CN111602054A

CN111602054A - 一种从血液诊断癌症的方法

Info

Publication number: CN111602054A
Application number: CN201880069653.1A
Authority: CN
Inventors: 金圣镇; 梁境珉
Original assignee: Next Generation Convergence Technology Research Institute; Medpacto Inc
Current assignee: Medpacto Inc
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2020-08-28
Also published as: CA3080263C; WO2019083262A1; JP7110367B2; CA3080263A1; AU2018354528A1; ES2936208T3; EP3702784B1; AU2018354528B2; JP2021508832A; KR102230314B1; EP3702784A4; JP2022130598A; US20200309779A1; KR20190045638A; EP3702784A1; JP2024038346A

Abstract

公开了一种诊断癌症的方法以及用于诊断癌症的试剂盒，该方法包括以下步骤：将从个体分离的试料与特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合接触；从通过接触所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体中测量所述试料中BAG2的存在或水平；以及将从所述试料测量的BAG2的存在或水平与从对照组测量的BAG2的水平进行比较。

Description

一种从血液诊断癌症的方法

技术领域

本发明涉及一种从血液中存在的BAG2、组织蛋白酶原B或其组合诊断癌症的方法，具体涉及一种三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer)的诊断方法。

背景技术

BAG(co-chaperone Bcl-2-associated athanogene)蛋白质家族介导多种生理过程，包括细胞内蛋白质折叠、应激反应、神经分化、细胞凋亡和细胞增殖等，并在功能上与多种协同蛋白质结合(Takayama and Reed.，2001；Doong et al.，2002)。BAG2为具有抗细胞凋亡活性的BAG结构域家族的成员之一，被称为作为分子伴侣相关泛素连接酶的CHIP(C-terminus of Hsc70-interacting protein)的负调节因子(Arndt et al.，2005；Dai etal.，2005)。BAG2在通过抑制CHIP活性来调节蛋白质中的主要作用与通过分子伴侣相关蛋白质(如PINK1和CFTR)的稳定化的神经退行性疾病和常染色体隐性遗传疾病有关(Qu etal.，2015；Arndt et al.，2005)。已表明，BAG2的表达增加蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡，当甲状腺癌细胞暴露于蛋白酶体抑制剂MG132时，BAG2敲低部分地抑制细胞凋亡，因此BAG2可以具有促凋亡(pro-apoptotic)活性(Wang et al.，2008)。另一方面，已经表明，在各种突变的K-Ras诱导的肿瘤中，BAG2的过表达可以促进强肿瘤基因STK33蛋白的稳定化，从而导致促进肿瘤发生(Azoitei et al.，2012)。然而，尽管有这些发现，但BAG2在癌症进展和转移中，尤其是在乳腺癌中的作用仍不清楚。

组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)为一种具有内源性和外源性肽酶活性的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，被认为在蛋白质循环中起作用(Mort and Buttle，1997)。CTSB合成为惰性/未成熟的原形式(pro-form)酶(41/43kDa)，并通过N端62个氨基酸的前肽的蛋白水解过程转化为活性的短链形式(31kDa)或双链形式(重链(heavy chain)，25/26kDa；轻链(lightchain)，5kDa)。CTSB的异常(aberrant)表达/活性往往与恶性肿瘤有关(Joyceet al.，2004；Withans，2012)。然而公认的是，成熟的CTSB通常位于溶酶体并在溶酶体介导的自噬(autophagy)/细胞凋亡过程中作为抑制剂蛋白酶在蛋白质循环中发挥功能，从而显示出胞质CTSB的抗凋亡作用(Stoka et al.，2001；Foghsgaardet al.，2001；Bhoopathiet al.，2010)。另一方面，尚不清楚CTSB的这种双重功能在癌症进展中的调节剂。

而且，尚未详细研究BAG2和组织蛋白酶B在细胞中存在的位置、分布以及根据细胞功能的位置移位等。

发明内容

技术问题

本发明一方面提供一种诊断癌症的方法，其包括：将从个体分离的试料与特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合接触；从通过接触所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体中测量所述试料中BAG2的存在或水平；以及将从所述试料测量的BAG2的存在或水平与从对照组测量的BAG2的水平进行比较。

