ES2646177T3 - Usos terapéuticos de las urolitinas - Google Patents

Abstract

Compuesto seleccionado del grupo consiste en: urolitina B, urolitina A, hidroxi-urolitina A, metil-urolitina A y un compuesto representado por la estructura**Fórmula** en la que R1 es H; OH; u OR3; R2 es H o alquilo C1 a C10; y R3 es alquilo C1 a C10 para su uso en el tratamiento en un sujeto de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: un sarcoma, un melanoma, un carcinoma de células escamosas de boca, garganta, laringe o pulmón, un cáncer genitourinario seleccionado de cáncer de cuello uterino o de vejiga, un cáncer hematopoyético, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer del sistema nervioso, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y cáncer de colon.

Description

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DESCRIPCION

Usos terapeuticos de las urolitinas Introduccion

Los elagitaninos (ET) son polifenoles polimericos abundantes en algunos frutos y frutos secos tales como granadas, frambuesas, fresas, moras, nueces y almendras. A pesar de los numerosos informes de las propiedades biologicas y beneficiosas para la salud humana de los ET, es limitado el conocimiento sobre su biodisponibilidad, farmacocinetica, disposicion y destino metabolico en los seres humanos.

Los frutos de granada (Punica granatum L.), se consumen ampliamente frescos y como bebidas tales como zumos (PJ). En metodos de procesamiento de zumos comerciales, los ET que son abundantes en la piel de los frutos, se extraen en grandes cantidades en el zumo. La punicalagina [2,3-hexahidroxidifenol-4,6-galagilglucosa], que se encuentra como isomeros (figura 1) es el ET predominante presente en PJ como resultado de este proceso. Los ET pertenecen a la clase qmmica de los taninos hidrolizables, que liberan acido elagico (EA) con su hidrolisis. Ademas, PJ contiene otros polifenoles tales como las antocianinas, que estan presentes en los arilos de fruta, confiriendo su color rojo rub brillante.

Las propiedades antioxidantes potentes de los PJ se han atribuido a su alto contenido de isomeros de punicalaginas que pueden alcanzar niveles > 2 g/l de zumo. Los ET tambien se han identificado como los compuestos activos antiaterogenicos en PJ. Se ha sugerido que los ET de granada y los extractos frutales de granada inhiben la proliferacion de celulas cancerosas humanas y modulan rutas de senalizacion subcelulares inflamatorias y la apoptosis, veanse, por ejemplo Seeram et al. (2005) J Nutr Biochem. 2005;16:360-7; Adams et al. (2006) J Agric Food Chem. 2006, 54, 980-85; Afaq et al. (2005) Photochem Photobiol. 2005; 81:38-45; Afaq et al. (2005) Int J Cancer. 2005;113:423-33. Se ha sugerido que el extracto frutal de granada reduce el crecimiento de tumor de prostata y los niveles de antfgeno serico prostatico en ratones desnudos atfmicos a los que se les han implantado celulas prostaticas CWR22Rv1 (Malik et at. (2005) Proc Natl Acad Sci. 2005; 102: 14813-8.

Cerda et al., J. Agric. Food Chem. 2005, vol. 53, pags. 227-235 se refiere al metabolismo de elagitaninos antioxidantes y quimiopreventivos de fresas, frambuesas, nueces y vinos envejecidos en roble en seres humanos.

Seeram et al., Journal of Nutritional Biochemistry, vol. 16, pags. 260-367 comenta la potenciacion in vitro de la actividad antiproliferativa, apoptotica y antioxidante de punicalagina, acido elagico y un extracto de tanino de granada total en combinacion con otros polifenoles en zumo de granada.

Larrosa et al., J. Agric. Food Chem. 2005, vol. 54, pags. 1611-1620 da a conocer urolitinas y metabolitos derivados del acido elagico producidos por microflora de colon humano.

Cerda et a., J. Agric. Food Chem. 2005, vol. 53. pags. 5571-5576 se refiere a la identificacion de urolitina como metabolito producido por microflora de colon humano a partir de acido elagico y compuestos relacionados.

Kiss et al., Phytomedicine 13, pags. 284-289, 2006 se refiere a la induccion de actividad endopeptidasa neutra en celulas PC-3 mediante un extracto acuoso de Epilobium angustifolium y oenotema B.

Sakagami et al., Phytomedicine, vol. 7(1), pags. 39-47, 2000 se refiere a la actividad citotoxica de taninos hidrolizables frente a lmeas celulares tumorales orales humanas.

Aunque se han notificado la absorcion, el metabolismo, la distribucion y excrecion de ET de granada en animales y seres humanos, sus parametros farmacocineticos permanecen todavfa sin investigar. Esta cada vez mas claro que se produce una variabilidad entre sujetos considerable en el metabolismo de polifenoles en seres humanos. Como tal, existe la necesidad de establecer parametros de biodisponibilidad, metabolismo y farmacocinetica de los ET de granada en voluntarios humanos, y relacionar los ET y/o metabolitos de los mismos con propiedades beneficiosas especfficas, por ejemplo, efectos antioxidantes, antiproliferativos en celulas cancerosas y proapoptoticos, etc. Esta invencion satisface estas y otras necesidades.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a metabolitos de polifenoles de granada (por ejemplo, elagitaninos), o derivados de los mismos, polifenoles que encuentran uso en metodos de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad hiperproliferativa en un sujeto. Los metabolitos de elagitaninos objeto se muestran en el presente documento que tienen un efecto antiproliferativo y/o efecto proapoptotico en celulas y como tal, encuentran uso en el tratamiento y la prevencion de varios estados patologicos, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral, disminuir la inflamacion asociada con un trastorno linfoproliferativo, inhibir el rechazo de injerto o dano neurologico debido a la reparacion tisular, etc.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica, que comprende una dosis eficaz de un metabolito de elagitaninos y un excipiente farmaceuticamente aceptable. La dosis eficaz sera habitualmente eficaz para inhibir la proliferacion de una celula, incluyendo celulas de tumor, por ejemplo celulas de tumor solido,

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tales como carcinomas, por ejemplo carcinomas de pancreas, carcinomas de prostata, y similares. En determinadas realizaciones, los metabolitos de elagitaninos de interes son urolitinas y/o derivados de las mismas.

En otra realizacion de la invencion, se proporcionan metodos para la inhibicion de la proliferacion celular no deseada, comprendiendo el metodo poner en contacto las celulas con una dosis eficaz de un metabolito de elagitaninos y un excipiente farmaceuticamente aceptable .Las celulas de interes incluyen, sin limitacion, celulas de tumor, celulas de tumor solido, tales como carcinomas, por ejemplo, carcinomas de pancreas, carcinomas de prostata y similares. En determinadas realizaciones, los metabolitos de elagitaninos de interes son urolitinas y/o derivados de las mismas.

En algunas realizaciones de la invencion, los pacientes se clasifican como productores de metabolitos y no productores de metabolitos, en los que el tratamiento puede adaptarse al estado del paciente.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Estructuras qmmicas de los isomeros de punicalagina (1), el elagitanino (ET) principal presente en el zumo de granada, y su producto de hidrolisis, el acido elagico (EA) (2).

Figura 2: Actividad proapototica de la urolitina B frente a cuatro lmeas celulares de cancer de prostata humano: A = 22Rv1; B = PC3; C = LNCaP; D = LNCaP-AR. La significacion estadfstica son: * p = 0,05 y * p = 0,01.

Figura 3: Actividad antiproliferativa de urolitinas frente a la lmea celular de cancer de colon humano HCT-116.

Figuras 4A y 4B. Actividad antiproliferativa de urolitinas frente a las lmeas celulares pancreaticas humanas ASPC-1 y BXPC-3.

Figura 5: Inhibicion del crecimiento del xenoinjerto tumoral (LAPC-4) por PE en ratones SCID. La inhibicion del crecimiento fue significativa comenzando a las dos semanas despues del inicio de la administracion de PE (0,8 mg/raton/dosis) por via oral (p<0,05), con mas del 50 por ciento de inhibicion del volumen tumoral a las 6 semanas despues de la inyeccion del tumor. El control de vehmulo o PE se administro cuando los tumores se volvieron palpables 2 semanas despues de la inyeccion de 200.000 celulas de tumor de prostata (LAPC-4).

Figuras 6A-6B. (A) Concentraciones de urolitina A (UA) y conjugados de UA: UA metilada, sulfato de UA y glucuronido de UA en plasma (ng/ml) y tejidos (ng/g) de ratones que recibieron UA (0,3 mg/raton/dosis) por via oral. Los niveles de metabolitos en el punto de tiempo de 24 h estaban por debajo del lfmite detectable (3 ng/ml para sangre y 5 ng/g para tejidos) y por tanto no se muestran. Los datos muestran la media + D.E. para n = 6 ratones por punto de tiempo. (B) Concentraciones de urolitina A (UA) y conjugados de UA: UA metilada, sulfato de UA y glucuronido de UA en plasma (ng/ml) y tejidos (ng/g) de ratones que recibieron UA (0,3 mg/raton/dosis) por via intraperitoneal. Los niveles de metabolitos en el punto de tiempo de 24 h estaban por debajo del lfmite detectable (3 ng/ml para sangre y 5 ng/g para tejidos) y por tanto no se muestran. Los datos muestran la media + D.E. para n = 6 ratones por punto de tiempo.

