ES2587652T3 - Astaxantina para mejorar la atrofia muscular - Google Patents

Abstract

Un agente para uso en el tratamiento de la atrofia muscular que incluye: al menos uno de astaxantina y un éster de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Astaxantina para mejorar la atrofia muscular Campo tecnico

La presente invencion se relaciona, en general, con un agente regulador de la expresion genica que comprende astaxantina y/o su ester como principio activo y con un alimento y una bebida que tienen un efecto de regulacion de la expresion genica y que contienen astaxantina y/o su ester. El alcance de la invencion queda definido por las reivindicaciones adjuntas.

Tecnica anterior

En los ultimos anos, se ha prestado atencion a la relacion existente entre el dano oxidativo inducido por substancias oxidadas y la cardiopatfa coronaria, el cancer, el envejecimiento o similares, especialmente a la relacion con el deterioro de los tejidos y la inhibicion de la funcion enzimatica o la expresion genica debido a la oxidacion de moleculas en el organismo vivo. La inhibicion del dano oxidativo inducido por los radicales libres puede reducir el riesgo de padecer dichas enfermedades degenerativas. Existen informes sobre la inhibicion de la oxidacion de moleculas en el organismo vivo por medio de antioxidantes naturales o sinteticos.

En los ultimos anos, se ha visto que la astaxantina, que es un tipo de carotenoide al igual que el p-caroteno, tiene un fuerte efecto antioxidante, de 100 a 1.000 veces mas fuerte que la vitamina E (a-tocoferol) y aproximadamente 40 veces mas fuerte que el p-caroteno. La astaxantina es un colorante rojo y se ha comido desde hace mucho tiempo. Esta ampliamente distribuida en la naturaleza, especialmente en el oceano, y se encuentra en, por ejemplo, crustaceos tales como gambas y cangrejos, peces tales como el salmon y el pargo, algas tales como el alga verde Haematococcus y levaduras tales como la levadura roja Phaffia. La astaxantina solfa ser tratada unicamente como un colorante; sin embargo, desde los descubrimientos antes mencionados, se espera que la astaxantina sea un alimento sano en la industria.

La astaxantina tiene otras propiedades funcionales, y existen muchos informes sobre ello, incluyendo, por ejemplo, un efecto antiinflamatorio, un efecto antiaterogenico, un efecto mejorador de la capacidad para recordar, un efecto de ajuste del ritmo diurno, un efecto inmunoestimulante, un efecto antiestres, un efecto mejorador de la resistencia muscular, un efecto protector de la retina frente a los danos inducidos por la luz, un efecto mejorador de la funcion reguladora de los ojos, un efecto mejorador de la calidad del esperma e inhibicion de la induccion del cancer de vejiga. Ademas, en cuanto a los efectos sobre la piel, se reportan efectos de inhibicion de la pigmentacion, de la produccion de melanina y del envejecimiento debido a la luz.

Se ha dicho que la administracion de astaxantina a ratones diabeticos reduce el nivel de glucosa en sangre y que la astaxantina tiene un efecto sobre el mejoramiento de la nefropatfa diabetica (Literatura no de patente 1). Ademas, la Literatura de patente 1 describe que la administracion de astaxantina a ratones diabeticos reduce el smtoma de nefropatfa diabetica y proporciona un sistema de ingestion de alimento en base a las pruebas de ADN de un organismo individual.

Sin embargo, no se conoce la regulacion de la expresion genica por la astaxantina y/o su ester.

Literatura no de patente 1

Naito Y. et al.; Astaxanthin protects beta-cells against glucose toxicity in diabetic db/db mice. Redox Rep, 7(5), 290-3, 2002.

Literatura de patente 1

Solicitud de Patente Japonesa Abierta al Publico N° 2003-265136 US6258855 desvela un metodo consistente en administrar una fuente de astaxantina en una cantidad terapeuticamente efectiva para prevenir, retardar y mejorar el smdrome del tunel carpiano y la tensinovitis.

Divulgacion de la invencion

Los inventores de la presente invencion buscaron substancias que regularan la expresion genica con objeto de resolver los problemas antes mencionados. Como resultado, vieron que astaxantina y/o su ester actuan regulando la expresion genica. La invencion ha sido conseguida en base a dichos hallazgos y proporciona un agente para uso en el tratamiento de la atrofia muscular segun la reivindicacion 1. Se describen aqrn un agente regulador de la expresion genica que incluye astaxantina y/o su ester como principio activo y un alimento y una bebida que tienen un efecto de regulacion de la expresion genica que contienen astaxantina o un ester de la misma.

Es un objeto de la presente divulgacion proporcionar un agente regulador de la expresion genica que incluye astaxantina y/o su ester como principio activo y un alimento y una bebida que tienen un efecto de regulacion de la expresion genica que contienen astaxantina o un ester de la misma. El agente y el alimento y la bebida de la

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divulgacion son utiles para tratar, mejorar y prevenir la enfermedad causada por la promocion de la expresion genica y la enfermedad causada por la supresion de la expresion genica mediante la regulacion de la expresion genica anormal.

Los inventores han investigado a fondo y han visto que la astaxantina y/o su ester tienen un efecto de regulacion de la expresion genica. La invencion se basa en dichos hallazgos.

