ES2557282T3

ES2557282T3 - Proteínas quiméricas de unión al factor H (fHBP) que contienen un dominio B heterólogo, y métodos de uso

Info

Publication number: ES2557282T3
Application number: ES09720813.6T
Authority: ES
Inventors: Dan Granoff; Peter Beernink; Jo Anne Welsch
Original assignee: Childrens Hospital Oakland Research Center
Current assignee: Childrens Hospital Oakland Research Center
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2016-01-25
Anticipated expiration: 2029-03-09
Also published as: WO2009114485A2; CA2717870A1; EP2265640B1; WO2009114485A3; US9511131B2; EP2631245A1; US20120107339A1; EP2265640A2; AU2009223613A1; AU2009223613B2

Abstract

Una proteína quimérica de unión al factor H (fHBP) que comprende, del extremo N al extremo C: a) una primera secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos contigua QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGK de un dominio B de la variante 1 (v.1) de fHBP, en la que el dominio B comprende una secuencia GEHT; y b) ligada operativamente a a), una segunda secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos contigua de una variante 2 (v.2) o una variante 3 (v.3) de fHBP; en la que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos están ligadas operativamente en un punto de unión situado en un sitio no más de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no más de 34 restos C-terminal de la secuencia GEHT, en la que el punto de unión está ubicado en un dominio B para proporcionar un dominio B heterólogo o en un dominio C para proporcionar un dominio C heterólogo de la fHBP quimérica; en la que la fHBP quimérica comprende el epítopo unido por el anticuerpo JAR 11 (ATCC PTA-8938) o el anticuerpo JAR 32 (ATCC PTA-8942); en la que la fHBP quimérica comprende el epítopo unido por el anticuerpo JAR 5 (ATCC PTA-8941); en la que cuando el punto de unión está ubicado en el dominio B, el punto de unión está ubicado en un sitio no más de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no más de 24 restos C-extremo Con respecto a la secuencia GEHT; en la que cuando el punto de unión está ubicado en el dominio C, el punto de unión está ubicado en un sitio no más de 34 aminoácidos C-extremo Con respecto a la secuencia GEHT.

Description

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DESCRIPCION

Protelnas quimericas de union al factor H (fHBP) que contienen un dominio B heterologo, y metodos de uso Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a vacunas para enfermedades causadas por Neisseria meningitidis.

Antecedentes

Neisseria meningitidis es una bacteria Gram-negativa que coloniza el tracto respiratorio superior humano y es responsable de brotes epidemicos esporadicos y clclicos en todo el mundo, principalmente, de meningitis y sepsis. Las tasas de ataque y morbilidad son mas elevadas en los ninos menores de 2 anos de edad. Al igual que otras bacterias Gram-negativas, por lo general, Neisseria meningitidis posee una membrana citoplasmatica, una capa de peptidoglicano, una membrana externa que, junto con el polisacarido capsular constituye la pared bacteriana, y pili, que se proyectan hacia el ambiente exterior. Las cepas encapsuladas de Neisseria meningitidis son una causa principal de meningitis bacteriana y septicemia en ninos y adultos jovenes. La prevalencia y la importancia economica de las infecciones por Neisseria meningitidis invasoras han impulsado la busqueda de vacunas eficaces que puedan conferir inmunidad a traves de diferentes cepas, y, en particular, a traves de cepas del grupo B geneticamente diversas con diferentes serotipos o serosubtipos.

La protelna de union al factor H (fHBP, tambien denominada en la tecnica lipoprotelna 2086 (Fletcher et al, Infect Immun 2004; 72: 2088-2100), el antlgeno de Neisseria derivado del genoma (GnA) 1870 (Masignani et al., J Exp Med 2003; 197:789-99) o "741"), es una protelna de N. meningitidis que se expresa en la bacteria en forma de una lipoprotelna expuesta a la superficie. Basandose en el analisis de secuencias de 71 cepas de N. meningitidis representativas de su diversidad genetica y geografica, las cepas de N. meningitidis se han subdividido en tres grupos de variantes de fHBP (denominadas variante 1 (v.1), variante 2 (v.2) y variante 3 (v.3)), basandose en la variabilidad de las secuencias de aminoacidos y en la reactividad inmunologica cruzada (Masignani et al J Exp Med 2003; 197:789-99). Otros investigadores (Fletcher et al, 2004) han subdividido la protelna en dos subfamilias designadas A (que incluye v.2 y v.3 de Masignani) y B (v.1). Las cepas de la variante 1 representan aproximadamente el 60 % de los aislados del grupo B que producen enfermedades (Masignani et al. 2003, supra). Dentro de cada grupo de variantes, hay conservation de la secuencia de aminoacidos del orden de aproximadamente un 92 % o superior. En concreto, la conservacion dentro de cada grupo de variantes varla entre el 89 y el 100 %, mientras que entre los grupos de variantes (por ejemplo, entre v.1 y v.2), la conservacion puede ser tan baja como del 59 %. La protelna es expresada por todas las cepas conocidas de N. meningitidis.

Los ratones inmunizados con fHBP recombinante generaron altas respuestas de anticuerpos bactericidas sericos contra cepas que expresaban protelnas fHBP del grupo de variante homologa (Masignani et al., 2003, supra; Welsch et al., 2004, J Immunol. 172(9):5606-15). Por lo tanto, el antisuero preparado contra la v.1 de fHBP confiere protection contra las cepas de N. meningitidis que expresan v.1 de fHBP, pero no contra las cepas que expresan la v.2 ni la v.3 de fHBP. Del mismo modo, el antisuero preparado contra la v.2 de fHBP protege contra las cepas que expresan la v.2 (o la v.3), pero no la v.1 (Masignani et al., J Exp Med 2003, 197:789-99; Beernink et al., J Infect Dis 2007; 195:1472-9). Con fines de vacunacion, serla deseable disponer de una sola protelna que fuera capaz de generar anticuerpos con proteccion cruzada frente a fHBP de diferentes grupos de variantes.

Se han usado protelnas quimericas para el desarrollo de vacunas de diversas maneras. Por ejemplo, una primera estrategia emplea un enlace genetico o qulmico de un antlgeno a una protelna inmunogenica conocida, pero no relacionada, tal como las protelnas de la difteria, del tetanos o del toxoide de la tos ferina, o el dominio de la toxina B del colera (CTB), para aumentar la magnitud de las respuestas de los anticuerpos hacia el antlgeno de interes. Una segunda estrategia usa una fusion genetica de dos antlgenos del mismo organismo para mejorar la proteccion cruzada contra cepas con diversidad antigenica (Giuliani et al., Infect Immun 2005 73:1151-60). Un ejemplo es la vacuna de protelna recombinante meningococica del grupo multivalente B, que contiene una mezcla de dos protelnas de fusion: una primera protelna de fusion de una protelna GNA2091 y de una protelna GNA1870 (o "fHBP"), y una segunda protelna de fusion de una protelna GNA2132 y de una protelna GNA1030 (Giuliani et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2006, 103:10834-9). Una tercera estrategia ha sido la de construir una fusion de diferentes variantes serologicas ("serovares") de un antlgeno para inducir la proteccion cruzada contra cepas con diversidad antigenica. Un ejemplo es una vacuna tetravalente quimerica de OspC contra la enfermedad de Lyme, que indujo respuestas de anticuerpos bactericidas contra cepas de espiroqueta que expresaban cada uno de los tipos de OspC que se incorporaron en la construction (Earnhart et al., “Vaccine” 2007; 25:466-80).

En los ejemplos de vacunas quimericas descritas que se disenaron para ampliar las respuestas inmunes protectoras, las vacunas estaban compuestas de repeticiones de un dominio individual con variabilidad antigenica. Las respectivas variantes del dominio se expresaron en tandem en una protelna (es decir, el mismo dominio de diferentes cepas, A1-A2-A3-A4, etc.). En algunos casos, dichas protelnas recombinantes en tandem pueden ser convenientes para la fabrication y el control de calidad. Sin embargo, tambien pueden ser muy grandes y someterse a plegamiento o degradation inadecuados.

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Una metodologla para evitar el problema de las protelnas de fusion en tandem de gran tamano es el diseno de un solo polipeptido que se componga de diferentes dominios de dos variantes antigenicas, por ejemplo, mediante el "intercambio" de diferentes dominios individuales de un antlgeno, o regiones incluso menores tales como epltopos individuales de dos protelnas diferentes, para formar una protelna quimerica que exprese epltopos no relacionados antigenicamente especlficos para mas de una cepa (es decir, diferentes dominios de dos cepas diferentes, A1-B2 o - A2-B1, etc.).

Esta ultima metodologla se realizo con fHBP. En primer lugar, para facilitar la identificacion de las regiones bactericidas de fHBP, se dividio la protelna en tres dominios, designados A, B y C (Giuliani (2005) Infect. Immun. 73:1151-1160). El dominio A esta muy conservado en los grupos de variantes, mientras que los dominios B y C contienen secuencias que difieren entre las cepas. Giuliani et al. identificaron un epltopo de fHBP que interacciona con un mAb bactericida ubicado en el dominio C de R204 (Giuliani (2005) supra). Sin embargo, una protelna quimerica que contiene el dominio B de una cepa de la variante 3 (B3) fusionado con el dominio C de una cepa de la variante 1 (C1) no pudo generar respuestas bactericidas de protection contra las cepas con fHBP v.1 ni con fHBP v.2. Vease tambien el documento WO 2006/024954 de los mismos autores. El documento WO 2007/060584 tambien se refiere a fHBP adicionales disenadas por ingenierla genetica en las que se pueden sustituir secuencias de una familia NMB 1870 a la position correspondiente de otra familia.

Las vacunas que aprovechan la capacidad de las fHBP para generar respuestas de anticuerpos bactericidas y que pueden generar dichos anticuerpos que son eficaces contra las cepas que expresan diferentes variantes de fHBP siguen siendo de interes.

Sumario

Se proporcionan fHBP quimericas que pueden generar anticuerpos que son bactericidas para diferentes cepas de variantes de fHBP de N. meningitidis y metodos de uso de acuerdo con las reivindicaciones.

La presente invention proporciona una protelna quimerica de union al factor H (fHBP) que comprende del extremo N al extremo C:

a) una primera secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGK (SEC ID n.° 1) de un dominio B de la variante 1 (v.1) de fHBP, en la que el dominio B comprende una secuencia GEHT; y

b) ligada operativamente a a), una segunda secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de una variante 2 (v.2) o una variante 3 (v.3) de fHBP;

en la que la primera y la segunda secuencia de aminoacidos estan ligadas operativamente en un punto de union situado en un sitio no mas de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no mas de 34 restos C-terminal de la secuencia GEHT, en la que el punto de union esta ubicado en un dominio B para proporcionar un dominio B heterologo o en un dominio C para proporcionar un dominio C heterologo de la fHBP quimerica; fHBP quimerica que comprende el epltopo unido por el anticuerpo JAR 11 (ATCC PTA-8938) o el anticuerpo JAR 32 (ATCC PTA-8942);

en la que la fHBP quimerica comprende el epltopo unido por el anticuerpo JAR 5 (ATCC PTA-8941); en la que el punto de union esta ubicado en el dominio B, el punto de union esta ubicado en un sitio no mas de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no mas de 24 restos C-terminal con respecto a la secuencia GEHT; en la que cuando el punto de union esta ubicado en el dominio C, el punto de union esta ubicado en un sitio no mas de 34 aminoacidos C-terminal con respecto a la secuencia GEHT.

En las reivindicaciones anexas, se definen caracterlsticas adicionales de la protelna quimerica de la invencion.

La invencion tambien proporciona un acido nucleico que codifica la fHBP quimerica de la invencion y una celula hospedadora recombinante que contiene el acido nucleico.

Tambien se proporciona un metodo de production de la fHBP quimerica de la invencion, metodo que comprende cultivar la celula hospedadora recombinante de la invencion en condiciones adecuadas para la expresion de la fHBP quimerica; y aislar la fHBP quimerica.

La invencion proporciona ademas una composition inmunogenica que comprende una fHBP quimerica de acuerdo con la invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

La fHBP quimerica de acuerdo con la invencion y sus composiciones tambien se proporcionan para su uso en un metodo de vacunacion de un mamlfero.

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Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una coleccion de resultados de analisis de transferencia Western que ilustran los restos de aminoacidos que participan en la union de los anticuerpos monoclonales (mAb) JAR 3 y JAR 5 a la proteina de union al factor H (fHBP). Grupo A, JAR 5; carril 1, patron de masa molecular; carril 2, pET2lb; carril 3, pET21-fHBP (MC58 de tipo silvestre); carril 4, pET21-fHBP(MC58)G121R; carril 5, pET21-fHBP (M6190 de tipo silvestre) R121; carril 6, pET21-fHBP (m6190) R121G. Grupo B, JAR 3. C, mAb Penta-His. Los grupos B y C tienen las mismas asignaciones de carril que el grupo A.

La Figura 2 es una serie de graficas que ilustran que la union de los mAb JAR 3 y JAR 5 a fHBP es competitiva. Se mide el porcentaje de inhibicion competitiva de la union de los mAb anti-fHBP a fHBP por un segundo anticuerpo mediante ELISA. Cada grupo incluye: antisuero anti-fHBP policlonal de conejo; suero preinmune de conejo; y un mAb de control negativo especifico de un antigeno capsular irrelevante (JW-C2, -A2 o -A1). Grupo A, Inhibicion de la union de JAR 3 por JAR 4 o JAR 5. Grupo B, Inhibicion de la union de JAR 5 por JAR 3 o JAR 4. Grupo C, Inhibicion de la union de jAr 4 por JAR 3 o JAR 5.

La Figura 3 es un esquema que ilustra las posiciones de los restos asociados a los epitopos de los nueve mAb anti- fHBP (mAb "JAR") en el modelo estructural basado en datos de RMN previamente publicados (Cantini et al. "Solution structure of the immunodominant domain of protective antigen GNA1870 of Neisseria meningitidis". J Biol Chem 2006; 281:7220-7). Para construir el modelo, se usaron coordinados de la estructura en solucion de los dominios B y C de la v.1 de fHBP de la cepa MC58. Cabe senalar que, en el modelo, se muestran las posiciones de los restos de aminoacidos implicados en los epitopos para los anticuerpos generados contra las proteinas v.2 y v.3 fHBP, a pesar de que estos anticuerpos no se unen a la proteina v.1 de la cepa MC58. Tambien cabe senalar que la numeration de los restos de aminoacidos se basa en la secuencia de proteina madura de fHBP (es decir, carece de la secuencia senal) de la cepa MC58. Dado que las secuencias de aminoacidos de la variante 2 (v.2) de la proteina fHBP (de la cepa 8047) y la variante 3 (v.3) de fHBP (de la cepa M1239) difieren en -1 y +7 restos de aminoacidos, respectivamente, de la de MC58, la numeracion usada para referirse a los restos de las proteinas v.2 y v.3 de fHBP difieren de la numeracion basada en las secuencias de aminoacidos reales de dichas proteinas. Asi pues, por ejemplo, la referencia a un resto de leucina (L) de la position 166 de la secuencia de v.2 o la v.3 de fHBP de la Figura 3, se refiere al resto de la posicion 165 de la proteina v.2 y de la posicion 173 de la proteina v.3. Para una mayor aclaracion, vease la Figura 4 de la alineacion. En el presente documento, se proporcionan datos de los restos reactivos y no reactivos. El resto mostrado para el mAb 502 es de un estudio publicado previamente (Giuliani et al., 2005 Infect Immun 73:1151-60). La numeracion se basa en la secuencia de aminoacidos de la v.1 de fHBP de MC58, que carece de la secuencia senal (Masignani et al., 2003 J Exp Med 197: 789-99).

La Figura 4 es un esquema que proporciona una alineacion de las secuencias de aminoacidos de fHBP de tipo silvestre y quimerica (la alineacion se realizo usando ClustalW). Se muestran las secuencias de aminoacidos deducidas de la v.1 de fHBP de la cepa MC58 (abajo) y de la v.2 de cepa 8047 (arriba), junto con las dos secuencias quimericas (en el medio, Quimera I y Quimera II). La numeracion para las cuatro proteinas se basa en la proteina v.1 natural madura de MC58 (es decir, sin la secuencia senal). La proteina fHBP recombinante expresada en E. coli carece de la secuencia senal y siete restos presumiblemente flexibles (CSSGGGG). Se anadio una metionina N- terminal a cada secuencia mostrada para facilitar la expresion en E. coli (no mostrada). Se anadio una secuencia C- terminal LEHHHHHH a cada secuencia mostrada para facilitar el aislamiento (no mostrado). Las identidades de las quimeras con las respectivas secuencias de tipo silvestre se muestran con simbolos encima y debajo de la alineacion (* = identicas; : = conservadas; . = semiconservadas). La posicion de la secuencia de aminoacidos de GEHT en los restos 136-139 de la parte C-terminal del dominio B de 8047 tras el punto de union se indica en un recuadro. Los corchetes exteriores, que abarcan los restos 101 a 164, muestran la region de la proteina definida como el dominio B (Giuliani et al. "The region comprising amino acids 100 to 255 of Neisseria meningitidis lipoprotein GNA 1870 elicits bactericidal antibodies". Infect Immun 2005; 73:1151-60). Con una exception, la Quimera I y la Quimera II tienen secuencias de aminoacidos identicas. La excepcion esta en el resto 174, en el que la alanina de la Quimera I se ha reemplazado por lisina en la Quimera II. La posicion de la sustitucion A174K de la Quimera II se muestra en negrita. La alineacion de secuencias se realizo con ClustalW.

La Figura 5 es una representation esquematica de fHBP quimericas. La parte N-terminal del dominio B de la v.1 de fHBP esta a la derecha, y la parte C-terminal del dominio B que abarca la helice a de la proteina v.2 junto con el dominio C de la v. 2 de fHBP esta a la izquierda. El punto de union para estas quimeras, ilustrado por G136, se indica con una flecha y el texto acompanante. Ambas proteinas quimericas expresan los epitopos de JAR 3 y JAR 5 expresados en el dominio B de la v.1 de fHBP, y el epitopo de JAR 10, que esta en el dominio C de los subconjuntos de las cepas que expresan v.1, v.2 o v.3 de fHBP. La Quimera I contiene el epitopo de JAR 11, incluyendo el resto A174 (Grupo A), que se expresa en los dominios C de un subconjunto de las cepas que expresan la v.2 o v.3 de fHBP. La Quimera II contiene los epitopos JAR 32/JAR 35, incluyendo el resto K174, que se expresa en los dominios C de subconjuntos de cepas que expresan la v.2 o la v.3 de fHBP. Los dominios A no se muestran en estas representaciones. El modelo se construyo basandose en la estructura de RMN de Cantini et al. (2006) J Biol Chem 281:7220-7.

La Figura 6 proporciona los resultados del analisis SDS-PAGE de las fHBP purificadas de tipo silvestre y mutante.

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Las protelnas se expresaron a partir de plasmidos basados en pET21 en BL21(DE3) de E. coli como fusiones de seis histidinas C-terminales y se purificaron mediante cromatografla de quelato metalico. Se sometieron las protelnas a dialisis frente a 1 x PBS, sacarosa al 5 % y DTT 1 mM, y se esterilizaron por filtracion. Se separaron las protelnas (5 mg de cada) en un gel de poliacrilamida al 4-12 % y se tineron con azul de Coomassie. Carril 1, patron de masa; 2, v.1 de fHBP (MC58); 3, v.2 de fHBP (8047); 4, Quimera I de fHBP; 5, Quimera II de fHBP.

La Figura 7 es un conjunto de graficas que ilustran la union de mAb anti-fHBP individuales a protelnas recombinantes. El grupo A muestra mAb preparados contra la v.1 de fHBP; Grupo B, v.2 de fHBP; Grupo C, v.3 de fHBP. Los slmbolos representan diferentes antlgenos en la placa: cuadrados vaclos, v.1 de fHBP; clrculos vaclos, v.2 de fHBP; triangulos vaclos, Quimera I; asteriscos, Quimera II.

La Figura 8A proporciona una tabla de las cepas usadas en los ejemplos, incluyendo las usadas para medir las respuestas de los anticuerpos bactericidas en suero y la descripcion de la identidad de las secuencias de aminoacidos en comparacion con el prototipo v.1, v.2 y v.3 de fHBP, y la union a los mAb JAR de las respectivas fHBP.

La Figura 8B muestra las identidades de aminoacidos de diferentes dominios de fHBP. Se realizan comparaciones para el dominio A (restos 1-100), el dominio B (restos 101-164) y el dominio C (restos 165-255). Tambien se realizan comparaciones para el dominio B hasta el punto de union (101 a 135) y el dominio B comenzando en el punto de union (136-164). La numeracion de restos de aminoacidos se basa en la protelna madura (es decir, la que carece de la secuencia senal) de la cepa MC58.

La Figura 9 es una grafica que ilustra las respuestas de anticuerpos bactericidas en suero de ratones inmunizados con protelnas recombinantes quimericas administradas con adyuvante de Freund medidas frente a cepas de N. meningitidis del grupo B que expresan fHBP en el grupo v.1 antigenico. La cepa H44/76 expresa v.1 de fHBP identica a la de la vacuna de control de v.1 de fHBP. El resto de cepas expresa subvariantes de v.1 de fHBP (vease la tabla de la Figura 8A, anterior). Los valores se presentan como 1/GMT (tltulo medio geometrico reclproco (o inverso)) con un intervalo de confianza del 95 %.

La Figura 10 es una grafica que ilustra las respuestas de anticuerpos bactericidas en suero de ratones inmunizados con protelnas recombinantes quimericas administradas con adyuvante de Freund medidas frente al grupo B de N. meningitidis que expresa fHBP en los grupos antigenicos v.2 o v.3. La cepa 8047 expresa v.2 de fHBP identica a la de la vacuna de control de v.2 de rfHBP. El resto de las cepas expresa subvariantes de v.2 o v.3 de fHBP (vease la tabla de la Figura 8A). Los valores se presentan como 1/GMT con un intervalo de confianza del 95 %. Los datos se estratifican basandose en las cepas que reaccionan con JAR 11 (grupo izquierdo) o JAR 32 (grupo derecho). Las vacunas de Quimera I y II son identicas excepto que la Quimera I tiene el resto A174 y es positiva en JAR 11 y negativa en JAR 32, mientras que la Quimera II tiene el resto K174, y es negativa en JAR 11 y positiva en JAR 32. Vease la figura para los slmbolos de barras.

La Figura 11 es una grafica que ilustra las respuestas de anticuerpos bactericidas en suero de ratones inmunizados con protelnas recombinantes quimericas adsorbidas en hidroxido de aluminio medidas frente a cepas de N. meningitidis del grupo B que expresan fHBP en el grupo v.1 antigenico. La cepa H44/76 expresa v.1 de fHBP identica a la de la vacuna de control de v.1 de fHBP. El resto de las cepas expresa subvariantes de v.1 de fHBP. Los valores se presentan como 1/GMT (es decir, tltulo medio geometrico reclproco (o inverso)) con un intervalo de confianza del 95 %. Los slmbolos de barras para cada vacuna son como los mostrados en la Figura 10.

La Figura 12 es una grafica que ilustra las respuestas de anticuerpos bactericidas en suero de ratones inmunizados con protelnas recombinantes quimericas adsorbidas en hidroxido de aluminio medidas frente al grupo B de N. meningitidis que expresa fHBP en los grupos antigenicos v.2 o v.3. La cepa 8047 expresa subvariantes de v.2 o v.3 de fHBP (vease la tabla de la Figura 8). Los valores se presentan como 1/GMT con un intervalo de confianza del 95 %. Los datos se estratifican basandose en las cepas que reaccionan con JAR 11 (grupo izquierdo) o JAR 32 (grupo derecho). Las vacunas de Quimera I y II son identicas excepto que la Quimera I es positiva en JAR 11 y negativa en JAR 32, mientras que la Quimera II es negativa en JAR 11 y positiva en JAR 32. Los slmbolos de barras para cada vacuna son como los mostrados en la Figura 10.

La Figura 13 es un esquema que muestra la alineacion de secuencias de aminoacidos de v.1 de fHBP con polimorfismos naturales en la parte N-terminal del dominio B. En la nomenclatura alternativa basada en datos estructurales tridimensionales de toda la molecula de fHBP, la secuencia mostrada tambien comprende una parte C- terminal del dominio fHbpN y una pequena parte N-terminal del dominio fHbpC como se indica encima de la alineacion. La conservation de las secuencias se muestra debajo de la alineacion (codigo como en la Figura 4). Las posiciones de las helices a se muestran encima de la alineacion. La position del punto de union de las protelnas quimericas se muestra en el recuadro. La numeracion se basa en la protelna madura (es decir, la que carece de la secuencia senal) de la cepa MC58. Las cepas MC48, M4105, 4243, NZ98/254 son positivos en reactividad hacia JAR3/JAR5; las cepas m6190 y 03S-0408 son negativos en la reactividad hacia JAR 3/5, y las cepas NM452 y CDC1573 no se han ensayado. Los restos G121 y K122, que se asocian con los epltopos de mAb JAR 3 y JAR 5, se muestran en negrita y texto subrayado. Cabe senalar que aunque la cepa 03S-0408 tiene G121, es negativo en

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reactividad hacia JAR 3/5. Esta cepa tiene diferencias en tres aminoacidos entre las posiciones 101 y 146 en comparacion con los aminoacidos de MC58: L109, V114 y S122. Dado que tanto L109 como V114 estan presentes en secuencias reactivas, por ejemplo, 4243 y M4105, la falta de reactividad de 03S-0408 se puede atribuir a la presencia de serina en la posicion 122 en lugar de lisina y, por lo tanto, ademas de G121, K122 tambien se asocia con la reactividad hacia JAR3/5.

