ES2653718T3

ES2653718T3 - Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de histidil-ARNt sintetasas

Info

Publication number: ES2653718T3
Application number: ES11816760.0T
Authority: ES
Inventors: Leslie Ann Greene; Kyle P. Chiang; Fei Hong; Alain P. Vasserot; Wing-Sze Lo; Jeffry D. Watkins; Cheryl L. Quinn; John D. Mendlein
Original assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Current assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2018-02-08
Anticipated expiration: 2031-07-12
Also published as: CN103108649A; US9422539B2; US10669533B2; US10196628B2; EA030418B1; US20130202576A1; EP2593126A4; CA2804424C; EA201390095A1; EP2593126A2; CN103108649B; US20170029800A1; AU2011289833A1; US20170321206A1; NZ603813A; JP2015227379A; JP2013533750A; KR20180059953A; CA2804424A1; US20190264190A1

Abstract

Una composición terapéutica, que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 34, en la que el polipéptido tiene una actividad de señalización extracelular y tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en donde la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína.

Description

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polinucleótido de referencia de AARS, como se desvela en la Tabla(s) 1-3, o Tabla(s) 4-6, o Tabla(s) 7-9 o Tabla E2. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se selecciona de un cebador, una sonda y un oligonucleótido antisentido. En las realizaciones específicas, el cebador, la sonda o el oligonucleótido antisentido se dirige a un punto de unión de corte y empalme específico o único y/o la secuencia 3' de este sitio de corte y empalme dentro de un polinucleótido de AARS.

Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de AARS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con uno o más agentes de unión que se unen específicamente con un fragmento proteico de AARS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia del agente de unión y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento proteico de AARS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de AARS en una muestra, que comprenden analizar la muestra con un detector que es capaz de identificar específicamente un fragmento proteico como se describe en el presente documento, y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento proteico de AARS. En realizaciones específicas, el detector es un espectrómetro de masas (EM), un citómetro de flujo, un dispositivo de captura de imágenes de proteínas, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) o una micromatriz de proteínas. Ciertas realizaciones comprenden comparar la presencia o los niveles del fragmento proteico de AARS con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones comprenden caracterizar el estado de la muestra para distinguirla del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes estados del desarrollo celular, células en diferentes estados de diferenciación celular, células en diferentes estados fisiológicos o células sanas y enfermas. Por ejemplo, las resectinas seleccionadas pueden ser más abundantes en condiciones tales como tensión o lesión.

Ciertas realizaciones incluyen métodos de descubrimiento de, y composiciones relacionadas para, identificar un compuesto que se une específicamente con un polipéptido de aminoacil ARNt sintetasa (AARS) como se describe en el presente documento, o uno o más de sus compañeros de unión celular, que comprenden a) combinar el polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos con el compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se una específicamente con el polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido o péptido, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, un peptidomimético, o una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es agonista de una actividad biológica no canónica del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo antagoniza una actividad biológica no canónica del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular. Ciertas realizaciones incluyen un compuesto identificado por el método anterior, tal como un agonista (por ejemplo, molécula pequeña, péptido).

Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de AARS en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos que hibridan específicamente con un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia de los oligonucleótidos en la muestra y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de AARS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de AARS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con al menos dos oligonucleótidos que amplifican específicamente un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, realizar una reacción de amplificación, detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado, y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de AARS. En realizaciones específicas, el oligonucleótido o los oligonucleótidos se hibridan específicamente con o amplifican específicamente un punto de unión de corte y empalme que es único de la variante de corte y empalme de AARS. Ciertas realizaciones incluyen comparar la presencia o los niveles del fragmento de proteína de AARS o variante de corte y empalme con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones incluyen caracterizar el estado de la muestra para distinguirlo del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes estados del desarrollo celular, células en diferentes estados de diferenciación celular o células sanas y enfermas.

Algunas realizaciones incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un polinucleótido de AARS descrito en el presente documento, un polipéptido de AARS descrito en el presente documento, un agente de unión como se describe en el presente documento, o un compuesto identificado por el método anterior o descrito en el presente documento, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Ciertas realizaciones incluyen métodos para modular una actividad celular de una célula, que comprenden poner en contacto la célula con un polinucleótido de AARS descrito en el presente documento, un polipéptido de AARS descrito en el presente documento, un agente de unión descrito en el presente documento, un compuesto del método anterior o descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica descrita en el presente

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muy bajos de LPS pueden provocar coagulación detectable del lisado de Limulus debido a una potente cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también pueden cuantificarse por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para ser sustancialmente sin endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser menos de aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de proteína. normalmente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.

En ciertas realizaciones, la “pureza” de cualquier agente dado (por ejemplo, fragmento proteico de AARS) en una composición puede definirse específicamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puro, incluyendo todos los decimales entre medias, como se mide, por ejemplo, y en ningún modo limitante, mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC), una forma bien conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.

Como se usa en el presente documento, los términos “función” y “funcional” y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

Por “gen” se entiende una unidad de herencia que puede ocupar un locus específico en un cromosoma y consiste en secuencias reguladoras de la transcripción y/o de la traducción y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5’ y 3’).

“Homología” se refiere al porcentaje del número de aminoácidos que son idénticos o constituyen substituciones conservativas. La homología puede determinarse usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De esta manera podrían compararse secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en el presente documento por inserción de huecos en el alineamiento, determinándose dichos huecos, por ejemplo, por el algoritmo de comparación usado por GAP.

La expresión “célula hospedadora” incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de cualquier vector o vectores recombinantes, polinucleótido aislado o polipéptido de la invención. Las células hospedadoras incluyen descendencia de una única célula hospedadora, y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula hospedadora incluye células transfectadas

o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de la invención es una célula hospedadora recombinante.

Por “aislado” se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un “polinucleótido aislado”, como se usa en el presente documento, incluye un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en su estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Como alternativa, un “péptido aislado” o un “polipéptido aislado” y similares, como se usa en el presente documento, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula peptídica o polipeptídica de su ambiente celular natural, y de asociación con otros componentes de la célula; es decir, no se asocia significativamente con sustancias in vivo.

El término “ARNm” o denominado en ocasiones “transcritos de ARNm” como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, transcrito o transcritos de preARNm, intermedios de procesamiento de transcritos, ARNm maduros listos para traducción y transcritos del gen o los genes, o ácidos nucleicos derivados del transcrito o los transcritos de ARNm. El procesamiento de transcritos puede incluir corte y empalme, edición y degradación. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico derivado de un transcrito de ARNm se refiere a un ácido nucleico para cuya síntesis el transcrito de ARNm o una subsecuencia del mismo ha actuado en última instancia como un molde. Un ADNc inverso transcrito a partir de un ARNm, un ARN transcrito a partir de ese ADNc, un ADN amplificado del ADNc, un ARN transcrito del ADN amplificado, etc., derivan todos del transcrito de ARNm y la detección de dichos productos derivados es indicativa de la presencia y/o abundancia del transcrito original en una muestra. Por lo tanto, las muestras derivadas de ARNm incluyen, pero sin limitación, transcritos de ARNm del gen o los genes, ADNc inverso transcrito del ARNm, ARNc transcrito del ADNc, ADN amplificado de los genes, ARN transcrito de ADN amplificado y similares.

