115mm至约120mm、约120mm至约125mm、约125mm至约130mm、约130mm至约135mm、约135mm至约140mm、约140mm至约145mm或约145mm至约150mm。在一些情况下，电极的宽度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。在一些情况下，电极的高度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm或约45mm至约50mm。

在一些情况下，电极是圆形的。在一些情况下，电极的直径范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约45mm、约45mm至约50mm、约50mm至约55mm、约55mm至约60mm、约60mm至约65mm、约65mm至约70mm、约70mm至约75mm、约75mm至约80mm、约80mm至约85mm、约85mm至约90mm、约90mm至约95mm或约95mm至约100mm。

在一些情况下，电极的宽度范围为约0.01mm至约5mm、约5mm至约10mm、约10mm至约15mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约25mm至约30mm、约30mm至约35mm、约35mm至约40mm、约40mm至约50mm。在一些情况下，电极的宽度为约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm。在一些情况下，电极的高度范围为约1mm至约5mm、约10mm至约15mm或约15mm至约20mm。在一些情况下，电极的高度为约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm。

在一些情况下，电极的总面积为约0.001cm²至约30cm²。在一些情况下，电极的总面积为约0.01cm²至约15cm²。在一些情况下，电极的总面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，电极的总面积为约0.01mm²至约15cm²。在一些情况下，电极的总面积为约0.01mm²至约5mm²、约0.01mm²至约10mm²、约0.01mm²至约15mm²、约0.01mm²至约20mm²。在一些情况下，电极的总面积为约0.05mm²至约1mm²、约0.1mm²至约0.5mm²、约0.5mm²至约1mm²、约1mm²至约5mm²、约5mm²至约10mm²、约10mm²至约20mm²、约20mm²至约30mm²、约30mm²至约40mm²、约40mm²至约50mm²、约50mm²至约60mm²、约60mm²至约70mm²、约70mm²至约80mm²、约80mm²至约90mm²或约90mm²至约100mm²。在一些情况下，电极的总面积为约1mm²至约50mm²或约50mm²至约100mm²。

在一些情况下，电极的活性表面的表面积为0.5×0.5cm²至20×20cm²。在一些情况下，电极的活性表面的表面积为0.5×0.5cm²至5×5cm²、5×5cm²至10×10cm²、10×10cm²至15×15cm²或15×15cm²至20×20cm²。

电极不限于本文所述的形状和/或尺寸，并且可以是根据针对其预期用途的特定条件所需的任何形状和/或尺寸。

在一些情况下，递送装置还包括用于控制由至少两个或更多个电极产生的电场的控制装置。在一些情况下，控制装置是电脉冲发生器。在一些情况下，至少两个电极与电脉冲发生器相连。

在一些情况下，电极的定位和放置会向第一储存器和/或第二储存器产生电场，从而将生物分子引入细胞中(Mir,L.M.,Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization.Bioelectrochemistry,2001.53：第1-10页)。在一些情况下，电极的定位和放置在第一储存器和第二储存器之间产生电场，从而将生物分子引入细胞中。在一些情况下，电场被施加到第二储存器。在一些情况下，电场被施加到第一储存器。在一些情况下，将电场从第二储存器施加到第一储存器。在一些情况下，将电场从第一储存器施加到第二储存器。在一些情况下，电场被施加到第一储存器和第二储存器之间。在一些情况下，电场实现细胞膜的透化作用。在一些情况下，细胞膜的透化作用可以是可逆的，例如暂时可渗透的。在一些情况下，细胞膜将在一段时间后重新封闭，例如当电脉冲停止时。在一些情况下，至少两个电极中的第一电极被配置成***在递送装置的第一储存器的远端处。在一些情况下，至少两个电极中的第二电极被配置为***在递送装置的第二储存器的远端处。在一些情况下，第一电极从上方***和/或定位到第一储存器的远端中或周围，并且第二电极从下方***和/或定位到第二储存器的远端中或周围。在一些情况下，第一电极位于第一储存器的远端。在一些情况下，第二电极位于第二储存器的远端。在一些情况下，第一电极和/或第二电极处于第一储存器和/或第二储存器的平面内。在一些情况下，第一电极和/或第二电极处于第一储存器和/或第二储存器的平面外。