本发明另一方面提供一种用于诊断癌症的试剂盒，其检测血液、血清(serum)、血浆(plasma)或其组合中存在的BAG2，并包括所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合。

技术方案

下面将更详细地描述本发明。

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术术语均以本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义相同地使用。另外，尽管本说明书中描述了优选的方法或试料，但与此相似或等同的方法或试料也包括在本发明的范围内。本说明书中作为参考文献记载的所有刊物的内容整体作为参考并入本说明书。

在另一具体实施例中，作为一种提供用于诊断癌症的信息的方法，所述方法用于通过检测个体中癌症的存在来诊断个体中存在的癌症。

当从个体分离的试料中存在BAG2时，特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合可以与所述试料中的BAG2结合。所述抗体或多肽可以用例如荧光团(fluorophore)、发色团(chromophore)或将底物转化为发色团的酶标记，以可视化试料中BAG2的存在。

由于所述结合反应，所述试料中的BAG2与所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合形成复合体，并可以使用本领域技术人员已知的方法从所述复合体中确认BAG2的存在，或者根据需要测量其水平。在一具体实施例中，测量所述复合体的步骤可以通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、双向(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、补体固定分析法(Complement Fixation Assay)、流式细胞分析法(FACS)、蛋白芯片(protein chip)或其组合进行。

可以将从所述试料测量的BAG2的存在或水平与从对照组测量的BAG2的水平进行比较，以诊断所述个体中是否存在癌症。所述对照组可以为取自健康个体的试料，也可以为根据需要取自各种类型的平均乳腺癌患者、非转移性乳腺癌患者或非TNBC型乳腺癌患者的试料。因此，从所述对照组测量的BAG2水平可以是指BAG2水平的取自健康个体的试料，或者根据需要取自各种类型的平均乳腺癌患者、非转移性乳腺癌患者或非TNBC型乳腺癌患者的试料中的BAG2浓度的平均值。用作所述对照组的试料可以与在与用于所述诊断的试料相同的解剖位置收集的试料具有相同的类型。例如，如果所述试料为从个人的肘正中静脉(Median Cubital Vein)收集的血液，则所述对照组也可以为从对照组的肘正中静脉收集的血液。所述健康个体不患有任何急性或慢性疾病，至少不患有癌症，优选地可以不患有乳腺癌。

取自所述健康个体的试料中BAG2的水平可以为实质上不存在BAG2。因此，当将对照组设定为从健康个体获得的值时，如果测量出被诊断的个体中BAG2的存在或其水平明显高，则可以怀疑所述受试者患有癌症。另一方面，如本发明的实施例所示，在乳腺癌患者中转移性乳腺癌患者，尤其TNBC型患者的血液中，BAG2的存在被检测的概率较高并平均值明显高。因此，当将对照组设定为从各种类型的平均乳腺癌患者、非转移性乳腺癌患者或非TNBC型乳腺癌患者分离的试料时，如果测量出被诊断的个体中BAG2的水平高于或明显高于对照组，则所述个体可以被怀疑患有转移性乳腺癌或TNBC型乳腺癌。

在本说明书中，所述“多肽”与“蛋白质”可互换使用。

所述试料从被诊断的个体分离，可以为细胞、器官、细胞裂解液、全血、血液、血清、血浆、淋巴液、细胞外液、体液、尿液、粪便、组织、骨髓、唾液、痰液、脑脊液或其组合。

在一具体实施例中，所述试料可以为血液、血清(serum)、血浆(plasma)或其组合。本发明人已经证明BAG2可以分泌到细胞外，并且实际上在乳腺癌患者的血液中检测到BAG2。因此在一具体实施例中，所述BAG2可溶于血液、血液、血清(serum)、血浆(plasma)或其组合。

