KR101549245B1 - Ｗｎｔ 단백질 및 암의 검출 및 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Wnt 및 FZD 단백질, 유전자, FZD 및 Wnt 특이 항체와 프로브를 사용하는 암의 진단 및 치료 방법과, 시험 화합물이 암을 치료하는 효능을 보유하는지 여부를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 예를 들어, 간암의 치료에 유용한 화합물에 관하여 개시하고 있다.

Description

Ｗｎｔ 단백질 및 암의 검출 및 치료{WNT PROTEINS AND DETECTION AND TREATMENT OF CANCER}
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 정부 지원 하에 미국 국립 보건원의 승인을 얻은 것으로서, 승인 번호는 CA035711 및 AA002666이다. 정부는 본 발명에 대하여 특정 권리를 보유한다.
관련 출원에 대한 상호 참조 문헌
본 출원은 미국 가 명세서 출원인 제60/612,098호(2004년 9월 21일 출원)을 우선권으로 주장하는, 국제 특허 출원 제PCT/US05/000267호(2005년 1월 5일자 출원)의 부분 계속 출원이며, 상기 문헌들은 둘 다 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용한다.
기술 분야
본 발명은 간암의 검출 및 치료에 관한 것이다.
간암(HCC)은 간에서 가장 흔히 발생하는 악성 종양이다. 비록 바이러스성 병인론적 인자가 확인된 바 있지만, 간암 발병 과정에 있어서 종양의 진행과 관련된 분자 수준의 기작에 관해서는 대부분 알려져 있지 않다. 단백질의 프리즐드 군(frizzled family)은 Wnt 단백질의 수용체로서 작용하는 7원성 경막 단백질(seven-transmembrane protein) 10개 이상으로 이루어져 있다. Wnt/프리즐드 신호 전달 네트워크는 다양한 생물학적 과정 즉, 세포의 운명 결정에서부터 세포의 이동성과 증식에 이르기까지에 영향을 미친다.
β-카테닌은 액틴 세포 골격에 카데린과 α-카테닌을 강하게 결합시키는 것을 포함하는 세포-세포 부착에 있어서 일정한 역할을 하는 다인성 단백질이다. Wnt/프리즐드 신호 전달이 이루어지지 않을 경우, β-카테닌은 글리코겐 신타제 키나제(GSK)-3β와의 상호 작용에 의해 인산화되어, 액신 및 선종성 용종 콜라이 단백질(adenomatous polyposis coli protein; APC)과 함께 복합체를 형성한다. 궁극적으로 β-카테닌은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitinproteasome system)에 의한 분해에 대하여 표적화된다. 이와는 반대로, Wnt 리간드가 이의 프리즐드 수용체에 결합하면 GSK-3β 효소 활성을 억제함으로써 세포 내 β-카테닌을 안정화한다. 이후, β-카테닌은 고 이동성 기 도메인 인자(high mobility group domain factors) 예를 들어, Tcf/Lef와 결합하여 핵 속으로 이동하게 된다. 이 복합체는 성장 조절 및 세포 이동 관련 유전자의 전사를 상향 조절하게 되는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 Wnt3, 8b 및 11이, HCC 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV) 관련 HCC에 있어서 일반적으로 그 mRNA 및 단백질이 과다한 수준으로 발현되는, 프리즐드 7(Frizzled 7)의 리간드라는 사실을 바탕으로 하는 것이다. 프리즐드 7을 과다하게 발현하는 간암 세포는 이동성(mobility)과 이주성(migration)이 강하다. 이와 같은 과다 발현은 다수의 단계들로 구성된 간세포 변형 과정에 있어서 초기에 일어나는 현상으로서, 프리즐드 7과 Wnt 3, 8b 및 11은 간암 치료를 위한 신규의 표적 분자인 것으로 파악된다.
그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 항암제를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 Wnt3, Wnt8b 또는 Wnt11 단백질 또는 이의 FZD-결합 단편의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 시험 화합물을 선별하는 단계와; 임의로는 이 시험 화합물이 (i) 세포 내에서 Wnt/FZD7 신호 전달을 감소시킬 수 있는지; (ii) 간 세포 이동성을 감소시킬 수 있는지; (iii) 간암 세포 내에 β-카테닌이 축적되는 것을 감소시킬 수 있는지; 또는 (iv) 시험관 내 또는 생체 내에서 간암을 치료할 수 있는지 여부를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (i)∼(iv) 중 한 가지 이상의 효능을 갖는 시험 화합물은 항암제이다. 몇몇 구체예에서, 시험 화합물을 선별하는 단계는, Wnt3, Wnt8b 또는 Wnt11 폴리펩티드 또는 이의 FZD 결합 단편의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계; 시험 화합물과 이 폴리펩티드를 접촉시키는 단계; 상기 폴리펩티드와 시험 화합물 사이의 결합 여부를 확인하는 단계; 및 이 시험 화합물이 상기 폴리펩티드에 결합하면 그 시험 화합물을 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 시험 화합물이 결합한 폴리펩티드는 (i) 천연 생성 폴리펩티드, (ii) 재조합 폴리펩티드, (iii) 세포 표면상에 발현되는 폴리펩티드 또는 (iv) 분리된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드가 Wnt3 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 폴리펩티드는 서열 번호 8∼서열 번호 12 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드가 Wnt 8b 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 폴리펩티드는 서열 번호 15∼서열 번호 19 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 Wnt11 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 폴리펩티드는 서열 번호 22∼서열 번호 26 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 임의의 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 7∼서열 번호 27 중 임의의 하나와 하나 이상의 비-Wnt 서열을 포함한다. 시험 화합물은 폴리펩티드, 리보핵산, 소 분자(예를 들어, 소 유기 분자) 및 데옥시리보핵산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 기술된 항암제를 동정하는 방법에 의하여 동정된 항암제의 예로서는 항Wnt 항체 예를 들어, 모노클로날 항체, FZD7 수용체, FZD7 수용체의 Wnt-결합 단편, 그리고 기타 Wnt-결합 화합물을 포함한다. 본 방법에 의하여 동정된 항암제는 암 예를 들어, 간암 치료에 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 방법에 의하여 동정된 항암제는 환자의 간암을 치료하고 간암 세포 이동성을 감소시키는 약품을 제조하는데에 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 후보 항암제를 동정하는 방법을 포함한다. 본 방법은 (a)(i) FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD7 폴리펩티드) 또는 이의 단편을 포함하고, (ii) Wnt(예를 들어, Wnt 3, 8b 또는 11)-결합 능력을 보유하는 제1 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b)(i) Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11 폴리펩티드) 또는 이의 단편을 포함하고, (ii) FZD(예를 들어, FZD7) 결합 능력을 보유하는 제2 폴리펩티드를 제공하는 단계; (c) 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 시험 화합물의 존재 하에 접촉시키는 단계; 및 (d) 시험 화합물의 존재 하에서 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이의 결합 수준을, 시험 화합물의 부재 하에서의 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 시험 화합물의 존재 하에서의 결합 수준이 이 시험 화합물의 부재 하에서의 결합 수준보다 낮음은, 상기 시험 화합물이 후보 항암제라는 것을 의미한다. 본 방법은 (e) 이 후보 항암제가 (i) 세포 내에서 Wnt/FZD7 신호 전달을 감소시킬 수 있는지, (ii) 암 세포 이동성을 감소시킬 수 있는지, (iii) 암 세포 내에 β-카테닌이 축적되는 것을 감소시킬 수 있는지 또는 (iv) 시험관 내 또는 생체 내에서 암 세포를 치료할 수 있는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 (i)∼(iv) 중 하나 이상의 특성을 갖는 후보 물질은 항암제이다. 시험 화합물로서는 폴리펩티드, 리보핵산, 소 분자(예를 들어, 소 유기 분자), 그리고 데옥시리보핵산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. Wnt 폴리펩티드는 예를 들어, 서열 번호 8∼12, 서열 번호 15∼19 및/또는 서열 번호 22∼26의 서열을 포함할 수 있다. FZD 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, 제1 폴리펩티드는, (i) 전사 인자의 전사 활성화 도메인 또는 (ii) 전사 인자의 DNA-결합 도메인에 융합된 FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD7 폴리펩티드)를 포함하는 제1 융합 단백질이고; 제2 폴리펩티드는, (i) 전사 인자의 전사 활성화 도메인 또는 (ii) 전사 인자의 DNA-결합 도메인에 융합된 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt 3, 8b 또는 11 폴리펩티드)를 포함하는 제2 융합 단백질로서, 상기 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드에 융합된 도메인과 상이한 도메인에 융합되어 있으며; 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 결합 여부는 전사 인자의 재구성 여부로서 확인된다.
본원에 기술된 방법에 의하여 동정된 항암제(및/또는 후보 항암제)는 암 예를 들어, 간암의 치료에 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에 기술된 방법에 의하여 동정된 항암제(및/또는 후보 항암제)는 암 예를 들어, 간암 치료용 약품을 제조하는데에 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포(예를 들어, 간 세포)가 암 세포인지, 또는 이 암 세포로 발전할 위험이 있는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 시험 세포(예를 들어, 간 세포)를 제공하는 단계; (b) FZD7 및/또는 Wnt3의 세포 내 발현 수준이 대조구 세포의 세포 내 발현 수준보다 더 높은지, 및/또는 FZD8 및/또는 Wnt11의 세포 내 발현 수준이 대조구 세포의 세포 내 발현 수준보다 더 낮은지 여부를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험 세포의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준이 대조구 세포의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준보다 더 높고/높거나, 상기 시험 세포의 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준이 대조구 세포의 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준보다 더 낮으면, 이 시험 세포를 (i) 암 세포 또는 (ii) 암 세포로 발전할 위험성이 있는 세포로 분류하는 단계를 포함한다. 상기 방법이 세포 내 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 이 방법은 (c) 시험 세포의 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준이 대조구 세포의 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준보다 더 낮은지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준이 더 낮다는 것은 이 시험 세포가 암 세포이거나 또는 암 세포로 발전할 위험성이 있음을 의미한다. 상기 방법이 세포 내 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 경우, 이 방법은 (c) 시험 세포의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준이 대조구 세포의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준보다 더 높은지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현 수준이 더 높다는 것은 이 시험 세포가 암 세포이거나 또는 암 세포로 발전할 위험성이 있음을 의미한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 환자에 암이 발병하였는지 또는 암 발병 위험이 있는지 여부 예를 들어, 시험 조직 시료가 암이 발병하였거나 또는 암 발병 위험이 있는 환자로부터 유래 되었는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 환자로부터 얻은 시험 조직 시료(예를 들어, 간 조직 예를 들어, 종양성(tumorous) 또는 종양 주위(peritumorous) 간 조직)를 제공하는 단계; 및 (b) 건강한 개체로부터 얻은 비교 대상 조직 시료의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준보다 시험 조직 시료의 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준이 더 높은지, 및/또는 건강한 개체로부터 얻은 비교 대상 조직 시료의 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준보다 시험 조직 시료 중 FZD8 및/또는 Wnt11 발현 수준이 더 낮은지 여부를 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 시험 조직 시료 중 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현 수준이 더 높고/높거나, 시험 조직 시료 중 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준이 더 낮다는 것은, 이 시료가 암이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자로부터 유래 되었음을 나타내는 지표가 되는 것이다. 상기 방법이 FZD7 및/또는 Wnt3 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 이 방법은 (c) 시험 조직 시료 중 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준이 건강한 개체로부터 얻은 조직 시료의 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준보다 낮은지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준이 더 낮다는 것은, 이 시료가 암이 발병한 환자 또는 발병 위험이 있는 환자로부터 유래 되었음을 나타내는 지표가 된다. 상기 방법이 FZD8 및/또는 Wnt11의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 이 방법은 (c) 시험 조직 시료 중 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현 수준이 건강한 개체로부터 얻은 조직 시료의 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현 수준보다 높은지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현 수준이 더 높다는 것은, 환자가 암이 발병하였거나 발병 위험이 있음을 나타내는 지표가 된다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 방법에 있어서, FZD7, FZD8, Wnt3 또는 Wnt11의 발현 수준을 측정하는 단계는, 세포 내 FZD7, FZD8, Wnt3 또는 Wnt11의 mRNA 양을 예를 들어, 노던 블럿 검정법 또는 RT-PCR 검정법을 이용하여 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 발현 수준을 측정하는 단계는 세포 내 FZD7, FZD8, Wnt3 또는 Wnt11 단백질의 양을 예를 들어, 항체 예를 들어, 서열 번호 7∼서열 번호 80에 결합하는 항Wnt 항체를 이용하여 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에 있어서 암(예를 들어, 간암)을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 환자에게 유효량의 화합물 즉, 환자의 FZD7 발현 세포에 있어서 Wnt/FZD7 신호 전달을 감소시키고, FZD7 발현 세포에 치명적이지 않기도 한 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 이 화합물은 환자에 있어서 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현을 감소시키고/감소시키거나, 환자에 있어서 Wnt11의 발현을 증가시키는 화합물이다. 다른 구체예에서, 본 화합물은 환자에 있어서 Wnt3, Wnt8b, Wnt11, FZD7 또는 FZD8에 결합하는 화합물이다. 이 화합물의 예로서는, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 생리적 조건하에서 Wnt 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 사슬 RNA(dsRNA), 분리된 FZD7 수용체 또는 이의 Wnt3 결합 단편, Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt11 폴리펩티드) 또는 FZD7의 절단형(예를 들어, FZD7의 세포 내 도메인 및/또는 경막 도메인이 결여된 FZD7의 한 형태)를 암호화하는 유전자 구조물, 및/또는 항FZD 및/또는 항Wnt 항체(예를 들어, 항Wnt3 항체)가 있다. 상기 화합물은 환자의 간에 투여하는 것과 같이, 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 임의의 구체예에서, 상기 화합물은 서열 번호 7 또는 서열 번호 80의 서열에 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, 상기 화합물은 서열 번호 81, 82 또는 83의 서열을 포함하는 siRNA이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 세포(예를 들어, 간암 세포)의 이동성을 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포에 유효량의 화합물 즉, 세포 내 Wnt/FZD7 신호 전달을 감소시키고 이 세포에 치명적이지 않기도 한 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 화합물은 환자에 있어서 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현을 감소시키고/감소시키거나, 환자에 있어서 Wnt11의 발현을 증가시키는 화합물이다. 다른 구체예에서, 본 화합물은 환자에 있어서, Wnt3, Wnt8b, Wnt11, FZD7 또는 FZD8에 결합하는 화합물이다. 이 화합물의 예로서는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 생리적 조건하에서 Wnt 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 사슬 RNA(dsRNA), 분리된 FZD7 수용체 또는 이의 Wnt3 결합 단편, Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt11 폴리펩티드) 또는 FZD7의 절단형(예를 들어, FZD7의 세포 내 도메인 및/또는 경막 도메인이 결여된 FZD7의 한 형태)을 암호화하는 유전자 구조물, 및/또는 항FZD 및/또는 항Wnt 항체(예를 들어, 항Wnt3 항체)가 있다. 이 화합물은 예를 들어, 환자의 간에 투여하는 것과 같이 임의의 경로에 의하여 투여될 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 화합물은 서열 번호 7 또는 서열 번호 80의 서열에 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, 본 화합물은 서열 번호 81, 82 또는 83의 서열을 포함하는 siRNA이다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 간암 치료용 약품 또는 (ii) 간암 세포의 이동성을 감소시키는 약품을 제조하는 과정에 있어서 FZD7 발현 세포 내 Wnt/FZD7 신호 전달을 감소시키는 화합물의 용도를 포함한다. 임의로, 상기 약품은 FZD7 발현 세포에 치명적이지 않다. 하나의 구체예에서, 이 화합물은 환자에 있어서 FZD7 및/또는 Wnt3의 발현을 감소시키고/감소시키거나 환자에 있어서 Wnt11의 발현을 증가시키는 화합물이다. 다른 구체예에서, 본 화합물은 환자에 있어서 Wnt3, Wnt8b, Wnt11, FZD7 또는 FZD8에 결합하는 화합물이다. 이 화합물의 예로서는, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 생리적 조건하에서 Wnt 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 사슬 RNA(dsRNA), 분리된 FZD7 수용체 또는 이의 Wnt3 결합 단편, Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt11 폴리펩티드) 또는 FZD7의 절단형(예를 들어, FZD7의 세포 내 도메인 및/또는 경막 도메인이 결여된 FZD7의 한 형태)을 암호화하는 유전자 구조물, 및/또는 항FZD 및/또는 항Wnt 항체(예를 들어, 항Wnt3 항체)가 있다.
임의의 측면에서, 본 발명은 항Wnt 항체 예를 들어, 항Wnt3 항체 예를 들어, 서열 번호 7 또는 아미노산 서열인 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 결합하는 항체를 포함한다. 본 항체는 환자에 투여하는데에 적당한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 병상 예를 들어, 암 예를 들어, 간암의 치료 또는 예방용인 약학 조성물의 제조에 있어서 본원에 개시된 화합물 중 임의의 화합물의 용도를 포함한다. 본 조성물은 본원에 개시된 방법에 따라서 암 치료 방법 및/또는 암 세포의 이동성을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 형태 예를 들어, 액체 또는 고체인 조성물일 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 화합물은 항체 예를 들어, 항Wnt 항체 예를 들어, 서열 번호 7 또는 아미노산 서열인 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, 본 화합물은 siRNA 예를 들어, 핵산 서열 WNT3-1:5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3'(서열 번호 81), WNT3-2:5'-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3'(서열 번호 82) 및/또는 WNT3-3:5'-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3'(서열 번호 83)을 포함하는 siRNA이다.
Wnt 단백질을 검출하는데에 유용한 핵산(예를 들어, 이하 표 1에 제시된 프라이머)도 본 발명에 포함된다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 보유한다. 비록 본원에 개시된 방법 및 물질과 유사하거나 또는 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 적당한 방법과 물질에 관하여는 이하에 기술하였다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌들은 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 분쟁이 발생할 경우에, 정의 부분을 포함하여 본 명세서가 해결해 줄 것이다. 물질, 방법 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 한정하기 위한 것은 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 이하에 상세히 기술된 발명의 상세한 설명과 청구항으로부터 명백히 파악될 것이다.
상세한 설명
본 발명은 최소한 부분적으로나마, 특정한 프리즐드(FZD) 단백질 예를 들어, FZD7 및 FZD8은 임의의 암 예를 들어, 간암과 관련되어 있으며, Wnt3, 8b 및 11은 FZD7 리간드라는 사실에 바탕을 둔다. 그러므로, 본 명세서는 특히 Wnt 및 FZD 단백질, 유전자, FZD-특이적 항체 및 프로브를 암 진단 및 치료에 사용하는 방법과, 암을 치료하는 능력에 대하여 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 암 예를 들어, 간암을 치료하는데에 유용한 화합물에 관하여도 개시되어 있다.
I. 핵산, 단백질, 벡터 및 숙주 세포
"프리즐드(Frizzled)", "FZD", "프리즐드 단백질(Frizzled protein)" 및 "프리즐드 수용체"라는 용어는 초파리 프리즐드 유전자와 관련된 포유 동물의 단백질 군으로서, 조직의 극성 발달에 있어서 한 몫을 하는 단백질 군을 의미하는 것이다. 상기 프리즐드 군은 10개 이상의 포유 동물 유전자를 포함한다. 대표적인 인간 프리즐드 수용체로서는 프리즐드 1, 프리즐드 2, 프리즐드 3, 프리즐드 4, 프리즐드 5, 프리즐드 6, 프리즐드 7, 프리즐드 8, 프리즐드 9 및 프리즐드 10을 포함한다. 프리즐드 수용체는 아미노-말단 리간드 결합 도메인을 보유하는 G-단백질-커플링된 수용체와 유사한, 경막 신호 전달의 동적 모델과 관련되어 있다.
"Wnt 단백질", "Wnt 리간드" 및 "Wnt"라는 용어는, 초파리 극성 절편 유전자(Drosophila segment polarity gene)인 "윙리스(wingless)"와 관련된 포유 동물 단백질의 일군을 의미한다. 사람에 있어서, Wnt 유전자 군은 통상적으로 38∼43kDa의 시스테인 부유 당단백질[소수성 시그널 서열과 보존적 아스파라긴-결합 올리고당 공통 서열 보유]을 암호화한다[예를 들어, Shimizu외 다수, Cell Growth Differ 8:1349-1358 (1997) 참조]. 상기 Wnt 군은 19개 이상의 포유 동물로부터 유래된 일원들을 포함한다. 대표적인 Wnt 단백질로서는 Wnt-1, Wnt-2, Wnt-2b(Wnt-13으로도 공지됨), Wnt-3, Wnt-3A, Wnt-4, Wnt-5A, Wnt-5B, Wnt-6, Wnt-7A, Wnt-7B, Wnt-8A, Wnt-8B, Wnt-1OA, Wnt-1OB, Wnt-11, Wnt14, Wnt15 및 Wnt16을 포함한다.
Wnt 리간드에 더하여, 분비형 프리즐드-관련 단백질(sFRP) 군이 분리되었다. sFRP는, 분비형 Wnt 리간드 결합에 대하여 경막성(membrane-spanning) 프리즐드 수용체와 경쟁함으로써, Wnt 신호 전달에 있어 가용성인 내인성 조정자로서의 기능을 하는 것으로 파악된다. sFRP는, 단백질을 결합시키고 이 단백질의 세포 표면에서의 신호 전달에 관여하는 수용체로의 접근을 차단함으로써 Wnt의 기능을 길항시킬 수 있거나, 또는 프리즐드 수용체에 리간드를 제시하는 것을 촉진함으로써 Wnt 활성을 강화시킬 수 있다.
"Wnt/FZD 신호 전달 경로"라는 용어는, 프리즐드 수용체 예를 들어, FZD7과 이의 리간드 중 하나 이상 예를 들어, Wnt 단백질 예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11 사이의 상호 작용에 의해서 개시되는 세포 내 신호 전달 경로를 의미한다. 통상적으로 Wnt/FZD 상호 작용은 Wnt 단백질 예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11을 프리즐드 수용체 예를 들어, FZD7에 결합시켜, 신호 전달 경로를 활성화시키는 과정을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, Wnt/프리즐드 신호 전달 경로를 활성화시키면, 하류-Wnt 및/또는 FZD-유도성 유전자를 유도화시킬 것이다. "하류 Wnt/FZD 조절 유전자 산물"은 Wnt/FZD 신호 전달 경로에 의한 신호 전달의 결과로서 조절되는(예를 들어, 상향 조절 또는 하향 조절) RNA 또는 단백질이다.
본 발명은 임의의 FZD 및 Wnt 핵산의 용도를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 FZD7 및 8 핵산 예를 들어, 도 8a∼도 8e에 제시한 대표적인 인간 및 마우스 FZD7(각각 서열 번호 1 및 3)과 FZD8(각각 서열 번호 4 및 6) 수용체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 용도를 포함한다. 다른 예로서, 본 발명은 임의의 Wnt3, 8b 및 11 핵산 예를 들어, 도 8a∼도 8e에 제시된 대표적인 인간 및 마우스 Wnt3(각각 서열 번호 7 및 13), 8b(각각 서열 번호 14 및 20), 그리고 11(각각 서열 번호 21 및 27) 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 FZD 및 Wnt 핵산 중 임의의 단편 예를 들어, 서열 번호 1, 3, 4, 6, 7, 13, 14, 20, 21 또는 27을 암호화하는 핵산 서열 단편의 용도도 포함한다. FZD 또는 Wnt 핵산의 단편은 각각 하나 이상의 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, 인간 또는 설치류 폴리펩티드)의 유용한 단편 예를 들어, 결합 도메인(예를 들어, CRD 도메인) 또는 기타 유용한 단편을 암호화한다. 예를 들어, FZD 행산의 유용한 단편은 결합 활성을 보유하는 FZD 수용체 단편 예를 들어, 서열 번호 3 또는 5에 해당하는 단편을 암호화할 수 있다. 다른 예로서, Wnt 핵산의 유용한 단편은 결합 활성을 보유하는 Wnt 폴리펩티드 단편 예를 들어, 서열 번호 8∼12, 15∼19 및 22∼26 중 임의의 것 하나 이상에 해당하는 단편을 암호화할 수 있다.