Los ejemplos de referencia aqu presentados incluyen (1) un metodo para regular la expresion genica, que incluye la administracion de al menos uno de astaxantina y un ester de la misma como principio activo; (2) un metodo para regular la expresion genica relacionada con citoquinas, que incluye la administracion de al menos uno de astaxantina y un ester de la misma como principio activo; (3) un metodo para regular la expresion genica relacionada con TGF-p, que incluye la administracion de al menos uno de astaxantina y un ester de la misma como principio activo; (4) un metodo para regular la expresion genica relacionada con colageno, que incluye la administracion de al menos uno de astaxantina y un ester de la misma como principio activo; (5) un metodo para regular la expresion de un gen relacionado con el aumento y la disminucion de las celulas musculares y de las celulas oseas, que incluye la administracion de al menos uno de astaxantina y un ester de la misma como principio activo; (6) el metodo para regular la expresion genica segun cualquiera de (1) a (5), donde el al menos uno de astaxantina y un ester de la misma es administrado como principio activo en forma de un alimento o de una bebida, y (7) un metodo para utilizar al menos uno de astaxantina y un ester de la misma para producir el agente regulador de la expresion genica de cualquiera de (1) a (6).

Breve descripcion del dibujo

La FIG. 1 es una microfotograffa del glomerulo renal del Ejemplo de referencia 1. db/db, db/db(Ax) y db/m son los glomerulos renales de ratones db/db, ratones a los que se ha administrado astaxantina y ratones db/m, respectivamente.

Mejor modo de realizacion de la invencion

De aqu en adelante, se describira la invencion con detalle. En la presente divulgacion, "efecto de regulacion de la expresion genica" se refiere al efecto de regulacion de la expresion genica anormal, que causa diversos tipos de enfermedades debido a una variedad de factores, a la expresion genica en condiciones normales, es decir, que cuando se promueve la expresion genica anormalmente, se inhibe la expresion genica, y, cuando se suprime la expresion genica anormalmente, se promueve la expresion genica, regulando asf la expresion genica de una manera apropiada.

El gen que ha de ser regulado puede ser cualquier tipo sin limitacion; como ejemplos del mismo, se incluyen genes relacionados con la oxidacion, con citoquinas, con el colageno, con el TGF y con el aumento y la disminucion de celulas musculares y de celulas oseas.

Como ejemplos espedficos del mismo, se incluyen genes relacionados con la produccion de enzimas o factores implicados en la oxidacion, tales como peroxirredoxina, catalasa, isocitrato deshidrogenasa (NSDAP+) y superoxido dismutasa; genes relacionados con la produccion de enzimas o factores relacionados con las citoquinas, tales como septina, fibrosina, granulina, protema dactilar RING, protema fosfatasa, fosfoprotema segregada, tirosina kinasa de tipo FMS, receptor de eritropoyetina, factor estimulante de colonias, interleuquina y fibrosina; genes relacionados con la produccion de enzimas o factores relacionados con el colageno, tales como el receptor del factor de crecimiento de tipo insulina, los receptores de los depuradores de macrofagos, el colageno de tipo XXV, el procolageno de tipo IV, C1q y la protema relacionada con el factor de necrosis tumoral, el factor relacionado con C1q y la metaloproteinasa de la matriz; genes relacionados con la produccion de enzimas o factores relacionados con el TGF, tales como la protema de union a FK506, la catenina beta, el homologo de MAD, el transcripto inducido por TGF beta y fosfoprotemas seleccionadas; y genes relacionados con la produccion de enzimas o factores relacionados con el aumento y la disminucion de las fibras musculares o de las celulas musculares y las celulas oseas, tales como fosfatidil inositol 3 kinasa, lisosoma proteasa, proteasa citoplasmica, RT1 y neuronatina.

El agente regulador de la expresion genica de la divulgacion del que la astaxantina y/o su ester forman parte y el alimento y la bebida de la divulgacion de los que la astaxantina y/o su ester forman parte pueden tratar, mejorar y/o prevenir la enfermedad causada por la anormalidad de la expresion genica.

El termino "astaxantina" en la invencion significa las que derivan de fuentes naturales o de fuentes sinteticas. Como ejemplos de las derivadas de fuentes naturales, se incluyen las derivadas de cascaras de crustaceos, tales como gambas, kril y cangrejos; pieles o huevos de diversos tipos de peces y marisco; algas, tales como el alga verde Haematococcus; levaduras, tales como la levadura roja Phaffia; bacterias marinas; plantas con semillas, tales como Adonis y ranunculo. Se puede disponer facilmente de extractos naturales y de compuestos qmmicamente sintetizados.

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La astaxantina puede ser obtenida cultivando, por ejemplo, la levadura roja Phaffia, el alga verde Haematococcus o bacterias marinas en un cultivo apropiado segun un metodo conocido en la tecnica. El alga verde Haematococcus es la mas adecuada en terminos de facil cultivo y extraccion y debido a que los productos resultantes contienen astaxantina en la mas alta concentracion y la productividad es elevada. Para el metodo de cultivo para obtener productos que contienen una gran cantidad de astaxantina a partir de algas verdes Haematococcus, es preferible un metodo de cultivo de tipo cerrado, que evita la mezcla y propagacion de microorganismos heterologos y permite que se mezclen menos impurezas. Por ejemplo, son adecuados los metodos siguientes: un metodo en el que se realiza el cultivo usando un aparato de cultivo que comprende un dispositivo de cultivo de tipo parcialmente abierto de forma abovedada, de forma conica o de forma cilmdrica, y un dispositivo de descarga de gas dispuesto de forma que pueda moverse en el dispositivo de cultivo (Publicacion Internacional N° WO 99/50384); un metodo en el que se realiza el cultivo irradiando en el interior con luz de una fuente luminosa dispuesta dentro de un dispositivo de cultivo de tipo cerrado; y un metodo en el que se realiza el cultivo en un fermentador tabular.

Se conocen diversos metodos para la extraccion o purificacion a partir del cultivo o de los crustaceos. La astaxantina y sus esteres son substancias liposolubles. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden extraer componentes que contengan astaxantina de fuentes naturales que contengan astaxantina con un solvente organico liposoluble, tal como acetona, alcohol, acetato de etilo, benceno y cloroformo. Ademas, tambien se puede realizar una extraccion supercntica usando dioxido de carbono y agua. Tras la extraccion, se puede obtener una mezcla concentrada de la forma monoester de astaxantina y la forma diester de astaxantina eliminando el solvente segun un metodo habitual. Se puede purificar luego el concentrado resultante con una columna de separacion o por degradacion con lipasas, de ser necesario.