在一具体实施例中，本发明的诊断方法可以进一步包括：将从所述个体分离的试料与特异性结合于组织蛋白酶B(cathepsin B)的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合接触；从通过接触所述特异性结合于组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体中测量组织蛋白酶B的存在或水平；以及将从所述试料测量的组织蛋白酶B的存在或水平与从对照组测量的组织蛋白酶B的水平进行比较。

本发明人已经证明，BAG2阻止组织蛋白酶B转化为成熟形式，因此最终可以抑制癌细胞的细胞凋亡(apoptosis)，并且与此一致，观察到BAG2和未成熟形式的组织蛋白酶B均分泌到细胞外。因此，本发明的诊断方法可以通过同时检测BAG2和组织蛋白酶B来进一步提高诊断的准确性。

组织蛋白酶B可以分为组织蛋白酶原B和成熟形式的单链(single-chain)或双链(double-chain)组织蛋白酶B，本发明人已经证明由于BAG2而未成熟的形式的组织蛋白酶B分泌到细胞外。因此，根据一具体实施例，在本发明的诊断方法中，所述组织蛋白酶B可以为组织蛋白酶原B(pro-cathepsin B)。所述组织蛋白酶原B可以与“未成熟组织蛋白酶B”或“未成熟CTSB”相同的含义使用。

在一具体实施例中，测量通过接触特异性结合于所述试料中的组织蛋白酶B和所述组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体的步骤可以通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、流式细胞分析法、蛋白芯片或其组合进行。

术语“抗体”是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。所述抗体是指分别与BAG2和组织蛋白酶原B特异性结合的多肽或多肽的组合，并将BAG2或组织蛋白酶原B基因克隆到表达载体以获得由每种基因编码的蛋白质，根据本领域的常规方法，可以从所获得的BAG2或组织蛋白酶原B蛋白制备对每种蛋白特异的抗体。所述抗体的形式包括多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体(例如，ScFv片段、双体抗体、单链抗体等)，并包括所有免疫球蛋白抗体。所述抗体还包括抗体分子的功能片段，所述抗体分子的功能片段不仅不具有带有两条全长轻链和两条全长重链的完整形态，还包括不具有带有两条轻链和两条重链的完整形态的完整抗体的结构，但具有针对抗原性位点的特异性抗原结合位点(结构域)以保留抗原结合功能。

所述BAG2和组织蛋白酶原B多肽可以分别来自人(Homo sapiens)或小鼠(Musmusculus)，并可以来自其他哺乳动物，例如猴子、牛、马等。所述BAG2的氨基酸序列可以包括序列号1或2(分别为GenBank登录号NP_004273.1和NP_663367.1)，并所述组织蛋白酶原B的氨基酸序列可以包括序列号3至8(分别为GenBank登录号NP_001899.1，NP_680090.1，NP_680091.1，NP_680092.1，NP_680093.1或NP_031824.1)。即使所述序列号1至8的某些氨基酸序列不一致，使得具有生物学等效活性的氨基酸序列也可以被视为BAG2或组织蛋白酶原B多肽。所述BAG2或组织蛋白酶原B多肽分别可以包括与序列号1或2和序列号3或8中的任何一个具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同源性的氨基酸序列。另外，所述BAG2或组织蛋白酶原B多肽可以分别为具有所述序列号1或2和序列号3或8中的任一个序列中的至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸或至少7个氨基酸残基不同的序列的多肽。

作为所述诊断方法的对象的个体可以为哺乳动物，例如人、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫，优选为人。

在一具体实施例中，可以通过本发明的诊断方法诊断的癌症可以选自乳腺癌、大肠癌、肺癌、肉瘤、黑素瘤、头颈癌、***、子宫癌、肝癌、肾癌、胰腺癌和神经母细胞瘤。

本发明人已经证明，BAG2在乳腺癌患者中过表达，尤其BAG2水平测得较高的乳腺癌患者有较高的概率患有转移性乳腺癌。因此，在一具体实施例中，可以通过本发明的诊断方法诊断的乳腺癌可以为转移性乳腺癌。