Descripcion de realizaciones espeaficas

La presente invencion se refiere a metabolitos de polifenoles de granada (por ejemplo, elagitaninos) que encuentran uso en metodos de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad neoplasica en un sujeto. Los metabolitos de elagitaninos objeto se muestran en el presente documento que tienen un efecto antiproliferativo y/o efecto proapoptotico, y como tal, encuentran uso en el tratamiento y la prevencion de varios estados patologicos hiperproliferativos. Entre las celulas tumorales que son sensibles al tratamiento con metabolitos de elagitaninos se encuentran los tumores solidos, por ejemplo carcinomas tales como celulas de carcinomas de pancreas, celulas de carcinomas de colon, etc. Tambien es de interes el tratamiento de carcinoma de prostata, incluyendo canceres de prostata con sensibilidad e insensibilidad a androgenos. En algunas realizaciones, los pacientes se clasifican como productores de metabolitos y no productores de metabolitos, en los que el tratamiento puede adaptarse al estado del paciente. En determinadas realizaciones, los metabolitos de elagitaninos de interes son urolitinas.

Antes de que se describa la presente invencion en mayor detalle, debe entenderse que esta invencion no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden variar. Debe entenderse tambien que la terminologfa usada en el presente documento es con el proposito de describir solo realizaciones particulares, y no tiene la intencion de ser limitativa, ya que el alcance de la presente invencion solo se vera limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la decima parte de la unidad del lfmite inferior a menor que el contexto dicte claramente otra cosa, entre los lfmites superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, esta abarcado dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden estar incluidos independientemente en los intervalos mas pequenos y tambien estan abarcados dentro la invencion, sujetos a que cualquier lfmite excluido espedficamente en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos lfmites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos lfmites incluidos tambien estan incluidos en

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la invencion.

A menos que se defina de otra manera, todos los termicos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque tambien puede usarse metodos y materiales cualesquiera similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la practica o las pruebas de la presente invencion, se describen ahora metodos y materiales ilustrativos representativos.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan al presente documento como referencia como si cada publicacion o patente individual se indicase espedfica e individualmente que se incorpora como referencia y se incorporan en el presente documento como referencia para dar a conocer y describir los metodos y/o materiales en relacion con los que se citan las publicaciones. La cita de cualquier publicacion es para su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no debe interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a anteceder a tal publicacion en virtud de invencion previa. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicaciones reales que puede ser necesario confirmar independientemente.

Cabe senalar que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un(o)” “una” y “el/la” incluye referentes en plural, a menos que en el contexto dicte otra cosa. Cabe senalar asf mismo que las reivindicaciones pueden estar redactadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaracion pretende servir como base de antecedentes para el uso de tal terminologfa exclusiva como “unicamente”, “solo” y similares en relacion con la cita de los elementos de reivindicacion, o el uso de una limitacion “negativa”.

Tal como resultara evidente para los expertos en la tecnica tras leer esta divulgacion, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene caractensticas y componentes diferenciados que pueden separarse facilmente de o combinarse con las caractensticas de cualquiera de las otras varias realizaciones sin apartarse del alcance de la presente invencion. Cualquier metodo citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible de manera logica.

Tal como se usa en el presente documento, compuestos que estan “disponibles comercialmente” pueden obtenerse de fuentes comerciales convencionales tales como Acros Organics (Pittsburgh, PA), Aldrich Chemical (Milwaukee, WI, que incluye Sigma Chemical y Fluka), Apin Chemicals Ltd. (Milton Park, R.U.), Avocado Research (Lancashire, R.U.), BDH Inc. (Toronto, Canada), Bionet (Cornwall, R.U.), Chemservice Inc. (West Chester, PA), Crescent Chemical Co. (Hauppauge, NY), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester, NY), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, PA), Fisons Chemicals (Leicestershire, R.U.), Frontier Scientific (Logan, UT), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA), Key Organics (Cornwall, R.U.), Lancaster Synthesis (Windham, NH), Maybridge Chemical Co. Ltd. (Cornwall, R.U.), Parish Chemical Co. (Orem, UT), PfaltZ & Bauer, Inc. (Waterbury, CN), Polyorganix (Houston, TX), Pierce Chemical Co. (Rockford, IL), Riedel de Haen AG (Hannover, Alemania), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, NJ), TCI America (Portland, OR), Trans World Chemicals, Inc. (Rockville, MD), Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, VA); Molecular Probes (Eugene, OR); Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA); y Glen Research (Sterling, VA).

Tal como se usa en el presente documento, las “condiciones adecuadas” para llevar a cabo una etapa de smtesis se proporcionan explfcitamente en el presente documento o pueden discernirse mediante referencia a publicaciones dirigidas a los metodos usados en qmmica organica de smtesis. Los tratados y libros de referencia expuestos previamente que detallan la smtesis de reactantes utiles en la preparacion de compuestos de la presente invencion, tambien proporcionaran condiciones adecuadas para llevar a cabo una etapa de smtesis segun la presente invencion

Tal como se usa en el presente documento, pueden identificarse “metodos conocidos por uno de los expertos habituales en la tecnica” a traves de diversas bases de datos y libros de referencia. Los tratados y libros de referencia adecuados que detallan la smtesis de reactantes utiles en la preparacion de compuestos de la presente invencion, o proporcionan referencias a artmulos que describen la preparacion, incluyen por ejemplo “Synthetic Organic Chemistry”, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; S. R. Sandler et al., “Organic Functional Group Preparations”, 2a ed., Academic Press, Nueva York, 1983; H. O. House, “Modern Synthetic Reactions”, 2a ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif. 1972; T. L. Gilchrist, “Heterocyclic Chemistry”, 2a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992; J. March, “Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure”, 4a ed., Wiley- Interscience, Nueva York, 1992. Tambien pueden identificarse reactantes analogos y espedficos a traves de indices de productos qmmicos conocidos preparados por Chemical Abstract Service de la American Chemical Society, que estan disponibles en la mayona de bibliotecas publicas y universitarias, asf como a traves de bases de datos en lmea (puede ponerse en contacto con la American Chemical Society, Washington, D.C., para mas detalles). Los productos qmmicos que se conocen pero no estan disponibles comercialmente en catalogos pueden prepararse por empresas de smtesis qmmica personalizadas, en las que muchas de las empresas de suministro de productos qmmicos convencionales (por ejemplo, los enumerados anteriormente) proporcionan servicios de smtesis personalizados.

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“Compuesto estable” y “estructura estable” pretenden indicar un compuesto que es suficientemente robusto como para sobrevivir al aislamiento hasta un grado de pureza util a partir de una mezcla de reaccion, y la formulacion para dar un agente terapeutico eficaz.

“Opcional” u “opcionalmente” significa que el evento de circunstancias descrito posteriormente puede producirse o no, y que la descripcion incluye casos en los que se producen dichos eventos o circunstancias y casos en los que no. Por ejemplo, “arilo sustituido opcionalmente” significa que el radical arilo puede estar sustituido o no y que la descripcion incluye tanto radicales arilo sustituidos como radicales arilo no sustituidos. El termino alquilo inferior se usa en el presente documento tal como se conoce en la tecnica para referirse a un alquilo, lineal, ramificado o dclico, de desde aproximadamente 1 hasta 6 carbonos.

“Portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable ” incluye sin limitacion cualquier adyuvante, portador, excipiente, agente deslizante, edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, surfactante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspension, estabilizante, agente isotonico, disolvente o emulsionante que haya sido aprobado por la Administracion de Alimentos y Farmacos de los Estados Unidos como que es aceptable para su uso en seres humanos o animales domesticos.

“Sal farmaceuticamente aceptable” incluye sales de adicion tanto de acido como de base. “Sal de adicion de acido aceptable farmaceuticamente” se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia y propiedades biologicas de las bases libres, que no son indeseables biologicamente o de otro modo que se forman con acidos inorganicos tales como acido clorhndrico, acido bromhHdrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares, y acidos organicos tales como acido acetico, acido trifluoroacetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido succmico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salidlico, y similares.

“Sal de adicion de base farmaceuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia y propiedades biologicas de los acidos libres, que no son indeseables biologicamente o de otro modo. Estas sales se preparan a partir de la adicion de una base inorganica o una base organica al acido libre. Las sales derivadas de bases inorganicas incluyen, pero no estan limitadas a las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales inorganicas preferidas son las sales de amonio, sodio, potasio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases organicas incluyen, pero no se limitan a, sales de aminas primaras, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas dclicas y resinas basicas de intercambio ionico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafema, procama, hidrabamina, colina, betama, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Bases organicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafema.

Los compuestos de la invencion, o sus sales farmaceuticamente aceptables, pueden contener uno o mas centros asimetricos y, por tanto, pueden dar lugar a enantiomeros, diastereomeros y otras formas estereoisomericas que pueden definirse, en cuanto a su estereoqmmica absoluta, como (R) o (S) o, como (D) o (L) para aminoacidos. La presente invencion pretende incluir todos de tales isomeros posibles, asf como, sus formas racemicas y opticamente puras. Los isomeros opticamente activos (+) y (-), (R) y (S), o (D) y (L) pueden prepararse usando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse usando tecnicas convencionales, tales como HpLC de fase inversa. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefmicos u otros centros de asimetna geometrica, y a menos que se especifique de otro modo, se pretende que los compuestos incluyan ambos isomeros geometricos E y Z. Igualmente, tambien se pretende que esten incluidas todas las formas tautomericas.