De manera alternativa, la astaxantina puede ser extrafda desecando algas Haematococcus cultivadas en el dispositivo de cultivo de forma abovedada o de tipo cerrado, extrayendo con acetona despues de triturar, o realizando simultaneamente una trituracion y una extraccion en acetona, y eliminando luego la acetona. Este procedimiento es ventajoso porque los extractos resultantes contienen menos impurezas, es decir, menos substancias que inhiban el efecto de regulacion de la expresion genica de la invencion, y por lo tanto contienen mas astaxantina y triglicerido con una gran pureza.

Se puede usar la astaxantina en formas tales como extractos de astaxantina obtenidos mediante el metodo antes mencionado y polvos o soluciones que contienen los extractos, o productos desecados de v.g., la levadura roja Phaffia, el alga verde Haematococcus o bacterias marinas y productos triturados de los mismos.

La astaxantina es 3,3'-dihidroxi-p,p-caroteno-4,4'-diona y tiene estereoisomeros. Concretamente, se conocen tres estereoisomeros, (3R,3'R)-astaxantina, (3R,3'S)-astaxantina y (3S,3'S)-astaxantina, todos los cuales pueden ser usados en la invencion.

En la descripcion de la invencion, "astaxantina" incluye astaxantina y/o su ester a menos que se describa algo diferente. Ademas, los esteres de astaxantina incluyen la forma monoester y/o la forma diester.

Se sabe que no se ha observado que la astaxantina tenga ninguna mutagenicidad y que es un compuesto altamente seguro. Es ampliamente utilizada como aditivo alimentario (Takahashi Jiro et al.; Toxicity test of Haematococcus alga astaxanthin-Ames test, rat single-dose toxicity test, rat 90-day repeat dose oral toxicity test-, Rinsho lyaku, 20: 867881,2004.).

Se puede usar al menos una de la forma libre, la forma monoester y la forma diester de astaxantina para el agente regulador de la expresion genica aqrn descrito que incluye astaxantina y/o su ester como principio activo. La forma diester es ffsicamente mas estable que la forma libre y la forma monoester y es diffcil que resulte afectada por la descomposicion oxidativa, ya que sus dos grupos hidroxi estan protegidos por enlaces ester. Sin embargo, cuando entra en el organismo vivo, se considera que se hidroliza rapidamente a astaxantina libre por enzimas in vivo para ejercer su efecto.

Como monoesteres de astaxantina, se incluyen esteres de acidos grasos saturados inferiores o superiores, o esteres de acidos grasos insaturados inferiores o superiores. Como ejemplos espedficos del acido graso saturado inferior o superior, o del acido graso insaturado inferior o superior, se incluyen acido acetico, acido laurico, acido minstico, acido pentadecanoico, acido palmftico, acido palmitoleico, acido heptadecanoico, acido elafdico, acido ricinoleico, acido petroselmico, acido vaccenico, acido eleoestearico, acido punidnico, acido licanoico, acido palinalico, acido gadolico, acido 5-eicosenoico, acido 5-docosenoico, acido cetolico, acido ercinoico, acido 5,13- docosadienoico, acido selacolico, acido decenoico, acido stering, acido dodecenoico, acido oleico, acido estearico, acido eicosapentaenoico, acido docosahexaenoico, acido linoleico, acido linolenico y acido araquidonico. Como diesteres de astaxantina, se incluyen diesteres de los mismos acidos grasos o de otros diferentes seleccionados entre el grupo consistente en los acidos grasos anteriormente mencionados.

Ademas, como ejemplos de monoester de astaxantina, se incluyen monoesteres de un aminoacido, tal como glicina y alanina; un acido mono- o policarboxflico, tal como acido acetico y acido dtrico; un acido inorganico, tal como

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acido fosforico y acido sulfurico; un azucar, tal como un glucosido; un acido graso de azucar, tal como glicoglicero- acido graso y esfingoglico-acido graso; un acido graso, tal como acido glicerograso; acido glicerofosforico; y similares. Cuando es posible, tambien se incluyen sales de los monoesteres antes mencionados.

Como diesteres de astaxantina, se incluyen diesteres compuestos por los mismos acidos u otros diferentes seleccionados entre el grupo consistente en los acidos grasos saturados inferiores, los acidos grasos saturados superiores, los acidos grasos insaturados inferiores, los acidos grasos insaturados superiores, los aminoacidos, los acidos mono- o policarboxflicos, los acidos inorganicos, los azucares, los acidos grasos de azucares, los acidos grasos y los acidos glicerofosforicos antes mencionados. Cuando es posible, tambien se incluyen sales de los diesteres antes mencionados. Como ejemplos de diesteres de acido glicerofosforico, se incluyen esteres de acidos grasos saturados de acido glicerofosforico y esteres de acido glicerofosforico que contienen acidos grasos seleccionados entre acidos grasos insaturados superiores, acidos grasos insaturados o acidos grasos saturados.

