ES2680624T3 - Conjugados de anticuerpos y fármacos (CAF) que se unen a las proteínas 191P4D12 - Google Patents

Conjugados de anticuerpos y fármacos (CAF) que se unen a las proteínas 191P4D12 Download PDF

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Abstract

Un conjugado de fármaco y anticuerpo que comprende un anticuerpo anti-191P4D12 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que consiste en el residuo de aminoácido 20 al residuo de aminoácido 136 de SEQ ID NO: 7 y una región variable de la cadena ligera que consiste en el residuo de aminoácido 23 al residuo de aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 8, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con monometil auristatina E (MMAE).

Description

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DESCRIPCION
Conjugados de anticuerpos y fármacos (CAF) que se unen a las proteínas 191P4D12 Campo de la invención
La invención descrita en la presente memoria se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión y conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) de los mismos, que se unen a proteínas, denominadas 191P4D12. La invención se refiere además a métodos y composiciones pronósticas, profilácticas y terapéuticas útiles en el tratamiento de cánceres que expresan 191P4D12.
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana después de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Solo en los Estados Unidos, según informa la Sociedad Estadounidense del Cáncer, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas al año, con más de 1,2 millones de casos nuevos diagnosticados por año. Si bien las muertes por enfermedades del corazón han disminuido significativamente, las que resultan del cáncer generalmente están en aumento. En la primera parte del próximo siglo, se predice que el cáncer se convertirá en la principal causa de muerte.
En todo el mundo, varios tipos de cáncer se destacan como las principales causas de muerte. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas, ovario y vejiga representan las principales causas de muerte por cáncer. Estos y casi todos los otros carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de un carcinoma es fatal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha demostrado que sus vidas están dramáticamente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan fuertes ansiedades impulsadas por la conciencia de la posibilidad de recurrencia o fracaso del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitaciones físicas después del tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una recurrencia.
En todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En América del Norte y el norte de Europa, es, con mucho, el cáncer más común en los hombres y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres. Solo en los Estados Unidos, más de 30.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad, solo superada por el cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no existe un tratamiento efectivo para el cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, la radioterapia, la terapia de ablación hormonal, la castración quirúrgica y la quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y a menudo se asocian con consecuencias indeseables.
En el frente diagnóstico, la falta de un marcador del tumor de próstata que pueda detectar con precisión los tumores localizados en estadio temprano sigue siendo una limitación significativa en el diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo del antígeno específico de próstata en suero (PSA) ha sido una herramienta muy útil, su especificidad y utilidad general se considera ampliamente como carente en varios aspectos importantes.
El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata se ha mejorado con la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos LAPC (cáncer de próstata de Los Ángeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido a pases en ratones inmunodeficientes combinados (SCID) y han demostrado la capacidad de imitar la transición de la dependencia de andrógenos a la independencia androgénica (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3: 402). Los marcadores de cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) (Pinto et al., Clin Cancer Res 1996 Sep. 2 (9): 1445 - 51), STEAP (Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 7 de diciembre; 96 (25): 14523 - 8) y antígeno prostático de células madre (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).
Mientras que los marcadores previamente identificados como PSA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar marcadores adicionales y dianas terapéuticas para la próstata y cánceres relacionados con el fin de mejorar aún más el diagnóstico y la terapia. Se estima que 130.200 casos de cáncer colorrectal ocurrieron en 2000 en los Estados Unidos, incluidos 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer de recto.
Los cánceres colorrectales son el tercer tipo de cáncer más común en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente durante 1992-1996 (-2,1% por año). La investigación sugiere que estas disminuciones se han debido a un aumento en el cribado y la eliminación de pólipos, lo que previene la progresión de pólipos a cánceres invasivos. Hubo una estimación de 56.300 muertes (47.700 por cáncer de colon, 8.600 por cáncer de recto) en 2000, lo que representa aproximadamente el 11% de todas las muertes por cáncer en los Estados Unidos.
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En la actualidad, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal, y para los cánceres que no se han dispersado, a menudo es curativa. La quimioterapia, o quimioterapia más radiación, se administra antes o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino o se ha dispersado a los ganglios linfáticos. En ocasiones se necesita una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de los desechos corporales) para el cáncer de colon y con poca frecuencia se requiere para el cáncer de recto. Sigue existiendo la necesidad de modalidades efectivas de diagnóstico y tratamiento para el cáncer colorrectal.
De todos los casos nuevos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en los hombres (el quinto neoplasma más común) y el 3 por ciento en las mujeres (el octavo neoplasma más común). La incidencia aumenta lentamente, al mismo tiempo que aumenta la población de mayor edad. En 1998, se estimaba que había 54.500 casos, incluidos 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada por edad en los Estados Unidos es de 32 por 100.000 para los hombres y ocho por 100.000 en las mujeres. La proporción histórica masculina/femenina de 3:1 puede estar disminuyendo en relación con los patrones de tabaquismo en las mujeres. Se estima que hubo 11.000 muertes por cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y la mortalidad del cáncer de vejiga aumentan fuertemente con la edad y será un problema creciente a medida que la población envejezca.
La mayoría de los cánceres de vejiga se repiten en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral de la vejiga (RTU) y quimioterapia o inmunoterapia intravesical. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga señala las limitaciones de la RTU. La mayoría de los cánceres musculares invasivos no se curan con la RTU sola. La cistectomía radical y la derivación urinaria son los medios más efectivos para eliminar el cáncer, pero tienen un impacto innegable en la función urinaria y sexual. Sigue existiendo una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para los pacientes con cáncer de vejiga.
Se estima que hubo 164.100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquios en 2000, lo que representa el 14% de todos los diagnósticos de cáncer en los EE. UU. La tasa de incidencia del cáncer pulmonar y bronquial está disminuyendo significativamente en los hombres, desde un máximo de 86,5 por 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En la década de 1990, la tasa de aumento entre las mujeres comenzó a disminuir. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por 100.000.
El cáncer pulmonar y bronquial causó una estimación de 156.900 muertes en 2000, lo que representa el 28% de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad por cáncer de pulmón disminuyó significativamente entre los hombres (-1,7% por año) mientras que las tasas para las mujeres todavía estaban aumentando significativamente (0,9% por año). Desde 1987, han muerto más mujeres cada año por cáncer de pulmón que por cáncer de mama, que, durante más de 40 años, fue la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres. La disminución de la incidencia del cáncer de pulmón y las tasas de mortalidad muy probablemente se debieron a la disminución de las tasas de tabaquismo en los últimos 30 años; sin embargo, la disminución de los patrones de tabaquismo entre las mujeres es inferior a la de los hombres. Es preocupante que, aunque el consumo de tabaco entre los adultos se ha reducido, el consumo de tabaco en los jóvenes está aumentando nuevamente.
Las opciones de tratamiento para el cáncer pulmonar y bronquial están determinadas por el tipo y el estadio del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía suele ser el tratamiento de elección. Debido a que la enfermedad generalmente se ha diseminado cuando se descubre, a menudo se necesita radioterapia y quimioterapia en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con radiación es el tratamiento de elección para el cáncer de pulmón de células pequeñas; en este régimen, un gran porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es de larga duración. Sin embargo, existe una necesidad constante de tratamiento efectivo y enfoques de diagnóstico para los cánceres de pulmón y bronquios.
Se calcula una estimación de que habrá 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre las mujeres en los Estados Unidos durante el año 2000. Además, se esperaba que cerca de 1.400 nuevos casos de cáncer de mama se diagnosticaran en hombres en 2000. Después de aumentar alrededor del 4% por año en la década de 1980, las tasas de incidencia del cáncer de mama en las mujeres se han estabilizado en la década de 1990 a alrededor de 110,6 casos por 100.000.
Solo en los EE. UU. hubo una estimación de 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido al cáncer de mama. El cáncer de mama ocupa el segundo lugar entre las muertes por cáncer en las mujeres. Según los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente durante 1992-1996, siendo las mayores disminuciones en las mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones fueron probablemente el resultado de una detección más temprana y un tratamiento mejorado.
Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento del cáncer de mama puede incluir una tumorectomía (extirpación local del tumor) y la extirpación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; mastectomía (extracción quirúrgica de la mama) y extirpación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. A menudo, se usan dos o más métodos en combinación. Numerosos estudios han demostrado que, para la enfermedad en estadio temprano, las tasas de supervivencia a largo plazo
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después de la lumpectomía más la radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de la mastectomía radical modificada. Los avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción mamaria después de la mastectomía. Recientemente, dicha reconstrucción se realizó al mismo tiempo que la mastectomía.
La extirpación local del carcinoma ductal in situ (CDIS) con cantidades adecuadas de tejido mamario circundante normal puede prevenir la recurrencia local del CDIS. La radiación en la mama y/o el tamoxifeno pueden reducir la posibilidad de que ocurra CDIS en el resto del tejido mamario. Esto es importante porque el CDIS, si no se trata, puede convertirse en un cáncer de mama invasivo. Sin embargo, hay serios efectos secundarios o secuelas de estos tratamientos. Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos eficaces contra el cáncer de mama.
Se estima que hubo 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en los Estados Unidos en 2000. Representa el 4% de todos los cánceres entre las mujeres y ocupa el segundo lugar entre los cánceres ginecológicos. Durante 19921996, las tasas de incidencia del cáncer de ovario disminuyeron significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario, hubo una estimación de 14.000 muertes en 2000. El cáncer de ovario causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductivo femenino.
La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía generalmente incluye la extirpación de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomía) y el útero (histerectomía). En algunos tumores muy tempranos, solo se eliminará el ovario involucrado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener hijos. Cuando la enfermedad está avanzada, se intenta eliminar toda la enfermedad intraabdominal para mejorar el efecto de la quimioterapia. Sigue existiendo una importante necesidad de opciones de tratamiento efectivas para el cáncer de ovario.
Se estima que hubo 28.300 nuevos casos de cáncer de páncreas en los Estados Unidos en 2000. En los últimos 20 años, las tasas de cáncer de páncreas han disminuido en los hombres. Las tasas entre las mujeres se han mantenido aproximadamente constantes, pero pueden estar empezando a disminuir. El cáncer de páncreas causó una estimación de 28.200 muertes en 2000 en los Estados Unidos. En los últimos 20 años, ha habido una ligera, pero significativa, disminución en las tasas de mortalidad entre los hombres (alrededor de -0,9% por año) mientras que las tasas han aumentado levemente entre las mujeres.
La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de páncreas. Estas opciones de tratamiento pueden extender la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero es probable que no produzcan una cura para la mayoría. Existe una necesidad significativa de opciones terapéuticas y de diagnóstico adicionales para los cánceres. Éstas incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas como modalidades de tratamiento. Además, también existe la necesidad de utilizar estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, controlar y promover el estado del arte en todas las áreas de tratamiento y estudios del cáncer.
La utilidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales (mAbs) (G. Kohler y C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) se está realizando. Los anticuerpos monoclonales ahora han sido aprobados como terapias en trasplantes, cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares e inflamación. Los diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Tales diferencias en la función se reflejan en distintas estructuras tridimensionales para los diferentes isotipos de inmunoglobulinas (P.M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6: 555 - 580 (1988)).
Debido a que los ratones son convenientes para la inmunización y reconocen la mayoría de los antígenos humanos como extraños, los mAb contra dianas humanas con potencial terapéutico han sido típicamente de origen murino. Sin embargo, los mAbs murinos tienen desventajas inherentes como agentes terapéuticos humanos. Requieren una dosificación más frecuente ya que los mAbs tienen una semivida circulante más corta en humanos que los anticuerpos humanos. Más críticamente, la administración repetida de anticuerpos murinos para el sistema inmune humano hace que el sistema inmune humano responda al reconocer la proteína del ratón como extraña y generando una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA). Dicha respuesta HAMA puede dar como resultado una reacción alérgica y la eliminación rápida del anticuerpo murino del sistema, lo que hace inútil el tratamiento con anticuerpos murinos. Para evitar tales efectos, se han intentado crear sistemas inmunes humanos en ratones.
Los intentos iniciales esperaban crear ratones transgénicos capaces de responder a antígenos con anticuerpos que tienen secuencias humanas (véase Bruggemann et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 6709-6713 (1989)), pero estaban limitados por la cantidad de ADN que podría mantenerse de manera estable por los vehículos de clonación disponibles. El uso de vectores de clonación del cromosoma artificial de levadura (YAC) condujo a la introducción de fragmentos de línea germinal grandes de locus de Ig humana en mamíferos transgénicos. Esencialmente, la mayoría de los genes de la región humana V, D y J dispuestos con el mismo espaciamiento encontrado en el genoma humano y las regiones constantes humanas se introdujeron en ratones usando YAC. Una de estas cepas de ratones transgénicos se conoce como ratones XenoMouse® y está disponible comercialmente en Amgen Fremont, Inc. (Fremont Calif.).
La solicitud de patente AU 2008 202 217 A1 (Agensys In.), 5 de junio de 2008, describe el gen de 191P4D12 (b) y su proteína codificada. Los anticuerpos o las células T reactivas con 191P4D12(b) pueden usarse en inmunización
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activa o pasiva. Se menciona adicionalmente que los anticuerpos también pueden conjugarse con una enzima activadora anticancerosa pro-fármaco capaz de convertir el profármaco en su forma activa. Sin embargo, los anticuerpos no se caracterizan por sus secuencias y no se usan en combinación con monometil auristatinas como agente citotóxico como uno de los compuestos principales.
Sumario de la invención
La invención proporciona anticuerpos, fragmentos de unión y conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) de los mismos que se unen a proteínas 191P4D12 y fragmentos de polipéptidos de proteínas 191P4D12. En algunas realizaciones, la invención comprende anticuerpos completamente humanos conjugados con un agente terapéutico. En ciertas realizaciones, hay una condición de que toda la secuencia de ácidos nucleicos de la FIG. 3 no está codificada y/o la secuencia de aminoácidos completa de la FIG. 2 no está preparada. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico completa de la FIG. 3 está codificada y/o la secuencia de aminoácidos completa de la FIG. 2 está preparada, cualquiera de los cuales están en formas de dosis unitarias humanas respectivas.
La invención proporciona además diversas composiciones inmunogénicas o terapéuticas, tales como conjugados de anticuerpo y fármaco, y estrategias para tratar cánceres que expresan 191P4D12, tales como los cánceres de tejidos enumerados en la Tabla I.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de 191P4D12 se muestran en la FIG. 1. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264 - 1796 que incluye el codón de parada.
Figs. 2A-B. Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de anticuerpos 191P4D12. FIG. 2A. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, subrayada está la región variable de la cadena pesada, y subrayada con una línea discontinua está la región constante IgG1 humana. FIG. 2B. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, subrayada está la región variable de la cadena ligera, y subrayada con una línea discontinua está la región constante kappa humana.
Figs. 3A-B. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos 191P4D12. FIG. 3A. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, subrayada está la región variable de la cadena pesada, y subrayada con una línea discontinua está la región constante IgG1 humana. FIG. 3B. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, subrayada está la región variable de la cadena ligera, y subrayada con una línea discontinua está la región constante kappa humana.
Figs. 4A-B. Alineación de anticuerpos Ha22-2(2,4)6.1 frente a la línea germinal de Ig humana. FIG. 4A. Alineación de la cadena pesada Ha22-2(2,4)6.1 con la línea germinal de Ig humana. FIG. 4B. Alineación de la cadena ligera Ha22- 2(2,4)6.1 con la línea germinal de Ig humana.
Figs. 5A-B. Ensayos de unión de MAb Ha22-2(2,4)6.1. FIG. 5A: Se tiñeron células RAT-control y RAT-191P4D12 con mAb Ha22-2(2,4)6.1 de células hibridomas o CHO. La unión se detectó mediante citometría de flujo. Los resultados muestran que Ha22-2(2,4)6.1 MAb expresado de forma recombinante en células CHO se secreta y se une específicamente a la superficie celular 191P4D12. FIG. 5B: El MAb Ha22-2(2,4)6.1 de células de hibridoma o CHO se ensayó para determinar la unión a la proteína extracelular purificada 191P4D12 recombinante mediante ELISA. Los resultados muestran que la unión de la proteína 191P4D12 a Ha22-2(2,4)6.1 derivada de CHO e hibridoma era idéntica.
FIG. 6. Determinación de la afinidad Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE por FACS usando células PC3-Human-191P4D12. La afinidad es 0,69 Kd.