La actividad “no canónica” como se usa en el presente documento, se refiere en general a i) una nueva actividad poseída por un polipéptido de AARS de la invención que no posee en ningún grado significativo la proteína parental de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que poseía la proteína parental de longitud completa nativa intacta, en la que el polipéptido de AARS muestra una actividad específica significativamente mayor (es decir al menos 20 % mayor) en comparación con la proteína parental de longitud completa nativa intacta o muestra la actividad en un nuevo contexto; por ejemplo aislando la actividad de otras actividades poseídas por la proteína parental de longitud completa nativa intacta. En el caso de polipéptidos de AARS, los ejemplos no limitantes de actividades no canónicas incluyen señalización extracelular, unión a ARN, unión a aminoácidos, modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular (por ejemplo,

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Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es de al menos 12, pero frecuentemente de 15 a 18 y con frecuencia de al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo restos de nucleótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solamente una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse óptimamente las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE.UU.) o mediante inspección y puede seleccionarse el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como por ejemplo se desvela en Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Puede encontrarse discusión detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.

Se realizan cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es de al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al menos 50 %, 60 %, e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse a no ser que se especifique de otro modo) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de fase de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de pesos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas en el presente documento pueden usarse como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas de moléculas de ácido nucleico de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas de moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines

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Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3ª Edición 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part

A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor)

5 (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3,4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N. Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

10 III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE AARS PURIFICADOS Y VARIANTES PARA PRODUCTOS TERAPÉUTICOS Y OTRAS APLICACIONES

Sorprendentemente, y a diferencia de sus secuencias parentales de longitud completa que se conocen solamente por sus actividades de aminoacilación, se ha descubierto que los fragmentos de AARS poseen actividades

15 biológicas importantes para aplicaciones bioterapéuticas, de descubrimiento y de diagnóstico. Las realizaciones de la presente invención incluyen por lo tanto proteínas de longitud completa, isoformas de proteínas maduras y fragmentos proteicos de aminoacil ARNt sintetasas (AARS), además de variantes y fragmentos de los mismos biológicamente activos. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos pueden surgir mediante proteólisis endógena, proteólisis in vitro, variación de corte y empalme o predicción por ordenador, entre otros mecanismos.

20 Los fragmentos proteicos de AARS descritos en el presente documento, y variantes de los mismos, pueden poseer al menos una actividad biológica “no canónica”. El fragmento o los fragmentos proteicos de AARS de la presente invención también se indican en el presente documento como “polipéptidos de AARS” o “polipéptidos de referencia de AARS”. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de AARS proporcionados en el presente documento comprenden o consisten esencialmente en todas o una parte de las “secuencia o secuencias de referencia” de

25 polipéptidos de AARS como se expone en la Tabla(s) 1-3, o Tabla(s) 4-6, o Tabla(s) 7-9 posteriormente, que representan la secuencia o las secuencias de aminoácidos de diversos fragmentos de histidil ARNt sintetasas. Las secuencias proteicas de AARS de ratón y de seres humanos están altamente relacionadas, difiriendo normalmente en no más de unos pocos aminoácidos dentro de una secuencia completa, un dominio particular o un fragmento proteico particular.

30 Polipéptidos de AARS N terminales: (Tablas 1, 2 y 3)

Tabla 1A Polipéptidos de AARS identificados por EM

Nombre: Tipo / especie / Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ.ID. NO.

HisRS1N1: Proteína / Humana / 1-141 SEQ.ID. NO.12

HisRS1N1: ADN / Humana / imagen12 SEQ.ID. NO.13

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HisRS1N2: Proteína / SEQ.ID. NO.

Humana: / 14

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HisRS1N2: ADN / SEQ.ID. NO.

Humana /: imagen13 15

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Tabla 2 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

HisRS1N 4: Proteína / Humana / 1-60 SEQ.ID. NO.26

HisRS1N 4: ADN / Humana SEQ.ID. NO.27

HisRS1N 5: Proteína / Humana / 1-243 + 27 aa SEQ.ID. NO.28

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HisRS1N 5: ADN / Humana imagen15 SEQ.ID. NO.29

Tabla 2B Puntos de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de AARS

Nombre: Tipo / especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en las cercanías del punto de unión de corte y empalme único SEQ.ID. NO.

H1-SV09: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.30

Proteína / Humana /: KFVLKTPK SEQ.ID. NO.31

H1-AS05: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.32

Proteína / Humana /: SSVDKLDKVGYPWWNS SEQ.ID. NO.33

Tabla 3 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados por Bioinformática

HisRS1N3: Proteína / Humana / 1113 imagen16 SEQ.ID. NO.34

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HisRS1C2: ADN / Humana SEQ.ID. NO.49

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HisRS1C3: Proteína / Humana / 1 SEQ.ID.

60 + 211-509: NO.50

HisRS1C3: ADN / Humana SEQ.ID. NO.51

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HisRS1C4: Proteína / Humana / 1 SEQ.ID.

100 + 211-509: NO.52

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HisRS1C4: ADN / Humana imagen18 SEQ.ID. NO.53

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HisRS1C5: ADN / Humana imagen20 SEQ.ID. NO.55

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HisRS1C6: ADN / Humana imagen22 SEQ.ID. NO.57

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HisRS1C7: ADN / Humana imagen24 SEQ.ID. NO.59

HisRS1C8: Proteína / Humana / 1 SEQ.ID.

60 + 399-509: NO.60

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HisRS1C8: ADN / Humana SEQ.ID. NO.61

HisRS1C9: Proteína / Humana / 1 SEQ.ID.

100 + 399-509: NO.62

HisRS1C9: ADN / Humana imagen25 SEQ.ID. NO.63

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HisRS1C10: Proteína / Humana 369-509 / SEQ.ID. NO.64

HisRS1C10: ADN / Humana SEQ.ID. NO.65

Tabla 5B Puntos de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de AARS

H1-AS01: ADN / Humana / imagen26 SEQ.ID. NO.66

Proteína / Humana /: KFVLKTPKDFDIAGNF SEQ.ID. NO.67

H1-AS02: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.68

Proteína / Humana /: KFVLKTPKVNDRRILD SEQ.ID. NO.69

H1-AS03: ADN / Humana / imagen27 SEQ.ID. NO.70

Proteína / Humana /: DTPVFELKVNDRRILD SEQ.ID. NO.71

H1-AS07: ADN / Humana / imagen28 SEQ.ID. NO.72

Proteína / Humana /: RYREFYQCVNDRRILD SEQ.ID. NO.73

H1-SV04: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.74

Proteína / Humana /: KFVLKTPKETLMGKYG SEQ.ID. NO.75

H1-SV10: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.76

Proteína / Humana /: DTPVFELKDFDIAGNF SEQ.ID. NO.77

H1-SV11: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.78

Proteína / Humana /: KFVLKTPKALEEKIRT SEQ.ID. NO.79

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H1-SV14: ADN / Humana / SEQ.ID. NO.80

Proteína / Humana /: DTPVFELKALEEKIRT SEQ.ID. NO.81

H1-AS05: ADN / Humana / imagen29 SEQ.ID. NO.82

Proteína / Humana /: N/D

Tabla 6 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados por Bioinformática

HisRS1C1: Proteína / Humana / 405-509 imagen30 SEQ.ID. NO.83

HisRS1C1: ADN / Humana imagen31 SEQ.ID. NO.84

Polipéptidos de AARS internos: (Tabla 7, 8 y 9)

Tabla 7A Polipéptidos de AARS identificados por EM

Tabla 7B Péptidos de enlace inferidos y detectados por péptidos de espectrometría de masas

Tipo / especie: Secuencia SEQ.ID. NO.