El agente regulador de la expresion genica aqrn descrito es util para tratar, mejorar y/o prevenir el aumento de enzimas y factores causado por una expresion anormal y la disminucion o deficiencia de enzimas y factores causada por una supresion anormal. Mediante la regulacion de la expresion genica, se puede regular la produccion y/o la inhibicion de enzimas y factores. Asf, el agente regulador de la expresion genica tiene un efecto sobre el tratamiento, el mejoramiento y/o la prevencion de enfermedades que se dice se desarrollan debido a una expresion genica anormal, por ejemplo, arteriosclerosis, hipertension, diabetes, cancer, hiperlipemia, reumatismo, gota, accidente cerebrovascular, cardiopatfa isquemica, enfisema pulmonar, ulcera gastrica, pancreatitis, nefritis, catarata, enfermedad de Alzheimer, enfermedad alergica, envejecimiento, neuropatfa como complicacion de la diabetes, retinopatfa, enfermedades relacionadas con nefropatfa y hemopatfa. En caso de neuropatfa, el agente tiene un efecto sobre el tratamiento, el mejoramiento y/o la prevencion de la perdida repentina de audicion, de la anormalidad en los ojos o en la cara (paralisis y dolor), de la hipotension ortostatica, de la dishidrosis, de la diarrea y de la constipacion (smtoma digestivo), de la alteracion urinaria, del dolor de las extremidades, de la anormalidad sensorial, de la atrofia de los musculos y de la gangrena. En caso de retinopatfa, el agente tiene un efecto sobre la degeneracion macular, el glaucoma, la catarata, la retinopatfa simple, la retinopatfa preproliferativa y la retinopatfa proliferativa. En caso de hemopatia, el agente tiene un efecto sobre el tratamiento, el mejoramiento y/o la prevencion del infarto cerebral y del infarto de miocardio.

El agente regulador de la expresion genica para uso segun la invencion que incluye astaxantina y/o su ester como principio activo puede ser administrado oral o no oralmente. El agente puede ser administrado oralmente en forma solida, tal como una tableta, una tableta de desintegracion oral, una capsula, un granulo y un granulo fino, o en forma lfquida, tal como un jarabe y una suspension. El agente puede ser administrado no oralmente en una forma tal como una inyeccion, un colirio, gotas nasales, una preparacion adhesiva, un unguento y un supositorio.

El agente regulador de la expresion genica para uso segun la invencion que incluye astaxantina y/o su ester como principio activo puede incluir diversos tipos de aditivos utilizados en la produccion de formulaciones generales en una cantidad apropiada. Como ejemplos de dichos aditivos, se incluyen excipientes, ligantes, acidulantes, agentes espumantes, edulcorantes artificiales, saborizantes, lubricantes, colorantes, estabilizadores, ajustadores del pH, surfactantes y similares. Como ejemplos de excipientes, se incluyen almidones, tales como almidon de mafz, almidon de patata, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon parcialmente pregelatinizado, almidon pregelatinizado y almidon poroso; azucares, tales como lactosa, fructosa y glucosa; alcoholes de azucares, tales como manitol, xilitol, eritritol, sorbitol y maltitol; y compuestos inorganicos, tales como aluminometasilicato de magnesio, hidrotalcita, fosfato de calcio anhidro, carbonato de calcio precipitado, silicato de calcio y acido silfcico anhidro ligero. Como ejemplos de ligantes, se incluyen hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, polvo de goma arabiga, gelatina y pululano. Como ejemplos de desintegrantes, se incluyen almidon, agar, carmelosa calcio, carboximetilalmidon sodio, croscarmelosa sodio, crospovidona y celulosa cristalina. Como ejemplos de acidulantes, se incluyen acido cftrico, acido tartarico, acido malico y acido ascorbico. Como ejemplos de agentes espumantes, se incluyen hidrogeno carbonato de sodio y carbonato de sodio. Como ejemplos de edulcorantes, se incluyen sacarina sodica, glicirrizinato dipotasico, aspartame, Stevia y taumatina. Como ejemplos de saborizantes, se incluyen aceite de limon, aceite de naranja y mentol. Como ejemplos de lubricantes, se incluyen estearato de magnesio, esteres de sacarosa y de acidos grasos, polietilenglicol, talco, acido estearico y estearilfumarato de sodio. Como ejemplos de colorantes, se incluyen colorantes alimentarios, tales como el Amarillo Alimentario N° 5, el Rojo Alimentario N° 2 y el Azul Alimentario N° 2, colorantes de lacas alimentarios y trioxido diferrico. Como ejemplos de estabilizadores, se incluyen edentato de sodio, tocoferol y ciclodextrinas. Como ejemplos de ajustadores del pH, se incluyen citrato, fosfato, carbonato, tartrato, fumarato, acetato y una sal de aminoacido. Como ejemplos de surfactantes, se incluyen polisorbato 80, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa sodio, monolaurato de polioxietilensorbitan, goma arabiga y tragacanto en polvo. La astaxantina puede ser formulada como un polvo o un granulo tras granulacion humeda.

Se pueden obtener formas lfquidas, tales como un jarabe, una bebida, una suspension, un colirio y una inyeccion, preparando un principio activo en presencia de un ajustador del pH, de un tampon, de un resolvente, de una suspension, de un agente de tonicidad, de un estabilizador, de un conservante, etc. en base a lo que resulte necesario segun un metodo habitual. Como ejemplos de suspensiones, se incluyen polisorbato 80, metilcelulosa,

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hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa sodio, monolaurato de polioxietilensorbitan, goma arabiga y tragacanto en polvo. Como ejemplos de resolventes, se incluyen polisorbato 80, polioxietileno aceite de ricino hidrogenado, amida del acido nicotrnico, monolaurato de polioxietilensorbitan, macrogol y ester etflico de acido graso aceite de ricino. Como ejemplos de estabilizadores, se incluyen sulfito de sodio y metasulfito de sodio. Como ejemplos de conservantes, se incluyen p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de etilo, acido sorbico, fenol, cresol y clorocresol.