FIG. 7. Determinación de la afinidad Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE por FACS usando células PC3-Macaco Rhesus- 191P4D12. La afinidad es 0,34 Kd.
FIG. 8. Determinación de la afinidad Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE por FACS usando células PC3-Rat-191P4D12. La afinidad es de 1,6 Kd.
Figs. 9A-D. Citotoxicidad celular mediada por Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE. FIG. 9A: Ensayo de citotoxicidad celular usando células PC3-Human-191P4D12. FIG. 9B: Ensayo de citotoxicidad celular usando células PC3-Macaco Rhesus-191P4D12. FIG. 9C: Ensayo de citotoxicidad celular usando células PC3-Rat-191P4D12. FIG. 9D: Ensayo de citotoxicidad celular usando células PC3-Neo.
FIG. 10. Mapeo de dominio de MAb Ha22-(2,4)6.1 por FACS.
FIG. 11. Mapeo de dominio MAb Ha22-2(2,4)6.1 por análisis de transferencia Western.
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FIG. 12. Evaluación del mAb Ha22-2(2,4)6.1 en el modelo de formación de tumor subcutáneo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano AG-L4 en ratones SCID. Los resultados muestran que los MAbs de 191P4D12 no inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en el xenoinjerto de cáncer de pulmón humano AG-L4 en ratones SCID.
FIG. 13. Evaluación del mAb Ha22-2(2,4)6.1 en el modelo de formación tumoral subcutánea de xenoinjerto de cáncer pancreático humano HPAC en ratones SCID. Los resultados muestran que los MAbs de 191P4D12 no inhibieron el crecimiento tumoral en un xenoinjerto pancreático humano en ratones SCID en comparación con el anticuerpo de control.
FIG. 14. Evaluación del mAb Ha22-2(2,4)6.1 en el modelo de formación tumoral subcutánea de xenoinjerto de cáncer pancreático humano AG-Panc3 en ratones SCID. Los resultados muestran que los MAbs de 191P4D12 no inhibieron el crecimiento tumoral en un xenoinjerto pancreático humano en ratones SCID en comparación con el anticuerpo de control.
FIG. 15. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE en xenoinjerto de cáncer de pulmón humano establecido por vía subcutánea AG-L4 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón AG-L4 implantados por vía subcutánea en ratones atímicos en comparación con el control tratado y el no tratado.
FIG. 16. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE en xenoinjerto de cáncer de mama humano subcutáneo BT-483 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de tumor de mama BT-483 implantados por vía subcutánea en ratones SCID en comparación con los CAFs de control tratados y no tratados.
FIG. 17. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE en xenoinjerto de cáncer de vejiga humano establecido por vía subcutánea AG-B1 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de vejiga AG-B1 en comparación con los CAF de control.
FIG. 18. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE en el xenoinjerto de cáncer de páncreas humano establecido por vía subcutánea AG-Panc2 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas AG-Panc2 en comparación con los CAF de control.
FIG. 19. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE en xenoinjerto de cáncer de pulmón humano establecido por vía subcutánea AG-Panc4 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas AG-Panc4 en comparación con los CAF de control.
FIG. 20. Eficacia de Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE a dosis comparativa en xenoinjerto de cáncer de vejiga humano establecido por vía subcutánea AG-B8 en ratones SCID. Los resultados muestran que el tratamiento con Ha22- 2(2,4)6.1vcMMAE a 10 mg/kg inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de vejiga AG-B8 en comparación con Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE a 5 mg/kg.
Figs. 21A-N. Detección de proteína 191P4D12 en muestras de pacientes con cáncer por IHC. Figs. 21A-B muestran muestras de cáncer de vejiga. Figs. 21C-D muestran muestras de cáncer de mama. Figs. 21E-F muestran muestras de cáncer de páncreas. Figs. 21G-H muestran muestras de cáncer de pulmón. Figs. 21I-J muestran muestras de cáncer de ovario. Figs. 21K-L muestran muestras de cáncer de esófago. FIG. 21M-N muestran muestras de cáncer de esófago.
Figs. 22A-B. Muestra las curvas de unión utilizadas para determinar la afinidad de Mab Ha22-2(2,4)6.1 y Ha22- 2(2,4)6.1vcMMAE a 191P4D12 recombinante purificado (aminoácidos ECD 1-348).
Figs. 23A-D. Muestra la unión de Ha22-2(2,4)6.1 a células PC3 que expresan 191P4D12 (Figura 23A) y ortólogos de macaco cangrejero (Figura 23B), rata (Figura 23C) y ratón (Figura 23D).
Figs. 24A-D. Muestra la unión de Ha22-2(2,4)6.1 al doble mutante A76I, S91N es similar a la unión del ortólogo murino.
FIG. 25. Muestra un modelo del dominio V de 191P4D12 basado en datos de la estructura cristalina publicados para miembros de la familia de proteínas que contienen el dominio Ig y 191P4D12 usando PyMOL. Se muestran las posiciones de Ala-76 (trazado punteado) y Ser-91 (trazado entramado).
Figs. 26A-C. Muestra que la unión de Ha22-2(2,4)6.1 se une a células que expresan el dominio V (Figura 26A) así como a 191P4D12 de tipo salvaje (Figura 26B), pero no a las células que expresan el dominio C1C2 generadas anteriormente (Figura 26C).
Descripción detallada de la invención
Esquema de Secciones
I. ) Definiciones
II. ) Anticuerpos 191P4D12
III. ) Conjugados de fármaco de anticuerpo Generalmente
5 III (A). Maitansinoides
III (B). Auristatinas y dolostatinas
III (C). Caliqueamicina
III (D). Otros agentes citotóxicos
IV. ) Conjugados de fármaco de anticuerpo que se unen a 191P4D12
10 V.) Unidades de enlace
VI. ) La unidad de estiramiento
VII. ) La unidad de aminoácido
VIII. ) La unidad espaciadora
IX. ) La unidad de fármaco
15 X.) Carga farmacéutica
XI. ) Métodos para determinar el efecto citotóxico de los CAF
XII. ) Tratamiento del cáncer o de los cánceres que expresan 191P4D12
XIII. ) 191P4D12 como un objetivo para la terapia basada en anticuerpos
XIV. ) Cócteles CAF 191P4D12 20 XV) Terapia de combinación
XVI.) Kits/Artículos de fabricación I.) Definiciones:
A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, las anotaciones y otros términos científicos o terminología utilizados en la presente memoria pretenden tener los significados comúnmente entendidos por los 25 expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en este documento para mayor claridad y/o para una referencia rápida, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial con respecto a lo que generalmente se entiende en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente son bien entendidos y comúnmente empleados usando metodología 30 convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según corresponda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.
35 Cuando se utiliza un nombre comercial en el presente documento, la referencia al nombre comercial también se refiere a la formulación del producto, el medicamento genérico y el/los ingrediente(s) farmacéutico(s) activo(s) del producto de nombre comercial, a menos que el contexto indique lo contrario.
Las expresiones "cáncer avanzado", "cáncer avanzado localmente", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres que se han extendido a través de la cápsula de tejido relevante, y están 40 destinados a incluir la enfermedad en estadio C según el sistema de la Asociación Americana de Urología (AUA), estadio de enfermedad C1-C2 bajo el sistema de Whitmore-Jewett, y la etapa T3-T4 y la enfermedad N+ bajo el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer clínicamente localizado (confinado al órgano).
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La abreviatura "AFP" se refiere a dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina-p-fenilendiamina (véase la Fórmula XVI infra).
La abreviatura "MMAE" se refiere a monometil auristatina E (véase la Fórmula XI más adelante).
La abreviatura "AEB" se refiere a un éster producido haciendo reaccionar auristatina E con ácido paraacetilbenzoico (ver Fórmula XX infra).
La abreviatura "AEVB" se refiere a un éster producido haciendo reaccionar auristatina E con ácido benzoilvalérico (véase la Fórmula XXI infra).
La abreviatura "MMAF" se refiere a dovalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina (véase la Fórmula XVIV infra).
A menos que se indique lo contrario, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en él), siendo preferidos desde aproximadamente 1 a aproximadamente 8 los átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n- propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1 -butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo , 2-hexilo, 3-hexilo, 2- metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo y 3,3-dimetil- 2-butilo.
Los grupos alquilo, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualesquiera sustituyentes adicionales seleccionados de halógeno), que incluyen, pero sin limitación, -halógeno, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R', - OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, - NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2- Cs, alquinilo-C2-Cs o -arilo, y en el que dicho -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, - alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs y grupos alquinilo -C2-Cs pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs, alquinilo -C2-Cs, -halógeno, -O- (alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, - C(O)NHR" , -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, -alquilo Ci-Cs, alquenilo-C2-Cs, alquinilo-C2-Cs, o -arilo.
A menos que se indique lo contrario, los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a cadenas de carbono lineales y ramificadas que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en ellas), siendo preferido de aproximadamente 2 a aproximadamente s átomos de carbono. Una cadena de alquenilo tiene al menos un doble enlace en la cadena y una cadena de alquinilo tiene al menos un triple enlace en la cadena. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero sin limitación, etileno o vinilo, alilo, -i-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -i- pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-i-butenilo, -2-metil-2-butenilo y -2,3-dimetil-2-butenilo. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero sin limitación, acetilénico, propargilo, acetilenilo, propinilo, -i-butinilo, -2-butinilo, -i-pentinilo, -2-pentinilo y -3-metil-i-butinilo.
Los grupos alquenilo y alquinilo, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más grupos, preferiblemente de i a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), que incluyen, pero sin limitación, -halógeno, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' es independientemente seleccionado entre -H, -alquilo Ci-Cs, alquenilo-C2-Cs, alquinilo-C2-Cs, o -arilo y en el que dicho -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O- (alquinilo C2-Cs), -arilo, -alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs y grupos alquinilo -C2-Cs pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más sustituyentes que incluyen, pero sin limitación, -alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-Cs, alquinilo C2-Cs, -halógeno, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo -C2-Cs), -arilo, -C(O)R", - OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R ", -OH, -N3, - NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente entre -H, -alquilo Ci-Cs, alquenilo - C2-Cs, -alquinilo C2-Cs, o -arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de aproximadamente i a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), siendo preferido desde aproximadamente i aproximadamente s átomos de carbono y con dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno de los mismos o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Los alquilenos típicos incluyen, pero sin limitación, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno, decaleno, i,4-ciclohexileno y similares. Los grupos alquileno, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más grupos, preferiblemente de i a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), que incluyen, pero
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sin limitación, -halógeno, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R ', -OC(O)R', - C(O)O', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, - NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-C8, o -arilo y en el que dicho -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8 y grupos alquinilo -C2-C8 pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más sustituyentes que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, -halógeno, -O- (alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, - C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente entre -H, -alquilo C1-C8, alquenilo-C2-C8, -alquinilo C2-C8, o -arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquenileno" se refiere a un grupo alquileno opcionalmente sustituido que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenileno incluyen, por ejemplo, etenileno (-CH=CH-) y propenileno (-CH=CHCH2-).
A menos que se indique lo contrario, el término "alquinileno" se refiere a un grupo alquileno opcionalmente sustituido que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinileno incluyen, por ejemplo, acetileno (-CEC-), propargilo (-CH2CEC-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CECH-).
A menos que se indique lo contrario, el término "arilo" se refiere a un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en él) derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático parental. Algunos grupos arilo están representados en las estructuras ejemplares como "Ar". Los grupos arilo típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, fenilo, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.
Un grupo arilo, ya sea solo o como parte de otro grupo, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, preferiblemente de 1 a 5, o incluso de 1 a 2 grupos que incluyen, pero sin limitación, -halógeno, alquilo C1-C8, - alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R', -
OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R ', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO2, - N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo C1-C8, alquenilo- C2-C8, alquinilo-C2-C8, o -arilo y en donde dicho alquilo C1-C8, alquenilo-C2-C8, alquinilo C2-C8, O-(alquilo C1-C8), -O- (alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8) y -arilo pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más sustituyentes que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-C8, -halógeno, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8)), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR ", -C(O)NH2, -C(O)NHR", - C(O)N (R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R ", - OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente entre -H, -alquilo C1-C8, alquenilo-C2-C8, alquinilo C2-C8, o -arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "arileno" se refiere a un grupo arilo opcionalmente sustituido que es divalente (es decir, derivado por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un sistema de anillo aromático original) y puede estar en el configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras con fenilo como el grupo arilo ejemplar.
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Los grupos "-(alquileno C1-C8)arilo", "-(alquenileno C2-C8)arilo " y "-(alquinileno C2-C8)arilo" típicos incluyen, pero sin limitación, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftilmetil-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2- naftofeniletan-1-ilo y similares.
A menos que se indique lo contrario, el término "heterociclo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o policíclico que tiene de 3 a 14 átomos en el anillo (también denominados miembros del anillo) donde al menos un átomo del anillo en al menos un anillo es un heteroátomo seleccionado entre N, O, P o S (y todas las combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono y heteroátomos en él). El heterociclo puede tener de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente de N, O, P o S. Uno o más átomos de N, C o S en un heterociclo pueden oxidarse. Un heterociclo monocíclico preferiblemente tiene de 3 a 7 miembros de anillo (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S), y un heterociclo bicíclico preferiblemente tiene de 5 a 10 miembros de anillo (por ejemplo, de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente entre N, O, P o S). El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se indique lo contrario, el heterociclo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable.
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Los heterociclos se describen en Paquette, "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamín, Nueva York, 1968), en particular los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, desde 1950 hasta la actualidad), en particular los volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960).
Los ejemplos de grupos "heterociclo" incluyen a modo de ejemplo y sin limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H- 1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H- indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4H- carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo. Los grupos "heterociclo" preferidos incluyen, pero sin limitación, benzofuranilo, benzotiofenilo, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo.
Un grupo heterociclo, ya sea solo o como parte de otro grupo, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos, preferiblemente de 1 a 2 grupos, que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C-i-Ca, alquenilo -C2-C8, alquinilo - C2-C8, -halógeno, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', - C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y - CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-C8, o -arilo y en el que dicho -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo -C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8 y grupos -arilo pueden estar adicionalmente opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes que incluyen, pero no limitado a, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-C8, -halógeno, -O-(alquilo C1-C8), -O- (alquenilo C2-C8), O- (alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR" , -C(O)N(R")2, - NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, -alquilo C1-C8, alquenilo-C2-C8, alquinilo-C2-C8 o arilo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono se pueden unir en las siguientes posiciones: posición 2, 3, 4, 5 ó 6 de una piridina; posición 3, 4, 5 ó 6 de una piridazina; posición 2, 4, 5 ó 6 de una pirimidina; posición 2, 3, 5 ó 6 de una pirazina; posición 2, 3, 4 ó 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol; posición 2, 4 ó 5 de un oxazol, imidazol o tiazol; posición 3, 4 ó 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol; posición 2 ó 3 de una aziridina; posición 2, 3 ó 4 de una azetidina; posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina; o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2- piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5- tiazolilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos por nitrógeno se pueden unir en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina o 1H-indazol; posición 2 de un isoindol, o isoindolina; posición 4 de una morfolina; y la posición 9 de un carbazol, o p-carbolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos por nitrógeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1- pirazolilo y 1-piperidinilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "carbociclo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o policíclico no aromático saturado o insaturado que tiene de 3 a 14 átomos en el anillo (y todas las combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en él) en donde todos los átomos del anillo son átomos de carbono. Los carbociclos monocíclicos tienen preferiblemente de 3 a 6 átomos en el anillo, aún más preferiblemente 5 ó 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos preferiblemente tienen de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 ó 10 átomos en el anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. El término "carbociclo" incluye, por ejemplo, un anillo de carbociclo monocíclico condensado con un anillo de arilo (por ejemplo, un anillo de carbociclo monocíclico condensado con un anillo de benceno). Los carbohidratos preferiblemente tienen de 3 a 8 átomos de carbono en el anillo.
Los grupos carbocíclicos, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden ser opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, uno o más grupos, preferiblemente 1 ó 2 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), que incluyen, pero sin limitación, -halógeno , -alquilo C-i-Ce, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-Cs, -O-(alquilo C-i-Cs), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', - C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo-C2-C8, o -arilo y en el que dicho - alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), y los
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grupos arilo pueden estar adicionalmente opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes que incluyen, pero sin limitación, alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo C2-C8, -halógeno, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O- (alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", - OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", - SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -oH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente entre -H, -alquilo C1-C8, alquenilo-C2-C8, alquinilo-C2-C8 o -arilo.