在一些情况下，所述至少两个电极可以电连接到电源。在一些情况下，递送装置包括电源和从电源到至少两个电极的电连接件。在一些情况下，电极可以电连接到电源以施加电脉冲。在一些情况下，电源以持续时间、电压、电流量及其组合向电极提供电脉冲，以将电场施加给递送装置内的细胞。在一些情况下，电场被施加到递送装置的第一储存器。在一些情况下，电场被施加到递送装置的第二储存器。在一些情况下，将电场从递送装置的第一储存器施加到第二储存器。

在一些情况下，电场包括5伏至100伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括15伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括30伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括50伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括以下范围内的电压：5伏至10伏、10伏至15伏、15伏至20伏、20伏至30伏、30伏至35伏、35伏至40伏、40伏至45伏、45伏至50伏、50伏至55伏、55伏至60伏、60伏至65伏、65伏至70伏、70伏至75伏、75伏至80伏、80伏至85伏、85伏至90伏、90伏至95伏或95伏至100伏。在一些情况下，电场包括30伏的电压。

在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从约1Hz到约1MHz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从约1Hz到约1000Hz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到100Hz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到25Hz、从25Hz到50Hz或从50Hz到100Hz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到10Hz、从10Hz到20Hz或从20Hz到30Hz、从30Hz到40Hz或从40Hz到50Hz的频率。

在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括纳秒脉冲、微秒脉冲或毫秒脉冲。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从1微秒到10毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从1毫秒到5毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从0.001毫秒到2毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从1微秒到2000微秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从200微秒到2000微秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从100微秒到500微秒、500微秒到1000微秒、1000微秒到1500微秒或1500微秒到2000微秒的脉冲持续时间。

在一些情况下，电极可以包括任何导电材料，包括但不限于钛、金、银、氧化锡、氧化铟锡(ITO)或铂。

递送方法

本公开的方面包括将生物分子递送到真核细胞中的方法。该方法包括向存在于本公开的递送装置中的液体施加电场。施加电场实现将生物分子递送到真核细胞中。

施加跨越多孔膜的电场，这导致1)由跨越多孔膜的纳米孔的电场诱导的细胞的细胞膜打开(与纳米孔共定位)，以及2)生物分子在施加于多孔膜的电场的影响下迁移通过纳米孔(即电泳运动)，从而使生物分子进入细胞。

在一些情况下，递送装置包括用于培养至少一种真核细胞的第一储存器。在一些情况下，本公开的递送装置的第一储存器包括一种真核细胞。在一些情况下，本公开的递送装置的第一储存器包括多种真核细胞。在一些情况下，真核细胞存在于第一储存器中的液体介质中，并与多孔膜物理接触。

在一些情况下，该装置包括用于培养多种真核细胞的第一储存器。在一些情况下，该装置包括用于培养2个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、1,000个或更多个、5,000个或更多个、10⁴个或更多个、10⁵个或更多个、10⁶个或更多个、10⁷个或更多个、10⁸个或更多个、10⁹个或更多个，或10¹⁰个或更多个细胞的第一储存器。

在一些情况下，细胞是哺乳动物细胞。细胞的非限制性实例包括啮齿动物细胞、人细胞、非人灵长类动物细胞等。任何类型的细胞都可以是目标细胞(例如干细胞，例如胚胎干(ES)细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、生殖细胞；体细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞；任何阶段下的胚胎(例如1个细胞、2个细胞、4个细胞、8个细胞等阶段的斑马鱼胚胎)的体外或体内胚细胞；等等)。细胞可以来自已建立的细胞系或者它们可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换地用来指衍生自受试者并且允许培养物在体外生长以进行有限次数的传代(即，***)的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物包括可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但传代次数不足以通过转折期的培养物。原代细胞系能够在体外维持小于10代。

在一些情况下，细胞选自由以下组成的组：真核细胞、真核单细胞生物体、体细胞、生殖细胞、干细胞、植物细胞、藻类细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼细胞、蛙细胞、鸟细胞、哺乳动物细胞、猪细胞、母牛细胞、山羊细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、非人灵长类动物细胞、人细胞，以及它们的组合。