Con objeto de aumentar el efecto de regulacion de la expresion genica, se pueden anadir substancias que tengan capacidad antioxidante. Se piensa que un antioxidante aumenta el efecto de la astaxantina, por ejemplo, inhibiendo la oxidacion de la astaxantina en el agente regulador de la expresion genica de la invencion, o inhibiendo la oxidacion de la astaxantina en el organismo vivo. El antioxidante no esta particularmente limitado y son aplicables los que tienen un efecto antioxidante. El antioxidante puede ser seleccionado entre el grupo consistente en vitaminas A, tales como el retinol y el 3,4-dideshidrorretinol; vitamina B; vitaminas C, tales como el acido D-ascorbico y el acido L-ascorbico; vitaminas E, tales como el tocoferol, el tocotrienol, el acetato de vitamina E, el succinato de vitamina E y el fosfato de vitamina E; carotenoides, tales como el p-caroteno y la lutema, y sales farmaceuticamente aceptables de estos; coenzima Q, flavonoide, tanino, acido elagico, polifenoles, acidos nucleicos, hierbas medicinales, algas marinas y substancias inorganicas; y sus mezclas. Se pueden usar solos o en combinacion. Ademas, se puede conseguir el mismo efecto incluyendo un fruto, o algas, hongos o similares, que contengan estos en el agente de la invencion.

Para una preparacion externa para la piel, ademas de los componentes anteriores se pueden incluir apropiadamente segun sea necesario componentes para uso en una preparacion externa para la piel, tales como cosmeticos y medicinas habituales, por ejemplo, un agente blanqueante, un humectante, un antioxidante, un componente oleoso, un absorbente ultravioleta, un surfactante, un espesante, un alcohol, un componente en polvo, un material colorante, un componente acuoso, agua, un suplemento nutricional para la piel o similar.

La cantidad de astaxantina o su ester para uso en el agente regulador de la expresion genica para uso segun la invencion corresponde a una dosificacion de 0,5 mg a 100 mg, preferiblemente de 1 mg a 20 mg, en terminos de astaxantina libre al dfa para adultos, administrados oral o no oralmente. La dosificacion puede variar dependiendo de la edad, del peso corporal o del grado de los smtomas de un paciente al que se ha de administrar, o de la forma de administracion. El agente farmaceutico para uso segun la invencion puede contener astaxantina en una cantidad del 0,01% en peso al 99,9% en peso, preferiblemente del 0,1% en peso al 90% en peso.

La presente divulgacion incluye un alimento y una bebida que tienen un efecto de regulacion de la expresion genica y que contienen astaxantina o su ester.

Como ejemplos de la forma del alimento y de la bebida, se incluyen alimentos comunes, tales como margarina, mantequilla, salsa de mantequilla, queso, nata cruda, manteca vegetal, manteca de cerdo, helado, yogur, productos lacteos, productos de salsa de carne, productos de pescado, encurtidos, patatas fritas, patatas a la inglesa, aperitivos, rebanadas finas de torta de arroz desecada, palomitas de mafz, polvo condimentado para espolvorear sobre arroz, goma de mascar, chocolate, budm, gelatina, golosinas gomosas, golosinas, gominolas, caramelo, pan, bizcocho, tarta, rosquilla, galletas, galletitas dulces, galletitas saladas, macarrones, pasta, fideos chinos en sopa, fideos de alforfon, fideos de harina de trigo, aceites para ensalada, sopa instantanea, alinos, huevos, mahonesa, miso o bebidas carbonatadas o no carbonatadas, tales como bebidas de frutas, refrescos, bebidas deportivas, bebidas no alcoholicas tales como te, cafe y cacao, o bebidas alcoholicas tales como licor, y bebidas alcoholicas medicinales.

El alimento y la bebida para uso segun la invencion pueden ser producidos formulando astaxantina y/o su ester con materias primas de alimentos comunes y procesando segun un metodo habitual. La cantidad de astaxantina y/o su ester para la formulacion es diferente segun la forma de alimento y no esta particularmente limitada. En general, la cantidad es del 0,00001% en peso al 10% en peso, preferiblemente del 0,0001% en peso al 5% en peso, y la astaxantina y/o su ester son ajustados de tal manera que haya la cantidad necesaria de astaxantina y/o su ester para ejercer el efecto de prevencion o mejoramiento. La cantidad de astaxantina y/o su ester que se ha de utilizar puede ser seleccionada apropiadamente dependiendo del tipo de alimento y bebida por los expertos en la tecnica, y la cantidad corresponde a una ingesta de 0,5 mg a 100 mg, preferiblemente de 1 mg a 20 mg al dfa para adultos.

Cuando el alimento y la bebida son usados como alimentos nutricionales y suplementarios o como alimentos funcionales, sus formas pueden ser las mismas que la de la preparacion farmaceutica antes mencionada. Tambien se pueden usar en combinacion protema de leche, protema de soja o protema de albumina de huevo, o su producto de descomposicion, oligopeptido de clara de huevo, hidrolizado de soja o una mezcla de estos con un solo aminoacido. El alimento y la bebida pueden estar en forma procesada, tal como alimentos lfquidos naturales, alimentos nutricionales semidigeridos y alimentos nutricionales, bebidas, capsulas o nutrientes enterales, etc. combinados con azucares, grasas, elementos traza, vitaminas, emulsiones, sabores o similares. Para la forma de bebida, se puede combinar el material con la bebida como aditivos nutricionales, tales como aminoacidos, vitaminas y minerales y edulcorantes, especias, sabores, pigmentos, etc., con objeto de mantener un equilibrio de nutrientes o

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de impartir un buen sabor cuando se ingiere. La forma del alimento y la bebida para uso segun la invencion no se limita a estas.

A partir de aqm, se describiran Ejemplos para explicar la invencion con mas detalle, pero sera obvio que la invencion no se restringe a estos Ejemplos.