Los ejemplos de sustituyentes carbocíclicos monocíclicos incluyen -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -1- ciclopent-1-enilo, -1-ciclopent-2-enilo, -1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, -1-ciclohex-1-enilo, -1-ciclohex-2-enilo, -1- ciclohex-3-enilo, -cicloheptilo, -ciclooctilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5- cicloheptatrienilo y -ciclooctadienilo.
Un "carbociclo", ya sea solo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo carbociclo opcionalmente sustituido como se definió anteriormente que es divalente (es decir, derivado por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un sistema de anillo carbocíclico parenteral).
A menos que se indique lo contrario por contexto, un guión (-) designa el punto de unión a la molécula colgante. Por consiguiente, el término "-(alquileno C1-C8)arilo" o "alquileno C1-C8(arilo)" se refiere a un radical alquileno C1-C8 como se define en la presente, en donde el radical alquileno está unido a la molécula colgante en cualquiera de los átomos de carbono del radical alquileno y uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono del radical alquileno se reemplazan con un radical arilo como se define en este documento.
Cuando un grupo particular está "sustituido", ese grupo puede tener uno o más sustituyentes, preferiblemente de uno a cinco sustituyentes, más preferiblemente de uno a tres sustituyentes, lo más preferiblemente de uno a dos sustituyentes, seleccionados independientemente de la lista de sustituyentes. El grupo puede, sin embargo, generalmente tener cualquier número de sustituyentes seleccionados de halógeno. Los grupos que están sustituidos están así indicados.
Se pretende que la definición de cualquier sustituyente o variable en una ubicación particular en una molécula sea independiente de sus definiciones en otra parte de esa molécula. Se entiende que los sustituyentes y los patrones de sustitución en los compuestos de esta invención pueden seleccionarse por un experto en la materia para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que se puedan sintetizar fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, así como los métodos establecidos adelante en este documento.
Los grupos protectores, como se usan en la presente memoria, se refieren a grupos que bloquean selectivamente, temporal o permanentemente, un sitio reactivo en un compuesto multifuncional. Los grupos protectores de hidroxi adecuados para usar en la presente invención son farmacéuticamente aceptables y pueden o no necesitar ser escindidos del compuesto original después de la administración a un sujeto para que el compuesto sea activo. La escisión se realiza a través de procesos metabólicos normales dentro del cuerpo. Los grupos protectores hidroxi son bien conocidos en la técnica, véase, Protective Groups in Organic Synthesis, de TW Greene y PGM Wuts (John Wiley & sons, 3a Edición), incorporados en este documento como referencia en su totalidad y para todos los fines e incluyen, por ejemplo, éter (por ejemplo, éteres alquílicos y sililéteres que incluyen, por ejemplo, dialquilsililéter, trialquilsililéter, dialquilalcoxisililéter), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato y grupos protectores de fosfato. Los ejemplos de grupos protectores de hidroxi incluyen, pero sin limitación, éter de metilo; metoximetil-éter, metiltiometil- éter, (fenildimetilsilil) metoximetil-éter, benciloximetil-éter, p-metoxibenciloximetil-éter, p-nitrobenciloximetil-éter, o- nitrobenciloximetil-éter, (4-metoxifenoxi) metil-éter, guayacolmetil-éter, t-butoximetil-éter, 4-penteniloximetil-éter, siloximetil-éter, 2-metoxietoximetil-éter, 2,2,2-tricloroetoximetil-éter, bis(2-cloroetoxi)metil-éter, 2- (trimetilsilil)etoximetil-éter, mentoximetil-éter, tetrahidropiranil-éter, 1-metoxiciclohexil-éter, 4- metoxitetrahidrotiopiranil-éter, 4-metoxitetrahidrotiopiranil éter S,S-Dióxido, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4- metoxipiperidin-4-il-éter, 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-il-éter, 1,4-dioxan-2-il-éter, tetrahidrofuranil-éter, tetrahidrotiofuranil-éter; éteres etílicos sustituidos tales como éter 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etil-éter, 1-[2- (trimetilsilil)etoxi]etil-éter, 1-metil-1-metoxietil-éter, 1 -metil-1-benciloxietil-éter, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetil-éter, 1- metil-1-fenoxietil-éter, 2-trimetilsilil-éter, t-butil-éter, alil-éter, propargil-éteres, p-clorofenil-éter, p-metoxifenil-éter, bencil-éter, p-metoxibencil-éter, 3,4-dimetoxibencil-éter, trimetilsilil-éter, trietilsilil-éter, tripropilsililéter, dimetil- isopropilsilil-éter, dietilisopropilsilil-éter, dimetilhexilsilil-éter, t-butildimetilsilil-éter, difenilmetilsilil-éter, éster de benzoilformiato, éster de acetato, éster de cloroacetato, éster de dicloroacetato, éster de tricloroacetato, éster de trifluoroacetato, éster de metoxiacetato, éster de trifenilmetoxietacetato, éster de fenilacetato, éster de benzoato, carbonato de metilo y alquilo, 9-fluorenilmetilcarbonato de alquilo, carbonato de etilo y alquilo, carbonato de alquil 2,2,2-tricloroetilo, carbonato de 1,1 -dimetil-2,2,2-tricloroetilo, alquilsulfonato, metanosulfonato, bencilsulfonato, tosilato, acetal de metileno, acetal de etilideno y acetal de t-butilmetilideno. Los grupos protectores preferidos están representados por las fórmulas - Ra, -Si(Ra)(Ra)(Ra), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NH(Ra), -S(O)2Ra, -S(O)2OH, P(O)(OH)2 y -P(O)(OH)ORa, en donde Ra es alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, alquileno C1-C20 (carbociclo), alquenileno -C2-C20 (carbociclo), alquinileno -C2-C20 (carbociclo), arilo -C6-C10, alquileno C1-C20 (arilo), alquenileno -C2-C20 (arilo), alquinileno -C2-C20 (arilo), alquileno -C1-C20 (heterociclo), -alquenileno -C2-C20 (heterociclo), o alquinileno -C2-C20 (heterociclo) donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinilino, arilo, carbociclo y heterociclo, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos.
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"Alterar el patrón de glicosilación nativo" pretende significar eliminar uno o más restos de carbohidrato encontrados en la secuencia nativa 191P4D12 (eliminando el sitio de glucosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa 191P4D12. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y las proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes.
El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con 191P4D12). Por ejemplo, un análogo de una proteína 191P4D12 puede unirse específicamente por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a 191P4D12.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede ser de origen natural o artificial, tal como anticuerpos monoclonales producidos por tecnología de hibridoma convencional. Los anticuerpos 191P4D12 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se una específicamente a 191P4D12 y/o muestre la actividad biológica deseada y específicamente cubra anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multi-específicos (p. ej. , anticuerpos bi-específicos) y fragmentos de anticuerpos siempre que se unan específicamente a 191P4D12 y/o exhiban la actividad biológica deseada. Se puede usar cualquier anticuerpo específico en los métodos y composiciones proporcionados en este documento. Así, en una realización, el término "anticuerpo" abarca una molécula que comprende al menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de cadena pesada que, en combinación, forman un sitio de unión específico para el antígeno diana. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones pueden generarse en cultivo celular, en fagos o en diversos animales, que incluyen, pero sin limitación, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsters, conejillos de Indias, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés y simios. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Las técnicas de fagos pueden usarse para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. Tales técnicas son rutinarias y bien conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo recombinante transfectando una célula huésped con un vector que comprenda una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Se pueden usar uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una VH en la célula huésped.
Las descripciones a modo de ejemplo de los medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); and CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención puede modificarse por medios recombinantes para aumentar la eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Por lo tanto, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpos puedan modificarse mediante sustituciones usando medios recombinantes. Típicamente, las sustituciones serán sustituciones conservadoras. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede reemplazarse por un residuo diferente. Ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N° 5.624.821, la patente de EE.UU. N° 6.194.551, Solicitud N° WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye deleciones, adiciones y sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, dichos cambios se realizan para reducir las actividades no deseadas, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento. Con frecuencia, los anticuerpos se marcan uniendo, ya sea de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación, y se muestran ampliamente en la literatura científica y de patentes. Estos anticuerpos se pueden cribar para unirse a 191P4D12 normal o defectuoso. Ver, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996). Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas se pueden identificar mediante los siguientes ensayos in vitro que incluyen, entre otros: proliferación, migración, adhesión, crecimiento de agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales y lo siguiente ensayos in vivo tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos proporcionados en este documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden cribarse la capacidad de unirse al antígeno específico sin inhibir la unión del receptor o la actividad biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También se pueden usar para cuantificar el 191P4D12 o su receptor.
La expresión "porción de unión a antígeno" o "fragmento de anticuerpo" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo 191P4D12 que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, 191P4D12 y variantes; Figura 1). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "porción de
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unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permita formarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423 - 426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883). Dichos anticuerpos monocatenarios también pretenden incluirse dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se criban para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Como se usa en este documento, cualquier forma del "antígeno" puede usarse para generar un anticuerpo que sea específico para 191P4D12. Por lo tanto, el antígeno desencadenante puede ser un único epítopo, múltiples epítopos o la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno desencadenante puede ser una proteína aislada de longitud completa, una proteína de superficie celular (por ejemplo, inmunizando con células transfectadas con al menos una porción del antígeno), o una proteína soluble (por ejemplo, inmunizando únicamente con la porción de dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula genéticamente modificada. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) y codifica al menos una porción del dominio extracelular. Como se usa en este documento, el término "porción" se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea apropiado, que constituyen un epítopo inmunogénico del antígeno de interés. Se pueden emplear cualesquiera vectores genéticos adecuados para la transformación de las células de interés, que incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos. En una realización, el anticuerpo de los métodos y composiciones de la presente memoria se unen específicamente al menos a una porción del dominio extracelular del 191P4D12 de interés.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden conjugarse con un "agente bioactivo". Como se usa en el presente documento, la expresión "agente bioactivo" se refiere a cualquier compuesto sintético o de origen natural que se una al antígeno y/o potencie o medie un efecto biológico deseado para mejorar las toxinas que destruyen las células. En una realización, los fragmentos de unión útiles en la presente invención son fragmentos biológicamente activos. Como se usa en este documento, la expresión "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse al epítopo antigénico deseado y ejercer directa o indirectamente un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero sin limitación, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal antiapoptótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptótica o necrótica, modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de ADCC, y modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CDC.
Los anticuerpos "bi-específicos" también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo bi-específico" se refiere a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Los métodos para producir anticuerpos bi-específicos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos bi- específicos pueden producirse de forma recombinante usando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Milstein et al., Nature 305: 537 - 39 (1983). Alternativamente, los anticuerpos bi-específicos pueden prepararse usando un enlace químico. Véase, por ejemplo, Brennan, et al., Science 229: 81 (1985). Los anticuerpos bi-específicos incluyen fragmentos de anticuerpos bi- específicos. Ver, por ejemplo, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. U.S.A. 90: 6444 - 48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Los anticuerpos monoclonales descritos en este documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es o son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie particular o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos particular, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que se unan específicamente al antígeno diana y/o exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 - 6855 (1984)).
La expresión "agente quimioterapéutico" se refiere a todos los compuestos químicos que son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes; por ejemplo, mostazas nitrogenadas, compuestos de etilenimina y alquilsulfonatos; antimetabolitos, por ejemplo, antagonistas de ácido fólico, purina o pirimidina; inhibidores mitóticos, por ejemplo, agentes anti-tubulina tales como alcaloides de vinca, auristatinas y derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos; compuestos que
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dañan o interfieren con la expresión o replicación del ADN, por ejemplo, aglutinantes del surco de menor importancia para el ADN; y antagonistas del receptor del factor de crecimiento. Además, los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes citotóxicos (como se definen en la presente memoria), anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas.
El término "compuesto" se refiere y abarca el compuesto químico en sí mismo, así como, el explícitamente establecido o no, y a menos que el contexto aclare que deben excluirse los siguientes: formas amorfas y cristalinas del compuesto, incluyendo formas polimórficas, donde estas formas pueden ser parte de una mezcla o estar en aislamiento; formas de ácido libre y base libre del compuesto, que son típicamente las formas mostradas en las estructuras proporcionadas en este documento; isómeros del compuesto, los cuales se refieren a los isómeros ópticos, e isómeros tautoméricos, donde los isómeros ópticos incluyen enantiómeros y diastereómeros, isómeros quirales e isómeros no quirales, y los isómeros ópticos incluyen isómeros ópticos aislados, así como mezclas de isómeros ópticos, incluidas las mezclas racémicos y no racémicas; donde un isómero puede estar en forma aislada o en una mezcla con uno o más isómeros diferentes; isótopos del compuesto, que incluyen compuestos que contienen deuterio y tritio, e incluyen compuestos que contienen radioisótopos, que incluyen radioisótopos efectivos terapéutica y diagnósticamente; formas multiméricas del compuesto, que incluyen formas diméricas, triméricas, etc.; sales del compuesto, preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables, que incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases, incluyendo sales que tienen contraiones orgánicos y contraiones inorgánicos, y que incluyen formas zwitteriónicas, donde si un compuesto está asociado con dos o más contraiones, los dos o más contraiones pueden ser los mismos o diferentes; y solvatos del compuesto, que incluyen hemisolvatos, monosolvatos, disolvatos, etc., que incluyen solvatos orgánicos y solvatos inorgánicos, incluyendo dichos solvatos inorgánicos hidratos; donde si un compuesto está asociado con dos o más moléculas de disolvente, las dos o más moléculas de disolvente pueden ser iguales o diferentes. En algunos casos, la referencia hecha en este documento a un compuesto de la invención incluirá una referencia explícita a una de las formas anteriores, por ejemplo, sales y/o solvatos; sin embargo, esta referencia es solo para énfasis, y no debe interpretarse como que excluye otras de las formas anteriores como se identificó anteriormente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución conservativa" se refiere a las sustituciones de aminoácidos que son conocidas por los expertos en esta técnica y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un único aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Edición 1987)). Dichas sustituciones a modo de ejemplo se realizan preferiblemente de acuerdo con los expuestos en la Tabla II y la(s) Tabla(s) III(a-b). Por ejemplo, tales cambios incluyen sustituir cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) para el ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) para asparagina (N) y viceversa; y serina (S) para treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservadoras, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) con frecuencia pueden ser intercambiables, al igual que la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en lugares en los que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y los diferentes pK de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. Aún otros cambios pueden considerarse "conservadores" en entornos particulares (ver, p. ej. Tabla III(a) en este documento; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Universidad de Stanford); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995, 19 de mayo; 270 (20): 11882 - 11886). Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservadoras conocidas.
La expresión "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de las células, la función de las células y/o causa la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, auristatinas (por ejemplo, auristatina E, auristatina F, MMAE y MMAF), auromicinas, maitansinoides, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolastatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxols, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena de abrina A, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogenina, reestrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32 e isótopos radiactivos de Lu que incluyen Lu177. Los anticuerpos también pueden conjugarse con una enzima activadora anticancerosa pro-fármaco capaz de convertir el profármaco en su forma activa.
Como se usa en este documento, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se
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fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el documento EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 -48 (1993).
El término "agotar", en el contexto del efecto de un agente de unión a 191P4D12 en células que expresan 191P4D12, se refiere a una reducción o eliminación del número de células que expresan 191P4D12.
La expresión "producto génico" se usa en el presente documento para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, un "producto génico de la invención" a veces se denomina en este documento "secuencia de aminoácidos cancerígena", "proteína cancerosa", "proteína de un cáncer enumerado en la Tabla I", un "ARNm canceroso", "ARNm de un cáncer enumerado en la Tabla I", etc. En una realización, la proteína del cáncer está codificada por un ácido nucleico de la FIG. 1. La proteína del cáncer puede ser un fragmento, o alternativamente, ser la proteína de longitud completa codificada por los ácidos nucleicos de la FIG. 1. En una realización, se usa una secuencia de aminoácidos de cáncer para determinar la identidad o similitud de secuencia. En otra realización, las secuencias son variantes alélicas de origen natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la FIG. 1. En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia como se describe adicionalmente en este documento.
Los anticuerpos "hetero-conjugados" son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo hetero-conjugado" se refiere a dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se pueden preparar usando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, que incluyen el uso de agentes de reticulación. Ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. No. 4.676.980.