在乳腺癌的分子亚型中，三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)为一种非常侵袭性的类型，尽管进行***的治疗，不仅预后不好，死亡率也高。与管腔型(luminal type)或HER2富集型(HER2-enriched type)相比，TNBC为一种异质型(Foulkeset al.，2010；Dent et al.，2007；Masuda et al.，2013)。大多数靶向乳腺癌治疗对激素受体性和HER2阳性乳腺癌均表现出积极的治疗效果，但由于TNBC患者没有三种靶向受体(ER、PR和HER2)或其他定义明确的分子靶标，因此其有效治疗的选择(例如，聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和Src酪氨酸激酶等)有限。因此，为了防止对TNBC患者进行不必要的治疗并选择有效的治疗方法，有必要在各种类型的乳腺癌患者中快速准确地区分TNBC患者。

本发明人已经证明，BAG2在乳腺癌患者中过表达，尤其BAG2水平测得较高的乳腺癌患者有较高的概率患有TNBC型乳腺癌。因此，在一具体实施例中，可以通过本发明的诊断方法诊断的乳腺癌可以为三阴性乳腺癌(或TNBC型乳腺癌)。

本发明另一方面提供一种用于诊断癌症的试剂盒，其包括所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合。所述试剂盒检测血液、血清、血浆或其组合中存在的BAG2，并适用于试剂盒的试料提供从个体分离的血液、血清、血浆或其组合。

在一具体实施例中，所述试剂盒可以进一步包括特异性结合于组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组。

所述试剂盒可以进一步包括适合于该试剂盒使用的分析方法(例如，免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、流式细胞分析法、蛋白芯片或其组合)的至少一种其他组分组合物、溶液或装置。例如，为了检测试料中的BAG2或组织蛋白酶B与其各自的特异性抗体的免疫复合体，可以进一步包括用底物、合适的缓冲溶液、发色酶或荧光团标记的二抗、发色底物。所述底物可以为由硝酸纤维素膜、聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板和玻璃载玻片等，可以将过氧化物酶(peroxidase)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)用作发色酶，可以将FITC、RITC等用作荧光团，并可以将2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等用作发色底物。

在所述试剂盒中提到的术语或元件中，与在要求保护的诊断方法的描述中提到的相同的应理解为与在要求保护的诊断方法的描述中提到的相同。

有益效果

根据本发明一方面，通过测量血液中BAG2多肽的存在或水平来诊断癌症的方法，与现有的收集组织以诊断癌症的方法相比，可以更容易和准确地诊断癌症。

根据本发明的另一方面，通过使用用于诊断癌症的试剂盒从血液中测量血液中BAG2多肽的存在或水平，所述诊断癌症的方法可以在各种诊断机构容易地用于诊断癌症。

附图说明

图1显示了使用RNA测序分析管腔型和TNBC细胞株中BAG家族表达水平差异的火山图(volcano plot)。

图2显示了从火山图分析的管腔型和TNBC细胞株中BAG2的mRNA表达量。

图3显示了从52种乳腺癌细胞株分析的BAG2表达量的散点图(scatter dot-plot)。

图4显示了分析正常和各乳腺癌细胞类型中BAG2表达量的微阵列(4A)和RNA测序结果(4B)。

图5显示了分析管腔型和TNBC组织中的BAG2表达量的RT-PCR定量结果。

图6显示了根据免疫印迹(6A)和CTSB活性度(6B)分析BAG2对CTSB的形式和活性的影响的结果。

图7显示了通过从培养有TNBC的条件培养基中对BAG2和CTSB进行免疫印迹来检测的结果。

图8为显示从培养有TNBC的条件培养基中检测到的组织蛋白酶原B的水平的图。

图9显示了通过对从培养有BAG2过表达细胞株的条件培养基中检测到的BAG2和CTSB进行免疫印迹来检测的结果。

图10显示了从健康人和乳腺癌患者的血清中检测BAG2的存在的结果。

具体实施方式

实施例1：确认各种乳腺癌细胞株中BAG2的表达

1-1.分析对乳腺癌细胞株的转录组(transcriptome)

