CN101951949B

CN101951949B - 脑膜炎球菌疫苗制剂

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Publication number: CN101951949B
Application number: CN2008801213328A
Authority: CN
Inventors: M·肯托尼; J·卡扎尔; D·欧哈根; M·辛格; M·尤戈佐力
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: CA2925217A1; MX340096B; CO6270339A2; DK2200642T3; ATE553774T1; RU2498815C2; SI2200642T1; CN101951949A; AU2008313424B2; NZ584683A; CA2702871A1; RU2010119947A; BR122016015627A2; JP2013216704A; BRPI0818545A2; WO2009050586A1; PT2200642E; US20100285069A1; HRP20120433T1; EP2462949A3

Abstract

针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌(Men-B)的疫苗的双重制剂包含(i)水包油乳液佐剂和(ii)冻干形式的Men-B免疫原性组分。冻干的Men-B抗原在用于给予患者时可重建成含佐剂的液体形式。发现该制剂获得优秀的稳定性和免疫原性结果。冻干组分还可包含血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎奈瑟球菌的一种或多种偶联荚膜糖。

Description

脑膜炎球菌疫苗制剂

技术领域

本发明属于配制脑膜炎球菌疫苗的领域。

背景技术

目前研究了针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(″Men-B″)的各种疫苗，但它们具有共同的特征。

以下公司生产的外膜囊泡(OMV)产品均包含氢氧化铝佐剂：诺华公司(Novartis)的MENZB^TM、芬雷研究院(Finlay Institute)的VA-MENGOC-BC^TM、挪威公共卫生研究院(Norwegian Institute of Public Health)的MENBVAC^TM和荷兰疫苗研究院(Netherlands Vaccine Institute)的HEXAMEN^TM和NONAMEN^TM。参考文献1中诺华公司报道的“血清群B脑膜炎球菌通用疫苗”也包含氢氧化铝佐剂，与最近参考文献2中报道的二价OMV疫苗一样。

发明内容

在诺华Men-B疫苗的开发中，本发明人发现最佳免疫原性需要有佐剂存在。此外，他们发现吸附于氢氧化铝为疫苗抗原提供优良的储存稳定性。然而，为避免使用铝盐，要找寻替代方法。

Men-B疫苗利用非铝佐剂是已知的。例如，参考文献3报道了利用MF59水包油乳液作为Men-B疫苗的佐剂，参考文献4描述了利用免疫刺激性寡核苷酸和/或MF59作为佐剂。虽然利用MF59获得优秀的免疫原性，并且随后的研究显示与氢氧化铝相比，该佐剂可增强Men-B疫苗的菌株覆盖度，但进一步的研究出乎意料地显示含水包油乳液作为佐剂的Men-B免疫原的长期稳定性差。因此，本发明的目的是提供在使用水包油乳液佐剂时能改善Men-B疫苗的储存稳定性的方法。

以前关于水包油乳液的经验来自流感疫苗领域。FLUAD^TM产品包含MF59乳液，其采用预混合的液体形式在一个容器中销售(“单瓶”方法)。目前发现该预混合制剂为Men-B疫苗提供的稳定性不佳。

作为水包油乳液疫苗的“单瓶”制剂的替代方案，“两瓶”方法应用于流感(例如，参见参考文献5)、HSV(例如，参考文献6)和HIV(例如参考文献7)，其中均是液体形式的疫苗和乳液一起销售，以便在使用时临时混合。

本发明对Men-B疫苗采用了不同的方法，其利用(i)水包油乳液佐剂和(ii)冻干形式的Men-B免疫原性组分组成的双重制剂。可在使用时将冻干的Men-B抗原重建成含佐剂的形式，从而便于给予患者。现已发现该制剂能获得优秀的稳定性和免疫原性结果。

本发明人还发现，当包含血清群A、C、W135和/或Y(Men-A、-C、-W135和-Y)脑膜炎奈瑟球菌的一种或多种偶联糖时，冻干的组分能维持效力。采用单一冻干组分，对包括血清群B在内的多种脑膜炎球菌血清群进行免疫的抗原组合尤其有优势。

因此，本发明提供一种试剂盒，其装有：(i)含有佐剂的第一容器，所述佐剂包含水包油乳液；和(ii)含有冻干抗原性组合物的第二容器，所述组合物包含引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答的免疫原。所述冻干的抗原性组合物还可包含血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎球菌中一种或多种的偶联荚膜糖。

本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，其包括混合以下组分的步骤：(i)包含水包油乳液的佐剂；和(ii)包含引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答的免疫原的冻干抗原性组合物。冻干的抗原性组合物还可包含血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎球菌中一种或多种的偶联荚膜糖。

本发明还提供包含以下组分的冻干抗原性组合物：(i)引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答的免疫原，和(ii)血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎球菌中一种或多种的偶联荚膜糖。该冻干组合物适合利用包含水包油乳液的佐剂重建，还适合用作本发明的试剂盒组合。

冻干的抗原性组合物

本发明利用包含引发针对Men-B的免疫应答的免疫原的冻干抗原性组合物。其可任选包含Men-A、Men-C、Men-W135和/或Men-Y中一种或多种的偶联荚膜糖。

Men-B免疫原可包含Men-B细菌的膜泡和/或Men-B重组蛋白和/或Men-B脂-低聚糖(LOS)。

冻干Men-B OMV是本领域已知的[8]，但这些OMV随后与磷酸铝佐剂一起给予。因此，当与水包油乳液佐剂混合时的抗原稳定性问题未见报道。类似地，冻干脑膜炎球菌偶联物抗原是已知的，包括随后用MF59重建[9]，但未与任何Men-B抗原组合。

包含囊泡的Men-B组分

用作Men-B疫苗组分的囊泡包括通过破坏细菌外膜形成包括外膜的蛋白质组分的囊泡从而获得的任何蛋白脂质囊泡(proteoliposomic vesicle)。因此，该术语包括OMV(有时称为′细胞泡′)、微囊泡(MV[10])和′天然OMV′(′NOMV′[11])。

MV和NOMV是在细菌生长期间自发形成并释放入培养基的天然产生膜泡。可在培养基中培养奈瑟球菌，分离培养基中的完整细胞与较小的MV(例如，通过过滤或低速离心从而只沉淀细胞而不沉淀较小的囊泡)，然后从除去细胞的培养基中收集MV(例如，通过过滤、差速离心或MV凝聚、高速离心以沉淀MV)，从而获得MV。通常可根据培养中MV的产生量选择用于产生MV的菌株，例如参考文献12和13描述了MV产量高的奈瑟球菌。