La Figura 14 es una representacion esquematica de la alineacion de secuencias de aminoacidos de v.2 de fHBP con polimorfismos naturales en la parte carboxilo-terminal del dominio B y del dominio C, o como alternativa, en todo el dominio fHbpC basandose en la nomenclatura estructural tridimensional. La conservation de las secuencias se muestra debajo de la alineacion (codigo como el de la leyenda de la Figura 4). Los restos implicados en epltopos de mAb anti-fHBP se designan con el numero del mAb JAR encima de la alineacion: JAR 11 (alanina en la posicion del resto 174; A174); JAR 10 (lisina en la posicion del resto 180 y glutamato en la posicion 192; K180 y E192); JAR 13 (resto de serina en la posicion 216; S216). La numeration en esta figura se basa en fHBP de la cepa MC58.

La Figura 15 es un esquema que ilustra vacunas quimericas ilustrativas adicionales (Quimeras lib, III, IV y V). La Quimera lIb se puede crear mediante la introduction de la sustitucion K180R en la Quimera II. Las Quimeras III y V se pueden crear usando partes de los dominios A y B de la cepa NZ98/254 (subvariante v.1) con la parte distal del dominio B y del dominio C de la cepa de v.2 8047 (Quimera III) o de la cepa RM1090 de la subvariante v.2 (Quimera V). La Quimera IV usa los dominios A y B proximales del MC58 con los dominios B y C distales de la RM1090.

La Figura 16 es un esquema que muestra una alineacion de secuencias de aminoacidos de fHBP quimericas ilustrativas adicionales (Quimera III, IV y V) de la region de la posicion de cruce, que esta indicada por el recuadro (restos GEHT). Los restos G121 y K122, implicados en los epltopos de JAR3 y JAR5, se muestran en negrita y subrayados.

La Figura 17 proporciona una tabla que resume la reactividad cruzada de los diferentes mAb JAR, sus respectivos isotipos de Ig y la capacidad de inhibir la union de fH humano.

La Figura 18 es una tabla en la que figura la actividad bactericida mediada por complemento humana de cada uno de los mAb JAR cuando se ensayan individualmente o en combination con un segundo mAb anti-fHBP.

La Figura 19 es una serie de graficas que muestran la capacidad de los mAb JAR representativos preparados contra protelnas v.2 o v.3 fHBP para dar la inhibition dependiente de la concentration de la union de fH a rfHBP en un ELISA. Grupo A, Inhibicion de la union de fH a v.2 de rfHBP. Grupo B, Inhibicion de la union de fH a v.3 de rfHBP. Las respectivas protelnas recombinantes v.2 y v.3 son las codificadas por los genes de fHBP de las cepas 8047 y M1239. Grupo C, Inhibicion de la union de fH a v.1 de rfHBP.

La Figura 20 es una tabla que enumera ciertas propiedades de los respectivos pares de mAb JAR con o sin anticuerpo bactericida mediado por complemento sinergico, incluyendo las posiciones de restos de aminoacidos que participan en los epltopos, las distancias entre los mismos, la inhibicion de la union a fH y el isotipo de cada mAb.

La Figura 21 proporciona la secuencia de aminoacidos de la variante 1 (v.1) de la protelna de union al factor H (fHBP) de MC58, con los dominios A, B y C indicados. Tambien se muestran las posiciones de los dominios estructurales fHbpN y fHbpC. Glutamina 101 (Q) y glicina 164 (G) indicados con flechas hacia arriba definen los llmites de los dominio el A/B y B/C, respectivamente, segun lo definido por Giuliani et al., Infect. Immun, 2005, 73:1151-60. La flecha hacia arriba de la glicina 136 designa el llmite entre los dominios fHbpN y fHbpC, segun lo definido por Cantini et al., J. Biol. Chem. 2.009.

La Figura 22 muestra las partes amino (N)-terminal y carboxilo (C)-terminal de los dominios B y C, que se definen con respecto a la secuencia de aminoacidos conservada de GEHT. Las secuencias de aminoacidos que pueden definir un epltopo de JAR 3/5 estan situadas N-terminalmente con respecto la segunda helice a; las secuencias de aminoacidos que pueden definir un epltopo de JAR 11/32/35 estan situadas C-terminalmente con respecto a la segunda helice a. Se indica la helice a (AH) 2.

La Figura 23 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera I (MC58/8047). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH).

La Figura 24 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera II (MC58/8047). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH). La sustitucion A174K se muestra en negrita y subrayada.

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La Figura 25 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera Ilb (MC58/8047 A174K/K180R). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH). Las sustituciones A174K y K180R se muestran en negrita.

La Figura 26 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera Ill

(NZ98254/8047). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH).

La Figura 27 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera IV

(MC58/RM1090). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH).

La Figura 28 es un esquema que muestra las secuencias proteica y de nucleotidos de la Quimera V

(NZ98254/RM1090). La secuencia antes del punto de union (cruce) se muestra en minusculas y la secuencia detras

del punto de union se muestra en mayusculas. Se muestran llneas de cincuenta restos. Solo se muestran las secuencias de Neisseria; las construcciones de expresion de E. coli contenlan un marcador de metionina N-terminal y hexa-histidina C-terminal (LEHHHHHH).

La Figura 29 proporciona una tabla que muestra las posiciones de los restos asociados con la union a mAb JAR. El resto reactivo de fHBP era de la cepa usada como fuente para la inmunizacion. Para los mAb anti-v.2, la cepa reactiva es 8047, cuya secuencia de fHBP es un 99,6 % identica a la de la cepa 2996. El resto no reactivo es el presente en la cepa no reactiva. La perdida de reactividad asociada con un cambio del resto reactivo en no reactivo se indica como anulado (KO) y el cambio inverso se indica como activado (Kl).

La Figura 30 proporciona una imagen de una transferencia Western que indica los restos que participan en los epltopos de JAR 10 y JAR 33. Se analizaron lisados de E. coli que contenlan plasmidos que expresaban las respectivas fHBP de tipo silvestre y mutantes mediante transferencia Western con JAR 10 (Grupo A), mAb Penta-His (Grupo B) o JAR 33 (Grupo C).

La Figura 31 proporciona una imagen de una transferencia Western que indica un resto que participa en los epltopos de JAR 11, JAR 32 y JAR 35. Se analizaron lisados de E. coli que contenlan plasmidos que expresaban las respectivas fHBP de tipo silvestre y mutantes mediante transferencia Western con JAR 32 (Grupo A), JAR 35 (Grupo B), JAR 11 (Grupo C) o mAb Penta-His (Grupo D).

La Figura 32 proporciona una imagen de una transferencia Western que indica un resto que participa en el epltopo de JAR 13. Lisados de E. coli que contenlan plasmidos que expresaban las respectivas fHBP de tipo silvestre y mutantes: carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, pET21 (plasmido vaclo); carril 3, fHBP (8047) wt; carril 4, fHBP (8047) S216G; carril 5, fHBP (RM1090) wt; carril 6, fHBP (RM1090) G216S. Las transferencias se sondaron con JAR 13 (Grupo A) o mAb Penta-His (Grupo B) y anticuerpo secundario anti-IgG de raton-HRP.

La Figura 33 proporciona una imagen de una transferencia Western de fHBP de tipo silvestre (WT) o quimerica expresada en N. meningitidis. Carril 1, fHBP H44/76 KO transformada con plasmido PCOM-fHBP v.2 de tipo silvestre; 2, fHBP H44/76 KO transformada con plasmido pCom-Quimera I; 3, marcador Kaleidoscope; 4, marcador Magic Mark; 5, celulas H44/76 (v.1) de tipo silvestre; 6, celulas 8047 (v.2) de tipo silvestre; 7, celulas de fHBP 8047 KO; 8, protelna v.1 de fHBP recombinante (r) (gen de la cepa MC58); 9, protelna v.2 de fHBP (gen de la cepa 8047). Grupo superior, transferencia sondada con mAb anti-fHBP JAR 3 (v.1); grupo inferior, transferencia sondada con mAb anti-fHBP JAR 13 (v.2 o v.3).

La Figura 34 muestra diagramas de bandas de v.1 de fHBP de longitud completa. Grupo A, fHBP se divide en tres dominios indicados por varios tonos de gris. El dominio A y la parte N-terminal del dominio B estan a la izquierda, y el llmite entre los dominios A y B se indica mediante una flecha en la lisina 100. La parte C-terminal del dominio B junto con el dominio C esta a la derecha, donde el llmite entre los dos se designa con una flecha en la glicina 164. Grupo B, una nomenclatura alternativa describe la fHBP como aquella que tiene dos dominios estructurales. El dominio N-terminal que contiene una mezcla de helices a y cadenas b se denomina dominio fHbpN (izquierda), y el dominio C-terminal que consiste en cadenas b se marca como el dominio fHbpC (derecha). fHbpN y fHbpC estan conectados por un enlazador en o proximo a la glicina 136. En algunas realizaciones, el punto de union correspondiente para la fHBP quimerica descrita en el presente documento esta en o proxima a G136, indicado por una flecha en ambos grupos. Los modelos mostrados en ambos grupos se construyen basados en la estructura de RMN de Cantini et al., J Biol Chem 2009.

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Antes de describir la presente invention y las realizaciones ilustrativas especlficas de la invention, se ha de entender que la presente invencion no se limita a las realizaciones descritas en particular, ya que, como es evidente, puede variar. Tambien se ha de entender que la terminologla usada en el presente documento tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion estara unicamente limitado por las reivindicaciones anexas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que se incluye en la invencion cada valor intermedio, hasta la decima parte de la unidad del llmite inferior, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el llmite superior o inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido. Tambien se incluyen en la invencion los llmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos que pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos, sujetos a cualquier llmite excluido especlficamente en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluya uno o ambos llmites, tambien se incluyen en la invencion los intervalos que excluyan cualquiera de ambos de estos llmites incluidos.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado comunmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque, en la practica o el ensayo de la presente invencion, tambien se puede usar cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuation, se describen los metodos y los materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento son para desvelar y describir los metodos y/o los materiales en relation con los que se citan en las publicaciones.

Cabe senalar que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular de "un", "una", y "el" y “ella” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. As! pues, por ejemplo, la referencia a "un antlgeno" incluye una pluralidad de dichos antlgenos, y la referencia a "la protelna" incluye la referencia a una o mas protelnas, etcetera.

Las publicaciones mencionadas en el presente documento se proporcionan unicamente para su divulgation antes de la fecha de presentation de la presente solicitud. Nada en el presente documento se debe interpretar como una admision de que la presente invencion no tenga derecho a anteceder a dicha publication en virtud de la invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.

Descripcion detallada de las realizaciones ilustrativas de la invencion

La presente divulgacion proporciona fHBP quimericas que pueden generar anticuerpos que son bactericidas para diferentes cepas de variantes de fHBP de N. meningitidis, y metodos de uso.

Definiciones

"Protelna de union al factor H" (fHBP), que tambien se conoce en la literatura como GNA1870, GNA 1870, ORF2086, LP2086 (lipoprotelna 2086) y "741" se refiere a un polipeptido de N. meningitidis que es una lipoprotelna presentada en la superficie de la bacteria. Las cepas de N. meningitidis se han subdividido en tres grupos de variantes de fHBP (denominadas variante 1 (v.1), variante 2 (v.2) y variante 3 (v.3) en algunos informes (Masignani et al., 2003, supra) y la familia A y B en otros informes (vease, por ejemplo, Fletcher et al., 2004 Infect Immun 20882100)) basandose en la variabilidad y la reactividad inmunologica cruzada de las secuencias de aminoacidos (Masignani et al., J Exp Med 2003; 197:789-99). Para mayor claridad, la presente divulgacion usa la terminologla v.1, v.2 y v.3. Dado que la longitud de la protelna variante 2 (v.2) de fHBP (de la cepa 8047) y la variante 3 (v.3) de fHBP (de la cepa M1239) difieren en -1 y +7 restos de aminoacidos, respectivamente, de la de MC58, la numeration usada para referirse a los restos para las protelnas v.2 y v.3 de fHBP difiere de la numeracion basada en las secuencias de aminoacidos reales de estas protelnas. As! pues, por ejemplo, la referencia a un resto de leucina (L) en la position 166 de la secuencia de v.2 o v.3 de fHBP de la Figura 3 se refiere al resto de la position 165 de la protelna v.2 y de la posicion 173 de la protelna v.3. Para mayor claridad, vease la Figura 4 para la alineacion.

El termino "heterologo" se refiere a dos componentes que estan definidos por estructuras derivadas de diferentes fuentes. Por ejemplo, cuando se usa "heterologo" en el contexto de un polipeptido quimerico, el polipeptido quimerico incluye secuencias de aminoacidos unidas operativamente que se pueden derivar de diferentes polipeptidos (por ejemplo, un primer componente de un polipeptido v.1 de fHBP y un segundo componente de un polipeptido v.2 de fHBP). De igual manera, "heterologo", en el contexto de un polinucleotido que codifica un polipeptido quimerico, incluye una secuencia de acido nucleico unida operativamente que se puede derivar de diferentes genes (por ejemplo, un primer componente de un acido nucleico que codifica un polipeptido v.1 de fHBP y un segundo componente de un acido nucleico que codifica un polipeptido v.2 de fHBP). Dichos polipeptidos quimericos descritos en el presente documento proporcionan la presentacion de epltopos en un solo polipeptido que normalmente se encuentran en diferentes polipeptidos. Otros acidos nucleicos "heterologos" ilustrativos incluyen construcciones de expresion en las que un acido nucleico que comprende una secuencia codificante esta unida operativamente a un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) que es de un origen genetico diferente del de la secuencia de codification (por ejemplo, para proporcionar la expresion en una celula hospedadora de interes que

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puede ser de diferente origen genetico que el del promotor, de la secuencia de codificacion o ambos). Por ejemplo, un promotor T7 unido operativamente a un polinucleotido que codifica un polipeptido fHBP o un dominio del mismo se dice que es un acido nucleico heterologo. "Heterologo", en el contexto de las celulas recombinantes, puede referirse a la presencia de un acido nucleico (o producto genico, tal como un polipeptido) que es de un origen genetico diferente del de la celula hospedadora en la que se encuentra presente. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos y de acido nucleico de Neisseria de una cepa es heterologa a un hospedador de Neisseria de otra cepa.

"Heterologo", como se usa en el presente documento en el contexto de una fHBP quimerica (por ejemplo, "dominio heterologo de fHBP", por ejemplo, un "dominio B heterologo", "dominio C heterologo") indica que la protelna fHBP quimerica contiene secuencias de aminoacidos contiguas y unidas operativamente de elementos estructurales de al menos dos variantes de fHBP diferentes (por ejemplo, para proporcionar la presentacion de epltopos de una v.1 de fHBP, y la presentacion de una v.2 de fHBP y/o una v.3 de fHBP en un solo polipeptido fHBP). Por ejemplo, un "dominio B heterologo" se refiere a un polipeptido que comprende un dominio B que contiene una primera parte que tiene una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio B de una primera variante de fHBP unida operativamente a una segunda parte que tiene una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio B de una segunda variante de fHBP.

"Derivada de", en el contexto de una secuencia de aminoacidos o secuencia de polinucleotido (por ejemplo, una secuencia de aminoacidos "derivada de" una v.1 de fHBP) pretende indicar que el polipeptido o el acido nucleico tiene una secuencia que se basa en la de un polipeptido o acido nucleico de referencia (por ejemplo, una protelna fHBP natural o acido nucleico codificante), y no pretende limitarse a la fuente ni al metodo en el que se crea la protelna o el acido nucleico. "Derivado de" en el contexto de las cepas bacterianas pretende indicar que una cepa se obtuvo a traves del paso in vivo, o en cultivo in vitro, de una cepa parental y/o es una celula recombinante obtenida mediante la modificacion de una cepa parental.

"Sustitucion de aminoacidos conservadora" se refiere a una sustitucion de un resto de aminoacido con otro que comparte las propiedades qulmicas y flsicas de la cadena lateral de aminoacidos (por ejemplo, carga, tamano, hidrofobicidad/hidrofilidad). Las "sustituciones conservadoras" pretenden incluir la sustitucion dentro de los siguientes grupos de restos de aminoacidos: Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos en el contexto de una fHBP quimerica desvelada en el presente documento se seleccionan para preservar la presentacion de un epltopo de interes. Se puede obtener orientacion para dichas sustituciones de las alineaciones de secuencias de aminoacidos de polipeptidos que presentan el epltopo de interes.

La expresion "inmunidad protectora" significa que un programa de vacunacion o inmunizacion que se administra a un mamlfero induce una respuesta inmunitaria que previene, retrasa el desarrollo de o reduce la gravedad de una enfermedad que es causada por Neisseria meningitidis, o disminuye o elimina por completo los slntomas de la enfermedad. La inmunidad protectora puede estar acompanada por la produccion de anticuerpos bactericidas. Cabe senalar que la produccion de anticuerpos bactericidas contra Neisseria meningitidis se acepta en el campo como predictiva de un efecto protector de la vacuna en seres humanos. (Goldschneider et al., 1969, J. Exp. Med. 129:1307; Borrow et al., 2001 Infect Immun. 69:1568).

La expresion "una enfermedad causada por una cepa del grupo B capsular de Neisseria meningitidis" incluye cualquier slntoma cllnico o combinacion de slntomas cllnicos que estan presentes en una infeccion en un ser humano con un miembro del grupo B capsular de Neisseria meningitidis. Dichos slntomas incluyen, pero sin limitacion: la colonizacion del tracto respiratorio superior (por ejemplo, la mucosa de la nasofaringe y las amlgdalas) por una cepa patogena del grupo B capsular de Neisseria meningitidis, la penetracion de las bacterias en la mucosa y en el lecho vascular submucoso, septicemia, choque septico, inflamacion, lesiones cutaneas hemorragicas, activacion de la fibrinolisis y de la coagulacion sangulnea, disfuncion de organos tales como rinon, pulmon e insuficiencia cardiaca, hemorragia suprarrenal e infarto muscular, filtracion capilar, edema, isquemia periferica en extremidades, slndrome de distres respiratorio, pericarditis y meningitis.

La expresion "inmunidad protectora de amplio espectro" significa que un programa de vacunacion o inmunizacion provoca "inmunidad protectora" contra al menos mas de una cepa (o puede ser contra al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, contra al menos ocho o mas cepas) de Neisseria meningitidis, en la que cada una de las cepas expresa una subvariante de fHBP o variante de fHBP diferente. La presente divulgacion contempla y engloba especlficamente una vacuna o un regimen de vacunacion que confiere proteccion contra una enfermedad causada por un miembro de cualquier grupo capsular (por ejemplo, A, B o C), con proteccion contra la enfermedad causada por una cepa del grupo B capsular de Neisseria meningitidis que es de interes debido a la prevalencia epidemiologica de las cepas causantes de la enfermedad con este grupo capsular y falta de vacunas del grupo B ampliamente eficaces.

La expresion "se une especlficamente a un anticuerpo" o "especlficamente inmunorreactivo con", en el contexto de un antlgeno (por ejemplo, un antlgeno polipeptldico), se refiere a una reaccion de union que se basa en y/o demuestra la presencia del antlgeno en una muestra que tambien puede incluir una poblacion heterogenea de otras

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moleculas. Por lo tanto, en las condiciones indicadas, el anticuerpo o los anticuerpos especlfico/s se une/n a uno o mas antlgenos en particular de una muestra y no se une/n, en una cantidad significativa, a otras moleculas presentes en la muestra. La expresion "se une especlficamente a un anticuerpo" o "especlficamente inmunorreactivo con", en el contexto de un epltopo de un antlgeno (por ejemplo, un epltopo de un polipeptido), se refiere a una reaccion de union que se basa en y/o demuestra la presencia del epltopo de un antlgeno (por ejemplo, un polipeptido) que tambien puede incluir una poblacion heterogenea de otros epltopos, as! como una poblacion heterogenea de antlgenos. Por lo tanto, en las condiciones indicadas, el anticuerpo o los anticuerpos especlfico/s se une/n a un determinado epltopo de un antlgeno y no se unen en una cantidad significativa a otros epltopos presentes en el antlgeno y/o en la muestra.

La expresion "en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria" significa que hay una diferencia detectable entre un indicador de respuesta inmunitaria medido antes y despues de la administration de una preparation de antlgeno particular. Los indicadores de respuesta inmunitaria incluyen, pero sin limitation: el tltulo o la especificidad de los anticuerpos, detectados mediante un ensayo, tal como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), un ensayo bactericida, citometrla de flujo, inmunoprecipitacion, inmunodifusion de Ouchter-Lowny; ensayos de detection de union, por ejemplo, de manchas, de transferencia Western o de matrices de antlgenos; ensayos de citotoxicidad, etc.

Un "antlgeno de superficie" es un antlgeno que esta presente en una estructura de la superficie de Neisseria meningitidis (por ejemplo, la membrana externa, la membrana interna, el espacio periplasmatico, capsula, pili, etc.).

"Aislado" se refiere a una entidad de interes que se encuentra en un ambiente diferente de aquel en el que el compuesto se puede encontrar de manera natural. "Aislado" pretende incluir los compuestos que estan en las muestras que estan sustancialmente enriquecidas en el compuesto de interes y/o en las que el compuesto de interes esta parcial o sustancialmente purificado.

"Enriquecido/a" significa que una muestra se ha manipulado de manera artificial (por ejemplo, mediante un experimentador o un cllnico) de modo que un compuesto de interes esta presente a una concentration superior (por ejemplo, al menos tres veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 64 veces mayor, o superior) a la concentracion del compuesto en la muestra de partida, tal como una muestra biologica (por ejemplo, una muestra en la que el compuesto se produce de forma natural o en la que esta presente despues de la administracion), o en la que se creo el compuesto (por ejemplo, como en un polipeptido bacteriano, anticuerpo, polipeptido quimerico, y similares).

La "anulacion" de una gen diana se refiere a una modification de la secuencia del gen que da lugar a una disminucion de la funcion del gen diana, por ejemplo, de manera que la expresion del gen diana sea indetectable o insignificante, y/o el producto genico no sea funcional o significativamente funcional. Por ejemplo, una "anulacion" de un gen implicado en la slntesis de LPS indica que la funcion del gen se ha reducido sustancialmente de modo que la expresion del gen no es detectable o solo esta presente a niveles insignificantes y/o una actividad biologica del producto genico (por ejemplo, una actividad enzimatica) se reduce significativamente con respecto a como era antes de la modificacion o no es detectable. Las "anulaciones" engloban anulaciones condicionales, en las que se puede producir la modificacion del gen diana, por ejemplo, tras la exposition a un conjunto predefinido de condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolaridad, exposicion a la sustancia que potencia la alteration del gen diana, y similares). Una "activation" de un gen diana se refiere a una modificacion genetica del genoma de una celula hospedadora que da lugar a un aumento de una funcion proporcionada por el gen diana.

fHBP Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA fHBP

Antes de describir fHBP quimericas ilustrativas adicionales contempladas por la presente divulgation, es util describir las fHBP de origen natural a partir de las que se pueden derivar las fHBP quimericas.

Por comodidad y con el fin de aclarar, la secuencia de aminoacidos natural de la v.1 de fHBP de la cepa MC58 de N. meningitidis se selecciona arbitrariamente como una secuencia de referencia para todas las secuencias de aminoacidos de v.1, v.2 y v.3 de fHBP natural, as! como para las fHBP quimericas descritas en el presente documento. Se han adoptado dos sistemas de nomenclatura para describir las fHBP: uno, que, por comodidad divide la protelna en tres dominios, designados A, B y C (Giuliani et al., Infect Immun 2005; 73:1151-60), y el otro basado en datos estructurales tridimensionales. En el sistema de nomenclatura alternativo que describe las fHBP basandose en datos estructurales tridimensionales, la fHBP se divide en dos dominios: la fHBPN y la fHbpC. A continuation, se describen los detalles de cada uno de estos dominios con referencia a la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de la cepa MC58.

Dominios A, B y C usando la primera definicion.

Como se ha indicado anteriormente, la nomenclatura basada en tres dominios describe la fHBP como aquella que tiene un "dominio A", un "dominio B" y un "dominio C". En la Fig. 21, se muestra la secuencia de aminoacidos de la v.1 de fHBP de la cepa MC58 junto con los llmites de los dominios A, B y C. Los restos Q101 y G164 indicados por

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las flechas hacia arriba denotan los if mites de los dominios A/B y B/C, respectivamente. Los slmboios "a" indican la posicion de la primera y segunda helice a de la fHBP (denominadas AH1 y AH2). Los restos GEHT estan subrayados seguidos por la segunda helice a (AH2) de fHBP. El Grupo A de la Fig. 34 tambien muestra un diagrama de bandas de la fHBP de longitud completa con los dominios A, B, y C indicados en varios tonos de gris.