Tabla 7C Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / especie: Secuencia SEQ.ID. NO.

Tabla 8 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

Tabla 8B Punto de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de AARS

Nombre: Tipo / especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en cercanías del punto de unión de corte y empalme único las SEQ.ID. NO.

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Tabla 9 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados por Bioinformática

HisRS1I1: Proteína / Humana / 191333 SEQ.ID. NO. 109

HisRS1I1: ADN / Humana imagen32 SEQ.ID. NO. 110

"Fragmentos proteicos", o la secuencia de aminoácidos de fragmentos proteicos, tales como fragmentos proteolíticos

o fragmentos de variantes de corte y empalme, pueden caracterizarse, identificarse o derivarse de acuerdo con diversas técnicas. Por ejemplo, pueden identificarse variantes de corte y empalme por técnicas tales como 5 secuenciación profunda (véase, por ejemplo, Xing et al., ARN 14: 1470-1479, 2008, y Zhang et al., Genome Research, 17:503-509, 2007). Como ejemplo adicional, pueden identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos in vitro, tal como incubando polipéptidos de AARS de longitud completa u otros con proteasas seleccionadas, o pueden identificarse de forma endógena (por ejemplo, in vivo). En ciertas realizaciones, pueden generarse o identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos, por ejemplo,

10 expresando de forma recombinante polipéptidos de AARS de longitud completa u otros en un microorganismo seleccionado o una célula eucariota que se ha modificado para contener una o más proteasas seleccionadas o que contiene de forma natural una o más proteasas que son capaces de actuar en un polipéptido de AARS seleccionado, y aislar y caracterizar los fragmentos proteicos producidos de forma endógena del mismo.

15 En ciertas realizaciones, los fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos (por ejemplo, de origen natural) pueden generarse o identificarse, por ejemplo, de diversas fracciones celulares (por ejemplo, citosólicas, de membrana, nucleares) y/o medio de cultivo de diversos tipos celulares, incluyendo, por ejemplo, células inmunitarias tales como monocitos, células dendríticas, macrófagos (por ejemplo, macrófagos RAW 264.7), neutrófilos, eosinófilos, basófilos y linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos T (por ejemplo, linfocitos auxiliares

20 CD4+ y citolíticos CD8+), incluyendo linfocitos T primarios y líneas de linfocitos T, tales como linfocitos T de Jurkat, así como linfocitos citolíticos naturales (NK).

En ciertas realizaciones, pueden identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos, generados de cualquier modo, por técnicas tales como espectrometría de masas, o técnicas equivalentes. Una vez

25 que se ha generado o identificado un fragmento proteico in vitro o identificado de forma endógena, este puede mapearse o secuenciarse y, por ejemplo, clonarse en un vector de expresión para producción recombinante, o producirse de forma sintética.

Puede usarse una amplia diversidad de proteasas para producir, identificar, derivar o caracterizar la secuencia de

30 fragmentos proteicos de AARS tales como fragmentos proteolíticos. En general, las proteasas se clasifican habitualmente según tres criterios principales: (i) la reacción catalizada, (ii) la naturaleza química del sitio catalítico y

(iii) la relación evolutiva, como se revela por la estructura. Los ejemplos generales de proteasas o proteinasas, como se clasifican por mecanismo de catálisis, incluyen proteasas aspárticas, serina proteasas, cisteína proteasas y

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los carriles de los geles cortarse en bandas a intervalos fijos; después de lo cual las bandas pueden digerirse opcionalmente con una proteasa apropiada, tal como tripsina, para liberar los péptidos, que pueden después analizarse por CL-EM/EM de fase inversa 1D. Los datos proteómicos resultantes pueden integrarse en los denominados peptógrafos que representan, en el panel izquierdo, la cobertura de secuencia para una proteína dada

5 en la dimensión horizontal (del extremo N a C terminal, de izquierda a derecha) frente a migración en SDS-PAGE en dimensión vertical (peso molecular de alto a bajo, de arriba a abajo). Los fragmentos peptídicos específicos pueden después secuenciarse o mapearse. En ciertas realizaciones, el fragmento de referencia de AARS puede caracterizarse por su peso molecular único, en comparación, por ejemplo, con el peso molecular de la AARS de longitud completa correspondiente.

10 Como se indica anteriormente, las realizaciones de la presente invención incluyen los polipéptidos AARS expuestos en la Tabla o las Tablas 1-3, o la Tabla o las Tablas 4-6, o la Tabla o las Tablas 7-9. También se incluyen "variantes" de los polipéptidos de referencia de AARS. La indicación "variante" polipeptídica se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de AARS de referencia mediante la adición, deleción y/o sustitución de al menos un

15 resto de aminoácido, y que normalmente conservan (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una

o más actividades no canónicas de un polipéptido de AARS de referencia.

Además, las histidil ARNt sintetasas humanas incluyen varios cientos de formas polimórficas altamente relacionadas, y se sabe en la técnica que estas son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Sería

20 por lo tanto un asunto rutinario seleccionar una variante de origen natural de histidil ARNt sintetasa, incluyendo, por ejemplo, las formas polimórficas de un único nucleótido enumeradas en la Tabla A para crear un polipéptido AARS que contiene uno o más cambios de aminoácidos basados en la secuencia de cualquiera de los homólogos, ortólogos e isoformas de origen natural de ser humano así como otras especies de histidil ARNt sintetasa.