OMV从细菌人工制备，可采用洗涤剂处理(例如，用脱氧胆酸)，或通过非洗涤剂方式(例如，参见参考文献14)制备。获得合适OMV制品的方法见，例如本文引用的参考文献。形成OMV的技术包括用胆酸盐洗涤剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸(ursocholic acid)等的盐，优选用脱氧胆酸钠[15和16]处理奈瑟球菌)在足够高从而不会沉淀洗涤剂的pH下处理细菌[17]。可采用诸如超声处理、匀浆、微流化、空泡形成、渗透压休克、研磨、弗氏细胞压碎、掺混等技术，基本上在没有洗涤剂存在下[14]实施其它技术。不用或用少量洗涤剂的方法可保留有用的抗原，例如NspA[14]。因此，某种方法可利用含约0.5％或更少，例如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或不含脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

制备OMV的有用方法描述于参考文献18，其涉及对粗制OMV进行超滤，而非高速离心。该方法在超滤后可包括超离心步骤。

可从任何Men-B菌株制备囊泡以便用于本发明。它们可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(immunotype)(例如，L1；L2；L3；L3，3，7；L10等)。脑膜炎球菌可来自任何合适谱系，包括超侵袭性和超毒力谱系，例如以下7种超毒力谱系的任一种：亚群I；亚群III；亚群IV-I；ET-5复合体；ET-37复合体；A4簇；谱系3。通过多位点酶电泳(MLEE)定义这些谱系，但也采用多位点序列分型(MLST)分类脑膜炎球菌[参考文献19]，例如，ET-37复合体通过MLST分类为ST-11复合体，ET-5复合体是ST-32(ET-5)，谱系3是ST-41/44，等等。可从具有以下亚型之一的菌株制备囊泡：P1.2；P1.2，5；P1.4；P1.5；P1.5，2；P1.5，c；P1.5c，10；P1.7，16；P1.7，16b；P1.7h，4；P1.9；P1.15；P1.9，15；P1.12，13；P1.13；P1.14；P1.21，16；P1.22，14。

可从野生型Men-B菌株或突变型菌株制备本发明所用的囊泡。例如，参考文献20公开了从含修饰的fur基因的脑膜炎奈瑟球菌获得的囊泡制品。参考文献27指导了nspA表达上调应与porA和cps敲除相伴。用于OMV产生的脑膜炎奈瑟球菌的其它敲除突变体见参考文献27-29。参考文献21披露了其中fHBP上调的囊泡。参考文献22披露了从经修饰以表达6种不同PorA亚型的菌株构建囊泡。还可利用通过敲除参与LPS生物合成的酶获得的内毒素水平低的突变型奈瑟球菌[23、24]。这些或其它突变体均可用于本发明。

因此，在一些实施方式中，本发明所用的Men-B菌株可表达多于一种的PorA亚型。已构建了6-价和9-价PorA菌株。菌株可表达PorA亚型中的2、3、4、5、6、7、8或9种：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1和/或P1.18-1，3，6。在其它实施方式中，相对于野生型水平(例如，相对于菌株H44/76，如参考文献30所述)，可下调菌株的PorA表达，例如将PorA含量降低至少20％(例如，≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％等)，或者甚至敲除。

在一些实施方式中，Men-B菌株可过表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可过表达NspA、蛋白287[45]、fHBP[21]、TbpA和/或TbpB[25]、Cu，Zn-超氧化物歧化酶[25]等。

在一些实施方式中，Men-B菌株可包含参考文献26-29中公开的一个或多个敲除和/或过表达突变。用于下调和/或敲除的优选基因包括：(a)Cps、QrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GaIE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Ope、PiIC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[26]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FipB、GaIE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Ope、PhoP、PiIC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[27]；(c)ExbB、ExbD、rmpM、QrA、CtrB、CtrD、GaIE、LbpA、LpbB、Opa、Ope、PiIC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[28]；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[29]。

在一些实施方式中，如果利用突变型菌株，其可具有以下特征中的一种或多种，或全部：(i)下调或敲除LgtB和/或GalE以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)上调TbpA；(iii)上调Hsf；(iv)上调Omp85；(v)上调LbpA；(vi)上调NspA；(vii)敲除PorA；(viii)下调或敲除FrpB；(ix)下调或敲除Opa；(x)下调或敲除Ope；(xii)删除cps基因复合体。截短的LOS可以不包含唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如其可以是半乳糖-缺陷型LOS。LOS可不具有α链。

如果LOS存在于囊泡中，则可能处理囊泡从而连接其LOS与蛋白质组分(“细胞泡内”偶联[29])。

本发明可利用不同菌株的囊泡的混合物。例如，参考文献30公开了包含多价脑膜炎球菌囊泡组合物的疫苗，所述组合物包含衍生自具有在使用国家流行的血清亚型的脑膜炎球菌菌株的第一囊泡和衍生自无需具有在使用国家流行的血清亚型的菌株的第二囊泡。参考文献31还公开了不同囊泡的有用组合。在一些实施方式中，就利用L2和L3免疫型中各自菌株的囊泡组合。

可从Men-B以外的血清群制备基于囊泡的抗原(例如，参考文献17公开了Men-A的方法)。因此，本发明可利用Men-B以外的血清群(例如，A、C、W 135和/或Y)制备的囊泡。然而，主要集中在Men-B。

包含重组蛋白的Men-B组分

也有报道将重组蛋白用作针对Men-B的疫苗免疫原。例如，参考文献32-40报道了各种抗原。这种抗原可单用或联用。如果混合多种纯化的蛋白质，则利用10种或少一些(例如，9、8、7、6、5、4、3、2)的纯化抗原是有帮助的。