在一些情况下，生物分子存在于第二储存器中的液体介质中。在一些情况下，液体介质是细胞培养基。在一些情况下，液体介质是细胞外缓冲液。在一些情况下，细胞外缓冲液包括NaCl、KCl、HEPES、CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄、甘油、葡萄糖、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、磷酸盐缓冲液(PBS)、水、具有不同pH范围的tris缓冲液或它们的组合。在一些情况下，液体介质是缓冲液和细胞培养基的组合。

在一些情况下，生物分子通过第二储存器的开口被注入到第二储存器中。在一些情况下，注入储存器的生物分子的体积为1μl至1ml。在一些情况下，注入储存器的生物分子的体积为1μl至5μl。在一些情况下，使用注射器将生物分子注入储存器中。在一些情况下，开口的直径为0.001mm至1mm。在一些情况下，开口的直径为1mm。

在一些情况下，第二储存器是第二电极。在这种情况下，生物分子以液滴的形式沉积在第二电极的顶表面(即第二电极的近端)上。在这种情况下，递送装置的多孔膜被放置于沉积在第二电极的顶表面(例如，近端)上的液滴上。在一些情况下，与递送装置的第一储存器成一体的多孔膜被放置于沉积在第二电极的顶表面上的液滴上。在一些情况下，包含生物分子的液滴的体积为1μl至5μl。

在一些情况下，第一储存器包括真核细胞群，并且其中生物分子被递送到真核细胞群的至少50％中。在一些情况下，施加电场后，真核细胞群的至少50％保持存活。在一些情况下，真核细胞群是哺乳动物细胞系群。

在一些情况下，第二储存器包括一个或多个生物分子。在一些情况下，第二储存器包括多个生物分子。在一些情况下，生物分子是核酸、多肽或其组合。在一些情况下，生物分子是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、核糖核蛋白(RNP)或脱氧核糖核蛋白(DNP)。生物分子的非限制性实例包括溶液中的盐和分子离子、小分子、蛋白质、遗传物质(例如DNA、RNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、单链向导RNA(sgRNA))、合成构建体和纳米颗粒、它们的组合等。在一些情况下，生物分子是来自真核生物信使RNA(mRNA)的互补DNA(cDNA)、来自真核生物DNA的基因组DNA序列、合成核酸或它们的组合。在一些情况下，RNA包含单分子CRISPR(簇状规则间隔短回文重复序列)/Cas效应子多肽向导RNA。在一些情况下，RNP包含CRISPR/Cas效应子多肽和向导RNA。

在一些情况下，该方法包括将第二储存器可逆地附接到多孔膜上。在一些情况下，该方法包括将第二储存器可逆地分离到多孔膜上。在一些情况下，该方法包括将第二储存器可滑动地附接或分离到多孔膜上。在一些情况下，该方法包括在施加电场之前将液体介质中的生物分子注射和/或转运到第二储存器中。在一些情况下，该方法包括在施加电场之前将包含液体介质中的生物分子的第二储存器附接到多孔膜上。

在一些情况下，该方法包括在施加电场之前对存在于递送装置的第一储存器中的真核细胞进行离心。在一些情况下，在施加电场之前使真核细胞离心可实现细胞与多孔膜的物理接触和/或粘附。在一些情况下，离心包括使悬浮在液体介质中的真核细胞离心，以使悬浮细胞与多孔膜物理接触。在一些情况下，当真核细胞在递送装置中培养时，真核细胞伸展和/或扩散通过多个纳米孔。

在一些情况下，使存在于第一储存器中的真核细胞离心包括在施加电场之前对递送装置进行离心。在一些情况下，在使真核细胞离心之前，将第二储存器与递送装置分离。在一些情况下，该方法包括通过将第一储存器和多孔膜放置于细胞培养板的孔中并在离心机中以150g使真核细胞群离心来对真核细胞群进行离心。在一些情况下，该方法包括在使真核细胞离心之前将盖子放置在第一储存器上。在一些情况下，该方法包括通过将第一储存器、第二储存器和多孔膜放置于细胞培养板的孔中并在离心机中以150g使真核细胞群离心来对真核细胞群进行离心。在一些情况下，细胞培养板是标准6孔、12孔或24孔细胞培养板。