Tabla A SNP de histidil ARNt sintetasa humana

Número de Referencia de GenBank: Cambio de Nucleótidos

rs78741041: G/T

rs34790864: C/G

rs34732372: C/T

rs11548125: A/G

rs11548124: C/G

rs2230361: C/T

rs1131046: C/T

rs1131045: C/G

rs1131044: C/T

rs1131043: C/G

rs1131042: A/C

rs1131041: C/G

rs1131040: A/G

rs1131039: C/T

rs1131038: A/G

rs1131037: A/G

rs1131036: A/G

rs1131035: C/T

rs1131034: A/G

rs1131033: A/G

rs1131032: A/G

rs1050252: C/T

rs1050251: A/T

rs1050250: A/G

rs1050249: C/T

rs1050248: A/T

rs1050247: C/T

rs1050246: C/G

rs1050245: C/G

rs71835204: (DELECIÓN GRANDE) /

rs71766955: (DELECIÓN GRANDE) /

rs71835204: (DELECIÓN GRANDE) /

rs71766955: (DELECIÓN GRANDE) /-

En ciertas realizaciones, una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia en una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, la variante polipeptídica comprende sustituciones conservativas y, a

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procesaron dos pocillos para cada control de Diferenciación. Controles: todos los medios se prepararon utilizando DMEM como el medio basal. Se siguió la bibliografía convencional y se obtuvo medio de diferenciación de Cell Applications. Según el proveedor, los medios de diferenciación contenían los siguientes aditivos: cóctel de diferenciación de músculo esquelético: FBS, insulina, glutamina, FGF, EGF; Cóctel de adipogénesis: insulina,

5 dexametasona e IBMX; Cóctel de osteogénesis: FBS, dexametasona, ascorbato 2 fosfato, beta-glicerofosfato; Cóctel de condrogénesis: insulina, ascorbato-2-fosfato y TGF-β1.

Se utilizan protocolos convencionales para usar un Kit de Expresión Génica Cells-to-CT™ de ABI (Applied Biosystems, n.º de Artículo AM1728) TAQMAN® para lisar células y recoger material genómico. Se usa una mezcla

10 Pre-Amp ABI (Applied Biosystems, n.º de Artículo 4391128) para iniciar la preamplificación. Se crean cebadores específicos de genes usando un programa Primer 3 y se obtiene de IDT technologies. Se usaron matrices de perfiles Fluidigm (n.º de Artículo BMK-M-96.96) para PCR cuantitativa real con reactivos de carga Fluidigm convencionales y dispositivos de pipeteo. La Tabla E1 a continuación enumera los genes perfilados.

Tabla E1 Lista de genes evaluados en el perfil transcripcional

Lista Única Compilada: refseq_nt Nombre_completo_ Sinónimos

ABCA1: NM_005502 casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1 ABC-1|ABC1|CERP|FLJ14958|HDLDT1 |MGC164864|MGC 165011|TGD

ACTB: NM_001101 actina, beta PS1TP5BP1

ACTG1: NM_001614 actina, gamma 1 ACT|ACTG|DFNA20|DFNA26|

ACVR2B: NM_001106 receptor de activina A, tipo IIB ACTRIIB|ActR-IIB|MGC116908

APOA1: NM_000039 apolipoproteína A-l MGC117399

ARNT: NM_178427 translocador nuclear de receptor de aril hidrocarburo HIF-1beta|HIF1B|HIF1BETA|TANGO|bHLHe2

BAD: NM_032989 agonista de muerte celular asociado a BCL2 BBC2|BCL2L8

BCL2: NM_000657 CLL de linfocitos B/linfoma 2 Bcl-2

BMP2: NM 001200 proteína morfogenética del hueso 2 BMP2A

BMP4: NM_130851 proteína morfogenética del hueso 4 BMP2B|BMP2B1|MCOPS6|OFC11| ZYME

C3AR1: NM_004054 receptor 1 de componente de complemento 3a AZ3B|C3AR|HNFAG09

CASP3: NM_032991 caspasa 3, cisteína peptidasa relacionada con apoptosis CPP32|CPP32B|SCA-1

CAV1: NM 001753 caveolina 1, proteína de caveolas, 22 kDa BSCL3|CGL3|MSTP085|VIP21

CDH5: NM_001795 cadherina 5, tipo 2 (endotelio vascular) 7B4|CD144|FLJ17376

CFLAR: NM_003879 regulador de la apoptosis de tipo FADD y CASP8 CASH|CASP8AP1|CLARP|Casper| FLAME|FLAME-1|FLAME1|FLIP| l-FLICE |MRIT|cFLIP| c-FLIPL|c-FLIPR|c-FLIPS

COMP: NM_000095 proteína de matriz oligomérica de cartílago EDM1|EPD1|MED|MGC131819| MGC149768| PSACH|THBS5

CSF1: NM_172212 factor estimulante de colonias 1 (macrófagos) MCSF|MGC31930

CTGF: NM_001901 factor de crecimiento tisular conectivo CCN2|HCS24|IGFBP8|MGC102839|NOV2

CTNNB1: NM_001904 catenina (proteína asociada a cadherina), beta 1, 88 kDa CTNNB|DKFZp686D02253|FLJ25606| FLJ37923

DAAM1: NM_014992 activador asociado a dishevelled de morfogénesis 1 FLJ41657|KIAA0666

ELN: NM_001081755 elastina FLJ38671 |FLJ43523|SVAS|WBS|WS

ENO1: NM_001428 enolasa 1, (alfa) EN01L1|MPB1|NNE|PPH

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FABP3: NM_004102 proteína de unión a ácido graso 3, músculo y corazón (inhibidor del crecimiento derivado de mama) FABP11 |H-FABP|MDGI|0-FABP

FAK: NM_001199649 quinasa de adhesión focal fakl

FGF4: NM_002007 factor de crecimiento de fibroblastos 4 HBGF-4|HST|HST-1|HSTF1|K-FGF| KFGF

FIGF: NM_004469 factor de crecimiento inducido por c-fos (factor de crecimiento endotelial vascular D) VEGF-D|VEGFD

FLT1: NM_002019 tirosina quinasa relacionada con fms 1 (receptor de factor de permeabilidad vascular/factor de crecimiento endotelial vascular) FLT|VEGFR1

FOXA1: NM_004496 caja forkhead A1 HNF3A|MGC33105|TCF3A

GAPDH: NM_002046 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa G3PD|GAPD|MGC88685

GFAP: NM_002055 proteína ácida fibrilar glial FLJ45472

SLC2A4: NM_001042 familia de vehículo de soluto 2 (transportador de glucosa facilitado), miembro 4 GLUT4

HAND1: NM_004821 expresado por derivados de corazón y cresta neural 1 Hxt|Thing1|bHLHa27|eHand

HIF1A: NM_181054 factor inducible por hipoxia 1, subunidad alfa (factor de transcripción básico de hélicebucle-hélice) HIF-1alpha|HIF1|HIF1-ALFA|MOP1|PASD8|bHLHe78

HK2: NM_000189 hexoquinasa 2 DKFZp686M1669|HKII|HXK2

HMGB1: NM_002128 caja de grupo de alta movilidad 1 DKFZp686A04236|HMG1|HMG3|SBP-1

HNF4A: NM_178850 factor nuclear de hepatocitos 4, alfa FLJ39654|HNF4|HNF4a7|HNF4a8|HNF4a9| HNF4alfa|MODY|MODY1|NR2A1| NR2A21| TCF|TCF14

HPRT1: NM_000194 hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 HGPRT|HPRT

HSPB1: NM_001540 proteína de choque térmico de 27 kDa 1 CMT2F|DKFZp586P1322|HMN2B| HS.76067| HSP27|HSP28|Hsp25|SRP27