USOS TERAPEUTICOS DE LOS METABOLITOS DE ELAGITANINO

Trastornos hiperproliferativos: se refiere a proliferacion celular en exceso, con relacion a los que se produce con el mismo tipo de celulas en la poblacion general y/o el mismo tipo de celula obtenida de un paciente en un tiempo previo. El termino indica poblaciones de celulas malignas asf como no malignas. Tales trastornos tienen una proliferacion celular en exceso de uno o mas subconjuntos de celulas, que a menudo parecen diferenciarse del tejido circundante tanto morfologica como genotfpicamente. La proliferacion celular en exceso puede determinarse mediante referencia a la poblacion general y/o mediante referencia a un paciente en particular, por ejemplo en un punto previo en la vida del paciente. Los trastornos celulares hiperproliferativos pueden producirse en diferentes tipos de animales y en seres humanos, y producen diferentes manifestaciones ffsicas dependiendo de las celulas afectadas.

Los trastornos celulares hiperproliferativos incluyen canceres; trastornos proliferativos en vasos sangumeos tales como reestenosis, aterosclerosis, estenosis en endoprotesis, reestenosis de injerto vascular, etc.; trastornos fibroticos; psoriasis; trastornos inflamatorios, por ejemplo artritis, etc.; nefritis glomerular; endometriosis; trastornos degenerativos maculares; trastornos de crecimientos benignos tales como hiperplasia de prostata y lipomas; y trastornos autoinmunitarios. Los canceres son de particular interes, incluyendo leucemias, linfomas (de Hodgkin y no

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Hodgkin), y otros trastornos mieloproliferativos; sarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tejido solido, por ejemplo cancer de pancreas, cancer de colon, cancer de prostata, etc., tumores hipoxicos, carcinomas de celulas escamosas de boca, garganta, laringe y pulmon, canceres genitourinarios tales como cancer de cuello uterino y de vejiga, un cancer hematopoyeticos, canceres de cabeza y cuello y canceres del sistema nervioso , lesiones benignas tales como papilomas, y similares.

El cancer de prostata es actualmente el cancer diagnosticado mas frecuentemente en los hombres. El cancer de prostata es latente; muchos hombres portan celulas de cancer de prostata sin signos manifiestos de enfermedad. Esta asociado a una alta morbilidad. La metastasis de cancer en hueso (estadio tardio) es frecuente y casi siempre mortal. Los tratamientos actuales incluyen prostatectomia radical, radioterapia, ablacion hormonal y quimioterapia. Desgraciadamente, en aproximadamente el 80% de casos, el diagnostico de cancer de prostata se establece cuando la enfermedad ya ha metastatizado en los huesos, limitando por tanto la eficacia de tratamientos quirurgicos. La terapia hormonal frecuentemente fracasa con el tiempo con el desarrollo de celulas de tumor resistentes a hormonas. Aunque se han empleado agentes quimioterapicos en el tratamiento de cancer de prostata, ningun agente ha demostrado superioridad con respecto a sus homologos, y ninguna combination de farmacos parece ser particularmente eficaz. La naturaleza generalmente de crecimiento lento y resistente a los farmacos de la mayoria de los canceres de prostata los hace particularmente resistentes a la quimioterapia convencional.

Tal como se demuestra a continuation en la section experimental, determinados tipos de metabolitos de elagitaninos (ET) tienen actividades antiproliferativas y/o actividades proapoptoticas sobre celulas cancerosas. Los ejemplos de tales metabolitos incluyen las urolitinas A y B y derivados de las mismas. Como tales, estos metabolitos o derivados de los mismos encuentran uso en el tratamiento y/o la prevention de enfermedades neoplasicas en sujetos.

Aunque estos metabolitos se derivan de ET que se encuentran presentes en determinados alimentos (por ejemplo, granadas), el consumo de estos alimentos no siempre conduce a una biodisponibilidad suficiente de estos metabolitos de ET terapeuticos. Espedficamente, determinados sujetos, denominados en el presente documento no productores, no producen cantidades detectables de estos metabolitos de ET despues del consumo de alimentos que contienen ET (por ejemplo, zumo de granada). Por tanto, en determinadas realizaciones, se administra(n) directamente un(os) metabolito(s) de ET a un sujeto que tiene una enfermedad neoplasica. En determinadas otras realizaciones, se administra(n) directamente un(os) metabolito(s) de ET a un sujeto para prevenir la aparicion o recurrencia de una enfermedad neoplasica. En determinadas realizaciones, la enfermedad neoplasica es un cancer, incluyendo cancer de prostata. En algunas de estas realizaciones, el cancer de prostata es dependiente o independiente de androgenos.

En determinadas realizaciones, el metabolito de ET o derivado del mismo, es un metabolito de acido elagico (EA) seleccionado del grupo que consiste en urolitina B, urolitina A, metil-urolitina A, hidroxi-urolitina A y derivados de las mismas. Tambien se incluyen en los metodos de la invention derivados de urolitinas, incluyendo esteres farmaceuticamente aceptables, etc., y derivados que tienen la estructura:

imagen1

en la que R1 es H, OH, OR3 en el que R3 es un alquilo inferior C1 a C10, NH2, NHR3, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3 en el que n es de desde aproximadamente 1 hasta 10; alquilo inferior C1 a C10, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; Cl, Br, CN, CF3, OCF3, O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3, SO2; CH3; ONO2; NO2; N3; y

R2 es H o alquilo inferior C1 a C10.

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Los metabolites de ET o derivados de los mismos pueden administrarse a un sujeto (por ejemplo, mairnfero) en una variedad de v^as. Por ejemplo, el/los metabolito(s) ET pueden administrarse por via oral, por via rectal, por via intravenosa, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via intracerebroespinal, por via subcutanea, por via intraarticular, por via intrasinovial, por via intratecal, de manera topica o mediante inhalacion. Como tal, la forma de la dosis del metabolito de ET puede estar en una variedad de formas, incluyendo microcapsulas, nanocapsulas, liposomas, emplastos, formas de inhalacion, pulverizaciones nasales, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberacion sostenida.

Los compuestos de esta invencion pueden incorporarse en una variedad de formulaciones para la administracion terapeutica. Mas particularmente, los compuestos de la presente invencion pueden formularse en composiciones farmaceuticas mediante combinacion con portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables apropiados, y pueden formularse en preparaciones en formas solidas, semisolidas, lfquidas o gaseosas, tales como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, pomadas, disoluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administracion de los compuestos puede lograrse por varias vfas, incluyendo administracion oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermica, transdermica, intratraqueal, etc. El agente activo puede ser sistemico tras la administracion o puede localizarse mediante el uso de administracion regional, administracion intramural o el uso de un implante que actua para retener la dosis activa en el sitio de implantacion.

En formas de dosificacion farmaceutica, los compuestos pueden administrarse en forma de su sal farmaceuticamente aceptable. Tambien pueden usarse en asociacion apropiada con otros compuestos farmaceuticamente activos. Los siguientes metodos y excipientes son meramente a modo de ejemplo y no son limitativos en modo alguno.

Para preparaciones orales, los compuestos pueden usarse solos o en combinacion con aditivos apropiados para producir comprimidos, polvos, granulos o capsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidon de mafz o almidon de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arabiga, almidon de mafz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidon de mafz, almidon de patata o carboximetilcelulosa sodica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes saborizantes.

Los compuestos pueden formularse en preparaciones para inyeccion disolviendolos, suspendiendolos o emulsionandolos en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, gliceridos de acidos alifaticos sinteticos, esteres de acidos alifaticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales, tales como solubilizantes, agentes isotonicos, agentes de suspension, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.

Los compuestos pueden usarse en formulacion de aerosol para administrarse mediante inhalacion. Los compuestos de la presente invencion pueden formularse en propelentes presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno y similares. Ademas, los compuestos pueden prepararse en supositorios mezclandolos con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse por via rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehteulos tales como manteca de cacao, Carbowax y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal aunque se solidifican a temperatura ambiente.

Pueden proporcionarse formas de dosificacion unitaria para administracion oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones en las que cada unidad de dosificacion, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composicion que contiene uno o mas compuestos de la presente invencion. De forma similar, las formas de dosificacion unitaria para inyeccion o administracion intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invencion en una composicion como disolucion en agua esteril, agua, solucion salina normal u otro portador farmaceuticamente aceptable.

Los implantes para formulaciones de liberacion sostenida se conocen bien en la tecnica. Los implantes se formulan como microesferas; ferulas, etc. con polfmeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polfmeros del acido lactico y/o acido glicolico forman un polfmero erosionable que el huesped tolera bien. El implante que contiene los compuestos inhibidores pueden ponerse en las proximidades del sitio de un tumor, de modo que la concentracion local del agente activo este aumentada con respecto al resto del cuerpo.

El termino “formas de dosificacion unitaria”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades ffsicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invencion calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociacion con un diluyente, portador o vehteulo aceptable farmaceuticamente. Las especificaciones para las formas de dosificacion unitaria novedosas de la presente invencion dependen del compuesto particular empleado y del efecto que ha de conseguirse, y la farmacodinamia asociada con cada compuesto en el huesped.

Los excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como vehteulos, adyuvantes, portadores o diluyentes, estan facilmente disponibles para el publico. Ademas, estan facilmente disponibles para el publico sustancias auxiliares

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farmaceuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste del pH y agentes tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agente humectantes y similares.