La Fig. 3 proporciona un esquema de un modelo estructural truncado de fHBP que tiene los dominios B y C unidos operativamente (el dominio A y una parte de la parte de N-terminal del dominio B no se muestran). La v.1 de fHBP natural de MC58 se volvio a usar como una secuencia de referencia para numerar los restos. Se observan los restos de aminoacidos identificados por mutagenesis dirigida de fHBP que contribuyen a la union de los nueve mAb anti- fHBP (denominados mAb "Jar"). Para construir el modelo, se usaron coordinados de la estructura en solucion de los dominios B y C de fHBP de la cepa MC58. Se ilustra la helice a del dominio B, al igual que los bucles y las cadenas b del dominio C.

Dominios estructurales tridimensionales/fHbpN y fHbpC

En un sistema de nomenclatura alternativa, fHBP se describe con dos dominios estructurales en comparacion con los tres dominios descritos anteriormente. El sistema de nomenclatura de dos dominios se basa en informacion estructural de una de fHBP de longitud completa a partir de la cual se pueden construir modelos tridimensionales tales como los que se muestran en la Fig. 34. La modelizacion estructural revela que fHBP de longitud completa se encuentra en solucion como dos dominios separados conectados por un enlazador. En la Fig. 21, se muestra la secuencia de aminoacidos de la v.1 de fHBP de la cepa MC58 con el extremo del dominio fHbpN indicado con una flecha en glicina 136. El dominio N-terminal se denomina fHbpN (restos 8-136) y el dominio C-terminal se denomina fHbpC (restos 141-255), comprendiendo cada uno al menos 8 cadenas P antiparalelas y unido por un enlazador natural (restos 137-140). Como se observa en la Fig. 21, el enlazador tambien comprende helice a AH2, pues "a" debajo de la secuencia en la Fig. 21 marca las posiciones de las helices a que residen en fHBP. Con el fin de simplificar, en el presente documento, se considera que el dominio fHbpC incluye el enlazador que conecta los dominios N-terminal y C-terminal basados en la convencion de dicha nomenclatura.

La fHBP se ha dividido en tres grupos de variantes (denominadas variante 1 (v.1), variante 2 (v.2) y variante 3 (v.3)), basandose en la variabilidad y la reactividad inmunologica cruzada de las secuencias de aminoacidos (Masignani et al., 2003, J Exp Med 197:789-99). En ciertos estudios, fHBP tambien se ha subdividido en dos subfamilias designadas subfamilia A (que incluye la v.2 y la v.3 de Masignani et al., 2003, J Exp Med 197:789-99) y la subfamilia B (v.1) (Fletcher et al., 2004, Infect Immun. 72: 2088-100). "Variante" como se usa en el contexto de una "variante de fHBP" se refiere a una fHBP que comparte al menos un 89 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la cepa prototipo de ese grupo de variantes (cepa MC58 para v.1; cepa 2996 para v.2; y cepa M1239 para v.3). Estas eran las secuencias prototipo originales descritas por Masignani et al., J. Exp. Med., 2003. Las cepas de un grupo de variantes codifican fHBP con identidad de aminoacidos superior al 88 %, mientras que las cepas de diferentes grupos de variantes de fHBP son del aproximadamente 60 al 88 % identicas. Las fHBP del mismo grupo de "variantes" poseen mas del 88 % de identidad con la respectiva secuencia prototipo (v.1, cepa MC58, v.2, cepa 2996; v.3, cepa M1239). Una "subvariante" como se usa en el contexto de una "subvariante de fHBP" se refiere a polipeptidos fHBP que difieren de la secuencia prototipo. Por ejemplo, la cepa NZ98/254 se conoce como una subvariante de v.1 de fHBP, con un 91 % de identidad con la secuencia prototipo de la cepa MC58; la cepa RM1090 se conoce como una subvariante de v.2 de fHBP, con una secuencia que es un 94 % identica a la cepa prototipo v.2 2996. Los ejemplos de subvariantes, y sus identidades de secuencias de aminoacidos relativas, se proporcionan en las Figuras 8a y 8B.

Los polipeptidos fHBP, y acidos nucleicos codificantes, de la que partes de las fHBP quimericas de la presente divulgacion pueden derivarse pueden ser de cualquier cepa de N. meningitidis adecuada. Como es conocido en la tecnica, las cepas de N. meningitidis se dividen en grupos serologicos (grupos capsulares), serotipos (fenotipos PorB) y subtipos (fenotipos PorA) basandose en las reacciones con anticuerpos policlonales (Frasch, C. E. y Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127:149-154) o monoclonales que interaction con diferentes antlgenos de superficie. La agrupacion capsular tradicionalmente se ha basado en las variaciones inmunologicamente detectables del polisacarido capsular, pero se estan reemplazando por PCR de genes que codifican enzimas especlficas responsables de la bioslntesis de los polisacaridos capsulares estructuralmente diferentes. Se conocen aproximadamente 12 grupos capsulares (incluyendo A, B, C, X, Y, Z, 29-E y W-135). Las cepas de los grupos capsulares A, B, C, Y y W-135 representan casi toda la enfermedad meningococica. Tradicionalmente, la serotipificacion se ha basado en las diferencias antigenicas definidas por los anticuerpos monoclonales en una protelna de membrana externa denominada Porina B (PorB). Actualmente, se conocen anticuerpos que definen aproximadamente 21 serotipos (Sacchi et al., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348). La subserotipificacion se ha basado en variaciones antigenicas definidas por anticuerpos en una protelna de membrana externa denominada Porina A (PorA). Tanto la serotipificacion como la subserotipificacion se estan reemplazando por la PCR y/o la secuenciacion del DNA para la identificacion de genes que codifican las regiones variables de PorB y PorA, respectivamente que estan asociadas con reactividad de los mAb (por ejemplo, Sacchi, Lemos et al., supra; Urwin et al., 1998, Epidem. and Infect. 120: 257).

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N. meningitidis tambien se puede dividir en grupos o subgrupos clonales, usando diversas tecnicas que caracterizan directa o indirectamente el genoma bacteriano. Estas tecnicas incluyen la electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), basada en la variacion de la movilidad electroforetica de una enzima, que refleja los polimorfismos subyacentes a un determinado locus genetico. Mediante la caracterizacion de las variantes de una serie de dichas protelnas, se puede deducir la "distancia" genetica entre dos cepas a partir de la proporcion de desapareamientos. De igual manera, se puede deducir la clonalidad entre dos aislamientos si los dos tienen patrones identicos de variantes electroforeticas en el numero de loci. En la literatura mas reciente, la tipificacion de secuencias multilocus (MLST) ha reemplazado a la MLEE como metodo de eleccion para la caracterizacion de microorganismos. Usando la MLST, se deduce la distancia genetica entre dos aislados, o la clonalidad, a partir de la proporcion de desapareamientos de las secuencias de ADN de siete genes constitutivos de cepas de Neisseria meningitidis (Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 3140).

Si bien se pueden usar cepas de N. meningitidis de cualquier grupo capsular, las cepas de N. meningitidis del grupo capsular B son de particular interes como fuentes a partir de las que se deriva el acido nucleico que codifica la fHBP y sus dominios.

Aunque la memoria descriptiva proporciona la secuencia de aminoacidos de las fHBP ilustrativas de las que el se puede derivar la fHBP quimerica, esto no pretende ser limitante. Por ejemplo, la fHBP quimerica puede contener secuencias de aminoacidos que sean al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identicas a una secuencia de aminoacidos de una fHBP natural.

Los acidos nucleicos que codifican polipeptidos fHBP para su uso en la construction de las fHBP quimericas contempladas en el presente documento son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en el documento WO 2004/048404; Masignani et al. 2003 J Exp Med 197:789-799; Fletcher et al. Infect Immun 2004 2088-2100; Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615; y el documento WO 99/57280, se describen polipeptidos fHBP ilustrativos. El acido nucleico (y secuencias de aminoacidos) para las variantes y subvariantes fHBP tambien se proporcionan en el GenBank como n.° de acceso: NC_003112, GenelD: 904318 (NCBI Ref. NP_274866) (de la cepa de N. meningitidis MC58); AY548371 (AAT01290.1) (la cepa de N. meningitidis CU385); AY548370 (AAT01289.1) (la cepa de N. meningitidis H44/76); AY548377 (AAS56920.1) (la cepa de N. meningitidis M4105); AY548376 (AAS56919.1) (la cepa de N. meningitidis M1390); AY548375 (AAS56918.1) (la cepa de N. meningitidis N98/254); AY548374 (AAS56917.1) (la cepa de N. meningitidis M6190); AY548373 (AAS56916.1) (la cepa de N. meningitidis 4243); y AY548372 (AAS56915.1) (la cepa de N. meningitidis BZ83).

Para identificar las secuencias de aminoacidos correspondientes contempladas para su uso en las fHBP quimericas desveladas en el presente documento, cabe senalar que la protelna fHBP inmadura incluye una secuencia llder de aproximadamente 19 restos. Ademas, cuando se proporciona una secuencia de aminoacidos, el experto habitual en la materia puede imaginar facilmente las secuencias de acido nucleico que pueden codificar, y proporcionar la expresion de, un polipeptido que tenga dicha secuencia de aminoacidos.

Ademas de las secuencias de aminoacidos y las secuencias de acido nucleico especlficas proporcionadas en el presente documento, la divulgation tambien contempla polipeptidos y acidos nucleicos que tienen secuencias que son al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identicas en secuencia a dicho aminoacido y acidos nucleicos ilustrativos. Los terminos "identicas" o “porcentaje de identidad” en el contexto de dos o mas secuencias de polinucleotidos, o dos o mas secuencias de aminoacidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identicas en una region especificada), cuando se comparan y se alinean para una correspondencia maxima en una region designada, por ejemplo, un dominio B o una parte del mismo, por ejemplo, una region de al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mas aminoacidos o nucleotidos de longitud, y pueden ser de hasta la longitud completa de la secuencia de aminoacidos o nucleotidos de referencia (por ejemplo, una fHBP de longitud completa). La divulgacion contempla especlficamente tanto polimorfismos de origen natural como secuencias de aminoacidos producidas sinteticamente y sus acidos nucleicos codificantes.

Para la comparacion de secuencias, normalmente una secuencia actua como secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de polipeptido fHBP natural), con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un programa informatico, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parametros del programa de algoritmo de secuencias. A continuation, el algoritmo de comparacion de secuencias calcula el porcentaje de identidad entre las secuencias para la/s secuencia/s de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa designados.

Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El programa informatico para realizar el analisis BLAST se encuentra a disposition del publico en el Centro Nacional de Information Biotecnologica (
www.ncbi.nlm.nih.gov). Otros algoritmos ilustrativos incluyen ClustalW (Higgins D., et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680),

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disponible en
www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html.

En una realizacion, las posiciones de restos que no son identicas difieren en sustituciones de aminoacidos conservativas. Las sustituciones de aminoacidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas es el de glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas-hidroxilo es el de serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas es el de fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas es el de lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es el de cistelna y metionina.

La identidad de secuencia entre dos acidos nucleicos tambien se puede describir en terminos de hibridacion de dos moleculas entre si en condiciones rigurosas. Las condiciones de hibridacion se seleccionan siguiendo los metodos convencionales en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edicion, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Un ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion a 50 °C o temperatura superior y 0,1 x SSC (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es la incubacion durante la noche a 42 °C en una solucion de: formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmon cortado, desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 °C. Las condiciones de hibridacion rigurosas son condiciones de hibridacion que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, considerandose que las condiciones son al menos tan rigurosas si son al menos un 80 % tan rigurosas, por lo general, al menos un 90 % tan rigurosas como las condiciones rigurosas especlficas anteriores.

A continuacion, se describe la fHBP quimerica de la presente divulgacion mas detalladamente en el contexto tanto de la nomenclatura en la que la protelna se divide en tres dominios, usada por Giuliani et al. (Infect Immun 2005; 73: 1151-60) como de la nomenclatura estructural tridimensional.

Dominio A de las fHBP

Como se ha indicado anteriormente, para facilitar el analisis, la fHBP se puede describir como aquella que tiene los tres dominios siguientes: dominio A, dominio B y dominio C. Como se muestra en la Fig. 21, las flechas hacia arriba de Q101 y G164 demarcan los llmites entre los dominios A/B y los dominios B/C, respectivamente. Las fHBP quimericas de la presente divulgacion incluyen opcionalmente un dominio A. Por conveniencia y claridad, el dominio A se puede definir estructuralmente como aquellos restos correspondientes a los restos 1-100 de v.1 de fHBP de MC58, donde la numeracion se basa en la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de MC58 que carece de la secuencia senal (Masignani et al., 2003, J Exp Med 197:789-99) (vease la Figura 21). Como se ilustra en la alineacion de v.1 de fHBP de MC58 y v.2 de fHBP de 8047, las respectivas secuencias de aminoacidos de los dominios A de las fHBP normalmente comparten una identidad de las secuencias de aminoacidos significativa (vease la Fig. 8B). Las fHBP quimericas que contienen un dominio A pueden contener una secuencia de aminoacidos del dominio A contigua que sea al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos de un dominio A de una fHBP natural. El dominio A puede derivarse del mismo grupo de variantes (y se puede derivar de la misma fHBP) que la parte N-terminal del dominio B, de modo que la secuencia de aminoacidos de la union A/B sea una que se pueda encontrar en naturaleza. Como alternativa, la secuencia de aminoacidos del dominio A se puede derivar de un grupo de variantes de fHBP diferente del grupo de variantes de fHBP del que se deriva la secuencia de aminoacidos N-terminal del dominio B (por ejemplo, el dominio A se puede derivar de una v.2 de fHBP y la secuencia de aminoacidos N-terminal del dominio B derivarse de una v.1 de fHBP).

Dominio B de v.1 de fHBP

Como se ha indicado anteriormente, las fHBP quimericas de la presente divulgacion contienen la secuencia de aminoacidos de un dominio B de v.1 de fHBP. Las secuencias de aminoacidos de v.1 de fHBP, que incluyen los dominios B de v.1 de fHBP, son bien conocidos en la tecnica, y se pueden usar para derivar la secuencia de aminoacidos deseada de una fHBP desvelada en el presente documento. La Fig. 13 proporciona las secuencias de aminoacidos de una parte N-terminal del dominio B de las v.1 de fHBP seleccionadas. La alineacion ilustra la posicion y la identidad polimorfismos naturales entre las v.1 de fHBP. La Figura 8A ilustra la identidad de las secuencias de aminoacidos entre las fHBP de longitud completa de las cepas de v.1, v.2 y v.3 ilustrativas y, ademas, ilustra la presencia o ausencia de epltopos definidos por los mAb JAR indicados. La Figura 8B ilustra la identidad de las secuencias de aminoacidos entre los dominios A, B y C de las v.1, v.2 y v.3 de fHBP ilustrativas, as! como la identidad de las secuencias de aminoacidos en las partes N-terminal (101-135) y C-terminal (136-164) de los dominios B.

La Fig. 21 muestra la secuencia de aminoacidos de la v.1 de fHBP de la cepa MC58, e ilustra la posicion de un dominio B de longitud completa (definido por los restos 101-164 y que abarca la secuencia de aminoacidos de GEHT seguida por la helice a AH2). La Fig. 22, Grupo A, ilustra que una parte N-terminal del dominio B de la v.1 de fHBP

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de la cepa MC58 puede abarcar una secuencia de aminoacidos definida por los restos correspondientes a los restos N-terminales de los restos de GEHT y que se extienden hasta el extremo N del dominio B en un resto correspondiente al resto 101. La parte C-terminal del dominio B de la v.1 de fHBP de la cepa MC58 puede abarcar una secuencia de aminoacidos definida por los restos correspondientes a una secuencia de aminoacidos que se extiende N-terminalmente desde el resto 164 del dominio B, y que abarca hasta e incluyendo la secuencia de aminoacidos de GEHT. Por lo tanto, un dominio B de longitud completa esta estructuralmente definido por los restos correspondientes a los restos 101-164 de la v.1 de fHBP de MC58, donde los restos 101-135 pueden definir una parte N-terminal ilustrativa del dominio B y los restos 136-164 pueden definir una parte C-terminal ilustrativa del dominio B, donde la numeracion se basa en la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de MC58, que carece de la secuencia senal (Masignani et al, 2003 J Exp Med 197:789-99).

Como se describira a continuacion con mas detalle, cabe destacar que, en el contexto de las fHBP quimericas de la presente divulgacion que tienen un dominio B heterologo, el extremo C de la parte N-terminal del dominio B (y, por lo tanto, el extremo N de la parte C-terminal del dominio B heterologo) esta definido por la posicion del punto de union, que puede estar presente N-terminal o C-extremo Con respecto a la secuencia de aminoacidos de GEHT, como se trata mas adelante con mayor detalle. Por ejemplo, el punto de union de un dominio B heterologo de una fHBP quimerica se puede situar C-extremo Con respecto una secuencia correspondiente a la GEHT, y por lo tanto, se puede extender mas alla de un resto correspondiente al resto 135.

Las fHBP quimericas ilustrativas incluyen aquellas que comprenden un dominio B que tiene una secuencia de aminoacidos contigua que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos del dominio B N-terminal de una v.1 de fHBP, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de la secuencia de aminoacidos del dominio B N-terminal ilustrada en la Fig. 13. La fHBP quimerica ilustrativa que tiene un dominio B heterologo contiene al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50 restos (y en algunas realizaciones, no mas de 50 restos) de una secuencia de aminoacidos N-extremo Contigua de un dominio B de una v.1 de fHBP.

Dominios B y C de la v.2 de fHBP y de la v.3 de fHBP

Las fHBP quimericas ilustrativas de la presente divulgacion contienen un dominio B heterologo que contiene una secuencia de aminoacidos N-terminal derivada de un parte N-terminal de un dominio B de la v.1 de fHBP y el resto de parte C-terminal derivada de la correspondiente parte C-terminal de un dominio B de la v.2 (o v.3) de fHBP, seguida de la secuencia de aminoacidos contigua de un dominio C de v.2 (o v.3). Por conveniencia y claridad, el dominio C se puede definir estructuralmente como aquellos restos correspondientes a los restos 165-255 de v.1 de fHBP de MC58, estando la numeracion basada en la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de MC58, que carece de la secuencia senal (Masignani et al., 2003, J Exp Med, 197:789-99) (vease la Figura 21).

Las secuencias de aminoacidos de la v.2 y la v.3 de fHBP, incluyendo los dominios B y C de v.2 y v.3 de fHBP, son bien conocidos en la tecnica y se pueden usar para derivar la secuencia de aminoacidos deseada de una fHBP quimerica desvelada en el presente documento. La Fig. 14 proporciona las secuencias de aminoacidos de una parte C-terminal del dominio B (segun lo ilustrado por los 25 aminoacidos C-terminales del dominio B de la v.2 de fHBP) y los dominios C de longitud completa de las v.2 de fHBP seleccionadas. La alineacion ilustra la posicion y la identidad de los polimorfismos naturales entre las v.2 de fHBP.

Las fHBP quimericas ilustrativas incluyen las que comprenden un dominio B que contiene una secuencia de aminoacidos C-terminal derivada de un dominio B de v.2 o v.3, que normalmente tiene una secuencia de aminoacidos contigua que es al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % o mas identica a una secuencia de aminoacidos del dominio B C-terminal de una v.2 o v.3 de fHBP, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de la secuencia de aminoacidos del dominio B C-terminal, tal como las secuencias de v.2 ilustradas en la Fig. 14. Cuando la fHBP quimerica contiene un dominio C heterologo, el dominio B puede ser al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identico a una secuencia de aminoacidos contigua de una secuencia de aminoacidos del domino B de longitud completa de una v.1 de fHBP. Un dominio B de longitud completa de una v.1 de fHBP es generalmente de aproximadamente 64 restos de longitud.

Dominio fHbpN de las fHBP

Como se ha tratado previamente, la fHBP tambien se puede describir como aquella que tiene dos dominios estructurales: fHbpN y fHbpC, basados en la nomenclatura alternativa que se deriva de la estructura de la fHBP de longitud completa. Como se muestra en la Fig. 21 y en el grupo B de la Figura 32, la glicina 136 marca aproximadamente el comienzo de un enlazador entre los dominios N-terminal y C-terminal, denominados fHbpN y fHbpC, respectivamente. La fHBP quimerica de la presente divulgacion puede incluir un dominio fHbpN de longitud completa o un dominio fHbpN parcial. Por conveniencia y claridad, el dominio fHbpN se puede definir estructuralmente como aquellos restos correspondientes a los restos 1-136 de v.1 de fHBP de MC58, estando la numeracion basada en la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de MC58 que carece de la secuencia senal

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(Masignani et al., 2003 J Exp Med, 197:789-99) (vease la Figura 21). Como se ilustra en la alineacion de v.1 de fHBP de MC58 y v.2 de fHBP de 8047, las respectivas secuencias de aminoacidos de los 100 primeros restos del dominio fHbpN normalmente comparten una identidad de secuencia de aminoacidos significativa (Fig. 8B). La fHBP quimerica que contiene un dominio fHbpN puede contener una secuencia contigua de aminoacidos del dominio fHbpN que sea al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos de un dominio fHbpN de una fHBP de origen natural.

Como alternativa, la fHBP quimerica puede incluir un dominio fHbpN parcial, de modo que una parte N-terminal de la fHBPN esta truncada. El dominio fHbpN parcial puede comprender al menos 30, 40 o 50 de una secuencia de aminoacidos contigua C-terminal del dominio fHbpN de longitud completa.

Las fHBP quimericas ilustrativas incluyen aquellas que comprenden un dominio fHbpN completo o parcial que tiene una secuencia de aminoacidos contigua que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a al menos una parte C-terminal de la secuencia de aminoacidos de fHbpN de una v.1 de fHBP, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de la secuencia de aminoacidos de fHbpN C-terminal ilustrada en la Fig. 13. Una fHBP quimerica ilustrativa que tiene dominios heterologos contiene al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50 restos (y, en algunas realizaciones, no mas de 50 restos) de una secuencia de aminoacidos C-extremo Contigua de un dominio fHbpN de una v.1 de fHBP.

El dominio fHbpN total o parcial se puede derivar del mismo grupo de variantes (y puede se puede derivar de la misma fHBP) como ciertas partes del dominio fHbpC. Como alternativa, la secuencia de aminoacidos de fHbpN se puede derivar de un grupo de variantes de fHBP diferente del grupo de variantes de fHBP del que se deriva la secuencia de aminoacidos N-terminal del dominio fHbpC (por ejemplo, el dominio fHbpC se puede derivar de una v.2 de fHBP y la secuencia de aminoacidos C-terminal del dominio fHbpN derivarse de una v.1 de fHBP).

Como se ha indicado anteriormente, las fHBP quimericas de la presente divulgacion contienen la secuencia de aminoacidos de un dominio fHbpN de v.1. Las secuencias de aminoacidos de v.1 de fHBP, incluyendo los dominios fHbpN de v.1, son bien conocidas en la tecnica, y se pueden usar para derivar la secuencia de aminoacidos deseada de una fHBP quimerica desvelada en el presente documento. La Fig. 13 proporciona las secuencias de aminoacidos C-terminales del dominio fHbpN de las v.1 de fHBP seleccionadas. La alineacion ilustra la posicion y la identidad de los polimorfismos naturales entre las v.1 de fHBP. La Figura 8A ilustra la identidad entre las secuencias de aminoacidos de las fHBP de longitud completa de las cepas v.1, v.2 y v.3 ilustrativas y, ademas, ilustra la presencia o la ausencia de epltopos definidos por los mAb JAR indicados. La Figura 8B ilustra la identidad entre las secuencias de aminoacidos de las v.1, v.2 y v.3 de fHBP ilustrativas, as! como la identidad entre las secuencias de aminoacidos dentro de la parte C-terminal de fHbpN (101-135) y la parte N-terminal (136-164) de los dominios fHbpC.

Union entre dominios heterologos de una fHBP quimerica

Como se describira a continuacion mas detalladamente, cabe senalar que, en el contexto de las fHBP quimericas de la presente divulgacion que tienen dominios heterologos, la posicion del punto de union entre los dominios heterologos puede estar presente dentro de o proxima al enlazador que conecta los dominios fHbpN y fHbpC. La glicina 136 define el llmite entre fHbpN y fHbpC, y tambien marca el comienzo de la secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora corresponde aproximadamente a los restos 136 a 149, e incluye la helice a AH2. Por ejemplo, el punto de union entre los dominios heterologos de una fHBP quimerica puede estar situado C-extremo Con respecto a una secuencia correspondiente a la secuencia de GEHT subrayada en la Fig. 21. En algunas realizaciones, la union puede ser de no mas de 20, no mas de 15, no mas de 5 o de menos restos de aminoacidos de distancia de la secuencia de aminoacidos de GEHT o la secuencia enlazadora. En otras realizaciones en las que los dominios heterologos estan presentes en el dominio fHbpC, la union entre los dominios heterologos se puede situar C-extremo Con respecto a la glicina 164. La glicina 164 tambien se indica con una flecha en la Fig. 21.