在一些情况下，使真核细胞离心至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟或至少10分钟。

在一些情况下，以100g至150g、150g至200g、200g至250g、250g至300g、300g至350g、350g至400g、400g至450g、450g至500g、500g至550g、550g至600g、600g至650g、650g至700g、700g至800g、800g至850g、850g至900g、900g至1000g的离心力对细胞进行离心。

在一些情况下，该方法包括在使真核细胞离心之后和在施加电场之前，培养存在于第一储存器中的真核细胞。在一些情况下，真核细胞在液体介质中培养过夜。在一些情况下，液体介质是细胞培养基。在一些情况下，该方法包括在施加电场之前将存在于第一储存器中的真核细胞培养一段时间，以使真核细胞与多孔膜物理接触。在一些情况下，一段时间为约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时或约14小时至约16小时。在一些情况下，真核细胞在液体介质中培养过夜以粘附在多孔膜的表面上。在一些情况下，真核细胞在液体介质中培养约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟或约10分钟。在一些情况下，真核细胞在液体介质中培养约10分钟。在一些情况下，培养真核细胞以在第一储存器和/或多孔膜中提供真核细胞群。任何合适的细胞培养基均可以用于培养细胞。细胞培养基的非限制性实例包括Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、具有营养混合物F-12的DMEM(DMEM/F12)、F10营养混合物、培养基199、最低必需培养基(MEM)、RPMI培养基、Opti-Mem I减血清培养基、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、neurobasal+加培养基及其组合等。在一些情况下，在PBS或电穿孔缓冲液中培养真核细胞。

在一些情况下，第一储存器和/或第二储存器中的液体介质是缓冲液。在一些情况下，缓冲液包括NaCl、KCl、HEPES、CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄、甘油、葡萄糖、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、水、PBS、具有不同pH范围的tris缓冲液或它们的组合。在一些情况下，液体介质是缓冲液和细胞培养基的组合。

在一些情况下，电极的定位和放置会向第一储存器和/或第二储存器产生电场，从而将生物分子引入细胞中(Mir,L.M.,Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization.Bioelectrochemistry,2001.53：第1-10页)。在一些情况下，该方法包括将电场施加到第二储存器。在一些情况下，该方法包括将电场施加到第一储存器。在一些情况下，该方法包括将电场从第二储存器施加到第一储存器。在一些情况下，该方法包括将电场从第一储存器施加到第二储存器。在一些情况下，电场实现细胞膜的透化作用。在一些情况下，细胞膜的透化作用可以是可逆的，例如暂时可渗透的。在一些情况下，细胞膜将在一段时间后重新封闭，例如当电脉冲停止时。

在一些情况下，该方法包括将至少两个电极中的第一电极***在递送装置的第一储存器的远端处。在一些情况下，该方法包括将至少两个电极中的第二电极***在递送装置的第二储存器的远端处。在一些情况下，该方法包括从上方将第一电极***和/或定位到第一储存器的远端中或周围；和/或从下方将第二电极***和/或定位到第二储存器的远端中或周围。在一些情况下，该方法包括将第一电极定位在第一储存器的远端。在一些情况下，该方法包括将第二电极定位在第二储存器的远端。在一些情况下，第一电极和/或第二电极处于第一储存器和/或第二储存器的平面内。在一些情况下，第一电极和/或第二电极处于第一储存器和/或第二储存器的平面外。

在一些情况下，该方法包括将至少两个电极电连接到电源。在一些情况下，递送装置包括电源和从电源到至少两个电极的电连接件。在一些情况下，电极可以电连接到电源以施加电脉冲。在一些情况下，电源以持续时间、电压、电流量及其组合向电极提供电脉冲，以将电场施加给递送装置内的细胞。在一些情况下，该方法包括将电场施加到递送装置的第一储存器。在一些情况下，该方法包括将电场施加到递送装置的第二储存器。在一些情况下，该方法包括将电场从递送装置的第一储存器施加到第二储存器。