El término "homólogo" se refiere a una molécula que exhibe homología con otra molécula, por ejemplo, que tiene secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.
En una realización, el anticuerpo proporcionado en este documento es un "anticuerpo humano". Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el que esencialmente las secuencias completas de las secuencias de cadena ligera y cadena pesada, que incluyen las regiones determinantes complementarias (CDR), son de genes humanos. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan mediante la técnica de trioma, la técnica de células B humanas (véase, por ejemplo, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), técnica de transformación de VEB (véase, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 77-96 (1985)), o usando presentación de fagos (véase, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). En una realización específica, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. Las técnicas para fabricar tales anticuerpos de parcialmente a completamente humanos se conocen en la técnica y se puede usar cualquiera de tales técnicas. De acuerdo con una realización particularmente preferida, las secuencias de anticuerpo completamente humanas se preparan en un ratón transgénico diseñado por ingeniería genética para expresar genes de anticuerpos de cadena pesada y ligera humanos. Una descripción ejemplar de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos encontrados en la Solicitud N° WO 02/43478 y en la Patente de EE.UU. N° 6.657.103 (Abgenix) y su progenie. Las células B de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado se pueden fusionar para formar líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Ver, por ejemplo, la patente de los EE.UU. Nos. 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998).
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Cabilly U.S. Pat. N° 4.816.567; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10033; y Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press 1996).
Los términos "inhibir" o "inhibición de", tal como se usan en el presente documento, significan reducir en una cantidad medible, o prevenir completamente.
Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material tal como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, los péptidos aislados de acuerdo con la invención preferiblemente no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes 191P4D12 o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen 191P4D12 o fragmentos del mismo. Cualquier experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de 191P4D12 aislado. Se dice que una proteína está "aislada", por ejemplo, cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar las proteínas 191P4D12 de los
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constituyentes celulares que normalmente están asociados con la proteína. Cualquier experto en la materia puede emplear fácilmente métodos de purificación convencionales para obtener una proteína 191P4D12 aislada. Alternativamente, una proteína aislada se puede preparar por medios químicos.
Los "marcadores" adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimio-luminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las patentes de EE.UU. Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Además, los anticuerpos proporcionados en este documento pueden ser útiles como el componente de unión a antígeno de fluoro-cuerpos. Ver, por ejemplo, Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003).
El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, que incluye ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un ser humano.
Los términos "cáncer metastásico" y "enfermedad metastásica" se refieren a los cánceres que se han diseminado a los ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes, y están destinados a incluir la enfermedad en estadio D bajo el sistema AUA y la etapa T * N * M + en el sistema TNM.
El término "modulador" o la expresión "compuesto de prueba" o "candidato a fármaco" o los equivalentes gramaticales que se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., que se probará según su capacidad de alterar directamente o indirectamente el fenotipo de cáncer o la expresión de una secuencia de cáncer, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o proteína, o efectos de secuencias de cáncer (por ejemplo, señalización, expresión génica, interacción de proteínas, etc.). En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína de cáncer de la invención. Por "neutralizar" se entiende que se inhibe o bloquea una actividad de una proteína, junto con el efecto consiguiente sobre la célula. En otro aspecto, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y su proteína correspondiente, de la invención normalizando los niveles de dicha proteína. En realizaciones preferidas, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o los ácidos nucleicos del perfil de expresión o las proteínas proporcionadas en este documento, o las rutas efectoras corriente abajo. En una realización, el modulador suprime un fenotipo del cáncer, p. ej., a una huella digital de tejido normal. En otra realización, un modulador indujo un fenotipo del cáncer. Generalmente, se ejecuta una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección.
Los moduladores, los fármacos candidatos o los compuestos de ensayo abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2.500 Dalton. Las moléculas pequeñas preferidas son inferiores a 2000, o inferiores a 1500 o inferiores a 1000 o inferiores a 500 D. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poli-aromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente preferidos son los péptidos. Una clase de moduladores son los péptidos, por ejemplo, de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, prefiriéndose de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferido de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferiblemente, la proteína moduladora del cáncer es soluble, incluye una región no transmembrana, y/o tiene una Cys N-terminal para ayudar en la solubilidad. En una realización, el extremo C del fragmento se mantiene como un ácido libre y el extremo N es una amina libre para ayudar en el acoplamiento, es decir, a la cisteína. En una realización, una proteína de cáncer de la invención se conjuga con un agente inmunogénico como se describe en el presente documento. En una realización, la proteína del cáncer se conjuga con BSA. Los péptidos de la invención, por ejemplo, de longitudes preferidas, se pueden unir entre sí o con otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser digeridos de proteínas de origen natural como se describe anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "sesgados". En una realización preferida, los moduladores basados en péptido/proteína son anticuerpos, y fragmentos de los mismos, como se definen en este documento.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) incluyen típicamente una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. En una realización, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de epítopo, afinidades o avideces dentro de un único antígeno que contiene múltiples epítopos antigénicos. El
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modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se unirán con al menos una Kd de aproximadamente 1 pM, más habitualmente de al menos aproximadamente 300 nM, típicamente de al menos aproximadamente 30 nM, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nM, más preferiblemente de al menos aproximadamente 3 nM o mejor, generalmente determinado por ELISA.
Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste y de tampón del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.
"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica, inerte y/o que es fisiológicamente compatible con humanos u otros mamíferos.
El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y está destinado a incluir formas de ADN y/o ARN de cadena simple o doble. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con "oligonucleótido". Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria en la que la timidina (T), como se muestra, por ejemplo, en la FIG. 1, también puede ser uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales en el ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).
El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la especificación, se usan designaciones estándar de tres letras o letras únicas para aminoácidos. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con "péptido" o "proteína".
Una molécula de ADN o ARN "recombinante" es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro.
Como se usa en el presente documento, la expresión "Fv monocatenario" o "scFv" o anticuerpo "monocatenario" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, The Pharmacology Of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
Como se usa en el presente documento, el término "específico", la expresión "se une específicamente" y la expresión "específicamente se une" se refieren a la unión selectiva del anticuerpo al epítopo del antígeno diana. Los anticuerpos pueden analizarse para determinar la especificidad de la unión comparando la unión al antígeno apropiado con la unión al antígeno irrelevante o a la mezcla de antígenos en un conjunto dado de condiciones. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7, y preferiblemente 10 veces más que el antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos, entonces se considera que es específico. En una realización, un anticuerpo específico es uno que solo se une al antígeno 191P4D12, pero que no se une al antígeno irrelevante. En otra realización, un anticuerpo específico es aquel que se une al antígeno 191P4D12 humano pero que no se une a un antígeno 191P4D12 no humano con 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor de homología de aminoácidos con el antígeno 191P4D12. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une al antígeno 191P4D12 humano y se une al antígeno 191P4D12 murino, pero con un mayor grado de unión del antígeno humano. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une al antígeno 191P4D12 humano y se une al antígeno 191P4D12 de los primates, pero con un mayor grado de unión del antígeno humano. En otra realización, el anticuerpo específico se une al antígeno 191P4D12 humano y a cualquier antígeno 191P4D12 no humano, pero con un mayor grado de unión del antígeno humano o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en este documento "tratar" o "terapéutico" y términos gramaticalmente relacionados, se refiere a cualquier mejora de cualquier consecuencia de la enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menos morbilidad y/o una disminución de los efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad alternativa terapéutica; como se aprecia fácilmente en la técnica, la erradicación completa de la enfermedad es una opción preferida pero no obligatoria para un acto de tratamiento.
El término "variante" se refiere a una molécula que exhibe una variación de un tipo o norma descrito, tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la(s) posición(es) correspondiente(s) de una proteína específicamente descrita (por ejemplo, la proteína 191P4D12 mostrada en la figura 1). Un análogo es un
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ejemplo de una proteína variante. Las isotermas de empalme y corte y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son otros ejemplos de variantes.
Las "proteínas 191P4D12" y/o las "proteínas relacionadas con 191P4D12" de la invención incluyen las específicamente identificadas en la presente (véase la figura 1), así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que se pueden aislar/generar y caracterizar sin experimentación indebida siguiendo los métodos descritos en este documento o fácilmente disponibles en la técnica. También se incluyen proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 191P4D12 o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína 191P4D12 y un polipéptido heterólogo. Tales proteínas 191P4D12 se denominan colectivamente proteínas relacionadas con 191P4D12, las proteínas de la invención, o 191P4D12. La expresión "proteína relacionada con 191P4D12" se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteína 191P4D12 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos.
II.) Anticuerpos 191P4D12
Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a proteínas relacionadas con 191P4D12 (véase la figura 1). En una realización, el anticuerpo que se une a las proteínas relacionadas con 191P4D12 es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína 191P4D12 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo que se une específicamente a la proteína 191P4D12 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluye anticuerpos que pueden unirse a otras proteínas relacionadas con 191P4D12. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a la proteína 191P4D12 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 pueden unirse a proteínas relacionadas con 191P4D12 tales como las variantes de 191P4D12 y los homólogos o análogos de las mismas.
Los anticuerpos 191P4D12 de la invención son particularmente útiles en ensayos de pronóstico de cáncer (véase, por ejemplo, Tabla I), imágenes y metodologías terapéuticas. De forma similar, dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento y/o pronóstico del cáncer de colon y otros, en la medida en que 191P4D12 también se expresa o se sobreexpresa en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de 191P4D12, tales como cánceres de colon avanzados o metastásicos u otros cánceres avanzados o metastásicos.
Diversos métodos para la preparación de anticuerpos, específicamente anticuerpos monoclonales, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar inmunizando un huésped mamífero adecuado usando una proteína, péptido o fragmento relacionado con 191P4D12, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también se pueden usar proteínas de fusión de 191P4D12, tales como una proteína de fusión GST 191P4D12. En una realización particular, una proteína de fusión de GST que comprende la totalidad o la mayoría de la secuencia de aminoácidos de la FIG. 1 se produce y luego se usa como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína relacionada con 191P4D12 y se usa como un inmunógeno.
Además, se usan técnicas de inmunización con ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin proteína 191P4D12 purificada o células que expresan 191P4D12) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (para una revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
La secuencia de aminoácidos de una proteína 191P4D12 como se muestra en la FIG. 1 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína 191P4D12 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de 191P4D12 se usan para identificar regiones hidrófilas en la estructura 191P4D12. Las regiones de una proteína 191P4D12 que muestran una estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente usando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o el análisis de Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilicidad se pueden generar usando el método de Hopp, T. P. y Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828. Los perfiles de hidropática se pueden generar usando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. El porcentaje (%) de perfiles de Residuos Accesibles se puede generar usando el método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Los perfiles de flexibilidad promedio se pueden generar usando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Se pueden generar perfiles de viraje beta utilizando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Por lo tanto, cada región identificada por cualquiera de estos programas o métodos está dentro del alcance de la presente invención. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos 191P4D12 se ilustran adicionalmente por medio de los ejemplos proporcionados en este documento. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para uso como un inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos en la técnica los métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína transportadora. En algunas circunstancias, se usa la
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conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, los reactivos de enlace tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., son efectivos. La administración de un inmunógeno de 191P4D12 a menudo se lleva a cabo mediante inyección durante un período de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la técnica. Durante el programa de inmunización, se pueden tomar títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales 191P4D12 pueden producirse por diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se preparan líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado usando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan células B productoras de anticuerpos, como se conoce en general. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante inmunoensayo en el que el antígeno es una proteína relacionada con 191P4D12. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado, las células se pueden expandir y los anticuerpos pueden producirse a partir de cultivos in vitro o de fluido de ascitis.
Los anticuerpos o fragmentos de la invención también se pueden producir por medios recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de una proteína 191P4D12 también se pueden producir en el contexto de anticuerpos injertados de la región determinante de la complementariedad (CDR) o quiméricos con origen en múltiples especies. También se pueden producir anticuerpos humanizados o humanos de 191P4D12, y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, sustituyendo una o más de las CDR de anticuerpos no humanos por secuencias de anticuerpos humanos correspondientes, son bien conocidos (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323 - 327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534 - 1536). Ver también, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden anticuerpos 191P4D12 completamente humanos (MAb 191P4D12). Diversos métodos en la técnica proporcionan medios para producir MAb 191P4D12 completamente humanos. Por ejemplo, una realización preferida proporciona técnicas que usan ratones transgénicos, inactivados para la producción de anticuerpos, modificados genéticamente con loci de cadenas pesadas y ligeras humanas denominadas Xenomouse (Amgen Fremont, Inc.). Una descripción ejemplar de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se puede encontrar en la patente de EE.UU. No. 6.657.103. Ver, también, las patentes de los EE. UU. Nos. 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Mendez, et. al. Nature Genetics, 15: 146 - 156 (1998); Kellerman, S. A. y Green, L. L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593 - 597 (2002).
Además, los anticuerpos humanos de la invención se pueden generar usando el ratón HuMAb (Medarex, Inc.) que contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina pesadas (mu y gamma) humanas no reordenadas y ligeras kappa, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena mu y kappa endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859).
En otra realización, se pueden generar anticuerpos completamente humanos de la invención usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en la presente memoria "ratones KM", se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722727 y la publicación PCT WO 02/43478 de Tomizuka, et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando métodos de presentación en fagos para explorar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Ver, por ejemplo: Pat. de EE. UU. Nos. 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; Pat. de EE. UU. Nos. 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; Pat. de EE. UU. Nos. 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y la patente de los EE. UU. Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando ratones SCID en los que las células inmunes humanas se han reconstituido de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.
En una realización preferida, los MAbs de 191P4D12 de la invención comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado Ha22-2(2,4)6.1 producido por un hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) N° de Acceso: PTA -11267 (véase, figura 3), o regiones variables pesadas y ligeras que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de Ha22-2(2,4)6.1, y en las que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los MAb 191P4D12 de la invención. La región variable de la cadena pesada de Ha22-2(2,4)6.1 consiste en la secuencia de aminoácidos que varía desde el 20° residuo E hasta el 136° residuo de la SEQ ID N°: 7, y la región variable de la cadena ligera de Ha22-2(2,4)6.1 consiste en la secuencia de aminoácidos que varía desde el 23° residuo D hasta el 130° residuo R de la SEQ ID N°: 8. Como la región constante del anticuerpo de la invención, se puede elegir cualquier subclase de región constante. En una realización, se puede
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usar la región constante de IgG1 humana como la región constante de la cadena pesada y la región constante Ig kappa humana como la región constante de la cadena ligera.
Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde:
(a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%
homóloga a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada expuesta en la FIG. 3; y
(b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en la FIG. 3.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos Vh y/o Vl pueden ser un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogas con las secuencias Vh y Vl expuestas en la FIG. 3.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada humanizada y una región variable de cadena ligera humanizada, en donde:
(a) la región variable de la cadena pesada comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de la cadena pesada expuestas en la FIG. 3;
(b) la región variable de la cadena ligera comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR
de la región variable de la cadena ligera expuestas en la FIG. 3.
Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones a restos de marco dentro de Vh y/o Vl (por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo). Típicamente, tales modificaciones de estructura se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "revertir" uno o más residuos del marco a la secuencia correspondiente de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias de marco de anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las cuales se deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región estructural a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR (por ejemplo, "retromutado" de leucina a metionina). También se pretende abarcar tales anticuerpos "retromutados" por la invención.
Otro tipo de modificación de marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T y reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0153043 de Carr et al.
Además, o alternativo a las modificaciones realizadas dentro de las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como semivida en suero, fijación del complemento, unión al receptor de Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un MAb 191P4D12 de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, uno o más restos químicos se pueden unir al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del MAb. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.
En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de EE.UU. N° 5.677.425 de Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o aumentar o disminuir la estabilidad del MAb 191P4D12.
En otra realización, la región de bisagra Fc de un anticuerpo está mutada para disminuir la semivida biológica del MAb 191P4D12. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra de Fc de manera que el anticuerpo tiene un enlace de proteína A estafilocócico (SpA) deteriorado con respecto a la unión de SpA del dominio de bisagra nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la patente de EE.UU. N° 6.165.745 por Ward et al.
En otra realización, el MAb 191P4D12 se modifica para aumentar su semivida biológica. Varios enfoques son posibles. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir como se describe en la patente de EE.UU. No. 6.277.375 a Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor natural tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de EE.UU. Nos. 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.