El uso combinado de los compuestos proporcionados de la presente invencion y otros agentes citotoxicos tiene las ventajas de que las dosificaciones requeridas para los farmacos individuales son menores, y el efecto de los diferentes farmacos es complementario. Dependiendo del paciente y estado que se traten y de la via de administracion, los compuestos objeto pueden administrarse en dosificaciones de al menos aproximadamente o alrededor de aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente o alrededor de aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal, al menos aproximadamente o alrededor de aproximadamente 1 |ig/kg de peso corporal, al menos aproximadamente o alrededor de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente o alrededor de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al dfa o incluso valores mayores, y habitualmente de no mas de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al dfa. El intervalo es amplio, ya que en general la eficacia de un efecto terapeutico para diferentes mairnferos vana ampliamente, siendo las dosis normalmente 10, 30 o incluso 40 veces menores (por peso corporal unitario) en hombre que en rata. De forma similar el modo de administracion puede tener un gran efecto sobre la dosificacion. Por tanto y por ejemplo, las dosificaciones orales en la rata pueden ser diez veces la dosis de inyeccion. Pueden usarse dosis menores para vfas de administracion localizadas.

Una dosificacion tfpica puede ser una disolucion adecuada para administracion intravenosa; un comprimido tomado de dos a seis veces al dfa, o una capsula o un comprimido de liberacion programada tomado una vez al dfa y que contiene un contenido proporcionalmente mayor de principio activo, etc. El efecto de liberacion programada puede obtenerse mediante materiales de capsula que se disuelven a diferentes valores de pH, mediante capsulas que liberan lentamente por presion osmotica, o mediante algun otro medio conocido de liberacion controlada.

Los expertos en la tecnica apreciaran facilmente que los niveles de dosis pueden variar en funcion del compuesto espedfico, la intensidad de los smtomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos de los compuestos espedficos son mas potentes que otros. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado pueden determinarlas facilmente los expertos de la tecnica mediante una variedad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiologica de un compuesto dado.

Para su uso en metodos objeto, los compuestos objeto pueden formularse con otros agentes farmaceuticamente activos, particularmente otros agentes antimetastasicos, antitumorales o antiangiogenicos. Los compuestos angiostaticos de interes incluyen angiostatina, endostatina, peptidos carboxilo terminales de colageno alfa (XV), etc. Los agentes citotoxicos y citoestaticos de interes incluyen adriamicina, Alkeran, Ara-C, BICNU, busulfano, CNNU, cisplatino, citoxano, daunorubicina, DTIC, 5-FU, Hydrea, ifosfamida, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, mostaza nitrogenada, Velban, vincristina, vinblastina, VP-16, carboplatino, fludarabina, gemcitabina, idarubicina, irinotecan, leustatina, navelbina, taxol, taxotere, topotecan, etc.

Los compuestos de urolitina son utiles para usos profilacticos o terapeuticos. Tal como se usa en el presente documento, el termino “tratar” se usa para referirse tanto a la prevencion de la enfermedad, como el tratamiento de estados preexistentes. La prevencion de la proliferacion se consigue mediante la administracion de los compuestos objeto antes del desarrollo de la enfermedad, por ejemplo, para prevenir el nuevo crecimiento de tumores, prevenir el crecimiento metastasico, disminuir la reestenosis asociada con cirugfa cardiovascular, etc. Alternativamente, los compuestos se usan para tratar enfermedades en curso, estabilizando o mejorando los smtomas clmicos del paciente.

El huesped o paciente, puede ser de cualquier especie de mamffero, por ejemplo, primates, particularmente seres humanos; roedores, incluyendo ratones, ratas y hamsteres; conejos; animales equinos, bovinos, caninos, felinos; etc. Los modelos de animales son de interes para investigaciones experimentales, proporcionando un modelo para el tratamiento de la enfermedad humana.

La susceptibilidad de una celula particular al tratamiento con el compuesto objeto puede determinarse mediante pruebas in vitro. Normalmente, se combina un cultivo de la celula con un compuesto objeto a concentraciones variables durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los agentes activos induzcan muerte celular o inhiban la migracion, habitualmente entre aproximadamente una hora y una semana. Para pruebas in vitro, pueden usarse celulas cultivadas de una muestra de biopsia. Se cuentan las celulas viables que quedan despues del tratamiento.

La dosis variara dependiendo del compuesto espedfico usado, trastorno espedfico, estado del paciente, etc. Normalmente, una dosis terapeutica sera suficiente para disminuir sustancialmente la poblacion de celulas no deseadas en el tejido seleccionado como diana, mientras se mantiene la viabilidad del paciente. El tratamiento generalmente se continuara hasta que haya una reduccion sustancial, por ejemplo, una disminucion de al menos aproximadamente el 50% de la carga celular, y puede continuarse hasta que no se detecten esencialmente celulas

no deseadas en el cuerpo La reduccion es preferiblemente de al menos aproximadamente el 10%, al menos

aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos

aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos

aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, y de manera ideal el 100%.

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Tal como se usa en el presente documento, “prevencion” de un estado (por ejemplo, una enfermedad neoplasica) significa que la aparicion del estado y/o sus smtomas se reducen o eliminan. La reduccion es preferiblemente de al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, y de manera ideal el 100%.

Los siguientes ejemplos se exponen a continuacion de modo que proporcione a los expertos en la tecnica una divulgacion y descripcion completas de como preparar y usar la presente invencion, y no se pretende limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion ni se pretende representar que los experimentos a continuacion son todos o los unicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunas desviaciones y errores experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados centigrados y la presion es o esta cerca de la atmosferica.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan al presente documento como referencia como si se indicase espedfica e individualmente que cada publicacion o solicitud de patente individual se incorpore como referencia.

La presente invencion se ha descrito en cuanto a realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender modos preferidos para la practica de la invencion. Los expertos en la tecnica apreciaran que, a la luz de la presente divulgacion, pueden realizarse numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance pretendido de la invencion. Se pretende que todas de tales modificaciones esten incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Parte experimental

EJEMPLO 1

SUJETOS, MATERIALES Y METODOS

Reactivos e instrumentos. Todos los disolventes son de calidad para HPLC y se adquirieron de Fisher Scientific Co. (Tustin, CA). Se adquirieron los acidos elagico, galico, formico, fosforico, 2-bromo-benzoico, 2-bromo-5- metoxibenzoico y acetico, resorcinol, dihidrogenofosfato de potasio, ABTS (sal de diamonio del acido 2,20-azinobis- 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), dioxido de manganeso, Trolox (acido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxflico), cloruro de magnesio, Tris HCl, acetato de sodio, acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA), desoxiguanosina (dG),p-D-glucuronidasa (tipo X-A de Escherichia coli) y arilsulfatasa (tipo VIII de vfsceras de abulon) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los analisis mediante cromatograffa de lfquidos de alta resolucion con deteccion ultravioleta (HPLC-UV) se llevaron a cabo en un sistema Waters Alliance 2690 equipado con un detector de red de fotodiodos de (PDA) (Waters Corp., Milford, MA) y se realizo la manipulacion de datos con el software Waters Millenium v 3.02. El sistema de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion con deteccion electroqmmica (HPLC-ECD) consistfa en una bomba cuaternaria Agilent Technologies 1100, automuestreador con regulacion de temperatura controlado mediante el software Chemstation 9.01 (Agilent Technology, Wilmington, DE), un detector electroqmmico COULARRAY ESA 5600A (ESA, Bedford, MA). El sistema de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion con espectroscopfa de masas (HPLC-EM) consistfa en un sistema LCQ Classic Finnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA), equipado con un sistema de HPLC de la serie HP 1100 que consistfa en un automuestreador/inyector, bomba cuaternaria, calentador de columna y detector de red de diodos (DAD) con el software Xcalibur 1.2 (Finnigan Corp.).

Analisis mediante HPLC-EM/EM. Las condiciones para la deteccion de los metabolitos de ET es tal como sigue: Columna, Symmetery C-18, 100 mm x 2,1 de d.i., 3,5 |im, (Waters Corp., Milford, MA); Disolvente A) HCOOH al 2%/H2O, B) HCOOH al 2%/MeOH; gradiente % de A: inicial: 99%, 30 min: 80%, 45 min: 60%, 60 min: 5%; tiempo de operacion 60 min; velocidad de flujo 0,15 ml/min; volumen de inyeccion 20 |il; Parametros de EM: modo de ionizacion, ionizacion por electropulverizacion (ESI) tanto en modo positivo como negativo (vease la figura 3); intervalo de barrido: 120-1500 uma; velocidad de barrido: 1 barrido/s; voltaje del cono: 17 eV. Se obtuvieron las identidades de pico haciendo corresponder sus iones moleculares (M-H+) o (M+H+) obtenidos mediante ESI/EM y EM/EM con los pesos moleculares teoricos esperados de los datos de la bibliograffa (4,5,13,15,18).