ICAM1: NM_000201 molécula de adhesión intracelular 1 BB2|CD54|P3.58

IFNG: NM_000619 interferón, gamma IFG|IFI

IGF1: NM_001111285 factor de crecimiento de tipo insulina 1 (somatomedina C) IGF-I|IGF1A|IGFI

IGF2: NM_001127598 factor de crecimiento de tipo insulina 2 (somatomedina A) C11orf43|FLJ22066|FLJ44734|INSIGF| pp9974

IGFBP3: NM_001013398 proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 3 BP-531|BP3

IGFBP5: NM_000599 proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 5 IBP5

IKBKB: NM_001556 inhibidor de potenciador de gen de polipéptido ligero kappa en linfocitos B, quinasa beta FLJ33771|FLJ36218|FLJ38368|FLJ40509| IKKbeta|IKK2|IKKB|MGC131801| NFKBIKB

IL10: NM_000572 interleucina 10 CSIF|IL-10|IL10A|MGC126450|MGC126451|TGIF

IL1B: NM_000576 interleucina 1, beta IL-1|IL1-BETA|IL1F2

IL3: NM_000588 interleucina 3 (factor estimulante de colonias, múltiple) IL-3|MCGF|MGC79398|MGC79399|MULTI-CSF

IL4: NM_172348 interleucina 4 BCGF-1|BCGF1|BSF1|IL-4|MGC79402

IL5: NM_000879 interleucina 5 (factor estimulante de colonias, eosinófilos) EDF|IL-5|TRF

IL6R: NM_181359 receptor de interleucina 6 CD126|IL-6R-1|IL-6R-alfa|IL6RA| MGC104991

IL8: NM_000584 interleucina 8 CXCL8|GCP-1|GCP1|LECT|LUCT| LYNAP| MDNCF |MONAP|NAF|NAP-1|NAP1

ITGA5: NM_002205 integrina, alfa 5 (receptor de fibronectina, polipéptido alfa) CD49e|FNRA|VLA5A

KDR: NM_002253 receptor de dominio de inserto de quinasa (una tirosina quinasa receptora de tipo III) CD309|FLK1|VEGFR|VEGFR2

LEP: NM_000230 Leptina FLJ94114|OB|OBS

LPL: NM_000237 lipoproteína lipasa HDLCQ11|LIPD

MAPK11: NM_002751 proteína quinasa activada por mitógeno 11 P38B|P38BETA2|PRKM11|SAPK2| SAPK2B|p38-2|p38Beta

MMP1: NM_002421 metalopeptidasa de matriz 1 (colagenasa intersticial) CLG|CLGN

MMP3: NM_002422 metalopeptidasa de matriz 3 (estromelisina 1, progelatinasa) CHDS6|MGC126102|MGC126103| MGC126104| MMP-3|SL-1|STMY|STMY1|STR1

MYH1: NM_005963 miosina, cadena pesada 1, músculo esquelético, adulto MGC133384|MYHSA1|MYHa |MyHC-2X/D| MyHC-2x

MYH11: NM_022844 miosina, cadena pesada 11, músculo liso AAT4|DKFZp686D10126| DKFZp686D19237| FAA4|FLJ35232|MGC126726|MGC32963| SMHC|SMMHC

MYH7: NM_000257 miosina, cadena pesada 7, músculo cardiaco, beta CMD1S|CMH1|DKFZp451F047| MGC138376| MGC138378|MPD1|MYHCB|SPMD| SPMM

MYOD1: NM_002478 diferenciación miogénica 1 MYF3|MYOD|PUM|bHLHc1

NFATC1: NM_172390 factor nuclear de linfocitos T activados, citoplasmático, dependiente de calcineurina 1 MGC138448|NF-ATC|NFAT2|NFATc

NFATC2: NM_173091 factor nuclear de linfocitos T activados, citoplasmático, dependiente de calcineurina 2 NFAT1|NFATP

NFKB1: NM_003998 factor nuclear de potenciador de gen de polipéptido ligero kappa en linfocitos B 1 DKFZp686C01211|EBP-1|KBF1| MGC54151| NF-kappa-B|NF p105| NFKB-p50|p105|p50-kappaB|NFKB-

NOS2: NM_000625 óxido nítrico sintasa 2, inducible HEP-NOS|INOS|NOS|NOS2A

NOTCH1: NM_017617 notch 1 TAN1|hN1

NR3C1: NM_001024094 subfamilia del receptor nuclear 3, grupo C, miembro 1 (receptor de glucocorticoides) GCCR|GCR|GR|GRL

NRP2: NM_201279 neuropilina 2 MGC126574|NP2|NPN2|PR02714|VEGF165R2

PAX7: NM_013945 caja emparejada 7 FLJ37460|HUP1|PAX7B|RMS2

PDGFB: NM_033016 polipéptido beta de factor de crecimiento derivado de plaquetas (homólogo de oncogén vírico de sarcoma de simio (v-sis)) FLJ12858|PDGF2|SIS|SSV|c-sis

PDK4: NM_002612 piruvato deshidrogenasa quinasa, isozima 4 FLJ40832

PLA2G1B: NM_000928 fosfolipasa A2, grupo IB (páncreas) MGC119834|MGC119835|PLA2|PLA2A| PPLA2

PLIN1: NM_002666 proteína asociada a gota lipídica perilipina

PPARG: NM_138712 receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma CIMT1|GLM1|NR1C3|PPARG1|PPARG2| PPARgamma

QARS: NM_005051 glutaminil-ARNt sintetasa GLNRS|PR02195

RHOA: NM_001664 familia génica del homólogo de ras, miembro A ARH12|ARHA|RH012|RHOH12

RUNX1: NM_001754 factor de transcripción relacionado con runt 1 AML1|AML1-EVI-1|AMLCR1|CBFA2|EVI-1|PEBP2aB

RXRA: NM_002957 receptor retinoide X, alfa FLJ00280|FLJ00318|FLJ16020|FLJ16733 |MGC102720|NR2B1

SERPINE1: NM 001165413 inhibidor de serpina peptidasa, clado E (nexina, inhibidor de activador de plasminógeno tipo 1), miembro 1 PAI|PAI-1|PAI1|PLANH1

SMAD2: NM_005901 miembro de la familia de SMAD 2 JV18|JV18-1|MADH2|MADR2|MGC22139| MGC34440|hMAD-2|hSMAD2

SMAD4: NM_005359 miembro de la familia de SMAD 4 DPC4|JIP|MADH4

TERT: NM_198255 transcriptasa inversa de telomerasa EST2|TCS1 |TP2|TRT|hEST2

TGFB1: NM_000660 factor de crecimiento transformante, beta 1 CED|DPD1|LAP|TGFB|TGFbeta

TGFB3: NM_003239 factor de crecimiento transformante, beta 3 ARVD|FLJ16571|TGF-beta3