Dominio fHbpC de la v.2 de fHBP y de v.3 de fHBP

Las fHBP quimericas ilustrativas de la presente divulgacion contienen dominios heterologos que comprenden un dominio fHbpN total o parcial de un dominio fHbpN de v.1 de fHBP y un dominio fHbpC derivado de una v.2 (o v.3) de fHBP. Por conveniencia y claridad, el dominio fHbpC se puede definir estructuralmente como aquellos restos correspondientes a los restos 141-255 de v.1 de fHBP de MC58, estando la numeration basada en la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de MC58 que carece de la secuencia senal (Masignani et al., 2003, J Exp Med 197:789-99) (Fig. 21).

Las secuencias de aminoacidos de la v.2 y la v.3 de fHBP, incluyendo los dominios fHbpN y fHbpC de v.2 y v.3 de fHBP, son bien conocidas en la tecnica, y se pueden usar para derivar la secuencia de aminoacidos deseada de una fHBP quimerica desvelada en el presente documento. La Fig. 14 proporciona las secuencias de aminoacidos de los dominios fHbpC de longitud completa de las v.2 de fHBP seleccionadas. La alineacion ilustra la posicion y la identidad de los polimorfismos naturales entre las v.2 de fHBP. Las fHBP quimericas ilustrativas incluyen las que

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comprenden una secuencia de aminoacidos de fHbpC derivada de un dominio fHbpC de v.2 o v.3, que normalmente tiene una secuencia de aminoacidos contigua que es al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % o mas identica a la secuencia de aminoacidos del dominio fHbpC de una v.2 o v.3 de fHBP, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de la secuencia de aminoacidos del dominio fHbpC, tal como las secuencias de v.2 ilustradas en la Fig. 14.

En ciertos casos, en lugar de tener la secuencia de aminoacidos de fHbpN derivada de una variante y la de fHbpC derivada de una variante diferente, el dominio fHbpC puede contener dos secuencias de aminoacidos contiguas derivadas de diferentes variantes. En los casos en que fHbpC contiene secuencias heterologas, una secuencia de aminoacidos N-extremo Contigua de fHbpC puede ser al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de la correspondiente secuencia de aminoacidos de una v.1 de fHBP.

PROTEINAS QUIMERICAS DE UNION AL FACTOR H

Como se ha explicado anteriormente, la fHBP se puede describir en el contexto de los tres dominios asignados por Giuliani et al., (Infect Immun 2005; 73:1151-60) o en el contexto de dos dominios estructurales tridimensionales. En aras de la brevedad, la divulgacion adoptara la nomenclatura de los tres dominios, designados dominios A, B, y C. Sin embargo, toda la descripcion en el contexto de los tres dominios funcionales se puede entender facilmente en el contexto de los dos dominios estructurales basandose en lo que se ha detallado anteriormente.

De acuerdo con lo establecido anteriormente, las fHBP quimericas de la presente divulgacion normalmente incluyen bien un dominio B heterologo y un dominio C; o un dominio B y un dominio C heterologo. Dichas fHBP quimericas se construyen de manera que contengan epltopos que generen anticuerpos bactericidas eficaces contra cepas de N. meningitidis productoras de mas de una variante de fHBP.

La expresion "protelna quimerica de union al factor H" o "fHBP quimerica" se refiere a un polipeptido que comprende, del extremo N al extremo C, una secuencia de aminoacidos de un dominio B y de un dominio C, en la que al menos uno entre el dominio B y el dominio C contiene una secuencia de aminoacidos heterologa caracterizada por tener una parte N-terminal derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de una v.1 de fHBP con el B restante y la parte C-terminal (o parte del extremo C) derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP. Las secuencias de aminoacidos del dominio B y/o del dominio C normalmente se derivan de una secuencia de aminoacidos contigua de una fHBP de origen natural y las mutantes de la misma que mantienen o introducen los epltopos deseados. La fHBP quimerica puede incluir opcionalmente una secuencia de aminoacidos de un dominio de A de fHBP unido operativamente y N-terminal al dominio B. La fHBP quimerica puede incluir ademas opcionalmente una secuencia llder, por ejemplo, para proporcionar la expresion de la fHBP quimerica en una superficie celular de una celula hospedadora bacteriana.

Cuando la fHBP quimerica contiene un dominio B heterologo, en general, el dominio B heterologo comprende al menos una parte N-terminal derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio B de v.1 de fHBP y una parte C-terminal derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio B de v.2 o v.3, estando el dominio B heterologo unido operativamente a un dominio C derivado de una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio C de v.2 o v.3 de fHBP. As! pues, por ejemplo, dicha fHBP quimerica se puede describir como aquella que tiene un dominio B heterologo compuesto de una parte N-terminal para la que una secuencia de aminoacidos contigua correspondiente de una secuencia del dominio B de v.1 de fHBP sirve como armazon, y una parte C- terminal para la que una secuencia de aminoacidos contigua correspondiente de una secuencia del domino B de v.2 o v.3 de fHBP B sirve como armazon.

Como se ha indicado anteriormente, la fHBP quimerica ilustrativa que tiene un dominio B heterologo contiene al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50 restos (y, en algunas realizaciones, no mas de 50 restos) de una secuencia de aminoacidos N-extremo Contigua de un dominio B de una v.1 de fHBP.

Cuando la fHBP quimerica contiene un dominio C heterologo, el dominio B de la fHBP quimerica comprende una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio B de v.1 de fHBP unido operativamente al dominio C heterologo que comprende al menos una parte N-terminal del domino C de una v.1 de fHBP y una parte C-terminal de un dominio C de v.2 o v.3. La fHBP quimerica ilustrativa de dicha realization contiene 2, 4, 6, 8 restos de una secuencia N-terminal de un dominio C de v.1, estando el resto del dominio C derivado de una secuencia de aminoacidos del dominio C de v.2 o v.3.

La fHBP quimerica contemplada por la presente divulgacion incluye aquellas que tienen una secuencia de aminoacidos correspondiente a un dominio B de longitud completa y un dominio C de longitud completa, y, opcionalmente, un dominio A de longitud completa, en la que la fHBP quimerica incluye al menos un dominio B heterologo o un dominio C heterologo. Otras realizaciones incluyen fHBP quimericas que tienen una secuencia de aminoacidos correspondiente a un fragmento de un dominio A compuesto de una secuencia de aminoacidos contigua que abarca aminoacidos que definen un epltopo unido por el mAb JAR 4. Otras realizaciones incluyen fHBP quimericas en las que el dominio C esta truncado en el extremo C, con la condition de que los epltopos de

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interes (por ejemplo, uno o mas de los epltopos unidos por los mAb JAR 10, JAR 11, JAR 33, JAR 32/35 y JAR 13) se conservan con el fin de mantener la capacidad de generar anticuerpos que se unan estos epltopos. La fHBP quimerica tambien incluye aquellas que carecen de un dominio A, y tienen un dominio B truncado N-terminalmente, con la condicion de que el dominio B truncado mantiene la expresion de uno o mas epltopos de interes. Las fHBP quimericas incluyen aquellas que tienen un dominio B que expresa un epltopo unido por el mAb JAR 5.

Los polipeptidos quimericos descritos en el presente documento pueden incluir secuencias de aminoacidos heterologas adicionales, por ejemplo, para proporcionar una metionina N-terminal o un derivado de la misma (por ejemplo, piroglutamato) como resultado de la expresion en una celula hospedadora bacteriana (por ejemplo, E. coli) y/o para proporcionar un polipeptido quimerico que tenga una pareja de fusion en su extremo N o su extremo C. Las parejas de fusion de interes incluyen, por ejemplo, glutation-S-transferasa (GST), protelna de union a la maltosa (MBP), marcador His6, y similares, as! como peptidos llder de otras protelnas, en particular, lipoprotelnas. Las parejas de fusion pueden proporcionar caracterlsticas adicionales tales como facilitar el aislamiento y la purification del polipeptido quimerico.

Habitualmente, la fHBP natural contiene una cistelna N-terminal a la que se puede unir covalentemente una fraction lipldica. Este resto de cistelna normalmente esta lipidado en la protelna natural, y se puede lipidar en las fHBP quimericas desveladas en el presente documento. As! pues, en la secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento (incluyendo aquellas presentadas en el listado de secuencias), la referencia a "cistelna" o "C" en esta position incluye especlficamente la referencia tanto a una cistelna no modificada, como a una cistelna que esta lipidada (por ejemplo, debido a la modification posterior a la traduction). Por lo tanto, la fHBP quimerica puede estar lipidada o no lipidada. Los metodos de production de protelnas lipidadas in vitro, (vease, por ejemplo, Andersson et al., 2001 J. Immunol. Methods 255(1-2): 135-48) o in vivo son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, ya se ha purificado previamente fHBP lipidada de la fraccion de membrana de la protelna de E. coli por extraction con detergente (Fletcher et al, 2004 Infection and Immunity 72(4):2088-100), metodo que se pueden adaptar a la produccion de fHBP quimerica lipidada. Las protelnas lipidadas pueden ser de interes, ya que pueden ser mas inmunogenicas que la protelna soluble (vease, por ejemplo, Fletcher et al, 2004 Infection and Immunity 72 (4): 2088100).

A continuation, se describen las fHBP quimericas ilustrativas en detalle. fHBP quimericas ilustrativas

Las fHBP quimericas de la presente divulgation engloban aquellas que se pueden describir en terminos de uno o mas de entre, por ejemplo, el sitio en el que las secuencias heterologas se unen dentro de la fHBP quimerica (es decir, el "punto de union"), la presencia de epltopos unidos especlficamente por un mAb, la secuencia de aminoacidos o cualquier combination de dichas caracterlsticas que pueden estar presentes en las fHBP ilustrativas.

Punto de union de la fHBP quimerica

En general, el punto de union de la fHBP quimerica es el punto en el que la secuencia de aminoacidos de la fHBP quimerica cambia de estar derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de una v.1 de fHBP a estar derivada de la secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP. Por lo tanto, el punto de union proporciona una secuencia de aminoacidos que es heterologa, es decir, que deriva de diferentes fHBP. La parte N-terminal y las partes C-terminales de un dominio heterologo (es decir, dominio B heterologo o dominio C heterologo) de la fHBP quimerica se unen en un punto de union, punto de union que define, por tanto, la longitud de las partes N-terminal y C-terminal del dominio quimerico que derivan de una secuencia de aminoacidos de v.1 o de v.2/v.3.

En general, una secuencia de aminoacidos del dominio B que comprende una secuencia de aminoacidos N-extremo Con respecto a la segunda helice a de fHBP, que incluye restos correspondientes a los implicados en la definition del epltopo del mAb JAR 5 (es decir, restos en las posiciones 121 y 122 de un dominio B de v.1 de fHBP de MC58, que son glicina y lisina, respectivamente), se denota como la "parte N-terminal del dominio B" (vease, por ejemplo, Fig. 13, Fig. 21 y Fig. 22, grupo A ). La secuencia de aminoacidos que flanquea y es C-extremo Con respecto a la parte N-terminal del dominio B es la "parte C-terminal (o distal) del dominio B" y se deriva de una secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP (Fig. 14 y Fig. 22). En conjunto, las partes N-terminal y C-terminal del dominio B componen un dominio B heterologo de una fHBP quimerica de la presente divulgacion.

Cuando la fHBP quimerica tiene un dominio B heterologo, el punto de union puede estar situado en un resto adyacente a la segunda helice a (AH2) (por ejemplo, adyacente y C-terminal a un resto correspondiente al resto 121 o 122 de la figura 21, por ejemplo, adyacente y C-terminal a uno de los restos de GEHTSFDK, por ejemplo, adyacente y C-terminal a uno de los restos de GEHT, N-terminal a AH2) o en una posicion C-extremo Con respecto a AH2.

En una realization, el punto de union del dominio B heterologo puede estar situado en cualquier sitio que corresponda a un sitio posterior al resto de glicina o posterior al resto de lisina, que defina un epltopo de anticuerpo monoclonal (mAb) JAR 5 de una v. 1 de fHBP (resto que esta situado en el dominio B, es decir, en G121 o K122 de

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la secuencia de referenda de v.1 de fHBP de la cepa MC58 ) pero antes de un resto correspondiente a un resto que defina un epitopo del mAb JAR 11 de una v.2 de fHBP (resto que esta situado en el dominio C, es decir, A174 de la secuencia de referencia de v.2 de fHBP de la cepa 8047). En una realizacion relacionada, el dominio B heterologo se proporciona de modo que el epitopo del mAb JAR 5, el epitopo de JAR 11, o ambos epitopos de JAR 5 y JAR 11, se mantienen de modo que la fHBP quimerica es unida especificamente por el respectivo mAb.

En una realizacion, el punto de union esta situado de modo que la fHBP quimerica contiene un dominio B heterologo, que tiene una parte N-terminal compuesta de una secuencia de aminoacidos contigua de una parte N- terminal de un dominio B de una v.1 de fHBP que contiene un epitopo de JAR 5 (definido en parte por G121 de la v.1 de fHBP de la cepa MC58) con la parte restante (es decir, la parte C-terminal) del dominio B derivada de una secuencia de aminoacidos contigua de la parte C-terminal correspondiente del dominio B de una v.2 o v.3 de fHBP. El dominio B heterologo esta unido operativamente a un dominio C derivado de una secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP, que puede la misma o diferente v.2 o v.3 de fHBP que de la que se deriva la parte C-terminal del dominio B.

Los ejemplos de dominios B heterologos incluyen aquellos que son al menos un 80 % identicos, al menos un 85 % identicos, al menos un 90 % identicos, al menos un 99 % identicos o mas a una secuencia de aminoacidos contigua de una v.1 de fHBP correspondiente a los restos 101-121 , 101-122, 101-123, 101-124, 101-125, 101-126, 101-127, 101-128, 101-129, 101-130, 101-131, 101-132, 101-133, 101-134, 101-134, 101-136, 101-137, 101-138 o 101-139 de una secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP, estando la numeracion basada en la fHBP de MC58 como referencia. Dichos dominios B heterologos incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoacidos que es al menos un 80 % identica, al menos un 85 % identica, al menos un 90 % identica, al menos un 99 % identicos o mas a una secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP para proporcionar el dominio B heterologo restante que tiene un extremo C correspondiente al resto 164 (de nuevo, usando la fHBP de MC58 como secuencia de referencia con el fin de la numeracion).

Por ejemplo, cuando el dominio B heterologo incluye los restos 101-122 o una v.1 de fHBP, la parte C-terminal del dominio B heterologo incluye los restos 123 a 164 de una v.2 o v.3 de fHBP. Por consiguiente, la parte C-terminal del dominio B heterologo puede incluir una secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica, al menos un 85 % identica, al menos un 90 % identica, al menos un 99 % identica o mas a una secuencia de aminoacidos contigua de una v.2 o v.3 de fHBP correspondiente a los restos 122-164, 123-164, 124-164, 125-164, 126-164,127-164, 128-164, 129-164, 130-164, 131-164, 132-164, 133-164, 134-164, 135-164, 136-164, 137-164, 139-164 o 140-164, estando la parte N-terminal del dominio B heterologo proporcionada por las secuencias de v.1 ilustradas anteriormente.

En otra realizacion, el punto de union esta situado N-terminal con respecto a la segunda helice a (AH2), que se indican en la Figura 22 con "a". Como se ha senalado anteriormente, los restos de GEHT estan altamente conservados a traves de las variantes v.1, v.2 y v.3 de fHBP, y por lo tanto, pueden servir como los restos convenientes del punto de union, asi como una referencia conveniente para la posicion de un punto de union en una fHBP quimerica. Por ejemplo, el punto de union puede estar situado en 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 resto/s N-terminal/es a GEHT para proporcionar una dominio B heterologo (por ejemplo, situado en un sitio no mas de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 resto/s N-terminal/es de GEHT); o esta situado en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 restos C-terminales con respecto a GEHT (por ejemplo, situado en un sitio no mas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33 o 34 restos C-terminales de GEHT), donde un punto de union en un sitio de menos de o igual a 26 restos C-terminales con respecto a GEHT proporciona un dominio B heterologo y un punto de union situado en mas de 26 restos C-terminales con respecto a GEHT produce una fHBP quimerica que tiene un dominio C heterologo.

Por ejemplo, el punto de union del dominio B heterologo se puede seleccionar de modo que la secuencia de aminoacidos del dominio B heterologo situado N-terminal y que flanquea la secuencia de aminoacidos GEHT se deriva de una secuencia de aminoacidos del dominio B de v.1 de fHBP, y la secuencia de aminoacidos del dominio B heterologo situada C-terminal y que flanquea la GEHT se deriva de una secuencia de aminoacidos del dominio B de v.2 o v.3 de fHBP.

En algunas realizaciones, el punto de union se situa para proporcionar un dominio B heterologo que comprenda una secuencia de aminoacidos que sea mas del 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %), al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % identica o identica a una secuencia de aminoacidos de QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GK (SEC ID n.° 1), donde la secuencia de aminoacidos proporciona opcionalmente un epitopo que media la union especifica de un mAb JAR 5. Las sustituciones de aminoacidos ilustrativas de la secuencia anterior son las siguientes: QSHSALTA(F/L)Q TEQ(I/V/E)QD(S/P)E(H/D)S (G/E/R)K.

Las modificaciones ilustrativas de las secuencias de aminoacidos del dominio B heterologo como se establece anteriormente incluyen, por ejemplo, una o mas de las siguientes sustituciones de SEC ID n.° 1:

leucina (L) por fenilalanina (F) en un resto correspondiente a la posicion 9;

valina (V) o acido glutamico (E) por isoleucina (I) en la posicion del resto 14;

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prolina (P) por serina (S) en la posicion del resto 17; acido aspartico (D) por histidina (H) en la posicion del resto 19; arginina (R) por glutamina (Q) en la posicion del resto 28; valina (V) por alanina (A) en la posicion del resto 35; glicina (G) por acido aspartico (D) en la posicion del resto 42; o lisina (K) por acido glutamico (E) en la posicion del resto 46.

En realizaciones adicionales, el dominio B heterologo comprende una secuencia de aminoacidos representada por la formula:

QSHSALTA(F/L)Q TEQ(I/V/E)QD(S/P)E(H/D)S (G/E/R)KMVAKR(Q/R)FR IGDI(A/V)GEHTA FNQLP (D/S)

En algunas realizaciones, el punto de union se situa para proporcionar un dominio B heterologo que comprenda una secuencia de aminoacidos que sea al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % identica o identica a una secuencia de aminoacidos de

TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD,

en la que la secuencia de aminoacidos proporciona opcionalmente un epltopo que media la union especlfica de un mAb jAr 5.

En otras realizaciones, el dominio B heterologo comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % identica o identica a una secuencia de aminoacidos de

QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD

en la que la secuencia de aminoacidos proporciona opcionalmente un epltopo unido especlficamente por el mAb JAR 5.

En otras realizaciones mas, el dominio B heterologo comprende una secuencia de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % identica o identica a una secuencia de aminoacidos expuesta en la Fig. 13, que proporciona una alineacion de las secuencias III, IV y V de las fHBP quimericas ilustrativas en la region del punto de union, que se indica con un recuadro. El resto G121, implicado en el epltopo de JAR 5 se muestra en negrita y subrayado.

En algunas realizaciones, el punto de union se situa para proporcionar un dominio B heterologo que comprenda una secuencia de aminoacidos que sea al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % identica o identica a una secuencia de aminoacidos de:

LTAFQ TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIA

en la que la secuencia de aminoacidos proporciona opcionalmente un epltopo que media en la union especlfica de un mAb JAR 5.

En otra realization, el punto de union de la fHBP quimerica se situa de modo que la fHBP quimerica contiene un dominio C heterologo compuesto de una secuencia de aminoacidos contigua de una parte N-terminal de un dominio C de una v.1 de fHBP y una secuencia de aminoacidos contigua de una parte C-terminal de un dominio C de una v.2 o v.3 de fHBP.

Por ejemplo, el punto de union de una fHBP quimerica que tiene un dominio C heterologo puede estar en las regiones de bucle del barril b del dominio C, o en cualquier segmento altamente conservado, por ejemplo en los restos D160 o I170. En una realizacion, el dominio C heterologo incluye una secuencia N-terminal de KLTYTIDFA.

En los siguientes ejemplos, se proporciona la FHBP quimerica ilustrativa. La presente divulgation contempla estas fHBP quimericas ilustrativas, as! como la fHBP quimerica que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o mas de identidad de secuencia de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos de estas fHBP quimericas ilustrativas (por ejemplo, Quimera I, Quimera II, Quimera lIb, Quimera III, Quimera IV y Quimera V). Las secuencias de aminoacidos y de acido nucleico que codifican la Quimera I, Quimera II, Quimera lIb, Quimera III, Quimera IV y Quimera V se proporcionan en las Figuras 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente. El asterisco indica el extremo C de la secuencia de aminoacidos (correspondiente al codon de termination del acido nucleico que codifica).

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Inclusion o mantenimiento de pares de epltopos que generan anticuerpos que presentan mejor actividad bactericida cuando estan unidos

La fHBP quimerica engloba la fHBP quimerica que contiene pares de epltopos que generan anticuerpos que, cuando ambos estan unidos a sus respectivos epltopos, muestran una mayor actividad bactericida contra N. meningitidis que cuando solo esta unido uno cualquiera. La fHBP quimerica se puede disenar para garantizar que se mantengan dichos epltopos o para introducir dichos epltopos (por ejemplo, mediante la modificacion de una secuencia de aminoacidos de fHBP para que incluya un par de epltopos heterologos a la secuencia de aminoacidos de fHBP).

En general (y sometido a la excepcion que figura mas delante), la distancia entre epltopos de dichos pares de epltopos se selecciona para que sea inferior a 27 A, pero superior a 14 A, y, por lo general, se encuentran dentro de una distancia de aproximadamente 18 A a 20 A. Como se trata en los siguientes ejemplos, se observo un mayor efecto bactericida cuando dos epltopos unidos por anticuerpos se situaban a distancias dentro de estos parametros. Sin quedar vinculados por la teorla, cuando se estan unidos por sus respectivos anticuerpos, la distancia entre los epltopos es suficiente para facilitar la interaccion de los anticuerpos con los factores de la cascada del complemento, pero no tan cerca como para provocar la inhibicion de la union debida al impedimento esterico. Por lo tanto, la fHBP quimerica que contiene dichos epltopos para las cepas v.2 y v.3 puede dar lugar a la production de anticuerpos que tengan una mayor actividad bactericida frente a dichas cepas. Los ejemplos de dichos pares de epltopos son los epltopos unidos por JAR 10 y JAR 11 (v.2 de fHBP); y JAR 33 y JAR 32/35 (JAR 32 y JAR 35 unen los mismos o epltopos superpuestos) (v.3 de fHBP).

Las fHBP quimericas tambien puede incluir pares de epltopos en los que un epltopo del par este definido por la union por el mAb JAR 4 y el segundo epltopo este unido por un anticuerpo que inhiba la union de fH. Dicho par de epltopos no esta necesariamente sujeto a las limitaciones de distancia entre los epltopos descritas anteriormente, con la condition de que los epltopos no esten tan cerca como para inhibir la union de sus respectivos anticuerpos. Como se trata en los ejemplos que figuran a continuation, la union de un anticuerpo que inhibe la union de fH puede ser bactericida junto con otro mAb que no inhiba la union de fH. Por ejemplo, un par de mAb tal como JAR 4 junto con cualquier mAb anti-v.1 o -v.2 que bloquea la union de fH puede dar lugar a la produccion de anticuerpos que tienen una mejor actividad bactericida.

Inclusion o mantenimiento de epltopos que generan anticuerpos que inhiben la union de fH

Las fHBP quimericas se pueden disenar para que incluyan uno o mas epltopos que generen anticuerpos que, cuando se unan a la fHBP, inhiban la union de fH. Por ejemplo, como se indica a continuacion, cuando los epltopos unidos por JAR 13 (epltopo v.2), JAR 11 (epltopo v.2) y JAR 32/35 (epltopo v.3) son unidos por el anticuerpo, se inhibe la union de fHBP al fH. Por lo tanto, la presencia de dichos epltopos de union de fH en los polipeptidos fHBP quimericos puede proporcionar la produccion de anticuerpos que pueden facilitar la protection a traves de esta via.

Acido nucleico que codifica la fHBP quimerica

La fHBP quimerica se puede generar usando tecnicas recombinantes para manipular los acidos nucleicos de diferentes fHBP conocidos en la tecnica por proporcionar construcciones que codifican una fHBP quimerica de interes. Como se ha indicado anteriormente, en la tecnica, se dispone de acidos nucleicos que codifican varias v.1, v.2 y v.3 de fHBP diferentes de N. meningitidis, y sus secuencias de nucleotidos son conocidas.

En las Figuras 23-28, se proporcionan secuencias de aminoacidos y de acido nucleico de las fHBP quimericas ilustrativas. Se apreciara que las secuencias de nucleotidos que codifican las fHBP quimericas se pueden modificar para optimizar el uso de codones con el fin de facilitar la expresion en una celula hospedadora de interes (por ejemplo, E. coli, N. meningitidis, humana (como en el caso de una vacuna a base de ADN), y similares). Los metodos de produccion de secuencias de codones optimizados se conocen en la tecnica.