为了确定与TNBC进展相关的新型分子靶标，本发明人首先在乳腺癌乳腺癌中使用RNA测序进行了转录组分析。首先，使用本领域公知的方法从多种乳腺癌细胞株中提取RNA，并将基因组分析委托给供应商(Theragen Etex)。然后，将乳腺癌细胞株分为管腔型(MCF-7、T47D、ZR-75B)或TNBC(MDA-MB-231、Hs578T)，并比较BAG2的表达量。

结果可见，如图1和图2所示，与管腔型细胞株相比，BAG2在TNBC细胞株中特异性过表达。

1-2.确认BAG2在52种乳腺癌细胞株中的表达趋势

在实施例1-1中扩展，确认了BAG2在更多种乳腺癌细胞中表达的趋势。乳腺癌细胞信息从公共微阵列数据集(GSE41313，Riaz et al.，2013)获得。确认由Riaz.et al.公开的52种乳腺癌细胞株中BAG2表达趋势的结果，如图3所示，可以发现BAG2在TNBC中的表达明显高于管腔型(Luminal)(P＜0.0001)。

1-3.确认临床BAG2表达趋势

为了更准确地确认在细胞株中确认的BAG2表达趋势，本发明人通过使用从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)库中获得的乳腺癌患者的RNA测序数据集和微阵列来分析了BAG2在乳腺癌各种亚型中表达的趋势。

结果可见，如图4A和图4B所示，与正常、管腔型A(Lum A)、管腔型B(Lum B)和HER2过量(HER2)患者相比，TNBC患者中BAG2表达显着更高。

1-4.以实验证实BAG2表达趋势

为了再次以实验证实使用公开的数据库分析的所述趋势，进行了定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)。

具体而言，在机构审查委员会(the institutional review board，IRB)批准(IRB批准号：3-2013-0268)之后，从延世大学医疗院获得了乳腺癌中12种管腔型和6种TNBC。然后，根据供应商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中分离总RNA。然后，使用18rRNA作为管家基因，使用用于检测BAG2的引物并使用power SYBR Green PCR MasterMix和Viia 7real-time PCR装置(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。

结果，如图5所示，可以确认与管腔型(Luminal)相比，BAG2在TNBC中过表达。

2.实施例3：确认BAG2和组织蛋白酶B的相互作用

为了确认BAG2是否可以充当组织蛋白酶B的调节上位性因子的作用，观察了BAG2和组织蛋白酶B的相互作用以及由BAG2引起的组织蛋白酶B的活性变化。

2-1.在蛋白水平上确认BAG2和组织蛋白酶B的相互作用

为了制备BAG2缺失细胞株，首先从Mission-shRNA(Sigma)购买BAG2特异性shRNA。为了制备BAG2特异性shRNA慢病毒，用编码Δ8.9和VSV-G的包装质粒的pLKO-BAG2或乱序的(scrambled)对照组pLKO-pGL2转染293T细胞(所使用的BAG2 shRNA的靶序列(5'→3')：GTACTAGGATCTAGCATATTT)。在转染36小时至48小时后，收集病毒上清液并通过0.45μm过滤器过滤。将MDA-MB-231(ATCC)以1×105个细胞/孔的密度接种(seed)于6孔板，并用病毒颗粒(particle)和聚凝胺(8μg/ml)感染。感染后，将含有所述病毒的培养基替换为普通培养基，然后选择所述细胞作为嘌呤霉素(2μg/ml)。所制备的BAG2缺失细胞株用作BAG2 shRNA。

为了过表达BAG2，同样按照供应商的说明使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将Myc-tag BAG2表达载体转染于MDA-MB-231(ATCC)，并将过表达BAG2的细胞作为BAG2 OV，将BAG2 shRNA转染于BAG2作为BAG2恢复的细胞而以BAG2拯救(rescue)使用。

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞并将其溶解后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将其转移至PVDF膜(Millipore)，并使用图1所示的各抗体进行免疫印迹以检测到各蛋白质。尤其，CTSB抗体均识别原形式(pro-form)和成熟形式的CTSB(SC(singlechain)和DC(double chain))，因此可以按分子量区分。