THBS4: NM_003248 trombospondina 4 TSP4

TNF: NM_000594 factor de necrosis tumoral DIF|TNF-alfa|TNFA|TNFSF2

TUBB: NM_178014 tubulina, beta M40|MGC117247|MGC16435|OK/SW-c1.56|TUBB1|TUBB5

TUBB1: NM_030773 tubulina, beta 1 isoforma de tubulina beta (1)

TUBS1: NM_001070 tubulina, gamma 1 GCP-1|TUBG|TUBGCP1

VCAM1: NM_080682 molécula de adhesión de células vasculares 1 CD106|DKTZp779G2333|INCAM-100| MGC99561

VEGFA: NM_003376 factor de crecimiento endotelial vascular A MGC70609|MVCD1|VEGF|VPF

VIM: NM_003380 vimentina FLJ36605

WISP1: NM_080838 proteína 1 de ruta de señalización inducible por WNT1 CCN4|WISP1c|WISP1i|WISP1tc

WNT1: NM_005430 familia de sitio de integración de MMTV tipo wingless, miembro 1 INT1

Análisis bioinformático: se convierten datos recuperados en formato .csv de la máquina Biomark de Fluidigm a un formato tabular que incluye información de muestra, ARNm y repetición junto con el valor de fluorescencia en bruto. Las reacciones de PCR que fracasan se marcan como ausentes. Se combinaron experimentos múltiples después de

5 normalizar con respecto a expresión total de especies de ARNm. Toda la expresión de ARNm medida se filtra basándose en el requisito de detección en al menos 2 de todos los replicados biológicos ensayados. Se evaluó la media de desviación técnica, biológica y de conjunto en conjuntos de datos completos.

Para análisis de datos se normalizan en primer lugar los valores de Ct para todos los genes de interés con respecto

10 a los valores de Ct promedio para genes constitutivos a partir de la muestra correspondiente para obtener valores de ∆Ct (∆Ct = Ct del gen – Ct de genes constitutivos promedio). Después se normalizan los genes de cada muestra con respecto al mismo gen en control no tratado para obtener valores de ∆∆Ct (∆∆Ct = ∆Ct de muestra de control -∆Ct de muestra tratada).

15 Para obtener valores de factor de cambio se someten genes regulados positivamente (es decir ∆∆Ct mayores de 0) al siguiente cálculo: factor de cambio = 2^∆∆Ct. Para genes regulados negativamente (es decir ∆∆Ct menores de 0): factor de Cambio = -(2^|∆∆Ct|).

Ensayos de proliferación celular (ensayos A1-A11 en las tablas de datos posteriores)

20 Antecedentes y relevancia terapéutica: la capacidad de modular la tasa de proliferación celular y apoptosis de diferentes tipos celulares representa una propiedad fundamental de muchos compuestos terapéuticos, y es directamente relevante para el tratamiento y prevención de una amplia serie de enfermedades y trastornos.

25 En consecuencia los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la tasa de proliferación celular y/o apoptosis tienen utilidad terapéutica significativa en una amplia serie de enfermedades incluyendo, como factores de crecimiento, y factores de diferenciación para células madre, y en regímenes de tratamiento para potenciar o suprimir la proliferación de tipos celulares específicos de interés in vivo o in vitro, incluyendo por ejemplo células

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OPTIMIZACIÓN DE CODONES DE POLINUCLEÓTIDOS DE AARS SELECCIONADOS

Se seleccionan polipéptidos de AARS representativos (resumidos en la Tabla E2) para caracterización bioquímica, 5 biofísica y funcional adicional basada en uno o más de los siguientes criterios, i) la identificación de fragmentos proteolíticos de polipéptidos de AARS, ii) la identificación de las variantes de corte y empalme de polipéptidos de AARS, iii) la identificación de polipéptidos de AARS por análisis bioinformático, iv) pruebas de expresión diferencial de polipéptidos de AARS específicos, v) la estructura de dominio de la proteína de AARS, vi) el tamaño del polipéptido de AARS y vii) la minimización de secuencias duplicativas similares. 10

Tabla E2 Sumario de Polipéptidos de AARS Seleccionados para Optimización de Codones y Expresión Bacteriana

Nombre del polipéptido de AARS: SEQ ID NO para Polipéptidos de AARS marcados con epítopos SEQ ID NO para Polinucleótidos de AARS Restos de proteína AARS Localización de marcador epitópico Método de clonación/síntesis usado

HisRS1N1: SEQ.ID. NO. 36 SEQ.ID. NO. 44 1-141 N-terminal 2

HisRS1N1: SEQ.ID. NO. 37 SEQ.ID. NO. 44 1-141 C-terminal 2

HisRS1N2: SEQ.ID. NO. 38 SEQ.ID. NO. 45 1-408 N-terminal 2

HisRS1N2: SEQ.ID. NO. 39 SEQ.ID. NO. 45 1-408 C-terminal 2

HisRS1N3: SEQ.ID. NO. 40 SEQ.ID. NO. 46 1-113 N-terminal 2

HisRS1N3: SEQ.ID. NO. 41 SEQ.ID. NO. 46 1-113 C-terminal 2

HisRS1N5: SEQ.ID. NO. 42 SEQ.ID. NO. 47 1-243 + 27aa N-terminal 2

HisRS1N5: SEQ.ID. NO. 43 SEQ.ID. NO. 47 1-243 + 27aa C-terminal 2

HisRS1C1: SEQ.ID. NO. 85 SEQ.ID. NO. 101 405-509 N-terminal 2

HisRS1C1: SEQ.ID. NO. 86 SEQ.ID. NO. 101 405-509 C-terminal 2

HisRS1C2: SEQ.ID. NO. 87 SEQ.ID. NO. 102 1-60 + 175-509 N-terminal 2

HisRS1C2: SEQ.ID. NO. 88 SEQ.ID. NO. 102 1-60 + 175-509 C-terminal 2

HisRS1C3: SEQ.ID. NO. 89 SEQ.ID. NO. 103 1-60 + 211-509 N-terminal 2

HisRS1C3: SEQ.ID. NO. 90 SEQ.ID. NO. 103 1-60 + 211-509 C-terminal 2

HisRS1C4: SEQ.ID. NO. 91 SEQ.ID. NO. 104 1-100 + 211509 N-terminal 2

HisRS1C4: SEQ.ID. NO. 92 SEQ.ID. NO. 104 1-100 + 211509 C-terminal 2

HisRS1C5: SEQ.ID. NO. 93 SEQ.ID. NO. 105 1-174 + 211509 N-terminal 2

HisRS1C5: SEQ.ID. NO. 94 SEQ.ID. NO. 105 1-174 + 211509 C-terminal 2

HisRS1C6: SEQ.ID. NO. 95 SEQ.ID. NO. 106 1-60 + 101-509 N-terminal 2

HisRS1C6: SEQ.ID. NO. 96 SEQ.ID. NO. 106 1-60 + 101-509 C-terminal 2

HisRS1C7: SEQ.ID. NO. 97 SEQ.ID. NO. 107 1-100 + 175509 N-terminal 2

HisRS1C7: SEQ.ID. NO. 98 SEQ.ID. NO. 107 1-100 + 175509 C-terminal 2

HisRS1C10: SEQ.ID. NO. 99 SEQ.ID. NO. 108 369-509 N-terminal 2

HisRS1C10: SEQ.ID. NO. 100 SEQ.ID. NO. 108 369-509 C-terminal 2

HisRS111: SEQ.ID. NO. 111 SEQ.ID. NO. 113 191-333 N-terminal 2

HisRS111: SEQ.ID. NO. 112 SEQ.ID. NO. 113 191-333 C-terminal 2

Se sintetizan polinucleótidos que codifican los polipéptidos de AARS seleccionados enumerados en la Tabla E2, junto con el marcador epitópico N o C-terminal apropiado, y se clonan como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales usando la metodología de síntesis génica enumerada en la Tabla E2. 15