METODOS DE PRODUCCION

Las fHBP quimericas se pueden producir mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo metodos recombinantes y no recombinantes (por ejemplo, slntesis qulmica). Cuando la fHBP quimerica se produce usando tecnicas recombinantes, los metodos pueden implicar cualquier construction adecuada y cualquier celula hospedadora adecuada, que puede ser una celula procariota o eucariota, por lo general, una celula hospedadora bacteriana o de levadura, mas habitualmente, una celula bacteriana. Los metodos de introduction de material genetico en celulas hospedadoras incluyen, por ejemplo, transformation, electroporation, conjugation, metodos de fosfato de calcio y similares. El metodo para la transferencia se puede seleccionar para que proporcione la expresion estable del acido nucleico que codifica la fHBP quimerica que se introduce. El acido nucleico que codifica la fHBP quimerica se puede proporcionar como un elemento episomal heredable (por ejemplo, plasmido) o se puede integrar genomicamente.

Los vectores adecuados para la transferencia del acido nucleico que codifica la fHBP quimerica pueden variar en composition. Los vectores integradores pueden ser plasmidos condicionalmente replicativos o suicidas, bacteriofagos, y similares. Las construcciones pueden incluir diversos elementos, incluyendo, por ejemplo,

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promotores, marcadores geneticos seleccionables (por ejemplo, genes que confieren resistencia a los antibioticos [por ejemplo, kanamicina, eritromicina, cloranfenicol o gentamicina]), origen de replicacion (para potenciar la replicacion en una celula hospedadora, por ejemplo, una celula hospedadora bacteriana), y similares. La eleccion del vector dependera de varios factores tales como el tipo de celula en la que se desea la propagacion y el fin de la propagacion. Ciertos vectores son utiles para amplificar y fabricar grandes cantidades de la secuencia de ADN deseada. Otros vectores son adecuados para la expresion en celulas en cultivo. Otros vectores mas son adecuados para la transferencia y la expresion en celulas en un animal entero. La eleccion del vector apropiado es competencia del experto en la materia. Muchos de dichos vectores se encuentran disponibles en el mercado.

En una realization, el vector es un vector de expresion basado en plasmidos episomales que contienen marcadores y elementos de resistencia a farmacos seleccionables que proporcionan la replicacion autonoma en diferentes celulas hospedadoras (por ejemplo, tanto en E. coli como en N. meningitidis). Un ejemplo de dicho "vector lanzadera" es el plasmido pFP10 (Pagotto et al., Gene 2000, 244:13-19).

Las construcciones se pueden preparar mediante, por ejemplo, la insertion de un polinucleotido de interes en la cadena principal de una construction, normalmente, por medio de la union de ADN ligasa a un sitio de enzima de restriction escindido del vector. Como alternativa, la secuencia de nucleotidos deseada se puede insertar mediante recombination homologa o recombination especlfica de sitio. Por lo general, la recombination homologa se realiza uniendo las regiones de homologla al vector en los flancos de la secuencia de nucleotidos deseada, mientras que la recombinacion especlfica de sitio se puede realizar a traves del uso de secuencias que faciliten la recombinacion especlfica de sitio (por ejemplo, cre-lox, sitios att, etc.). Se puede anadir acido nucleico que contenga dichas secuencias, por ejemplo, mediante la ligadura de oligonucleotidos, o mediante la reaction en cadena de la polimerasa usando cebadores que comprendan tanto la region de homologla como una parte de la secuencia de nucleotidos deseada.

Los vectores pueden proporcionar el mantenimiento extracromosomico en una celula hospedadora o pueden proporcionar la integration en el genoma de la celula hospedadora. Los vectores se describen ampliamente en numerosas publicaciones bien conocidas por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, “Short Protocols in Molecular Biology”, (1999) F. Ausubel, et al., eds., Wiley & Sons. Los vectores pueden proporcionar la expresion de los acidos nucleicos que codifican una fHBP quimerica, pueden proporcionar la propagacion de los acidos nucleicos en cuestion, o ambas.

Los vectores ilustrativos que se pueden usar incluyen, pero sin limitation, los derivados de ADN de bacteriofago recombinante, ADN de plasmido o ADN de cosmido. Por ejemplo, se pueden usar vectores de plasmido tales como pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 y la serie M13 mp de vectores. pET21 tambien es un vector de expresion que se puede usar. Los vectores de bacteriofagos pueden incluir 1gt10, Igt 11, 1gt18-23, 1ZAP/R y la serie de vectores de bacteriofago EMBL. Otros vectores que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitacion, pJB8, pCV 103, pCV 107, 108 pCV, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 y la serie de vectores charomid 9.

Para la expresion de una fHBP quimerica de interes, se puede emplear un casete de expresion. Por lo tanto, la presente divulgation proporciona un vector de expresion recombinante que comprende un acido nucleico en cuestion. El vector de expresion proporciona secuencias reguladoras de la transcription y de la traduction, y puede proporcionar la expresion inducible o constitutiva, estando la region codificante operativamente enlazada bajo el control transcripcional de la region de initiation de la transcripcion, y una region de termination de la transcripcion y de la traduccion. Estas regiones de control pueden ser naturales de una fHBP a partir de la que se deriva la fHBP quimerica, o pueden derivar de fuentes exogenas. En general, las secuencias reguladoras de la transcripcion y de la traduccion pueden incluir, pero sin limitacion, secuencias promotoras, sitios de union al ribosoma, secuencias de inicio y detention de la transcripcion, secuencias de inicio y detention de la traduccion, y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden ser un promotor constitutivo potente (por ejemplo, T7, y similares).

En general, los vectores de expresion tienen sitios de restriccion convenientes situados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la insercion de secuencias de acido nucleico que codifiquen las protelnas de interes. Puede haber un marcador seleccionable operativo en el hospedador de expresion para facilitar la selection de celulas que contengan el vector. Ademas, la construccion de expresion puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresion puede tener uno o dos sistemas de replicacion, permitiendo as! su mantenimiento en los organismos, por ejemplo, en celulas de mamlferos o insectos para la expresion y en un hospedador procariota para la donation y la amplification. Ademas, la construccion de expresion puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de celulas hospedadoras transformadas. Los genes de seleccion son bien conocidos en la tecnica y variaran con la celula hospedadora usada.

Cabe senalar que la fHBP quimerica de la presente divulgacion puede comprender elementos adicionales, tales como un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador de biotina, un marcador inmunologicamente detectable (por ejemplo, un marcador de HA, un marcador de poli-histidina) y similares. Se pueden proporcionar elementos adicionales de fHBP quimerica para facilitar el aislamiento (por ejemplo, un marcador de biotina, un marcador inmunologicamente detectable) a traves de diversos metodos (por

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ejemplo, la captura de afinidad, etc.). Opcionalmente, la fHBP quimerica se puede inmovilizar sobre un soporte a traves de la union covalente o no covalente.

El aislamiento y la purificacion de fHBP quimerica se pueden realizar de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la fHBP quimerica se puede aislar de un lisado de celulas modificadas geneticamente para expresar una fHBP quimerica, o de una mezcla de reaccion sintetica, mediante purificacion por inmunoafinidad, que generalmente implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-fHBP quimerica (por ejemplo, un mAb anti-fHBP quimerica, tal como un mAb JAR 5 u otro mAb JAR apropiado descrito en el presente documento), lavar para eliminar el material unido no especlficamente y eluir la fHBP quimerica unida especlficamente. La fHBP quimerica aislada se puede purificar ademas mediante dialisis y otros metodos normalmente empleados en los metodos de purificacion de protelnas. En una realizacion, la fHBP quimerica se puede aislar usando metodos de cromatografla de quelatos metalicos.

Celulas hospedadoras

En la produccion de fHBP quimericas, se puede usar cualquiera de una serie de celulas hospedadoras adecuadas. En general, la fHBP quimerica descrita en el presente documento se puede expresar en organismos procariotas o eucariotas, generalmente bacterias, mas habitualmente E. coli o Neisseria (por ejemplo, N. meningitidis) de acuerdo con tecnicas convencionales. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona ademas una celula hospedadora geneticamente modificada que contiene un acido nucleico que codifica una fHBP quimerica. Las celulas hospedadoras para la produccion (incluyendo la produccion a gran escala) de una fHBP quimerica se pueden seleccionar de cualquiera de varias celulas hospedadoras disponibles. Las celulas hospedadoras ilustrativas para la expresion incluyen las de un organismo unicelular procariota o eucariota, tal como bacterias (por ejemplo, cepas de Escherichia coli), levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia sp., y similares), y pueden incluir celulas hospedadoras derivadas originariamente de un organismo superior tal como insectos, vertebrados, particularmente mamlferos, (por ejemplo, CHO, HEK, y similares). En general, las celulas hospedadoras bacterianas y las levaduras son de particular interes para la produccion de fHBP quimericas.

Las fHBP quimericas se pueden preparar en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente exenta de otros polipeptidos de Neisseria o de celulas hospedadoras) o forma sustancialmente aislada. En ciertas realizaciones, la fHBP quimerica esta presente en una composition que esta enriquecida en el polipeptido con respecto a otros componentes que pueden estar presentes (por ejemplo, otros polipeptidos u otros componentes de la celula hospedadora). Se puede proporcionar fHBP quimerica purificada de manera que el polipeptido esta presente en una composicion que esta sustancialmente exenta de otros polipeptidos expresados, por ejemplo, menos del 90 %, normalmente menos del 60 % y mas normalmente menos del 50 % de la composicion esta constituido por otros polipeptidos expresados.

Celulas hospedadoras para la produccion de vesiculas

Cuando se va a proporcionar una fHBP quimerica en una veslcula de membrana (como se explica en detalle mas adelante), se modifica geneticamente una celula hospedadora de Neisseria para que exprese una fHBP quimerica. Se puede modificar cualquiera de varias cepas de Neisseria sp. para producir una fHBP quimerica, que, opcionalmente, produzca o se pueda modificar para que produzca otros antlgenos de interes, tales como PorA, que se pueden usar en los metodos desvelados en el presente documento.

Los metodos y vectores para proporcionar la modification genetica de cepas de Neisseria y la expresion de un polipeptido deseado son conocidos en la tecnica. En el documento WO 02/09746 y en O'Dwyer et al. Infect Immun 2004; 72:6511-80, se proporcionan vectores y metodos ilustrativos. Son de particular interes los promotores potentes, particularmente, los promotores potentes constitutivos. Los promotores ilustrativos incluyen los promotores de porA, porB, lbpB, tbpB, p110, hpuAB, lgtF, opa, p110, 1st, hpuAB y rmp.

La especie Neisseria patogena o las cepas derivadas de especies de Neisseria patogenas, especialmente, las cepas patogenas para el ser humano o las derivadas de las cepas patogenas o comensales para el ser humano, son de particular interes para su uso en la produccion de vesiculas de membrana. Las especies de Neisseria ilustrativas incluyen N. meningitidis, N. flavescens, N. gonorrhoea, N. lactamica, N. polysaccharea, N. cinerea, N. mucosa, N. subflava, N. sicca, N. elongata, y similares.

Las cepas de N. meningitidis son de particular interes para la modificacion genetica destinada a expresar una fHBP quimerica y para su uso en la produccion de vesiculas. La cepa usada para la produccion de vesiculas se puede seleccionar de acuerdo con una serie de caracteristicas diferentes que se pueden desear. Por ejemplo, la cepa se puede seleccionar de acuerdo con: un tipo de PorA deseado (un "serosubtipo", como se ha descrito anteriormente), grupo capsular, serotipo, y similares; la reduction de la produccion de polisacarido capsular; y similares. Por ejemplo, la cepa de produccion puede producir cualquier polipeptido PorA deseado, y puede expresar uno o mas polipeptidos PorA (ya sea de manera natural o por la ingenieria genetica). Las cepas ilustrativas incluyen las que producen un polipeptido PorA que confiere un serosubtipo de P1.7,16; P1.19,15; P1.7,1; P1.5,2; P1.22a,14; P1.14; P1.5,10; P1.7,4; P1.12,13; asi como variantes de dichos polipeptidos PorA que pueden o no pueden retener

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reactividad con reactivos serologicos convencionales usados en la serosubtipificacion. Tambien son de interes los polipeptidos PorA caracterizados de acuerdo con la tipificacion de regiones variables (VR) de PorA (vease, por ejemplo, Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678; Sacchi C. T., et al, Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:845- 55; Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182:1169-1176). Se ha identificado un numero considerable de tipos de VR distintos, que se pueden clasificar en "prototipos" de las familias VR1 y VR2. En neisseria.org/nm/typing/pora, se encuentra una base de datos accesible en la Web que describe dicha nomenclatura y su relacion con los esquemas de tipificacion anteriores. En Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678, se proporcionan alineaciones de los tipos de PorA VR1 y VR2 ilustrativos.

Como alternativa o ademas, la cepa de produccion puede ser una cepa deficiente en capsula. Las cepas deficientes en capsula pueden proporcionar vacunas a base de veslculas que proporcionan un menor riesgo de provocar una respuesta de autoanticuerpos significativa en un sujeto al que se administre la vacuna (por ejemplo, debido a la produccion de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con el acido sialico en las superficies las celulas hospedadoras). "Deficiente en capsula" o "deficiente en polisacarido capsular", como se usan en el presente documento, se refieren a un nivel de polisacarido capsular en la superficie bacteriana que es inferior al de una cepa de origen natural o, cuando la cepa se ha modificado geneticamente, que es inferior al de de una cepa parental de la que se deriva la cepa deficiente en capsula. Una cepa deficiente en capsula incluye cepas que tienen una reduccion de la produccion de polisacarido capsular superficial de al menos 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o mas, e incluye cepas en las que el polisacarido capsular no es detectable en la superficie bacteriana (por ejemplo, mediante ELISA de celulas enteras usando un anticuerpo anti-polisacarido capsular).

Las cepas deficientes en capsula incluyen aquellas que son deficientes en capsula debido a una modificacion genetica de origen natural o generada por recombinacion. Las cepas deficientes en capsula de origen natural (vease, por ejemplo, Dolan-Livengood et al. J. Infect. Dis. (2003) 187(10): 1616-28), as! como los metodos de identification y/o generation de cepas deficientes de capsula (vease, por ejemplo, Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73(7):4070-4080; Stephens et al. (1991) Infect Immun 59(11):4097-102; Frosch et al. (1990) Mol Microbiol. 1990 4(7):1215-1218) son conocidos en la tecnica.

La modificacion de una celula hospedadora de Neisseria para reducir la produccion de polisacarido capsular puede incluir la modificacion de uno o mas genes implicados en la slntesis de la capsula, cuando la modificacion da lugar, por ejemplo, a la reduccion de los niveles de polisacarido capsular con respecto a una celula parental antes de la modificacion. Dichas modificaciones geneticas pueden incluir cambios en las secuencias de nucleotidos y/o de aminoacidos de uno o mas genes de la bioslntesis de la capsula volviendo a la cepa deficiente en capsula (por ejemplo, debido a una o mas inserciones, eliminaciones, sustituciones, y similares, en uno o mas genes de la bioslntesis de la capsula). Las cepas deficientes en capsula pueden carecer o ser no funcionales para uno o mas genes de la capsula.

Son de particular interes las cepas que son deficientes en la bioslntesis del acido sialico. Dichas cepas pueden proporcionar la produccion de veslculas que tengan un menor riesgo de generar anticuerpos anti-acido sialico que reaccionen de forma cruzada con los antlgenos de acido sialico humanos, y pueden proporcionar ademas una mejor seguridad de fabrication. Las cepas que tienen un defecto en la bioslntesis del acido sialico (ya sea debido a una modificacion de origen natural o a una modificacion por ingenierla genetica) pueden ser defectuosas en cualquiera de una serie de diferentes genes de la via de bioslntesis del acido sialico. Son de particular interes las cepas que son defectuosas en un producto genico codificado por el gen N-acetilglucosamina-6-fosfato 2-epimerasa (conocido como synX AAF40537.1 o siaA AAA20475), siendo de particular interes las cepas que tienen este gen inactivado. Por ejemplo, en una realization, se genera una cepa deficiente en capsula mediante la interruption de la produccion de un producto genico synX funcional (vease, por ejemplo, Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176(5):1530-4).

Las cepas deficientes en capsula tambien se pueden generar a partir de cepas de origen natural usando tecnicas no recombinantes, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos anti-capsulares bactericidas para seleccionar las cepas que reducen la produccion de polisacarido capsular.

Cuando la divulgation implica el uso de dos o mas cepas (por ejemplo, para producir composiciones antigenicas que contengan veslculas presentadoras de fHBP quimerica de diferentes cepas), las cepas se pueden seleccionar de manera que se diferencien en una o mas caracterlsticas de las cepas, por ejemplo, para proporcionar veslculas que difieran en la fHBP quimerica usada, PorA, y similares.

Preoaracion de las vesiculas

Las composiciones antigenicas contempladas por la presente divulgacion incluyen, en general, las veslculas preparadas a partir de celulas de Neisseria que expresan una fHBP quimerica. Como se hace referencia en el presente documento, se entiende que el termino "veslculas" engloba veslculas de membrana externa, as! como microveslculas (tambien conocidas como ampollas).

En una realizacion, la composition antigenica comprende veslculas de membrana externa (OMV) preparadas a partir de la membrana externa de una cepa cultivada de la especie Neisseria meningitidis modificada geneticamente

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para expresar una fHBP quimerica. Las OMV se pueden obtener a partir de Neisseria meningitidis cultivada en caldo o medio de cultivo solido, preferentemente separando las celulas bacterianas del medio de cultivo (por ejemplo, por filtracion o por una centrifugacion a baja velocidad de sedimentos celulares, o similares), la lisis de las celulas (por ejemplo, mediante la adicion de detergente, choque osmotico, sonicacion, cavitacion, homogeneizacion, o similares) y la separacion de una fraccion de membrana externa de moleculas citoplasmicas (por ejemplo, por filtracion, o por precipitacion diferencial o agregacion de membranas externas y/o veslculas de membrana externa, o mediante metodos de separacion por afinidad usando ligandos que reconocen especlficamente moleculas de la membrana externa, o por una centrifugacion de alta velocidad de sedimentos de membranas externas y/o veslculas de membrana externa, o similares); se pueden usar fracciones de membrana externa para producir las OMV.

En otra realizacion, la composition antigenica comprende microveslculas (MV) (o "ampollas") que contienen fHBP quimerica, donde las MV o ampollas se liberan durante el cultivo de una cepa de Neisseria meningitidis modificada geneticamente para expresar una fHBP quimerica. Por ejemplo, las MV se pueden obtener mediante el cultivo de una cepa de Neisseria meningitidis en medio de cultivo de caldo, separando las celulas enteras del medio de cultivo de caldo (por ejemplo, por filtracion o por una centrifugacion a baja velocidad que aglomera solamente las celulas y no las ampollas mas pequenas, o similares), y luego la recogida de las MV que estan presentes en el medio de cultivo exento de celulas (por ejemplo, por filtracion, precipitacion diferencial o agregacion de las MV, o por una centrifugacion de alta velocidad que aglomera las ampollas, o similares). En general, las cepas para su uso en la production de MV se pueden seleccionar basandose en la cantidad de ampollas producidas en cultivo (por ejemplo, las bacterias se pueden cultivar en un numero razonable para producir las ampollas adecuadas para el aislamiento y la administration en los metodos descritos en el presente documento). Una cepa ilustrativa que produce altos niveles de ampollas se describe en la publication PCT n.° WO 01/34642. Ademas de la produccion de ampollas, las cepas para su uso en la produccion de MV tambien se pueden seleccionar basandose en la produccion de NspA, pudiendo ser de particular interes las cepas que producen niveles mas altos de NspA (para consultar ejemplos de cepas de N. meningitidis que tienen diferentes niveles de produccion de NspA, vease, por ejemplo, Moe et al. (1999, Infect. Immun. 67: 5664). Otras cepas de interes para su uso en la produccion de ampollas incluyen cepas que tienen un gen GN33 inactivado que codifica una lipoprotelna necesaria para la separacion celular, la arquitectura de la membrana y la virulencia (vease, por ejemplo, Adu-Bobie et al. Infect Immun. 2004; 72: 1914-1919).

Las composiciones antigenicas de la presente divulgation pueden comprender veslculas de una cepa, o de 2, 3, 4, 5 o mas cepas, pudiendo ser las cepas homologas o heterologas, por lo general, heterologas, entre si. Por ejemplo, las cepas pueden ser homologas o heterologas con respecto a PorA. En una realizacion, se pueden preparar veslculas a partir de cepas que expresen mas de una fHBP quimerica (por ejemplo, 1, 2, 3 o mas fHBP quimericas) que puede estar compuesta de secuencias de aminoacidos de diferentes variantes (v.1, v.2 o v.3) o subvariantes (por ejemplo, una subvariante de v.1, v.2 o v.3) de fHBP.

Las composiciones antigenicas pueden comprender una mezcla de OMV y MV que presentan las mismas fHBP quimericas o diferentes, pudiendo presentar las fHBP quimericas opcionalmente epltopos de diferentes combinaciones de variantes y/o subvariantes de fHBP, y pudiendo proceder las OMV y/o MV de las mismas o diferentes cepas. Es posible administrar veslculas de diferentes cepas como una mezcla, o se pueden administrar en serie.

Cuando se desee (por ejemplo, cuando las cepas usadas para producir veslculas estan asociadas con endotoxina o niveles particularmente altos de endotoxina), las veslculas se tratan opcionalmente para reducir la endotoxina, por ejemplo, para reducir la toxicidad tras la administracion. Aunque es menos deseable, como se tratara a continuation, la reduction de endotoxina se puede realizar mediante extraction con un detergente adecuado (por ejemplo, BRIJ- 96, desoxicolato de sodio, lauroilsarcosinato de sodio, Empigen BB, Triton X-100, TWEEN 20 (monolaurato de polioxietileno de de sorbitan), TWEEN 80, a una concentration del 0,1 al 10 %, preferentemente del 0,5 al 2 %, y SDS). Cuando se usa la extraccion con detergente, es preferible usar un detergente que no sea desoxicolato.

En algunas realizaciones, las veslculas de las composiciones antigenicas se preparan sin detergente, por ejemplo, sin el uso de desoxicolato. Aunque el tratamiento de detergente es util para eliminar la actividad de la endotoxina, puede agotar la lipoprotelna fHBP natural y/o fHBP quimerica (incluyendo la fHBP quimerica lipidada) por la extraccion durante la produccion de veslculas. Por lo tanto, puede ser particularmente deseable reducir la actividad de la endotoxina usando tecnologla que no requiera un detergente. En una metodologla, se usan cepas que producen niveles relativamente bajos de endotoxina (lipopolisacarido, LPS) para evitar la necesidad de eliminar la endotoxina del preparado final antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, las veslculas se pueden preparar a partir de mutantes de Neisseria en los que se reduzcan o eliminen los lipooligosacaridos u otros antlgenos que puedan no ser deseados en una vacuna (por ejemplo, Rmp).

Las veslculas se puede preparar a partir de cepas de N. meningitidis que contengan modificaciones geneticas que den lugar a la reduccion o a ninguna actividad toxica detectable del llpido A. Por ejemplo, dicha cepa se puede modificar geneticamente en la bioslntesis del llpido A (Steeghs et al. Infect Immun 1999; 67:4988-93; van der Ley et al. Infect Immun 2001; 69:5981-90; Steeghs et al. J Endotoxin Res 2004; 10:113-9; Fissha et al, Infect Immun 73:4070, 2005). Las composiciones inmunogenicas pueden ser desintoxicadas mediante la modification de LPS, tal como la regulation a la baja y/o la inactivation de las enzimas codificadas por lpxL1 o lpxL2, respectivamente. La

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produccion de un llpido A penta-acilado creado en mutantes lpxL1 indica que la enzima codificada por lpxL1 anade el C12 al C14 3-OH enlazado en N en la posicion 2' de GlcN II. La principal especie de llpido A que se encuentra en los mutantes lpxL2 esta tetra-acilada, lo que indica que la enzima codificada por lpxL2 anade el otro C12, es decir, C14 3-OH enlazado en N en la posicion 2 de GlcN I. Las mutaciones que reducen (o anulan) la expresion de estos genes (o reducen o anulan la actividad de los productos de estos genes) dan lugar una actividad toxica modificada del llpido A (van der Ley et al 2001; 69:5981-90). El llpido A tetra-acilado (mutante lpxL2) y pentaacilado (mutante lpxL1) son menos toxicos que los llpidos A de tipo silvestre. Las mutaciones en el gen que codifica la llpido A 4'- quinasa (IpxK) tambien disminuyen la actividad toxica del llpido A. Son de particular interes para su uso en la produccion de veslculas (por ejemplo, MV o OMV) las cepas de N. meningitidis modificadas geneticamente para proporcionar la reduccion o anulacion de protelna codificada por LpxL1 funcional detectable. Dichas veslculas proporcionan toxicidad reducida en comparacion con las cepas de N. meningitidis que son de tipo silvestre para la produccion de LPS, a la vez que conservan la inmunogenidad de la fHBP quimerica.