参考文献1和40公开了特别有用的抗原组合，因此，组合物可包含以下的1、2、3、4或5种：(1)′NadA′蛋白；(2)′fHBP′蛋白，以前称为′741′；(3)′936′蛋白；(4)′953′蛋白；和(5)′287′蛋白。其它可能的抗原组合可包含转铁蛋白结合蛋白(例如，TbpA和/或TbpB)和Hsf抗原。其它可能的纯化抗原包括含有以下氨基酸序列之一的蛋白质：参考文献32的SEQ ID NO：650；参考文献32的SEQ ID NO：878；参考文献32的SEQ ID NO：884；参考文献33的SEQ ID NO：4；参考文献34的SEQ ID NO：598；参考文献34的SEQID NO：818；参考文献34的SEQ ID NO：864；参考文献34的SEQ ID NO：866；参考文献34的SEQ ID NO：1196；参考文献34的SEQ ID NO：1272；参考文献34的SEQ ID NO：1274；参考文献34的SEQ ID NO：1640；参考文献34的SEQ ID NO：1788；参考文献34的SEQ ID NO：2288；参考文献34的SEQ ID NO.2466；参考文献34的SEQ ID NO：2554；参考文献34的SEQ IDNO：2576；参考文献34的SEQ ID NO.2606；参考文献34的SEQ ID NO：2608；参考文献34的SEQ ID NO：2616；参考文献34的SEQ ID NO：2668；参考文献34的SEQ ID NO：2780；参考文献34的SEQ ID NO：2932；参考文献34的SEQ ID NO：2958；参考文献34的SEQ ID NO：2970；参考文献34的SEQ ID NO：2988；或包含某种氨基酸序列的多肽，该序列：(a)与所述序列具有50％或更高相同性(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)；和/或(b)包含所述序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中n是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含相关序列的表位。可包含多于一种(例如，2、3、4、5、6)的这些多肽。

fHBP抗原有三种不同变体[39]。本发明的Men-B组分可包括一种fHBP变体，但其包含两种或所有三种变体中每一种的fHBP是有用的。因此，其可包含两种或三种不同的纯化fHBP的组合，其选自：(a)第一蛋白，包含与SEQID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含与SEQ ID NO：2有至少b％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；和/或(c)第三蛋白，包含与SEQ ID NO：3有至少c％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。

a的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。b的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95.96、97、98、99、99.5或更高。C的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。a、b和c的值彼此无关。

x的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值彼此无关。

在一些实施方式中，fHBP蛋白脂质化，例如在N-末端半胱氨酸脂质化。在其它实施方式中，它们不脂质化。

基于纯化蛋白的有用组合物包含以下多肽的组合物：(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的第一多肽；(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO：5或4SEQ IDNO：7的第一多肽；和(iii)具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的第一多肽。参见参考文献1和40。

包含LOS的Men-B组分

基于脂低聚糖的脑膜炎球菌疫苗已有报道。LOS可以其本身使用，或偶联于运载体。偶联之时，偶联可经LOS中的脂质A蛋白或通过任何合适的部分，例如KDO残基。如果LOS的脂质A部分不存在，则这种备选连接是必要的。

LOS可来自任何免疫型，例如L2、L3、L7等。

优选利用修饰形式，而非利用天然LOS。可通过化学方法实现这些修饰，但敲除Men-B中负责某些生物合成添加的酶更方便。例如，可修饰LOS以除去天然乳糖-N新四糖单位的至少末端Gal，这种修饰可通过敲除一个或多个相关酶得以实现。可敲除负责加入天然LOS中两个末端单糖(唾液酸和半乳糖)的酶，从而恰好消除末端Sia或消除Sia-Gal二糖。例如，敲除lgtB基因除去了Sia-Gal。敲除galE基因还提供有用的修饰LOS。可敲除脂质A脂肪转移酶基因[41]。

可从LOS中除去至少一个一级O-连接脂肪酸[42]。还可利用每个LOS分子的二级酰基链数量减少的LOS[43]。LOS可没有α链。

LOS可包含GlcNAc-Hep₂磷酸乙醇胺-KDO₂-脂质A[44]。

混合的Men-B组分

本发明可利用囊泡，纯化的多肽或LOS作为Men-B抗原。还可利用这三种抗原的组合，例如(i)囊泡+纯化的多肽；(ii)囊泡+LOS；(iii)纯化的多肽+LOS；或(iv)囊泡+纯化的多肽+LOS。可通过分别制备各组分，然后混合它们来制备这些组合。例如，参考文献45公开了将纯化的蛋白质加入囊泡以提供效力更广的组合物。

血清群A、C、W135和Y

针对血清群C的偶联单价疫苗已被批准用于人，其包含MENJUGATE^TM、MENINGITEC^TM和NEISVAC-C^TM。已知血清群A+C的偶联物的混合物[46，47]，已报道了血清群A+C+W135+Y的偶联物的混合物[48-51]，并于2005被批准作为水性MENACTRA^TM产品上市。

本发明所用的冻干组分可包含血清群A、C、W135和Y中1、2、3或4种的荚膜糖的一种或多种偶联物，例如A+C，A+W135，A+Y，C+W135，C+Y，W135+Y，A+C+W135，A+C+Y，A+W135+Y，A+C+W135+Y，等等。优选包含血清群A、C、W135和Y中所有四种的糖的组分。

血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，具有部分C3和C4位的O-乙酰基化。C-3位的乙酰化可以是70-95％。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但在C-3位保留OAc也是有用的。在一些实施方式中，血清群A糖中至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％或更多)的甘露糖胺残基的C-3位被O-乙酰基化。乙酰基可被封闭基团取代以避免水解[52]，这种改性的糖仍然是本发明涵义内的血清群A糖。

血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，或“NeuNAc”)的均聚物。糖结构为→9)-Neu p NAc 7/8OAc-(α2→。大多数血清群C株在唾液酸残基的C-7和/或C-8位具有O-乙酰基团，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[53，54]。OAc基团的存在与否产生独特表位，抗体与糖结合的特异性可影响其对O-乙酰化(OAc-)和脱-O-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[55-57]。本发明中使用的血清群C糖可以从OAc+或OAc-菌株获得。获得许可的MenC偶联物疫苗包含OAc-(NEISVAC-C^TM)和OAc+(MENJUGATE^TM和MENINGITEC^TM)糖。在一些实施方式中，用于制备血清群C偶联物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16，血清亚型P1.7a，1等。因此，可使用C:16:P1.7a，1OAc+菌株。也可使用血清亚型P1.1的OAc+菌株，例如C11菌株。

血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。类似于血清群C糖，其具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位[58]。结构如下：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。

血清群Y糖类似于血清群W135糖，只是二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。类似于血清群W135，在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[31]。血清群Y的结构如下：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。

本发明中使用的糖可以如上所述O-乙酰化(例如，在天然荚膜糖中所见相同的O乙酰化模式)，或者可以在糖环的一个或多个位置部分或完全脱-O-乙酰化，或者与天然荚膜糖相比，它们可以超-O-乙酰化。