在一些情况下，电场包括5伏至100伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括15伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括30伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括50伏至80伏范围内的电压。在一些情况下，电场包括以下范围内的电压：5伏至10伏、10伏至15伏、15伏至20伏、20伏至30伏、30伏至35伏、35伏至40伏、40伏至45伏、45伏至50伏、50伏至55伏、55伏至60伏、60伏至65伏、65伏至70伏、70伏至75伏、75伏至80伏、80伏至85伏、85伏至90伏、90伏至95伏或95伏至100伏。在一些情况下，电场包括30伏的电压。

在一些情况下，该方法包括产生范围从约1Hz到约1MHz的频率。在一些情况下，频率由脉冲发生器产生。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从约1Hz到约1MHz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到100Hz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到25Hz、从25Hz到50Hz或从50Hz到100Hz的频率。在一些情况下，脉冲发生器被配置为产生范围从1Hz到10Hz、从10Hz到20Hz或从20Hz到30Hz、从30Hz到40Hz或从40Hz到50Hz的频率。

在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括纳秒脉冲、微秒脉冲或毫秒脉冲。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从1微秒到10毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从1毫秒到5毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从0.001毫秒到2毫秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从200微秒到2000微秒的脉冲持续时间。在一些情况下，电脉冲的持续时间可以包括范围从100微秒到500微秒、500微秒到1000微秒、1000微秒到1500微秒或1500微秒到2000微秒的脉冲持续时间。

在一些情况下，该方法包括将生物分子递送到真核细胞群的至少50％中。在一些情况下，该方法包括将生物分子递送到真核细胞群的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％中。在一些情况下，该方法包括将生物分子递送到真核细胞群的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％中。

在一些情况下，施加电场后，真核细胞群的至少50％保持存活。在一些情况下，施加电场后，真核细胞群的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％保持存活。在一些情况下，施加电场后，真核细胞群的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％保持存活。

在一些情况下，该方法进一步包括评估真核细胞的活力和/或存活率。在一些情况下，在使用递送装置之前评估真核细胞的活力和/或存活率。在一些情况下，在使用递送装置之后评估真核细胞的活力和/或存活率。在一些情况下，在使用递送装置之前和之后评估真核细胞的活力和/或存活率。可以通过细胞存活率和/或细胞活力的许多指标(包括细胞内酯酶活性、质膜完整性、代谢活性、基因表达和蛋白质表达)之一来评估细胞存活率和/或细胞活力。在一些情况下，可以通过测量葡萄糖代谢、钙离子转运、ATP产生、pH水平、乳酸形成、氧化还原状态、电动势和/或耗氧量来评估细胞活力。

在一些情况下，可以通过使用无法通过活细胞的完整膜但进入死细胞的细胞质和细胞核的标记(例如染料或染色剂)来评估细胞存活率。此类分子的非限制性实例包括嵌入或共价结合至DNA的碘化丙锭和单叠氮化乙锭。

在一些情况下，标记是荧光染料或发光染料。荧光染料可以是荧光多肽(例如青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、mCherry等)、小分子染料(例如，Cy染料(例如Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy 7)、Alexa染料(例如Alexa Fluor488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750)、Visen染料(例如VivoTag680、VivoTag750)、S染料(例如S0387)、DyLight荧光团(例如DyLight 750、DyLight 800)、IRDye(例如IRDye680、IRDye 800)、荧光素染料(例如荧光素、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC))、罗丹明染料(例如罗丹明、四甲基罗丹明(TAMRA))或HOECHST染料)或量子点。可以组合一种或多种染料。

在一些情况下，使用

存活率/细胞毒性测定试剂盒评估细胞存活率，该试剂盒包括保留在活细胞内的可透过细胞的荧光染料钙黄绿素AM和进入膜受损的细胞的乙锭同二聚体(EthD-1)。结果，可以根据用于存活率染色的荧光团的荧光强度容易地区分活细胞和死细胞。

在一些情况下，可以使用细胞计数仪和膜不可渗透性染料评估细胞存活率、细胞活力和/或细胞密度。在一些情况下，可以使用血球计和膜不可渗透性染料评估细胞存活率、细胞活力和/或细胞密度。在一些情况下，可以通过流式细胞术或通过使用读板器装置来评估细胞存活率、细胞活力和/或细胞密度。在一些情况下，可以使用任何显微镜检查方法评估细胞存活率、细胞活力和/或细胞密度。