Materiales de cultivo celular. Se obtuvieron las lmeas celulares de cancer de prostata 22Rv1, DU145, LNCaP y PC3 de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). Las lmeas celulares LNCaP-AR y Hi-Myc fueron una amable donacion del Dr. C. Sawyers (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA). Las celulas DU145, 22Rv1, LNCaP, LNCaP-AR y PC3 se hicieron crecer en RPMI 1640; las celulas Hi-Myc se hicieron crecer en medio de Dulbecco modificado por Isecove. Todos los medios conteman suero fetal bovino (FBS) al 10% en presencia de penicilina 100 U/ml y estreptomicina 0,1 g/l. Las celulas de prostata RWPE-1 se hicieron crecer en medio libre de suero de queratinocito definido (DKSFM) que contema factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Se incubaron las celulas a 37°C con el 95% de aire y el 5% de

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CO2. Todas las celulas se mantuvieron por debajo del pase 20 y se usaron en experimentos durante la fase lineal de crecimiento.

S^ntesis de urolitina B y metilurolitina A. Se sintetizaron los derivados de urolitina (dibenzo[b,d]piran-6-ona) segun el metodo publicado (21). En resumen, se suspendieron acido 2-bromobenzoico (5 g) y resorcinol (5 g) en una disolucion acuosa de NaOH (2 g/25 ml de agua), y se mantuvo a reflujo durante 30 minutos. Despues de anadir de una disolucion acuosa de CuSO4 al 5% (15 ml), se puso la mezcla a reflujo durante unos 10 min adicionales. Con enfriamiento, la urolitina B (3-hidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona) precipito como un polvo blanco palido y se recristalizo en una disolucion de MeOH-acido acetico glacial (10:1) como agujas. De forma similar, se sintetizo 8- metoxi-urolitina A (3-hidroxi-8-metoxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona), a partir de acido 2-bromo-5-metoxibenzoico (1 g), resorcinol (1 g) y una disolucion acuosa de NaOH al 8% (2 g/25 ml de agua; 10 ml). La 8-metilurolitina A precipito como un polvo de color amarillo palido desde la disolucion y se recristalizo en una disolucion de MeOH-acido acetico glacial (10:1) como agujas. Los datos de CL-EM/EM de los derivados de la urolitina corresponden a los informes publicados (5, 13-15).

Ensayo celular antiproliferativo. Se midio la proliferacion usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Boletm tecnico n.° 288, Promega Corp., Madison, WI). Cuando se anadio a las celulas, el reactivo de ensayo produce luminiscencia en presencia de ATP procedente de celulas viables. Se sembraron las celulas en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 celulas/pocillo e se incubaron durante 24 horas. Se solubilizaron las muestras de ensayo en DMSO mediante sonicacion, se esterilizaron por filtracion y se diluyeron con medios hasta la concentracion de tratamiento deseada. Se trataron las celulas con 100 |il de medios de control, control de vehmulo (DMSO < 0,2% del total) o muestras de analisis e se incubaron durante un periodo de exposicion al farmaco de 48 horas a concentraciones de 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 |ig/ml. Al final de las 48 h, se equilibraron las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos; se anadieron 100 |il del reactivo de ensayo a cada pocillo y se indujo la lisis celular en un agitador orbital durante 2 min. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 10 min para estabilizar la senal de luminiscencia y se leyeron los resultados en un luminometro de microplacas Orion (Bertholds Detection Systems, Pforzheim, Alemania). Todas las placas teman pocillos de control que conteman medio sin celulas para obtener un valor para la luminiscencia de fondo. Se expresan los datos como porcentaje de celulas sin tratar (es decir, valor de tratamiento-blanco/ valor de vehmulo-blanco), media + D.E. para tres replicas.

Evaluacion de la apoptosis. Se evaluo la apoptosis usando el ensayo de deteccion de muerte celular ELISAPLUS (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Este ensayo es un inmunoensayo fotometrico ligado a enzimas que mide cuantitativamente la degradacion internucleosomica de ADN, que se produce durante la apoptosis. Espedficamente, el ensayo detecta mono y oligonucleosomas asociados a histonas que son indicadores de apoptosis. Se sembraron las celulas (22RV1, PC-3, LNCaP, LNCaP-AR) en placas de 60 mm a una densidad de 100.000 celulas/placa y se permitio que se fijasen durante 24 horas. Se trataron las celulas con control de vehmulo (DMSO al 100%; concentracion final del 0,3%) o urolitina B (0-50 |ig/ml o 0-236 |iM) durante 48 horas. Tras los tratamientos, se recogieron las celulas no adherentes y se sedimentaron a 200 x g durante diez minutos. Se desecho el sobrenadante; se lavo el sedimento celular con CMF-PBS fno y se volvio a centrifugar. Se lavaron las celulas adherentes con solucion salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio fna (CMF-PBS, cloruro de sodio 137 mmol/l, fosfato de potasio 1,5 mmol/l, fosfato de sodio 7,2 mmol/l, cloruro de potasio 2,7 mmol/l, pH 7,4), se tripsinizaron, se recogieron y se combinaron con las celulas no adherentes en un total de 1 ml de DMEM. Entonces se contaron tanto las celulas vivas como las muertas por exclusion de azul tnpano (Pierce, Rockford, IL) y se anadieron numeros iguales de celulas a la placa de microtitulacion para todos los grupos de tratamiento y se realizo el ensayo de apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se expresan los datos como absorbancia a 405 nm de cada muestra con respecto a los controles de vehmulo tal como sigue = valor de tratamiento-blanco/valor de vehmulo-blanco.

RESULTADOS

Actividad antiproliferativa. Se evaluaron el EA y los metabolitos de EA (acidos galico y galagico, urolitina B y urolitina A metilada) para determinar la actividad antiproliferativa frente a un panel de lmeas celulares de cancer de prostata humano (22Rv1, PC3, DU145, LNCaP, LNCaP-AR) y una lmea celular de cancer de prostata de raton (Hi-Myc). Los valores de CI50 se muestran en la tabla 1. Las lmeas celulares mostraron diferentes niveles de sensibilidad frente a metabolitos espedficos tal como sigue. La urolitina B era la mas eficaz frente a celulas LNCaP-AR con una CI50 de 28,5 |iM mientras que el derivado metilado de la urolitina A mostro el mayor efecto frente a esta misma lmea celular pero a una concentracion mucho mayor con una CI50 de 150,7 |iM. El EA era el mas eficaz frente a las celulas Hi- Myc con una CI50 de 1,7 |iM, el acido galico frente a 22Rv1 con una CI50 de 18,6 |iM y el acido galagico frente a LNCaP con una CI50 de 71,4 |iM.

Tabla 1. Valores de CI5q(|iM) de EA y metabolitos deEA frente a lmeas celulares de cancer de prostata

Urolitina B 8-Metil-urolitina A Acido elagico Acido galico Acido galagico

22RV1

117,6 127,0 41,7 18,5 166,1

DU145

59,4 466,5 96,0 29,4 197,7

HiMyc

59,9 586,2 1,7 73,5 82,7

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LNCaP

90,5 206,4 20,5 32,3 71,4

LNCaP-AR

28,5 150,7 82,6 29,2 82,4

PC3

127,2 526,4 83,6 110,9 83,6

Actividad proapoptotica. Se examino la urolitina B para determinar su capacidad para inducir la apoptosis de las lmeas celulares 22Rv1, PC3, LNCap y LNCaP-AR a concentraciones que oscilan entre 0 y 236 |iM (entre 0 y 50 |ig/ml) tal como se muestra en las figuras 5A-D. La urolitina B mostro efectos proapoptoticos estad^sticamente significativos frente a diferentes lmeas celulares tal como sigue: 59 |iM frente a 22Rv1 (p = 0,05), 29,5 |iM frente a PC3 (p = 0,05), 118 |iM frente a LNCaP (p = 0,01) y 59 |iM frente a LNCaP-AR (p = 0,01).

DISCUSION

Las propiedades biologicas atribuidas a las granadas y PJ se han relacionado con sus constituyentes fenolicos y, en particular, con sus ET principales, punicalagina (3,6-9). Se ha investigado previamente la actividad antiproliferativa de varios acidos fenolicos producidos por la accion de bacterias colonicas en flavonoides del te, soja y dtricos y se hallo que la actividad era espedfica de un metabolito particular (32). En el presente estudio, se han evaluado varios posibles y supuestos metabolitos de ET de granada incluyendo los acidos elagico, acido galico y galagico, la urolitina B y urolitina A metilada para determinar la actividad antiproliferativa frente a un panel de lmeas celulares de cancer de prostata humano (22Rv1, PC3, DU145, LNCaP, LNCaP-AR) y una lmea celular de cancer de prostata de raton (Hi-Myc) (tabla 1). Aunque no ha sido informado sobre el acido galico a partir de los estudios de biodisponibilidad con polifenoles de granada, puede estar presente en estado libre en las granadas y/o liberarse a partir de la hidrolisis de los galotaninos, que se sabe que estan presentes en las granadas El acido galico tiene una de las mayores biodisponibilidades entre los compuestos fenolicos de los alimentos (38). Debido a la no disponibilidad de un patron puro de urolitina A, no se monitorizo en los ensayos contrael cancer.

Las caractensticas de las lmeas celulares se describen a continuacion. 22Rv1 es una lmea celular epitelial de carcinoma de prostata humano con una debil respuesta a androgenos, expresion de antfgeno serico prostatico (PSA) y receptor de androgenos (AR). DU145 es un carcinoma de prostata metastasico humano aislado de tejido cerebral, no responde a androgenos, no expresa PSA ni AR. PC3 es una metastasis en hueso de un paciente con carcinoma de prostata metastasico con debil respuesta a androgenos, no expresa PSA ni AR. La lmea celular LNCaP es un carcinoma de prostata metastasico humano aislado de ganglio linfatico. A diferencia de las tres lmeas celulares mencionadas anteriormente, las celulas LNCaP son sensibles a androgenos y expresan PSA y AR. La lmea celular LNCaP-AR es la lmea celular LNCaP con el AR sobreexpresado de manera estable. Las cinco lmeas celulares son tumorigenicas en ratones desnudos. Hi-Myc es una lmea celular murina desarrollada para sobreexpresar el oncogen c-myc.