Ejemplo de referencia 1

[Aparicion de complicacion diabetica]

Se compraron ratones db/db hembra con diabetes de tipo II y db/m no diabeticos a Clea Japan, Inc. Se mantuvo a los ratones en condiciones de un ciclo de 12 horas de luz-obscuridad a una temperatura de 21°C a 25°C. Para su aclimatacion, se alimento a los ratones con CE-2 (Clea Japan, Inc.) y libre acceso al agua durante una semana. Se dividio a los ratones en tres grupos de 8 ratones cada uno (db/m no diabeticos, db/db diabeticos y db/db a los que se administro astaxantina) y se mantuvo a cada grupo con alimento ad libitum. Se alimento a los ratones del grupo al que se administro astaxantina con una dieta que combinaba un 0,02% de astaxantina en terminos de astaxantina libre con CE-2. Se mantuvo a cada grupo durante 12 semanas y se midieron el peso corporal, los niveles de glucosa en sangre, los niveles de 8-OHdG en orina, los niveles de albumina en orina y la histopatologfa del rinon. La astaxantina aqm utilizada era AstaReal (marca registrada, Fuji Chemical Industry Co., Ltd.) 50F, que es un aceite compuesto por ester de astaxantina y acido graso y trigliceridos y contiene un 5% de astaxantina en terminos de astaxantina libre.

[Tabla 1] Cambio en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre

Grupo

Nivel de albumina en orina (mg/dl) Nivel de 8-OHdG en orina (mg/dl)

db/db

46,9+0,6 421,5+22,5

db/db (Ax)

46,2+1,5 325,2+38,5

db/m

30,2+1,2 119,4+3,6

Cada valor representa la desviacion estandar * p<0,01 grupo al que se realizo la administracion frente al control (prueba t).

db/db, db/db (Ax) y db/m son ratones db/db, ratones db/db a los que se administro astaxantina y ratones db/m, respectivamente.

[Tabla 2] Cambio en el nivel de albumina en orina y el nivel de 8-OHdG en orina

Grupo

Nivel de albumina en orina (mg/dl) Nivel de 8-OHdG en orina (mg/dl)

db/db

236,2+173,5 335,8+67,9

db/db (Ax)

77,8+44,6 160,5+43,5

db/m

75,5+43,9 75,0+15,1

Cada valor representa la desviacion estandar * p<0,01 grupo al que se realizo la administracion frente al control (prueba t).

Las Tablas 1 y 2 muestran el efecto de la astaxantina sobre los niveles de glucosa en sangre, los niveles de albumina en orina y los niveles de 8-OHdG en orina en ratones diabeticos.

Estos resultados indican que la astaxantina en la diabetes reduce los niveles de glucosa en sangre, los niveles de albumina en orina y los niveles de 8-OHdG en orina y, por lo tanto, tiene un efecto sobre la diabetes y la nefropatfa diabetica.

Se extirpo el rinon de cada uno de los ratones db/db, db/db(Ax) y db/m, se hicieron cortes finos y se observo entonces el glomerulo al microscopio. El mesangio glomerular de los ratones db/db estaba aumentado; sin embargo, el aumento del mesangio glomerular resultaba aparentemente inhibido en el caso de los db/db (Ax) a los que se habfa administrado astaxantina. La FIG. 1 es una microfotograffa del tejido glomerular. Se revelo que, dado que la astaxantina inhibfa la lesion del glomerulo renal, se reducfa el aumento en los niveles de albumina en orina y en los niveles de 8-OHdG en orina en la nefropatfa diabetica.

[Medicion del grado de expresion genica]

Tras el penodo de mantenimiento de la prueba, se extirpo el rinon y se congelo a -80°C. Utilizando un sistema LM200 (Olympus Corporation), se corto el glomerulo renal del rinon de los ratones manteniendo una baja temperatura. Se extrajo el ARNt del glomerulo renal usando el reactivo de extraccion de ARNt "Isogen" (producido por Nippon Gene Co., Ltd.) y se llevaron luego a cabo la preparacion de ARNc y la hibridacion segun el Affymetrix

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GeneChip Eukaryotic Small Sample Target Labeling Assay Ver. II.

(1) Smtesis de la primera hebra de ADNc: Se mezclaron 1 |il de solucion de ARN total y 1 |il de cebador T7- Oligo(dT) 5 |iM, se calento a 70°C durante 6 minutos y se enfrio despues a 4°C durante 2 minutos. Se anadieron 3 |il de RT_Premix_1 (1,5 |il de agua tratada con DEPC, 4 |il de tampon de primera hebra 5x, 2 |il de DTT (0,1 M), 1,5 |il de Mezcla dNTP (10 mM), 1 |il de inhibidor de ARNasa (40 U/|il) y 2 |il de SuperScript II (200 U/|il)) y se realizo una transcripcion inversa a 42°C durante 1 hora. Se calento la muestra a 70°C durante 10 minutos para inactivar el Super Script II y se enfrio despues hasta 4°C.

(2) Smtesis de la segunda hebra de ADNc: Se anadieron 32,5 |il de SS_Premix_1 (91 |il de agua tratada con DEPC, 30 |il de tampon de segunda hebra 5x, 3 |il de dNTP (10 mM), 1 |il de ADN ligasa de E. coli (10 U/|il), 4 |il de ADN polimerasa de E. coli (10 U/|il) y 1 |il de ARNasa H (2 U/|il)) a la solucion de primera hebra de ADNc y se dejo que reaccionaran durante 2 horas a 16°C.

(3) Se anadio al ADNc resultante 1 |il de ADN polimerasa T4 (5 U/|il) y se dejo que reaccionaran durante 10 minutos a 16°C, y se purifico por precipitacion con etanol.