偶联物中的糖部分可包括由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或可包括全长糖的片段，即比细菌中存在的天然荚膜糖短的糖。因此，糖可以解聚，解聚发生在糖纯化期间或者之后、但在偶联之前。解聚可降低糖链长度。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[48]。将过氧化氢加入糖中(例如，H₂O₂终浓度为1％)，然后温育混合物(例如在约55℃)直到实现所需的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[49]。其他解聚方法是本领域已知的。用于制备本发明所用偶联物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可利用解聚获得对于免疫原性最佳的链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。在一些实施方式中，糖具有以下平均聚合度(Dp)：A＝10-20；C＝12-22；W135＝15-25；Y＝15-25。在分子量方面，而非Dp，对于所有血清群，有用的范围是：＜100kDa；5kDa-75kDa；7kDa-50kDa；8kDa-35kDa；12kDa-25kDa；15kDa-22kDa。

在一些实施方式中，脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y各自的糖的平均分子量超过50kDa，例如≥75kDa，≥100kDa，≥110kDa，≥120kDa，≥130kDa，等等[59]，甚至最高达1500kDa，具体通过MALLS测定。例如：MenA糖可以是50-500kDa，如60-80kDa；MenC糖可以是100-210kDa；MenW135糖可以是60-190kDa，如120-140kDa；和/或MenY糖可以是60-190kDa，如150-160kDa。

重建疫苗中每种血清群的脑膜炎球菌糖的质量通常在1微克到20微克之间，例如每种血清群2-10微克，或约4微克或约5-10微克。如果包括来自多于一种的血清群的偶联物，它们可以基本上相等质量存在，例如各血清群糖的质量彼此在±10％内。作为相等比例的替代形式，可利用双倍质量的血清群A的糖。因此，疫苗可包含10微克MenA糖以及各5微克的MenC、W135和Y糖。

优选的运载体蛋白是细菌毒素，如白喉毒素或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。这些运载体通常用于偶联物疫苗中。特别优选CRM₁₉₇白喉毒素突变体[60]。其它合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[61]、合成肽[62，63]、热激蛋白[64，65]、百日咳蛋白[66，67]、细胞因子[68]、淋巴因子[68]、激素[68]、生长因子[68]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[69]如N19[70]、流感嗜血杆菌的D蛋白[71-73]、肺炎球菌溶血素[74]或其无毒衍生物[75]、肺炎球菌表面蛋白PspA[76]、铁摄取蛋白[77]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[78]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[79]，等等。一种运载体蛋白可携带多种不同血清群的糖[80]，但不优选这种配置。如果冻干的组分包含多于一种脑膜炎球菌血清群的偶联物，则各种偶联物可利用不同运载体蛋白(例如，一种血清群偶联于CRM197，另一种偶联于破伤风类毒素)或者它们可利用相同的运载体蛋白(例如，两种血清群的糖分别偶联于CRM197，然后混合)。

可使用糖∶蛋白质比例(w/w)在1∶5(即蛋白质过量)和5∶1(即糖过量)之间的偶联物，例如比例在1∶2到5∶1之间，比例在1∶1.25到1∶2.5之间。如参考文献81所述，混合物中不同的脑膜炎球菌血清群偶联物具有不同的糖∶蛋白质比例，例如一种的比例为1∶2到1∶5之间，而另一种的比例在5∶1到1∶1.99之间。

具有参考文献82所述特征的糖和偶联物是有用的。

运载体分子可直接或经接头共价偶联于脑膜炎球菌糖。已知各种接头，例如，将游离-NH₂基团(例如通过胺化引入糖)偶联于己二酸(采用，例如二酰亚胺活化)得到的己二酸接头，然后将蛋白质偶联于得到的糖-己二酸中间体[83，84]。另一优选的连接类型是羰基接头，其可通过将糖的游离羟基与CDI反应得到[85，86]，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接键。其它接头包括β-丙酰胺基[87]、硝基苯基-乙基胺[88]、卤代酰基卤化物[89]、糖苷键[90]、6-氨基己酸[91]、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)[92]、己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide)ADH[93]、C₄-C₁₂部分[94]等。也可使用碳二亚胺缩合反应[95]。

如参考文献96所述，混合物可包含一种糖/蛋白直接连接的偶联物和另一种通过接头连接的偶联物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖偶联物时这种设置尤其有用，例如MenA和MenC糖可通过接头偶联，而MenW135和MenY糖则直接偶联于载体蛋白。

如果组合物包含Men-A、-C、-W和/或-Y偶联物中的一种或多种，在一些实施方式中，优选还包含Hib偶联物(见下文)。如果组合物包含来自多于一种的脑膜炎球菌血清群的糖，则每种血清群有平均糖质量。如果使用基本相等质量的各血清群，则平均质量与各个血清群的质量相同；如果使用非等量的血清群，则平均质量不同，对于10∶5∶5∶5微克的Men-ACWY混合物，平均质量为每血清群6.25微克。如果也包含Hib糖，则在一些实施方式中，其质量与每血清群的脑膜炎球菌糖的平均质量基本相同。在一些实施方式中，Hib糖的质量大于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)。在一些实施方式中，Hib糖的质量小于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)[97]。

水包油乳液

已知各种水包油乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。

本发明可使用的油，例如动物油(如鱼油)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和类萜，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物-鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚。可采用油的混合物。

如果组合物包含生育酚，可利用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但优选α-生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可用。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。

可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。也适合采用聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物。另一种有用的混合物包含聚乙二醇单月桂醚9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的含量(重量％)优选为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，该乳液的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”[98-100]，更详细的讨论见参考文献101的第10章及参考文献102的第12章。MF59乳液可包含柠檬酸盐离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。

·角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL。该乳液可包含磷酸缓冲液。

·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75∶11∶10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml α-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括任何比例的这些组分与抗原。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL。水相可含有磷酸缓冲液。

·角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普流罗尼克^TM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP一起使用[103]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％角鲨烷、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[104]。优选微流体化。

·含有角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[105]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。这类乳液可以被冻干。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献106所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，参见参考文献107)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[109]。

水包油乳液本身可用作佐剂，或者用作其它免疫刺激性化合物，例如免疫刺激性寡核苷酸、3d-MPL等的运载体。

3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4-单磷酰脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。参考文献110首先描述了3dMPL的制备方法。

重建和包装

本发明的冻干抗原组分最终用液体组分重建，从而获得适合给予患者的物质。重建通常在使用时进行。因此，抗原和水包油乳液佐剂可分别保存在包装或分销的疫苗试剂盒中，以便在使用时最终配制。