结果可见，如图6A所示，切割的半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在BAG2缺失细胞中表达，并半胱氨酸蛋白酶-3的活性形式增加，但因BAG2的恢复而再次减少。另外，在BAG2缺失细胞中，还观察到短链(SC)组织蛋白酶B增加，但像半胱氨酸蛋白酶-3一样，也因BAG2的恢复而再次减少。因此，可见BAG2参与阻止组织蛋白酶原B转化为成熟形式的短链组织蛋白酶B的机制。

2-2.确认BAG2对CTSB活性的影响

为了使BAG2对CTSB调节的影响更加明确，观察了CTSB活性根据BAG2存在与否的变化。

具体地，如实施例3-1中所述，制备BAG2缺失MCF10CA1a细胞，并转染BAG2表达载体以过表达BAG2，或从BAG2缺失细胞中恢复BAG2表达。成熟的CTSB将包括Arg-Arg的合成肽作为底物，所以之后将荧光形成组织蛋白酶B底物(200μMAc-RR-AFC；Abcam)和根据供应商的说明制备的细胞试料在27℃下孵育1小时。在多板检测器Wallac 1440Victor2(PerkinElmer)上进行荧光测量，并使用355nm的激发(excitation)波长在460nm下测量相对荧光单位。

结果，如图6B所示，将BAG2重新引入到BAG2缺失MCF10CA1a细胞中，结果观察到在不存在BAG2的情况下CTSB活性增加，并BAG2抑制CTSB转化为成熟形式，从而最终导致降低CTSB的活性。因此，可见BAG2与CTSB相互作用并抑制CTSB转化为成熟形式，从而参与抑制半胱氨酸蛋白酶-3介导的细胞凋亡。

实施例3、确认血液中BAG2的CTSB存在

3-1.确认TNBC细胞是否分泌BAG2和CTSB

确认了BAG2和CTSB是否不仅存在于TNBC细胞的内部且还分泌到细胞外。

具体地，如实施例2-1中所述，用TNBC细胞在Hs578T、MDA-MB-231和MCF10ACa1上制备BAG2缺失细胞，然后将每个细胞在条件培养基DMEM(Cat.LM001-05，WELGENE)培养，在小心不收集细胞的同时收集上清液，然后如实施例2-1中所述进行免疫印迹。为了显示蛋白质的总量，根据供应商的说明对其中一些进行考马斯亮蓝染色(ELT006，ELBIO)。

另外，使用组织蛋白酶原B quantikine ELISA试剂盒(R&D***)，根据供应商的说明分析从所述培养基获得的一些试料，并在培养了作为BAG2过表达细胞株的MCF10AT1的培养基中再次确认了BAG2和CTSB的存在。

结果，如图7至图9所示，在培养了BAG2表达TNBC细胞的培养基中均观察到BAG2和CTSB。尤其，作为组织蛋白酶原B，CTSB显示出与BAG2表达相同的趋势。

3-2.确认血液中BAG2和CTSB是否分泌

已经确认BAG2分泌到细胞外，所以进一步确认了是否可以在血液中分泌而在血液中被检测到。

具体而言，收集健康志愿者(N＝17)的血清和恶性乳腺癌患者(N＝76)的血清。使用人BAG2 ELISA试剂盒(MyBiosource)，根据供应商的说明分析所获得的血清。

结果，从图10可知，与健康志愿者相比，在乳腺癌患者的血清中，血液中检测到BAG2的程度显着高。

在所述实施例中，P值表示为使用未配对的双尾学生t检验(unpaired two-tailedStudent's t-test)的三个独立实验的平均值+_SD。

上面以本发明的优选实施例为主进行了说明。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的基本特征的情况下，可以以修改的形式实现本发明。因此，所公开的实施例应仅在描述性意义上考虑，而不是出于限制的目的。本发明的范围是在权利要求书中而不是在前面的描述中示出的，并且该范围内的所有差异将被解释为包括在本发明中。