(4) Transcripcion in vitro: Se anadieron a la pella de ADNc de doble hebra seca 10 |il de reactivos (4 |il de agua tratada con DEPC, 4 |il de NTP premezclados, 1 |il de tampon de reaccion 10x y 1 |il de mezcla enzimatica 10x) y se dejo que reaccionaran a 37°C en un bano de agua durante 6 horas.

(5) Se purifico el ARNc de primer ciclo usando el RNeasy Mini Kit de acuerdo con el protocolo del manual (QIAGEN).

(6) A continuacion, para la amplificacion y el marcaje, se mezclo la muestra de ARNc con cebadores aleatorios (0,2 |ig/|il), se trato a 70°C durante 10 minutos, se enfrio sobre hielo durante 2 minutos, se anadieron 5 |il de RT_Premix_2 (tampon de primera hebra 5x, DTT (0,1 M), mezcla de dNTP (10 mM), inhibidor de ARNasa (40 U/|il) y SuperScript II (200 U/|il) y se dejo que reaccionaran a 42°C durante 1 hora.

(7) Se llevo despues a cabo la smtesis de la segunda hebra de ADNc anadiendo promotor T7-Oligo(dT) 5 |iM, tratando a 70°C durante 6 minutos, enfriando a 4°C y anadiendo 62 |il de SS_Premix_2 (43 |il de agua tratada con DEPC, 15 |il de tampon de segunda hebra 5x, 1,5 |il de mezcla de dNTP (10 mM) y 2 |il de ADN polimerasa de E. coli (10 U/|il)).

(8) Se anadio al ADNc resultante 1 |il de ADN polimerasa T4 (5 U/|il), se dejo que reaccionaran a 16°C durante 10 minutos y se purifico por precipitacion con etanol.

(9) Para llevar a cabo la transcripcion in vitro y el marcaje con el Kit de Marcaje de Transcriptos de ARN de Alto

Rendimiento de Biomatriz ENZO, se anadieron 40 |il de reactivos (22 |il de solucion tratada con DEPC, 4 |il de tampon de reaccion HY 10x, 4 |il de ribonucleotidos marcados con biotina 10x, 4 |il de DTT 10x, 4 |il de mezcla

de inhibicion de ARNasa 10x y 2 |il de ARN polimerasa T7 20x) y se dejo que reaccionaran a 37°C durante 4 horas.

(10) Se purifico el ARNc diana marcado con columnas RNeasy.

(11) Se llevaron a cabo la fragmentacion y la hibridacion segun el "GeneChip Expression Analysis Technical Manual".

Se hibrido el ARNc marcado preparado con un "Conjunto de Expresion en raton 430A, que representaba un total de 22.690 transcriptos de raton" GeneChip (Affymetrix). Para el analisis de los datos, se uso el GeneChip Analysis Suite Ver. 5.1 (Affymetrix). Se llevaron a escala todas las micromatrices hasta una intensidad diana de 1.000 y se compararon con el ruido de fondo y la intensidad de tincion global. Se identificaron los transcriptos expresados diferencialmente mediante algoritmos del programa Affymetrix.

[Tabla 3] fndice de intensidad de la expresion genica relacionada con el estres oxidativo *

N° de acceso

db/db:db/m db/db:db/db(Ax) db/db(Ax):db/m Descripciones

1424111_at

13,00 0,87 11,31 Receptor del factor de crecimiento de tipo insulina 2

1448061_at

5,28 0,25 1,32 Receptor del depurador macrofagico 1

1438655 a at

4,59 0,19 0,87 Colageno, tipo XXV, alfa 1

1425476 at

4,00 0,50 2,00 Procolageno, tipo IV, alfa 5

1424762_at

0,62 2,00 1,23 C1q y protema relacionada con el factor de necrosis tumoral 5

1422777 at

0,54 1,32 0,71 Factor relacionado con C1q

1449366 at

0,31 2,00 0,62 Metaloproteinasa de la matriz 8

* El N° de acceso es el numero del sitio del "Conjunto de Expresion en raton 430A" al que se unen las sondas; db/db:db/m, db/db(Ax):db/m y db/db(Ax):db/m representan el mdice de intensidad de expresion genica entre los ratones db/db y los ratones db/m, el mdice de intensidad de expresion genica entre los ratones db/db y los ratones db/db a los que se administro astaxantina y el mdice de intensidad de expresion genica entre los ratones db/db a los que se administro astaxantina y los ratones db/db, respectivamente. En las "Descripciones", se muestran los factores con los que se asocia la sonda unida. Las Tablas 4 a 6 que se muestran a continuacion son descritas de la

misma manera.

[Tabla 4] Indice relativo de expresion genica relacionada con citoquinas

N° de acceso

db/db:db/m db/db(Ax):db/db db/db(Ax):db/m Descripciones

1434099 at

78,79 0,87 68,59 Caspasa 7

1420811 a at

32,00 0,38 12,13 Catenina beta

1422486 a at

27,86 1,00 27,86 Homologo MAD 4 (Dorosophia)

1448184 at

9,85 0,66 6,50 Protema de union a FK506 1a

1454971_x_at

5,66 0,57 3,25 Transcripto 4 inducido por el factor de crecimiento transformante beta 1 Fosfoprotema segregada 1

1449254 at

4,92 0,13 0,66

1425742_a_at

4,29 0,33 1,41 Transcripto 4 inducido por el factor de crecimiento transformante beta 1

5 [Tabla 5] Indice relativo de expresion genica relacionada con citoquinas

N° de acceso

db/db:db/m db/db(Ax):db/db db/db(Ax):db/m Descripciones

1436691 x at

64,00 0,14 9,19 Peroxirredoxina 1

1416430 at

25,99 0,33 8,57 Catalasa

1419821_s_at

21,11 0,33 6,96 Isocitrato deshidrogenasa 1 (NADP+), soluble

1448184 at

17,15 0,23 4,00 Superoxido dismutasa 1, soluble

1448733_at

10,56 0,76 8,00 Region de insercion blinfoma Mo- MLV 1

[Tabla 6] Indice relativo de expresion genica relacionada con citoquinas

N° de acceso

db/db:db/m db/db(Ax):db/db db/db(Ax):db/m Descripciones

1454610 at

48,5 0,76 36,76 Septina 7

1433816 at

25,99 0,31 8 Fibrosina 1

1438629 x at

16 0,19 3,03 Granulina

1449036 at

16 0,1 1,62 Protema dactilar ring 128

1423344 at

0,31 2,30 0,71 Receptor de eritropoyetina

10

Se ve que los genes excesivamente expresados de los ratones db/db en los que ha tenido lugar una expresion genica anormal son moderados.