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En otras realizaciones más, la región Fc se altera reemplazando al menos un resto de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la función o funciones efectoras del MAb 191P4D12. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de residuos aminoácidos específicos pueden reemplazarse con un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector al que se modifica la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 de complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes de EE.UU. Nos. 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.
La reactividad de los anticuerpos 191P4D12 con una proteína relacionada con 191P4D12 puede establecerse mediante varios medios bien conocidos, que incluyen análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA y FACS usando, según sea apropiado, proteínas relacionadas con 191P4D12, células que expresan 191P4D12 o extractos de las mismas. Un anticuerpo 191P4D12 o un fragmento del mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Además, se generan anticuerpos bi-específicos específicos para dos o más epítopos de 191P4D12 usando métodos generalmente conocidos en la técnica. Los anticuerpos homodiméricos también se pueden generar mediante técnicas de entrecruzamiento conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
En aún otra realización preferida, el MAb 191P4D12 de la invención es un anticuerpo que comprende una cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado como Ha22-2(2,4)6.1. La cadena pesada de Ha22-2(2,4)6.1 consiste en la secuencia de aminoácidos que varía desde el 20° residuo E hasta el 466° residuo K de la SEQ ID NO: 7 y la cadena ligera de Ha22-2(2,4)6,1 consiste en una secuencia de aminoácidos que varía desde el 23° residuo D hasta el 236° residuo C de la secuencia SEQ ID NO: 8. La secuencia de los cuales se expone en la FIG. 2 y FIG. 3. En una realización preferida, Ha22-2(2,4)6.1 está conjugado con un agente citotóxico.
El hibridoma que produce el anticuerpo designado Ha22-2(2,4)6.1 se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (AtCc), P.O. Box 1549, Manassas, Va. 20108 el 18 de agosto de 2010 y número de acceso asignado PTA-11267.
III.) Conjugados de anticuerpo y fármaco en general
En otro aspecto, la invención proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (CAFs), que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de bacterias, hongos, plantas o de origen animal, o fragmentos de los mismos) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En otro aspecto, la invención proporciona además métodos para usar los CAF. En un aspecto, un CAF comprende cualquiera de los MAb 191P4D12 de la presente invención unidos covalentemente a un agente citotóxico o a un agente detectable.
El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, medicamentos para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; Pat. U.S. N° 4.975.278) permite la administración dirigida del resto del fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en el mismo, donde la administración sistémica de estos fármacos sin conjugar puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como para las células tumorales que se buscan eliminar (Baldwin et al. al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en "Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications", A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Se busca la máxima eficacia con la toxicidad mínima. Se ha mostrado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183 - 87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Las toxinas usadas en conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025 - 1028; Mandler el al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786 - 791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden hacer valer sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.
Ejemplos de conjugados de fármacos con anticuerpos son ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) que es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisótopos 111In o 90Y unidos por un ligante-quelante de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12): 4336 - 42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69).
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Además, el MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto de un anticuerpo hu CD33 unido a caliqueamicina, se aprobó en 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; patentes de los EE. UU. Nos. 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001).
Además, el Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 unido mediante el enlazante disulfuro SPP al resto del fármaco maitansinoide, DM1, avanza a ensayos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico y otros.
Además, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de fármaco y anticuerpo compuesto por el anticuerpo monoclonal anti-próstata específico de membrana (PSMA) vinculado al resto fármaco maytansinoide, DM1, está en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata.
Finalmente, los péptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específicos para CD30 en neoplasias hematológicas) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784) y se encuentran en desarrollo terapéutico.
Además, los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de CAFs se describen en este documento. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena de difteria A, fragmentos no enlazantes activos de toxina diftérica, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantininas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcin, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogenina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 octubre de 1993. Una variedad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al. (1987) Science, 238: 1098. El ácido 1 -isotiocianatobencil-3-metildietilén triaminapentaacético marcado con carbono- 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (documento WO94/11026).
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en este documento.
III (A). Maitansinoides
Los compuestos de maitansina adecuados para usar como restos de fármaco maitansinoide son bien conocidos en la técnica, y se pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos, producidos usando técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973), o análogos de maitansinol y de maitansinol preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
Los restos de fármaco maitansinoide ilustrativos incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tal como: C-19-declorado (Patente de Estados Unidos N° 4.256.746) (preparado por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) +/- C-19-declorado (patente de EE.UU. Números 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y C-20- demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/- decloro (Patente de Estados Unidos N° 4.294.757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo), y los que tienen modificaciones en otras posiciones
Los restos de fármaco de maitansinoide a modo de ejemplo también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (Patente de Estados Unidos N° 4.424.219) (preparada mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetilo (demetoxi/CH2OR) (Patente de Estados Unidos N° 4.331.598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (Patente de Estados Unidos N° 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia); C-15- hidroxi/aciloxi (Patente de Estados Unidos N° 4.364.866) (preparada mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (patente de Estados Unidos Nos. 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-desmetilo (patente de Estados Unidos Nos. 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (Patente de Estados Unidos N° 4.371.533) (preparada por la reducción de tricloruro de titanio/LAH de maitansinol).
Los CAF que contienen maitansinoides, los métodos para prepararlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nos. 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1,
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cuyas descripciones se incorporan expresamente en este documento por referencia. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describió CAF que comprendían un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para células de cáncer de colon cultivadas, y mostraba actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen CAFs en los que se conjugó un maitansinoide a través de un enlazador disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que une el oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3x105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco de maitansinoide libre, que podría incrementarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en ratones.
III (B). Auristatinas y Dolastatinas
En algunas realizaciones, el CAF comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos de dolostatinas y derivados, las auristatinas (patente de EE.UU. Nos. 5.635.483; 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents y Chemother. 45 (12): 3580-3584) y tienen actividad anticancerígena (Patente de Estados Unidos N° 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). El resto del fármaco dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto del fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
Ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen las fracciones de fármaco de monometilauristatina unidas al extremo N DE y DF, descritas en "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research", Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en Estados Unidos Publicación de Patente No. 2005/0238649, cuya descripción se incorpora expresamente por referencia en su totalidad.
Una realización de auristatina ejemplar es MMAE (en la que la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de fármaco y anticuerpo).
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Otra realización ejemplar de auristatina es MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo y fármaco (documento US 2005/0238649):
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Las realizaciones ejemplares adicionales que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes enlazadores (descritos adicionalmente en este documento) tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde Ab significa anticuerpo, S es un azufre del anticuerpo, y p es de 1 a aproximadamente 8):
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Típicamente, las fracciones de fármaco basadas en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los restos de fármaco auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos de: la patente de EE.UU. No. 5.635.483; Pat. de EE.UU. No. 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243 - 277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719 - 725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778-784.
III (C). Caliqueamicina
En otras realizaciones, el CAF comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones sub-picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, ver la patente de EE.UU. Nos. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, Y11, a2I, as1, N-acetii-Y-i1, PSAG y 9^ (Hinman et al. al., Cancer Research 53: 3336 - 3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925 - 2928 (1998) y las patentes de EE. UU. antes mencionadas para American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos aumenta en gran medida sus efectos citotóxicos.
III (D). Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL- E33288 descrito en la patente de EE.UU. Nos. 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas (Patente de Estados Unidos N° 5.877.296).
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena diftérica A, fragmentos activos no enlazantes de toxina diftérica, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantininas, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogenina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.
La presente invención además contempla un CAF formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa, DNasa).
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Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para la resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética (IRM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otras se pueden incorporar en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Se pueden unir marcadores como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 se puede unir a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun 80: 49-57 se puede usar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
IV.) Compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco que se unen a 191P4D12
La presente invención proporciona, entre otros, compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco para la administración dirigida de fármacos. Los inventores han descubierto que los compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco tienen una potente actividad citotóxica y/o citostática contra las células que expresan 191P4D12. Los compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco comprenden una unidad de anticuerpo unida covalentemente a al menos una unidad de fármaco. Las unidades farmacéuticas se pueden unir covalentemente directamente o a través de una unidad enlazante (LU).
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente fórmula:
L- (LU-D)p (I)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; donde:
L es la unidad de anticuerpo, por ejemplo, MAb 191P4D12 de la presente invención, y (LU-D) es un resto de una unidad enlazante-unidad de fármaco, en donde:
LU- es una unidad enlazante, y
-D es una unidad de fármaco que tiene actividad citostática o citotóxica contra una célula diana; y p es un número entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 10, de 2 a 9, de 2 a 8, de 2 a 7, de 2 a 6, de 2 a 5, de 2 a 4 o de 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En algunas realizaciones, p es 2 ó 4.
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente fórmula:
L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
L es la unidad de anticuerpo, por ejemplo, MAb 191P4D12; y -Aa-Ww-Yy- es una unidad de Enlazador (LU), en la que:
-A- es una unidad ensanchadora, a es 0 ó 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido, w es un número entero que va desde 0 a 12,
-Y- es una unidad espaciadora autoinmolable, y es 0, 1 ó 2;
-D es una unidad farmacéutica que tiene actividad citostática o citotóxica contra la célula diana; y p es un número entero de 1 a 20.
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En algunas realizaciones, a es 0 ó 1, w es 0 ó 1, e y es 0, 1 ó 2. En algunas realizaciones, a es 0 ó 1, w es 0 ó 1, e y es 0 ó 1. En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ó 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 8, de 2 a 7, de 2 a 6, de 2 a 5, de 2 a 4 o de 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En algunas realizaciones, p es 2 ó 4. En algunas realizaciones, cuando w no es cero, y es 1 ó 2. En algunas realizaciones, cuando w es 1 a 12, y es 1 ó 2. En algunas realizaciones, w es de 2 a 12 e y es 1 ó 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w e y son 0.
Para las composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos, la carga farmacéutica está representada por p, el número promedio de moléculas de fármaco por anticuerpo. La carga farmacéutica puede variar de 1 a 20 medicamentos (D) por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo en la preparación de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. La distribución cuantitativa de conjugados de anticuerpo y fármaco en términos de p también puede determinarse. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de conjugados de anticuerpo-fármaco homogéneos donde p es un cierto valor de conjugados de anticuerpo-fármaco con otras cargas farmacéuticas se puede lograr por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. En realizaciones ejemplares, p es de 2 a 8.
La generación de compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, los compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco comprenden MAb de 191P4D12 como la unidad de anticuerpo, un fármaco y, opcionalmente, un enlazante que se une al fármaco y al agente de unión. En una realización preferida, el anticuerpo es MAb 191P4D12 que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo designado como Ha22-2(2,4)6.1 descrito anteriormente. En una realización más preferida, el anticuerpo es 191P4D12 MAb que comprende la cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado Ha22-2(2,4)6.1 descrito anteriormente. Están disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de fármacos y/o enlazantes a agentes de unión. Esto se logra a menudo por la reacción de los residuos de aminoácidos del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que incluye los grupos amina de lisina, los grupos ácidos carboxílicos libres de ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de cisteína y los diversos restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos más comúnmente utilizados de unión covalente es la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Adicionalmente, se han usado agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molécula de anticuerpo. También está disponible para la unión de fármacos a agentes de unión la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, formando así un aldehído que luego reacciona con el agente de unión. La unión se produce mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. Los isotiocianatos también se pueden usar como agentes de acoplamiento para unir covalentemente fármacos a agentes aglutinantes. Los expertos en la técnica conocen otras técnicas y están dentro del alcance de la presente invención.
En ciertas realizaciones, un intermedio, que es el precursor del enlazante, se hace reaccionar con el fármaco en condiciones apropiadas. En ciertas realizaciones, se usan grupos reactivos en el fármaco y/o el intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermedio, o el fármaco derivatizado, se hace reaccionar subsiguientemente con el MAb 191P4D12 en condiciones apropiadas.
Cada una de las unidades particulares de los compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco se describe con más detalle en el presente documento. La síntesis y estructura de las unidades de enlazante ejemplares, unidades del ensanchador, unidades de aminoácidos, unidad espaciadora autoinmolable y unidades farmacéuticas también se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2003-0083263, 2005-0238649 y 2005-0009751.
V.) Unidades enlazantes
Típicamente, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenden una unidad enlazante entre la unidad farmacéutica y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, el enlazante es escindible en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del enlazante libera la unidad farmacéutica del anticuerpo en el entorno intracelular. En otras realizaciones más, la unidad enlazante no es escindible y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo.
En algunas realizaciones, el enlazante es escindible por un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolea). El enlazante puede ser, por ejemplo, un enlazante peptidilo que se escinde mediante una peptidasa o enzima de proteasa intracelular, que incluye, pero sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el enlazante de peptidilo tiene al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales se sabe que hidrolizan derivados de fármacos dipeptídicos dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67 - 123). Los más típicos son los enlazantes de peptidilo que son escindibles por las enzimas que están presentes en las células que expresan 191P4D12. Por ejemplo, se puede usar un enlazante de peptidilo escindible por la proteasa dependiente de tiol catepsina B, que está altamente
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expresada en tejido canceroso (p. ej., Un enlazante Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 9)). Se describen otros ejemplos de dichos enlazantes, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 6.214.345, incorporada en este documento como referencia en su totalidad y para todos los propósitos. En una realización específica, el enlazante peptídico escindible por una proteasa intracelular es un enlazante Val-Cit o un enlazante Phe-Lys (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.214.345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazante Val- Cit) . Una ventaja del uso de la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente típicamente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades en suero de los conjugados son típicamente altas.
En otras realizaciones, el enlazante escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el enlazante sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede usar un enlazante lábil en ácido que sea hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares). (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67 - 123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Tales enlazantes son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como los que se encuentran en la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 ó 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas realizaciones, el enlazante hidrolizable es un enlazante de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico a través de un enlace de acilhidrazona (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.622.929).
En otras realizaciones más, el enlazante es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazante disulfuro). En la técnica se conocen diversos enlaces disulfuro, que incluyen, por ejemplo, aquellos que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N- succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT. (Véase, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver también la patente de los EE.UU. No. 4.880.935).
En aún otras realizaciones específicas, el enlazante es un enlazante de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387 - 93), un enlazante de maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg - Med - Chem. 3 (10): 1299-1304) o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).
En otras realizaciones más, la unidad enlazante no es escindible y el fármaco se libera por la degradación del anticuerpo. (Véase la Publicación de Estados Unidos N° 2005/0238649).
Típicamente, el enlazante no es sustancialmente sensible al entorno extracelular. Como se usa en este documento, "no es sustancialmente sensible al entorno extracelular", en el contexto de un enlazante, significa que no más de aproximadamente 20%, típicamente no más de aproximadamente 15%, más típicamente no más de aproximadamente 10%, y aún más típicamente no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 3%, o no más de aproximadamente 1% de los enlazantes, en una muestra de compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco, se escinden cuando el compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Que un enlazante no es sustancialmente sensible al entorno extracelular se puede determinar, por ejemplo, incubando con plasma el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 ó 24 horas) y luego cuantificando la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
En otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el enlazante promueve la internalización celular. En ciertas realizaciones, el enlazante promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico (es decir, en el medio del resto enlazante-agente terapéutico del compuesto conjugado anticuerpo-fármaco como se describe en este documento). En otras realizaciones más, el enlazante promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con el compuesto de auristatina como con el MAb 191P4D12.
Se describen diversos enlazantes ejemplares que se pueden usar con las presentes composiciones y métodos en los documentos WO 2004-010957, publicación estadounidense n.° 2006/0074008, publicación estadounidense n.° 20050238649 y publicación estadounidense n.° 2006/0024317.
Una "unidad de enlazante" (LU) es un compuesto bifuncional que se puede usar para unir una unidad farmacéutica y una unidad de anticuerpo para formar un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco. En algunas realizaciones, la unidad de enlazante tiene la fórmula:
-Aa-Ww-Yy-
en donde: -A- es una unidad ensanchadora, a es 0 ó 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido, w es un número entero que va de 0 a 12,
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-Y- es una unidad espadadora auto-inmoladora, e y es 0, 1 ó 2.
En algunas realizaciones, a es 0 ó 1, w es 0 ó 1, e y es 0, 1 ó 2. En algunas realizaciones, a es 0 ó 1, w es 0 ó 1, e y es 0 ó 1. En algunas realizaciones, cuando w es de 1 a 12, y es 1 ó 2. En algunas realizaciones, w es de 2 a 12 e y es 1 ó 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w e y son 0.