在装有两个容器的试剂盒中，一个含有用于重建的液体，而第二容器含有冻干的物质。第二容器通常密封。通常经第一针头将该液体引入该第二容器，从而将冻干物质重建成液体形式。然后洗出液体，通常吸入注射器以便给予患者。该洗出步骤可利用第一针头，但常用第二针头。用于洗出的针头可以与随后用于患者给药相同的针头，或者可以是不同的针头。

所述第二容器通常是药瓶。重建冻干物质的水包油乳液还可以在药瓶中，或者可以在注射器中。其它配置利用第一和第二容器作为双-室注射器中不同的小室，在驱动时，液体物质从所述第一容器引入所述第二容器。然后液体形式的混合和重建物质可排除该注射器。然而，在所有情况中，冻干和液体物质分别保存直至混合。

虽然水包油乳液通常以其液体形式使用，但在本发明的一些实施方式中，可能使用冻干的水包油乳液佐剂。例如，参考文献105和111描述了以此方式冻干乳液佐剂。这些干燥的乳液仍在使用时重建成液体形式，例如利用水性运载体。冻干的佐剂和冻干的抗原组分可以是不同的试剂盒组分，但在一些实施方式中，它们和混合成(在冻干前或冻干后)冻干形式。因此，在一些实施方式中，本发明提供的组合物包含冻干水包油乳液和冻干抗原性组合物的混合物，所述抗原性组合物包含免疫原以供引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答。可将该混合的冻干组合物与水性运载体混合，从而在一步重建中得到含水包油乳液佐剂的Men-B组合物。

因此，试剂盒可装有，例如两个药瓶，一个预填充注射器和一个药瓶，等等。注射器通常包含单剂量的组合物，而药瓶可包含单剂量或多剂量。因此，对于多剂量形式，药瓶优于预填充注射器。

在给予患者之前，还可加入其它液体和/或冻干的物质。

冻干组分的容器可以有适合的帽(如吕埃锁(Luer lock))，以便将预填装注射器***该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶从而在其中重建冻干物质，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将疫苗给予患者。该帽可以位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。

当将组分包装入药瓶时，优选该药瓶用玻璃或塑料材料制成。加入组合物之前优选灭菌药瓶。为避免对乳胶敏感患者造成问题，可用不含乳胶的塞子密封药瓶。药瓶中可装有单剂量疫苗或者可装有一剂以上疫苗(‘多剂量’药瓶)，例如，10剂。优选的药瓶由无色玻璃制成。

当将组合物包装入注射器时，该注射器上可连有针头，或者可没有针头。可与注射器一起提供单独的针头以供装配和使用。优选安全针头。通常为1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。可在注射器上提供可剥离的印有内容物批号和有效期的标签以方便保存记录。注射器内的柱塞优选有制动器以防止柱塞在抽吸过程中意外被拉出。

当采用玻璃容器(例如，注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅玻璃而非钠钙玻璃制成的容器。

由于给予患者的疫苗通常是0.5ml剂量，考虑到死体积，第一容器中液体的体积应适合在重建后给予至少0.5ml的剂量体积，例如0.6ml。

出于稳定性的原因，本发明的冻干组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖和/或甘露醇，以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。利用蔗糖/甘露醇混合物能加速干燥过程。冻干的组分还可包含氯化钠。重建后冻干物质中的可溶性组分可维持在组合物中，因此，最终液体疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。

组合物可包含温度保护剂，如参考文献112所述。例子包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适的PEG的平均分子量是200-20,000Da。在优选的实施方式中，聚乙二醇的平均分子量约为300Da(“PEG-300”)。

药物组合物

最终可利用本发明物质制备给予患者的药物组合物。这些药物组合物通常可包含药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体的充分讨论见参考文献113。

可惯常确定有效剂量体积，但该组合物的典型人用剂量是约0.5ml的体积，例如以便肌内注射。通过肌内注射将0.5ml体积的RIVM OMV疫苗给予大腿或上臂[114]。通过肌内注射将0.5ml的MeNZB^TM给予大腿前外侧或手臂的三角肌区域。其它递送途径可采用类似剂量，例如雾化的鼻内OMV疫苗的体积是每次喷雾约100μl或约130μl，给予四次喷雾获得总剂量是约0.5ml。

重建后，组合物的pH优选6-8，更优选6.5-7.5(例如，约7)。RIVM OMV疫苗的pH是7.4[115]，组合物的pH优选＜7.5。利用10mM Tris/HCl缓冲液维持RIVM OMV疫苗的pH，可利用缓冲液维持组合物的稳定pH，例如Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液或组氨酸缓冲液。因此，组合物通常包含缓冲液。缓冲液组分视需要位于液体组合和/或冻干组分中，从而得到所需的最终重建后配置。

组合物可以无菌和/或无热原。组合物对于人可以是等渗的。

给予患者的组合物是免疫原性的，更优选疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即，防止感染)或治疗性的(即，治疗感染)，但通常是预防性的。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学有效量的抗原以及需要的任何其它组分。“免疫学有效量”表示将该用量在单剂量中或作为连续剂量的一部分给予个体对于治疗或预防是有效的。该用量根据待治疗个体的健康和身体条件、年龄、分类学组别(例如，非人灵长类、灵长类等)、该个体的免疫***合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗的配方、治疗医师对医学状况的评估和其它相关因素而有所不同。估计该用量落在通过常规试验可确定的较宽范围中。通常以每剂量的蛋白质含量表示组合物的抗原含量。OMV鼻内疫苗的剂量通常是每毫升约0.9毫克蛋白质。

脑膜炎球菌影响身体的各区域，因此组合物可制成各种液体形式。例如，可将组合物制成溶液或混悬液形式的注射剂。可将组合物制成利用细喷雾的肺部给药，例如通过吸入器。可将组合物制成用于鼻、耳或眼部给药，例如作为喷雾剂或滴剂。通常是肌内给药的注射剂。

组合物可包含抗菌剂，特别是包装成多剂量形式之时。疫苗中通常有抗菌剂，例如硫柳汞和2-苯氧基乙醇，但优选利用无汞防腐剂或根本不含防腐剂。

本发明的冻干组分和/或共同包装的水包油溶液佐剂可以基本上不含铝盐。该配置使得重建的本发明组合物基本上不含铝盐。

组合物可包含洗涤剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。洗涤剂通常是低水平的，例如＜0.01。

组合物可包含从OMV制备的残留洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐)。每微克Men-B蛋白的残留洗涤剂含量优选低于0.4μg(更优选低于0.2μg)。