본원에 개시된 FZD 및 Wnt 핵산은 게놈 DNA 및 합성(예를 들어, 화학 합성된) DNA를 포함하여, RNA 및 DNA를 둘 다 포함한다. 핵산은 이중 사슬 또는 단일 사슬일 수 있다. 단일 사슬일 경우, 핵산은 센스 사슬 또는 안티센스 사슬일 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 유도체(예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 이용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 염기쌍 형성 능력이 변형되었거나 또는 뉴클레아제에 대한 내성이 증가된 핵산을 제조하는데에 사용될 수 있다.
"분리된 핵산"이란, 핵산 즉, 임의의 천연 생성 핵산의 구조와 동일하지 않거나 또는 3개 이상의 개별 유전자로 이루어진 임의의 경막 핵산의 구조와 동일하지 않은 구조를 갖는 핵산이다. 그러므로, 상기 용어는 예를 들어, (a) 천연 생성 게놈 DNA 분자의 일부 서열을 보유하되, 천연 생성되는 유기체의 게놈 중 분자의 일부에 측접하는 암호화 서열 둘 다에 의해 측접되지는 않는 DNA; (b) 원핵 생물 또는 진핵 생물의 벡터 또는 게놈 DNA에, 임의의 천연 생성 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않은 분자가 형성되도록 통합된 핵산; (c) 별도의 분자 예를 들어, cDNA, 게놈 단편, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 합성된 단편, 또는 제한 단편; 및 (d) 혼성 유전자 즉, 융합 단백질을 암호화하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 의미이다. 특히 (i) DNA 분자; (ii) 형질 감염된 세포; 및 (iii) 세포 클론 예를 들어, DNA 라이브러리 예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 생산되는 세포 클론의 혼합물에 존재하는 핵산은 상기 정의에서 배제된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 FZD 또는 Wnt 핵산과 실질적으로 상동성인 핵산 서열의 용도를 포함한다. FZD 또는 Wnt 핵산에 "실질적으로 상동성인" 핵산 서열은 서열 번호 1∼27 중 임의의 하나를 암호화하는 FZD 또는 Wnt 핵산 서열에 75% 이상 상동성이다. 예를 들어, 실질적으로 상동성인 핵산 서열은 서열 번호 1∼27을 암호화하는 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 이상 상동성일 수 있다. 핵산의 비교를 위하여, 참고 핵산 서열의 길이는 50 뉴클레오티드 이상일 것이지만, 그보다 더 길 수 있는데 예를 들어, 60 뉴클레오티드 이상 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 사용된, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 "상동성 %"는, 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci USA 87:2264-2268]에 기술된 알고리즘 즉, 문헌[Karlin and Altschul(1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에 기술된 알고리즘과 같이 변형된 알고리즘을 이용하여 측정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul외 다수(1990); J. Mol. Biol. 215:403-410]에 개시된 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 검색법은 NBLAST 프로그램[스코어 = 100, 문자 길이 = 12]으로 실행되며, 그 결과 본 발명에 사용된 FZD 또는 Wnt 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 얻어진다. BLAST 단백질 검색법은 XBLAST 프로그램[스코어 = 50, 문자 길이 = 3]으로 실행되며, 그 결과 참고 폴리펩티드에 상동성인 아미노산 서열이 얻어진다. 갭이 형성된 비교용 정렬을 얻기 위해서는, 문헌[Altschul외 다수, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이, 갭이 형성된 BLAST를 이용한다. BLAST 및 갭이 형성된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개 변수가 사용된다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하시오.
본 발명은 또한 엄중 혼성화 조건(본원에 정의됨) 하에서, 서열 번호 1∼27 중 임의의 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 모두 또는 일부에 혼성화하거나, 또는 이러한 핵산 서열의 상보 서열에 혼성화하는 핵산의 용도를 포함한다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분의 길이는 통상적으로 15 뉴클레오티드 이상(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50 뉴클레오티드)이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 일부 또는 전부, 또는 이의 상보 서열과 약 75% 이상(예를 들어, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상) 상동성이다. 본원에 기술된 유형의 혼성화 핵산은 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머(예를 들어, PCR 프라이머) 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 것은 통상적으로 엄중 조건 하에서 실행된다. 핵산 이중체 또는 혼성체의 안정성은 용융 온도 즉, Tm으로서 표시되는데, 이 온도는 프로브가 표적 DNA로부터 해리되는 온도이다. 이러한 용융 온도는 필요한 엄중도 조건을 정의하는데에 사용된다. 만일 서열이 프로브와 관련되어 있고, 완전히 동일하다기보다는 실질적으로 동일한 것으로 판명되면, 우선 최저 온도 즉, 특정 농도의 염(예를 들어, SSC 또는 SSPE)과의 상동성 혼성화만이 발생하는 온도를 확립하는 것이 유용하다.
이후, Tm 온도가 1℃ 내려갈 때마다 1%씩 미스 매치가 일어난다고 가정하면, 혼성화 반응에서의 최종 세척 온도도 이에 따라 하강한다[예를 들어, 프로브와의 상동성이 > 95%인 서열이 발견되면, 최종 세척 온도는 5℃까지 하강함]. 실제로, Tm의 변화폭은 미스 매치가 1% 일어날 때마다 0.5∼1.5℃일 수 있다. 엄중 조건은, 5×SSC/5×덴하르트 용액/1.0% SDS 중 68℃에서의 혼성화와, 0.2×SSC/0.1% SDS 중 실온에서의 세척을 포함한다. 경도의 엄중 조건은 42℃의 3×SSC에서의 세척을 포함한다. 염 농도와 온도의 매개 변수는 다양하여, 프로브와 표적 핵산 사이의 상동성의 최적 수준을 이룰 수 있다. 이러한 조건에 대한 부가적 지침은 당 업계에서 용이하게 파악할 수 있는데 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel외 다수(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.), Unit 2.10]에 기술되어 있다.
서열 번호 1∼27 중 임의의 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산은 "안티센스 올리고뉴클레오티드"로 간주한다.
본원에 기술된 FZD 및/또는 Wnt 핵산이 전사 및/또는 번역 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있어서, 이 FZD 및/또는 Wnt 핵산을 발현시킬 수 있는 유전자 구조물(예를 들어, 벡터 및 플라스미드) 예를 들어, 발현 벡터도 본 발명에 포함된다. 선별된 핵산 예를 들어, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자는, 다른 분자가 선별된 핵산을 전사 및/또는 번역시킬 수 있도록 위치할 때, 다른 핵산 분자 예를 들어, 프로모터에 "작동 가능하도록 결합"되어 있는 것이다. 예를 들어, 선별된 핵산은 다른 핵산 분자에 인접하여 위치할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 FZD 및/또는 Wnt 핵산을 함유하는 다양한 조작 세포를 포함하기도 한다. 예를 들어, 본 발명은 형질 전환된 숙주 세포 즉, 재조합 DNA 기술에 의하여 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 도입된 세포(또는 이것이 도입된 조상 세포)를 포함한다. 원핵 세포와 진핵 세포 의 예로서는, 포유 동물 세포(예를 들어, 간 세포), 진균 및 박테리아(예를 들어, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)) 등이 있다. 본 발명에 포함된 유형의 대표적인 조작 세포로서는 FZD7 트랜스 유전자를 과다 발현하는 간 세포이다.
"FZD를 과다 발현하는" 세포는, 특정 FZD 단백질 예를 들어, FZD7 및/또는 FZD8의 발현 수준 즉, 각각 동일한 조직 유형으로부터 유래된 비-암 세포 또는 비-트랜스게닉 세포 내에서의 발현 수준이 약 1.5 배 이상 예를 들어, 약 2, 3, 4 또는 5 배 이상인 암 세포 및/또는 트랜스게닉 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포 내 FZD 발현은 상이한 조직-유형의 비-암 세포 또는 비-트랜스게닉 세포에서의 발현, 또는 상이한 조직 유형의 비-암 세포 또는 비-트랜스게닉 세포의 패널에서의 발현과 비교될 수 있다. 뿐만 아니라, FZD 단백질 중 하나의 유형(예를 들어, FZD7)의 발현 수준은 동일한 세포 내 다른 FZD 단백질의 발현 수준과 비교될 수 있다. 특정 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법으로서는 RT-PCR, 실시간 PCR 및 유전자 산물에 대한 항체를 사용하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
임의의 FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 용도도 본 발명에 포함된다. 본 발명에 사용되는 FZD 폴리펩티드의 예로서는 인간 및 마우스 FZD 폴리펩티드 예를 들어, 각각 서열 번호 1 및 3의 폴리펩티드, 및 각각 서열 번호 4 및 6의 폴리펩티드가 있다. 본 발명에 사용되는 Wnt 폴리펩티드의 예로서는 인간 및 마우스 Wnt3, 8b 및 11 폴리펩티드 예를 들어, 서열 번호 7, 13, 14, 20, 21 및 27의 폴리펩티드가 있다. FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 임의의 단편 예를 들어, 서열 번호 1, 3, 4, 6, 7, 13, 14, 20, 21 및 27의 단편도 본 발명에 사용된다. FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 단편은 전장 FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 하나 이상의 결합 도메인 또는 기타 유용한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 유용한 단편으로서는 결합 활성을 보유하는 단편(예를 들어, 서열 번호 2, 5, 8∼12, 15∼19 및 22∼26)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 모두 길이나 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화) 여부에 상관없이 임의의 아미노산 사슬을 의미하는 것이다. 그러므로, "프리즐드 단백질", "Wnt 단백질", "프리즐드 폴리펩티드" 및 "Wnt 폴리펩티드"라는 용어는 전장의 천연 생성되는 분리 단백질뿐만 아니라, 재조합 또는 합성 생산된 폴리펩티드로서, 천연 생성되는 전장 단백질, 또는 천연 생성되거나 또는 합성된 전장 폴리펩티드의 단편에 해당하는 폴리펩티드를 포함한다.
전술한 바와 같이, "프리즐드 폴리펩티드" 및 "Wnt 폴리펩티드"란 용어는, 각각 천연 생성되거나 또는 합성되는 FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다. 단백질 단편은 당 업자에게 공지된 다양한 방법들 중 임의의 방법 예를 들어, 단백 분해에 의하거나 또는 화학 합성에 의한 재조합 방법에 의하여 생산될 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 (말단 단편에 대하여) 한쪽 말단, 또는 (내부 단편에 대하여) 양쪽 말단으로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 생산될 수 있다. 이러한 돌연 변이된 DNA의 발현은 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있다. "말단-잠식(end-nibbling)" 엔도뉴클레아제로 분해하면, 단편 어레이를 암호화하는 DNA를 생산할 수 있다. 단백질 단편을 암호화하는 DNA는 또한 올리고뉴클레오티드의 랜덤 전단법(random shearing), 제한 분해법, 화학 합성법과, 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 DNA의 증폭법 또는 상기 방법들을 조합 사용하여 생산될 수도 있다. 단편은 또한 당 업계에 공지된 기술 예를 들어, 통상의 메리필드 고상 FMOC 또는 t-Boc 화학적 방법을 이용하여 화학 합성될 수 있다.
정제 또는 분리된 화합물은 목적 화합물 예를 들어, FZD 폴리펩티드, Wnt 폴리펩티드 또는 항체를 60 중량% 이상 포함하는 조성물이다. 예를 들어, 제조물은 목적 화합물을 75 중량% 이상(예를 들어, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상 또는 99 중량% 이상) 포함할 수 있다. 순도는 당 업계에 공지된 임의의 적당한 방법 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 또는 HPLC 분석법에 의하여 측정될 수 있다.
임의의 구체예에서, FZD 및 Wnt 폴리펩티드는 천연 생성되는 FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동성인 서열을 포함한다. 본원에 개시된 FZD 및 Wnt 폴리펩티드 서열에 "실질적으로 상동성인" 폴리펩티드는 서열 번호 1∼27에 의해 나타내어지는 아미노산 서열에 65% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 예를 들어, 100%) 상동성(본원에 기술된 바에 따라서 측정)인 아미노산 서열을 보유한다. 비교의 목적으로, 참고 FZD 및 Wnt 폴리펩티드 서열의 길이는 16 아미노산 이상 예를 들어, 20 또는 25 아미노산 이상일 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"이란, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 경우를 의미한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기 군은 당 업계에 정의되어 있다. 상기 군은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
본 발명은 또한 FZD(예를 들어, FZD7 및/또는 FZD8) 폴리펩티드 또는 Wnt(예를 들어, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11) 폴리펩티드의 일부가 이와 관련이 없는 폴리펩티드(예를 들어, 마커 폴리펩티드 또는 융합 파트너)에 융합되어 융합 단백질을 생성하는, 융합 단백질(및 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)의 용도를 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 헥사-히스티딘 태그 또는 FLAG 태그에 융합하여 박테리아에서 발현되는 폴리펩티드의 정제를 촉진하거나, 또는 헤마토글루티닌 태그 또는 FLAG 태그에 융합하여 진핵 세포 내에서 발현되는 폴리펩티드의 정제를 촉진할 수 있다. 본 발명은 또한 예를 들어, 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 분리된 폴리펩티드(및 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)의 용도를 포함하기도 하며, 여기서 상기 제1 부분은 예를 들어, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드를 포함하고, 제2 부분은 관련이 없는 폴리펩티드 예를 들어, 면역 글로불린 불변부(Fc) 또는 검출 가능한 마커를 포함한다.
상기 융합 파트너는 예를 들어, 분비를 촉진하는 폴리펩티드 예를 들어, 분비 서열일 수 있다. 이와 같이 융합된 폴리펩티드를 통상적으로 전 단백질(preprotein)이라 칭한다. 분비 서열은 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 단백질을 형성할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리펩티드 서열에 융합된 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드를 암호화하여 불활성의 전 단백질을 생산하는 핵산을 포함한다. 전 단백질은 불활성화 서열을 절단함으로써 단백질의 활성형으로 전환될 수 있다.
II . 암을 검출하는 방법
어떠한 이론에도 국한되지 않았을 경우, 다수의 FZD 단백질 예를 들어, FZD7 및 FZD8, 그리고 FZD 리간드 예를 들어, Wnt3 및 11은 암 예를 들어, 간암에 있어서 매우 중요하다. 특히, 간 세포는 변형 과정 중의 초기 예를 들어, HCC가 진행되기 이전에 FZD7 및 Wnt3을 과다 발현하는 것으로 파악된다. 이와 유사하게, 이러한 세포들은 종종 FZD8 및/또는 Wnt11을 적게 발현한다. Wnt3, 8b 및 11은 FZD7 리간드인 것으로 생각된다.
그러므로, 본 발명은 암 세포를 검출하는 방법 즉, 환자에서 암의 존재 및 심각성(예를 들어, 종양 기수(tumor grade) 및 종양 적하(tumor burden) 등)의 진단을 촉진하는 방법, 환자 예후의 측정을 촉진하는 방법 및 치료법에 대한 환자의 반응성을 평가하는 방법(예를 들어, 화학 요법 실행중 또는 실행 이후에 종양 적하를 평가함으로써 치료 효과를 측정하는 방법)을 제공한다.
검출은, (예를 들어, 비-암 세포와 비교하였을 때) 암 세포 내에서 차등적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 폴리뉴클레오티드)의 검출 및/또는 암 세포 내에서 차등적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 폴리펩티드)의 검출을 바탕으로 할 수 있다. 본 발명의 검출 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서, 생물학적 시료 예를 들어, 분리된 세포 및/또는 전체 조직에 대하여 실행될 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적 시료"란, 핵산 또는 폴리펩티드 예를 들어, FZD7 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 전사체를 함유하는 생물학적 조직 또는 유체 시료를 의미한다. 이러한 시료로서는 간, 폐, 림프절, 결장, 위, 췌장, 담관, 소장 및/또는 식도로부터 얻어진 조직을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 시료로서는 또한 조직 검편 예를 들어, 생검 및 부검 시료, 해부학적 용도로 취한 냉동 검편, 혈액, 혈장, 혈청, 가래, 대변, 눈물, 점액, 담즙, 타액, 림프, 모발, 피부 등을 포함할 수도 있다. 생물학적 시료는 또한 환자의 조직으로부터 유래된 외식 편과, 1차 및/또는 변형 세포 배양액을 포함하기도 한다. 생물학적 시료는 통상적으로 진핵 유기체 예를 들어, 영장류 예를 들어, 침팬지 또는 사람; 소; 말; 염소; 양; 개; 고양이; 설치류 예를 들어, 기니아 피그, 래트 또는 마우스; 토끼; 새; 파충류; 또는 어류로부터 얻어진다. 일반적으로 시료는 동물로부터 세포 시료를 분리함으로써 제공되지만, 미리 분리된 세포(예를 들어, 다른 시간에 다른 사람으로부터 분리된 세포 및/또는 여러 가지 목적으로 분리된 세포)를 제공하거나, 또는 생체 내에서 본 발명의 방법을 수행함으로써 제공될 수도 있다. 일정한 처리가 행하여졌거나 또는 아주 오래 보관해 두었던 조직을 사용할 수도 있다.
몇몇 구체예에서, 암 세포 내에서 차등 발현되는 전사체(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 전사체)가 세포 내에서 발현되는 것을 검출함으로써 암 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 다수의 공지된 방법들 중 임의의 방법이 예를 들어, mRNA를 적당한 혼성화 프로브와 혼성화시켜 전사체를 검출하는 방법; 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응에 의해 전사체를 검출하는 방법; 및 적당한 혼성화 프로브를 사용하여 시험관 내 혼성화시키는 방법을 포함하는 검출 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법은 암 세포 내에서 차등 발현되는 유전자의 mRNA 수준을 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 a) 혼성화가 가능한 조건 하에서 본원에 기술된 바와 같이 차등 발현된 유전자에 해당하는 폴리뉴클레오티드와 시료를 접촉시키는 단계; 및 b) 혼성화되었을 경우, 혼성화된 물질을 검출하는 단계를 포함한다.
적당한 대조군과 비교하였을 때, 차등 혼성화 여부의 검출 결과는, 암 세포 내에서 차등적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드 시료가 존재함을 나타내는 지표가 된다. 예를 들어, 적당한 대조구는 암 세포가 아닌 시료, 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 것으로 공지된 시료를 포함하며, 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드와 동일한 "센스" 서열의 표지화된 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 혼성화가 가능한 조건에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 상기에 보다 상세히 기술하였다. 검출은 또한 임의의 공지된 방법 예를 들어, 시험관 내 혼성화, PCR(중합 효소 연쇄 반응) 및/또는 RT-PCR(역전사-PCR)에 의하거나 또는 공지된 기술을 조합 사용함으로써 수행될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다수의 표지 및 표지화 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이 방법은 본 발명의 검정 방법에 사용될 수 있다. 혼성화 특이성은 적당한 대조구와 비교함으로써 측정될 수 있다.
일반적으로 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 연속적 뉴클레오티드를 10 nt 이상, 12 nt 이상 또는 15 nt 이상 포함하는 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 본원에 기술된 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 다양한 용도 예를 들어, 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드의 전사 수준을 측정 및/또는 검출하기 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 당 업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 프로브는 검출 가능하도록 표지화되어 예를 들어, 시험 시료(예를 들어, mRNA)로부터 얻어진 고정화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 프로브는 어레이 및 검출 가능하도록 표지화된 시험 시료 상에 고정될 수 있다. 상기의 것들을 사용하는 것과 본 발명의 방법에 관한 기타 변법들에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있으며, 본 발명의 범위에 속한다.
뉴클레오티드 프로브는 제공된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자의 발현을 검출하는데에 사용될 수 있다. 노던 블럿에서, mRNA는 전기 영동에 의해 분리되어 프로브와 접촉하게 된다. 프로브는 특정한 크기의 mRNA 종과 혼성화될 때 검출된다. 혼성화 양은 발현의 상대적 양을 측정하도록 정량화될 수 있다. 프로브는 발현을 검출할 세포에 대한 인 시츄(in situ) 혼성화용으로 사용될 수 있다. 프로브는 또한 혼성화 서열의 생체 내 진단 검출용으로도 사용될 수 있다. 프로브는 방사성 동위 원소 또는 기타 유형의 검출 가능한 표지 예를 들어, 발색단, 형광단 및/또는 효소로 표지화될 수 있다. 뉴클레오티드 혼성화 검정법의 기타 예로서는 WO 92/02526 및 미국 특허 제5,124,246호에 기술되어 있다.
PCR은 소량의 표적 핵산을 검출하기 위한 또 다른 수단이다[예를 들어, Mullis외 다수, Meth. Enzymol. (1987) 155:335; 미국 특허 제4,683,195호; 및 동 제4,683,202호 참조]. 표적 핵산과 혼성화되는 2개의 프라이머 올리고뉴클레오티드는 반응을 프라이밍하기 위해 사용될 수 있다. 프라이머는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 내에 포함되어 있거나, 또는 이 폴리펩티드에 대해 3'→5' 방향으로 포함되어 있는 서열로 이루어질 수 있다. 표준적 PCR법에 의하여 표적을 증폭시킨 이후에, 증폭된 표적 핵산은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 서던 블럿으로 검출될 수 있다. mRNA 또는 cDNA는 또한 문헌[Sambrook외 다수, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)(예를 들어, PCR 증폭 과정 불포함)]에 개시된 바와 같이 통상의 블럿팅 기술(예를 들어, 서던 블럿, 노던 블럿 등)에 의해 검출될 수도 있다. 일반적으로, 중합 효소를 사용하여 mRNA로부터 생산된 cDNA 또는 mRNA는 겔 전기 영동에 의해 정제 및 분리되어, 고형 지지체 예를 들어, 니트로셀룰로즈에 옮겨질 수 있다. 이러한 고형 지지체는 표지화된 프로브에 노출된 후 세척되며, 혼성화되지 않은 임의의 프로브는 제거될 수 있다. 이후 표지화된 프로브를 함유하는 이중체를 검출할 수 있다.
PCR 증폭법을 이용한 방법은 하나 이상의 세포로부터 유래된 DNA 상에서 수행될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응을 사용하는 것에 관하여는 문헌[Saiki외 다수 (1985) Science 239:487]에 기술되어 있으며, 그 기술에 관한 연구는 문헌[Sambrook외 다수, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; pp.14.2-14.33)]에서 살펴볼 수 있다. 검출 가능한 표지는 증폭 반응에 포함될 수 있다. 검출 가능한 적당한 표지로서는 형광 색소(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 6-카복시플루오레세인(6-FAM), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시플루오레세인, 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시- 2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인(HEX), 5-카복시플루오레세인(5-FAM) 또는 N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA)), 방사성 표지(예를 들어, 32P, 35S, 3H 등) 등을 포함한다. 표지는 2단계 시스템(two stage system)일 수 있는데 즉, 폴리뉴클레오티드는 고 친화성 결합 파트너 예를 들어, 아비딘, 특이 항체 등과 결합되어 있는 바이오틴, 햅텐 등에 컨쥬게이트화되어 있고, 상기 결합 파트너는 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트화되어 있다. 상기 표지는 프라이머 중 하나 또는 둘 다에 컨쥬게이트화될 수 있다. 대안적으로, 증폭 과정에 사용되는 뉴클레오티드 풀은 표지화되어, 표지를 증폭 생산물에 통합시키게 된다.