EJEMPLO 9

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN BACTERIANA A PEQUEÑA ESCALA

20 Los polipéptidos de AARS enumerados en la Tabla E2 se expresan en E. coli, como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales. La expresión relativa de polipéptidos de AARS localizados en cuerpos de inclusión y solubles se resume en la Tabla E3 a continuación.

117

Tabla E3 Sumario de Características de Expresión Bacteriana de Polipéptidos de AARS

Polipéptido de AARS: Localización de Marcador Epitópico Cantidad de Proteínas Recuperada de Fracción Soluble Cantidad de Proteínas Recuperada de Cuerpos de Inclusión

HisRS1N1: N-terminal + +++

HisRS1N1: C-terminal + +

HisRS1N2: N-terminal + ++++

HisRS1N2: C-terminal + +

HisRS1N3: N-terminal + +++

HisRS1N3: C-terminal + +

HisRS1N5: N-terminal + ++

HisRS1N5: C-terminal + +

HisRS1C1: N-terminal + +++

HisRS1C1: C-terminal ++ +++++

HisRS1C2: N-terminal + +++

HisRS1C2: C-terminal + +

HisRS1C3: N-terminal + +

HisRS1C3: C-terminal + +

HisRS1C4: N-terminal + +++

HisRS1C4: C-terminal + +

HisRS1C5: N-terminal + +

HisRS1C5: C-terminal + +

HisRS1C6: N-terminal + +++

HisRS1C6: C-terminal + +

HisRS1C7: N-terminal + +++

HisRS1C7: C-terminal + +

HisRS1C10: N-terminal + +++

HisRS1C10: C-terminal + +

HisRS1I1: N-terminal + ++

HisRS1I1: C-terminal + +

"+" representa 0-1 mg/l de expresión de polipéptido de AARS "++" representa 1-5 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "+++" representa 5-10 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "++++" representa 10-15 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "+++++" representa ≥ 15 mg/l de expresión de polipéptido de AARS;

ND: no determinada

Sorprendentemente, los datos de expresión de proteínas demuestran la existencia de al menos una familia de dominios proteicos que muestra alto nivel de expresión de proteína soluble cuando se expresa en E. coli. Específicamente, los datos demuestran que el polipéptido AARS HisRS1C1 (aminoácidos 405-509), define el límite

118

imagen108

imagen109

Los resultados de estos estudios establecen que proteínas de AARS representativas de la familia de PheRSa1N2 de proteínas de AARS, muestran rendimientos de expresión y características de solubilidad de proteínas iniciales razonables.

5 EJEMPLO 11

PERFIL DE TRANSCRIPCIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE AARS REPRESENTATIVOS

Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular la expresión génica, se

10 incubaron polipéptidos de AARS seleccionados con células madre mesenquimales o células del músculo esquelético humano durante los tiempos y a las concentraciones mostradas en la Tabla E5.

Tabla E5 Perfil de Transcripción de Polipéptidos de AARS Representativos en Células Madre Mesenquimales (MSC) o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC)

Descripción de la Muestra de Ensayo: Tipo Celular y Tiempo de Exposición

Polipéptidos de AARS: Localización de Marcador Epitópico Concentración nM MSC 24 horas MSC 72 horas HSkMC 24 horas HSkMC 72 horas

HisRS1N1: N-terminal 250 4 2 7 4

HisRS1N2: N-terminal 250 >20 1 5 7

HisRS1N3: N-terminal 250 6 6 5 5

HisRS1N4: C-terminal 250 >20 5 11 2

HisRS1N5: N-terminal 250 >20 3 4 2

HisRS1C1: N-terminal 250 0 1 5 7

HisRS1C1: C-terminal 250 0 1 18 5

HisRS1C2: N-terminal 250 16 0 5 6

HisRS1C4: N-terminal 250 12 1 10 4

HisRS1C6: N-terminal 250 >20 0 3 4

HisRS1C7: N-terminal 250 15 4 5 4

HisRS1C8: C-terminal 250 18 0 7 5

HisRS1C9: C-terminal 250 19 0 1 3

HisRS1C10: N-terminal 250 13 3 12 2

HisRS1I1: N-terminal 250 0 0 5 4

Controles

Promedio entre todos los polipéptidos de AARS explorados: 6 2 5 4

Cóctel de Osteogénesis: 16 18 ND ND

Cóctel de Condrogénesis: 11 16 ND ND

Cóctel de Adipogénesis: 11 11 ND ND

Ctrl Pos de SKMC: ND ND 32 20

No tratado: 0 0 8 3

En la Tabla E5, los números en cada columna representan el número de genes que se modularon, bien

15 positivamente o bien negativamente, al menos 4 veces en comparación con las muestras de control, como se describe en la sección de métodos generales. Los datos muestran que formas específicas de los polipéptidos de AARS ensayados tienen la sorprendente capacidad de regular la transcripción, y por lo tanto modulan potencialmente el destino de desarrollo o estado de diferenciación cuando se añaden a Células Madre Mesenquimales (MSC) y/o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC). Las células sombreadas con

20 números en negrita en la tabla representan ejemplos en los que el polipéptido de AARS muestra una influencia significativa en la regulación de la transcripción génica en las líneas celulares y los tiempos indicados en la tabla.

Se concluye que HisRS1N1, HisRS1N2, HisRS1N3, HisRS1N4, HisRS1N5, HisRS1I1, HisRS1C1 HisRS1C2, HisRS1C4 , HisRS1C6, HisRS1C7, HisRS1C8, HisRS1C9 y HisRS1C10 parecen ser reguladores importantes de la expresión génica 25 de células mesenquimales y/o células del músculo esquelético humano.

121

Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular una serie de procesos fenotípicos, se incubaron polipéptidos de AARS seleccionados con los tipos celulares, y las condiciones proporcionadas en la sección de métodos generales, y las Tablas E5 y E6.