在一些情况下，通过使用对细胞死亡标记物(例如裂解的Caspase3、裂解的Parp或膜联蛋白V)具有特异性的荧光标记亲和结合剂来评估细胞存活率。

在一些情况下，通过任何免疫学方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质印迹分析、荧光相关光谱法(FCS)和/或荧光互相关光谱法(FCCS))来评估细胞存活率。

在一些情况下，评估细胞存活率包括用放射性标记、自旋标记、荧光标记或发光标记来标记真核细胞。标记可以直接地或通过功能性接头(例如，肽接头、聚乙二醇(PEG)接头、糖接头、脂肪酸接头、烷基接头等)缀合至真核细胞。或者，可以对一种或多种标记的抗体或其衍生物进行标记并使其结合至真核细胞。可以在美国专利号9,994,854中找到用于评估细胞存活率的标记的非限制性实例，该专利的全部内容通过引用合并于此。

在一些情况下，评估细胞存活率包括检测从标记的真核细胞发出的荧光。在这种情况下，可以使用已知的显微镜检查方法检测荧光。可用于评估细胞存活率的显微镜检查方法的非限制性实例包括荧光显微镜检查、共聚焦显微镜检查、荧光分子断层扫描(FMT)、荧光分子成像(FMI)、明视野显微镜检查、FCS、FCCS或荧光去极化。可以在美国专利号9,994,854中找到用于评估细胞存活率的显微镜检查方法的非限制性实例，该专利的全部内容通过引用合并于此。

本公开的非限制性方面的实例

上述本发明主题的方面(包括实例)可以是单独有益的或在与一个或多个其他方面或实例组合的情况下是有益的。在不限制前述描述的情况下，下面提供本公开的编号为1-22的某些非限制性方面。本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，每个单独编号的方面可以与先前或随后单独编号的方面中的任一个一起使用或组合。这旨在为方面的所有此类组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：

方面1.一种用于将生物分子递送到真核细胞中的递送装置，所述装置包括：第一储存器，其包括近端和远端；第二储存器，其包括近端和远端；多孔膜，其包含孔径为约50nm至约150nm的至少一个纳米孔，其中所述至少一个纳米孔流体连接至所述第一储存器和第二储存器；以及两个或更多个电极，它们被配置为产生跨越多孔膜的电场。

方面2.根据方面1所述的装置，其中所述至少一个纳米孔的孔径为50nm至约100nm。

方面3.根据方面2所述的装置，其中所述至少一个纳米孔的孔径为100nm至约150nm。

方面4.根据方面1所述的装置，其中所述多孔膜的纳米孔密度为1×10⁸个纳米孔/cm²至5×10⁸个纳米孔/cm²。

方面5.根据方面1所述的装置，其中所述多孔膜包括聚合物材料。

方面6.根据方面1所述的装置，其中所述多孔膜包括弹性体、热固性塑料、热塑性塑料、玻璃、石英或硅材料。

方面7.根据方面5所述的装置，其中所述材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰亚胺、聚氨酯、SU-8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氯乙烯(PVC)或聚己内酯(PCL)。

方面8.根据方面1所述的装置，其中所述两个或更多个电极包括第一电极和第二电极。

方面9.根据方面8所述的装置，其中所述第一电极位于所述第一储存器的远端，并且所述第二电极位于所述第二储存器的远端。

方面10.根据方面1所述的装置，其中所述装置的总面积为约0.01cm²至约15cm²。

方面11.根据方面1至13中任一项所述的装置，其中所述多孔膜的厚度在10μm至100μm的范围内。

方面12.根据权利要求1至14中任一项所述的装置，其中所述两个或更多个电极是两个或更多个铂或钛电极。

方面13.一种将生物分子递送到真核细胞中的方法，所述方法包括：施加跨越根据方面1至13中任一项所述的递送装置的多孔膜的电场，其中所述生物分子存在于所述第二储存器中的液体介质中，其中所述真核细胞存在于所述第一储存器中的液体介质中并与所述多孔膜物理接触，并且其中施加电场实现将所述生物分子递送到所述真核细胞中。

