ES2645921T3 - Composiciones que comprenden enzimas con actividad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas con actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa - Google Patents

Composiciones que comprenden enzimas con actividad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas con actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende una enzima que exhibe actividad de endo-1,4-ß-xilanasa, enzima que comprende un secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1; en combinación con una enzima que presenta actividad de endo-1,3(4)-3-glucanasa, cuya enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 7.

Description

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Una unidad de actividad de endo-1,3(4)-β-glucanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5,0 (o como se especifica) y 50ºC).
En algunas realizaciones, la composición enzimática de acuerdo con la invención comprende una actividad de βglucanasa de al menos aproximadamente 10000 U/g, tal como al menos aproximadamente 12000 U/g, tal como al menos aproximadamente 14000 U/g, tal como al menos aproximadamente 15.000 U/g, tal como al menos aproximadamente 18000 U/g, medida por el ensayo descrito en los ejemplos.
La composición enzimática según la invención puede tener una actividad de laminarinasa o puede comprender una
o más enzimas adicionales que tienen actividad de laminarinasa. La actividad de la laminarinasa se determina como se describe en el ensayo de laminarasa descrito en la sección de Ensayo.
La laminarinasa puede ser una endo-1,3(4)-beta-glucanasa clasificada en E.C. 3.2.1.6 o glucano endo-1,3-beta-Dglucosidasa clasificada en E.C. 3.2.1.39. Endo-1,3(4)-beta-glucanasa con los nombres alternativos, laminarinasa, endo-1,3-beta-glucanasa, Endo-1,4-beta-glucanasa se clasifica en E.C. 3.2.1.6. Los sustratos incluyen laminarina, liquenina y D-glucanos de cereal y la enzima cataliza la endohidrólisis de los enlaces (1->3) o (1->4) en los beta-Dglucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor está implicado en el enlace a ser hidrolizado está sustituido por sí mismo en C-3. El glucano endo-1,3-beta-D-glucosidasa con los nombres alternativos (1->3)-betaglucano endohidrolasa, endo-1,3-beta-glucanasa y laminarinasa se clasifica en EC 3.2.1.39 e hidroliza los enlaces (1->3)-beta-D-glucosídicos en (1->3)-beta-D-glucanos en sustratos como, por ejemplo, laminarina, paramilón y paquimán.
La composición enzimática según la invención puede tener actividad de arabinanasa o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de arabinanasa. La arabinanasa está clasificada como EC 3.2.1.99. El nombre sistemático es 5-α-L-arabinan 5-α-L-arabinanohidrolasa pero tiene varios otros nombres tales como arabinan endo1,5-α-L-arabinosidasa, y endo-1,5-α-L-arabinanasa, endo-α-1,5-arabanasa, endo-arabanasa, 1,5-α-L-arabinan y 1,5α-L-arabinanohidrolasa. La arabinasa produce la endohidrólisis de los enlaces (1→5)-α-arabinofuranosídico en (1→5)-arabinanos. La arabinanasa también actúa sobre el arabinano.
La actividad de la arabinasa de la composición enzimática de acuerdo con la invención se puede medir mediante un ensayo de arabinasa como se describe en lo que sigue bajo el encabezamiento "Ensayos". El ensayo se puede llevar a cabo a pH 3,5 y 50ºC utilizando como sustrato la remolacha azucarera arabinano, y puede realizarse a diferentes valores de pH y temperatura para su caracterización y especificación adicionales de enzimas. La actividad enzimática se calcula a partir del aumento de la absorbancia a 540 nm por unidad de tiempo.
Una unidad de actividad de la arabinasa se define como la cantidad de enzima (normalizada para el volumen de ensayo total) que da un aumento en ΔOD540nm.min-1, bajo las condiciones del ensayo (pH 3,5 y 50ºC).
La composición enzimática de acuerdo con la invención puede tener actividad de beta-D-glucósido glucohidrolasa o puede comprender una enzima adicional que tiene beta-D-glucósido glucohidrolasa. La beta-D-glucósido glucohidrolasa se refiere a enzimas de E.C. 3.2.1.21.
La composición enzimática según la invención puede tener actividad de β-xilosidasa o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de β-xilosidasa. La "β-xilosidasa" o "xilano 1,4-beta-xilosidasa" se refieren a enzimas de E.C 3.2.1.37. La β-xilosidasa cataliza la hidrólisis de (1->4)-beta-D-xilanos para eliminar los residuos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores.