하나의 구체예에서, 발현 수준은 실시간 PCR에 의해 평가된다. RNA는 목적 시료로부터 분리된다. PCR 프라이머는 목적으로 하는 특정 유전자를 증폭시키도록 디자인된다. PCR 산물의 축적 여부는 이중-표지화된 형광 발색 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 측정된다. 상기 프로브는 2개의 상이한 형광 염료 즉, 5' 말단 리포터 염료 및 3' 말단 급랭 염료(quenching dye)로 표지화된다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 PCR 앰플리콘에 존재하는 내부 표적 서열에 상동성인 것으로 선택된다. 이 프로브가 원래 상태의 것일 때, 2개의 형광단 사이에서는 에너지 이동이 일어나며, 형광 발광 현상은 중단된다. PCR의 증폭 과정시, 프로브는 Taq 중합 효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단된다. 그러므로, 리포터는 더 이상 급랭 물질에 급접하여 존재하지 않게 되며, 이 때, 발광 강도가 증가함을 살펴볼 수 있다. 실시간 PCR을 이용하여 FZD 발현 여부를 검출하는 대표적인 방법은 이하 실시예 부분에 제공되어 있다. 프라이머는 또한 다른 방법 예를 들어, RT-PCR에서 사용될 수도 있다. 이러한 검정법은 핵산의 정량적 측정 수단을 제공한다.
다른 구체예에서는, 세포에 의해 차등 발현되는 단백질(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 단백질)의 발현을 검출함으로써 암 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법 예를 들어, 결합 화합물 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(ELISA 및/또는 웨스턴 블럿 방법에서 유용한 단편)을 사용하는 방법이 검출 방법으로서 사용될 수 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 또한 검출 가능한 마커(예를 들어, 형광단, 발색단 또는 동위 원소 등)로 표지화될 수 있다. 적당한 경우, 이 화합물은 고형 지지체 예를 들어, 비드, 평판, 필터, 수지 등에 부착될 수 있다. 화합물/표적 복합체가 형성되었는지 여부를 검출하는 방법은, 이 복합체를 추가의 화합물(예를 들어, 2차 항체) 즉, 제1 화합물(또는 복합체)에 특이적으로 결합하는 화합물과 접촉시킴으로써 실행될 수 있다. 제1 화합물과 마찬가지로, 추가의 화합물은 고형 지지체에 부착될 수 있으며/있거나, 검출 가능한 마커로 표지화될 수 있다.
본원에 기술된 검출 방법을 수행하기 위하여 필요한 물질은 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 추가로, 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드 및/또는 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 생물 시료 중에 존재하는지 여부 및/또는 그 수준을 검출(예를 들어, 차등 발현되는 목적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA를 검출함으로써 검출)하는 검출용 키트도 제공한다. 이 키트를 이용하는 방법은 임상 실험실, 실험용 실험실, 의료 실무자 또는 개인에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 키트 즉, 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트는 이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 부분 예를 들어, 항체를 포함할 수 있다. 암 세포 내에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오티드를 검출하는데에 사용되는 본 발명의 키트는 이러한 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되는 부분을 포함할 수 있다. 이 키트는 또한 검출 방법에 유용한 부가의 성분 예를 들어, 완충액, 현상 시약, 표지, 반응 표면, 검출 수단, 대조구 시료, 표준, 지침 및 해석 정보를 제공할 수도 있다.
본 발명은 또한 포유 동물(예를 들어, 사람)에서 신생물 또는 종양전 병상을 검출/진단하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본원에 있어서 "진단"이란 용어는 일반적으로, 환자의 질병 또는 질환에 대한 민감도를 측정하는 것, 개체에 현재 질병 또는 질환이 발병하였는지 여부를 측정하는 것, 질병 또는 질환이 발병한 개체의 예후를 관찰하는 것(예를 들어, 전이 전 또는 전이성 암 상태, 암의 기수 또는 치료법에 대한 암의 반응성을 관찰하는 것), 그리고 감별 진단(예를 들어, 개체의 병상을 관찰함으로써 치료법의 효과 또는 효능에 대한 정보를 제공하는 것)을 포함한다.
하나의 대표적인 검출/진단 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 포유 동물(예를 들어, 사람)으로부터 생물학적 시료(예를 들어, 간 조직)를 얻는 단계; (b) 시료 중 FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 유전자 산물(예를 들어, 단백질 또는 mRNA)의 존부를 검출하는 단계; 및 (c) FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 유전자 산물의 양을 대조구 시료 중의 FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11 유전자 산물의 양과 비교하는 단계를 포함한다. 이 방법에 따르면, 시료 중 FZD7 및/또는 Wnt3 유전자 산물의 수준이 증가하였고/증가하였거나 FZD8 및/또는 Wnt11 유전자 산물의 수준이 감소하였음은 곧, 개체가 암 또는 전암 상태 예를 들어, 간암 또는 간암으로의 발전 위험이 있음을 나타내는 것이다.
본 발명에 따라서 증가한 FZD7 및/또는 Wnt3 단백질 수준 및/또는 감소한 FZD8 및/또는 Wnt11 단백질 수준을 확인하면, 특정 치료법에 의해 혜택을 볼 수 있을 것 같은 환자를 확인할 수 있게 된다. 예를 들어, 1차 치료 수행 이후의 개체(예를 들어, 수술 실시 개체)로부터 얻어진 생물학적 시료는 FZD7 및/또는 Wnt3 단백질의 수준이 상승하였는지 여부 및/또는 FZD8 및/또는 Wnt11 단백질의 수준이 감소하였는지 여부에 대해 스크리닝되며, 이러한 단백질 수준은 종양 조직이 잔류하는지 여부에 대한 지표가 됨을 확인될 수 있다. 이와 유사하게, 수술에 의해 제거된 종양의 절단 부위를 둘러싸고 있는 조직(예를 들어, 종양 주위 조직)은, (주변 조직에 비하여) FZD7 및/또는 Wnt3의 수준이 상승하였는지 여부 또는 FZD8 및/또는 Wnt11의 수준이 감소하였는지 여부에 대하여 관찰될 수 있으며(예를 들어, 면역 광법에 의함), 이러한 관찰 결과는 이 조직에서 병이 진행될 가능성이 있는지 여부 또는 종양이 불완전하게 제거되었는지 여부에 대한 지표가 될 수 있다. 이와 같이 환자를 동정하는 능력은 특정 환자의 요구 조건에 치료법을 맞출 수 있게 해 준다. 수술 이외의 치료법 예를 들어, 화학 요법 또는 방사선 요법을 실행중인 개체도 또한 관찰될 수 있으며, 그러한 개체로부터 얻은 시료 중 FZD7 및/또는 Wnt3의 수준이 증가하였거나 또는 FZD8 및/또는 Wnt11의 수준이 감소하였음은 곧, 계속적인 치료가 필요한지 여부에 대한 지표가 된다. 당 업자는 또한 치료 방법을 최적화하기 위하여 본원에 개시된 방법을 사용하여 암(예를 들어, 간암)의 기수를 판단할 수 있음을 이해할 것이다.
III . 암을 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 방법
본 발명은 시험 화합물이 암 예를 들어, 간암을 치료하는 능력이 있는지 여부에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 "시험 화합물"이란, 본원에 기술된 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있는 임의의 화합물을 말한다. 예를 들어, 시험 화합물은 예를 들어, 소 유기 분자 또는 소 무기 분자(분자량 = 1000 Da 미만)일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 시험 화합물은 폴리펩티드[예를 들어, 랜덤하거나 또는 미리 결정한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 천연 생성 또는 합성 폴리펩티드) 또는 핵산 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 시험 화합물은 천연 생성되는 것(예를 들어, 식물성 또는 천연 생산물)일 수 있거나, 또는 합성되는 것일 수 있으며, 아니면 천연 및 합성 성분 모두를 포함할 수 있다. 시험 화합물의 식량(formular weight)은 약 10,000 g/mole 미만, 5,000 g/mole 미만, 1,000 g/mole, 또는 약 500 g/mole 미만일 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 임의의 유기 또는 무기 화합물(예를 들어, 이종 유기 화합물(heteroorganic compound) 또는 유기 금속 화합물), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리펩티드, 펩티도모의체(예를 들어, 펩토이드), 올리고펩티드(예를 들어, 길이가 약 5∼약 25 아미노산, 바람직하게는 약 10∼20 아미노산, 또는 12∼18 아미노산, 바람직하게는 12, 15 또는 18 아미노산), 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 당류, 지질(예를 들어, 스핑고지질) 및/또는 지방산 또는 상기 물질의 임의의 조합체일 수 있다.
Wnt/FZD 신호 전달(예를 들어, Wnt/FZD7 신호 전달)의 "길항제" 또는 "억제제"란 용어는, 예를 들어, Wnt 단백질(예를 들어, Wnt3, 8 및/또는 11) 및/또는 FZD 수용체(예를 들어, FZD7)에 결합하고/결합하거나, Wnt/FZD 신호 전달에 대하여 공지된 검정법에서 측정되는 바와 같이[예를 들어, β-카테닌 수준, Tcf 및 Lef 전사 인자 또는 기타 하류 Wnt/프리즐드 조절 유전자 산물에 의해 제어되는 발암 유전자의 발현의 측정], 부분적으로 또는 전체적으로 Wnt/FZD 신호 전달(예를 들어, Wnt/FZD7 신호 전달)을 차단 또는 억제하는 화합물을 의미한다. 억제제로서는 예를 들어, Wnt 또는 FZD 단백질에 대하여 유도된 항체(항Wnt3 항체의 일례에 관하여는 ㅇg하 실시예 부분에 기술되어 있음), 변형된 형태의 Wnt 또는 FZD 단백질, 천연 생성 및 합성 리간드, 길항제, 작동제, 항체, 소 화학 분자 등을 포함한다. 억제제 또는 길항제를 검출하는 검정법에 관하여는 이하에 보다 상세히 기술되어 있다.
시험 화합물의 라이브러리
임의의 구체예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 시험 화합물의 라이브러리를 이용한다. "라이브러리"는 하나 이상의 출발 성분을 여러 가지로 조합함으로써 합성되는 화합물(예를 들어, 혼합물의 형태이거나 또는 물리적으로 분리된 개별 화합물)의 집합체이다. 화합물 중 최소한 일부는 라이브러리 내에 존재하는 기타 화합물의 최소한 일부와는 상이하여야 한다. 라이브러리는 예를 들어, 5, 10, 50, 100, 1000 개, 또는 10,000, 50,000 또는 100,000개 이상의 상이한 화합물(즉, 라이브러리 중 일부 화합물은 중복하여 존재할 수 있거나 또는 1개 이상 존재할 수 있지만, 단순히 동일한 화합물의 다수 개의 복사체인 것은 아님)을 포함할 수 있다. 상이한 화합물 각각은 몇몇 수단에 의하여 그 존재가 확인될 수 있는 양만큼 예를 들어, 수용체 또는 적당한 프로브를 이용하여 분리, 분석 및/또는 검출될 수 있는 양만큼 존재할 것이다. 각각의 상이한 화합물의 존재를 확인하는데에 필요한 이 화합물의 실제 양은, 실제 사용된 방법에 따라서 다양할 것이며 또한 분리, 검출 및 분석 기술이 발전함에 따라서도 달라질 수 있다. 화합물이 혼합물 중에 실제 동 몰 량으로 존재할 때, 예를 들어, 각 화합물은 100 pmole에 해당하는 양만큼 검출될 수 있다. 라이브러리는 각 화합물의 라이브러리(예를 들어, 병렬 합성법(parallel synthesis) 또는 풀 및 스플릿 풀(split pool) 방법을 통해 제조된 라이브러리로서, 실질적으로 웰 당 단일 형태의 화합물로서 존재함) 및 각 목적 화합물을 실질적으로 동 몰 량 함유하는 혼합물(즉, 단일 화합물이 거의 존재하지 않는 혼합물)을 포함할 수 있다. 라이브러리 중 어느 하나는 검정법에서 발견되는 활성 화합물을 동정할 수 있게 만든다.
시험 화합물은 개별적으로 또는 병렬 방식으로 스크리닝될 수 있다. 병렬 스크리닝의 예로서는, 화학 물질의 거대 라이브러리에 대한 고 처리량 약물 스크리닝이 있다. 후보 화합물의 이와 같은 라이브러리는 제조 또는 예를 들어, 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 켐브리지 코포레이션(Chembridge Corp.)으로부터 구입할 수 있다. 대안적으로, 이전의 실험 및 실생활을 통한 증거에 의하여, 효능이 강화된 화합물 군 또는 카테고리를 제안할 수 있다. 라이브러리는 이러한 화학 물질 군을 포함하도록 디자인 및 합성될 수 있다.
조합형 라이브러리의 합성 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌[예를 들어, E.M. Gordon et al, J. Med. Chem. (1994) 37:1385-1401 ; DeWitt, S. H.; Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res. (1996) 29:114; Armstrong, R. W.; Combs, A. P.; Tempest, P. A.; Brown, S. D.; Keating, T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:123; Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:132; Gordon, E. M.; Gallop, M. A.; Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29:144; Lowe, G. Chem. Soc. Rev. (1995) 309, Blondelle외 다수 Trends Anal. Chem. (1995) 14:83; Chen외 다수 J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2661; 미국 특허 제5,359,115호, 동 제5,362,899호 및 동 제5,288,514호; PCT 공보 제 WO 92/10092, WO 93/09668, WO 91/07087, WO 93/20242, WO 94/08051]을 참조할 수 있다.
화합물 라이브러리는 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 이 중 몇몇 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, "스플릿-풀(split-pool)" 기법은 다음과 같은 방식 즉, 작용화된 중합체 지지체 비드를 다수의 반응 용기에 넣어 실행될 수 있으며, 여기서 고상 펩티드 합성법에 적당한 다수의 중합체 지지체는 공지되어 있고, 일부는 시판중에 있다[예를 들어, M. Bodansky "Principles of Peptide Synthesis", 제2판, Springer-Verlag, Berlin(1993)참조]. 각각의 비드 분취액에 상이한 활성화 아미노산을 첨가하고, 반응을 진행시켜 다수개의 고정화된 아미노산을 얻는다(각 반응 용기에 하나씩 넣어둠). 이후 유도체화된 비드 분취액을 세척하고, "풀링"하여(즉, 다시 합쳐), 비드 풀을 다시 나누고, 이때 각 분취액은 개별 반응 용기에 넣는다. 이후, 다른 활성화 아미노산을 각 비드 분취액에 가한다. 목적으로 하는 펩티드의 길이가 얻어질 때까지 합성 주기를 반복 수행한다. 각각의 합성 주기에 첨가한 아미노산 잔기를 랜덤하게 선별할 수 있으며; 대안적으로, 아미노산은 선별되어 "편향성(biased)" 라이브러리 예를 들어, 억제제의 임의의 부분이 랜덤하지 않게 선별되어 예를 들어, 항체와 상호 작용할 수 있는 공지의 펩티드 예를 들어, 항-유전자형 항체 항원 결합 위치에 대한 상동성이 있거나 구조 유사성이 공지된 억제제를 제공할 라이브러리를 제공할 수 있다. 다양한 펩티드, 펩티도 모의체 또는 비-특이성 화합물이 이러한 방식으로 용이하게 제조될 수 있음을 이해할 것이다.
"스플릿-풀" 기법은 본 발명의 시험 화합물 라이브러리를 제조하는데에 사용될 수 있는 펩티드 라이브러리 예를 들어, 조정자(modulator) 라이브러리를 생산할 수 있다. 또 다른 예시적 합성법에 있어서, "다양한 라이브러리"는 문헌[Hobbs DeWitt et al(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993)]에 기술된 방법에 의하여 제조된다. 기타 합성 방법 예를 들어, 허튼의 "티백(tea-bag)" 기술[예를 들어, Houghten외 다수, Nature 354:84-86 (1991)]은 또한 본 발명에 따른 화합물의 라이브러리를 합성하는데에 사용될 수 있다.
화합물 라이브러리는 스크리닝되어 라이브러리의 임의의 일원이 목적으로 하는 활성을 보유하는지 여부에 대해 측정될 수 있고, 활성을 보유할 경우, 활성 종을 동정할 수 있다. 조합형 라이브러리의 스크리닝 방법에 관하여는 개시되어 있다[예를 들어, Gordon외 다수, J Med. Chem.(상동) 참조]. 가용성 화합물 라이브러리는 적당한 수용체를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 스크리닝되어 수용체에 대한 리간드를 분리할 수 있고, 이후 통상의 기술(예를 들어, 질량 분광 분석법, NMR 등)에 의해 분리된 리간드를 동정할 수 있다. 고정화된 화합물은 이 화합물을 가용성 수용체와 접촉시킴으로써 스크리닝될 수 있으며, 여기서 상기 가용성 수용체는 바람직하게는 리간드와 결합되어 있음을 나타낼 수 있는 검출 표지(예를 들어, 형광단, 발색 효소, 방사성 동위 원소, 발광 화합물 등)에 컨쥬게이트화된다. 대안적으로, 고정화된 화합물은 선택적으로 방출되고, 막을 통해 확산되어 수용체와 상호 작용할 수 있게 된다. 시험 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 대표적인 검정법에 관하여는 전술되어 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 암 예를 들어, 간암을 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 비록 본 발명의 출원인들은 이와 관련된 생물학적 기작에 관한 어떠한 특정 이론에도 국한되지 않고자 하지만, 이러한 화합물은 특히 (1) Wnt/FZD 신호 전달[예를 들어, FZD7, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11 폴리펩티드에의 결합 및/또는 Wnt/FZD-매개성 전사의 감소(예를 들어, 방지)에 의한 신호 전달] 및/또는 (2) FZD7, FZD8, Wnt3 및/또는 Wnt11의 발현을 조정하는 것으로 생각된다.
본 발명의 임의의 측면에서, 이러한 화합물을 스크리닝하는 방법은, (i) 시험 화합물 그룹 중에서 FZD7, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11 폴리펩티드에 결합하고, FZD7 및 이의 리간드(예를 들어, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11) 사이의 상호 작용을 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)하며/하거나 FZD7, FZD8, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11의 전사 및/또는 번역을 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 화합물을 동정하는 단계; 및 임의로는, (ii) Wnt/FZD 신호 전달을 조정하고, 암 세포 이동성을 감소시키며, 암 세포 내에 β-카테닌이 축적되는 것을 감소시키고/감소시키거나 시험관 내 또는 생체 내에서 암을 치료하는 상기 화합물의 능력에 대하여 추가로 시험하는 단계에 의하여 수행된다. FZD7, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11 폴리펩티드에 결합하는 시험 화합물은, FZD7과 이의 리간드(예를 들어, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11) 사이의 상호 작용을 조정하거나, 또는 FZD7, FZD8, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11의 전사 및/또는 번역을 조정하므로, 본원에서는 "후보 항암제"라 칭한다. 후보 항암제는 또한 추가로 시험된 결과, 이것이 시험관 내 또는 생체 내 Wnt/FZD 신호 전달을 조정할 수 있고, 암 세포의 이동성을 감소시킬 수 있으며, β-카테닌이 암 세포 내에 축적되는 것을 감소시키고/감소시키거나, 암을 치료할 수 있는 것으로 파악되므로, 본원에서는 "항암제"로서 간주된다. 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 후보 항암제는 이것이 항암제인지 여부를 측정하기 위하여 시험될 수 있지만, 반드시 그러해야 하는 것은 아니다. 본 발명의 검정법은 생물학적 시료, 전 세포 제제 및/또는 세포 외 무 세포 시스템 중에서 수행될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 FZD 폴리펩티드 예를 들어, FZD7 폴리펩티드, 및/또는 Wnt 폴리펩티드 예를 들어, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 동정하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 시험 화합물이 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 결합하는지 여부는 기판 예를 들어, 96-웰 폴리스티렌 미세 역가 평판의 웰 표면 상에 시험 화합물(들) 또는 Wnt 또는 FZD 폴리펩티드를 시험관 내에서 가역적 또는 비가역적으로 고정화시킴으로써, 검출될 수 있다. 폴리펩티드 및 기타 소 분자를 고정화시키는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미세 역가 평판은, 용액 중 폴리펩티드(통상적으로, 1∼100 ㎕의 부피 중에 0.05∼1 ㎎/㎖의 농도)를 각 웰에 첨가하고, 이 평판을 실온에서 소정의 시간 예를 들어, 0.1∼36 시간 동안 실온∼37℃에서 항온 처리함으로써, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드로 코팅할 수 있다. 이 평판에 결합하지 않는 폴리펩티드는, 이 평판에 과량의 용액을 넣어 진탕하여 제거될 수 있고, 그 다음 이 평판을 물 또는 완충액으로 (1회 또는 반복적으로) 세척함으로써 제거될 수 있다. 통상적으로 폴리펩티드는 물 또는 완충액 중에 존재한다. 이후, 상기 평판을 완충액으로 세척하여 결합되어 있던 폴리펩티드를 제거한다. 평판 상 유리 단백질-결합 부위를 차단하기 위해서, 평판을 결합된 폴리펩티드와 관련 없는 단백질로 차단할 수 있다. 예를 들어, Tris-HCl 중 농도 2 ㎎/㎖의 소 혈청 알부미네이트(BSA) 300 ㎕를 사용할 수 있다. 적당한 기판으로서는 제한된 가교 화학 물질을 함유하는 기판(예를 들어, 플라스틱 기판 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌 또는 폴리프로필렌 기판(예를 들어, 마이에미 캠브리지에 소재하는 코닝 코스타 코포레이션 제품))을 포함한다. 원한다면, 입자 예를 들어, 비드형 아가로즈 또는 비드형 세파로즈를 기판으로서 사용할 수도 있다. 이후 시험 화합물을 코팅된 평판에 가하여 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드가 결합하도록 만든다(37℃, 0.5∼12 시간). 이후, 평판을 전술한 바와 같이 헹굴 수 있다. 숙련자는 이 방법을 여러 가지로 변형하여 실행할 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 예를 들어, 이 방법은 시험 화합물로 기판을 코팅하는 단계와, 이 기판-결합 화합물에 Wnt 또는 FZD 폴리펩티드를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
FZD 또는 Wnt가 제2 화합물 예를 들어, 전술한 바와 같은 시험 화합물 또는 결합 파트너(예를 들어, FZD7에 대해서는 Wnt3, 8b 및/또는 11; 이하 보다 상세히 설명함)에 결합되었는지 여부는 업계에 공지된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(즉, 항FZD 항체 또는 항Wnt 항체 예를 들어, 이하 실시예 부분에 기술되어 있는 폴리클로날 항Wnt3 항체)는 면역 검정법에서 사용될 수 있다. 원한다면, 상기 항체를 표지화하여(예를 들어, 형광 표지화 또는 방사성 동위 원소로 표지화), 직접 검출할 수 있다[예를 들어, West and McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977 참조]. 대안적으로, 제2 항체(예를 들어, 항FZD 항체 또는 항Wnt 항체의 Fc 부분에 결합하는 표지화된 항체)는 검출용으로 사용될 수 있다. 대안적 검출 방법에 있어서, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드는 (예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광단, 발색단 등으로) 표지화되고, 이 표지는 검출된다. 또 다른 방법에서, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드는 예를 들어, 녹색 형광 단백질(UV 광선 하에서 검출 가능)을 사용하여 광학적으로 검출될 수 있는 단백질과의 융합 단백질로서 생산된다. 대안적 방법에서, 폴리펩티드는 검출 가능한 효소 활성을 보유하는 효소 예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 글루코즈 옥시다제를 보유하는 융합 단백질로서 제조된다. 상기 효소들 모두를 암호화하는 유전자는 당 업자에 의하여 클로닝되어 용이하게 사용할 수 있다. 원한다면, 상기 융합 단백질은 통상의 방법을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로 검출 및 측정될 수 있는 항원 또는 에피토프를 포함할 수 있다. 적당한 항원으로서는 효소(예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제) 및 비-효소 폴리펩티드(예를 들어, 혈청 단백질 예를 들어, BSA 및 글로불린, 그리고 우유 단백질 예를 들어, 카세인)을 포함한다.
FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드(예를 들어, 시험 폴리펩티드)를 동정하는 다양한 방법에 있어서, 단백질/단백질 상호 작용에 대한 통상의 2-혼성체 검정법(two-hybrid assay)이 사용될 수 있다[예를 들어, Chien외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578, 1991; Fields외 다수, 미국 특허 제5,283,173호; Fields and Song, Nature, 340:245, 1989; Le Douarin외 다수, Nucleic Acids Research, 23:876, 1995; Vidal외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10315-10320, 1996; 및 White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10001-10003, 1996]. 일반적으로, 2-혼성체 방법은 전사 인자의 개별 도메인 2개를 재구성하는 단계를 포함한다. 하나의 융합 단백질은 전사 인자(예를 들어, Gal4)의 트랜스 활성 인자(transactivator) 도메인 또는 DNA 결합 도메인 중 어느 하나에 융합된 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 다른 융합 단백질은 시험 폴리펩티드 또는 제1 융합 단백질[전사 인자의 트랜스 활성 인자 도메인 또는 DNA 결합 도메인 중 어느 하나에 융합되어 있음]에 포함된 폴리펩티드의 결합 파트너를 함유한다. 시험 화합물 또는 결합 파트너에 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드가 결합함으로써 전사 인자는 재구성된다. 전사 인자가 재구성되었는지 여부는, 전사 인자의 DNA 결합 도메인에 의하여 결합된 DNA 서열에 작동 가능하도록 결합된 유전자(즉, 리포터 유전자)의 발현 여부를 검출함으로써 확인될 수 있다. 다양한 2-혼성체 방법을 실행하기 위한 키트는 시판되고 있다[예를 들어, 캘리포니아 팔로 알토 소재, Clontech 社].
다른 측면에서, 본 발명은 FZD 및 Wnt 폴리펩티드 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 조정하는 화합물을 동정하기 위하여 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 전사 조절 인자들 간의 단백질-단백질 상호 작용을 조정할 수 있는 화합물을 고 처리량으로 스크리닝하는데 유용한 방법에 관하여는 문헌[Lepourcelet외 다수, Cancer Cell 5: 91-102 (2004); 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 기술되어 있다. 통상적으로 제1 화합물은 제공된다. 제1 화합물로서는 FZD(예를 들어, FZD7) 또는 Wnt(예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편이 있다. 제2 화합물은 제1 화합물과는 상이하게 표지화된다. 제2 화합물은 FZD(예를 들어, FZD7) 또는 Wnt(예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편이 있다. 시험 화합물이 제공된다. 제1 화합물, 제2 화합물 및 시험 화합물은 상호 접촉된다. 이후 제1 화합물에 결합된 표지의 양을 측정한다. 표지의 결합에 의하여 평가되는 바와 같이, 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 단백질-단백질 상호 작용의 변화는, FZD와 Wnt 폴리펩티드 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 조정하는데에 있어서 이 시험 화합물이 유용함을 나타내는 지표이다.
임의의 구체예에서, 제공된 제1 화합물은 고형 지지체 상에 부착된다. 고형 지지체로서는 예를 들어, 수지(예를 들어, 아가로즈 및 비드)와 다중 웰 평판을 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 접촉 단계 이후에 세척 단계를 포함하며, 이로써 결합 및 미결합 표지가 분리된다.
임의의 구체예에서, 다수의 시험 화합물은 제1 화합물 및 제2 화합물과 접촉된다. 상이한 시험 화합물은 다른 화합물과 한꺼번에 또는 개별적으로 접촉될 수 있다. 임의의 구체예에서, 시험 화합물 각각은 각각의 웰 내에서 제1 화합물 및 제2 화합물과 접촉된다. 예를 들어, 본 방법은 시험 화합물 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 시험 화합물의 라이브러리는 이미 상술한 바 있다. 라이브러리는 예를 들어, 천연 생산물, 유기 화학 물질, 펩티드 및/또는 변형된 펩티드 예를 들어, D-아미노산, 통상적이지 않은 아미노산 및 N-치환 아미노산을 포함할 수 있다. 통상적으로, 라이브러리는 다중 웰 평판 내에서 스크리닝하기에 적합한 형태(예를 들어, 96-웰 평판)이다. 다중 웰 방식으로 자동화 실행되는 검정법[이 검정법에 포함되는 다수의 단계들은 컴퓨터로 제어되며, 자동화 장치에 의해 실행됨]이 특히 유용하다. 라이브러리는 또한 다른 방식 예를 들어, 고형 지지체에 고정되어 있는 합성 화학 라이브러리로 사용될 수도 있으며, 이는 또한 미적(microdroplet)으로 용이하게 방출될 수 있다.
임의의 구체예에서, 제1 화합물은 FZD7 폴리펩티드 또는 이의 단편이고, 제2 화합물은 Wnt 폴리펩티드 예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 다른 구체예에서, 제1 화합물은 Wnt 폴리펩티드 예를 들어, Wnt3, 8b 또는 11, 또는 이의 단편이고, 제2 화합물은 FZD7 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 제1 화합물이 결합되어 있는 고형 지지체는 예를 들어, 세파로즈 비드, SPA 비드(발광제를 포함하는 미소구) 또는 다중 웰 평판일 수 있다. SPA 비드는 검정법이 세척 단계를 생략하고 수행될 때 예를 들어, 발광 근접 검정법(scintillant proximity assay)에 사용될 수 있다. 세파로즈 비드는 검정법이 세척 단계를 생략하지 않고 수행될 때에 사용될 수 있다. 제2 화합물은 검출이 가능한 임의의 표지 예를 들어, 방사성 표지, 형광 제제, 바이오틴, 펩티드 태그 또는 효소 단편으로 표지화될 수 있다. 제2 화합물은 또한 예를 들어, 125I 또는 3H를 이용하여 방사성 표지화될 수도 있다.
임의의 구체예에서, 제1 화합물 또는 제2 화합물을 보유하는 융합 단백질로서 발현되거나, 또는 상기 제1 화합물 또는 제2 화합물에 화학적으로 컨쥬게이트화된 효소의 효소 활성은 결합된 단백질을 검출하는데에 사용된다. 표준적인 면역학적 방법을 이용하여 결합 단백질을 검출하는 결합 검정법도 포함된다. 임의의 기타 구체예에서, Wnt 및 FZD 폴리펩티드 또는 이의 단편의 상호 작용은, 공여 발광 스펙트럼과 수용 여기 스펙트럼 사이에 적절한 중첩부가 존재하여, FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 단백질-단백질 상호 작용을 통해 형광단이 근접하여 존재할 때 효율적으로 비 방사성 에너지가 이동하는 경우, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 공유 결합된 공여 형광단[예를 들어, FZD 또는 Wnt에 화학적으로 컨쥬게이트화된 형광 기, 또는 FZD 또는 Wnt-GFP 키메라 단백질로서 발현되는 녹색 형광 단백질(GFP)의 변이체]과 기질 단백질에 공유 결합되어 있는 수용 형광단 사이의 형광 공명 에너지 이동(FRET)에 의해 검출된다.
다른 구체예에서, 단백질-단백질 상호 작용은 효소 예를 들어, 베타-갈락토시다제의 도메인들을 재구성함으로써 검출된다[Rossi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8405-8410 (1997)].
또 다른 구체예에서, 단백질-단백질 상호 작용은 세포 내 FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 적당한 키메라 구조체의 형광도 비율을 이미지화하거나[Bacskai et al, Science 260:222-226 (1993)], 또는 2-혼성체 검정법의 변법[Fearon et al, Proc Natl Acad Sci USA 89:7958-7962 (1992); Takacs et al, Proc Natl Acad Sci USA 90:10375-10379 (1993); Vidal et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:10321-10326 (1996)] 즉, FZD 및 Wnt 폴리펩티드의 적당한 구조체를 사용하는 방법을 실행함으로써 평가되며, 또한 고 처리량 검정법에 맞추어 실시되어, FZD/Wnt 상호 작용을 억제하는 화합물을 검출하게 된다. 이러한 구체예는 시험 화합물의 세포 투과성을 보장한다는 이점이 있다.
예를 들어, 하나의 검정법에서, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드 또는 이의 단편은 ELISA 평판에 흡착된다. 이후, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드는 시험 화합물 → 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)-결합 파트너 융합 단백질 예를 들어, GST-FZD 또는 GST-Wnt 폴리펩티드 융합 단백질에 노출된다. 결합된 단백질은 염소 항GST 항체, 알칼리성 포스파타제(AP)-커플링 항-염소 IgG 및 AP 기질로써 검출된다. 단백질-단백질 상호 작용을 방해하는 화합물은 ELISA 평판에서의 실험에 있어서 AP 시그널을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드의 발현을 조정하는(예를 들어, 증가 또는 감소시키는) 시험 화합물의 동정 방법을 제공한다. 이 방법은 FZD 및/또는 Wnt 핵산과 시험 화합물을 접촉시킨 다음, 암호화된 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드의 발현을 조정하는(예를 들어, 증가 또는 감소시키는) 화합물을 동정하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) FZD 및/또는 Wnt 핵산 서열 또는 이의 단편이나 이의 대립 형질 변이체를 포함하는 제조합 구조체에 통합된 세포주; 또는 (b) 천연의 상태에서 FZD 및/또는 Wnt를 선택적으로 발현하는 세포 군집 또는 세포주 중에 존재하는, 시험 화합물의 존재 하에서 FZD 폴리펩티드의 발현을 측정하거나, 또는 이 시험 화합물을 첨가한 이후 FZD 폴리펩티드의 발현을 측정한 후, FZD 및/또는 Wnt 단백질의 발현 여부를 측정함으로써 실행된다.
본원에 개시된 FZD 및 Wnt 핵산이 동정되면, 이 핵산을 다양한 숙주 세포(예를 들어, 포유 동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 또는 진균)에 클로닝하여, 전체 세포 중에서 이러한 검정법을 수행할 수 있다.
임의의 구체예에서, FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자는 생체 내에서(예를 들어, FZD 및/또는 Wnt-생산 세포 내에서) FZD 및/또는 Wnt의 발현을 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 화합물을 동정하는데에 사용된다. 이러한 구체예에서는, FZD(예를 들어, FZD7 및/또는 FZD8) 및/또는 Wnt(예를 들어, Wnt3, Wnt8b 또는 Wnt11)를 발현하는 세포를 배양하고, 이를 시험 화합물(또는 시험 화합물의 혼합물)에 노출시킨 다음, FZD 및/또는 Wnt 발현 수준을 세포(또는 이전 세포와 동일하되, 시험 화합물(들)에 노출되지 않은 세포) 내에서의 FZD 및/또는 Wnt 발현 수준 또는 활성과 비교한다. 유전자 발현의 표준적인 정량 검정법을 사용할 수 있다.
FZD 및 Wnt의 발현은 업계에 공지된 방법 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자를 프로브로서 사용하는 노던 블럿 PCR 분석법 또는 RNAse 보호 분석법에 의해 측정될 수 있다. 다른 예로서는 효소-결합 면역 흡착 검정법(ELISA), 방사능 면역 검정법(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 포함한다. 시험 분자의 존재하에서의 발현 수준은, 시험 분자 부재시 발현 수준과 비교되었을 때, FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드의 발현을 조정하는 시험 화합물인지 여부에 대한 지표를 제공할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 또는 여러 개의 전사/번역 성분에 발생하는 혼란에 대하여 감수성인 세포계를 이용하여 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
임의의 구체예에서, 본 방법은 FZD 및/또는 Wnt 번역의 정확성을 단계적으로 떨어뜨리는 예를 들어, 번역중 적당한 해독 틀을 유지하고 종결 코돈에서 번역을 종결시키는 후보 화합물을 동정하는 단계를 포함한다. 본 방법은 하나의 해독 틀에 머무르거나 또는 종결 코돈에서 번역을 종결시키는 정상적인 과정이 엉켜진 경우에만 검출 가능한 리포터 폴리펩티드를 생산하는 세포를 구성하는 단계를 포함한다. 이 방법은 이 세포와 시험 화합물을 접촉시켜 리포터 폴리펩티드의 생산이 증가하였는지 또는 감소하였는지 여부를 관찰하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 구체예에서, 세포계는 무 세포 추출물이며, 그 방법은 시험관 내에서 전사 또는 번역을 측정하는 단계를 포함한다. 조건은 세포 추출물에 전사 개질제 또는 번역 개질제를 첨가함으로써 리포터의 전사 또는 번역이 증가 또는 감소하도록 선별된다.
후보 화합물을 동정하는 하나의 방법은 전사-반응성 유전자 산물에 따라 달라진다. 이 방법은, FZD 및/또는 Wnt 핵산의 세포 전사량이 변화하는(즉, 증가 또는 감소하는) 조건 하에서, 리포터 분자의 생산량이 변화하는(즉, 증가 또는 감소하는) 세포를 구성하는 단계를 포함한다. 구체적으로 이 리포터 분자는, FZD 및/또는 Wnt 핵산의 전사량이 변함에 따라서, 리포터 분자의 생산량에 상대적 변화를 유도하도록 구성 및 정렬된 서열에 전사 가능하도록 결합되어 있는 핵산에 의해 암호화된다. 리포터를 암호화하는 유전자 서열은 예를 들어, 전사-반응성 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부, 및/또는 유전자 산물의 생산을 제어하는 유전 요소의 일부 또는 전부에 융합될 수 있다. 대안적으로, 전사-반응성 유전자 산물은 리포터를 암호화하는 유전자의 전사를 직간접적으로 촉진할 수 있다. 이 방법은 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계와, 시험 화합물이 세포 내에서 리포터 분자의 생산을 증가 또는 감소시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
대안적으로, 후보 화합물을 동정하는 방법은 번역-반응성 유전자 산물에 따라 달라질 수 있다. 본 방법은 FZD 및/또는 Wnt 핵산의 세포 내 번역량이 변화된(즉, 증가 또는 감소한) 세포를 구성하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 리포터 분자는, FZD 및/또는 Wnt 핵산의 전사량이 변할 때, 리포터 분자의 생산량을 상대적 으로 증가 또는 감소시키도록 구성 및 정렬된 서열에 번역 가능하도록 결합되어 있는 핵산에 의해 암호화된다. 리포터를 암호화하는 유전자 서열은 예를 들어, 전사-반응성 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부, 및/또는 유전자 산물의 생산을 제어하는 유전 요소의 일부 또는 전부에 융합될 수 있다. 대안적으로, 전사-반응성 유전자 산물은 리포터를 암호화하는 유전자의 전사를 직간접적으로 촉진할 수 있다. 이 방법은 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계와, 시험 화합물이 세포 내에서 리포터 분자의 생산을 증가 또는 감소시키는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법 및 본원에 기술된 임의의 방법에 있어서, 다양한 리포터가 사용될 수 있으며, 이때 통상적인 리포터는 편리하게 검출 가능한(예를 들어, 분광계에 의해 검출) 시그널을 제공한다. 예를 들어, 리포터 유전자는 흡광성을 변경시키는 반응을 촉매 하는 효소를 암호화할 수 있다.
상기 리포터 분자의 예로서는 예를 들어, β-갈락토시다제, 인버타제, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 엑소-글루카나제, 글루코아밀라제 및 방사성 표지화된 리포터를 포함한다. 예를 들어, 리포터 분자의 제조 여부는 리포터 유전자 산물 예를 들어, β-갈락토시다제의 효소 활성에 의해서 측정될 수 있다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 방법은 다수의 시험 화합물의 고 처리량 스크리닝용으로서 수행되어, 후보 항암제를 동정하는데 사용될 수 있다. 고 처리량 스크리닝이란, 다수의 후보 화합물을 비교적 용이하고 신속하게 스크리닝할 수 있는 방법을 의미한다.
시험 화합물이 후보 항암제인 것으로 동정되면, 이 화합물은 당 업계에 공지된 기술을 통해 생체 내 또는 시험관 내에서 추가로 시험 되며, 원한다면 이 화합물이 항암제인지 여부를 확인할 수 있는데 즉, 이 화합물이 Wnt/FZD 신호 전달을 조정할 수 있는지, 암 세포의 이동성을 조정할 수 있는지 및/또는, FZD 및/또는 Wnt의 시험관 내(예를 들어, 분리된 세포 또는 무 세포 시스템 사용) 또는 생체 내(예를 들어, 동물 예를 들어, 설치류 모델 시스템 사용) 발현을 조정할 수 있는지 여부를 확인할 수 있다.
후보 화합물의 시험관 내 시험 방법은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 세포 예를 들어, 야생형 세포, 암 세포 및/또는 트랜스게닉 간 세포를 사용하는 것을 포함하는 검정법에 의해 실행될 수 있다. Wnt/FZD 신호 전달, FZD 및 Wnt 발현과 암 세포 이동성, 그리고 이러한 검정법에 사용될 수 있는 유용한 세포를 관찰하기 위한 대표적인 검정법에 관하여는 이하 실시예 부분에 기술되어 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 후보 화합물의 생체 내 시험 방법은 당 업계에 공지된 수단에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물(들)은 포유 동물 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스) 또는 토끼에 투여될 수 있다. 이러한 동물 모델 시스템은, 환자 예를 들어, 사람인 환자에 있어서 약학 제제의 약학적 효능을 측정하기 위한, 유효한 약학 제제를 시험하는 수단으로서 당 업계에서 인정되고 있다. 생체 내 시험 방법에 특히 유용한 동물로서는 야생형 동물 또는 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드를 과다하게 생산하는 비 야생형 동물(예를 들어, 마우스) 예를 들어, FZD 또는 Wnt 트랜스 유전자(예를 들어, FZD7 또는 Wnt3 트랜스 유전자)를 과다하게 발현하는 동물, 및/또는 FZD8 및/또는 Wnt11 폴리펩티드는 적게 생산하는 비 야생형 동물이 있다. 생체 내 시험 방법에 유용한 기타 동물로서는 간암 세포가 진행하도록 육종된 동물이 있다. 간암이 진행중인 임의의 트랜스게닉 마우스로서 특히 유용한 마우스에 관하여는 이하 실시예 부분에 기술되어 있으며, 이는 본 발명에 포함되는 것이다.
통상의 생체 내 검정법에서, 동물(예를 들어, 야생형 또는 트랜스게닉 마우스)에는 임의의 적당한 투여 경로(예를 들어, 주사)를 통하여 일정 투여량의 후보 화합물이 투여된다. 이후 통상의 방법과 기준은 동물이 목적으로 하는 활성을 나타내는 것인지를 관찰하는데에 사용될 수 있다. 필요하다면, 후보 화합물의 존재 하에서 얻어진 결과는 시험 화합물로 처리되지 않은 대조구 동물에서 얻어진 결과와 비교될 수 있다.
의약 화학
일단 목적 화합물(또는 제제)이 동정 되면, 의약 화학의 표준 원리에 따라서 추가의 시험 실시 라운드에 사용될 화합물의 유도체를 생산할 수 있다. 유도체는 약리학적 특성 예를 들어, 효능, 약학 동력학, 안정성, 가용성 및 소멸률이 개선되었는지에 대해 스크리닝될 수 있다. 상기 기술된 검정법에서 화합물의 활성에 관여하는 부분은, 당 업계에서 통상적으로 수행되고 있는 구조-활성 관계(SAR)를 관찰함으로써 증명될 수 있다. 약품 화학 분야의 당 업자는 후보 화합물 또는 제제 상에 존재하는 부분을 변형시켜, 이러한 변형이 이 화합물 또는 제제의 효능에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하고, 이로써 효능이 증가된 유도체를 생산할 수 있었다. 예를 들어, 문헌[Nagarajan외 다수 (1988) J. Antibiot. 41:1430-8]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 만일 화합물(또는 제제)의 생화학적 표적이 공지되거나 또는 결정되면, 표적 및 화합물의 구조는 유도체의 디자인과 최적화 방법을 알려줄 수 있다. 이와 같은 목적을 갖는 분자 수준의 모델링 소프트웨어는 시판되고 있다[예를 들어, Molecular Simulations, Inc.].
IV . 항체
본 발명은 예를 들어, FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 정제 또는 분리된 항체 즉, 항-FZD 및 항-Wnt 항체를 특징으로 한다. 항체가 항원에 결합하되, 시료 중 다른 분자를 보다 낮은 정도로 인지하고 이에 결합할 때(예를 들어, 거의 인지하지 않고 또한 결합하지 않을 때), 그 항체는 특정 항원 예를 들어, FZD7 및/또는 FZD8 폴리펩티드에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 이용하여 생산된 분자를 포함한다.
본 발명에 포함되는 임의의 유형의 항체로서는 예를 들어, 이하 실시예 부분에 기술되어 있는 폴리클로날 항Wnt3 항체가 있다. 폴리클로날 항체를 생산하는 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된, "항체"란 용어는 하나 이상 예를 들어, 2개의 중쇄(H) 가변부(본원에서는 VH라 약칭함)와, 하나 이상 예를 들어, 2개의 경쇄(L) 가변부(본원에서는 VL이라 약칭함)를 포함하는 단백질을 의미한다. 상기 VH 및 VL 부위는 또한 초 가변성 부위 즉, "상보성 결정 부위(CDR)", 보다 보존적인 부위를 보유하면서 산재되어 있는 부위 즉, "구조틀 부위(framework region; FR)"로 세분화될 수도 있다. 상기 구조틀 부위와 CDR의 범위는 이미 정의되어 있다[Kabat, E.A.,외 다수 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 및 Chothia, C.외 다수 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]. 상기 VH 및 VL은 각각 3개의 CDR와 4개의 FR로 이루어져 있는데, 이들은 아미노 말단 → 카복시 말단의 방향으로 다음과 같은 순서에 따라서 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항-FZD 또는 항-Wnt 항체는 또한 중쇄 및 경쇄 불변부를 추가로 포함하여, 각각 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 사슬을 형성할 수도 있다. 항체는 2개의 중쇄 면역 글로불린 사슬과 2개의 경쇄 면역 글로불린 사슬로 이루어진 사량체일 수 있으며, 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 사슬들은 예를 들어, 이황화 결합에 의해 상호 연결되어 있다. 상기 중쇄 불변부는 3개의 도메인 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 상기 경쇄 불변부는 하나의 도메인 즉, CL로 이루어져 있다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변부는 항원과 상호 작용을 하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 통상적으로 항체가 숙주 조직 또는 인자 예를 들어, 다양한 면역계 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 통상의 보체 시스템의 제1 성분(C1q)에 결합하는 것을 매개한다.