VI.) La unidad ensanchadora
La unidad ensanchadora (A), cuando está presente, es capaz de unir una unidad de anticuerpo a una unidad de aminoácido (-W-), si está presente, a una unidad espaciadora (-Y-), si está presente; o a una unidad de fármaco (D). Grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un MAb 191P4D12 (p. ej. Ha22-2(2,4)6.1), ya sea de forma natural o mediante manipulación química, incluyen, pero sin limitación, sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un hidrato de carbono y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son sulfhidrilo y amino. En un ejemplo, los grupos sulfhidrilo pueden generarse por reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de un MAb 191P4D12. En otra realización, los grupos sulfhidrilo pueden generarse por la reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un MAb 191P4D12 con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otros reactivos que generan sulfhidrilo. En ciertas realizaciones, el MAb 191P4D12 es un anticuerpo recombinante y está diseñado para transportar una o más lisinas. En ciertas otras realizaciones, el MAb 191P4D12 recombinante se modifica por ingeniería genética para transportar grupos sulfhidrilo adicionales, por ejemplo, cisteínas adicionales.
En una realización, la unidad ensanchadora forma un enlace con un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo. El átomo de azufre se puede derivar de un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo. Las unidades representativas de ensanchador de esta realización se representan dentro de los corchetes de las fórmulas IIIa y IIIb, en donde L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definieron anteriormente, y R17 se selecciona de -alquileno C1-C10-, -alquenileno C1-C10-, - alquinileno C1-C10-, carbociclo-, -O-(alquileno C1-C8)-, O-(alquenileno C1-C8)-, -O-(alquinileno C1-C8)-, arileno, alquileno C1-C10-arileno-, alquenileno C2-C10-arileno, alquinileno C2-C10-arileno, -arileno-alquileno C1-C10-, -arileno- alquenileno C2-C10-, -arileno-alquinileno C2-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo)-, - alquenileno C2-C10-(carbociclo)-, - alquinileno C2-C10-(carbociclo)-, -(carbociclo)-alquileno C1-C10-, -(carbociclo)-alquenileno C2-C10, -(carbociclo)- alquinileno C2-C10, -heterociclo-, alquilen C1-C10-(heterociclo)-, alquenileno C2-C10-(heterociclo)-, alquinileno C2-C10- (heterociclo)-, -(heterociclo)-alquileno C1-C10-, -(heterociclo)-alquenileno C2-C10-, -(heterociclo)-alquinileno C1-C10-, - (CH2CH2OX- , o -(CH2CH2O)r-CH2-, y r es un número entero que varía de 1-10, donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, carbociclo, heterociclo y arileno, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, carbociclo, heterociclo y arileno, ya sean solos o como parte de otro grupo, no están sustituidos. En algunas realizaciones, R17 se selecciona de alquileno C1-C10, -carbociclo-, -O-(alquileno C1-C8) -, -arileno-, alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, alquilen C1-C10 (carbociclo)-, -(carbociclo)-alquileno C1-C10-, heterociclo- C3-C8, alquileno C1-C10-(heterociclo)-, - (heterociclo)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2OX- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1-10, en el que dichos grupos alquileno no están sustituidos y el resto de los grupos está opcionalmente sustituido.
Debe entenderse a partir de todas las realizaciones ejemplares que incluso cuando no se indique expresamente, se pueden unir 1 a 20 restos de fármaco a un anticuerpo (p = 1-20).
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Una unidad de ensanchamiento ilustrativa es la de la Fórmula IIIa en la que R17 es -(CH2)5-:
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Otra unidad de Ensanchamiento ilustrativa es la de la Fórmula Illa en la que R15 * 17 * * 20 es -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es 2:
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Una unidad de ensanchamiento ilustrativa es la de la Fórmula IIIa en donde R17 es arileno o arileno-alquileno C1- 5 C10-. En algunas realizaciones, el grupo arilo es un grupo fenilo no sustituido.
Todavía otra unidad de ensanchamiento ilustrativa es la de la Fórmula IIIb en la que R17 es -(CH2)5-:
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En ciertas realizaciones, la unidad ensanchadora está unida a la unidad de anticuerpo a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad ensanchadora. Una 10 unidad ensanchadora representativa de esta realización se representa dentro de los corchetes de Fórmula IV, en donde R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
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Debe observarse que, a lo largo de esta solicitud, el resto S en la fórmula siguiente se refiere a un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo, a menos que se indique lo contrario por el contexto.
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En otras realizaciones más, el ensanchador contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo
amino primario o secundario de un anticuerpo. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero sin limitación,
ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres
de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades
20 ensanchadoras representativas de esta realización se representan dentro de los corchetes de las fórmulas Va y Vb, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definieron anteriormente;
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En algunas realizaciones, el ensanchador contiene un sitio reactivo que es reactivo con un grupo de carbohidratos modificados (-CHO) que puede estar presente en un anticuerpo. Por ejemplo, un carbohidrato se puede oxidar levemente usando un reactivo como el peryodato de sodio y la unidad resultante (-CHO) del carbohidrato oxidado se 5 puede condensar con un ensanchador que contiene una funcionalidad como hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un hidrazina carboxilato y una arilhidrazida tales como las descritas por Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41. Las unidades ensanchadoras representativas de esta realización se representan dentro de los corchetes de las Fórmulas VIa, VIb y VIc, en las que -R17-, L-, -W-, - Y-, -D, w e y se definen como encima.
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VII.) La unidad de aminoácidos
La unidad de aminoácidos (-W-), cuando está presente, vincula la unidad ensanchadora con la unidad espaciadora si la unidad espaciadora está presente, vincula la unidad ensanchadora al resto farmacéutico si la unidad espaciadora está ausente, y vincula la unidad de anticuerpo a la unidad farmacéutica si la unidad ensanchadora y la 15 unidad espaciadora están ausentes.
Ww- puede ser, por ejemplo, una unidad de monopéptido, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad - W- tiene independientemente la fórmula indicada a continuación entre corchetes, y w es un número entero que va de 0 a 12:
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donde R19 es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, - CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, (CH2)4NHCHO, - 5 (CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo,
ciclohexilo,
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En algunas realizaciones, la unidad de aminoácido puede escindirse enzimáticamente por una o más enzimas, que incluyen una proteasa asociada a un cáncer o a un tumor, para liberar la unidad farmacéutica (-D), que en una 10 realización se protona in vivo después de la liberación para proporcionar un fármaco (D).
En ciertas realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos naturales. En otras realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos no naturales. Las unidades Ww ilustrativas están representadas por las fórmulas (VII) - (IX):
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en donde R20 y R21 son los siguientes:
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R20
R21
Bencilo
Metilo
Isopropilo
Isopropilo
Bencilo
Isobutilo
Sec-butilo
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H
(CH2)4NH2;
(CH2)4NH2;
(CH2)4NH2;
(CH2)3NHCONH2;
(CH2)3NHCONH2;
(CH2)3NHCONH2;
(CH2)3NHCONH2;
(CH2)3NHCONH2
Bencilo Metilo;
Bencilo (CH2)3NHC(=NH)NH2;
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en donde R20, R21 y R22 son los siguientes:
R20
R21
R22
Bencilo
Isopropilo
H
Bencilo
(CH2)4NH2;
Bencilo
(CH2)4NH2; y
Bencilo
(CH2)4NH2;
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en donde R20, R21, R22 y R23 son los siguientes:
R20
R21 R22 R23
H
Bencilo Isobutilo H; y
Metilo
Isobutilo Metilo Isobutilo
Las unidades ejemplares de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, unidades de fórmula VII en la que: R20 es bencilo y R21 es -(Ch2)4NH2; R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)4NH2; o R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)3NHCONH2. Otra unidad ejemplar de aminoácidos es una unidad de fórmula VIII en la que R20 es bencilo, R21 es bencilo, y R22 es -(CH2)4NH2.
Las unidades -Ww- útiles pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor. En una realización, una unidad -Ww- es aquella cuya escisión está catalizada por la catepsina B, C y D, o una plasmina proteasa.
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En una realización, -Ww- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido o pentapéptido. Cuando R19, R20, R21, R22 o R23 son distintos de hidrógeno, el átomo de carbono al que R19, R20, R21, R22 o R23 está unido es quiral.
Cada átomo de carbono al que están unidos R19, R20, R21, R22 o R23 está independientemente en la configuración (S)
o (R).
En un aspecto de la unidad de aminoácidos, la unidad de aminoácidos es valina-citrulina (vc o Val-Cit). En otro aspecto, la unidad de aminoácido es fenilalanina-lisina (es decir, fk). En otro aspecto más de la unidad de aminoácidos, la unidad de aminoácidos es N-metilvalina-citrulina. En otro aspecto más, la unidad de aminoácidos es ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolincarboxilato lisina, ciclohexilalanina lisina, ácido isonipecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina y ácido isonipecótico.
VIII.) La unidad espaciadora
La unidad espaciadora (-Y-), cuando está presente, vincula una unidad de aminoácidos con la unidad farmacéutica cuando está presente una unidad de aminoácidos. Alternativamente, la unidad espaciadora vincula la unidad ensanchadora con la unidad farmacéutica cuando la unidad de aminoácidos está ausente. La unidad espaciadora también vincula la unidad farmacéutica a la unidad de anticuerpo cuando están ausentes la unidad de aminoácidos y la unidad ensanchadora.
Las unidades espaciales son de dos tipos generales: no autoinmolable o autoinmolable. Una unidad espaciadora no autoinmolable es una en la que una parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al resto del fármaco después de la escisión, particularmente enzimática, de una unidad de aminoácido del conjugado anticuerpo-fármaco. Los ejemplos de una unidad espaciadora no autoinmolable incluyen, pero sin limitación, una unidad espaciadora (glicina-glicina) y una unidad espaciadora de glicina (ambas representadas en el Esquema 1) (infra). Cuando un conjugado que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina se somete a una escisión enzimática a través de una enzima (por ejemplo, una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerígenas o una proteasa asociada a linfocitos), un resto glicina- glicina-fármaco o un resto glicina-fármaco se escinde de L-Aa-Ww-. En una realización, tiene lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana, escindiendo el enlace del resto glicina-fármaco y liberando el fármaco.
Esquema 1
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En algunas realizaciones, una unidad espaciadora no autoinmolable (-Y-) es -Gly-. En algunas realizaciones, una unidad espaciadora no autoinmolable (-Y-) es -Gly-Gly-.
En una realización, se proporciona un conjugado de fármaco-enlazante en el que la unidad espaciadora está ausente (-Yy- cuando y = 0), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Alternativamente, un conjugado que contiene una unidad espaciadora autoinmolable puede liberar -D. Como se usa en el presente documento, la expresión "espaciador autoinmolable" se refiere a un resto químico bifuncional que es capaz de unir de manera covalente dos restos químicos espaciados en una molécula tripartita estable. Se separará espontáneamente del segundo resto químico si se escinde su enlace al primer resto.
En algunas realizaciones, -Yy- es una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) (véanse los Esquemas 2 y 3) cuya porción de fenileno está sustituida con Qm, en donde Q es -alquilo C1-C8, -alquenilo C1-C8, -alquinilo C1-C8, -O- (alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C1-C8), -O-(alquinilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que va de 0 a 4. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
En algunas realizaciones, -Y- es un grupo PAB que está unido a -Ww- a través del átomo de nitrógeno del amino del grupo PAB, y conectado directamente a -D a través de un grupo carbonato, carbamato o éter. Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo particular, el esquema 2 representa un posible mecanismo de liberación de fármaco de
un grupo PAB que está unido directamente a -D a través de un grupo carbamato o carbonato como se describe por Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872.
Esquema 2
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5 En el Esquema 2, Q es -alquilo C-i-Ca, -alquenilo C-i-Ca, -alquinilo C-i-Ca, -O-(alquilo C-i-Ca), -O-(alquenilo C-i-Ca), -O- (alquinilo C-i-Ca), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4; y p varía de - a aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
Sin estar sujeto a ninguna teoría o mecanismo particular, el Esquema 3 describe un posible mecanismo de liberación -0 de fármaco de un grupo PAB que está unido directamente a -D a través de un enlace éter o amina, en donde D incluye el grupo de oxígeno o nitrógeno que es parte de la unidad farmacéutica.
Esquema 3
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En el Esquema 3, Q es -alquilo C1-C8, alquenilo C1-C8, alquinilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C1-C8), -O- (alquinilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4; y p varía de 1 a 5 aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolables incluyen, pero sin limitación, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) y orto o para-aminobencilacetales. Se pueden usar espaciadores que 10 experimenten ciclación tras hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anillo biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) y amidas del ácido 2- aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen aminas que están sustituidas en la posición a de glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) es también 15 un ejemplo de espaciadores autoinmolables.
En una realización, la unidad espaciadora es una unidad ramificada de bis(hidroximetil)-estireno (BHMS) como se representa en el esquema 4, que puede usarse para incorporar y liberar múltiples fármacos.
Esquema 4
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En el Esquema 4, Q es -alquilo C1-C8, alquenilo C1-C8, alquinilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C1-C8), -O-
(alquinilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4; n es 0 ó 1; y p varía de 1 a 5 aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
En algunas realizaciones, las fracciones -D son las mismas. En otra realización más, los restos -D son diferentes.
En un aspecto, las unidades espadadoras (-Yy-) están representadas por las fórmulas (X) - (XII):
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10 donde Q es -alquilo C1-C8, alquenilo C1-C8, alquinilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C1-C8), -O-(alquinilo C1-
C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que va de 0 a 4. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
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y
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Las realizaciones de la Fórmula I y II, que comprenden compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco, pueden incluir:
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donde w e y son cada uno 0, 1 ó 2, y
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donde w e y son cada uno 0,
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IX.) La unidad farmacéutica
El resto de fármaco (D) puede ser cualquier fármaco citotóxico, citostático o inmunomodulador (por ejemplo, inmunosupresor). D es una unidad farmacéutica (fracción) que tiene un átomo que puede formar una unión con la unidad espaciadora, con la unidad de aminoácido, con la unidad ensanchadora o con la unidad de anticuerpo. En 10 algunas realizaciones, la unidad farmacéutica D tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la
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unidad espadadora. Como se usa en este documento, las expresiones "unidad farmacéutica" y "resto farmacéutico" son sinónimos y se usan de forma intercambiable.
Las clases útiles de agentes citotóxicos, citostáticos o inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, aglutinantes de surco minoritario de ADN, inhibidores de replicación de ADN y agentes alquilantes.
En algunas realizaciones, el fármaco es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en la técnica como un derivado de dolastatina-10) o un derivado de la misma. La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre la auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con el ácido paraacetilbenzoico o el ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y la estructura de auristatinas ejemplares se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003-0083263; la Publicación de Patente Internacional No. WO 04/010957, la Publicación de Patente Internacional No. WO 02/088172, y las Pat. U.S. Nos. 7.498.298, 6.884.869, 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5,780,588; 5,665,860; 5.663.149; 5,635,483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5,504,191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4,986,988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414, cada una de las cuales se incorpora por referencia en este documento en su totalidad y para todos los fines.
Se ha demostrado que las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos y la división nuclear y celular y tienen actividad anticancerígena. Las auristatinas se unen a la tubulina y pueden ejercer un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa 191P4D12. Hay varios ensayos diferentes, conocidos en la técnica, que se pueden usar para determinar si una auristatina o el conjugado de anticuerpo-fármaco resultante ejercen un efecto citostático o citotóxico sobre una línea celular deseada.
Los métodos para determinar si un compuesto se une a tubulina son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390 - 4397; Hamel et al., Molecular Pharmacology, 1995, 47: 965 - 976; y Hamel et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990, 265: 28, 17141-17149. Para los fines de la presente invención, puede determinarse la afinidad relativa de un compuesto por tubulina. Algunas auristatinas preferidas de la presente invención se unen a tubulina con una afinidad que varía desde 10 veces menor (afinidad más débil) que la afinidad de unión de MMAE a tubulina a 10 veces, 20 veces o incluso 100 veces mayor (mayor afinidad) que la afinidad de unión de MMAE a tubulina.