方面14.根据方面14所述的方法，其进一步包括在施加电场之前，对存在于所述递送装置的第一储存器中的真核细胞进行离心。

方面15.根据方面15所述的方法，其进一步包括在所述第一储存器的近端培养至少一种真核细胞达一段时间，以允许所述至少一种真核细胞接触所述多孔膜。

方面16.根据方面14至16中任一项所述的方法，其中所述电场包括15伏至80伏范围内的电压。

方面17.根据方面17所述的方法，其中所述电场包括50伏至80伏范围内的电压。

方面18.根据方面14至18中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自由以下组成的组：DNA、RNA、多肽、核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)和它们的组合。

方面19.根据方面19所述的方法，其中所述RNA是单分子CRISPR/Cas效应肽向导RNA。

方面20.根据方面19所述的方法，其中所述RNP包括CRISPR/Cas效应子多肽和向导RNA。

方面21.根据方面14至21中任一项所述的方法，其中所述第一储存器包含真核细胞群，并且其中所述生物分子被递送到所述真核细胞群的至少50％中。

方面22.根据方面14至22中任一项所述的方法，其中在施加电场后，所述真核细胞群的至少50％保持存活。

实施例

给出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供对如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明者所视为的他们的发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是所进行的所有或仅有实验。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。

实施例1：用于将生物分子递送到真核细胞中的递送装置

本公开的递送装置和方法包括无毒的通用递送装置，其简化了所有细胞类型的细胞内转染。如图1A-1C和图10所示，递送装置包括多孔膜作为介质，以将生物分子递送到细胞中。将细胞放置在第一储存器(例如细胞培养容器)中，该第一储存器包括底部用聚碳酸酯纳米多孔膜密封的支架(图1A)。为了获得最佳的递送能力，如在细胞***/传代过程中所常规进行的，允许粘附细胞在递送前在储存器上散布(即伸展)过夜(图1B)。但是，对于悬浮细胞而言，过夜培养不是必需的。进行温和离心以实现与纳米多孔膜的物理接触，然后向细胞施加电场(图1B)。通过施加低强度电脉冲，将包括核酸、蛋白质、小信号分子或RNP复合物的生物分子通过细胞下方的膜中的纳米孔电泳地牵拉到细胞中(图1C)。因为由施加通过纳米孔的电场所诱导的细胞膜开口是瞬时的、超小的，并与纳米孔共定位，所以该过程对细胞几乎没有可检测的损伤。评估细胞损伤包括测量培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的渗漏和分析转染细胞中DNA损伤诱导性转录因子3基因(DDIT3)的表达谱。

核酸高效转染至粘附细胞内

为了测试用于转染的递送装置，将人胚胎肾细胞293(HEK293)、HeLa细胞和NIH3T3成纤维细胞(3T3)在底部用多孔聚碳酸酯膜密封的第一储存器中培养过夜。用mCherry编码mRNA(图2A-2C)和绿色荧光蛋白(GFP)编码DNA质粒(图3A-3C)转染细胞。测试了为产生电场所施加的一系列电压(例如15V至80V)。15V至50V的电压强度产生最高的转染效率。HEK293、HeLa和3T3细胞的mRNA转染效率分别为85％、95％和75％。由于DNA质粒转染需要更多的细胞活性，因此这三种类型的细胞的DNA质粒转染效率略低于mRNA效率：分别为65％、90％和40％。通过分析HeLa细胞的DNA质粒转染效率，将本公开的递送装置与LFN 2000介导的递送进行了比较。流式细胞术分选(FACS)的结果显示，本公开的递送装置相比于LFN***具有高至少20％的产率(图4)。

核酸高效转染至悬浮细胞内

本公开的递送装置也适用于转染悬浮细胞。由于人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat难以被转染，所以使用该细胞系测试核酸向细胞内的转染。为了使用本公开的递送装置将mRNA或DNA质粒递送到Jurkat细胞中，将Jurkat细胞以150g离心3至5分钟以使细胞与多孔膜的表面物理接触(图1A-1C)。将少量(例如1μl至5μl)mRNA或DNA质粒置于多孔膜下方的第二储存器中，并且通过由施加电场产生的电场力将生物分子通过膜中的纳米孔牵拉到细胞中。测试了从30V到80V的不同电压强度(图5A-5B)。结果显示30V足以将mRNA或DNA质粒高效递送至细胞中。细胞图像分析表明，mRNA和DNA质粒的转染效率分别为90％和60％。此外，来自荧光激活细胞分选(FACS)的结果表明，来自本公开的递送装置的转染效率比LFN 2000介导的转染高40％(图6)。