항체의 "FZD 결합 단편" 및 "Wnt 결합 단편"이란, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 각각 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 단편, 또는 이의 일부를 의미한다. 항체의 폴리펩티드 결합 단편의 예로서는 (i) Fab 단편 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 즉, 힌지 부에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 비록 Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 암호화되지만, 이 도메인은 재조합 방법을 이용하여, 이 도메인들이 단일 단백질 사슬[즉, VL 및 VH 부위가 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)이라고 공지되어 있음; 예를 들어, Bird외 다수 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston외 다수 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬]로서 합성될 수 있도록 만드는, 합성 링커에 의해서 연결될 수 있다.이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "FZD 결합 단편" 및 "Wnt 결합 단편"이라는 용어 속에 포함된다. 상기 항체 단편들은 당 업자에게 공지된 종래의 기술을 이용하여 얻어질 수 있다.
항체를 제조하기 위하여, 폴리펩티드(또는 이 폴리펩티드의 항원 단편(예를 들어, 하전된 잔기가 다수 존재하는 것과 같은 기준에 따라서 항원성인 것으로 파악되는 폴리펩티드의 단편) 또는 이 폴리펩티드의 유사체) 예를 들어, 재조합 또는 펩티드 합성 기술[예를 들어, Solid Phase Peptide Synthesis(상동); Ausubel외 다수(상동)]에 의하여 생산된 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드는 담체 단백질 예를 들어, KLH(Ausubel외 다수, (상동))에 커플링되어, 애쥬반트와 혼합되고, 또한 이 숙주 포유 동물에 주사될 수 있다. "담체"는 결합된 분자의 면역원성 또는 이동성을 안정화하고/안정화하거나, 이를 보조 또는 강화하는 물질이다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt 단백질 또는 이의 단편은 PCR의 표준 기술을 이용하여 제조되어, pGEX 발현 벡터에 클로닝될 수 있다(Ausubel외 다수, (상동)). 융합 단백질은 문헌[Ausubel외 다수, (상동)]에 기술된 바와 같이 이.콜라이(E. coli)에서 발현되어, 글루타치온 아가로즈 친화성 매트릭스를 이용하여 정제될 수 있다.
통상적으로, 다양한 숙주 동물에 FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드를 주사한다. 적당한 숙주 동물의 예로서는 토끼, 마우스, 기니아 피그 및 래트를 포함한다. 다양한 애쥬반트는 숙주의 종류에 따라서 면역 반응을 증가시키는데에 사용될 수 있는 것으로서, 그 예로서는 프룬트(완전 및 불완전 애쥬반트) 애쥬반트, 애쥬반트 무기 겔 예를 들어, 수산화알루미늄, 표면 활성화 물질 예를 들어, 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 다가 음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, BCG(바실레 칼메트-구에린; Bacille Calmette-Guerin) 및 코린박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)이 있다. 이러한 방법을 통하여, 폴리클로날 항체 즉, 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 군집을 생산할 수 있다. 항체는 숙주 동물에서 얻은 혈액으로부터 예를 들어, 친화성 크로마토그래피법(FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드 항원이 고정된 수지를 이용하는 방법)으로 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 항-FZD 모노클로날 항체 및 항-Wnt 모노클로날 항체를 포함한다. 특정 항원에 특이적인 항체의 동종 군집인 모노클로날 항체(mAb)는 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드와 표준적인 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다[예를 들어, Kohler외 다수, Nature, 256:495, 1975; Kohler외 다수, Eur. J. Immunol, 6:511, 1976; Kohler외 다수, Eur. J. Immunol, 6:292, 1976; Hammerling외 다수, In Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas, Elsevier, NY, 1981; Ausubel외 다수, (상동) 참조].
통상적으로 모노클로날 항체는 배양액 중에서 연속 세포주에 의해 항체 분자가 생산되도록 하는 임의의 기술 예를 들어, 문헌[Kohler외 다수, Nature, 256:495, 1975, 및 미국 특허 제4,376,110호]에 개시된 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술[Kosbor외 다수, Immunology Today, 4:72, 1983; Cole외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026, 1983]; 및 EBV-하이브리도마 기술[Cole외 다수, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983]에 개시된 기술을 이용하여 제조된다. 이러한 항체는 임의의 면역 글로불린 군 예를 들어, IgG, IgM, IgE, IgA, IgD와, 이의 임의의 하위 군일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내 배양될 수 있다.
일단 생산되면, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 인지능 예를 들어, 문헌[Ausubel외 다수(상동)]에 개시된 바와 같은 표준 기술을 사용하는 면역 검정법 예를 들어, 웨스턴 블럿 또는 면역 침전 분석법에서 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 능력에 대해 시험 될 수 있다. FZD 또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11)에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명에 유용하다. 예를 들어, 이러한 항체는 시료 예를 들어, 조직 시료 중 폴리펩티드를 검출하고/검출하거나, FZD/Wnt 신호 전달을 조정하는(예를 들어, 암 예를 들어, 간암을 치료하는) 면역 검정법에 사용될 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 모노클로날 항체는 재조합적 방법으로 생산될 수 있는데, 예를 들어, 문헌[Ladner외 다수, 미국 특허 제5,223,409호; Kang외 다수 국제 특허 공보 WO 92/18619; Dower외 다수 국제 특허 공보 WO 91/17271; Winter외 다수 국제 특허 공보 WO 92/20791; Markland외 다수 국제 특허 공보 WO 92/15679; Breitling외 다수 국제 특허 공보 WO 93/01288; McCafferty외 다수 국제 특허 공보 WO 92/01047; Garrard외 다수 국제 특허 공보 WO 92/09690; Ladner외 다수 국제 특허 공보 WO 90/02809; Fuchs외 다수 (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay외 다수 (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse외 다수 (1989) Science 246:1275-1281; Griffths외 다수 (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins외 다수 (1992) J Mol. Biol 226:889-896; Clackson외 다수 (1991) Nature 352:624-628; Gram외 다수 (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad외 다수 (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom외 다수 (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas외 다수 (1991) PNAS 88:7978-7982]에 개시된 바와 같이 파지 전시법(phage display) 또는 조합법(combinatorial method)에 의해 생산될 수 있다.
항FZD 항체 및 항Wnt 항체는 전체가 인간의 항체[예를 들어, 인간의 면역 글로불린 서열로부터 항체를 생산하도록 유전자 조작된 마우스에서 생산된 항체]이거나, 또는 인간 이외의 것의 항체 예를 들어, 설치류(마우스 또는 래트), 토끼, 말, 소, 염소, 영장류(예를 들어, 원숭이), 낙타, 당나귀, 돼지 또는 조류의 항체일 수 있다.
항FZD 항체 및 항Wnt 항체는 가변부 또는 항체의 일부 예를 들어, CDR이 인간 이외의 유기체 예를 들어, 래트 또는 마우스 내에서 생산된 것일 수 있다. 항FZD 항체 및 항Wnt 항체는 또한 예를 들어, 키메라 항체, CDR-이식 항체 또는 인간화된 항체일 수도 있다. 항FZD 항체 및 항Wnt 항체는 또한 인간 이외의 유기체 예를 들어, 래트 또는 마우스 내에서 생산된 다음, 예를 들어, 가변 구조틀 또는 불변부에 변형이 일어나게 되면, 인간 체내에서의 면역원성이 감소될 수도 있다.
"키메라 항체"의 생산용으로 개발된 기술[Morrison외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851, 1984; Neuberger외 다수, Nature, 312:604, 1984; Takeda외 다수, Nature, 314:452, 1984]은, 항원 특이성이 적당한 마우스 항체 분자로부터 유래된 유전자와 생물학적 활성이 적당한 인간 항체 분자로부터 유래된 유전자를 스플라이싱(splicing) 하는데 이용될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 상이한 부분 예를 들어, 쥐과 동물의 mAb로부터 유래된 가변부 및 인간의 면역 글로불린 불변부를 보유하는 분자이다.
대안적으로, 단일 사슬 항체의 생산용인 것으로 개시된 기술(미국 특허 제4,946,778호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 동 제4,704,692호)은 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드에 특이적인 단일 사슬 항체를 생산하는데 적용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 결합을 통하여 Fv 부위의 경쇄 및 중쇄 단편을 연결함으로써 형성된다.
특이적 에피토프를 인지하고 이에 결합하는 항체 단편은 공지의 기술에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은 예를 들어, F(ab')2 단편[항체 분자를 펩신으로 분해하였을 때 생산될 수 있는 단편] 및 Fab 단편[F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시켰을 때 생산될 수 있는 단편]을 포함할 수 있다. 대안적으로, Fab 발현 라이브러리는 목적으로 하는 특이성을 보유하는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있도록 구성될 수 있다[Huse외 다수, Science, 246:1275, 1989].
FZD 및/또는 Wnt 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체(또는 이의 단편)은 예를 들어, 환자의 다양한 조직 중 FZD 및/또는 Wnt의 발현을 검출하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, FZD7 및/또는 FZD8 폴리펩티드는 생물학적 조직 또는 추출물의 통상적인 면역 검정법에서 검출될 수 있다. 적당한 검정법의 예로서는 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사성 면역 검정법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
V. 약학 조성물
약학적으로 활성인 임의의 화합물, 제제, 핵산, 폴리펩티드 또는 항체(본원에서 이들 모두를 "활성 화합물"이라 칭함)는 약학 조성물에 퉁합될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 활성 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"로서는, 약학적 투여 방법에 적합한, 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 보충적 활성 화합물은 또한 본 조성물에 통합될 수도 있다.
약학 조성물은 의도로 하는 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예로서는 경장(enteral)(예를 들어, 경구 또는 직장) 투여 및 비경구 투여 예를 들어, 정맥 내(예를 들어, 간문맥), 피내, 피하, 경피, 경점막 및 폐내 투여 를 포함한다. 투여는 예를 들어, 주사에 의하거나 또는 수술시 국소 투여하는 것과 같이, 간에 직접적으로 이루어질 수 있다. 주사에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예를 들어, 주사용 물, 염수 용액, 불 휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화 방지제 예를 들어, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예를 들어, 아세트산염, 구연산염 또는 인산염 그리고 삼투압 조정제 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로즈. pH는 산이나 염기 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨으로써 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리나 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 복수 투여용 바이알에 담겨질 수 있다.
주사용으로서 적당한 약학 조성물은, 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석으로 제조하는데에 사용되는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산제와 멸균 분말을 포함한다. 정맥 내 투여에 있어서, 적당한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포(Cremophor) EL™(뉴저지 파시파니 소재, BASF) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 본 조성물은 멸균성이고 용이하게 주사 가능한 정도로 유동성이어야 한다. 본 조성물은 제조 및 보관 상태에서 안정하여야 하고, 미생물 예를 들어, 박테리아나 곰팡이의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 분산시 적당한 입도를 유지시켜 주는 피복물 예를 들어 레시틴과 계면 활성제를 사용하면 유동성이 적당히 유지될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 사용하면 미생물의 활동을 예방할 수 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 설탕, 폴리알콜 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨과 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 본 조성물에 흡수를 장기지속시키는 제제 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴을 첨가하면, 이러한 주사용 조성물의 흡수 시간을 연장할 수 있다.
멸균 주사 용액은 활성 화합물을 필요량만큼 적당한 용매 중에 상기 나열한 성분 중 어느 하나 또는 이 성분들을 조합하여 첨가한 후, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비이클 즉, 염기성 분산 매질과 상기 나열한 성분 중 필요한 성분을 함유하는 비이클에 첨가함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는 진공 건조법과 동결 건조법이 있으며, 이러한 방법을 통하여서는, 미리 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분 분말과 목적으로 하는 임의의 부가 성분을 얻을 수 있다.
경구 투여용 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 치료제의 경구 투여를 위하여, 활성 화합물은 부형제와 함께 통합될 수 있으며, 또한 정제, 트로키 또는 캡슐 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 또한 구강 세척용 담체액을 사용하여 제조될 수도 있다. 약학적으로 허용 가능한 결합제 및/또는 애쥬반트 물질은 본 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은 다음과 같은 성분들 중 임의의 성분, 또는 유사한 성질을 갖는 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예를 들어, 미세 결정질 셀룰로즈, 검 트래거칸트 또는 젤라틴; 부형제 예를 들어, 전분 또는 락토즈, 붕해제 예를 들어, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제 예를 들어, 스테아르산마그네슘 또는 스테로트(Sterotes); 활주제 예를 들어, 콜로이드성 이산화실리콘; 감미제 예를 들어, 수크로즈 또는 사카린; 또는 풍미제 예를 들어, 페퍼민트, 살리실산 메틸 또는 오렌지 향.
흡입 투여를 위해서, 본 발명의 화합물은 적당한 추진제 예를 들어, 가스 예를 들어, 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기로부터 분사되는 에어로졸 스프레이 또는 분무기의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서, 장막을 침투할 수 있도록 만드는데에 적당한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제에 관하여는 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 경점막 투여용 침투제, 세제, 담즙산염과 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제(예를 들어, 통상의 좌제 베이스 예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세리드 함유)에 의하여 실행될 수 있다. 경피 투여에 있어서, 활성 화합물은 당 업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 연고, 고약, 겔 또는 크림의 형태로 제형화된다.
하나의 구체예에서, 활성 화합물은 체내에서 화합물이 급속하게 소멸되는 것을 막아주는 담체 예를 들어, 조절 방출 제형 예를 들어, 임플란트 및 미소 봉입 전달 시스템으로 제조된다. 생분해성, 생체 적합성 중합체 예를 들어, 아세트산 에틸렌 비닐, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당 업자에 의해 이해될 것이다. 이 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티컬스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 시판되고 있다. 리포좀 현탁액은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수도 있다. 이 현탁액은 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 개시된 바와 같이, 당 업자에게 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다.
용이하게 투여할 수 있도록 하고 균일하게 투여될 수 있는 투여 단위 형으로 경구 또는 비경구 투여용 조성물을 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에 사용된 투여 단위 형은, 처리될 개체에 단일 투여하기에 적합한, 물리적으로 별개인 단위를 의미하는 것으로서; 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 함께 소정 량 즉, 목적으로 하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 양의 활성 성분을 함유한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED50(군집의 50%에서 치료학적으로 효능을 나타내는 투여량)을 측정하는 표준적인 약학적 방법에 따라서 세포 배양액 또는 실험용 동물 내에서 결정될 수 있다. 독성 효과 및 치료 효과 사이의 투여량 비를 치료 지수라 하며, 이 치료 지수는 LD50/ED50의 비율로 나타낼 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있으나, 그러한 경우에는 건강한 세포에 미칠 수 있는 손상을 최소화하여 부작용을 줄일 수 있도록 발병 조직 부위 예를 들어, 간에 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 디자인하는데 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정법과 동물 연구를 통하여 얻어진 데이터는 인간에 대한 투여량 범위를 공식화하는데에 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 또는 아예 없도록, ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentration)의 범위 내에 포함되도록 하는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여형과 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 화합물에 있어서, 치료학적 유효 투여량은 처음에 세포 배양 검정법을 통해 추산될 수 있다. 투여량은 순환 혈장 내 농도 범위 즉, 세포 배양액 중에서 측정된 IC50(즉, 증상을 최대로 억제할 수 있는 농도의 반에 해당하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 농도 범위에 이르도록 동물 모델 내에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 사람에 있어서 유효 투여량을 더 정확하게 측정하는데에 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본원에 있어서 "유효량" 및 "치료에 유효한"이라는 용어는, 일정 기간 동안 사용되었을 때(예를 들어, 단기 또는 장기 투여 및 주기적 또는 연속적 투여), 의도로 하는 효과 또는 생리학적 결과를 가져올 수 있는 투여 범위 내에서 효과적인 화합물의 양 또는 농도를 의미한다. 본원에 개시된 화합물에 있어서, 예를 들어, 폴리펩티드의 유효량(즉, 유효 투여량) 범위는 체중 1㎏ 당 약 0.001∼500 ㎎ 예를 들어, 약 0.01∼50 ㎎ 예를 들어, 약 0.1∼20 ㎎이다. 폴리펩티드는 약 1∼10주 동안 예를 들어, 2∼8주 동안, 약 3∼7주 동안 또는 약 4주, 5주 또는 6주 동안의 기간에 걸쳐 1주일에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 임의의 인자 예를 들어, 치료받을 환자의 유형, 질병 또는 질환의 심각성, 이전의 치료 경력, 환자의 전반적인 건강 상태 및/또는 연령, 그리고 기타 앓고 있는 질병이 환자를 효과적으로 치료하는데에 필요한 투여량과 시간에 영향을 미친다는 사실을 이해할 것이다. 뿐만 아니라, 환자를 치료학적 유효량의 화합물로 치료하는 방법으로서는 단일 치료법을 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게 연속 치료법을 포함할 수도 있다.
항체에 있어서, 부분적 인간 항체 및 전체적 인간 항체는 다른 항체들의 경우보다 인체 내에서의 반감기가 더 길다. 그러므로, 투여량과 투여 횟수를 더 줄일 수 있다. 변형 예를 들어, 지질화(lipidation)는 항체를 안정화하고 흡수율과 조직 침투력을 강화하는데에 사용될 수 있다. 항체의 지질화 방법에 관하여는 문헌[Cruikshank외 다수(1997), J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193]에 개시되어 있다.
만일 화합물이 소 분자인 경우, 대표적인 투여량은 개체 또는 시료 중량 1㎏ 당 소 분자를 ㎎ 또는 ㎍ 단위의 양으로 포함한다[예를 들어, 약 1㎍/㎏∼약 500 ㎎/㎏, 약 100 ㎍/㎏∼약 5㎎/㎏, 또는 약 1㎍/㎏∼약 50 ㎍/㎏]. 또한, 소 분자의 적당한 투여량은 조정될 발현량이나 활성에 대한 소 분자의 효능에 따라 달라진다는 사실을 이해할 것이다. 이와 같은 소 분자 중 하나 이상이 동물(예를 들어, 사람)에 투여되어 FZD 또는 Wnt 폴리펩티드 또는 핵산의 발현량 또는 활성을 조정할 때, 전문의, 수의사 또는 연구원은 예를 들어, 처음에는 비교적 적은 투여량으로 처방하다가, 나중에는 그 투여량을 마침내 적당한 반응이 나타날 때까지 늘릴 수 있다. 뿐만 아니라, 임의의 특정 동물 개체에 특이적인 투여량 수준은 다수의 인자 예를 들어, 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별 및 개체의 식이 습관, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 약품의 임의의 조합 투여, 그리고 조정될 발현량 또는 활성의 정도에 따라서 달라질 것이다.
핵산 분자(예를 들어, FZD7, FZD8, Wnt3, Wnt8b 및/또는 Wnt11 DNA)는 벡터에 삽입되어 유전자 치료용 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료용 벡터는 개체에 예를 들어, 정맥 내 주사, 국소 투여법(예를 들어, 미국 특허 제5,328,470호) 또는 정위적 주사(예를 들어, Chen외 다수 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)으로 전달될 수 있다. 유전자 치료용 벡터의 약학 제제는 허용 가능한 희석제 중에 유전자 치료용 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비이클이 묻혀있는 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 원형 그대로 생산될 수 있는 경우, 약학 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 유전자 치료법에 유효하게 사용될 수 있는 대표적인 구조물에 관하여는 이하 실시예 부분에 기술되어 있다.
약학 조성물은 용기, 팩 또는 분배기 내에 투여 지침과 함께 포함될 수 있다.
VI . 암 및 이의 치료 방법
"암"이란 용어는, 자발적으로 성장할 수 있는 능력을 보유하는 동물 세포를 의미하는 것이다. 이러한 세포의 예로서는, 세포가 급속하게 성장하여 증식하는 것을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 병상을 나타내는 세포를 포함한다. 상기 용어는 조직학적 유형 또는 침투 단계에 상관없이, 암 세포의 성장 상태를 포함하는 의미로서, 예를 들어, 종양, 발암 과정, 전이 조직 및 악성 변형 세포, 조직 또는 기관을 포함한다. 뿐만 아니라, 다양한 기관계 예를 들어, 호흡기, 심혈관계, 신장, 생식기, 조혈계, 신경계, 간, 위장관 및 내분비계의 악성 종양; 그리고 악성 종양 예를 들어, 대부분의 결장암, 신장-세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 암, 폐의 비-소 세포 암, 소장 암 및 식도암을 포함하는 선암종도 포함된다. "천연 발생" 암으로서는 개체에 암 세포를 주입함으로써 실험적으로 유발되는 것이 아닌 임의의 암을 포함하는 것으로서, 예를 들어, 자발적으로 발생하는 암, 환자가 발암원에 노출됨으로써 발생하는 암, 트랜스게닉 발암 유전자를 삽입하거나 또는 종양 억제 인자 유전자의 기능을 상실시킴으로써 유발되는 암, 그리고 감염 예를 들어, 바이러스 감염에 의해 유발되는 암이 있다. "암종"이란 용어는 당 업계에 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양인 것으로서 알려져 있다. 상기 용어에는 암육종을 포함하는데, 이는 암 조직과 육종 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함한다. "선암종"이란, 선 조직으로부터 유래된 암종 또는 인지 가능한 선 구조를 형성하는 종양 세포인 암종을 의미한다. "간세포 암종(HCC)"이란 용어는, 간 세포 즉, 간을 이루는 주요 세포 유형에 발생하는 암을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서 "환자"란 용어는, 동물 즉, 인간 또는 인간 이외의 것들, 설치류 또는 설치류 이외의 것들을 의미하는 것으로서, 본 발명의 방법에 따라서 치료가 행하여지는 동물을 의미하는 것이다. 수의학적 및 인간에 대한 임상 실험도 간주된다. "환자"란 용어에는 예를 들어, 조류, 파충류, 양서류 및 포유류 예를 들어, 인간, 기타 영장류, 돼지, 설치류 예를 들어, 마우스 및 래트, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소도 포함된다. 바람직한 개체로서는 인간, 농장용 동물, 그리고 애완 동물 예를 들어, 고양이와 개가 있다. 본원에 있어서 "치료(법)"란 용어는, 병상 예를 들어, 암이 발병한 환자의 생명을 연장시키거나, 또는 암의 세력을 억제, 완화시키고, 암 발생을 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명의 방법과 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 암으로서는 예를 들어, 간암, 위암, 결장암, 직장암, 구강암/인두암, 식도암, 후두암, 췌장암, 폐암, 소장암 및 담즙관 암을 포함한다.
주로 종양에 관한 예후가 나타나기 이전에 예방적 차원에서 치료가 시작될 수 있기 때문에, 암 발병 위험이 있는 것으로 생각되는 개체가 특히 본 발명에 의한 혜택을 받을 수 있다. "위험이 있는" 개체로서는 예를 들어, 발암원에 노출된 개체 예를 들어, 민감한 개체인 경우 통계학적으로 암 발병을 촉발시키는 것으로 파악되는 수준으로 발암 원을 소비 예를 들어, 흡입 및/또는 섭취한 개체를 포함한다. 바이러스 예를 들어, 간염 바이러스 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV)에 노출된 개체도 포함된다. 자외 광선에 노출되거나, 또는 환경, 직업 및/또는 유전에 의해 발병 위험 인자를 갖게 된 개체, 그리고 전암 상태에 관한 징후를 보이는 개체도 포함된다. 이와 유사하게, 암의 초기 단계 또는 전이 과정 중에 있는 개체(즉, 개체의 체내 또는 개체 조직의 특정 부위에 하나 또는 소수의 이상 세포가 존재하는 경우)는 이러한 예방적 차원의 치료를 통하여 혜택을 받을 수 있다.
당 업자는, 본원에 개시된 방법 임의로는 부가적 방법 예를 들어, 환자의 병력을 평가하거나, 다른 진단 시험을 수행하거나/수행하고, 이미지화 기술을 이용하여, 전문의(또는 환자를 진단하기에 적당한 수의사)로부터 환자가 암이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단될 수 있음을 이해할 것이다.