Los metabolitos de ET de granada inhibieron significativamente la proliferacion de celulas de prostata de manera dependiente de la dosis en las lmeas celulares sometidas a prueba (p < 0,01) y los valores de CI50 se muestran en la tabla 1. Estos resultados proporcionan datos en cuanto a la capacidad de estos compuestos para inhibir el crecimiento de diferentes lmeas celulares de prostata.

En los ensayos antiproliferativos, la urolitina B mostro ser de dos a diez veces mas potente que la urolitina A metilada en todas las lmeas celulares sometidas a prueba, dependiendo de la lmea celular. Las lmeas celulares eran sensibles a la urolitina B en el siguiente orden: LNCaP-AR < DU145 < HiMyc < LNCaP < 22Rv1 < PC3 (tabla 4). El acido galico fue hasta nueve veces mas eficaz en la inhibicion de la proliferacion de lmeas celulares de cancer de prostata que el acido galagico y hasta tres veces mas que el acido elagico (tabla 1). Las lmeas celulares eran sensibles al acido galico en el siguiente orden: 22Rv1 < LNCaP-AR < DU145 < LNCaP < Hi-Myc < PC3. Como con los metabolitos, el resultado mas interesante es que la lmea celular LNCaP-AR, que tiene un receptor de androgenos (AR) sobreexpresado es mas sensible a la inhibicion proliferativa que la lmea celular parental LNCaP. La sobreexpresion de AR es un rasgo distintivo de la enfermedad independiente de androgenos, por tanto es posible que los metabolitos de granada desempenen un papel en la prevencion del estadio de la enfermedad independiente de androgenos.

Mientras que se ha mostrado que los EA y otros ET inducen apoptosis en celulas cancerosas, no se han notificado los efectos proapoptoticos de las urolitinas. En estos estudios de apoptosis, se examino la urolitina B a concentraciones que oscilaron entre 0 y 236 |iM (de 0 a 50 |ig/ml) frente a celulas PC3, 22Rv, LNCaP y LNCaP-AR (figura 5). Las celulas PC3, 22Rv1 y LNCaP-AR fueron mas sensibles a la urolitina B que las celulas LNCaP (figura 5). Las concentraciones de urolitina B que indujeron apoptosis frente a estas lmeas celulares fueron de 29,5, 59, 59 y 118 |iM para las celulas PC3, 22Rv1m LNCaP-AR y LNCaP, respectivamente. Como con los datos de proliferacion, la lmea celular LNCaP-AR era mas sensible a los efectos de la urolitina B que la lmea celular parental LNCaP, lo que sugiere que el consumo de granada puede desempenar un papel en la progresion del cancer de prostata.

Se observo una variabilidad interindividual significativa de la produccion de urolitina entre los sujetos del estudio, lo que condujo a una posible clasificacion en sujetos productores y no productores de metabolitos. Se ha observado una variabilidad interindividual similar para otros polifenoles. Las urolitinas se producen como resultado de transformaciones metabolicas llevadas a cabo por la microflora colonica en EA y compuestos relacionados. Se han

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encontrado urolitinas en orina humana recogida 24 h despues de la ingestion de PJ y en orina de rata, 4 dfas despues de la ingestion de ET de granada, lo que sugiere que las producen bacterias colonicas. Se detectaron EA y metabolites de EA (glucuronido de acido dimetilelagico, glucuronido de urolitina A y glucuronido de urolitina B) en muestras de orina de 24 h de quince de los diecinueve sujetos. La glucuronidacion y metilacion forman parte del metabolismo hepatico de fase II que sirve para aumentar la solubilidad en agua y facilitar la excrecion. Los metabolites que fueron los mas prevalentes en los sujetos incluyeron el glucuronido de acido dimetilelagico y el glucuronido de urolitina B que se encontraron en 13 voluntarios.

Se ha demostrado la potente actividad antiproliferativa frente a celulas cancerosas para muchos flavonoides, pero solo se ha sometido a prueba un numero limitado de metabolitos colonicos. Se han evaluado previamente las urolitinas para determinar sus actividades antioxidantes y estrogenicas. El presente estudio es el primero que evalua la actividad antiproliferativa de urolitinas frente a una variedad de lmeas celulares de cancer de prostata humano, 22Rv1, PC3, DU145, LNCaP (tabla 1). EA presento la actividad antiproliferativa mas intensa en todas las lmeas celulares (tabla 1) siendo las celulas independientes de androgenos (DU145 y PC3) las mas resistentes. En los ensayos antiproliferativos, la urolitina B mostro ser de dos a diez veces mas potente que la metil-urolitina A en todas las lmeas celulares sometidas a prueba.

Tampoco se han estudiado previamente los efectos proapoptoticos de las urolitinas. En el ensayo de apoptosis, las celulas PC3 y 22Rv1 fueron mas sensibles a la urolitina B que las celulas LNCaP (figuras 4A-C).

En resumen, se han identificado metabolitos de ET que tienen actividad antiproliferativa y proapoptotica con respecto a las celulas cancerosas. Como tales, estos metabolitos encuentran uso como agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades neoplasicas. Ademas, estos hallazgos hacen posible examinar composiciones que contienen elagitaninos (por ejemplo, productos alimentarios) para determinar su capacidad para producir estos metabolitos beneficiosos en un individuo.

Ejemplo 2

Efecto de las urolitinas sobre celulas de cancer de colon

Actividad antiproliferativa. Se evaluaron EA y los metabolitos EA (acidos galico y galagico, urolitina B y urolitina A metilada) para determinar su actividad antiproliferativa frente a la lmea celular de cancer de colon humano HCT-116. Se hicieron crecer las celulas hasta una concentracion de 10.000 celulas por pocillo en un formato de 96 pocillos; y luego se resuspendieron en un medio que contema control de vehteulo o el compuesto indicado: acido elagico, urolitina A, metil-urolitina A o urolitina B, a una concentracion de 100 |ig/ml. Se incubaron las celulas durante 48 h, y se sometio a ensayo la viabilidad mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Boletm tecnico n.°288, Promega Corp., Madison, WI).

Estos datos, tal como se muestra en la figura 3, demuestran la eficacia de los metabolitos de elagitanino como agentes antiproliferativos. Los datos muestran que la urolitina A es la mas activa, luego el acido elagico, la urolitina B y la metil-urolitina A.

Ejemplo 3

Efecto de las urolitinas sobre celulas de cancer de pancreas

Actividad antiproliferativa. Se evaluaron EA y metabolitos de EA (acidos galico y galagico, urolitina B y urolitina A metilada) para determinar su actividad antiproliferativa frente a las lmeas celulares de cancer de pancreas humano ASPC-1 y BXPC-3. Se hicieron crecer las celulas hasta una concentracion de 10.000 celulas por pocillo; y luego se resuspendieron en un medio que contema el control de vehteulo o el compuesto indicado: acido elagico, urolitina A, metil-urolitina A o urolitina B, a una concentracion de 100 |ig/ml. Se incubaron las celulas durante 48 h, y se sometio a ensayo la viabilidad mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Boletm tecnico n.° 288, Promega Corp., Madison, WI).

Estos datos mostrados en la figura 4 demuestran la eficacia de los metabolitos de elagitaninos como agentes antiproliferativos. Los datos muestran que la urolitina A es la mas activa, luego el acido elagico, la urolitina B y la metil-urolitina A.

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Ejemplo 4

Metabolitos derivados de elagitaninos de granada inhiben el crecimiento de cancer de prostata y se localizan en la prostata de raton

Se ha mostrado previamente en un ensayo clmico de fase II que el zumo de granada aumenta el tiempo de duplicacion del antfgeno prostatico espedfico (PSA) en pacientes con cancer de prostata (CaP) con un PSA creciente. Usando un extracto de granada (PE) normalizado, se trato de definir adicionalmente el metabolismo y la distribucion tisular de los metabolitos de granada, y sus efectos in vivo sobre el crecimiento de xenoinjerto CaP humano en un modelo preclmico bien establecido.

Se administraron PE y un metabolito de granada, la urolitina A (UA), a ratones macho y se determinaron los niveles de metabolitos en plasma y tejidos a lo largo de 24 horas. Se administro control de vefnculo o PE por via oral a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) a los que se les inyecto por via subcutanea celulas CaP humanas (LAPC-4). Se estudiaron los efectos in vitro de los metabolitos de granada, acido elagico (EA) y urolitinas en lmeas celulares CaP dependientes e independientes de androgenos.

Los metabolitos de granada se concentraron a mayores niveles en la prostata y en los tejidos intestinales de los ratones en comparacion con otros tejidos despues de la administracion de PE o Ua. PE inhibio significativamente el crecimiento de xenoinjerto LAPC-4 en ratones SCID. Los metabolitos de PE, EA y las urolitinas, inhibieron el crecimiento de celulas CaP dependientes e independientes de androgenos in vitro.