En algunas realizaciones, -D es una auristatina de la fórmula De o Df:
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o una forma de sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde, independientemente en cada ubicación:
la línea ondulada indica un enlace;
R2 es -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20 o -alquinilo C2-C20;
R3 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -carbociclo, -alquileno C1-C20 (carbociclo), -alquenileno C2-C20(carbociclo), -alquinileno C2-C20(carbociclo), -arilo, -alquileno C1-C20(arilo), -alquenileno C2-C20(arilo), - alquinileno C2-C20(arilo), heterociclo, -alquileno C1-C20(heterociclo), -alquenileno C2-C20(heterociclo) o alquinileno C2- C20(heterociclo);
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R4 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, carbociclo, alquileno Ci-C2o(carbociclo), -alquenileno C2-C2o(carbociclo), -alquinileno C2-C20(carbociclo), arilo, alquileno C1-C20(arilo), -alquenileno C2-C20 (arilo), - alquinileno C2-C20(arilo), -heterociclo, alquileno C1-C20(heterociclo), -alquenileno C2-C20(heterociclo) o alquinileno C2- C20 (heterociclo);
R5 es -H o -alquilo C1-C8; o
R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)s- en donde Ra y Rb son independientemente -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, o -carbociclo y s es 2, 3, 4, 5 ó 6,
R6 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, o alquinilo C2-C20;
R7 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, carbociclo, -alquileno C1-C20 (carbociclo), -alquenileno C2-C20 (carbociclo), -alquinileno C2-C20 (carbociclo), -arilo, alquileno C1-C20 (arilo), -alquenileno C2-C20 (arilo), - alquinileno C2-C20 (arilo), heterociclo, alquileno C1-C20 (heterociclo), -alquenileno C2-C20 (heterociclo) o alquinileno C2-C20 (heterociclo);
cada R8 es independientemente -H, -OH, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -O-(alquilo C1-C20), -O- (alquenilo C2-C20) , -O-(alquinilo C1-C20) o -carbociclo;
R9 es -H -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, o alquinilo C2-C20;
R24 es -arilo, -heterociclo o -carbociclo;
R25 es -H, alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -carbociclo, -O-(alquilo C1-C20), -O-(alquenilo C2-C20), - O-(alquinilo C2-C20), u OR18, en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R26 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20 o -alquinilo C2-C20, -arilo, -heterociclo o -carbociclo;
R10 es -arilo o -heterociclo;
Z es -O, -S, -NH o -NR12, en donde R12 es alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20 o -alquinilo C2-C20;
R11 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -arilo, -heterociclo, -(R13O)m-R14, -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía de 1-1000 o m = 0-1000;
R13 es -alquileno C2-C20, -alquenileno C2-C20 o -alquinileno C2-C20;
R14 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20 o -alquinilo C2-C20;
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)n-SO3-alquilo C1- C20, -(CH2)n-SO3-alquenilo C2-C20, o -(CH2)n-SO3-alquinilo C2-C20;
cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20 o -(CH2)n- COOH; y
n es un número entero que varía de 0 a 6;
donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y heterociclo, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y heterociclo no están sustituidos.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 no están sustituidos y los grupos de R19, R20 y R21 están opcionalmente sustituidos como se describe en este documento.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que
R2 es alquilo C1-C8;
R3, R4 y R7 se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, carbociclo C3-C6 monocíclico, alquileno C1-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), -alquenileno C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), -alquinileno C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), arilo C6-C10, alquileno C1-C20 (arilo C6-C10), -
alquenileno C2-C20 (arilo C6-C10), -alquinileno C2-C20 (arilo C6-C10), heterociclo, alquileno C1-C20 (heterociclo), - alquenileno C2-C20 (heterociclo) o -alquinileno C2-C20 (heterociclo); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heterociclo están opcionalmente sustituidos;
5
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35
40
R5 es -H;
R6 es alquilo C1-C8;
cada R8 se selecciona independientemente de -OH, -O-(alquilo C1-C20), -O-(alquenilo C2-C20), o -O-(alquinilo C2-C20) en el que dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
R9 es -H o -alquilo C1-C8;
R24 es fenilo opcionalmente sustituido;
R25 es -OR18; en donde R18 es H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R26 se selecciona de -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20 o -carbociclo; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo y carbociclo están opcionalmente sustituidos; o una forma de sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que
R2 es metilo;
R3 es -H, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8 o -alquinilo C2-C8, donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
R4 es -H, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8, carbociclo C3-C6 monocíclico, -arilo C6-C10, alquileno C1-
C8 (arilo C6-C10), -alquenileno C2-C8 (arilo C6-C10), alquinileno C2-C8 (arilo C6-C10), alquileno C1-C8 (carbociclo C3-C6
monocíclico), alquenileno C2-C8 (carbociclo C3-C6 monocíclico), -alquinileno C2-C8 (carbociclo C3-C6 monocíclico); donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo y carbociclo, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos;
R5 es -H;
R6 es metilo;
R7 es alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8 o -alquinilo C2-C8; cada R8 es metoxi;
R9 es -H o -alquilo C1-C8;
R24 es -fenilo;
R25 es -OR18; en donde R18 es H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R26 es metilo;
o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en donde:
R2 es metilo; R3 es -H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5; R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o -alquilo C1-C8; R24 es fenilo; R25 es -OR18; en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O; y R26 es metilo; o una forma de sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo o alquilo C1-C3,
R3 es -H o -alquilo C1-C3;
R4 es alquilo C1-C5;
R5 es H;
R6 es alquilo C1-C3;
R7 es alquilo C1-C5;
R8 es -alcoxi C1-C3;
5
10
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25
30
35
40
45
R9 es -H o -alquilo C-i-Ca;
R24 es fenilo;
R25 es -OR18; en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O; y R26 es alquilo C1-C3;
o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que R2 es metilo;
R3, R4 y R7 se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20,
carbociclo C3-C6 monocíclico, -alquileno C1-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), alquenileno C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), alquinileno C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico), arilo C6-C10, alquileno C1-C20 (arilo C6-C10),
alquenileno C2-C20 (arilo C6-C10), alquinileno C2-C20 (arilo C6-C10), heterociclo, alquileno C1-C20 (heterociclo), alquenileno C2-C20 (heterociclo) o -alquinileno C2-C20 (heterociclo); donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heterociclo, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos;
R5 es -H;
R6 es metilo;
cada R8 es metoxi;
R9 es -H -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, o -alquinilo C2-C20; en el que dicho radical alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
R10 es arilo opcionalmente sustituido o heterociclo opcionalmente sustituido;
Z es -O-, -S-, -NH- o -NR12, en donde R12 es alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20 o alquinilo C2-C20, cada uno de los cuales es opcionalmente sustituido;
R11 es -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -arilo, -heterociclo, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2, en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heterociclo están opcionalmente sustituidos;
m es un número entero que varía de 1-1000 o m = 0;
R13 es alquileno C2-C20, alquenileno C2-C20 o alquinileno C2-C20, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido;
R14 es -H -alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, o alquinilo C2-C20, en el que dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)n-SO3-alquilo C1- C20, -(CH2)n-SO3- alquenilo C2-C20, o -(CH2)n-SO3-alquinilo C2-C20 en el que dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20 o -(CH2)n-COOH en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
n es un número entero que varía entre 0 y 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En algunas de estas realizaciones, R10 es fenilo opcionalmente sustituido.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 no están sustituidos y los grupos R10 y R11 son como se describen en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y heterociclo no están sustituidos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que
R2 es alquilo C1-C3; R3 es -H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5; R5 es -H; R6 es alquilo C1-C3; R7 es alquilo C1-C5;
R8 es alcoxi C1-C3; R9 es -H o -alquilo C1-C8; R10 es fenilo opcionalmente sustituido; Z es -O-, -S- o -NH-; R11 es
como se define en este documento; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
5
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15
20
25
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35
40
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que
R2 es metilo; R3 es -H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5; R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o -alquilo C1-C8; R10 es fenilo opcionalmente sustituido; Z es -O-, -S- o -NH-; y R11 es como se define en este documento; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que
R2 es metilo; R3 es -H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5; R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o alquilo C1-C8; R10 es fenilo; y Z es -O- o -NH- y R11 son como se define en la presente memoria, preferiblemente hidrógeno; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que
R2 es alquilo C1-C3; R3 es -H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5; R5 es -H; R6 es alquilo C1-C3; R7 es alquilo C1-C5; R8 es -alcoxi C1-C3; R9 es -H o -alquilo C1-C8; R10 es fenilo; y Z es -O- o -NH- y R11 es como se define en la presente memoria, preferiblemente hidrógeno; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En una realización ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H y R7 es sec-butilo. El resto de los sustituyentes es como se define en este documento.
Las Auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es H. El resto de los sustituyentes es como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula De o Df incluyen aquellas en las que cada aparición de R8 es -OCH3. El resto de los sustituyentes es como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es H. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que Z es -O- o -NH-. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que R10 es arilo. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que R10 es -fenilo. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que Z es -O-, y R11 es H, metilo o t-butilo. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que, cuando Z es -NH-, R11 es -(R13O)m-CH(R15)2, en donde R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que cuando Z es -NH-, R11 es -(R13O)m-CH(R15)2, en donde R15 es -(CH2VSO3H. El resto de los sustituyentes son como se define en este documento.
En realizaciones preferidas, cuando D es una auristatina de fórmula De, w es un número entero que varía de 1 a 12, preferiblemente de 2 a 12, y es 1 ó 2, y a es preferiblemente 1.
En algunas realizaciones, en donde D es una auristatina de fórmula Df, a es 1 y w e y son 0.
Las unidades farmacéuticas ilustrativas (-D) incluyen las unidades farmacéuticas que tienen las siguientes estructuras:

Claims (75)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Un conjugado de fármaco y anticuerpo que comprende un anticuerpo anti-191P4D12 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que consiste en el residuo de aminoácido 20 al residuo de aminoácido 136 de SEQ ID NO: 7 y una región variable de la cadena ligera que consiste en el residuo de aminoácido 23 al residuo de aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 8, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con monometil auristatina E (MMAE).
  2. 2. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en el residuo de aminoácido 20 al residuo de aminoácido 466 de la sEq ID NO: 7 y una cadena ligera que consiste en el residuo de aminoácido 23 al residuo de aminoácido 236 de SEQ ID NO: 8.
  3. 3. Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo anti-191P4D12 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido por un hibridoma depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) N° de entrada PTA-11267, y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo producido por un hibridoma depositado bajo el número de entrada ATCC PTA-11267, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con monometil auristatina E (MMAE).
  4. 4. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo producido por un hibridoma depositado bajo ATCC. N° de entrada PTA-11267, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo producido por un hibridoma depositado bajo ATCC. N° de entrada PTA-11267.
  5. 5. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 1 ó 3, en el que el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, Fd, dAb o scFv.
  6. 6. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
  7. 7. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo se produce recombinantemente.
  8. 8. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se conjuga con MMAE a través de una unidad enlazante.
  9. 9. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 8, en el que la unidad enlazante es escindible por enzimas.
  10. 10. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 8 ó 9, en el que la unidad enlazante forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo o fragmento del mismo.
  11. 11. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente fórmula:
    L - (LU - D)p,
    donde:
    L es el anticuerpo anti-191P4D12 o fragmento del mismo,
    (LU - D) es una unidad enlazante - resto de unidad farmacéutica, en donde:
    LU es una unidad enlazante, y D es MMAE; y
    p es un número entero de 1 a 20.
  12. 12. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 11, en el que p varía de 1 a 10, o donde p varía de 2 a 5.
  13. 13. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 11 ó 12, en el que la unidad enlazante tiene la fórmula:
    -Aa-Ww-Yy-,
    donde:
    10
    15
    -A- es una unidad ensanchadora, a es 0 ó 1;
    -W- es una unidad de aminoácidos, w es un número entero que va de 0 a 12;
    -Y- es una unidad espadadora, e y es 0, 1 ó 2.
  14. 14. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 13, en el que la unidad de aminoácido comprende valina-citrulina (Val-Cit).
  15. 15. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 13 ó 14, en el que: la unidad ensanchadora tiene la estructura de Fórmula IIIa:
    imagen1
    Fórmula IIIa
    la unidad de aminoácido es valina-citrulina (Val-Cit); y la unidad espaciadora tiene la estructura de Fórmula Xa:
    imagen2
    Fórmula Xa
  16. 16. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 15, en el que la unidad ensanchadora forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo o fragmento del mismo; y en el que la unidad espaciadora está unida a MMAE a través de un grupo carbamato.
  17. 17. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el conjugado 20 de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente estructura:
    imagen3
    donde p varía de 1 a 10.
  18. 18. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 17, en el que p varía de 2 a 5.
  19. 19. Un conjugado de anticuerpo y fármaco, como se define en una de las reivindicaciones 1 a 18, para su uso en el 25 tratamiento del cáncer en un sujeto.
  20. 20. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de la reivindicación 19, en donde el cáncer es un cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de mama.
  21. 21. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de la reivindicación 20, en el que el cáncer es un cáncer de 5 vejiga.
  22. 22. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de la reivindicación 21, en el que el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga avanzado.
  23. 23. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el método comprende además administrar al sujeto radiación o un agente quimioterapéutico.
    10 24. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el que el
    sujeto es un sujeto humano.
  24. 25. El conjugado de anticuerpo y fármaco para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que el método comprende administrar al sujeto el conjugado de anticuerpo y fármaco en una cantidad de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg.
    15 26. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 19 en una forma de dosis unitaria humana.
  25. 27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en la que la composición farmacéutica comprende además un agente quimioterapéutico.
  26. 28. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, que comprende de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg del conjugado de 20 anticuerpo y fármaco.
    Figura 1: La secuencia de ADNc (SEQ ID N0:1) y de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de 191P4D12. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796 incluyendo el codón de parada.