Tambien es posible modificar la actividad toxica de los LPS mediante la introduccion de mutaciones en los genes/loci implicados en la resistencia a la polimixina B (dicha resistencia se ha correlacionado con la adicion de aminoarabinosa en el fosfato 4' del llpido A). Estos genes/loci podrlan ser pmrE que codifica una UDP-glucosa deshidrogenasa, o una region de genes de resistencia a peptidos antimicrobianos comunes a muchas enterobacterias que podrlan estar implicadas en la slntesis y transferencia de aminoarabinosa. El gen pmrF que esta presente en esta region codifica una dolicol-fosfato manosil transferasa (Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).

Las mutaciones en el sistema regulador PhoP-PhoQ, que es un sistema regulador de dos componentes basado en fosfo (por ejemplo, fenotipo constitutivo PhoP, PhoPc), o condiciones ambientales o de cultivo bajas en Mg++ (que activan el sistema regulador PhoP-PhoQ) conducen a la adicion de aminoarabinosa en el fosfato 4' y 2- hidroximiristato de sustitucion del miristato (hidroxilacion del miristato). Este llpido A modificado muestra una capacidad reducida para estimular la expresion de E-selectina por las celulas endoteliales humanas y la secrecion de TNF de monocitos humanos.

Tambien son adecuadas para su uso las cepas resistentes a la polimixina B, pues dichas cepas han mostrado tener una menor toxicidad de los LPS (vease, por ejemplo, van der Ley et al. 1994. en: “Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference”. The Guildhall, Winchester, Inglaterra). Como alternativa, se pueden anadir peptidos sinteticos que imitan la actividad de union de la polimixina B a las composiciones antigenicas para reducir la actividad toxica de los LPS (vease, por ejemplo, Rustici et al. 1993, Science 259:361-365; Porro et al. Prog Clin Biol Res. 1998; 397:315-25).

La endotoxina tambien se puede reducir mediante la seleccion de las condiciones de cultivo. Por ejemplo, el cultivo de la cepa en un medio de crecimiento que contenga de 0,1 mg a 100 mg de aminoarabinosa por litro de medio proporciona una reduccion de la toxicidad de los llpidos (vease, por ejemplo, el documento WO 02/097646).

FORMULACIONES

Las expresiones "composition de antlgeno", "composition antigenica" o "composition inmunogenica" se usan en el presente documento por una cuestion de conveniencia para referirse genericamente a composiciones que comprenden una fHBP quimerica segun lo desvelado en el presente documento, fHBP quimerica que puede estar opcionalmente conjugada para mejorar aun mas la inmunogenidad. Las composiciones utiles para generar anticuerpos, en particular, anticuerpos contra el grupo B de Neisseria meningitidis (NmB), en un ser humano se contemplan especlficamente por la presente divulgation. Las composiciones antigenicas pueden contener 2 o mas fHBP quimericas diferentes, donde las fHBP quimericas pueden presentar epltopos de diferentes combinaciones de variantes y/o subvariantes de fHBP.

Las composiciones antigenicas comprenden, en general, una cantidad inmunologicamente eficaz de fHBP quimerica, y pueden incluir ademas otros componentes compatibles, segun sea necesario. La expresion "cantidad inmunologicamente eficaz" pretende significar que la administration de esa cantidad a un individuo, bien en una sola dosis, como parte de una serie de las mismas composiciones antigenicas o diferentes composiciones antigenicas, es eficaz para provocar una respuesta de anticuerpos eficaz para el tratamiento o la prevention de un slntoma de, o de una enfermedad causada por, por ejemplo, la infection por Neisseria, particularmente N. meningitidis, mas particularmente N. meningitidis del grupo B. Esta cantidad varla dependiendo del estado de salud y del estado flsico del individuo que se vaya a tratar, de la edad, de la capacidad del sistema inmune del individuo para producir anticuerpos, del grado de protection deseado, de la formulation de la vacuna, de la evaluation que el medico tratante realice de la situation medica y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse mediante ensayos habituales.

La pauta de dosificacion puede ser un programa de monodosis o un programa de multidosis (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo) con una forma de dosificacion unitaria de la composicion antigenica administrada en momentos diferentes. La expresion "forma de dosificacion unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades flsicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales,

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conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de las composiciones antigenicas de la presente invention en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, composiciones que se proporcionan en asociacion con un excipiente farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, diluyente, portador o vehlculo farmaceuticamente aceptable). La composition antigenica se puede administrar en combination con otros agentes inmunorreguladores.

Las composiciones antigenicas se pueden proporcionar en un excipiente farmaceuticamente aceptable, que puede ser una solution tal como una solution acuosa esteril, normalmente, una solution salina, o que se pueden proporcionar en forma de polvo. Si se desea, dichos excipientes pueden ser sustancialmente inertes.

Las composiciones antigenicas pueden comprender ademas un adyuvante. Los ejemplos de adyuvantes adecuados conocidos que se pueden usar en los seres humanos incluyen, pero sin limitarse necesariamente a, alumbre, fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, MF59 (escualeno al 4,3 % p/v, Tween 80™ al 0,5 % p/v, Span 85 al 0,5 % p/v), acido nucleico que contiene CpG (donde la citosina no esta metilada), QS21, MPL, 3dMPL, extractos de Aquilla, ISCOMS, mutantes LT/CT, micropartlculas de poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG), Quil A, interleucinas, y similares. Para los animales experimentales, se puede usar de Freund, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N- acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominado nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (CGP 19835A, denominado MTP- PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraldos de bacterias, llpido A monofosforllico, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsion de escualeno al 2 %/Tween 80. La eficacia de un adyuvante se puede determinar midiendo la cantidad de anticuerpos dirigidos contra el antlgeno inmunogenico o epltopo antigenico del mismo.

Los adyuvantes adicionales ilustrativos para mejorar la eficacia de la composicion incluyen, pero sin limitation: (1) formulaciones de emulsion de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes especlficos tales como peptidos de muramilo (vease mas abajo) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo, (a) mF59™ (documento WO 90/14837; Capltulo 10 de “Vaccine design: the subunit and adjuvant approach”, eds. Powell & Newman, Plenum Press, 1995), que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (que contiene opcionalmente MTP-PE) formulado en partlculas submicrometricas usando un microfluidizador; (b) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, pollmero L121 bloqueado con pluronic al 5 % y thr-MDP bien microfluidizado en una emulsion submicrometrica o sometido a movimientos vorticiales para generar una emulsion de mayor tamano de partlcula; y (c) sistema de adyuvantes RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana, tales como monofosforil-llpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (2) se pueden usar adyuvantes de saponina tales como QS21 o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.) o partlculas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), ISCOM que pueden estar desprovistos de un detergente adicional, por ejemplo, el documento WO 00/07621; (3) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (4) citoquinas tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO99/44636), etc.), interferones (por ejemplo, interferon g), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (5) monofosforil-llpido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL), por ejemplo, los documentos GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se usa con sacaridos neumococicos, por ejemplo, documento WO 00/56358; (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleotidos que comprenden motivos CpG (Krieg, “Vaccine” 2000, 19, 618-622; Krieg, Curr opin Mol Ther, 2001 3:15-24; Roman et al., Nat. Med, 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS EE.UU., 1997, 94, 10833-10837; Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876; Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami et al., “Vaccine”, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS EE.UU., 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122; Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; y Yi et al, J. Immunol, 1998, 55 160, 5898-5906; solicitudes de patente internacional WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581), es decir, que contiene al menos un dinucleotido CG, donde la citosina esta desmetilada; (8) un eter de polioxietileno o un ester de polioxietileno, por ejemplo, el documento WO 99/52549; (9) un tensioactivo de ester de polioxietilensorbitan en combinacion con un octoxinol (documento WO 01/21207) o un tensioactivo de polioxietilenalquileter o polioxietilenalquilester en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol (documento Wo 01/21152); (10) una saponina y un oligonucleotido inmunoestimulante (por ejemplo, un oligonucleotido CpG) (documento WO 00/62800); (11) un inmunoestimulante y una partlcula de sal metalica, por ejemplo, el documento WO 00/23105; (12) una saponina y una emulsion de aceite en agua, por ejemplo, el documento WO 99/11241; (13) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IM2 (opcionalmente + un esterol) por ejemplo, el documento WO 98/57659; (14) otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composicion. Los peptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-25-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutarninil-L- alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE), etc. Son de particular interes los adyuvantes adecuados para la administration a un ser humano.

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Las composiciones antigenicas pueden comprender otros componentes tales como calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requieran para aproximarse a las condiciones fisiologicas tales como agentes de ajuste del pH y agentes tampon, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares.

La concentracion de fHBP quimerica de una formulacion puede variar ampliamente (por ejemplo, de menos del aproximadamente 0,1 %, normalmente a o al menos aproximadamente 2 % hasta tanto como del 20 % al 50 % o mas en peso) y, por lo general, se seleccionara principalmente basandose en volumenes de fluido, viscosidades y factores basados en el paciente de acuerdo con el modo particular de administracion seleccionado y las necesidades del paciente.

Las formulaciones que contienen fHBP quimerica se pueden proporcionar en forma de una solucion, suspension, comprimido, plldora, capsula, polvo, gel, crema, locion, pomada, aerosol o similares. Se reconoce que la administracion oral puede requerir proteger las composiciones de la digestion. Esto, por lo general, se realiza bien mediante la asociacion de la composicion con un agente que la vuelva resistente a la hidrolisis acida y enzimatica o mediante el envasado de la composicion en un vehlculo apropiadamente resistente. Los medios de proteccion de la digestion son bien conocidos en la tecnica.

Las formulaciones que contienen fHBP quimerica tambien se pueden proporcionar para que aumenten la semivida en suero de la fHBP quimerica tras la administracion. Por ejemplo, cuando las fHBP quimericas aisladas se formulan para inyeccion, la fHBP quimerica se puede proporcionar en una formulacion de liposomas, preparada en forma de coloide, u otras tecnicas convencionales para prolongar la semivida en suero. Hay varios metodos disponibles para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), patentes de EE.UU. n.° 4.235.871, 4.501.728 y 4.837.028. Las preparaciones tambien se pueden proporcionar en formas de liberacion lenta o de liberation controlada.

INMUNIZACION

En general, las composiciones antigenicas que contienen fHBP quimericas se administran a un sujeto humano que se encuentre en riesgo de adquirir una enfermedad producida por Neisseria con el fin de prevenir o al menos detener parcialmente el desarrollo de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para el uso terapeutico dependeran de, por ejemplo, la composicion antigenica, la forma de administracion, el peso y el estado general de salud del paciente, y el juicio del medico que las prescribe. Se pueden administrar monodosis y multidosis de las composiciones antigenicas dependiendo de la dosificacion, y de la frecuencia requerida y tolerada por el paciente, y la via de administracion.

Las composiciones antigenicas que contienen fHBP quimerica generalmente se administran en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune, particularmente una respuesta inmune humoral, en el hospedador. Como se ha indicado anteriormente, las cantidades para la inmunizacion seran variables, pudiendo variar generalmente de aproximadamente 1 mg a 100 mg por paciente de 70 kg, normalmente, de 5 mg a 50 mg/70 kg. Las dosis sustancialmente mas elevadas (por ejemplo, de 10 mg a 100 mg o superiores) pueden ser adecuadas en las vlas de administracion oral, nasal o topica. A la administracion inicial le puede seguir la inmunizacion de refuerzo de la misma o diferente composicion antigenica que contiene fHBP quimerica. Por lo general, la vacunacion implica al menos un refuerzo, mas generalmente dos refuerzos.

En general, la inmunizacion se puede realizar mediante la administracion por cualquier via adecuada, incluyendo la administracion de la composicion por via oral, nasal, nasofaringea, parenteral, enterica, gastrica, topica, transdermica, subcutanea, intramuscular, en comprimido, en forma solida, en polvo, en forma llquida, en forma de aerosol, local o sistemicamente, con o sin excipientes anadidos. Los metodos reales de preparation de composiciones administrables por via parenteral seran conocidos o evidentes para los expertos en la materia, y se describen mas detalladamente en publicaciones tales como “Remington's Pharmaceutical Science”, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).

La respuesta inmune anti-fHBP quimerica se puede evaluar mediante metodos conocidos (por ejemplo, mediante la obtencion de suero del individuo antes y despues de la inmunizacion inicial, y la demostracion de un cambio en el estado inmune del individuo, por ejemplo, un ensayo de inmunoprecipitacion o un ELISA, o un ensayo bactericida o una transferencia Western o ensayo de citometrla de flujo, o similar).

En una realization, las composiciones antigenicas se pueden administrar a un sujeto humano que no haya sido tratado previamente inmunologicamente con respecto a Neisseria meningitidis. En una realizacion particular, el sujeto es un nino humano de aproximadamente cinco anos o edad inferior, y preferentemente de aproximadamente dos anos o edad inferior, y las composiciones antigenicas se administran en uno o mas de los siguientes momentos, a las dos semanas, al mes, a los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 meses, o a un ano o 15, 18 o 21 meses del nacimiento,

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o a los 2, 3, 4 o 5 anos de edad.

Puede ser deseable, en general, iniciar la inmunizacion antes del primer signo de slntoma de la enfermedad, o en el primer signo de una posible exposicion o exposicion real a la infeccion o la enfermedad (por ejemplo, debido a la exposicion o infeccion por Neisseria).

Ejemplos

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento son solo con fines ilustrativos, y que los expertos en la materia sugeriran diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos, que estaran incluidos dentro del esplritu y del alcance de la presente solicitud, y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

MATERIALES Y METODOS

En los ejemplos que figuran mas adelante, se usaron los siguientes metodos y materiales.

Clonacion de genes. Se amplificaron genes de fHBP de tipo silvestre a partir de ADN genomico por PCR, y se clonaron en pGEM-T-Easy (Promega). Se trataron los plasmidos resultantes con las enzimas de restriccion NdeI y XhoI, y se ligaron los fragmentos de aproximadamente 800 pares de bases que contenlan las secuencias de codificacion de fHBP en pET21b (Novagen) cortado con las dos mismas enzimas. Se confirmaron los clones de plasmido mediante la determination de la secuencia de ADN de los productos de PCR obtenidos mediante la amplification del plasmido con cebadores especlficos del promotor T7 y las regiones terminadoras. Los plasmidos codificaban las protelnas fHBP de longitud completa a exception de la secuencia senal de 19 aminoacidos amino- terminal y 7 restos N-terminales presumiblemente flexibles, e inclulan un marcador de hexa-histidina (His6) C- terminal procedente del plasmido pET21b.

Se construyo la quimera I de fHBP carente de una secuencia senal mediante la amplificacion por PCR de la region codificante de los restos 8-135 del ADN genomico de la cepa MC58 (v.1 de fHBP) y codificante de los restos 136255 de la cepa 8047 (v.2). Se ensamblaron los dos fragmentos, incluyendo una region de solapamiento de 48 pares de bases en torno a los aminoacidos 136-139, mediante amplificacion por PCR usando cebadores externos especlficos de los genes que contenlan los sitios de restriccion NdeI y XhoI. El gen quimerico se clono en pET21b como se ha descrito anteriormente para los genes de tipo silvestre.

Mutagenesis especffica del sitio. Se uso la mutagenesis especlfica de sitio para ensayar las predicciones de los restos de aminoacidos implicados en los epltopos de mAb anti-fHBP y para crear la Quimera II. La mutagenesis se realizo usando el kit QuikChange II (Stratagene), usando 10 ng de molde de plasmido y los protocolos del fabricante. Para el ensayo de restos supuestamente implicados en los epltopos de mAb, las reacciones de mutagenesis se realizaron en plasmidos basados en pET21 que codificaban genes de fHBP de tipo silvestre de diversas cepas. Se cambio un resto de una secuencia reactiva por uno presente de forma natural en una secuencia no reactiva o vice versa. Para construir la Quimera II, se uso mutagenesis especlfica de sitio para introducir la sustitucion A174K en el plasmido pET21 que codificaba la Quimera I. Los genes de fHBP mutante se confirmaron por secuenciacion del ADN como se describe para los plasmidos de tipo silvestre anteriores.

Expresion y purificacion de fHBP. Se expresaron fHBP de tipo silvestre, mutantes y quimericas en BL21(DE3) de Escherichia coli (Novagen). Se realizaron purificaciones de fHBP a partir de cultivos de 1 litro. Se cultivaron cultivos de crecimiento exponencial medio (densidad optica a 600 nm de 0,5-0,6) a 37 °C, se indujeron con isopropiltiogalactosido 0,5 mM durante 3-4 h y se cosecharon las bacterias por centrifugation. Se lisaron las celulas mediante incubation con lisozima de clara de huevo de pollo (Sigma) y dos ciclos de congelacion/descongelacion. Se trataron los lisados bacterianos con DNasa y RNasa (Sigma) e inhibidores de proteasa (exentos de de EDTA Complete, Roche), y se aclararon por centrifugacion a 13.000 xg. Las fHBP recombinantes se purificaron por cromatografla de quelato de nlquel usando Ni-NTA agarosa (Qiagen) y los tampones recomendados por el proveedor. Se combinaron las fracciones que contenlan fHBP purificada y se sometieron a dialisis frente a PBS (Roche) que contenla sacarosa al 5 % (p/v) y NaN3 al 0,01 %, se esterilizaron por filtration y se almacenaron a 4 °C.

Preparacion de mAb. Se generaron llneas de celulas de hibridoma de bazo de ratones CD-1 inmunizados con el grupo de variante 2 de fHBP recombinante (gen de la cepa 2996) o grupo de variante 3 (gen de la cepa M1239) usando los metodos descritos anteriormente para la preparacion de las llneas de celulas de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales contra la protelna v.1 de fHBP (Welsch et al., J. Immunol. 2004). Se hicieron precipitar los mAb en los sobrenadantes de cultivo tisular con solution saturada de (NH4)2SO4 al 50 %, y se sometieron a dialisis frente a solucion salina tamponada con fosfato (PBS; Roche). Se determinaron los isotipos de IgG usando reactivos Clonotyping-AP (Southern Biotech).

ELISA de union directa e inhibicion. Se midio la union de los mAb a fHBP recombinante mediante ELISA. Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulacion (Immulon 2B; Thermo Electron Corp.) con 1 mg/ml de fHBP recombinante en PBS, y se incubaron durante la noche a 4 °C. Se bloquearon las placas con PBS que contenla Tween-20 al 0,1 % (Sigma) (PBST) y BSA al 1 % (Sigma). Los anticuerpos primarios eran mAb anti-fHBP (0,016 a

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5 mg/ml) y el anticuerpo secundario era fosfatasa alcalina de conejo anti-IgG de raton (Zymed; 1:5000), cada uno diluido en PBST. Despues de 1 h a temperatura ambiente, se anadio sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma) y se midio la absorbancia a 405 nm despues de 30 min.

Para los ELISA de inhibicion competitiva, se mantuvo un mAb a una concentracion fija suficiente para obtener una DO a 405 nm de 1,0 determinada por ELISA de union directa, como se ha descrito anteriormente. Se anadio un segundo mAb de un isotipo diferente junto con el primer mAb a los pocillos de una placa de microtitulacion recubiertos con el antlgeno como se ha descrito anteriormente, a concentraciones que variaban de 0,4 a 50 mg/ml. El mAb secundario era un conjugado de fosfatasa alcalina de raton anti-IgG especlfico del isotipo. El ELISA se desarrollo como se ha descrito anteriormente.

inhibition de la union del factor H. Se midio la capacidad de un mAb anti-fHBP para inhibir la union de fH a fHBP por ELISA. Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulacion con rfHBP como se ha descrito anteriormente. Se anadieron diluciones que contenlan de 0,016 a 50 mg/ml del mAb a los pocillos junto con 50 mg/ml de fH purificado (Complement Technology, Inc.). Se incubaron las placas durante la noche a 4 °C. Se detecto el fH unido con anticuerpo policlonal de cabra anti-fH (Bethyl Laboratories) (1:1000), seguido de conjugado de raton de fosfatasa alcalina-anti-IgG de cabra (Santa Cruz Biotech) (1:2000). Ambas etapas se realizaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues del lavado, se anadio sustrato y se procedio como se ha descrito anteriormente para el ELISA de union de los anticuerpos.

Transferencia Western. Se cultivo un ml de cultivo bacteriano y se indujo como se ha descrito anteriormente (vease la expresion y purificacion de fHBP anterior). Se recogieron las celulas por centrifugacion y se volvieron a suspender en 0,5 ml de 1 x tampon de muestra LDS (Invitrogen) que contenla 2-ME 25 mM. Se separaron los lisados bacterianos por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida NuPAGE al 4-12 % y tampon de SDS-PAGE MES (Invitrogen). Se transfirieron las protelnas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P; Millipore). Se bloquearon las membranas usando PBST que contenla leche descremada en polvo al 2 % (Carnation, Nestle, Inc.). Se lavaron las membranas, se incubaron con los diferentes mAb anti-fHBP (1 a 5 mg/ml) o, como control para la expresion de la protelna por los diferentes clones, 0,02 mg/ml de mAb Penta-His (Qiagen). Se lavaron las membranas en PBST y se incubaron con una dilucion 1:10.000 de un conjugado de conejo de peroxidasa de rabano picante anti-IgG de raton (Zymed) y se lavaron de nuevo. Se revelaron las membranas con un sustrato quimioluminiscente (ECL+, GE Healthcare) y visualizados en un generador de imagenes 840 (Molecular Dynamics).

inmunizacion de ratones. Se inmunizaron grupos (5 ratones cada uno) de ratones CD-1 de cinco semanas de vida (Charles River) con cuatro dosis que contenlan 20 mg de vacunas de fHBP quimericas o de tipo silvestre, o adyuvante solo en intervalos de dos semanas. Cada vacuna experimental o de control se administro con hidroxido de aluminio o coadyuvante de Freund (FA) (FA completo por primera dosis y FA incompleto para las dosis posteriores).

Actividad bactericida. Se midio la actividad bactericida mediada por el complemento como se ha descrito previamente usando bacterias en fase logarltmica, lavadas, cultivadas en caldo de Mueller-Hinton suplementado con glucosa al 0,25 % y CMP-NANA 0,02 mM a una DO620 de 0,6. El tampon era solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco de (Mediatech, Inc.) que contenla CaCl2 0,9 mM x 2 H2O, MgCl2 0,5 mM x 6 H2O y BSA al 1 % (p/v). La fuente del suplemento era suero humano de un adulto sano sin actividad bactericida intrlnseca detectable. Para el sinergismo de la actividad bactericida de los mAb, se usaron cantidades iguales de dos mAb que variaban de 0,4 a 50 ug/ml (concentracion final). La actividad bactericida (CB50) del antisuero del raton (o combinacion de mAb) se definio por la dilucion (o concentracion de mAb) que dio una reduccion del 50 % en el numero de UFC tras 60 min de incubacion a 37 °C en comparacion con las UFC en el punto temporal 0 de las reacciones de control negativo.

VISION DE CONJUNTO DE LOS EJEMPLOS

En el presente estudio, se uso un grupo de doce anticuerpos monoclonales murinos (mAb) que se hablan preparado contra las protelnas recombinantes representativas de los tres principales grupos de variantes de la protelna de union al factor H (fHBP). Estos grupos de variantes se designan variante 1 (v.1; Welsch et al J Immunol 2004; 172:5606-15), variante 2 (v.2, Beernink et al J Infect Dis 2007; 195:1472-9) y v.3 (Beernink et al, (2008) Infect Immun 76:4232-4240). Como se ilustra mediante el resumen de las caracterlsticas seleccionadas de estos mAb en las tablas de las Figuras 17 y 18, cada uno de estos mAb es bactericida cuando se combina con un segundo mAb. Ademas, JAR 1 y JAR 3 son bactericidas individualmente, segun lo ensayado contra ciertas cepas que expresan v.1 de fHBP.

Los resultados resumidos en la Figura 18 prueban que los epltopos reconocidos por cada uno de los mAb estan expuestos en la superficie en cepas meningococicas encapsuladas y son capaces de interactuar con anticuerpos protectores.

Nueve de estos mAb JAR se usaron como herramientas para determinar restos de aminoacidos de fHBP que contribuyen a los epltopos para la union de estos mAb con el fin de proporcionar las predicciones estructurales sobre

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las ubicaciones de los epltopos de fHBP de diferentes grupos de variantes que interactuan con anticuerpos bactericidas. Entonces, dicha information se podrla usar para construir vacunas de fHBP quimericas que expresan epltopos de mas de un grupo de variantes y que son capaces de generar anticuerpos que confieren protection contra cepas que expresan diferentes variantes de fHBP.

Para mayor comodidad a la hora de facilitar los estudios previos destinados a la identification de regiones bactericidas de fHBP, la protelna se dividio en tres dominios, designados A, B y C (Giuliani et al., Infect Immun 2005; 73: 1151-60). Como se ha tratado anteriormente, el dominio A esta altamente conservado entre los grupos de las variantes v.1 y v.2, mientras que los dominios B y C contienen secuencias que divergen entre las cepas. Anteriormente, el unico epltopo de fHBP conocido que interaccionaba con un mAb bactericida se encontraba en el dominio C en R204 (Giuliani et al. Supra). (Cabe senalar que, en el presente documento, se adopta la convention de la numeration de los restos de aminoacidos que comienza con el primer resto detras de la secuencia senal). Sin embargo, una vacuna de protelna quimerica compuesta del dominio B de una cepa de la variante 3 (B3) fusionado con el dominio C de una cepa de la variante 1 (C1) no genero respuestas bactericidas de proteccion contra las cepas bien con la variante 1 o 3 de fHBP.