组合物可包含脑膜炎球菌的LOS。每微克蛋白的LOS含量优选低于0.12μg(更优选低于0.05μg)。

组合物可包含钠盐(例如，氯化钠)以获得张力。典型的浓度是10±2mg/mlNaCl，例如约9mg/ml。

治疗方法

本发明可用于引发哺乳动物中免疫应答的方法，包括将本发明的液体药物组合物给予该哺乳动物。免疫应答优选是保护性的，优选包括抗体。该方法可引发已针对脑膜炎奈瑟球菌作过初免的患者中的加强应答。OMV的皮下和鼻内初免/加强方案见参考文献116。

哺乳动物优选人。如果疫苗是预防性使用，则人优选儿童(例如，学步儿童或婴儿)或青少年；如果疫苗是治疗性使用，则人优选成年人。用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。

这些应用的方法优选用于预防和/或治疗脑膜炎奈瑟球菌所致疾病，例如细菌性(或者，更具体地说脑膜炎球菌性)脑膜炎或败血症。

一种评价治疗性治疗效果的方法包括给予组合物后监测奈瑟菌感染。一种评价预防性治疗效果的方法包括给予组合物后监测针对抗原的免疫应答。组合物的免疫原性可用以下方法测定：将其给予受试对象(例如12-16月大的儿童或动物模型[117])，然后检测包括血清杀菌抗体(SBA)以及ELISA滴度在内的包装参数(GMT)。这些免疫应答反应通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的值相比较。优选SBA提高至少4倍或8倍。如果给予多于一次剂量的组合物，可以进行多于一次的给药后测定。

组合物通常在给予对象后能诱导血清杀菌抗体应答。这些应答不难在小鼠中检测，并且是疫苗效力的标准指示。血清杀菌活性(SBA)衡量不同介导的细菌杀伤作用，可利用人或幼兔不同检验。WHO标准要求疫苗在超过90％的受试者中诱导SBA升高至少4-倍。给予第三剂量后4-6周，MeNZB^TM引发SBA升高4倍。

优选组合物可以在人患者体内产生优于对象的可接受百分比的血清保护力标准的抗体滴度。抗原所具有的相关抗体滴度(高于其认为宿主对该抗原是血清阳转的)是熟知的，并且这些滴度由例如WHO等组织公布。优选大于80％的具有统计学意义的对象样品是血清阳转的，更优选大于90％，还要优选大于93％，最优选96-100％。

组合物通常直接给予患者。直接递送可通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或注射至组织间隙)，或通过任何其它合适途径实现。本发明可用于引发全身性和/或粘膜免疫力。优选大腿或上臂的肌内给药。注射可以通过针头(例如皮下针头)，但另外可以使用无针头注射。典型的肌内注射剂量是0.5ml。

剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。强化剂量方案可以在初次剂量方案之后。可常规确定初免剂量之间(例如4-16周之间)以及初免和加强之间的适当间隔时间。采用3-或4-剂量初免方案检验基于OMV的RIVM疫苗，在第0、2和8或0、1、2和8月接种。以6周间隔给予3剂量的MeNZB^TM。

可利用组合物诱导针对多于一种的脑膜炎球菌超毒力谱系的杀菌抗体应答。具体地说，它们优选诱导针对以下三种超毒力谱系中2或3种的杀菌应答：(i)簇A4；(ii)ET5复合体；和(iii)谱系3。它们还可诱导针对亚群I、亚群III、亚群IV-1或ET-37复合体中一种或多种以及针对其它谱系，例如超侵袭性谱系的杀菌抗体应答。这并不一定表示该组合物可诱导针对这些超毒力谱系内各脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体；而是，例如对于任何给定的由特定超毒力谱系中的4种或更多脑膜炎球菌菌株构成的组而言，该组合物诱导的抗体具有针对该组的至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更高)的杀菌活性。优选的菌株组包括从以下至少4个国家分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选具有至少1024的杀菌滴度(例如2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即所述免疫血清经1024倍稀释时能够杀灭至少50％特定菌株的测试菌。

有用组合物可诱导对以下血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌应答：(i)簇A4的、菌株961-5945(B:2b:P1.21，16)和/或菌株G2136(B:-)；(ii)ET-5复合体的，菌株MC58(B:15:P1.7，16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7，16)；(iii)谱系3的，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更优选组合物可诱导对菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌应答。

菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST参照菌株[参考文献118中是638和1002]。菌株MC58可广泛获得(例如，ATCC BAA-335)，在参考文献119中列出了此菌株序列。菌株44/76已被广泛应用和鉴定(例如，参考文献120)，其是奈瑟菌MLST对照菌株之一[参考文献118中是237；参考文献19中表2第32行]。菌株394/98于1998年在新西兰最早分离得到，采用该菌株已发表了几篇研究(例如，参考文献121和122)。菌株BZ198是另一种MLST对照菌株[参考文献118中是409；参考文献19中表2第41行]。

其它抗原性组分

除了含有脑膜炎奈瑟球菌的抗原，组合物可包含其它病原体的抗原。例如，所述组合物可包含以下其它抗原中的一种或多种：

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原，例如糖(通常是偶联的)

-乙型肝炎病毒的抗原，例如表面抗原HBsAg；

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，例如百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合；

-白喉抗原，如白喉类毒素；

-破伤风抗原，例如破伤风类毒素；

-乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)(Hib)的糖抗原，通常是偶联的；

-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。

这些额外的抗原可以液体形式包含在水包油乳液的同一容器中，可以冻干形式包含在冻干Men-B抗原的同一容器中，或者在第三容器中(可以是冻干形式，通常是液体形式)。

白喉抗原包含在组合物中时，其还优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。

如果包含Hib糖(通常是偶联物)，该糖部分可以是多糖(例如，从细菌纯化的全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可能通过，例如水解将纯化的糖断裂以制备寡糖(例如，分子量约1-约5kDa)。重建疫苗中Hib偶联物的浓度通常是0.5μg-50μg，例如1-20μg、10-15μg、12-16μg等等。在一些实施方式中，该含量可以是约15g，或约12.5μg。低于5μg的含量是合适的[123]，例如1-5μg、2-4μg或约2.5μg。如上所述，在包含Hib糖和脑膜炎球菌糖的组合中，前者的剂量可根据后者的剂量(具体地说，对于多种脑膜炎球菌血清群的它们的平均质量)作选择。Hib偶联物的其它特征如上文脑膜炎球菌偶联物所述，包括运载体蛋白(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接键、比例等的选择。