EJEMPLO 12 PERFILES FUNCIONALES DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

Tabla E6 Clave para Ensayos y criterios para indicar un acierto

Ensayos de proliferación

Fuente y tipo celular: Número de Ensayo

Células de leucemia megacariocítica humana/Mo7e: A1

Células de leucemia promielocítica aguda humana/HL60: A2

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer)/RPMI8226: A3

Células madre mesenquimales humanas/hMSC: A4

Astrocitos humanos: A5

Células de leucemia monocítica aguda/THP1: A6

Células de aspirado de Médula Ósea humana/Células de Médula Ósea (Cultivo a Largo Plazo): A7

Sinoviocito Humano/HFLS-SynRA: A8

Células preadipocíticas humanas/hPAD: A9

Célula de músculo liso de arteria pulmonar humana/hPASMC: A10

Célula de músculo esquelético humano/hSKMC: A11

Se realizó análisis de datos para ensayos de proliferación dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran proliferativos si el valor medido estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva. Se consideró que un polipéptido de AARS derivado de ARNt sintetasa era citotóxico si estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección negativa. Se utilizó un compuesto citotóxico como un control negativo y el valor promedio para esto estuvo siempre a más de 3 DT de distancia del valor promedio de PBS.

Ensayos de diferenciación y fenotipo celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Captación de LDL acetilada por hepatocito humano (Células HepG2C3a): B1

Se realizó análisis de datos para ensayo de captación de ac-LDL dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la captación de ac-LDL si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se realizó una comprobación visual para confirmar los resultados del lector de placas usando un microscopio fluorescente,

Ensayos de Neutrófilos Humanos

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Estallido oxidativo de Neutrófilo (agonista): C1

Estallido oxidativo de Neutrófilo (antagonista): C2

Elastasa de Neutrófilo: C3

Se realizó análisis de datos para ensayos de neutrófilos dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la producción de elastasa o biología de estallido oxidativo de neutrófilos si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa.

Modulación de Receptores de Tipo Toll (TLR)

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Activación de TLR en células RAW BLUE: D1

Antagonismo de TLR en células RAW BLUE: D2

Activación de hTLR2: D3

Activación de hTLR4: D4

Se realiza análisis de datos para ensayos de modulación de TLR dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la biología específica de TLR si el valor medido estaba más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Los controles positivos, incluyendo el LPS y el reactivo de detección, fueron siempre significativamente distintos y >3 DT del valor promedio del PBS.

122 123 124

Liberación de Citocina

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL6): E1

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL6): E2

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL6): E3

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL6): E4

Liberación de IL6 de sangre completa: E5

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8) Incubación de 72 h: E6

Producción de IL8

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL8): E7

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8): E8

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL8): E9

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL8): E10

Liberación de IL8 por hepatocitos humanos (células HepG2C3a): E11

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL8): E12

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer) / RPMI8226 (liberación de IL8): E13

Producción de TNF alfa

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de TNF alfa): E14

Liberación de TNF alfa de sangre completa: E15

Liberación de IL10

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL10): E16

Células mononucleares de sangre primaria humana (liberación de IL10): E17

Se realizaron análisis de datos para ensayos de liberación de citocinas dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la producción de citocinas o biología relacionada con citocinas si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia de valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se eligieron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos

Adhesión celular y quimiotaxis

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Adhesión celular de monocito THP 1/ Célula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC): F1

Hepatocito humano (células HepG2C3a) (liberación de ICAM): F2

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) (liberación de ICAM): F3

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (liberación de VCAM): F4

Regulación de la adhesión celular de células madre mesenquimales humanas (hMSC) (Liberación de ICAM): F5

Regulación de la adhesión celular de células del músculo esquelético humano (hSKMC) (Liberación de ICAM): F6

Regulación de la adhesión celular de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de VCAM): F7

Se realizó análisis de datos para ensayos de regulación de adhesión celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la adhesión celular o un regulador de la biología relacionada con la adhesión celular si se obtuvo un valor a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. En el caso de los ensayos de ELISA, se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se seleccionaron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos.

Diferenciación Celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Diferenciación de células preadipocíticas humanas (hPAD): G1

Diferenciación de células de músculo esquelético humano (hSKMC): G2

Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC): G3

Diferenciación de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC): G4

Se realizó análisis de datos para ensayos de diferenciación celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Los ensayos de diferenciación se puntuaron basándose en la intensidad de fluorescencia de anticuerpos particulares como se describe en la sección de métodos. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la diferenciación celular si un valor de intensidad para un marcador específico de diferenciación estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa en un pocillo tratado dado.

Unión Celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

PBMC: H1

Linfocito T primario: H2

Linfocito B primario: H3

Monocito primario: H4

HepG2: H5

3T3L1: H6

C2C12: H7

THP1: H8

Jurkat: H9

Raji: H10

Se consideró que los polipéptidos de AARS se unían con un tipo celular particular si la intensidad de fluorescencia unida a células media estaba a más de 2 DT de distancia de los valores de control del reactivo para ese tipo celular.

Tabla E7 Resultados de Estudios de Perfiles Funcional de Polipéptidos de AARS

Polipéptidos de AARS: Localización de marcador Epitópico Concentración [nM] Aciertos de Ensayo

HisRS1N1: N-terminal 250 D1 (Biología de receptor de tipo Toll) E12, E14 (Liberación de citocinas) G1 (Diferenciación celular)

HisRS1N2: N-terminal 250 C2 (Estallido oxidativo de neutrófilo) E1, E7, E13 (Liberación de citocinas) F2 (Adhesión celular y quimiotaxis)

HisRS1N3: N-terminal 250 A7 (Proliferación) E1, E7 (Liberación de citocinas) F5, F6 (Adhesión celular y quimiotaxis) G3 (Diferenciación celular)

HisRS1N4: C-terminal 250 A7(Proliferación) D1 (Biología de receptor de tipo Toll)

HisRS1N5: N-terminal 250 C2 (Estallido oxidativo de neutrófilo) D2 (Biología de receptor de tipo Toll) E7, E10, E11, E12 (Liberación de citocinas) F2, F6 (Adhesión celular y quimiotaxis) G1 (Diferenciación celular)

HisRS1C1: N-terminal 250 F2 (Adhesión celular y quimiotaxis) G1 (Diferenciación celular)

HisRS1C1: C-terminal 250 E1, E9, E11 (Liberación de citocinas) G1, G3 (Diferenciación celular)

HisRS1C2: N-terminal 250 D1 (Biología de receptor de tipo Toll) E11, E12, E14 (Liberación de citocinas)

HisRS1C4: N-terminal 250 A6 (Proliferación) B1 (Captación de Ac-LDL) D1 (Biología de receptor de tipo Toll) E11, E12, E14 (Liberación de citocinas) G1, G2 (Diferenciación celular)

HisRS1C6: N-terminal 250 A3 (Proliferación) C2 (Estallido oxidativo de neutrófilo) D1, D2 (Biología de receptor de tipo TLR) F2 (Adhesión celular y quimiotaxis)

HisRS1C7: N-terminal 250 C2 (Estallido oxidativo de neutrófilo) D1, D2 (Biología de receptor de tipo TLR) F2, F6 (Adhesión celular y quimiotaxis)

HisRS1C8: C-terminal 250 A4, A7 (Proliferación) E11 (Liberación de citocinas)

Claims

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