Como se expone con mas detalle a continuation, los inventores identificaron la localization de un epltopo definido por dos mAb anti-fHBP, JAR 3 y 5 (denominado en el presente documento epltopo "JAR3/5"), en el dominio B1 entorno al resto G121. JAR 3 se conocla individualmente como bactericida con complemento humano frente a las cepas del complejo 32 de tipo secuencia (ST) (Welsch et al J Immunol 2004; 172: 5606-15), y tanto JAR 3 como JAR 5 cuando se combinaron con otros anticuerpos monoclonales fueron ampliamente bactericidas contra las cepas que expresaban subvariantes de la variante 1 de fHBP (Welsch et al., supra). JAR 3 (Madico et al J Immunol 2006; 177:501-10) y JAR 5 tambien inhibieron la union del factor H (fH) a la superficie de cepas de N. meningitidis encapsuladas. Cabe senalar que, a exception de JAR3/5, el resto de mAb mapeados hasta la fecha resultaron unirse a epltopos que forman parte del dominio C.

Las observaciones relativas a la presencia del epltopo JAR 3/5 en el dominio B sirvieron de fundamento para la fusion de la parte de la protelna de dominio B de v.1 que contenla el epltopo JAR3/5 (por ejemplo, hasta el resto 136) con la parte restante del dominio B y el dominio C completo de la protelna v.2 (Quimera I). La inclusion del epltopo JAR 3/5 de la v.1 en los restos cercanos y que inclulan G121 genero anticuerpos ampliamente protectores contra cepas de subvariantes de v.1 y de v.1.

Ademas, mediante la inclusion de los otros epltopos, tales como JAR 10, 11 y 13, la fHBP quimerica proporciono un polipeptido que genero anticuerpos ampliamente protectores contra cepas de v.2 o v.3. Cuando los ratones fueron inmunizados con vacunas bien de Quimera I o de Quimera II, los animales desarrollaron respuestas de anticuerpos bactericidas sericos contra cepas que expresaban la v.1, la v.2 o la v.3 de fHBP, mientras que, como era de esperar, las respuestas de anticuerpos bactericidas sericos de los ratones de control inmunizados con la v.1 de fHBP recombinante de tipo silvestre se restringieron casi totalmente a las cepas que expresaban la v.1 de fHBP, y las de los ratones de control inmunizados con la v.2 de fHBP recombinante de tipo silvestre se limitaron a v.2 o v.3 (que, segun estudios anteriores, se sabe que reaccionan de forma cruzada (Masignani 2007 J Exp Med, supra y Beernink 2007 J. Infect Dis supra). Los resultados proporcionan una prueba de concepto de que una protelna quimerica individual puede generar anticuerpos que son bactericidas con complemento humano frente a cepas que expresan la fHBP de diferentes grupos de variantes.

Por lo tanto, en contraste con la B3C1 quimerica anteriormente publicada, una vacuna de protelna quimerica compuesta por el dominio A1 (que esta altamente conservada en la variante 1 y 2), la parte N-terminal del dominio B1 que expresa el epltopo JAR 3/5 fusionado con la parte terminal distal del dominio B1 y el dominio C1 genero anticuerpos bactericidas con proteccion cruzada en ratones inmunizados.

El epltopo JAR 11 se expresa en aproximadamente un tercio de las cepas de N. meningitidis productoras de enfermedades en EE.UU. que expresan v.2 o v.3 de fHBP (Beernink 2007 J. Infect Dis, supra). Aproximadamente el 50 por ciento de las cepas negativas en JAR 11 con v.2 o v.3 de fHBP expresan el epltopo JAR 32/35. Por lo tanto, para aumentar la cobertura contra estas cepas, se preparo la vacuna de Quimera II, en la que se introdujo un cambio de aminoacido, A174K, en el dominio C que inactivo el epltopo reconocido por JAR 11 e introdujo el epltopo reconocido por JAR 32/35. A pesar de la expresion de ingenierla genetica del epltopo JAR 11 de la Quimera I y el epltopo JAR 32 de la Quimera II, no hubo diferencias estadlsticamente significativas en las respectivas respuestas de anticuerpos bactericidas sericos de ratones inmunizados con cualquier vacuna contra las cepas que expresaban la v.2 o v.3 de fHBP que eran positivas en JAR 11 o positivas en JAR 32.

Como se establece a continuacion, mas tarde se descubrio que la union del anticuerpo a un epltopo situado cerca del resto 174 (es decir, JAR 11 en algunas cepas, y JAR 32 en otras; vease la Figura 1) no bastaba para generar actividad bactericida mediada por complemento significativa en ausencia de un segundo mAb que se uniera a un epltopo asociado con un par ionico en los restos 180 y 192 (tal como JAR 10 en algunas cepas o JAR 33 en otras (vease la tabla de la Fig. 20)). Entre las cepas de tipo silvestre que expresan v.2 o v.3 de fHBP, la expresion de JAR 32 se suele asociar con la expresion de JAR 33 (por ejemplo, las cepas 03S-0658, M1239 y SK104, tabla de la Figura 8A), mientras que la expresion de JAR 11 normalmente se asocia con la expresion de JAR 10 (vease, por

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ejemplo, las presentes cepas 8047, MD1435 y MD1321, Figura 8A). Dicha vision se referla a la produccion de vacunas de fHBP quimericas eficaces contra las cepas positivas en JAR 32 introduciendo tambien el epltopo JAR 33.

Ademas, como se expone a continuacion, se descubrio que la actividad bactericida de los anticuerpos es mayor cuando dos anticuerpos se unen a sus respectivos epltopos situados a una distancia de aproximadamente 18 a 20 A. Dicho de otra manera, se observo un mayor efecto bactericida cuando dos anticuerpos se unieron a epltopos situados a aproximadamente 18-20 A en la fHBP quimerica en comparacion con el efecto bactericida de estos anticuerpos solos. Por el contrario, la union de dos anticuerpos a epltopos situados a una distancia mayor (por ejemplo, > 27 A) no mejoro la actividad bactericida, lo que se puede deber a la reduction de la capacidad de estos anticuerpos unidos para proporcionar una mejor interaction con C1q de la cascada del complemento. La union de dos anticuerpos a epltopos situados a < 14 A tampoco proporciono una mejor actividad bactericida, lo que se puede deber a un impedimento esterico de la union de un anticuerpo por el otro. Por lo tanto, las fHBP quimericas que contienen epltopos que generan anticuerpos que se unen a epltopos a una distancia de aproximadamente 18-20 A pueden proporcionar una produccion de anticuerpos bactericidas todavla mejor. Los ejemplos de dichos pares de epltopos son aquellos epltopos unidos por JAR 10 y JAR 11; y por JAR 33 y jAr 32/35 (JaR 32 y JAR 35 se unen a los mismos epltopos (o superpuestos)).

El efecto de los polipeptidos fHBP quimericos como vacunas se puede mejorar aun mas mediante la inclusion de epltopos que generan anticuerpos que bloquean la union al fH. Por ejemplo, como se indica a continuacion, cuando los epltopos unidos por JAR 13 (epltopo v.2), JAR 11 (epltopo v.2) y JAR 32/35 (epltopo v.3) son unidos por el anticuerpo, se inhibe la union de fHBP al fH. Por lo tanto, la presencia de dichos epltopos de union al fH en los polipeptidos fHBP quimericos puede proporcionar la produccion de anticuerpos que pueden facilitar protection a traves de esta via.

A continuacion, se exponen los detalles de los estudios que condujeron a dicho descubrimiento.

EJEMPLO 1: IDENTIFICACION DE RESTOS DE AMINOACIDOS DE EPITOPOS DE FHBP IMPORTANTES PARA LA UNION DE MAB JAR 3/5

En las tablas de las Figuras 17 y 18, se resumen las propiedades conocidas seleccionadas de los mAb JAR. En particular, se sabe que JAR 3 y jAr 5 se unen a v.1 o subvariantes de v.1 de fHBP expresadas por las cepas MC58, 4243, M1390 y NZ98/254, pero no a la cepa M6190 (Welsch et al J Immunol 2004; 172:5606-15). Ademas, fHBP expresada por M6190 tenia una arginina en la position 121 (R121), mientras que las fHBP de las cuatro cepas reactivas tenian glicina en la posicion 121 (G121) (Welsch et al J Immunol 2004; 172:5606-15).

Para confirmar que G121 era importante para la union de JAR 3 y JAR 5, se uso la mutagenesis dirigida para cambiar el resto de glicina de la posicion 121 de la secuencia de fHBP de la cepa MC58 por arginina.

Como se ilustra en las transferencias Western de la Figura 1, la sustitucion G121R se tradujo en la perdida de la reactividad de JAR 3 y JAR 5 (Figura 1, Grupo A). El cambio inverso en fHBP de la cepa M6190, R121G, introdujo el epitopo JAR 5 (Figura 1, Grupo A, carril 6) y, en menor medida, el epitopo JAR 3 (Figura 1, Grupo B, carril 6). Las senales mas debiles para la proteina R140G mutante de M6190, en particular, para JAR 3, indicaron que los restos adicionales pueden haber sido importantes para estos epltopos. El mAb de control Penta-His mostro que las proteinas de tipo silvestre y mutantes se produjeron en cantidades similares (Figura 1, Grupo C).

La evidencia adicional de que JAR 3 y JAR 5 reconocieron epltopos superpuestos se derivo de experimentos de inhibition competitiva.

Los resultados se muestran en la Figura 2. JAR 5 (5 mg/ml) inhibio la union de JAR 3 en mas de un 90 % (Figura 2, Grupo A) y la reaction reciproca con JAR 3 inhibio la union de JAR 5 (Figura 2, Grupo B). Por el contrario, no hubo inhibicion detectable de la union de JAR 4 por JAR 3 (50 mg/ml) ni JAR 5 (50 mg/ml) (Figura 2C). JAR 4 tampoco inhibio la union de JAR 3 (Figura 2, Grupo A) ni JAR 5 (Figura 2, Grupo B). El control positivo, una dilution 1:10 de antisuero de conejo anti-v.1 de fHBP, inhibio la union de los tres mAb, mientras que el suero de conejo preinmune y los mAb de control negativo dieron menos del 7 % de inhibicion. Por lo tanto, JAR 3 y JAR 5 reconocen los epltopos superpuestos (o identicos), ya que cada uno de estos mAb inhibio la union del otro a fHBP.

EJEMPLO 2: IDENTIFICACION DE RESTOS DE AMINOACIDOS DE EPITOPOS DE FHBP IMPLICADOS EN LA UNION DE MAB JAR

Para investigar los epltopos definidos por el resto de mAb anti-fHBP del grupo, se uso mutagenesis especifica de sitio para crear anulaciones (KO) de las fHBP recombinantes. Para nueve de los mAb, una fHBP KO carente del resto indicado genero una perdida significativa de la union del correspondiente mAb JAR medida por transferencia Western y/o ELISA (vease la tabla de la Figura 29). Para siete de los mAb, se demostro que el respectivo mAb que era negativo para la union se volvio positivo para la union tras la introduction de una o dos de las sustituciones de aminoacidos correspondientes (vease la tabla de la Figura 29). Tomadas en conjunto, una o ambas estrategias

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sirvieron para identificar correctamente los restos de aminoacidos implicados en la reactividad de nueve de los mAb JAR (Figura 3).

Las Figuras 30-32 proporcionan datos de apoyo para la identificacion de los restos que participan en la union de los mAb JAR. Se analizaron los lisados de E. coli que contenlan plasmidos que expresaban las respectivas fHBP de tipo silvestre y mutantes por transferencia Western usando el mAb JAR apropiado, as! como un anticuerpo de control para detectar un marcador epitopico presente en la fHBP (penta-His).

En concreto, la Figura 30 es una transferencia Western que indica los restos que participan en los epltopos JAR 10 y JAR 33, en la que los lisados de E. coli que contienen plasmidos que expresan las respectivas fHBP mutantes y de tipo silvestre se analizaron mediante transferencia Western con JAR 10 (Grupo A) o mAb Penta-His (Grupo B). La Figura 31 es una transferencia Western que indica un resto implicado en los epltopos JAR 11, JAR 32 y JAR 35, en la que lisados de E. coli que contienen plasmidos que expresan las respectivas fHBP mutantes y de tipo silvestre se analizaron mediante transferencia Western con JAR 32 (Grupo A), JAR 35 (Grupo B), JAR 11 (Grupo C) o mAb Penta-His (Grupo D). La Figura 32 es una transferencia Western que indica el resto implicado en el epltopo JAR 13, en la que lisados de E. coli que contiene plasmidos que expresan las respectivas fHBP mutantes y de tipo silvestre se sondaron con JAR 13 (Grupo A) o mAb Penta-His (Grupo B) y anticuerpo secundario de HRP anti-IgG de raton.

Se ha de senalar que la numeracion de los restos de aminoacidos usados en el presente documento se hace con referencia a la secuencia de protelna madura (es decir, que carece de la senal) de fHBP de la cepa MC58 (es decir, se uso la secuencia de aminoacidos de fHBP de MC58 como la secuencia de aminoacidos de v.1 de fHBP de referencia). Dado que el numero total de restos de aminoacidos de v.2 y/o v.3 de fHBP difiere del numero total de restos de aminoacidos de las v.1 de fHBP, las secuencias de aminoacidos de la protelna v.2 (usando fHBP de la cepa 8047 como la secuencia de aminoacidos de v.2 de referencia) y la v.3 de fHBP (usando la fHBP de la cepa M1239 como la secuencia de aminoacidos de v.3 de referencia) difieren en -1 y +7 restos de aminoacidos, respectivamente, de la de MC58. As! pues, por ejemplo, un resto de leucina (L) situado, segun el sistema de numeracion del presente documento, en la posicion 166 de la secuencia de v.2 o la v.3 de fHBP, en realidad, se encuentra en la posicion 165 de la protelna v.2 y en la posicion 173 de la protelna v.3 basandose en la secuencia de aminoacidos real de estas protelnas, y no segun la numeracion usada en el presente documento basada en la alineacion de estas secuencias con la v.1 de fHBP de MC58.

Ademas, se investigo el papel de los epltopos de mAb JAR en la union a fH por fHBP. La Figura 19 es una serie de graficas que muestran la capacidad de los mAb JAR representativos preparados contra las protelnas recombinantes v.2 (8047), v.3 (MI239) o v.1 (MC58) de fHBP para dar la inhibicion dependiente de la concentracion de la union de fH a v.2 de rfHBP (Grupo A), v.3 de rfHBP (Grupo B), o v.1 de rfHBP (Grupo C) en un ELISA. Estos datos muestran que algunos de los restos de contacto definidos por los epltopos de mAb JAR estan implicados en la union a fH. Por lo tanto, estos datos argumentan la posible inclusion o preservacion de epltopos de mAb JAR que participan en la union a fH, pues el bloqueo de la union de fH a N. meningitidis puede proporcionar un mecanismo adicional de proteccion.

EJEMPLO 3: PRODUCCION DE FHBP QUIMERICAS QUE CONTIENEN EPITOPOS V.1 Y V.2

Como se ha senalado anteriormente, los epltopos definidos por JAR 3 y JAR 5, estan situados dentro del dominio B de la variante 1 de fHBP, comenzando aproximadamente 19 restos de aminoacidos N-terminales con respecto al inicio de la helice a AH2, o aproximadamente 15 restos de aminoacidos N-terminales con respecto a la secuencia de aminoacidos de GEHT. Se construyo una primera fHBP quimerica (denominada en el presente documento "Quimera I") mediante la combinacion de una parte del gen que codifica el dominio A y la parte N-terminal del dominio B hasta el resto G136 de v.1 de fHBP de MC58 con la parte distal del gen que codifica la helice a del dominio B y el dominio C de de la v.2 de fHBP de la cepa 8047. Se uso el resto de la posicion G136 como una posicion de cruce conveniente (el punto en el que la secuencia quimerica "cambio" del de la v.1 de fHBP al de la v.2 de fHBP). G136 es N-terminal de la helice a AH2 y comienza una secuencia de cuatro restos altamente conservados, GEHT, que se muestran en un recuadro en la Figura 4. Los corchetes exteriores muestran la region de la protelna definida previamente como el dominio B (Giuliani et al Infect Immun 2005; 73:1151-60).

Se genero una segunda fHBP quimerica, denominada en el presente documento Quimera II. La Quimera II era identica en la secuencia de aminoacidos a la Quimera I, a excepcion de la introduccion de la sustitucion A174K (K en negrita y subrayada, Quimera II, Figura 4). Cabe senalar que el dominio A no se muestra en la Figura 4 ni en la estructura basada en RMN de la Figura 5, pero estarla unida al extremo N marcado con "N" en la Figura 5.

En la Figura 5, se muestran modelos de las dos vacunas de quimera, Grupos A y B. La Quimera I contiene el epltopo JAR 11, incluyendo el resto A174 (Figura 5, Grupo A). La Quimera II contiene los epltopos JAR 32 y JAR 35, incluyendo el resto K174 (Figura 5, Grupo B). El modelo de las quimeras fHBP se construyo basandose en la estructura de RMN de Cantini et al. J Biol Chem 2006; 281: 7220-7.

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EJEMPLO 4: PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE PROTEINAS MUTANTES

Se expresaron protelnas recombinantes en E. coli como fusiones de hexahistidina (HiS6) C-terminales, que se purificaron por cromatografla de quelatos metalicos. En concreto, las protelnas se expresaron a partir de plasmidos basados en pET21 en BL21(DE3) de E. coli como fusiones de hexahistidina C-terminales. Las protelnas de fusion se aislaron por cromatografla de quelato de metal de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. Las protelnas aisladas se sometieron a dialisis frente a 1 x PBS, sacarosa al 5 % y DTT 1 mM, y se esterilizaron por filtracion. Las protelnas (5 mg cada uno) se separaron en un gel de poliacrilamida al 4-12 % y se tineron con azul de Coomassie.

Los resultados se muestran en la Figura 6. Carril 1, patron de masa; 2, v.1 de fHBP (MC58); 3, v.2 de fHBP (8047); 4, Quimera I de fHBP; 5, Quimera II de fHBP.

EJEMPLO 5: EXPRESION DE EPITOPOS POR PARTE DE ANTIGENOS QUIMERICOS

Se uso un ELISA para evaluar la union dependiente de la concentracion de los anticuerpos mAb anti-fHBP a los antlgenos quimericos aislados del Ejemplo 4. Como era de esperar, JAR 1, que se une a un epltopo v.1 en el dominio C (R204), no se unio a ninguna de las protelnas quimericas (Fig. 7, Grupo A). JAR 5, que es especlfico de un epltopo del dominio B de v.1 de fHBP, y JAR 4, que reacciona de forma cruzada con un epltopo que todavla no esta definido expresado por v.1 y v.2, mostraron una union dependiente de la concentracion identica respectiva con las dos protelnas quimericas en comparacion con las respectivas protelnas v.1 y/o v.2 de tipo silvestre.

La Figura 7, Grupo B, proporciona los datos de union de los mAb JAR 10, 11 y 13, procedentes de un raton inmunizado con v.2 o fHBP. Los tres mAb reconocen los epltopos del dominio C de v.2 de fHBP de la cepa 8047 (Figura 20), y mostraron union dependiente de la concentracion respectiva similar con la protelna Quimera I a la que mostraron con la protelna de control v.2 de rfHBP de tipo silvestre expresada a partir del gen de la cepa 8047 (Fig. 7, Grupo B). Como era de esperar, JAR 11 no se unio a la Quimera II, ya que esta protelna tenia la lisina sustituida con alanina en la posicion 174 (A174K), lo que elimino el epitopo JAR 11 e introdujo el epitopo JAR 32 (Grupo C). JAR 36, que reacciona de forma cruzada con un epitopo aun no definido, pero presente en v.2 de fHBP y v.3 de fHBP se unio a ambas proteinas quimericas y al control de v.2 de rfHBP de tipo silvestre, pero no al control de v.1 de fHBP (Fig. 7, Grupo C). En conjunto, los datos mostraron que las dos fHBP quimericas expresaron epitopos asociados con las proteinas v.1, v.2 y/o v.3 de fHBP, y reaccionaron, como era de esperar, con los diversos mAb de acuerdo con los presentes estudios de la localizacion de los epitopos.

EJEMPLO 6: INMUNIZACION DE RATONES CON FHBP MUTANTES Y QUIMERICAS DOBLES Y RESPUESTAS DE ANTICUERPOS BACTERICIDAS

Se usaron las proteinas que se muestran en la Figura 6 para inmunizar ratones de acuerdo con el programa de la Tabla 1 que figura a continuacion. Se administraron cuatro dosis de la vacuna (20 mg de proteina) IP con intervalos de 2 semanas entre las dosis. Se sangraron los ratones 2,5 semanas despues de dosis 4. CFA = adyuvante completo de Freund; IFA = adyuvante incompleto de Freund; Al(OH)3 = hidroxido de aluminio. A continuacion, CFA/IFA indica que los ratones recibieron una dosis inicial con CFA, y a continuacion, las dosis de refuerzo posteriores con IFA. Cuando se uso Al(OH)3 como adyuvante, todas las dosis se administraron con hidroxido de aluminio como adyuvante.

Tabla 1. Programa de inmunizacion1

Grupo: Protelna fHBP Adyuvante

1: — CFA/IFA

2: v.1 de fHBP CFA/IFA

3: v.2 de fHBP CFA/IFA

4: Quimera I CFA/IFA

5: Quimera II CFA/IFA

6: — Al(OH)3

7: v.1 de fHBP Al(OH)3

8: v.2 de fHBP Al(OH)3

9: Quimera I Al(OH)3

10: Quimera II Al(OH)3

1Los Grupos 1 a 10 consisten en 5 ratones CD-1 en cada uno (N = 60). Cada animal recibio cuatro inyecciones.________________________________________________

La figura 9 resume las respuestas de los anticuerpos en suero de los ratones que recibieron las vacunas quimericas administradas con FA medidas contra la cepa H44/76 (variante 1) y cuatro cepas adicionales que expresan subvariantes de v.1 de fHBP (es decir, proteinas fHBP con relativamente pocas diferencias de aminoacidos (por

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ejemplo, con mas del aproximadamente 88 % y menos del 97 % de identidad de secuencia de aminoacidos) entre la secuencia de la respectiva proteina y la de v.1 de fHBP de H44/76). Los ratones inmunizados con la proteina de control v.1 de rfHBP de tipo silvestre tuvieron altas respuestas a H44/76 (GMT reciproco de casi 10.000) y

respuestas mas bajas y variables contra las otras cuatro cepas de ensayo (que varian desde un GMT de < 1:10

contra la cepa NZ98/254 a un GMT de > 1:1.000 en contra SK084). Los sueros de los ratones inmunizados con la proteina de control v.2 de rfHBP fueron bien negativos para la actividad bactericida (titulos bactericidas < 1:10, cuatro cepas) o debilmente positivos (GMT reciproco de 1:10; cepa SK141). Los ratones inmunizados con vacuna de cualquier proteina quimerica desarrollaron anticuerpos bactericidas sericos contra las cuatro cepas que eran susceptibles a la actividad bactericida de los sueros de los ratones de control inmunizados con la v.1 de rfHBP. Para tres de las cuatro cepas, los respectivos GMT reciprocos de los grupos de vacuna quimericas fueron ~ 1 log

inferiores a los de los ratones que recibieron la vacuna v.1 de rfHBP de control, mientras que las respuestas a la

quinta cepa, SK141, fueron tan altas o mas altas que las de la ratones que recibieron la vacuna de v.1 de rfHBP de control.

La Figura 10 resume las respuestas de anticuerpos bactericidas sericos medidas frente a las seis cepas que expresan las fHBP en los grupos de variantes v.2 o v.3. Tres de las cepas fueron positivas en JAR 11 (grupo de la izquierda) y tres fueron positivas en JAR 32 (grupo de la derecha). Los sueros de los ratones de control inmunizados con v.2 de rfHBP fueron bactericidas contra todas las seis cepas mientras que, con una excepcion (cepa 03S-0658), los titulos bactericidas en suero de los ratones de control inmunizados con v.1 de rfHBP fueron < 1:10. Los sueros de los ratones inmunizados con cualquiera de las vacunas quimericas fueron bactericidas contra las seis cepas. Para cuatro de las cepas (8047, MD1321, M1239 y SK104), los respectivos titulos fueron ~ 1 log inferiores a los de los ratones de control inmunizados con v.2 de rfHBP. Para las dos cepas restantes, 03S-0658 y MD1435) Los titulos generados por una o ambas vacunas quimericas fueron similares a los de los ratones que recibieron la vacuna de v.2 de rfHBP de control positivo. Por lo tanto, en contraste con las vacunas de v.1 o v.2 de rfHBP de control, las vacunas quimericas provocaron respuestas de anticuerpos bactericidas contra las cepas que expresaban fHBP de cada uno de los tres grupos de variantes antigenicas.