蛋白质和Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物(RNP)的高效递送

通过将带有mCherry标签的蛋白质STIM1(98kDa)或SpyCas9-sgRNA RNP递送到细胞中进行基因编辑，测试递送装置将生物分子转运到细胞中的效率。蛋白质和RNP的递送过程与核酸的递送过程完全相同。结果显示，带有mCherry标签的STIM1蛋白进入HEK293细胞中的递送效率高达90％(图7)。如随后的T7E1测定所示，将SpyCas9-sgRNA RNP递送到HEK293细胞中也是有效的。从RNP切割出超过50％的PPIB靶DNA(图8)。

滤水器纳米孔递送***对递送细胞的损伤较小

为了确定使用本公开的递送装置的转染过程是否对转染细胞造成损伤，测量了培养基中LDH的渗漏，并使用qPCR分析了在转染HeLa细胞中DNA损伤诱导性转录因子3基因(DDIT3)的表达谱。这些测定表明，与LFN介导的转染相比，用本公开的递送装置进行的转染对转染细胞的毒性较小(图9A-9B)。

尽管已经参考本发明的特定实例描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变并且可进行等效物替换。此外，可进行许多修改以使特定的情况、材料、物质组成、过程、一个或多个过程步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (22)

1.一种用于将生物分子递送到真核细胞中的递送装置，所述装置包括：

第一储存器，其包括近端和远端；

第二储存器，其包括近端和远端；

多孔膜，其包含孔径为约50nm至约150nm的至少一个纳米孔，其中所述至少一个纳米孔流体连接至所述第一储存器和所述第二储存器；和

两个或更多个电极，其被配置为产生跨越所述多孔膜的电场。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个纳米孔的孔径为50nm至约100nm。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述至少一个纳米孔的孔径为100nm至约150nm。

4.根据权利要求1所述的装置，其中所述多孔膜的纳米孔密度为1×10⁸个纳米孔/cm²至5×10⁸个纳米孔/cm²。

5.根据权利要求1所述的装置，其中所述多孔膜包括聚合物材料。

6.根据权利要求1所述的装置，其中所述多孔膜包括弹性体、热固性塑料、热塑性塑料、玻璃、石英或硅材料。

7.根据权利要求5所述的装置，其中所述材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰亚胺、聚氨酯、SU-8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氯乙烯(PVC)或聚己内酯(PCL)。

8.根据权利要求1所述的装置，其中所述两个或更多个电极包括第一电极和第二电极。

9.根据权利要求8所述的装置，其中所述第一电极位于所述第一储存器的远端，并且所述第二电极位于所述第二储存器的远端。

10.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置的总面积为约0.01cm²至约15cm²。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的装置，其中所述多孔膜的厚度在10μm至100μm的范围内。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的装置，其中所述两个或更多个电极是两个或更多个铂或钛电极。

13.一种将生物分子递送到真核细胞中的方法，所述方法包括：

施加跨越根据权利要求1至12中任一项所述的递送装置的多孔膜的电场，

其中所述生物分子存在于所述第二储存器中的液体介质中，

其中所述真核细胞存在于所述第一储存器中的液体介质中，并与所述多孔膜物理接触，并且

其中施加电场实现将所述生物分子递送到所述真核细胞中。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括在施加电场之前，对存在于所述递送装置的第一储存器中的真核细胞进行离心。

15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括在所述第一储存器的近端培养至少一种真核细胞达一段时间，以允许所述至少一种真核细胞接触所述多孔膜。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述电场包括15伏至80伏范围内的电压。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述电场包括50伏至80伏范围内的电压。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自由以下组成的组：DNA、RNA、多肽、核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)和它们的组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述RNA是单分子CRISPR/Cas效应肽向导RNA。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述RNP包括CRISPR/Cas效应子多肽和向导RNA。

21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述第一储存器包含真核细胞群，并且其中所述生物分子被递送到所述真核细胞群的至少50％中。

22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中在施加电场后，所述真核细胞群的至少50％保持存活。

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