Los efectos anticancerosos de PE en modelos preclmicos de CaP y la localizacion de metabolitos bioactivos en tejidos de prostata demuestran que PE puede desempenar un papel en el tratamiento y la quimioprevencion de CaP. Estos resultados forman una base solida para ensayos clmicos en hombres con CaP.

El consumo de zumo de granada por parte de pacientes con cancer de prostata (CaP) con antfgeno prostatico espedfico (PSA) creciente, tras la terapia primaria, aumento significativamente el tiempo de duplicacion de PSA medio de 15 a 54 meses (p<0,001). Los elagitaninos son los polifenoles predominantes que se encuentran en los frutos de granada, y tambien son los polifenoles mas abundantes en algunos frutos de bayas, tales como fresas, frambuesas, moras y uvas moscatel. Algunos estudios publicados han mostrado que los ET y su producto de hidrolisis, el acido elagico (EA), inhiben el crecimiento de celulas CaP a traves de una detencion del ciclo celular y la estimulacion de apoptosis. El zumo de granada y los extractos de granada (PE) tambien han mostrado que inhiben el crecimiento de CaP in vitro (ver Seeram et al. J Nutr Biochem.16 (2005), pag. 360; Lansky et al. Invest New Drugs 23 (2005), pag. 11). Asimismo, los PE administrados en dietas para animales han mostrado que inhiben el crecimiento del xenoinjerto CaP en ratones con una inmunodeficiencia combinada grave (SCID) (ver Albrecht et al. Med Food 7 (2004), pag. 274; Malik et al. Proc Natl Acad Sci. USA 102 (2005), pag. 14813).

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En voluntarios humanos, los ET del zumo de granada se hidrolizan para dar EA, y luego se convierten adicionalmente por bacterias intestinales para producir derivados de “urolitina A (UA)” biodisponibles (ver Seeram et al. J Nutr Biochem.16 (2005), pag. 360; Lansky et al. Invest New Drugs 23 (2005), pag. 11; Albrecht et al. Med Food 7 (2004), pag. 274; Malik et al. Proc Natl Acad Sci. USA 102 (2005), pag. 14813; Seeram et al. J Nutr. 136 (2006), pag. 2481; Cerda et al. Eur J Nutr. 43 (2004), pag. 205; Cerda, et al. J Agric Food Chem. 53 (2005), pag. 227; Cerda et al. Eur J Clin Nutr. 60 (2006), pag. 245). Las urolitinas aparecen en sangre, orina y heces de voluntarios humanos 12-24 horas despues del consumo de una unica dosis bebidas o comidas ricas en Et y persisten in vivo entre 45 y hasta 48-56 horas despues de la ingestion. A pesar de estos avances en la comprension del metabolismo de ET de granada en roedores y seres humanos, no ha habido ningun estudio que determine la disposicion de metabolitos de ET en tejidos de interes incluyendo la prostata, y ningun estudio in vitro que evalue el efecto antiproliferativo de las urolitinas. Por tanto, se planificaron los presentes estudios para analizar la bioactividad y la distribucion tisular de PE y UA, los efectos de PE administrado por via oral sobre el crecimiento de xenoinjerto CaP en ratones SCID y los efectos de derivados de EA y UA sobre lmeas celulares CaP dependientes de androgenos (LNCaP) e independientes dependientes de androgenos humanas in vitro.

MATERIALES Y METODOS

Extracto de granada. El extracto de granada (PE) obtenido de la piel del fruto de granada (Punica granatum L., Paramount Farms, Lost Hills, CA) se normalizo al 37% de ET (como punicalaginas) y el 3,5% de EA libre tal como se notifica (Seeram et al. Sep Purific Tech. 41 (2005), pag. 49). Se administro PE a los animales en dosis basadas en la cantidad de ET en una sola racion de zumo de granada (240 ml de zumo una unica concentracion, 80 mg de ET). Se calculo que la dosis equivalente que se le administrana a un ser humano de 70 kg para un raton de peso corporal de 25 g era de 0,03 mg de ET. Se uso diez veces (10 X) esta dosis en el estudio en animales (0,8 mg de PE por dosis por animal) para mejorar nuestra capacidad para detectar la distribucion fitoqmmica. Para estudios en que se administraron UA, se calcularon las dosis suponiendo la completa conversion de ET en UA. Esto da como resultado una dosis de 0,3 mg de US sintetizada purificada por animal. Se suspendieron tanto PE como UA en 50 |il de PBS o disolucion acuosa de glucosa al 10% para administracion intraperitoneal u oral, respectivamente.

Estudios de disposicion tisular. Se alimentaron ratones macho C57/B6 (n = 156 ratones procreadores retirados, 7 meses de edad, 25-30 g) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) con dietas AIN 93G y agua a voluntad, y se mantuvieron en ayunas 6 horas antes de la dosificacion. Se les dosifico a los ratones por via oral o por via intraperitoneal o bien PE (0,8 mg/raton/dosis; n = 72), UA (0,3 mg/raton/dosis; n = 72) o bien control de vehfculo (50 |il; n = 12 ratones). Se extrajeron muestras de sangre a las 0,5, 1, 2, 4, 6 y 24 h despues de la dosificacion y se extirparon tejidos de prostata, tugado, rinon, pulmon, colon, intestino y cerebro y se almacenaron a -80°C. Se homogeneizo el tejido recogido (200 mg) en metanol con acido acetico al 0,1% (1 ml) y se centrifugo a 3000 x g durante 10 min. Se seco el sobrenadante en un sistema SpeedVac y se reconstituyo con 200 |il de la fase movil de HPLC para un volumen de inyeccion final de 20 |il. Los homogeneizados de tejido de xenoinjerto requirieron hidrolisis acida antes de la cromatograffa tal como se informa (Gu et al. J Agric Food Chem. 53 (2005), pag. 6858). Se llevaron a cabo analisis mediante HPLC-UV y HPLC-EM/eM en un sistema Waters Alliance 2690 (Waters Corp., Milford, MA) un sistema LCQ Classic Finnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA), respectivamente, tal como se describio previamente (Seeram et al. Clin Chim Acta.348 (2004), pag. 63). Se construyeron curvas de calibracion lineal usando un metodo de patron interno con adiciones conocidas de EA o UA usando tejidos plasmaticos o hepaticos recogidos de ratones de control tal como se describio previamente. (Seeram et al. Clin Chim Acta.348 (2004), pag. 63). Los valores de exactitud variaron entre el 91-108% para las muestras de control de calidad que conteman el patron de EA o UA.

Estudio de xenoinjerto .Todos los ratones recibieron una dieta de investigacion convencional (AIN 93G, Dyets, Betlehem, PA) a voluntad en el transcurso del experimento. Se implantaron 2 x 106 celulas de cancer de prostata dependientes de androgenos LAPC-4 (donacion de Charles Sawyers) por via subcutanea en los hombros de 24 ratones SCID de 5 semanas de edad (Granja Taconic, Germantown, NY). Cuando los tumores se volvieron palpables, se les administro a los ratones por via oral 5 dfas a la semana (de lunes a viernes) o bien PE (n = 12 ratones) o bien control de vehfculo (n = 12 ratones). La dosificacion oral se consiguio sujetando suavemente al raton con una mano y suministrando el PE o control de vehfculo mediante una aguja de alimentacion para animales (Biomedical Needles, Popper y Sons Inc., New Hyde Park, NY) unida a una jeringa para tuberculina de 1 ml. Se midieron los tumores dos veces a la semana y se pesaron los ratones semanalmente. Se calcularon los volumenes tumorales usando la formula: longitud x anchura x altura x 0,5236 (Gleave et al. Cancer Res. 51 (1991); pag. 3753). En el sacrificio, se extirparon los tumores primarios y se extrajo sangre Todos los protocolos para animales fueron aprobados por la Universidad de California, Los Angeles Chancellor's Animal Care Committee.

Estudios de proliferacion in vitro. Se mantuvieron celulas DU145 y LNCaP (ATCC, Rockville, MD), celulas 22Rv1 (donacion de Pinchas Cohen) y celulas LNCAP-AR (donacion de Charles Sawyers) por debajo del pase 20 y se usaron en experimentos durante la fase lineal de crecimiento tal como se describio previamente (Seeram et al. J Nutr Biochem.16 (2005), pag. 360). Se adquirio EA de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se sintetizaron UA (3,8- dihidroxi-6H-benzo[6,d]cromen-6-ona), UA metilada y UA dimetilada en este laboratorio tal como se describio previamente (Ghosal et al. J Chem Res Synop.11 (1989), pag. 350). Se disolvieron los compuestos en dimetilsulfoxido (DMSO) luego se anadieron a medios para conseguir la concentracion de prueba deseada final con

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una concentracion en DMSO final que no superase el 0,1%. Se determino la proliferacion mediante la captacion de timidina tritiada tal como se describio previamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Analisis estad^stico. Para los ensayos de proliferacion celular, se expresan los datos como porcentaje de celulas sin tratar (es decir, valor de tratamiento-blanco/valor de vehteulo-blanco), media + D.E. para al menos tres experimented independientes. Se analizaron los datos o bien mediante la prueba de la t de Student o bien mediante ANOVA de un factor seguido por la prueba de rangos multiples de Dunnett (a = 0,05) con Graph Pad Prism 3.0 (Graph Pad Software Inc.) segun fuese apropiado. Se uso el paquete estadfstico R.2.5.1 para calcular la estadfstica descriptiva y generar las representaciones graficas mostradas en la figura 6.