La vacuna de Quimera I expreso el epitopo JAR 11, mientras que la vacuna de Quimera II expreso el epitopo JAR 32 (Fig. 1). Sin embargo, con una excepcion, las respectivas respuestas de los ratones inmunizados con cualquiera de las vacunas quimericas cuando se midieron frente a cepas que expresaban fHBP positiva en JAR 11 o en JAR 32 no fueron significativamente diferentes entre si (Fig. 5). La excepcion fue la cepa positiva en JAR 11 MD1435, en la que hubo una tendencia a un mayor GMT reciproco en el grupo de ratones inmunizados con la Quimera I que con la Quimera II (P = 0,06).

Por lo tanto, la sustitucion A174K en la Quimera II, que elimino el epitopo JAR 11 (v.2) e introdujo el epitopo JAR 32/35 (v.3), no aumento apreciablemente las respuestas bactericidas contra una cepa de ensayo que expresaba la proteina v.3.

La Figura 11 resume las respuestas de anticuerpos bactericidas sericos de ratones inmunizados con las vacunas quimericas cuando se absorbieron con hidroxido de aluminio como medida contra el grupo de cepas de ensayo con v.1 de fHBP. En la Figura 12, se muestran los datos correspondientes a las respuestas generadas hacia las cepas de ensayo que expresan la v.2 o la v.3 de fHBP. En general, las respectivas respuestas a las diferentes vacunas absorbidas con hidroxido de aluminio fueron paralelas a las observadas para las vacunas administradas con adyuvante de Freund, aunque, como era de esperar, los titulos fueron algo inferiores con el adyuvante de hidroxido de aluminio.

Los datos anteriores indican que el epitopo JAR3/5, que es comun a casi todas las proteinas v.1, pero que no esta presente en fHBP de las cepas v.2 o v.3, es importante para generar altos titulos de anticuerpos bactericidas hacia la proteina v.1 de fHBP. Dicho descubrimiento de que el epitopo reconocido por JAR 3/5 desempena un papel importante en la generacion de anticuerpos bactericidas v.1 de fHBP proporciona la base para el diseno racional de vacunas de fHBP quimericas adicionales que pueden generar anticuerpos bactericidas contra las cepas que expresan diferentes variantes de la proteina fHBP, en particular, contra cepas que expresan tanto v.1 como v.2 de fHBP. Por ejemplo, las dos vacunas quimericas descritas anteriormente (Quimera I y Quimera II) incluian, desde el extremo N hasta el extremo C:

1) un dominio A (comun tanto a v.1 como a v.2);

2) un dominio B heterologo compuesto de, desde el extremo N hasta el extremo C,

a) una secuencia de aminoacidos contigua de una parte N-terminal de un dominio B de una v.1 de fHBP que

contenia la secuencia de aminoacidos que define el epitopo JAR 3/5, unida operativamente a

b) una secuencia de aminoacidos contigua que define el resto del dominio B, secuencia de aminoacidos que

es la de un dominio B de una v.2 de fHBP, donde la secuencia de aminoacidos de v.2 de fHBP esta presente

en el dominio B heterologo despues de la secuencia de aminoacidos de GEHT; y

3) un dominio C de la proteina v.2.

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EJEMPLO 8: POLIMORFISMOS NATURALES O SINTETICOS DE LOS DOMINIOS B DE V.1 DE FHBP

Como se ha indicado anteriormente, el descubrimiento del epltopo JAR 3/5 en la parte N-terminal de v.1 de fHBP proporciona la base para la construccion de polipeptidos fHBP quimericos adicionales que pueden servir como vacunas para generar anticuerpos bactericidas con reactividad cruzada contra las cepas de N. meningitidis que expresan v.1 de fHBP y las cepas de N. meningitidis que expresan v.2 de fHBP. Para orientar en cuanto a las secuencias de aminoacidos de v.1 de fHBP que encuentran su uso en las vacunas de fHBP quimericas contempladas en el presente documento, se analizaron diversas secuencias de aminoacidos de v.1 de fHBP del dominio B.

La Figura 13 proporciona una alineacion de secuencias de v.1 de fHBP con polimorfismos naturales en la parte N- terminal del dominio B. La conservacion de la secuencia se muestra debajo de la alineacion, indicando el "*" los restos que son identicos; indicando ":" los restos que estan conservados; y “.” Indicando los restos que estan semiconservados a traves de las secuencias alineadas. Las posiciones de las helices a se muestran encima de la alineacion, estando los restos implicados en las helices a indicados en cursiva. El resto G121, que esta implicado en el epltopo JAR 3 y JAR 5, se muestra en negrita y subrayado. Tambien aparece una lisina en la posicion 122 (K122) que es importante en el epltopo JAR 3/5, ya que una cepa que es negativa en la union de JAR 3 y JAR 5, 03S-0408, tiene G121 pero difiere de las cepas reactivas con JAR 3/5 en que tiene serina en la posicion 122 (S122) (datos no mostrados). La secuencia de aminoacidos de GEHT que proporciona el punto en el que la secuencia del dominio B de la quimera "cambia" o "cruza" a la secuencia de aminoacidos de un dominio B de v.2 de la Quimera I y Quimera II (denominado en el presente documento "punto de union") se muestra en el recuadro.

Como se muestra en la Figura 13, hay una serie de polimorfismos naturales en la region de G121 que esta implicado en el epltopo JAR 3/JAR 5. En concreto, una fHBP que contiene R121 (en lugar de G121) no expresa el epltopo JAR 3/JAR 5. Sin embargo, los polimorfismos cercanos a G121, por ejemplo, P117 en NZ98/254 y D121 en 4243, no interfieren con la union de JAR 3 ni JAR 5. Por lo tanto, algunas modificaciones en restos distintos de G121 proporcionan la expresion del epltopo JAR 3/5.

As! pues, la alineacion proporciona orientacion en cuanto a los tipos de sustituciones de aminoacidos que se pueden introducir a la vez que se mantiene la expresion del epltopo JAR 3/5. Dichas sustituciones de aminoacidos pueden ser bien de origen natural (es decir, polimorfismos naturales) o se pueden introducir por medios sinteticos (por ejemplo, polimorfismos recombinantes). Por lo tanto, los dominios B heterologos de los polipeptidos fHBP quimericos contemplados en el presente documento incluyen aquellos que contienen secuencias de dominio B de v.1 con polimorfismos naturales y sinteticos en el dominio B proximal, incluyendo variantes tanto naturales como sinteticas.

EJEMPLO 9: POLIMORFISMO NATURAL O SINTETICO DE DOMINIOS C DE FHBP

Ademas del epltopo JAR 3/5, las fHBP quimericas contempladas en el presente documento generalmente incluyen uno o mas epltopos de los dominios B y C de v.2 de fHBP, estando los epltopos del dominio B de v.2 de fHBP presentes en un lugar C-terminal (es decir, distal) con respecto a la ubicacion del epltopo JAR 3/5 de las v.1 de fHBP, que generalmente es C-terminal a la helice a que sigue a la secuencia de GEHT, que esta compartida entre las v.1 y v.2 de fHBP. Para orientar en cuanto a las secuencias de aminoacidos de la v.2 de fHBP que encuentran uso en las vacunas de fHBP quimericas contempladas en el presente documento, se analizaron diversas secuencias de aminoacidos del dominio B de v.2 de fHBP, as! como el dominio C.

La Figura 14 proporciona una alineacion de secuencias de v.2 de fHBP ilustrativas de la parte distal del dominio B, y proporciona, ademas, secuencias de v.2 de fHBP ilustrativas del dominio C, en las que el dominio B se define generalmente como los restos 101-164, con la numeration basada en la fHBP de MC58 como referencia.

Por lo tanto, basandose en las variantes polimorficas mostradas en las Figuras 13 y 14, se pueden prever facilmente las variaciones en la secuencia de aminoacidos de los dominios B y dominios C de v.2 de fHBP, as! como combinaciones adicionales de los dominios B heterologos de v.1/v.2 con diferente dominios C de v.2 para generar fHBP quimericas adicionales. Las Figuras 13 y 14 proporcionan 7 secuencias de aminoacidos ilustrativas de la region N-terminal del dominio B de v.1 (Figura 10) y 9 secuencias de aminoacidos ilustrativas para la parte distal del dominio B de v.2 de fHBP y para el dominio C de v.2 de fHBP (Figura 11). Por lo tanto, las secuencias de las Figuras 13 y 14 proporcionan al menos 63 quimeras de fHBP diferentes, simplemente mediante la combination de las secuencias de aminoacidos segun lo previsto. Ademas, las alineaciones proporcionan orientacion en cuanto a los restos de aminoacidos que se pueden sustituir.

As! pues, no solo estas secuencias ilustrativas proporcionan una gula para el uso de secuencias de aminoacidos que contienen polimorfismos naturales, sino que tambien proporcionan una gula para la production de variantes generadas sinteticamente (por ejemplo, usando metodos recombinantes). Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones puntuales adicionales en el acido nucleico codificante para proporcionar quimeras de fHBP que expresen otros epltopos deseables tales como el epltopo de v.1 reconocido por JAR 1/mAb 502, que esta en la parte del dominio C (R204), o el epltopo JAR 11 de las Quimeras IV y V. La introduction del epltopo JAR1/mAb 502 puede ofrecer mejor reactividad cruzada contra cepas de v.1 del linaje ST-32 que casi siempre expresan el epltopo JAR 1,

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mientras que la generacion de anticuerpos contra el epltopo JAR 11 puede proporcionar mejores tltulos contra cepas de v.2 (vease Koeberling et al, J Infect Dis 2008, 198:262-270, para una descripcion de v.1.1).

Tambien cabe senalar que, a pesar de la expresion por ingenierla genetica del epltopo JAR 11 en la Quimera I y el epltopo JAR 32 en la Quimera II, no se observaron diferencias estadlsticamente significativas en las respectivas respuestas de anticuerpos bactericidas sericos de los ratones inmunizados con cualquier vacuna contra las cepas que expresan la v.2 o la v.3 de fHBP que eran positivas en JAR 11 o positivas en JAR 32. Sin embargo, el descubrimiento de que la union del anticuerpo a un epltopo situado cerca del resto 174 (es decir, JAR 11 en algunas cepas, y JAR 32 en otras; vease la Figura 3) no basto para generar actividad bactericida mediada por el complemento en ausencia de la generacion de anticuerpos adicionales que se unieran a un segundo epltopo asociado con un par ionico en los restos 180 y 192 (tales como JAR 10 en algunas cepas o JAR 33 en otras (tabla de la Figura 20) indica que es posible mejorar la cobertura contra las cepas positivas en JAR 32 mediante la expresion por ingenierla genetica de un segundo epltopo definido por la union con JAR 33 (es decir, R180/E192). Cabe senalar que, entre las cepas de tipo silvestre que expresan la v.2 o la v.3 de fHBP, la expresion de JAR 32 se suele asociar con la expresion de JAR 33, mientras que la expresion de JAR 11 normalmente se asocia con la expresion de JAR 10 (vease, por ejemplo, el grupo de cepas, Figura 8).

EJEMPLO 10: VACUNAS QUIMERICAS ILUSTRATIVAS ADICIONALES

La Tabla 2 y las Figuras 15 y 16 proporcionan vacunas quimericas hipoteticas adicionales, designadas Quimera III, Quimera IV y Quimera V. Cada una de estas fHBP quimericas se generan usando una estrategia similar a la usada para generar la Quimera I para proporcionar una fHBP quimerica que genere anticuerpos anti-v.1 y v.2 bactericidas.

Como se ilustra en la Figura 15, la Quimera III contiene el dominio A y el dominio B proximal de la subvariante v.1.10 codificada por la fHBP de NZ98/254, y usa el mismo dominio B distal y dominio C de la Quimera I y la Quimera II.

La Quimera IV, que se ilustra en la Figura 15, incluye los dominios A y B proximal de la Quimera I y la Quimera II, pero sustituye los dominios B y C distales de v.2 de la cepa 8047 (v.2.1) de estas quimeras con las de RM1090 (subvariante v.2).

La Quimera V fusiona el dominio A y el dominio B proximal de un subvariante v.1 (cepa NZ98/254) con los dominios B y C distales de la subvariante de v.2 (cepa RM1090).

En la Figura 16, se muestran los cambios de aminoacidos que generaran los respectivos antlgenos de vacuna de Quimera III, IV y V, en comparacion con las respectivas secuencias de aminoacidos del dominio A y B proximal de MC58 y los dominios B y C distales de 8047 usados para preparar la Quimera I. Las Quimeras III y V pueden proporcionar una mayor amplitud de proteccion contra ciertas cepas que expresan subvariantes de v.1, tales como NZ98/254, que no esta cubierta por las vacunas de Quimera I o Quimera II. Las Quimeras IV y V pueden establecer una mayor proteccion contra las cepas de v.3 que estan mal cubiertas por la Quimera I o la Quimera II.

La Tabla 2 proporciona un resumen de la expresion de epltopos observada para la Quimera I y la Quimera II, y, ademas, establece la expresion de epltopos predicha para las Quimeras III, IV y V propuestas.

Tabla 2. Expresion de epltopos predicha (u observada) por protelnas quimericas

: Variante 1 Variante 1/2/3 Variante 2/3

: mAb

mAb: 502/J JAR 3/5 JAR 10 JAR 11 JAR 13 JAR 32/35 JAR 33

: AR1

Dominio: C B C C C C C

Epltopo: R204 G121 K180 y E192 A174 S216 K174 R180, E192

Protelnas de tipo silvestre

MC58 (v.1): 1 1 0 0 0 0 0

NZ98/254 (v.1, sv): 0 1 1 0 0 0 0

8047 (v.2): 0 0 1 1 1 0 0

RM1090 (v.2, sv): 0 0 0 0 0 1 1

Protelnas quimericas

Quimera I: 0 1 1 1 1 0 0

Quimera II: 0 1 1 0 1 1 0

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Quimeras

propuestas

Quimera III

Quimera IV

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1

Quimera V

0

1

0

1

1 = presencia de epltopo; 0 = ausencia de epltopo; sv, subvariante.

El mAb 502 fue descrito por Giuliani et al. (Infect Immun 2005; 73:1151-60). JAR 3 y 5 se prepararon contra una v.1 de fHBP (gen de la cepa MC58) (Welsch et al. J Immunol 2004; 172:5606-15). JAR 10, 11 y 13 se prepararon contra una protelna v.2 (gen de la cepa 2996) (Beernink et al. J Infect Dis 2007; 195:1472-9), y JAR 32, 33 y 35 se prepararon contra una protelna v.3 (gen de la cepa M1239). Cada uno de los mAb reacciona con la protelna de la variante que se uso para inmunizar al raton. Algunos de los mAb tambien reaccionan de forma cruzada con subconjuntos de protelnas de otros grupos de variantes.

Se construyeron las Quimeras I y II que contenlan los restos de aminoacidos 1 a 135 codificados por el gen v.1.1 de fHBP (MC58) fusionados con los restos 136 a 255 del gen v.2.1 de 8047. La Quimera II tambien contiene una mutacion puntual A174K introducida en el dominio C que inactiva el epltopo reconocido por JAR 11 e introduce el epltopo reconocido por JAR 32/35.

Las Quimeras III, IV y V propuestas son ejemplos de fHBP quimericas adicionales con la expresion de epltopos predicha segun lo definido por la union de los respectivos mAb JAR mostrados.___________________________

0

1

0

Otras modificaciones de la fHBP quimerica incluyen la variacion del resto dentro del dominio B heterologo en el que la secuencia del dominio B de v.1 de fHBP finaliza y la secuencia del dominio B de v.2 (o v.2) de fHBP finaliza. En concreto, aunque se uso el resto G136 como la posicion del "cruce" entre las variantes de fHBP, el residuo del "cruce" puede ser cualquier resto C-terminal de la secuencia de aminoacidos que define el epltopo JAR 3/JAR 5, pudiendose seleccionar tambien un resto de M123-S136. Ademas, las posiciones de los restos C-terminales con respecto a G136 (E137-D142), o las posiciones de los restos adyacentes o de dentro de la helice a AH2 (K143- A150, previas a la primera cadena b) pueden ser posiciones adecuadas de restos de cruce. Por lo tanto, en el presente documento, se contempla una serie de diferentes posiciones de los restos de cruce, pudiendo estar el resto de cruce situado detras de G121 del epltopo JAR 3/5 (G121) a traves de e incluyendo A174 del epltopo JAR 11, donde la presencia del epltopo JAR 3/5 se puede evaluar usando metodos de inmunoensayo conocidos en la tecnica. (Cabe senalar que la numeracion anterior se basa en el numero de secuencia de aminoacidos de la secuencia de referencia de fHBP de MC58).

EJEMPLO 11: EXPRESION DE FHBP QUIMERICA EN N. MENINGITIDIS

La Figura 33 muestra una transferencia Western de muestras de N. meningitidis que expresan la fHBP de tipo silvestre (WT) o una fHBP quimerica (Quimera I (vease la Fig. 23)). La Quimera I correspondla a una fHBP de longitud completa y ademas inclula la secuencia senal (pero carecla de cualquier marcador de epltopo tal como un marcador Penta-His) Como se muestra en la Figura 33, las celulas bacterianas transformadas con el plasmido que contiene el gen que codifica la Quimera I eran positivas en ambos mAb anti-fHbp, mientras que las celulas de H44/76 transformadas con el plasmido que contiene el gen que codifica la v.2 de fHbp o H44/76 WT solo reaccionan con JAR 3 (v.1) y las celulas de 8047 solo reaccionan con JAR 13 (v.2).

DEPOSITO DE LA ATCC

Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales JAR 4, JAR 5, JAR 11 y JAR 32 fueron depositados en virtud de los terminos del Tratado de Budapest en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, EE.UU. (ATCC) en la fecha indicada en la siguiente tabla, y recibieron las denominaciones expuestas en la siguiente tabla.

Deposito de la ATCC n.° (Datos del deposito): Material depositado

PTA-8943 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 4

PTA-8941 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 5

PTA-8940 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 10

PTA-8938 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 11

PTA-8942 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 32

PTA-8939 (7 de febrero, 2008): Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal JAR 33

Cabe senalar que el mAb JAR 5 se une especlficamente a un epltopo que al menos se solapa con el epltopo unido especlficamente por el mAb JAR 3, y que el mAb JAR 32 se une especlficamente a un epltopo que al menos se solapa con el epltopo unido especlficamente por el mAb JAR 35.

Estos depositos se realizaron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos con fines del procedimiento de patentes y el reglamento en virtud del mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del deposito durante 30 anos a

partir de la fecha del deposito y durante al menos cinco (5) anos despues de la solicitud mas reciente de entrega de una muestra del deposito recibida por el depositario. Los depositos se pondran a disposicion del publico por la ATCC en virtud de los terminos del Tratado de Budapest, y estaran sujetos a un acuerdo entre el Hospital Infantil y el Centro de Investigacion de Oakland y la ATCC (el cesionario de la presente solicitud) que garantice que todas las

5 restricciones impuestas por el depositario sobre la disponibilidad al publico del material depositado se eliminaran de

manera irrevocable tras la concesion de la correspondiente patente estadounidense, que garantice la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del deposito al publico tras la publicacion de la patente de EE.UU. pertinente o tras la apertura a inspeccion publica de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y que garantice la disponibilidad de la progenie a cualquiera determinado por el Comisionado 10 estadounidense de Patentes y Marcas que tenga derecho a la misma de acuerdo con 35 USC § 122 y las reglas del Comisionado conforme a la misma (incluyendo 37 C.F.R. § 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El/los cesionario/s de la presente solicitud ha/n acordado que, en caso de muerte, perdida o destruction de un cultivo de los materiales en deposito cultivado en condiciones adecuadas, los materiales seran reemplazados con

15 prontitud con respecto a la notification por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se ha de

interpretar como una licencia para poner en practica la invention en contravention de los derechos otorgados en virtud de la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una protelna quimerica de union al factor H (fHBP) que comprende, del extremo N al extremo C:

a) una primera secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGK de un dominio B de la variante 1 (v.1) de fHBP, en la que el dominio B comprende una secuencia GEHT; y

b) ligada operativamente a a), una segunda secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica a una secuencia de aminoacidos contigua de una variante 2 (v.2) o una variante 3 (v.3) de fHBP;

en la que la primera y la segunda secuencias de aminoacidos estan ligadas operativamente en un punto de union situado en un sitio no mas de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no mas de 34 restos C-terminal de la secuencia GEHT,

en la que el punto de union esta ubicado en un dominio B para proporcionar un dominio B heterologo o en un dominio C para proporcionar un dominio C heterologo de la fHBP quimerica;

en la que la fHBP quimerica comprende el epltopo unido por el anticuerpo JAR 11 (ATCC PTA-8938) o el anticuerpo JAR 32 (ATCC PTA-8942);

en la que la fHBP quimerica comprende el epltopo unido por el anticuerpo JAR 5 (ATCC PTA-8941); en la que cuando el punto de union esta ubicado en el dominio B, el punto de union esta ubicado en un sitio no mas de 13 restos N-terminal de la secuencia GEHT y no mas de 24 restos C-extremo Con respecto a la secuencia GEHT;

en la que cuando el punto de union esta ubicado en el dominio C, el punto de union esta ubicado en un sitio no mas de 34 aminoacidos C-extremo Con respecto a la secuencia GEHT.
2. La protelna quimerica de union al factor H (fHBP) de la reivindicacion 1 que comprende:

a) un dominio B heterologo que comprende, del extremo N al extremo C,

i) una secuencia de aminoacidos contigua N-terminal de un dominio B de la variante 1 (v.1) de la protelna de union al factor H (fHBP); y

ii) una secuencia de aminoacidos contigua C-terminal de un dominio B de la variante 2 (v.2) de la fHBP o un dominio B de la variante 3 (v.3) de la fHBP; y

b) un dominio C ligado operativamente al dominio B heterologo de a), en donde el dominio C comprende una secuencia de aminoacidos contigua de un dominio C de la variante 2 (v.2) de la fHBP o un dominio C de la variante 3 (v.3) de la fHBP;

comprendiendo la fHBP quimerica el epltopo unido por el anticuerpo JAR 5 (ATCC PTA-8941).
3. La fHBP quimerica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la secuencia de aminoacidos contigua del dominio B de v.1 de fHBP comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80 % identica a la secuencia de aminoacidos contigua de

LTAFQ TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIA,

TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD o QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD.
4. La fHBP quimerica de la reivindicacion 3, en la que la secuencia de aminoacidos del dominio B heterologo comprende una o mas de:

una sustitucion de leucina (L) con la fenilalanina (F) en la posicion del resto 9 de QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GK;

una sustitucion de una valina (V) o un acido glutamico (E) con isoleucina (I) en la posicion del resto 4 de QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GK;

una sustitucion de una prolina (P) con serina (S) en la posicion del resto 17 de QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GK;

una sustitucion de un acido aspartico (D) con histidina (H) en la posicion del resto 19 de QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GK;

una sustitucion de una arginina (R) con glutamina (Q) en la posicion del resto 28 de la secuencia QSHSALTAFQ TE-QIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD; y

una sustitucion de valina (V) con alanina (A) en la posicion del resto 35 de la secuencia QSHSALTAFQ TEQIQDSEHS GKMVAKRQFR IGDIAGEHTA FNQLPD.
5. La fHBP quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la secuencia de aminoacidos del dominio B heterologo comprende una sustitucion de aminoacido en una o mas posiciones que son polimorficas en una variante 1 de fHBP natural.

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15

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25

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6. La fHBP quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la fHBP quimerica comprende una secuencia de aminoacidos de un dominio A de una v.1, v.2 o v.3 de fHBP en posicion N-terminal del, y ligado operativamente al dominio B heterologo.
7. La fHBP quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la fHBP quimerica comprende al menos un epltopo que cuando es unido por un anticuerpo bloquea la union de fH a fHBP.
8. La fHBP quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la fHBP quimerica comprende un par de epltopos que generan anticuerpos que, cuando se unen a sus respectivos epltopos, presentan actividad bactericida.
9. La fHBP quimerica de la reivindicacion 8, en la que el par de epltopos es el epltopo unido por al anticuerpo JAR 10 (ATCC PTA-8940) y el epltopo unido por al anticuerpo Jar 11 (ATCC PTA-8938).
10. La fHBP quimerica de la reivindicacion 8, en la que el par de epltopos es el epltopo unido por al anticuerpo JAR 33 (ATCC PtA- 8939) y el epltopo unido por al anticuerpo Jar 32 (AtCc PTA-8942).
11. La fHBP quimerica de la reivindicacion 1, en la que el punto de union esta situado en el dominio C, de manera que la fHBP quimerica comprende un dominio C heterologo, en donde el dominio C heterologo comprende una secuencia de aminoacidos N-terminal KLTYTIDFA.
12. Un acido nucleico que codifica la fHBP quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Una celula hospedadora recombinante que contiene el acido nucleico de la reivindicacion 12.
14. Un metodo de produccion de una fHBP quimerica, metodo que comprende:

cultivar la celula hospedadora recombinante de la reivindicacion 13 en condiciones adecuadas para la expresion de la fHBP quimerica; y aislar la fHBP quimerica.
15. Una composicion inmunogenica que comprende una fHBP quimerica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
16. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 15, en la que la fHBP quimerica esta en un preparado de veslculas realizado a partir de una cepa de Neisseria meningitidis.
17. Una fHBP quimerica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o la composicion de las reivindicaciones 15 o 16 para su uso en un metodo de vacunacion de un mamlfero.