[Tabla 7] Peso del gastrocnemio y cambio en el indice de atrofia

Grupo control Grupo Ax

Peso corporal (g)

343,8 338,7

Gastrocnemio

Peso de la extremidad posterior derecha (mg) Peso de la extremidad posterior izquierda (mg) Porcentaje de contraccion (%) 5,05+0,32 2,84+0,28 43,8 4,94+0,27 3,08+0,10 37,7

El grupo Ax tema un valor menor de indice de atrofia en comparacion con el grupo control, lo que indica que Ax tiene un efecto de moderacion de la atrofia muscular. El indice de riesgo era del 5% o inferior y se obtuvieron resultados significativos.

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[Tabla 8] Expresion genica relacionada con el aumento y la disminucion de celulas musculares y de celulas oseas

(aumento de expresion)

N° de acceso

ad/nc ad/nd nd nc ad ac Descripciones

1369999 a at

4,75 0,61 1043,2 135 640,7 106,4 Neuronatina

1377334 at

2,27 0,51 615,4 137,6 312 220,5 RT1 clase II, locus Ba

1387172 a at

1,50 0,57 1179 452,6 677,8 479,9 Factor de crecimiento transformante, beta 2

1387353 at

1,21 0,67 1564 862,6 1042, 6 715,4 Homologo 2 del oncogen vmco del timoma murino (v-akt)

* El N° de acceso es el numero del sitio del "Conjunto de Expresion en raton 430A" al que se unen las sondas; nd, nc, ad y ac son las intensidades de luminiscencia del sitio al que se unen las sondas de los genes en el musculo soleo de la extremidad posterior izquierda (miembro en el que se extirparon los nervios) del grupo control, en el

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musculo soleo de la extremidad posterior derecha (control) del grupo control, en el musculo soleo de la extremidad posterior izquierda (miembro en el que se extirparon los nervios) del grupo al que se administro astaxantina y en el musculo soleo de la extremidad posterior derecha (control) del grupo al que se administro astaxantina, respectivamente; ad/nc y ad/nd representan el mdice de intensidad de expresion genica del gen en el musculo soleo de la extremidad posterior izquierda (miembro en el que se extirparon los nervios) del grupo al que se administro astaxantina en relacion al gen en el musculo soleo de la extremidad posterior derecha (control) del grupo control y el mdice de intensidad de expresion genica del musculo soleo de la extremidad posterior izquierda (miembro en el que se extirparon los nervios) del grupo al que se administro astaxantina en relacion al musculo soleo de la extremidad posterior izquierda (miembro en el que se extirparon los nervios) del grupo control, respectivamente. En las "Descripciones", se muestran factores con los que se asocia la sonda unida. La Tabla 9 es descrita de la misma manera.

Se ve que la administracion de astaxantina modera el aumento de la expresion de los genes relacionados con la atrofia muscular con mayor expresion.

[Tabla 9] Expresion genica relacionada con el aumento y la disminucion de celulas musculares y de celulas oseas

(supresion de la expresion)

N° de acceso

ad/nc ad/nd nd nc ad ac Descripciones

1398469_at

1,09 1,90 175,1 479,2 333,1 523,6 Protema fosfatasa 3, isoforma gamma de la subunidad catalttica

1369098_at

1,00 1,49 213,1 501,2 318 500,5 Receptor de la lipoprotema de muy baja densidad

1369161_at

1,34 1,41 217,3 503,5 306,9 677,1 Cassette de union a ATP, miembro de la subfamilia B (MDR/TAP)

Se ve que la administracion de astaxantina aumenta la expresion de los genes relacionados con la atrofia muscular con supresion de la expresion.

[Ejemplo de preparacion de referencia 1] (Tableta)

Se mezclaron uniformemente los ingredientes mostrados a continuacion en la siguiente proporcion de composicion (% en peso) para preparar tabletas, cada una de 180 mg.

Astaxantina

5%

Lactosa

75%

Oxido de magnesio pesado

20%

[Ejemplo de preparacion de referencia 2] (Capsula)

Se introdujo aceite extrafdo de Haematococcus (que contema un 10% en peso de astaxantina) en una pelmula de capsula blanda consistente en los siguientes componentes segun un metodo habitual para preparar capsulas blandas, cada una de 100 mg.

Gelatina

Glicerina

p-Hidroxibenzoato de propilo

Agua

Total

70%

23%

0,5%

Cantidad apropiada 100%

Aplicabilidad industrial

La presente divulgacion revelo que la astaxantina tiene un efecto de regulacion de la expresion genica y lleva la expresion genica a condiciones normales. A saber, el agente regulador de la expresion genica de la presente divulgacion es util como agente regulador de la expresion genica que incluye astaxantina o su ester como principio activo.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agente para uso en el tratamiento de la atrofia muscular que incluye:

   5 al menos uno de astaxantina y un ester de la misma.
2. 2. El agente para uso segun la reivindicacion 1, donde el ester de astaxantina es un ester de astaxantina y acido graso.

   10 3. El agente para uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que es un alimento o una bebida.