    1
    ggccgtcgttgttggccacaqcgtgggaagcagctctgggggagctcggagctcccgatc
    61
    aoggcttcttgggggtagctacggctgggtgtgtagaacggggccggggctggggctggg
    - oí
    fcqccctagtggagacccaagtgcgagaggcaagaactct.gcagcttcctgccttctgggt
    _si
    cagttccttattcaagtctgcagccggctcccagggagatctcggtggaacttcagaaac MPLSLGAEMVÍGPE
    241
    gctgggcagtctgcctttcaaccj^CCCCXGTCCCTGGGAGCCGAGATGTGGGGGCCTG
    14 301
    AWLLLLLLLASFXGRCPAGE AGGCCTGGCGGCTGCTCCTGCTACTGCTGGCATCATTTACAGGCuGGTGíXCCGCGSGTG
    34 LE? M DVVTVVLGQDAKLPCF
    361
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    54
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    431
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    34
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    541
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    L 1_ 4
    LRNAVQADESEYECRVSXFP
    601
    -GGTGCGCAACGCAGTGCAGGCGGATGAGGGCGAGTACGAGTGCCGGGTCAGCACCTTGC
    134 661
    AGSFQARLRLRVLVPPLPSL GCSGCGGCAGCGTGCAGGCGCGGCTGCGGGTCCGAGTGCTGGTGCCTCCCCTGCCCTCAC
    154
    NPGPALEEGQGLTLAAS C " A
    721
    rC5AATCCTGG7CCA3CACTAGAAGA3GGCCAGGGCCTGACCCTGGCAGCCTCC7GCACA3
    174
    EGSPAPSVXWDTEVKGTXSS
    731
    GT3AGGGCAGCCCAGCCCCCAGCGTGACCTGGGACACGGAGG"CAAAGGC?.CAACGTCCA
    134
    RSFKHSRSAAVTSEFHLVPS
    341
    3CGGTTCCT7CAA3CACTCCCGCTCGGCTGCCGTCACCTCAGAGTTCCACTTGGGGCCTA
    _ _ 4
    RSMNGQPLiCVVSUPGLLQD
    901
    jCGGCAGCAGGAATGGGGAGCGACTGAC'I’TGTGTGGTG'í'CCCATCCTGGCCTGCTCCAGG
    234
    2RITHILHVSFLAEASVRGL
    961
    ACCAAAGGA7CACCCACATCCTCCACGTGTCCTTCCTT5C?GAGGCCTCTGTGAGGGGCC
    254
    3DONLW112 GREGAMLKC LEE
    1021
    TTGAAGACCAAAAl’Gl’GTGGCACAGTGGCAGAGAAGGAGCTATGCTCñAGTGCCTGAGXÜ
    274
    SQPPPSYHWTR1DGPLFSGV
    1081
    AAGGGCAGCCCCCFCCC^CA'TACAACTGGACACGGCTGGATGGGCCTCTGCCCAGTGGGG
    234
    RVDGDTLGFPPLTTEHSGIY
    1141
    TACGAGTGGATGGGGACACTTTGGGCTTTCCCCCACTGACCACTGAGCACAGCGGCATCT
    314
    VCHVSNEFSSRDSQVTVDVL
    1201
    ACGTCTGCCAXGTCAGCAATGAGTXCTCCTCAAGGGATTCTCAGGTCACTGXGGAXGTTC
    334
    DPQEDSGKQVDLVSAS V V V V
    imagen4
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    2281 ggtggagactqtqgctcagacccaqqtqtgcgggcatagctqqaqctggaatctgcctcc
    2341 ggtgtgagggaacctgtctcctaccacttcggagccatgggggcaagtgtgaagcagcca 2401 gtccctgggtcagccagaggct.t.gaactgttacagaagccctctgccotctggr.ggcctc 2461 tgggcctgctgcatgtacatattttctgtaaatatacatgcgccgggagcttcttgcagq 2521 aatactgctccgaatcacttttaatttttttcttttttttttcttgccctttccattagt 258: tgtattttttatttatttttatrrttatttttttttagagatggagt':t''.acfatgttgc 2641 tcaggctggccttgaactcctgggctcaagcaaccctcctgcctoagoccccctagtagc 27C1 tgggactttaagtgtacaccactgtgcctgctttgaatcctttacgaagagaaaaaaaaa
    2761 attaaagaaagccttfcagatttatccaatgtctactactgggattgcttaaagtgaggcc
    2821 cctccaacaccagggggttaattcctgt.gattgtgaañggggctacttccaaggcat'r.tt
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    3061 gcagtgafctatagaccgagagagtaggagttgaggtgaggtgaaggaggtgctgggggtg
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    3301 ggcctaagggagaggctcccatccttogttccccagccagcctaggaottcgaatgtgg<-i FÍQUT3 1
    3361 gectgaagatctaagatcctaaeatgtaeattttatgtciaatatgegeatatttgtaeat
    3421 aaaatgatattctgtt.t.t.taaataaacagaeaaaacttgaaaaa (ContÍnU3CÍÓn)
    Figura 2A: La secuencia de ADNc (SEQ ID N0:3) y de aminoácidos (SEQ ID NO:4) de la cadena pesada de Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, el subrayado sencillo es la región variable de la cadena pesada y el subrayado sencillo con una línea de puntos es la región constante de lgG1 humana
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    . jVGAGSÍlAATUCXAAüAAlTCflCTGIXTKl'rüClAAATGAAl^AH .'CK^íA!iB0GK#áftCAW^J3CJK J2KTTACTG
  27. 27.6 30 i 376
    f,5j
    526 6C1 676 751 826 301 376 1051 1126 12C1 1276 1351 1426
    •ARAYYYGNDVWGQGTTVTVSSASTK
    •GPSVFPLAPSSKSTSGG7AALGC LV (4Gax:aAix:*"!7rTCarcrr«xiACíx:7xxrKXAA(ffiG(iACcrx7t^5(iav3«í:G5txxr,:í3íír:,xc’T«7'- "”k""5" y""p"’r " e”"i""v""? ’v"~~~~w "n"s" ’g " a"’I""?"'s a""v‘"n" t""f’'"f
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    ~ F Y P ~S D I A~“v E W É Y Ñ ~G "q~p" e"~H~N Y ~K ~T T ~p" P
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    •VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
    K -1
    EUfiíZifi
    Figura 2B: La secuencia de ADNc (SEQ ID NO:5) y de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de la cadena ligera de Ha22-2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, el subrayado sencillo es la región variable de la cadena ligera y el subrayado sencillo con una línea de puntos es la región constante kappa humana
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    A
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    226
    301
    376
    451
    526
    601
    F L I Y 7i A 5 T L Q S G V P S R 7 5 G 5 G 5 G T D
    FTLTISStQPEDFATYYCQQANSPP
    rrt3ClL7KA0CATC%GCAG'XlfA^XriGAAGArTir-7CAR<rr7AC,rArTGi:jViC3lGGCrR«AGXri7:C.rr
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    Figura 3A: La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:7) de la cadena pesada de Ha22- 2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, el subrayado sencillo es la región variable de la cadena pesada y el subrayado sencillo con una línea de puntos es la región constante de lgG1 humana
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    2C1 LS3^X/f§'l3iJÍiICFFjafraHKFSN^F>l®VEF-K^DKJíITCPPj:PA 251 PEU/»8PSVFLBVÍ»KPK¡M!LMISR,ÍPfiV<l’CWVDVSHESDPEVKFIiW)£VOG 3C1 VDVllNAKCKFREEQYNC^
    351 :EKTISKy<GOJE^^VYTLPPSJP|;EMrKNpySITCLVKGFYPSD:AJ^W 4 C1 E § N GQPE HK1K ? 2 P P VLDSDG S FF L Y SKLTVDKSIWQ^ÍFySCSWHEA 4 51 LENñYT£KSLSL_SPGK
    Figura 3B: La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:8) de la cadena ligera de Ha22- 2(2,4)6.1. El doble subrayado es la secuencia líder, el subrayado sencillo es la región variable de la cadena ligera y el subrayado sencillo con una línea de puntos es la región constante kappa humana
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    - c i gLE2g¿Z&c^ s
    151 TA oA¡CL LHÍPFJ PR£MA^WKV_DN¿iQ§GJí,§25l5yj5Q5^p§I 2 01 ZT'LSKhpYE K H KVY A C E VI HJ G LSSPVT K SjH'JP GE C_
    Figura 4A: Alineación de la cadena pesada de Ha22-2(2,4)6.1 (una parte de SEQ ID N0S:3, 4) frente a la línea germinal de IgG humana VH3-48 (SEQ ID NO: 9)
    oo
    CD
    [D%
    ¿ ¿ i 4 ) . -í.
  28. 99.3(293/295) VH3-48
    100(6/6} D2-21
  29. 98.2(54/55)
    IDfc
    JfJ6
    212,4)6.1
  30. 99.3(293/295} VK3-48
    100(6/6) D2-21
  31. 98.2(54/55) JH6
    ID%
    2(2,4)6.1
  32. 99.3(293/295) V113-48
    100(6/6) D2-21
  33. 98.2(54/55) JH6
    IS'á
    2(2,4)6.2
  34. 99.3(293/295) VH3-48
    100(6/6) 02-21
  35. 98.2(54/55) JH6
    89
    1
    229
    299
    V E S G G
    V
    G G
    —FWR1—
    V Q F
    i.ca
    V Q
    R L
    L R L
    70
    ------> <---------------CDRi--------------> <-----------------------------------------FWR2---------------------
    CCTCT GC-ATTCACCTTCAGTAGCTATAAC ArGAACTGGGTCCC-CCAÜGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG 228 AS G F T F 3 S Y S MNWVRQAPGKGLEW ........................................................G...................................................................................... 140
    <----------------CCR2-
    V S Y GGTTTCATAC
    V S Y
    I3SS3ST1 YYADSVKGRFTI
    ATTAGTAGTAGTASTAGTACCATA TACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATC ISSSSSTI YYADSVKGRFTI
    298
    210
    -------------------------------------FVJR3---------------------------------------------------------------------------------------
    SRDNAKNSLSLQMNSLRDEDTAV TCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGT SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
    ......................................................A................................................................................ 280
    >63
    CD
    O
    ID% ----------->
    2(2
    369 V V Q ATTACTGT
  36. 99.3(293/295)
    VH3-48 281 Y Y C
    100(6/6)
    D2-21 -
  37. 98.2(54/55)
    JH6 9 —
    ID% n /O «» i p
    4)6.1 439 AG 440
  38. 99.3(293/295)
    VH3-48 —
    100(6/6)
    D2-21 ....
  39. 58.2(54/55)
    JH6 <M K£> . . 63
    ARAYYYGMDVWGQGT T V T V S GCGAGAGCATACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGrCTCCT A R
    g
    295
    6
    61
    Figura 4A (Continuación)
    ir> y
    Figura 4B: Alineación de la cadena ligera de Ha22-2(2,4)6.1 (una parte de SEQ ID N0S:5, 6) frente a la línea germinal de IgG humana L5 (SEQ ID NO: 10)
    ÍD%
    2 {2/ 4} 6. _ Si
  40. 98.6(283/287)
    L5 1
    100(35/35)
    7VA
    ID*
    2(2.416.1 16:
  41. 98.6(283/287)
    j r. ¡ J.
    100(35/35)
    JK4
    IDt
    2 [2. 4 \ 6. : 23:
  42. 98.6(283/287)
    L 5 14:
    100(35/35)
    JK4
    ID%
    2(2,41 6.1 30:
  43. 98.6(283/287)
    L5 21
    100(35/35)
    JK4
    ID!
    2 (2,4)6.: 37
  44. 98.6(283/287)
    28
    100(35/35)
    JK4 4
    D I Q M T Q
    •jacatccaüa?gíícccag:
    D I Q M 1 Q
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    163
    70
    ----------> RAS
    <— o ------CEU------ G I S 3 A ! * <-------- L A w Y Q Q K F -FWR2----------- G K A F K F L
    GGGCGAG?
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    GATCTAT
    C5CTGCA7CC ACT FTG CAAA37C33C iCTFCCFATCAAGG'I TG AGCG3CAGTG ¡GATCTGGSACA3AT 300
    I Y
    A A S s T Q S S V P S R r S 3 3 G S 3 T D
    —
    ..................... ... ..................... ............................... •* ....................... 210
    WR3
    f T L T
    I s S L Q ? B D F A T Y Y C Q 0 A N S
    TTCAC7C7CACC
    ACCAGG ^GíCCSGCAGCCI GAAjAT TT'TGCAACI'TACTATTG? ■» pn/Trni ■» r*T* *lr7/■> v. AiV.Áoj^./yv.Aj: * _5 / 1/
    F T L T
    1 s S L Q P S D F A T Y Y C Q Q A H S
    23C
    FPPTFSGGTKVEIK TCX’CTCCCACTTTCGGCGGASGGACCAAGGTjGAGArCAAAC 412 F P P
    ...........—------------------—--------------------------.... 237
    ........................................................................................................... T¡g
    Recuento
    Figura 5A: Unión del Mab Ha22-2(2,4)6.1 usando citometría de flujo
    imagen7
    imagen8
    f"i 11 mi
    1Q2
    FL2-H
    TTT7T!1!.......
    103
    — MAb control —• Material MAb del CHO Ha22-2(2,4)6.1
    — [Material MAb del hibridoma Ha22-2(2,4)6.1 —- ¡Control CHO simulado
    - ' ' - T .TT
    104
    imagen9
    Figura 5B: Unión del Mab Ha22-2 2,4 6.1 usando ELISA
    -Q- Ha22-2(2.4)6.1-CHO
  45. 2.00
    _^>_Ha22-2(2.4)6.1-Hibridoma
    1.80
    1.60
    1.40
    .20
  46. 0.80
  47. 0.60
  48. 0.40
  49. 0.20
  50. 0.00
    10,0
  51. 100.0
  52. 1000.0
    Ab (ng/ml)
    Células PC3-humano-191P4D12 (tratado con tampón de fijación)
    imagen10
    Valores MFI (mM))
    Ha22-2(2.4)6.1 vcMMAE
    Lot vcE-03
    160
    257
    80
    273
    40
    285
  53. 13.33
    256
  54. 4.44
    183
    1.48
    183
  55. 0.49
    105
  56. 0.16
    78
  57. 0.05
    26
  58. 0.02
    14
  59. 0.01
    S
  60. 0.000
    1
    Ha22- | 2(2,4)6.1 vcMMAE
    Lot vcE-03 265
    Bmax
    Kd (nM)
    0.69
    Células PC3-cinomólogas-191 P4D12 (tratado con tampón de fijación
    imagen11
    Valores MFI (mM))
    Ha22-2(2,4)6.1 ve M MAE
    Lot vcE-03
    160
    375
    80
    403
    40
    364
  61. 13.33
    288
  62. 4.44
    298
    1.48
    248
  63. 0.49
    1S6
  64. 0.16
    122
  65. 0.05
    86
  66. 0.02
    34
  67. 0.01
    19
  68. 0.000
    1
    Ha22- 2(2,4)6.1 vcMMAE
    Lot vcE-03
    Bmax
    343
    Kd (nM)
    0.34
    Valores MFI (mM))
    Ha22-2(2,4)6.1 ve M MAE
    Lot vcE-03
    160
    205
    SO
    296
    40
    243
    13,33
    192
  69. 4.44
    224
    1.48
    121
  70. 0.49
    56
  71. 0.16
    40
  72. 0.05
    22
  73. 0.02
    11
  74. 0.01
    8
  75. 0.000
    4
    Células PC3-rata-191P4D12 (tratado con tampón de fijación)
    imagen12
    -o- Ha22-2(2,4)6.1 vcMMAE
    Ha22- 2(2.4)61 vcMMAE
    Lot vcE-03
    Bmax
    265
    Kd (nM)
    1.5
    300
    200
    100
    0
    % supervivencia % supervivencia
    imagen13
    EC50 6.0415 nM Figura 9A
    PC-3 cino-191P4D12: eliminación 4 días/1500 células por pocilio
    imagen14
    EC50 0.0526 nM Figura 9B
    % supervivencia % supervivencia
    imagen15
    PC-3 Neo: eliminación 4 días/1500 células por pocilio
    imagen16
    co co
    Ha22-2(2,4)6.1 MAb
    imagen17
    191P4D12 FL
    Ha22-8e6.1 MAb
    imagen18
    Ha22-8e6.1 MAb
    imagen19
    Ha22-8e6.1 MAb
    imagen20
    imagen21
    Sondado con Ha22-2(2,4)6.1-biotina y estreptavidina-HRP
    • ECD de cadena completa 191P4D12, fusión mFc
    • 191P4D12(aa1-147, Dominio V), fusión mFc
    • 191P4D12 (aa1-242. Dominio VC1), fusión mFc
    . 191P4D12 (aa1-31, 147-346,
    Dominio C1C2), fusión mFc
    imagen22
    Sondado con conjugado de FIRP antiratón de cabra
    • ECD de cadena completa 191P4D12, fusión mFc 191P4D12 (aa1-147, Dominio V),
    * fusión mFc
    191P4D12 (aa1-242, Dominio
    • VC1), fusión mFc 191P4D12 (aa1-31, 147-346,
    # Dominio C1C2), fusión mFc
    103
    imagen23
    104
    imagen24
    105
    imagen25
    0 10 20 30 40
    Días de tratamiento
    106
    imagen26
    imagen27
    Días de tratamiento
    Volumen de tumor medio (mm3)
    imagen28
    imagen29
    imagen30
    Volumen de tumor medio (mm3)
    imagen31
    Figura 21: Detección de proteína 191P4D12 en muestras de pacientes con cáncer por inmunohistoquímica
    imagen32
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    Muestra de cáncer de vejiga
    Muestra de cáncer de vejiga
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    Figura 21A
    Figura 21B
    Muestra de cáncer de mama
    Muestra de cáncer de mama
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    Figura 21C
    Figura 21D
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    Figura 21E
    Figura 21F
    Muestra de cáncer de pulmón
    Muestra de cáncer de pulmón
    Figura 21G
    Figura 21H
    Muestra de cáncer de ovario
    Muestra de cáncer de ovario
    Muestra de cáncer de páncreas Muestra de cáncer de páncreas
    Figura 21J
    Figura 211
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    Muestras de cáncer de esófago Muestras de cáncer de esófago
    Figura 21K
    Figura 21L
    Muestras de cáncer de cabeza y cuello Muestras de cáncer de cabeza y cuello
    ...................................... i........
    Figura 21M
    Figura 21N
    Figura 22: Curvas de unión (Sensogramas) usadas para determinar la
    afinidad vía SPR
    Ha22-2(2,4)6.1
    imagen37
    Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE
    imagen38
    116
    Figura 23: Ha22-2(4,6).1 se une a células PC3 que expresan 191P4D12 (A) y ortólogos de macacos Rhesus (B), rata (C) y ratón (D)
    imagen39
    imagen40
    117
    Figura 23 (continuación): Ha22-2(4,6).1 se une a células PC3 que expresan 191P4D12 (A) y ortólogos de macacos Rhesus (B), rata (C) y ratón (D)
    imagen41
    imagen42
    118
    imagen43
    Figura 24A
    imagen44
    119
    Figura 24 (Continuación):
    imagen45
    imagen46
    Figu ra 24D
    imagen47
    Recuentos Recuentos
    Figura 26 (Continuación): Unión de Mab Ha22-2(2,4)6.1
    evaluada por FACS
    imagen48
    Figura 26B
    imagen49
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