RESULTADOS

Inhibicion del crecimiento de xenoinjerto. La administracion oral de PE condujo a una inhibicion significativa del crecimiento de xenoinjerto LAPC-4 con relacion al grupo de control de vehteulo (figura 5). Los volumenes tumorales se redujeron significativamente en el grupo tratado con PE con relacion al grupo de control a las cuatro semanas (0,35 + 0,19 frente a 0,20 + 0,14 cm3; p = 0,0280), las cinco semanas (0,78 + 0,39 frente a 0,39 + 0,26 frente a cm3; p = 0,005) y las seis semanas (1,18 + 0,37 frente a 0,47 + 0,28 cm3; p = 0,0002) despues de la inyeccion de celulas tumorales. Se encontro EA a mayores concentraciones en tejidos tumorales recogidos de tres ratones tratados con PE (1030 + 124,9 ng/g) en comparacion con ratones que recibieron el control de vehteulo (316,3 + 54,1 ng/g; p = 0,0008). No se detectaron UA y sus metabolitos en tejidos de xenoinjerto.

Distribucion tisular de los metabolitos de extracto de granada. Despues de la administracion oral de PE (a ratones sin xenoinjertos), se detecto EA en plasma a las 0,5 horas y se elimino despues de 2 h. El PE administrado por via intraperitoneal proporciono mayores niveles de EA en plasma a las 0,5 horas en comparacion con la dosificacion oral (134,5 + 12 frente a 11,5 + 1,4 ng/ml) y persistio en el plasma durante 6 h. No se detecto EA en tejido prostatico despues de la administracion de PE oral, mientras que se detecto a altas concentraciones en tejido prostatico (676 + 172 ng/g) y en menor grado en el intestino, colon e tngado despues de la administracion intraperitoneal. No se detecto UA, un metabolito de EA, en plasma o en tejidos tras la administracion de PE.

UA administrada por via oral se absorbio rapidamente y se capto en las mayores concentraciones en la prostata seguida por el intestino delgado y el colon (figura 6A). UA administrada por via intraperitoneal se concentro en prostata, colon e intestino con un maximo a las 2 h (figura 6B). Entre los metabolitos de Ua, se detectaron sulfato de UA y UA metilada principalmente en la prostata, mientras que el glucuronido de UA se encontro en mayor concentracion en los tejidos hepaticos y renales.

Bioactividad de metabolitos de PE in vitro. Se incubaron EA, UA sintetizada y metabolitos de UA sintetizados a concentraciones de 10-100 |imol/l con lmeas celulares CaP dependientes de androgenos (LNCaP) e independientes de androgenos (LNCaP-AR, DU145 y 22RV1). Todos los metabolitos mostraron efectos antiproliferativos dependientes de la dosis en todas las lmeas celulares sometidas a prueba. La CI50 de UA era menor que la de EA en todas las lmeas celulares (tabla 2). Entre los metabolitos de UA, UA metilada tuvo la mayor bioactividad en la inhibicion del crecimiento de celulas LNCaP y 22RV1. Los valores de CI50 para cada metabolito se resumen en la tabla 2.

Tabla 2. Valores de CI50 (|imol/l) de metabolitos de elagitaninos de granada en el crecimiento de celulas de cancer de prostata humano. Los datos se expresan como porcentaje de celulas sin tratar (esto es, valor de tratamiento- blanco/valor de vehteulo-blanco), media + D.E. para al menos tres experimentos independientes.

Celulas

EA UA mUA dmUA

LNCaP

62,4 + 4,2 31,3 + 0,5 15,9 + 4,7 71,4 + 13,5

LNCaP-AR

78,7 + 3,2 43,3 + 2,8 126,7 + 7,3 ND

DU145

74,3 + 5,2 49,8 + 3,9 43,3 + 3,5 70,7 + 13,0

22RVA TTT7----TT7—“777

108,7 + 16,6 47,8 + 3,2 6,2 + 0,8 85,0 + 8,6

'UA = UA, mUA = UA metilada, dmUA = UA dimetilada.

Los presentes estudios se disenaron para determinar la disposicion tisular de los metabolitos de extracto de granada, EA y urolitinas, y para determinar si los metabolitos se localizan en la prostata y en xenoinjertos de tumor de prostata. Se estudio la urolitina A (UA) en detalle. En el presente estudio, la administracion oral de PE a ratones condujo a niveles aumentados de EA en plasma, pero no se detecto EA en la prostata. Por otro lado, la administracion intraperitoneal de PE condujo a niveles diez veces mayores de EA en plasma, y niveles de EA mayores y detectables en prostata, intestino y colon con relacion a otros sistemas de organos. Los niveles de EA detectables en tejido prostatico tras la administracion peritoneal pero no oral, se deben probablemente a los mayores niveles en plasma obtenidos despues de la administracion intraperitoneal. La administracion intraperitoneal y oral de UA condujo a la captacion de UA y sus conjugados en el tejido prostatico, y los niveles de urolitina eran mayores en tejidos prostaticos e intestinales con relacion a otros sistemas de organos. De manera importante, la predileccion de los metabolitos bioactivos de granada por localizarse en tejido prostatico combinado con datos preclmicos que demuestran los efectos anticancengenos demuestra el potencial de los productos de granada para desempenar un

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papel en la quimioprevencion del cancer de prostata.

Este es el primer estudio que demuestra que las urolitinas tienen una potente actividad antiproliferativa frente a lmeas celulares de cancer de prostata dependientes de androgenos e independientes de androgenos, con valores de CI50 menores que EA.

Tras la administracion de UA, varios conjugados de UA pudieron detectarse en la prostata. La UA y otros polifenoles se metabolizan por enzimas hepaticas de fase II incluyendo glucuronosil transferasas para formar glucuronidos, sulfotransferasas para formar sulfatos y catecol-o-metiltransferasas para formar derivados metilados. Estos procesos metabolicos de fase II aumentan la hidrofilicidad de los metabolitos y facilitan su excrecion. El sulfato de Ua fue el principal producto metabolico de UA en este estudio, lo que sugiere que entre las enzimas de fase II, las sulfotransferasas desempenaron un papel principal en la transformacion de UA. De forma importante, la UA y los conjugados de UA que se concentraron en la prostata de raton en el presente estudio teman actividad antiproliferativa frente a lmeas celulares CaP sensibles e insensibles a androgenos humanas.

Aunque la invencion anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustracion y ejemplo con fines de claridad y comprension, resulta facilmente evidente para los expertos habituales en la tecnica a la luz de las ensenanzas de esta invencion que pueden realizarse determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espmtu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Por consiguiente, lo anterior simplemente ilustra los principios de la invencion. Se apreciara que los expertos en la tecnica podran concebir diversas disposiciones que, aunque no se describan o muestren explfcitamente en el presente documento, presentan los principios de la invencion y se incluyen dentro de su espmtu y alcance. Ademas, todos los ejemplos y lenguaje condicional citados en el presente documento estan destinados principalmente a ayudar al lector a comprender los principios de la invencion y los conceptos con los que contribuyen los inventores para hacer avanzar la tecnica, y han de interpretarse como que carecen de limitacion para tales ejemplos y condiciones citados espedficamente. Ademas, todas las declaraciones en el presente documento que citan principios, aspectos y realizaciones de la invencion asf como ejemplos espedficos de la misma, pretenden abarcar tanto equivalentes conocidos actualmente como equivalentes desarrollados en el futuro, por ejemplo, cualquier elemento desarrollado que realice la misma funcion independientemente de su estructura. Por tanto, no se pretende que el alcance de la presente invencion se limite a las realizaciones a modo de ejemplo mostradas y descritas en el presente documento. Mas bien, el alcance y espmtu de la presente invencion se presenta mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

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2. 2.

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3. 3.
4. 4.
5. 5.

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6. 6. 7.

   25 8.

   REIVINDICACIONES

   Compuesto seleccionado del grupo consiste en: urolitina B, urolitina A, hidroxi-urolitina A, metil-urolitina A y un compuesto representado por la estructura

   imagen1

   en la que

   R1 es H; OH; u OR3;

   R2 es H o alquilo C1 a C10; y R3 es alquilo C-i a C10

   para su uso en el tratamiento en un sujeto de un cancer seleccionado del grupo que consiste en: un sarcoma, un melanoma, un carcinoma de celulas escamosas de boca, garganta, laringe o pulmon, un cancer genitourinario seleccionado de cancer de cuello uterino o de vejiga, un cancer hematopoyetico, un cancer de cabeza y cuello, un cancer del sistema nervioso, cancer de prostata, cancer de pancreas y cancer de colon.

   Compuesto para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho cancer es uno de cancer de prostata, cancer de pancreas y cancer de colon.

   Compuesto para su uso segun la reivindicacion 2, en el que dicho cancer es cancer de prostata, y dicho cancer de prostata es independiente de androgenos.

   Compuesto para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho cancer es cancer hematopoyetico.

   Compuesto para su uso segun la reivindicacion 4, en el que cancer hematopoyetico se selecciona del grupo que consiste en: linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin y una leucemia.

   Compuesto para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en: urolitina B, urolitina A, hidroxi-urolitina A y metil-urolitina A.

   Compuesto para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho sujeto es un mamifero.

   Compuesto para su uso segun la reivindicacion 7, en el que dicho mamifero es un ser humano.