序列表

<110> 下一代融合技术研究院

<120> 一种用血液诊断癌症的方法

<130> PN115517

<150> KR 10-2017-138455

<151> 2017-10-24

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 人类

<400> 1

Met Ala Gln Ala Lys Ile Asn Ala Lys Ala Asn Glu Gly Arg Phe Cys

1 5 10 15

Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu

20 25 30

Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Glu Ala Ala Thr Ala

35 40 45

Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val

85 90 95

Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Gln Glu Ser Leu Lys His

100 105 110

Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Asn Lys Phe Leu Asp Asp Leu

115 120 125

Gly Asn Ala Lys Ser His Leu Met Ser Leu Tyr Ser Ala Cys Ser Ser

130 135 140

Glu Val Pro His Gly Pro Val Asp Gln Lys Phe Gln Ser Ile Val Ile

145 150 155 160

Gly Cys Ala Leu Glu Asp Gln Lys Lys Ile Lys Arg Arg Leu Glu Thr

165 170 175

Leu Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ser Asp Lys Ala Ile Lys Leu Leu Glu

180 185 190

His Ser Lys Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Gln Gln Asn Ala Glu Ser

195 200 205

Arg Phe Asn

210

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Met Ala Gln Ala Lys Ile Ser Ala Lys Ala His Glu Gly Arg Phe Cys

1 5 10 15

Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu

20 25 30

Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Asp Ala Ala Thr Ala

35 40 45

Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val

85 90 95

Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Glu Glu Ser Leu Lys His

100 105 110

Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Ser Lys Phe Leu Asp Asp Leu

115 120 125

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Phe Asn

210

<210> 3

<211> 339

<212> PRT

<213> 人类

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<213> 人类

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Glu Lys Ile

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<212> PRT

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Met Trp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Cys Cys Leu Leu Val Leu Ala Asn

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<210> 7

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<212> PRT

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<211> 339

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

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Ile Glu Ser Glu Ile Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr Trp

325 330 335

Gly Arg Phe

Claims

1.一种诊断癌症的方法，其包括：

将从个体分离的试料与特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合接触；

从通过接触所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体中测量所述试料中BAG2的存在或水平；以及

将从所述试料测量的BAG2的存在或水平与从对照组测量的BAG2的水平进行比较。

2.如权利要求1所述的方法，其中：所述试料为血液、血清、血浆或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述BAG2可溶于血液、血液、血清、血浆或其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述BAG2多肽的氨基酸序列具有序列号1或2的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：

将从所述个体分离的试料与特异性结合于组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合接触；

从通过接触所述特异性结合于组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合来形成的复合体中测量组织蛋白酶B的存在或水平；以及

将从所述试料测量的组织蛋白酶B的存在或水平与从对照组测量的组织蛋白酶B的水平进行比较。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述组织蛋白酶B为组织蛋白酶原B。

7.如权利要求5所述的方法，其中，所述组织蛋白酶B多肽的氨基酸序列具有选自序列号3至8中的任一个的氨基酸序列。

8.如权利要求5所述的方法，其中，从所述试料测量BAG2或组织蛋白酶B的存在或水平的步骤通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、流式细胞分析法、蛋白芯片或其组合进行。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自乳腺癌、大肠癌、肺癌、肉瘤、黑素瘤、头颈癌、***、子宫癌、肝癌、肾癌、胰腺癌和神经母细胞瘤。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

12.一种用于诊断癌症的试剂盒，其检测血液、血清、血浆或其组合中存在的BAG2，

并包括所述特异性结合于BAG2多肽或其片段的抗体、多肽或其组合。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其进一步包括：特异性结合于组织蛋白酶B的多肽或其片段的抗体、多肽或其组合。

14.如权利要求12所述的试剂盒，其中，

所述癌症选自乳腺癌、大肠癌、肺癌、肉瘤、黑素瘤、头颈癌、***、子宫癌、肝癌、肾癌、胰腺癌和神经母细胞瘤。

15.如权利要求12的试剂盒，其中，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。

16.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。