암이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자를 치료하는 한 가지 기법은 환자 내 Wnt/FZD 신호 전달을 조정하는 것이다. 이것의 목표는 신호 전달이 너무 느릴 경우 신호 전달을 가속화시키고, 신호 전달이 너무 빠를 경우 신호 전달을 늦추는 것이다. Wnt/FZD 신호 전달의 조정은 2가지 기본적인 부류로 나눌 수 있다: 활성이 충분하지 않거나 또는 활성이 없을 때, Wnt/FZD 신호 전달을 감소시키는 것(즉, 억제, 예를 들어, 소멸시키는 것)과, Wnt/FZD 신호 전달을 증가시키는 것(즉, 보충 또는 제공하는 것). Wnt/FZD 신호 전달이 억제되어야 하는지 또는 증가되어야 하는지 여부는 의도로 하는 목적에 따라서 달라진다. Wnt/FZD 신호 전달은 본원에 기술된 바와 같이, 활성 화합물(예를 들어, 항Wnt 항체, siRNA, 후보 화합물 및/또는 항암제)을 이용하여 조정될 수 있다. 예를 들어, FZD7 및/또는 Wnt3의 발현량을 감소시키고/감소시키거나 FZD7과 이의 리간드(예를 들어, Wnt3, 8b 및/또는 11) 간 상호 작용을 방해함으로써 Wnt/FZD 신호 전달 활성을 감소시키는 화합물은 예를 들어, 암 예를 들어, 간암 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, FZD8의 발현량을 증가시킴으로써 활성을 증가시키는 화합물도 또한 예를 들어, 암 예를 들어, 간암 치료제로서 사용될 수도 있다.
Wnt / FZD 신호 전달의 감소
당 업계에 공지된, 환자 체내에서 특정 단백질의 발현을 감소시키는 방법은 Wnt/FZD 신호 전달을 감소시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 FZD 또는 Wnt 유전자 예를 들어, FZD7 유전자 또는 Wnt3 유전자의 발현을 억제하는데에 효과적인 안티센스 핵산이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스"란 용어는, 생리 조건 하에서 DNA 즉, 특정 유전자를 포함하는 DNA, 또는 이 유전자의 mRNA 전사체에 혼성화하여, 이 유전자의 전사 및/또는 이 mRNA의 번역을 억제하는, 올리고뉴클레오티드 즉, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 올리고리보뉴클레오티드 또는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다.
안티센스 분자는 표적 유전자 또는 전사체와 혼성화됨에 따라서 표적 유전자(예를 들어, FZD7 또는 Wnt3, 8b 또는 11을 암호화하는 유전자)의 전사 또는 번역을 방해하도록 디자인된다. 상기 안티센스 핵산은 전체 FZD 또는 Wnt RNA 또는 이 RNA의 일부분만에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 한편, 상기 안티센스 핵산은 FZD 또는 Wnt RNA와 효과적으로 혼성화되도록 충분히 길 필요가 있다. 그러므로, 최소 길이는 약 12∼25 뉴클레오티드이다. 다른 한편으로, 길이가 약 150 뉴클레오티드 이상으로 증가하게 되면, 번역을 억제하는 효능은 그 한계만큼 증가할 수 있는 반면에, 표적 세포에 안티센스 핵산을 도입하는 것은 훨씬 어려워질 수 있다. 그러므로, 안티센스 핵산으로서 적당한 길이는 약 15∼약 150 뉴클레오티드 예를 들어, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70 또는 80 뉴클레오티드일 수 있다. 안티센스 핵산은 FZD 또는 Wnt mRNA의 암호화 부위, 또는 FZD 또는 Wnt mRNA의 5' 또는 3' 비-암호화 부위, 또는 이 둘 다에 상보성일 수 있다. 한가지 방법은 안티센스 핵산을 FZD 또는 Wnt mRNA의 번역 개시 위치 양쪽 모두에 존재하는 부위에 상보성이 되도록 디자인 하는 것이다.
본원에 개시된 서열을 바탕으로 하여, 당 업자는 본 발명에 따라서 사용되는 다수의 적당한 안티센스 분자 중 임의의 분자를 용이하게 선택하여 합성할 수 있다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt mRNA에 상보성이고 이것의 길이 방향으로 뻗어있는 길이 15∼30 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 다수개 포함하는 "유전자 워크(gene walk)"를 마련하여, FZD 또는 Wnt 발현 억제에 대하여 시험될 수 있다. 임의로는, 5∼10 뉴클레오티드인 갭은 올리고뉴클레오티드 사이에 존재하여, 합성 및 시험 될 올리고뉴클레오티드의 수를 줄일 수 있게 된다.
안티센스 핵산은 예를 들어, 시판중인 핵산 합성기를 판매지의 지시에 따라서 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 안티센스 핵산은 천연 생성되는 뉴클레오티드에만 통합될 수 있다. 대안적으로, 상기 안티센스 핵산은 다양하게 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 통합되어, 이것의 생체 내 반감기를 증가시키거나, 또는 안티센스 분자와 이의 표적 RNA 사이에 형성되는 이중체의 안정성을 증가시킬 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 예로서는 포스포로티오에이트 유도체와 아크리딘-치환 뉴클레오티드를 포함한다. 표적 및 서열을 표시할 때, 적당한 안티센스 분자의 디자인 및 생산 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 안티센스 핵산에 관하여는 문헌[Goodchild, "Inhibition of Gene Expression by Oligonucleotides," in Topics in Molecular and Structural Biology, Vol. 12: Oligodeoxynucleotides (Cohen, ed.), MacMillan Press, London, pp. 53-77 (1989)]에 개시되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달은 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 및/또는 세포 외 작업을 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전달할 경우에는, 표준적인 방법 예를 들어, 리포좀 방법에 의하거나 또는 간단히 막 투과성 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써 전달된다.
생체 내 방법에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달은 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 선택 위치 예를 들어, 간에 국소 주입하는 방법에 의할 수 있다. 본 방법은 이미 건선의 성장 억제와 싸이토메갈로바이러스 억제에 대해 입증된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Wraight외 다수, (2001). Pharmacol Ther. 90(1):89-104; Anderson외 다수, (1996) Antimicrob Agents Chemother 40: 2004-2011; 및 Crooke외 다수, (1996) J Pharmacol Exp Ther 277: 923-937]을 참조하시오.
이와 유사하게, RNA 간섭(RNAi) 기술은, 안티센스 기술에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서 FZD 또는 Wnt 발현을 억제하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt 핵산에 대하여 유도된 소 간섭 RNA(siRNA) 이중체는 합성되어 암호화된 단백질(들)의 발현을 막는데에 사용될 수 있다. 대표적인 Wnt3 siRNA 에 관하여는 이하 실시예 부분에 기술되어 있다.
Wnt/FZD 신호 전달을 억제하는 다른 접근법은, 환자에게 FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD7 폴리펩티드)에 결합하는 화합물 예를 들어, 후보 화합물 또는 항암제 및/또는 이의 결합 파트너(예를 들어, Wnt3, 8b 및/또는 11)를 투여하고, 상기 2가지 물질 사이의 상호 작용을 막는 단계를 포함한다. 이러한 화합물 및 제제는 단백질 간 상호 작용을 막는 형태로 예를 들어, FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD 폴리펩티드의 CRD 도메인)에 결합하고/결합하거나, Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt 폴리펩티드의 결합 도메인)에 결합할 수 있다. 이러한 후보 화합물 및 항암제는 본원에 개시된 스크리닝 방법을 통하여 동정될 수 있다. Wnt 폴리펩티드 예를 들어, Wnt3, 8b 및/또는 11에 결합할 수 있는 화합물의 예로서는, 이하 실시예 부분에 기술된, FZD7 수용체 또는 이의 절단형과, 항Wnt 항체(또는 이의 FZD-결합 단편) 예를 들어, 항Wnt3 항체가 있다.
Wnt/FZD 신호 전달을 억제하는 또 다른 접근법은, 환자에게 FZD 수용체 예를 들어, FZD7 수용체의 돌연 변이 형(예를 들어, 절단형)을 암호화하는 벡터(예를 들어, 유전자 치료용 벡터)를 투여하는 단계를 포함한다. 환자 세포(즉, 구조물을 포함하는 세포)에 의해 상기 수용체 돌연 변이 형을 발현시키면, 세포 내 Wnt/FZD 신호 전달을 방해할 수 있다. 예를 들어, FZD 수용체(예를 들어, FZD7 수용체)의 분비형 및 가용형을 암호화하는 구조물이 사용될 수 있다. 이러한 구조물을 표적 세포에 의해 발현시키면, 이 표적 세포는 Wnt 폴리펩티드와 결합할 FZD 수용체를 가용성 형태로 분비하게 되며, 그 결과 이 Wnt 폴리펩티드는 세포 표면상에 존재하는 원형 그대로의 FZD 수용체에 결합할 수 없게 된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 막 결합형이되, 불활성 형태인 FZD 수용체[즉, 대응 야생형 FZD 수용체에 의해 수행되는 몇몇 작용을 수행할 수 없는 돌연 변이 FZD 수용체]를 암호화하는 구조물이 사용될 수 있다. 이러한 구조물이 표적 세포에 의해 발현되면, Wnt 폴리펩티드가 관여하지 않는 내부 기작을 통해 Wnt 폴리펩티드와 결합할 수 있거나 또는 Wnt/FZD 신호 전달을 방해할 수 있다. Wnt/FZD 신호 전달을 억제하는 또 다른 방법은 환자에게 Wnt11 폴리펩티드를 암호화하는 벡터(예를 들어, 유전자 치료용 벡터)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 Wnt11 폴리펩티드는 정형적인 HCC 내 Wnt 경로의 억제 인자이다. 벡터는 비-복제성 선형 또는 환형 DNA 또는 RNA 벡터로부터 유래될 수 있거나, 또는 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 유래될 수 있다. 적당한 발현 벡터를 구성하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이에 유용한 물질은 시판되고 있다.
Wnt / FZD 신호 전달의 증가
신규의 또는 보충적인 Wnt/FZD 신호 전달은 생체 내에서 즉, 환자의 체 내에서 FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD8 폴리펩티드) 및/또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3 폴리펩티드)의 발현을 증가시킴으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, FZD 또는 Wnt 폴리펩티드는 FZD 폴리펩티드(예를 들어, FZD8 폴리펩티드) 및/또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3 폴리펩티드)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산 구조물을 유기체 세포 내에서 발현시켜 유기체 예를 들어, 인간의 체 내에서 직접 생산될 수 있다. 목적 유기체의 세포를 형질 감염시키는데에 적당한 임의의 발현 벡터를 이와 같은 목적으로 사용할 수 있다.
VII . 트랜스게닉 동물
본 발명은 또한 간 세포 내에서 간암을 진행시키고 FZD7을 과다 발현하는 트랜스게닉 동물을 특징으로 한다. 이러한 동물들은 간암 연구와, Wnt/FZD 신호 전달을 조정하고 암을 치료할 수 있는 치료제 개발을 위한 모델 시스템을 대표한다.
트랜스게닉 동물로서는 예를 들어, 농장용 동물(돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류(예를 들어, 래트, 기니아 피그 및 마우스), 인간 이외의 영장류(예를 들어, 개코 원숭이, 원숭이 및 침팬지), 그리고 애완 동물(예를 들어, 개 및 고양이)이 있다.
당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 트랜스 유전자를 동물에 도입시켜, 트랜스게닉 동물의 조상 동물(founder line)을 만들 수 있다. 이러한 기술의 예로서는 전핵 미세 주입법(미국 특허 제4,873,191호); 레트로바이러스를 매개로 하여 생식 세포로 유전자를 운반하는 방법(Van der Putten외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:6148, 1985); 배아 줄기 세포로의 유전자 표적화(Thompson외 다수, Cell 56:313, 1989); 및 배아의 전기 천공법(Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803, 1983)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 문헌[Yang외 다수 (Proc. Natl Acac. Sci. USA 94:3004-3009, 1997)]에 개시된 방법이 특히 유용하다.
트랜스게닉 동물을 생산 및 평가하는데에 사용될 수 있는 기술에 관하여 보다 자세히 파악하기 위해서, 당 업자는 문헌[Intl. Rev. Cytol. 115:171-229, 1989]을 참고할 수 있으며, 또한 문헌[Hogan외 다수 Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986); Krimpenfort외 다수 (Bio/Technology 9:86, 1991), Palmiter외 다수 (Cell 41:343, 1985), Kraemer외 다수 (Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1985), Hammer et al(Nature 315:680, 1985), Purcel외 다수 (Science, 244:1281, 1986), Wagner외 다수 (미국 특허 제5,175,385호), 및 Krimpenfort외 다수(미국 특허 제5,175,384호)]을 통해서 부가적인 지침을 습득할 수도 있다.
도 1a는 Huh7 세포에 헤파린을 처리한 후(Hep+) 또는 처리하지 않았을 때(Hep-) Huh7 세포로부터 유래된 분획화 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)의 패턴을 나타내는 2차원 SDS-PAGE 겔을 은으로 염색한 결과를 나타내는 그림이다. 헤파린 친화성 크로마토그래피로부터 얻은 0.25M NaCl 분획을 pH3∼10인 1차원 비선형 IPG 겔과 4∼12% 구배의 2차원 NuPAGE 겔 상에서 분리하였다. 헤파린-미처리 분획으로부터 얻어진 단백질 스팟(동그라미 친 부분; 이하 "제1 스팟"이라 칭함)을 관찰한 결과, 발현이 증가하였음을 알 수 있었다.
도 1b는 제1 스팟으로부터 유래된 트립신 처리 펩티드의 질량 스펙트럼 결과이다. 제1 스팟을 잘라내어, 탈색시킨 후 트립신으로 분해하였다. 펩티드 질량은 PBSII 기구 상에서 분석하였다. * 표시한 피크는 인간 Wnt11 펩티드의 계산 질량과 일치하는 펩티드를 나타내는 것이다.
도 1c는 RT-PCR을 이용하여 다양한 간세포 암종 세포주의 Wnt 리간드 mRNA를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 사진이다. 모든 HCC 세포주에서는 Wnt3 mRNA가 검출되었으며, 3개의 HCC 세포주에서는 Wnt11 mRNA가 검출되었다(단, 포커스(FOCUS) 세포 제외). RT-PCR에 의해서는 더 이상의 Wnt mRNA가 검출되지 않았다.
도 2a는 HCC 세포주 내 Wnt3 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. 18S rRNA 수준을 내부 대조구로 이용하였으며, Wnt3와 Wnt11의 mRNA 수준은 109개의 18S rRNA 당 복사체의 수로 나타내었다. HCC 세포주 중 Wnt3 mRNA의 발현 수준(평균 ± SE)은, HepG2의 경우에는 370.0 ± 10.3, Hep3B의 경우에는 381.3 ± 12.7, Huh7의 경우에는 95.2 ± 6.3이었으며, 109개의 18S rRNA 당 210.4 ± 9.5 복사체에 해당하였다.
도 2b는 HCC 세포주 내 Wnt11 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. 18S rRNA 수준을 내부 대조구로 이용하였으며, Wnt11의 mRNA 수준은 109개의 18S rRNA 당 복사체의 수로 나타내었다. Wnt11 mRNA 발현 수준은, HepG2의 경우에는 8,499.3 ± 845.0, Hep3B의 경우에는 290.9 ± 40.1이었으며, Huh7 세포 내에서는 109개의 18S rRNA 당 3.57 ± 0.2 복사체에 해당하였다. Wnt11 mRNA는 포커스 세포 내에서 qRT-PCR로 검출될 수 없었으며, 이는 통상적인 RT-PCR의 경우도 마찬가지였다.
도 3a는 인간의 HCC 조직 내 Wnt3 mRNA의 발현을 나타내는 막대 그래프이다. mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정하였다. 흰색 막대는 정상 간 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 검정 색 막대는 HCC 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 회색 막대는 상응하는 종양 주위 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 실험은 2회 실시하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. HCC의 77% 및 종양 주위 조 직의 59%에서는, 정상 간 조직에서의 평균 ± 3SD 값을 넘는 수준만큼 Wnt3 mRNA의 발현 수준이 증가하였다. HCC의 71%에서는, Wnt3 mRNA 발현 수준이 상응하는 종양 주위 조직에서의 Wnt3 mRNA 발현 수준보다 높았다.
도 3b는 인간 HCC 조직 내 Wnt11 mRNA의 발현을 나타내는 막대 그래프이다. mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정하였다. 흰색 막대는 정상 간 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 검정 색 막대는 HCC 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 회색 막대는 상응하는 종양 주위 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 실험은 2회 실시하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. HCC 조직의 41%에서는, 정상 간 조직에서의 최소 컷-오프(cut-off) 수준보다 낮게 발현 수준이 감소 된 반면에, 종양 주위 조직의 경우에는 그러하지 않았다(P = 0.0036, 피셔 적합 검정). 쌍을 이룬 시료 중 65%에서는, 상응하는 종양 주위 조직과 비교하였을 때 종양 내 Wnt11 mRNA 발현 수준이 감소하였음을 알 수 있었다.
도 3c는 인간 HCC 조직에서의 FZD7 mRNA의 발현을 나타내는 막대 그래프이다. mRNA 수준은 qRT-PCR로 측정하였다. 흰색 막대는 정상 간 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 검정 색 막대는 HCC 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 회색 막대는 상응하는 종양 주위 조직에서의 mRNA 수준을 나타내는 것이다. 실험은 2회 실시하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. HCC과 종양 주위 조직 모두 중 59%에서는, 정상 간 조직의 경우보다 FZD7 mRNA 발현이 증가하였다. 쌍을 이룬 시료 중 71%에서는, 상응하는 종양 주위 조직과 비교하였을 때 종양 내 FZD7 mRNA 발현 수준이 증가하였음을 알 수 있었다(P = 0.031, 윌콕슨 순위합 검정).
도 4a∼4d는 면역 조직 화학적으로 염색된 인간의 HCC 및 종양 주위 조직(400배 배율)의 사진이다. 도 4a는 네가티브 대조구이고, 도 4b는 β-카테닌 염색된 종양 주위 조직을 나타내는 것이다. 간 세포는 통상적으로 막 염색되었다. 도 4c는 β-카테닌 염색 HCC 조직을 나타내는 것으로서, 이 경우 β-카테닌은 핵 내에 축적되었다. β-카테닌의 핵 염색 결과와 농도가 진해진 세포질 염색 결과에 주목해야 할 것이다. 도 4d는 β-카테닌이 핵에는 축적되지 않고 세포질에 축적된 HCC 조직을 나타내는 것이다.
도 5a는 HCC 세포주에 있어서 T-세포 인자(Tcf) 전사 활성에 대한 Wnt3 플라스미드 형질 감염의 효과를 나타내는 웨스턴 블럿을 복수 회 실시한 결과를 나타내는 것이다. 포커스(Focus), Huh7 및 Hep3B 세포에 myc-태깅된 Wnt3 플라스미드 또는 pcDNA3.1/myc-His A 플라스미드, pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH, 그리고 β-갈락토시다제 플라스미드를 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염시킨 후 24시간 경과시, 세포 배양액에서 혈청을 제거하여 세포를 24시간 동안 배양한 후, 1% FBS MEM을 첨가하였다. 이와 같이 첨가한 후 2시간 및 24시간 경과시 세포를 수집하여, 루시퍼라제 검정법을 수행하였으며, 이후 Wnt3과 β-카테닌에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 토끼의 폴리클로날 항Wnt3 항체로 웨스턴 블럿 분석한 결과, 형질 감염 후 Wnt3 단백질이 증가하였음을 알 수 있었다. 모노클로날 항myc 항체를 사용하여 폴리클로날 항Wnt3 항체의 특이성을 확인하였다. 포커스 세포에서 세포 내 β-카테닌 수준이 증가하였음에 주목하여야 할 것이다. Hsp90 단백질은 내부 로딩 대조구로서 사용하였다.
도 5b는 Wnt3 플라스미드로 형질 감염시킨 이후 HCC 세포주에서의 Tcf 전사 활성 변화를 나타내는 막대 그래프이다. Tcf 전사 활성은, 대조구 플라스미드가 형질 감염된 포커스 세포의 경우와 비교하였을 때, 형질 감염 후 포커스 세포에서 3배 증가하였다. Tcf 전사 활성은 형질 감염 후 Huh7 세포의 경우 약간 감소하였으나, Hep3B 세포의 경우에는 변함이 없었다. 흰색 막대는 대조구 플라스미드(pcDNA)로 형질 감염된 세포를 나타내는 것이고, 검정 색 막대는 Wnt3 플라스미드로 형질 감염된 세포를 나타내는 것이다.
도 6a는 HCC 세포주 내 Tcf 전사 활성에 항Wnt3 항체가 미치는 영향력을 나타내는 막대 그래프이다. HCC 세포를 12웰 평판에 접종하고, 이를 β-갈락토시다제 플라스미드와 함께 pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH로 형질 감염시켰다. 세포 배양액에서 혈청을 뺀 채로 24시간을 경과 한 다음, 이 세포를 항Wnt3 항체(Wnt3-Ab; 검정 색 막대) 또는 대조구 항체(10㎍/㎖) 중 어느 하나를 함유하는 1% FBS MEM과 함께 항온 처리한 후, 다시 24 시간 경과시 세포를 수집하였다. 정상의 토끼 IgG를 대조구 항체로서 사용하였다(C-Ab; 흰색 막대). 폴리클로날 항Wnt3 항체 처리시 Tcf 전사 활성은 Huh7의 경우 60%까지 감소하였고, Hep3B 세포의 경우에는 26%까지 감소하였으며, 포커스 세포의 경우에는 40%까지 감소하였다.
도 6b는 내인성 Wnt3 mRNA 발현에 siRNA가 미치는 영향력을 나타내는 막대 그래프이다. 대조구 siRNA 및 Wnt3 siRNA(WNT3-3)를 10 또는 100 nM의 농도로 HCC 세포에 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48시간 경과시 세포를 수집한 다음, qRT-PCR을 이용하여 Wnt3 mRNA 발현 수준을 측정하였다. siRNA Wnt3-3은 3개의 세포주 모두에 있어서 100 nM의 농도로 mRNA 수준을 평균 50∼60% 감소시켰다. 도 6b는 Huh7 세포에 있어서의 이와 같은 효과를 나타내는 것이다.
도 6c는 Tcf 전사 활성 또는 HCC 세포주에 Wnt3 siRNA가 미치는 영향력을 나타내는 막대 그래프이다. Wnt3 siRNA 또는 대조구 siRNA는 Tcf 리포터가 지정된 농도(nM)로 존재하는 조건 하에 공동 형질 감염되었다. Tcf 전사 활성은 Huh7의 경우에는 48.5%, Hep3B의 경우에는 33%, 그리고 포커스 세포의 경우에는 43.5%까지 감소하였다.
도 7은 항Wnt3 항체 처리한 포커스 세포의 상처 치유가 지연됨을 나타내는 세포 배양액 사진이다. 포커스 세포는 6웰 평판에 도말하였다. 합류 상태의 단일 층 세포에 200㎕들이 멸균 플라스틱 마이크로피펫 끝 부분으로 상처를 입혔다. 이후 세포를 항Wnt3 Ab 또는 토끼 IgG(대조구 항체(C Ab); 10 ㎍/㎖) 중 어느 하나를 함유하는 배지로 처리하고, 상이한 시점에서 사진 촬영을 하였다. 항Wnt3 Ab 처리된 포커스 세포는 상처 치유가 지연되었음을 알 수 있었다. 이러한 효과는 24시간 경과시에 가장 강력하였다. 24시간 경과시, 대부분의 상처는 C Ab로 처리된 세포 중 이주성 세포 및/또는 증식성 세포로 덮여진 반면에, 항Wnt3 Ab 처리된 포커스 세포는 그렇지 않았다.