如果包含肺炎链球菌抗原，其可以是多肽或糖。偶联荚膜糖尤其可用于对肺炎球菌作免疫。糖可以是具有从细菌纯化糖期间产生的大小的多糖，或者其可以是通过将这种多糖断裂获得的寡糖。在7-价PREVNAR^TM产品中，糖中的6种是完整的多糖，而一种(18C血清型)是寡糖。组合物可包含以下肺炎球菌血清型中一种或多种的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、HA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。组合物可包含多种血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种血清型。本领域已知7-价、9-价、10-价、11-价和13-价偶联物组合，以及23-价未偶联组合。例如，10-价组合可包含血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。11-价组合还可包含血清型3的糖。可加入10-价混合物(得到)12-价组合：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；r22F和15B；可加入11-价混合物(得到)13-价组合：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F，等等。肺炎球菌偶联物的其它特征如上文脑膜炎球菌偶联物所述，包括运载体蛋白(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接键、比例等的选择。如果组合物包含多于一种的偶联物，各偶联物可利用相同或不同的运载体蛋白。参考文献124描述了在多价肺炎球菌偶联物疫苗中利用不同运载体蛋白时的潜在优势。

概要

术语“包含”指“包括”以及“由构成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X构成，或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“约”是关于数值x的，例如x±10％。

词语“基本上”不排斥“完全”，例如“基本上”没有Y的组合物可以完全没有Y。需要时，“基本上”这个词可以从本发明的定义中省略。

附图简述

图1显示本发明组合物的两条叠加分析曲线。所示曲线是冻干前和重建后的组合物。由于非常接近，基本上只有一条线可见。

图2显示在4℃保存和在37℃保存的组合物的两条叠加分析曲线。与图1不同，两条线是可见的。

图3显示各种制剂的SDS-PAGE分析。从左到右，10条道是：(1)分子量标记；(2)-(4)100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml的液体抗原；(5)冻干前，与2％甘露醇和3％蔗糖相混合的抗原；(6)与道(5)相同，但在冻干和用wfi重建后；(7)与道(5)相同，但在冻干和用MF59重建后；(8)-(10)与道(5)-(7)一样，但用5％蔗糖。

本发明实施方式

在Men-B疫苗中包含佐剂

诺华公司(Novartis)Men-B疫苗的初步临床前评估表明最佳免疫应答需要存在氢氧化铝佐剂。然而，即使有该佐剂存在，菌株覆盖并不完全。例如，该疫苗引发血清杀伤100％的测试ST32和ST8菌株，对于ST11菌株该数字降低至65％。相反，利用MF59乳液作为佐剂对于所有ST32、ST8和ST11菌株获得100％覆盖率。其它实验证实了MF59的优越性。

当将血清群A、C、W135和Y的偶联荚膜糖加入Men-B疫苗时观察到相同的优越性。就杀菌滴度和菌株覆盖度而言，该A-B-C-W-Y疫苗利用MF59获得的免疫原性优于利用氢氧化铝获得的。

因此，与氢氧化铝佐剂相比，MF59提供增强的免疫原性效力。然而，当检验该疫苗的稳定性时，发现即使保存在4℃，Men-B抗原在约12周后开始降解。当保存在较高温度下，最早在2周后即明显降解，6个月后完全降解。利用安捷仑2100生物分析仪(Agilent 2100 Bioanalyzer)或尺寸排阻层析分析证实了降解。相反，吸附至氢氧化铝的抗原维持稳定。

MF59配制的非-B血清群的偶联荚膜糖也观察到稳定性降低。保存于4℃的含MF59佐剂制剂的游离唾液酸(Men-C、Men-W135和Men-Y的荚膜糖的组分)水平逐渐升高，6个月后达到约15％。然而，在较高温度下，约10周后游离水平达到50％，6个月后达到100％(即，完全降解)。

因此，MF59实现的免疫原性增强是以储存稳定性为代价的。进行研究来观察利用MF59和/或无需吸附至氢氧化铝佐剂是否能获得稳定制剂。

Men-B冻干

为实现稳定性目标，冻干Men-B抗原。重建后，证实它们仍有效力。此外，观察到Men-B抗原与血清群A、C、W135和Y各自的偶联荚膜糖的混合物的稳定性。

例如，图1显示两条叠加的分析曲线，其中峰对应于Men-B蛋白质的洗脱位置。两条曲线几乎相同，提示没有实质性的物理化学改变。相反，图2显示在4℃或37℃保存的同一组合物的两条叠加曲线，不难看到有变化。其它分析技术证实冻干前后没有任何可检测的改变。4℃，即使在冻干后保存6个月后，各Men-B抗原看来仍保持了完整性。

在有4.5％甘露醇和1.5％蔗糖存在下冻干组合物。

因此，可实现脑膜炎球菌抗原的长期稳定性而无需吸附于铝盐。因此，冻干使得抗原能与水包油乳液联用，从而增强已经证实的这些佐剂的效力和菌株覆盖度，而避免相关的稳定性问题。

其它制剂

在冻干Men-B疫苗的进一步开发工作中，制备了两种重组蛋白疫苗制剂。两种制剂均利用蔗糖作为冻干稳定剂，但一种还包含甘露醇。克分子渗透压浓度是300mOsmU，pH是7.0。各药瓶包含一份人剂量的足够物质，有40％余量(70μg各重组蛋白，15mg PBS和14mg甘露醇或21mg甘露醇+35mg蔗糖)，用700μl水-MF59(或为比较，用wfi)重建。

冻干后立即检测水份含量，然后在低温或高温下1个月后检测。水份含量维持恒定在约1.1％。

冻干前和重建后的RP-HPLC曲线比较显示两种制剂中的蛋白质在冻干后，即使在37℃、1个月后亦维持稳定。SDS-PAGE(图3)和蛋白质印迹也显示3种蛋白质在冻干过程后稳定，用MF59或wfi在4℃和37℃重建后没有降解或凝聚的证据。Experion分析得到相同结果。尺寸排阻层析显示冻干导致凝聚有些许增加，但随后凝聚物的量并未增加，即使在37℃保存3个月或在4℃保存6个月后。

免疫原性研究

免疫原性研究利用小鼠评估冻干对疫苗效力的影响。用MF59重建冻干的制剂，比较液体形式中和与MF59临时混合对同一抗原的滴度(例如，“双瓶”方法)。两种制剂诱导相似的滴度。