도 8a∼도 8e는 추정 결합 모티프를 포함하는, 대표적인 FZD7, FZD8, Wnt3, Wnt8b 및 Wnt11 인간 및 마우스 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
본 발명은 부분적으로는 다음의 실시예를 통하여 입증되며, 이하 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1. HCC 성장 억제에 대한 천연 Wnt 리간드의 동정
방법
세포 표면 HSPG 의 제조 및 헤파린- 아가로즈 크로마토그래피에 의한 분획화
Huh7 세포를 10% FBS(미주리주 세인트루이스 소재, Sigma) MEM(미국 버지니아주 헌돈 소재, Mediatech) 중에서 70% 합류 상태가 될 때까지 배양하였다. 항온 처리후 24시간 경과시 이 배지를 0% FBS MEM으로 바꾸고, 세포를 12시간 동안 0.1% FBS MEM 중에서 헤파린으로 처리(50 ug/㎖) 또는 처리하지 않았다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 5회 세척하고, 세포층을 Tris-완충 염수/EDTA 중에서 결정화 트립신(20 ug/㎖)과 함께 얼음 상에서 10분 동안 항온 처리하였다. 여기에 대두 트립신 억제제를 최종 농도 100 ug/㎖가 되도록 첨가하여 트립신의 활성을 중지시켰다. 이 반응물을 4℃에서 5분 동안 원심 분리시켜(400 x g) 트립신 처리된 세포로부터 오염 세포를 제거하였다.
상기 트립신 처리된 세포를 헤파린-아가로즈 크로마토그래피시켰다. 요약하면, 트립신 처리된 세포를 헤파린(4%) 아가로즈 비드와 함께 밤새도록 항온 처리(4℃)한 후, 이 비드를 4분 동안 2000 x g에서 원심 분리하여 수집한 다음, 이 비드를 PBS 중 0.1 M NaCl 20 부피로 세척하였다. 용리된 분획을 PBS 중 0.25, 0.5, 0.75 및 1.0 M NaCl을 이용하여 수집하였다.
겔 분해 및 펩티드 맵핑에 있어서의 2차원 겔 전기 영동
등전 초법(isoelectric focusing; IEF)용 IPG 완충액으로 침전 및 재 수화시 켜, 헤파린-아가로즈 크로마토그래피로부터 시료를 분획화하였다. 제조자의 프로토콜에 따라서, 줌 IPG 러너(ZOOM IPGRunner)(Invitrogen™, 캘리포니아 칼스배드 소재)를 이용하여 IEF를 실시하였다. 줌 스트립(pH3∼10)을 밤새도록 시료로 재 수화시킨 후, 다음과 같이 단계적 전압 램핑법(step voltage ramping method)을 실시하였다: 200 V, 20 분 → 450 V, 15 분 → 750 V, 15 분 → 2000 V, 120 분. 포커싱된 겔을 줌 겔(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE(2차원적 전기 영동) 시켰다. 전기 영동 후, 실버퀘스트 은 염색 키트(SilverQuest Silver Staining kit; Invitrogen)를 사용하여 겔을 염색하였다.
은 염색된 겔로부터 단백질 스팟을 절개하여 탈색 및 건조시킨 다음, 서열급 개질 트립신(위스콘신주 매디슨 소재, Promega)을 사용하여 효소 분해하였다. 트립신 절단된 펩티드를 탈염시키고 이를 집팁C18(ZipTipC18)(메시츄세츠주 베드포드 소재, Millipore)로 농축시켰다. 농축된 트립신 처리 펩티드를 SEND 프로테인칩(SEND ProteinChip)에 가하고, PBSII(Ciphergen, 캘리포니아 프레몬트 소재)로 펩티드 맵핑을 실시하였다. 프로테인 프로스팩터(Protein Prospector)라는 프로그램의 MS-피트라는 데이터베이스 검색 도구(http://prospector.ucsf.edu)를 이용하여 펩티드 질량 핑거프린팅(peptide mass fingerprinting)을 수행하였다. 2-D 겔 내 스팟의 위치 측정 결과를 바탕으로 하여 다수의 제한 위치에 대해서 초기 검색을 실시하였다: 종 = 호모 사피엔스(homo sapiens), pI 범위 = 6∼9.5, 질량 범위 = 35∼50 kDa.
RT - PCR 분석
TRIzol® 시약(Invitrogen)을 이용하여 HepG2, Hep3B, Huh7 및 포커스 세포주로부터 전 세포 RNA를 추출하였다. 제1 사슬 cDNA를, 반응 혼합물 20 ㎕ 중에서 RT-PCR(AMV)용 제1 사슬 cDNA 합성 키트(Roche Diagnostics, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 이용하여 랜덤 헥사머와 AMV RT와 함께 전 RNA 250 ng으로 합성하였다. 50 ng의 cDNA와 고 신뢰성 PCR 마스터(High Fidelity PCR Master; Roche Diagnostics)를 이용하여, 열 순환 반응기(MJ Research Inc., 매사츄세츠주 월담 소재) 내에서 PCR을 실시하였다. 각각의 Wnt 리간드에 대한 프라이머 쌍을 이하 표 1에 나열하였다. 각 프라이머의 최종 농도는 250 nM이었다. 처음에 94℃에서 4분 동안 변성시킨 후, 다음과 같은 온도 프로그램에 따라서 반응을 35회 반복 수행하였다: 94℃, 30초 → 55℃, 30초 → 72℃, 1분 → 최종 증폭 단계; 72℃, 10분. 증폭된 생산물을 브롬화 에티듐 염색한 2% 아가로즈 겔 상에서 분석하였다.
qRT - PCR 검정법
전술한 바와 같이 간 조직과 HCC 세포주로부터 총 RNA 및 RT 반응물을 추출하였다. SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(캘리모니아 포스터 시티 소재, Applied Biosystems), 각 프라이머 400 nM과 cDNA 5 ng(균등한 총 RNA)으로 이루어진 혼합물과, i-사이클러 iQ 다색상 실시간 PCR 검출 시스템(iCycler iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System; 캘리포니아 헤르큘스 소재, Bio-Rad)을 사용하여 qRT-PCR을 수행함으로써, 미지의 시료로부터 Wnt3, Wnt11 및 FZD7의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 열 순환 조건은 처음에 95℃에서 10분 → 95℃에서 15초(40 순환) → 60℃에서 30초 → 72℃에서 30초이었다. Wnt3, Wnt11, FZD7 및 18S rRNA에 대한 프라이머 서열은 다음과 같았다:
(1) Wnt3, 5'-ACTTCGGCGTGTTAGTGTCC-3'(전방향)(서열 번호 68) 및 5'-CATTTGAGGTGCATGTGGTC-3'(역방향)(서열 번호 69);
(2) Wnt11, 5'-TTCCGATGCTCCTATGAAGG-3'(전방향)(서열 번호 70) 및 5'-AGACACCCCATGGCACTTAC-3'(역방향)(서열 번호 71);
(3) FZD7, 5'-GCCGCTTCTACCACAGACT-3'(전방향)(서열 번호 72) 및 5'-TTCATACCGCAGTCTCCCC-3'(역방향)(서열 번호 73);
(4) 18SrRNA, 5'-GGACACGGACAGGATTGACA-3'(전방향)(서열 번호 74) 및 5'-ACCCACGGAATCGAGAAAGA-3'(역방향)(서열 번호 75).
앰플리콘의 크기는 Wnt3의 경우 130 bp, Wnt11의 경우 133 bp, FZD7의 경우 54 bp 및 18SrRNA의 경우 50 bp이었다. 1.5% 아가로즈 겔 전기 영동과 브롬화에티듐으로 PCR 산물을 시각화한 다음, PCR 산물을 절개하여 pCR2.1 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. T7 전방향 프라이머와 M13 역방향 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열 결정을 실시하였다. 뉴클레오티드 서열을 확인한 후, pCR 2.1 벡터에 클로닝된 각 PCR 산물을 10배 희석하여 실시간 PCR 기준을 제조하였다. Ct 값을 측정한 후 각 유전자에 대한 표준 곡선으로 비교하여 18SrRNA에 대해 정규화함으로써, 미지의 시료 중 Wnt3, Wnt11 및 FZD7 mRNA의 복사체 수를 정량화하였다. 실험은 2회 실시하였다.
플라스미드 및 항 Wnt3 Ab 의 제조
인간 Wnt3 플라스미드의 C-말단에는 원래의 플라스미드에는 존재하는 22개의 아미노산이 결실되어 있기 때문에, 인간 Wnt3의 서열[HindIII 및 EcoRII 제한 효소 위치를 통하여 pcDNA™3.1/myc-His A (Invitrogen)에 클로닝됨]을 바탕으로 한 PCR 증폭 과정을 3회 실시하여 전장 서열이 되도록 증폭시켰다. 프라이머 서열은 다음과 같았다:
5'-TAGTTAAGCTTACCATGGAGCCCCACCTGCTC-3'(전방향)(서열 번호 76),
5'-GCAGCTGACGTAGCAGCACCAGTGGAAGATGCAGTG-3'(역방향-1)(서열 번호 77),
5'-GTAGATGCGAATACACTCCTGGCAGCTGACGTAGCA-3'(역방향-2)(서열 번호 78),
5'-TGCTTGAATTCCTTGCAGGTGTGCACGTCGTAGATGCGAATACA-3'(역방향-3)(서열 번호 79).
인간 Wnt3의 259∼274번 아미노산(259LRAKYSLFKPPTERDL274)(서열 번호 80)에 상응하는 합성 펩티드에 대한 토끼의 폴리클로날 항체를 제조하였다. 펩티드 서열은 Wnt 군에 속하는 다른 일원들 또는 기타 공지의 단백질의 상동성이 거의 없었다. myc-태깅된 Wnt3 플라스미드로 형질 감염된 HCC 세포주를 이용하는 웨스턴 블럿 분석법으로 항체의 특이성을 확인하였다.
세포 배양액
Hep3B, Huh7 및 포커스 세포주를, 10% FBS 및 1× 최소 필수 배지 불 필수 아미노산 용액(Sigma)이 보충된 MEM 중에서 배양하였다. HepG2 세포에는 β-카테닌 유전자(31)가 결실된 돌연 변이가 발생하였으므로, 이 HepG2 세포는 제외하였다. 제조자의 지침에 따라서, LipofectAMINE 2000(Invitrogen) 또는 TransIT-LT1(위스콘신 주 매디슨 소재, Mirus)을 사용하여 70%의 합류 상태가 되었을 때 형질 감염 실험을 실시하였다. pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH(32)로 세포를 형질 감염 시킨 후, 루시퍼라제 검정 시스템(위스콘신주 매디슨 소재, Promega)을 이용하여 Tcf 전사 활성을 분석하였다. β-갈락토시다제 활성을 형질 감염 대조구로서 이용하여 루시퍼라제 활성에 관한 미처리 데이터를 정규화하였다. 결과를 입증하기 위해 실험을 3회 반복 수행하였다.
HCC 세포 내 Wnt3 과발현의 효과
HCC 세포를 pcDNA3/myc-His A(대조구 플라스미드) 또는 Wnt3 플라스미드, pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH, 및 β-갈락토시다제 플라스미드로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 24 시간 경과시, 세포를 0% FBS MEM 중에서 24 시간 동안 항온 처리한 후, 1% FBS MEM을 첨가하여 배양을 촉진하였다. 배양 촉진 후 2 시간 및 24 시간 경과시 세포를 수집하여, Wnt3 및 β-카테닌에 대한 루시퍼라제 검정법 및 웨스턴 블럿 분석법을 수행하였다.
항 Wnt3 항체의 효과
실험을 차단하기 위해, 세포를 12웰 평판에 접종하고, 이를 전술한 β-갈락토시다제 플라스미드와 함께 pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH로 형질 감염시켰다. 24 시간 동안 혈청을 뺀 후, 세포를 항Wnt3 Ab 또는 대조구 Ab(10㎍/㎖)를 함유하는 1% FBS MEM과 함께 항온 처리하고, 이와 같이 항온 처리 후 24 시간 경과시 세포를 수집하였다. 정상의 토끼 IgG(Upstate, 매사츄세츠주 월담 소재)는 대 조구 항체로 사용하였다.
siRNA 의 효과
대조구 siRNA 및 Wnt3 siRNA[WNT3-1: 5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3'(서열 번호 81), WNT3-2: 5'-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3'(서열 번호 82), WNT3-3: 5'-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3'(서열 번호 83)]를 앰비온(Ambion; 텍사스주 오스틴 소재)으로부터 구입하고, 이것들을 10 또는 100 nM의 농도로 pSUPER8xTOPFLASH 또는 pSUPER8xFOPFLASH, 그리고 β-갈락토시다제 플라스미드와 함께[TransIT-LT1 또는 DharmaFECT 4(일리노이주 시카고 소재, Dharmacon) 사용] HCC 세포에 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 48 시간 경과시, Wnt3 및 Tcf 전사 활성의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR 및 루시퍼라제 검정법으로 각각 측정하였다.
상처 치유시 항 Wnt3 Ab 를 차단하였을 때의 효과
포커스 세포를 6-웰 평판에 도말하였다. 200 ㎕들이 멸균 플라스틱 마이크로피펫의 끝 부분으로 합류 단일층 세포에 상처를 입혔다. 이후, 세포를 항Wnt3 Ab 또는 토끼 IgG을 함유하는 배지로 처리하고, 상이한 시점에서 이 세포의 사진을 촬영하였다.
웨스턴 블럿 분석법
총 단백질을 추출하기 위해, 세포를 프로티나제 억제제(Roche Diagnostics)를 함유하는 용균 완충액(30 mM Tris, pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 10% 글리세롤 및 2mM EDTA) 중에서 균질화한 후, 초음파 처리를 하였다. BCA 단백질 검정 키트(일리노이주 록포드 소재, Pierce)와 BSA(표준)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 12∼15%의 SDS-PAGE를 이용하여 동량의 단백질(150 ㎍)을 분리하고, 이를 PVDF 막(PerkinElmer, 메사츄세츠주 웰레슬리 소재)에 옮겼다. 0.1% Tween 20을 함유하는 Tris-완충 염수 중 5% BSA로 상기 막을 차단한 다음, 이를 마우스 모노클로날 항myc Ab(1:1,000 희석)(Santa Cruz Biotechnology Inc., 캘리포니아 산타크루즈 소재), 토끼 폴리클로날 항Wnt3 Ab(1:200 희석), 마우스 모노클로날 항β-카테닌 Ab(1:1,000 희석)(Transduction Laboratories, 캘리포니아 샌 디에고 소재), 또는 토끼 폴리클로날 항hsp90 Ab(1:2,000 희석)(Santa Cruz Biotechnology Inc.)과 함께 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 0.1% Tween 20을 함유하는 Tris-완충 염수로 세척한 다음, 막을 실온에서 1 시간 30분 동안 2차 HRP 항체(1:10,000 희석)와 함께 항온 처리한 후, 화학 발광 이미지 형성 웨스턴 블럿 전광법(PerkinElmer)으로 시각화하였다.
인간 HCC 조직
17쌍의 HCC와 매칭되지만 이것들과 관련되지는 않은 종양 주위 간 조직을 대한민국 및 남아프리카로부터 구하였다. 시료 중 12쌍은 절제 수술을 받은 대한 민국 국적의 환자로부터 얻었다. 12명의 환자들 중 9명은 남성이었으며, 중간 나이는 52세이었다(범위: 22∼67세). 11명의 환자들은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)에 대해 양성이었으며, 나머지 1명은 병인이 밝혀지지 않은 상태였다. 7명의 환자(58%)는 간경화 진행중이었다. 결장암이 간까지 전이되어 간 절제술을 받은 대한 민국 국적의 환자로부터 5개의 간 조직을 구하여, 이를 정상 간 조직에 대한 대조구로서 사용하였다. 환자 중 4명은 남성이었으며, 중간 나이는 46 세(범위: 37∼57세)였다. 해부학적으로 관찰한 결과, 주위를 둘러싸고 있는 종양 주위 간 조직에서는 어떠한 병상도 관찰되지 않았다.
β- 카테닌에 대한 면역 조직 화학
포르말린 고정되어 파라핀에 묻혀있는 검편을 자일렌에 담가 두어 파라핀을 제거한 다음, 에탄올의 농도를 감소시키면서 재 수화하였다. 검편을 10분 동안 마이크로파 오븐에서 가열한 10 mM의 시트르산나트륨 완충액(pH6.0) 중에 침지시키고, 이를 다시 실온으로 냉각시켜 에피토프를 부활시켰다. 이후 슬라이드를 제조자의 지침에 따라서 유니버설 DakoCytomation LSAB® + Kit, 퍼옥시다제(DAKO Corp., 캘리포니아 카핀테리아 소재)로 가공 처리하였다. 이를 3% 과산화수소와 내인성 아비딘/바이오틴 차단 키트(Endogenous Avidin/Biotin Blocking Kit; Zymed Laboratories Inc., 캘리포니아 사우스 샌 프란시스코 소재)를 이용하여 내인성 퍼옥시다제, 아비딘 및 바이오틴 활성을 차단시켰다. 항인간 β-카테닌 모노클로날 Ab를 1:500 희석시킨 용액과 함께 검편을 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 네가티브 대조구로서, 1차 항체를 PBS와 바꾸었다. β-카테닌 발현 패턴을 핵 염색이 되는지 여부에 따라서 2개의 군으로 분류하였다. 종양 조직의 세포질을 염색하여 종양 주위 조직의 염색 결과와 비교하였다.
β- 카테닌 유전자의 엑손-3에 대한 돌연 변이 분석
Wong외 다수(11)의 방법을 약간 변형시킨 방법으로 β-카테닌 유전자의 엑손 3 돌연 변이를 분석하였다. 간단히 말해서, β-카테닌 유전자 엑손 3의 218 bp 단편을, 확장 고 신뢰성 PCR 시스템(Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnostics)을 이용하여 HCC와 이를 둘러싸는 종양 주위 간 조직의 cDNA(50 ng)로부터 증폭시켰다. 프라이머 서열은 5'-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3'(전방향)(서열 번호 84) 및 5'-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3'(역방향)(서열 번호 85)였다. 열 순환 조건은 처음에 94℃에서 3분(변성 단계) → 95℃에서 30초(35 순환) → 58℃에서 30초 → 72℃에서 30초이었다. PCR 산물을 시각화한 다음, 이 PCR 산물을 pCR 2.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝 한 후, T7 전방향 프라이머 및 M13 역방향 프라이머를 이용하여 서열 결정하였다. 각 PCR 산물로부터 5개 이상의 클론을 얻어 이를 서열 결정하여 분석하였다.
결과
HCC 세포주 내 Wnt 리간드의 동정
Wnt 단백질은 주로 세포 표면에 존재하는 ECM과 결합되어 있기 때문에, 세포 표면 HSPG 예를 들어, Wnt 단백질(들)을 Huh7 세포 결합형으로서 정제하고자 시도하였다. 트립신 처리하여 생산된 Huh7-HSPG를 헤파린-아가로즈 친화성 수지에 가하여 예비-분획화를 실시하였다. 용리된 분획물을 SDS-PAGE에 가한 다음, 이를 헤파린 처리 및 비처리 시료의 단백질 밴드와 비교하였다. 0.25 M NaCl 용리 분획을 관찰한 결과, 헤파린 미처리 분획에서 대략 45 kDa의 단백질 밴드가 나타났다(데이터는 제시하지 않음). Wnt 단백질의 예측 분자량은 35∼45 kDa에 해당하기 때문에, 이 단백질 밴드는 잠재적으로 Wnt 단백질을 포함하는 것으로 간주되었다. 이 단백질 밴드를 규명하기 위해 2차원 전기 영동을 수행하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 헤파린 처리 시료와 헤파린 미처리 시료 간 단백질 발현 수준이 상이한 몇몇 은-염색 단백질 스팟이 형성되었다. 분자량 35∼55 kDa이고 pI 5∼9.5인 단백질 스팟을 Wnt 리간드 단백질에 대한 후보 물질인 것으로 간주하였다. Wnt 단백질은 헤파린 처리에 의해 방출될 수 있으므로, 헤파린 미처리 시료 중 2개의 상향 조절 단백질 스팟을 조사하였다. 은-염색 2차원 겔로부터 절개한 단백질 스팟을 겔내 분해시킨 다음, 질량 분광 분석법에 의해 펩티드 맵핑하였다. 데이터 분석 결과, 9개의 펩티드가 인간 Wnt11 단백질과 매치되었음을 알 수 있었다(도 1b). 이러한 관찰 결과를 확실히 뒷받침하기 위하여, 공지의 인간 Wnt 리간드 모두에 특이적인 19쌍의 프라이머를 이용하는 RT-PCR을 통해, HCC 세포주 내 Wnt mRNA 발현 여부를 관찰하였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 관찰된 19개의 Wnt 유전자 모두 중 Wnt3와 Wnt11 mRNA만이 HCC 세포주 내에서 발현되었다. 기타 공지된 Wnt mRNA는 그 어느 것도 RT-PCR에 의해 검출되지 않았다. Wnt3과 Wnt11을 HCC 세포주 내에서 동정한 후, 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR) 검정법으로 이 HCC 세포주 내에서의 mRNA 발현 수준을 관찰하였다. HCC 세포주 내에서의 Wnt3 mRNA 발현 수준(평균 ± SE)은, HepG2의 경우 370.0 ± 10.3, Hep3B의 경우 381.3 ± 12.7, Huh7의 경우 95.2 ± 6.3이었으며, 109 개의 18S 리보좀 RNA(18SrRNA)당 210.4 ± 9.5개 복사체였다. Wnt11 mRNA 발현 수준은, HepG2의 경우 8,499.3 ± 845.0, Hep3B의 경우 290.9 ± 40.1이었으며, Huh7 세포 중 109 개의 18S 리보좀 RNA(18SrRNA)당 3.57 ± 0.2개 복사체였다. Wnt11 mRNA는 실시간 RT-PCR을 이용하였을 경우 포커스 세포 내에서는 검출되지 않았는데, 이는 종래의 RT-PCR을 이용하였을 때에도 마찬가지였다(도 2b).
인간 HCC 조직 내 Wnt3 , Wnt11 및 FZD7 mRNA 의 발현
컷-오프 수준을 정상 간 조직 내 평균 ± 3 SD의 값으로 정의하였을 때, 17개의 HCC 조직 중 13개(76.5%)와 17개의 종양 주위 조직 중 10개(58.8%)의 Wnt3 mRNA 발현 수준은 정상 대조구의 경우에 비하여 증가하였다. 정상 간 조직에 비하여 1개의 종양 주위 조직에서만이 발현 수준이 감소하였음을 알 수 있었다. 17쌍의 시료 중, 12쌍(70.6%)에서는 종양 내 Wnt3 mRNA 발현 수준이 상응하는 종양 주위 조직의 경우에 비하여 증가하였음을 알 수 있었으나, 그 증가 폭은 통계학적으로 유의적이지 않았다[P = 0.435, 윌콕슨 순위합 검정](도 3a). Wnt3의 경우와는 반대로, 17쌍의 시료 중 11쌍(64.7%)에서는 종양 내 Wnt11 mRNA 발현 수준이 상응하는 종양 주위 조직의 경우에 비하여 증가하였음을 알 수 있었으나, 그 증가 폭은 통계학적으로 유의적이지 않았다[P = 0.227, 윌콕슨 순위합 검정]. 그러나, 17개의 종양 조직 중 7개(41.2%)에서는 발현 수준이 정상 간 조직의 최하 컷-오프 수준보다도 낮았던 반면에, 종양 주위 조직의 경우는 그렇지 않았다[P = 0.0036, 피셔 적합 검정]. 17개의 종양 조직 중 5개(29.4%)에서는, Wnt11 mRNA 발현 수준이 정상 간 조직의 경우보다 증가하였으나, 종양 주위 조직의 경우에는 17개 중 9개(52.9%)가 그러하였다. HCC 조직과 종양 주위 조직 모두에서는, FZD7 mRNA 발현 수준이 정상 간 조직의 경우에 비하여 17개의 시료 중 10개꼴로(58.8%) 증가하였다(도 3b). 17개 쌍 중 12개(70.6%)에서는, 종양 내 FZD7 mRNA 발현 수준이 상응하는 종양 주위 조직에 비하여 증가하였는데, 그 차이는 통계학적으로 유의적인 수준이었다[P = 0.031, 윌콕슨 순위합 검정](도 3c).
β- 카테닌의 핵 내 축적
면역 조직 화학적 염색을 통하여, 17개의 HCC 조직 중 7개(41%)에서 β-카테닌이 핵 내 축적됨을 알 수 있었다. 주변을 둘러싸고 있는 종양 조위 조직의 핵에는 β-카테닌이 전혀 축적되지 않았다(도 4). β-카테닌이 핵 내에 축적된 7개의 시료 모두의 경우는 세포질 내에도 β-카테닌이 축적되어 염색 밀도가 진하였다. β-카테닌이 핵 내에 축적되지 않은 10개의 종양 조직들 가운데에 1개의 시료에서는 β-카테닌에 대한 세포질 염색 밀도가, 이 종양 조직에 상응하는 종양 주위 조직에 비하여 진하였다.
서열 결정 분석법에 의하여, 17개의 HCC 시료 중 4개(23.5%)에서 β-카테닌 유전자의 엑손 3에 돌연 변이가 발생하였던 반면에, 이를 둘러싸고 있는 종양 주위 조직의 경우에는 돌연 변이가 발생하지 않았음을 알 수 있었다. 이 돌연 변이는 모두 35번, 37번 및 45번 코돈(2개는 I35S, 하나는 S37C, 그리고 하나는 S45F)에 일어난 단일 미스센스 돌연변이였다. β-카테닌이 핵 내에 축적된 7개의 시료 중 3개(42.9%)를 면역 조직 화학적 방법으로 염색한 결과, β-카테닌의 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)에 관여하는 부위에 돌연 변이가 일어났음을 알 수 있었다. β-카테닌 유전자(I35S)에 돌연 변이가 일어났으나 β-카테닌이 핵 내에 축적되지 않은 시료 하나를 면역 조직 화학적 방법으로 염색한 결과, 세포질이 진하게 염색되었다. β-카테닌이 핵 내에 축적되었으나 β-카테닌 유전자에는 어떠한 돌연 변이도 발생하지 않은 나머지 4개의 시료 모두에서는, FZD7 mRNA 수준이 이와 쌍을 이루는 종양 주위 조직의 경우에 비하여 증가하였다. FZD7 mRNA 수준도 또한 정상 간 조직의 평균 값에 비하여 7∼74배 증가하였다. 그러나, Wnt3 및/또는 Wnt11의 mRNA 발현 수준은 β-카테닌이 핵 내에 축적되는지 여부와는 관련이 없었다.
HCC 세포주 내 Wnt3 과발현의 효과
HCC 내 정형화된 Wnt 경로에 Wnt3가 미치는 효과를 측정하기 위하여, Wnt3 플라스미드로 형질 감염시킨 이후에 T-세포 인자(Tcf) 전사 활성의 변화를 관찰하였다. Wnt3 플라스미드로 형질 감염한 결과, 도 5a에 도시한 바와 같이, mRNA 발현 수준(데이터는 제시하지 않음)과 단백질 발현 수준이 모두 눈에 띄게 증가하였다. Tcf 전사 활성은 또한 대조구에 비하여 포커스 세포의 경우, 약 3배 정도 증가하였으며, 이는 통계학적으로 유의적인 수준이었다(P < 0.01). 그러나, Tcf 전사 활성은, 특히 성장 자극 이후 24 시간 경과시, Hep3B 세포에서는 변하지 않았으며, 심지어 Huh7 세포의 경우에는 감소하였다(도 5b). 이러한 결과와 마찬가지로, 세포 내 β-카테닌 수준은 웨스턴 블럿 분석에 의해 입증된 바에 의하면, 포커스 세포의 경우 Wnt3 플라스미드로 형질 감염된 이후에 증가하였으나, Hep3B 또는 Huh7 세포의 세포 내 β-카테닌 수준은 변함없거나 또는 감소하였음을 알 수 있었다(도 5a).
항 Wnt3 Ab 또는 Wnt siRNA 에 의한 Wnt 신호 전달의 길항 작용
다음으로, 기준 Tcf 전사 활성과 세포 내 β-카테닌 수준은, 포커스 세포의 경우에 비하여 Huh7 및 Hep3B 세포의 경우가 높았기 때문에, HCC 세포주의 정형화된 경로를 항Wnt3 Ab 또는 siRNA가 억제하는 효과를 관찰하였다(도 5). 폴리클로날 항Wnt3 Ab와 함께 항온 처리한 결과, 루시퍼라제 활성은 Huh7의 경우에는 60%, Hep3B의 경우에는 26%, 그리고 포커스 세포의 경우에는 40% 감소하였다(도 6a). 이러한 정형화된 경로에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여, Wnt3에 대한 siRNA를 사용하였다. 우선, 3가지의 상이한 종류의 siRNA의 억제 효율을 qRT-PCR 검정법을 이용하여 Huh7 및 Hep3B 세포 내에서 측정하였다. 100 nM의 농도에서 mRNA 수준을 평균 50∼60% 까지 감소시킨 것으로 보아, siRNA Wnt3-3이 가장 효율적임을 알 수 있었다(데이터는 제시하지 않음)(도 6b). 이와 같이 mRNA가 감소함에 따라서, Tcf 전사 활성 또한, Huh7의 경우에는 48.5%, Hep3B의 경우에는 33%, 그리고 포커스 세포의 경우에는 43.5% 감소하였다(도 6c). 그러므로, Wnt3가 억제되면, HCC 세포주의 정형화된 경로도 억제됨을 알 수 있었다.
HCC 세포 내 상처 치유 과정에 있어서 항 Wnt3 Ab 처리의 효과
Tcf 전사 활성을 억제하면 HCC 세포의 거동을 기능적으로 변화시키는지 여부에 관하여도 관찰하였다. 포커스 세포를 이용한 상처 치유 검정법을 수행한 결과, 항Wnt3 Ab 처리한 세포의 경우에는 상처 치유 과정이 지연되었음을 알 수 있었으며, 이러한 변화는 24 시간 경과시에 가장 두드러졌다. 24 시간 경과시, 대조구 Ab로 처리된 포커스 세포 내 대부분의 상처는 이주성 세포 및/또는 증식성 세포로 덮여졌던 반면에, 항Wnt3 Ab 처리된 세포의 경우에는 그러하지 않았다(도 7).
본 연구를 통하여 간 및 HCC에서의 Wnt 리간드 발현 패턴을 분석하였다. Wnt3과 Wnt11의 mRNA는 종래의 RT-PCR과 qRT-PCR 방법을 이용하여 시험한 결과 대부분의 HCC 세포주에서 발현되었음을 알 수 있었다. Wnt11의 단백질 발현 수준은 또한 단백체학(proteomics) 기술을 이용하여 입증되었다. 이와 같은 HCC 세포주 내 에서의 관찰 결과와 마찬가지로, Wnt3 및 Wnt11 mRNA 발현 여부는 또한 HCC에 포함된 인간의 간 조직에서 확인되었다.
Wnt3, Wnt11 및 FZD7의 발현 패턴을 인간 간 조직 예를 들어, HCC 조직 및 상응하는 종양 주위 조직에서 관찰하였다. 종양 조직 내 FZD7의 mRNA 수준은 상응하는 종양 주위 조직과 정상 간 조직 내 mRNA 수준보다 높았다. HCC와 종양 주위 조직 간 Wnt3 mRNA 발현 수준의 차이는 통계학적으로 유의적이지는 않았지만, HCC의 71%에서는 이와 상응하는 종양 주위 조직에 비하여 Wnt3 발현 수준이 증가하였음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, HCC 조직의 77%와 종양 주위 조직의 59%의 경우에는 Wnt3 mRNA 발현 수준이 정상 간 조직의 "평균 ± 3SD" 값보다 컸음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, Wnt3는 간암 발병 과정의 초기에 상향 조절될 수 있으며/있거나, 이는 간 염증과 간 괴사 진행시 간 세포를 재생시키는데에 중요한 역할을 하는 것으로 파악된다.
또한, 쌍을 이루는 HCC 시료의 65%에서는 종양 내 Wnt11 mRNA의 발현 수준이, 상응하는 종양 주위 조직에 비하여 감소하였음을 알 수 있었다. 종양 조직의 41%에서는 Wnt11 발현 수준이 정상 간 조직의 최하 컷-오프 수준 이하까지 감소하였음을 알 수 있었다. 이러한 관찰 결과는 Wnt11이 정형화된 경로의 억제제로서 역할을 한다는 것을 뒷받침해주는 사실이었다.
Tcf 전사 활성이 3배 증가하였고 세포 내 β-카테닌 수준이 상승한 것으로 판단하건대, Wnt3 과발현은 또한 포커스 세포 내 정형화된 Wnt 경로를 활성화시키는 것으로 파악되었다. 그러나, Tcf 전사 활성은 Hep3B 세포에서는 변함이 없었으 며, 심지어 Huh7 세포에서는 약간 감소하기까지 하였고, 형질 감염 이후에는 Wnt3 mRNA와 단백질 발현 수준은 눈에 띄게 상승하였다.
폴리클로날 항Wnt3 Ab 또는 siRNA에 의해 Wnt3이 억제되면, 3개의 HCC 세포주 모두에 있어서 Tcf 전사 활성은 감소하였다. 이러한 변화는 기준 Tcf 전사 활성이 가장 높았던 Huh7 세포에서 가장 두드러졌다. 뿐만 아니라, 포커스 세포를 항Wnt3 Ab로 처리하면, 상처 치유 과정을 억제하였는데, 이로써 이 억제 작용 결과는 세포의 이주성과 증식성을 감소시킨다는 사실을 알 수 있다.
17개의 HCC 조직 중 8개(47%)에서는 β-카테닌이 핵 내 및/또는 세포질 내에축적되었으며, 이들 중 절반은 β-카테닌 유전자에 돌연 변이가 발생하였다. β-카테닌이 축적되었지만 돌연 변이는 일어나지 않은 나머지 4가지 경우에서는 종양 내 FZD7의 수준이 눈에 띄게 상승하였는데, 이로써 FZD7의 상향 조절은 종양 내 정형화된 Wnt 신호 전달 경로의 활성화와 직접적으로 관련이 있음을 알 수 있다. Wnt3 또는 Wnt11의 발현 수준은 β-카테닌 축적 또는 FZD7 축적 어느 것과도 관련이 없었다.
결론적으로, Wnt3과 Wnt11은 HCC 세포주와 이 HCC 조직을 포함하는 인간 간 조직에서 확인되었다. Wnt3 mRNA 발현 수준은 정상의 간 조직에 비하여 HCC 및 종양 주위 조직 모두에서 상향 조절되었다. Wnt11 mRNA 발현은 HCC 조직 내에서는 하향 조절되었다. 항Wnt3 Ab 또는 siRNA에 의해 Wnt3이 억제되면 정형화된 Wnt 신호 전달 경로가 방해되어 상처 치유가 지연되었으나, Wnt3을 촉진시키면 포커스 세포 내 Tcf 전사 활성은 증가하였다. 이러한 관찰 결과는, Wnt3가 간암 발병 과정 중 β-카테닌에 돌연 변이를 일으키지 않고, 정형화된 Wnt 신호 전달 경로를 활성화시키고 FZD7을 과발현시키는 천연의 Wnt 리간드임을 시사하는 것이다.
[참고 문헌]
Figure 112007030119892-pct00001
Figure 112007030119892-pct00002
Figure 112007030119892-pct00003
Figure 112007030119892-pct00004
Figure 112007030119892-pct00005
지금까지 본 발명의 다수의 구체예를 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상과 범위에서 벗어남이 없이, 본 발명을 더욱 다양하게 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 다른 구체예들도 이하 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner <120> WNT PROTEINS AND DETECTION AND TREATMENT OF CANCER <130> 18121-003WO2 <140> PCT/US2005/033775 <141> 2005-02-20 <150> US 60/612,098 <151> 2004-09-21 <160> 85 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Asp Pro Gly Ala Ala Val Pro Leu Ser Ser Leu Gly Phe Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ala Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Gln Pro Tyr His Gly Glu Lys Gly Ile Ser Val Pro Asp His Gly Phe 35 40 45 Cys Gln Pro Ile Ser Ile Pro Leu Cys Thr Asp Ile Ala Tyr Asn Gln 50 55 60 Thr Ile Leu Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gln Glu Asp Ala Gly 65 70 75 80 Leu Glu Val His Gln Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gln Cys Ser Pro 85 90 95 Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr Val 100 105 110 Leu Asp Gln Ala Ile Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala Arg 115 120 125 Gln Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gln Trp Pro Glu 130 135 140 Arg Leu 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musculus <400> 20 Met Phe Leu Met Lys Pro Val Cys Val Leu Leu Val Thr Cys Val Leu 1 5 10 15 His Arg Ser His Ala Trp Ser Val Asn Asn Phe Leu Met Thr Gly Pro 20 25 30 Lys Ala Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Ser Val Ala Ala Gly Ala Gln Ser 35 40 45 Gly Ile Glu Glu Cys Lys Tyr Gln Phe Ala Trp Asp Arg Trp Asn Cys 50 55 60 Pro Glu Arg Ala Leu Gln Leu Ser Ser His Gly Gly Leu Arg Ser Ala 65 70 75 80 Asn Arg Glu Thr Ala Phe Val His Ala Ile Ser Ser Ala Gly Val Met 85 90 95 Tyr Thr Leu Thr Arg Asn Cys Ser Leu Gly Asp Phe Asp Asn Cys Gly 100 105 110 Cys Asp Asp Ser Arg Asn Gly Gln Leu Gly Gly Gln Gly Trp Leu Trp 115 120 125 Gly Gly Cys Ser Asp Asn Val Gly Phe Gly Glu Ala Ile Ser Lys Gln 130 135 140 Phe Val Asp Ala Leu Glu Thr Gly Gln Asp Ala Arg Ala Ala Met Asn 145 150 155 160 Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Lys Ala Val Lys Gly Thr Met Lys 165 170 175 Arg Thr Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly Ser Cys Thr Thr Gln Thr 180 185 190 Cys Trp Leu Gln Leu Pro Glu Phe Arg Glu Val Gly Ala His Leu Lys 195 200 205 Glu Lys Tyr His Ala Ala Leu Lys Val Asp Leu Leu Gln Gly Ala Gly 210 215 220 Asn Ser Ala Ala Gly Arg Gly Ala Ile Ala Asp Thr Phe Arg Ser Ile 225 230 235 240 Ser Thr Arg Glu Leu Val His Leu Glu Asp Ser Pro Asp Tyr Cys Leu 245 250 255 Glu Asn Lys Thr Leu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Arg Glu Cys Leu 260 265 270 Arg Arg Gly Arg Ala Leu Gly Arg Trp Glu Arg Arg Ser Cys Arg Arg 275 280 285 Leu Cys Gly Asp Cys Gly Leu Ala Val Glu Glu Arg Arg Ala Glu Thr 290 295 300 Val Ser Ser Cys Asn Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Ala Val Arg Cys 305 310 315 320 Glu Gln Cys Arg Arg Arg Val Thr Lys Tyr Phe Cys Ser Arg Ala Glu 325 330 335 Arg Pro Pro Arg Gly Ala Ala His Lys Pro Gly Lys Asn Ser 340 345 350 <210> 21 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Arg Ala Arg Pro Gln Val Cys Glu Ala Leu Leu Phe Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Gln Thr Gly Val Cys Tyr Gly Ile Lys Trp Leu Ala Leu Ser Lys 20 25 30 Thr Pro Ser Ala Leu Ala Leu Asn Gln Thr Gln His Cys Lys Gln Leu 35 40 45 Glu Gly Leu Val Ser Ala Gln Val Gln Leu Cys 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Asp Ser Glu 260 265 270 Leu Val Tyr Leu Gln Ser Ser Pro Asp Phe Cys Met Lys Asn Glu Lys 275 280 285 Val Gly Ser His Gly Thr Gln Asp Arg Gln Cys Asn Lys Thr Ser Asn 290 295 300 Gly Ser Asp Ser Cys Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Pro 305 310 315 320 Tyr Thr Asp Arg Val Val Glu Arg Cys His Cys Lys Tyr His Trp Cys 325 330 335 Cys Tyr Val Thr Cys Arg Arg Cys Glu Arg Thr Val Glu Arg Tyr Val 340 345 350 Cys Lys <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Glu Ser Ala Phe Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ile Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Ala Cys Thr Ser Gly Asp Leu Pro Gly Cys Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asn Arg Trp Gly Gly Cys Ala Asp Asn Leu Ser Tyr Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Ile Arg Thr Cys Trp 1 5 10 15 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Leu Val Tyr Leu Gln Ser Ser Pro Asp Phe Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 354 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Arg Ala Arg Pro Gln Val Cys Glu Ala Leu Leu Phe Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu His Thr Gly Val Cys Tyr Gly Ile Lys Trp Leu Ala Leu Ser Lys 20 25 30 Thr Pro Ala Ala Leu Ala Leu Asn Gln Thr Gln His Cys Lys Gln Leu 35 40 45 Glu Gly Leu Val Ser Ala Gln Val Gln Leu Cys Arg Ser Asn Leu Glu 50 55 60 Leu Met Arg Thr Ile Val His Ala Ala Arg Gly Ala Met Lys Ala Cys 65 70 75 80 Arg Arg Ala Phe Ala Asp Met Arg Trp Asn Cys Ser Ser Ile Glu Leu 85 90 95 Ala Pro Asn Tyr Leu Leu Asp Leu Glu Arg Gly Thr Arg Glu Ser Ala 100 105 110 Phe Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ala Thr Ile Ser His Thr Ile Ala Arg 115 120 125 Ala Cys Thr Ser Gly Asp Leu Pro Gly Cys Ser Cys Gly Pro Val Pro 130 135 140 Gly Glu Pro Pro Gly Pro Gly Asn Arg Trp Gly Gly Cys Ala Asp Asn 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Gly Leu Leu Met Gly Ala Lys Phe Ser Asp Ala Pro Met 165 170 175 Lys Val Lys Lys Thr Gly Ser Gln Ala Asn Lys Leu Met Arg Leu His 180 185 190 Asn Ser Glu Val Gly Arg Gln Ala Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Lys 195 200 205 Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Ile Arg Thr Cys Trp 210 215 220 Lys Gly Leu Gln Glu Leu Gln Asp Val Ala Ala Asp Leu Lys Thr Arg 225 230 235 240 Tyr Leu Ser Ala Thr Lys Val Val His Arg Pro Met Gly Thr Arg Lys 245 250 255 His Leu Val Pro Lys Asp Leu Asp Ile Arg Pro Val Lys Asp Ser Glu 260 265 270 Leu Val Tyr Leu Gln Ser Ser Pro Asp Phe Cys Met Lys Asn Glu Lys 275 280 285 Val Gly Ser His Gly Thr Gln Asp Arg Gln Cys Asn Lys Thr Ser Asn 290 295 300 Gly Ser Asp Ser Cys Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Pro 305 310 315 320 Tyr Thr Asp Arg Val Val Glu Arg Cys His Cys Lys Tyr His Trp Cys 325 330 335 Cys Tyr Val Thr Cys Arg Arg Cys Glu Arg Thr Val Glu Arg Tyr Val 340 345 350 Cys Lys <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 gaaatcccat caccatcttc cag 23 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 atgagtcctt ccacgatacc aaag 24 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 tgttgcctgg ctgggtttc 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ctgtaagcag gttcgtggag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 gtggatgcaa aggaaaggaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 agccagcatg tcctgagagt 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 acccaagatg gtgccaactt c 21 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 cacaaccgtc tgttcctttt gatg 24 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ggagtgtatt cgcatctacg acg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 cgagttgggt ctgggtcatt tac 23 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ccccactcgg atacttctta ctcc 24 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 ctcctggatg ccaatcttga tg 22 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 tttgtggatg tgcgggagag 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 atctgtgtgc ggcttgaact g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 acacctcttt ccaaacaggc c 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 ggattgttaa actcaactct c 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 ggagcgagag aagaactttg cc 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 gaagcagcac cagtggaact tg 22 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 cttggttatg gaccctaccc aggcatc 27 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 cactgcagca gctcgcccat agaa 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gctgcctggg ccacctcttt ctca 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 cccggtggta caggccttgc ttct 24 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 tcaacgagtg ccagtaccag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ccctcggctt ggttgtagta 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 tccagtttgc ttgggaacgc 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 ccatcacagc cacagttttc g 21 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 catctgtctt ttcacctgtg tcctc 25 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 aatgctgtct cccgattggc 20 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 tctgggtgct cctgttcttc ctac 24 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 attggtgttg gcattcgtgg 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 actgtcccga ggcaagagtt tc 22 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 gcatttccgc ttcaggtttt c 21 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 tgctgacctc aagacccgat ac 22 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 tgtcgcttcc gttggatgtc 20 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 tgccagttcc agttccgctt tg 22 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 ttcacaccca cgaggttgtt g 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 tgagtgccag tttcagttcc g 21 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 cttgtttcct ctcttggacc cc 22 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 ctgctccgat gatgtccagt atg 23 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 cattctctgc cttgtgtccc tg 22 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 acttcggcgt gttagtgtcc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 catttgaggt gcatgtggtc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 ttccgatgct cctatgaagg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 agacacccca tggcacttac 20 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 gccgcttcta ccacagact 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 ttcataccgc agtctcccc 19 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 ggacacggac aggattgaca 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 75 acccacggaa tcgagaaaga 20 <210> 76 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 tagttaagct taccatggag ccccacctgc tc 32 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 gcagctgacg tagcagcacc agtggaagat gcagtg 36 <210> 78 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 gtagatgcga atacactcct ggcagctgac gtagca 36 <210> 79 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 tgcttgaatt ccttgcaggt gtgcacgtcg tagatgcgaa taca 44 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 80 Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Leu Phe Lys Pro Pro Thr Glu Arg Asp Leu 1 5 10 15 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated siRNA <400> 81 ggaaaaaugc cacugcauc 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated siRNA <400> 82 ggaguguauu cgcaucuac 19 <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated siRNA <400> 83 ggcuuaucuu ugcacaugu 19 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 gatttgatgg agttggacat gg 22 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 tgttcttgag tgaaggactg ag 22

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  11. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체.
  12. 제11항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
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  14. 제11항에 있어서, 간암을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
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  20. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 키메릭 항체.
  21. 제20항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
  22. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 인간화된 항체.
  23. 제22항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
  24. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 단일 사슬 항체.
  25. 제24항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
  26. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 Fab 단편.
  27. 제26항의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
  28. 아미노산 서열 LRAKYSLFKPPTERDL(서열 번호 80)에 특이적으로 결합하는 분리된 F(ab')2 단편.
  29. 제28항의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
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