为研究长期稳定性，将两种冻干抗原制品(一种用蔗糖冻干，另一种用蔗糖+甘露醇冻干)保存在4℃，保存3和6个月后检验它们的免疫原性。用MF59(与抗原一样保存于4℃)重建保存的抗原并快速用于免疫。为进行比较，还平行混合并检验新鲜制备的水性抗原和MF59。

两个独立研究的ELISA结果表明用MF59重建时，冻干的制剂诱导的抗体滴度(GMT)与新鲜制备的制剂引发的抗体滴度相似。当通过SBA评估抗体应答时观察到相似结果，例如，蔗糖冻干的抗原在第0时观察到SBA滴度为32768，保存6个月后依旧观察到。因此，Men-B抗原在冻干和保存后维持活性。

在其它研究中，将冻干的制品保存在4℃或37℃，然后评估免疫原性。即使在37℃保存1个月后，冻干抗原显示SBA活性未丧失。

与冻干Men-B抗原混合的乳液的尺寸稳定性

4℃和25℃，24小时后检测单独的MF59乳液、或与冻干的Men-B抗原混合的MF59乳液、或与对照抗原混合的MF59乳液的油滴尺寸。油滴尺寸(nm)如下所示：

因此，4℃或25℃下，有冻干Men-B抗原存在下乳液的粒径稳定24小时，与乳液本身基本上相同。

应该知道本发明只是借助实施例得以描述，可作出改进。

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序列表

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<120>脑膜炎球菌疫苗制剂

<130>P051966WO

<140>PCT/IB2008/_____

<141>2008-10-17

<150>US-60/999,590

<151>2007-10-19

<160>7

<170>SeqWin99，版本1.02

<210>1

<211>248

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>1

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

20 25 30

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

35 40 45

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

50 55 60

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

65 70 75 80

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

85 90 95

Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His

100 105 110

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

115 120 125

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr

130 135 140

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

145 150 155 160

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His

165 170 175

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys

180 185 190

Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

195 200 205

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala

210 215 220

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg

225 230 235 240

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245

<210>2

<211>247

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>2

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

20 25 30

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

35 40 45

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

50 55 60

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

65 70 75 80

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

85 90 95

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

100 105 110

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

115 120 125

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

130 135 140

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

145 150 155 160

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

165 170 175

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala

180 185 190

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

195 200 205

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

210 215 220

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu

225 230 235 240

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245

<210>3

<211>250

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>3

Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser

20 25 30

Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys

35 40 45

Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu

50 55 60

Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val

65 70 75 80

Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys

85 90 95

Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn

100 105 110

Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser

115 120 125

Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys

130 135 140

Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg

145 150 155 160

Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile

165 170 175

Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu

180 185 190

Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg

195 200 205

Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp

210 215 220

Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys

225 230 235 240

Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210>4

<211>644

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>4

Met Ala Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala

1 5 10 15

Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Ala Pro

20 25 30

Gln Ala Gly Ser Gln Gly Gln Gly Ala Pro Ser Ala Gln Gly Gly Gln

35 40 45

Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gln Asn Asp Met

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Asp Gly Met Gln Gly Asp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Gly

130 135 140

Asn Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asn Gln Ala Glu Asn Asn Gln Thr Ala

145 150 155 160

Gly Ser Gln Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn Ser

165 170 175

Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn Val Gly Asn Ser Val Val Ile Asp

180 185 190

Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser Cys

195 200 205

Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gln Leu Lys Ser Glu Phe

210 215 220

Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly

225 230 235 240

Lys Asn Asp Gly Lys Asn Asp Lys Phe Val Gly Leu Val Ala Asp Ser

245 250 255

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260 265 270

Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser

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340 345 350

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Ala Asn Leu Gln Ser Gly Ser Gln His Phe Thr Asp His Leu Lys Ser

530 535 540

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Ala Ala Lys Gln

<210>5

<211>434

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>5

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1 5 10 15

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Leu Leu Leu Leu Gly Gln Val Ala Thr Glu Gly Glu Lys Gln Phe Val

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Thr Trp Asn Thr Ser Lys Val Arg Ala Thr Leu Leu Gly Ile Ser Pro

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Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp

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275 280 285

Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala

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Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe

305 310 315 320

Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe

325 330 335

Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala

340 345 350

Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu

355 360 365

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370 375 380

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser

385 390 395 400

Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser

405 410 415

Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala

420 425 430

Lys Gln

<210>6

<211>327

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>6

Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lys Lys Ala Ala Thr Val Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gln Glu Ile Asn Gly Phe Lys Ala Gly Glu

20 25 30

Thr Ile Tyr Asp IIe Asp Glu Asp Gly Thr Ile Thr Lys Lys Asp Ala

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Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp Phe Lys Gly Leu Gly Leu Lys

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu

245 250 255

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275 280 285

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325

<210>7

<211>434

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400>7

Met Val Ser Ala Val Ile Gly Ser Ala Ala Val Gly Ala Lys Ser Ala

1 5 10 15

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195 200 205

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210 215 220

Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp

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Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp

245 250 255

Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser

260 265 270

Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe

275 280 285

Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala

290 295 300

Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe

305 310 315 320

Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe

325 330 335

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340 345 350

Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu

355 360 365

Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His

370 375 380

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser

385 390 395 400

Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser

405 410 415

Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala

420 425 430

Lys Gln

Claims

1.一种试剂盒，其装有：(i)含有佐剂的第一容器，所述佐剂包含MF59水包油乳液；和(ii)含有冻干的抗原性组合物的第二容器，所述组合物包含引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答的免疫原。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器中的所述冻干的抗原性组合物还包含血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎奈瑟球菌中一种或多种的偶联荚膜糖。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述的冻干的抗原性组合物没有铝盐。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述的冻干的抗原性组合物和/或乳液佐剂没有铝盐。

5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的膜泡。

6.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的重组蛋白。

7.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的脂低聚糖。

8.一种制备液体佐剂免疫原性组合物的方法，包括在准备给予病人时混合以下组分的步骤：(i)包含MF59水包油乳液的佐剂；和(ii)包含免疫原的冻干的抗原性组合物，所述免疫原引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的免疫应答。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物还包含血清群A、C、W135和/或Y脑膜炎奈瑟球菌中一种或多种的偶联荚膜糖。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物没有铝盐。

11.如权利要求8-10任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的膜泡。

12.如权利要求8-10任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的重组蛋白。

13.如权利要求8-10任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干的抗原性组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的血清群B菌株的脂低聚糖。