La composición enzimática según la invención puede tener actividad de celobiohidrolasa o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de celobiohidrolasa. La "celobiohidrolasa" o "celulosa 1,4-beta-celobiosidasa" se refieren a enzimas de EC 3.2.1.91. La celulosa 1,4-beta-celobiosidasa cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4beta-D-glucosídicos en la celulosa y la celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas.
La actividad de celobiohidrolasa de la composición enzimática de acuerdo con la invención se puede medir mediante el ensayo de celobiohidrolasa como se describe en lo que sigue bajo el título "Ensayos". El ensayo estándar se lleva a cabo a pH 5,0 y puede realizarse a diferentes valores de pH para la caracterización y especificación adicionales de las enzimas.
Una unidad de actividad de celobiohidrolasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de pnitrofenol a partir de p-nitrofenil β-D-celobiopiranísido por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5,0 (o según se especifica) y 50ºC).
La composición enzimática de acuerdo con la invención puede tener actividad de a-N-arabinofuranosidasa o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de arabinofuranosidasa. "a-N-arabinofuranosidasa" o "alfa-Narabinofuranosidasa" se refieren a enzimas de EC 3.2.1.55. La a-N-arabinofuranosidasa cataliza la hidrólisis de los residuos terminales no reductores de alfa-L-arabinofuranosido en alfa-L-arabinósidos.
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La actividad de arabinofuranosidasa de la composición enzimática de acuerdo con la invención se puede medir mediante el ensayo de arabinofuranosidasa como se describe en lo que sigue bajo el título "Ensayos". El ensayo estándar puede realizarse a pH 5,0 y 50ºC y puede realizarse a diferentes valores de pH y temperatura para la caracterización y especificación adicionales de las enzimas.
Una unidad de actividad de a-N-arabinofuranosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil a-L-arabinofuranosida por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5,0 y 50ºC (o como se especifica)).
La composición enzimática según la invención puede tener actividad de glucano 1,4-beta-glucosidasa o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de glucano 1,4-beta-glucosidasa. "Glucano 1,4-betaglucosidasa" o "glucano 1,4-beta-glucosidasa" se refieren a enzimas de E.C3.2.1.74. La glucano 1,4-betaglucosidasa cataliza la hidrólisis de los enlaces (1->4) en (1->4)-beta-D-glucanos, para eliminar unidades de glucosa sucesivas.
La composición enzimática de acuerdo con la invención tiene actividad de exo-beta-1,4-glucanasa específica de xiloglucano o puede comprender una enzima adicional que tiene actividad de exo-beta-1,4-glucanasa específica de xiloglucano. La "exo-beta-1,4-glucanasa específica de xiloglucano" se refiere a enzimas de E.C. 3.2.1.155. La exobeta-1,4-glucanasa específica de xiloglucano cataliza la exohidrólisis de enlaces (1->4)-beta-D-glucosídicos en el xiloglucano.
Las enzimas y composiciones enzimáticas según se describen en este documento pueden utilizarse en un procedimiento que comprende reducir la viscosidad de una solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón.
Las enzimas y composiciones enzimáticas también pueden usarse en un proceso que comprende filtrar una solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón. En algunas realizaciones, la solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón es una pasta para la fabricación de cerveza, y en otras realizaciones, la solución acuosa que comprende un hidrolizado de almidón es una composición alimenticia.
Alternativamente, la composición enzimática de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada en la producción de zumo de fruta, vino, procesamiento de grano, alcohol combustible, biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol y alcohol potable.
En algunas realizaciones, el biocombustible de primera o segunda generación, tal como el bioetanol, se produce a partir de reservas de piensos agrícolas tales como la caña de azúcar, patata, maíz, sorgo de trigo, etc., o de material celulósico tal como hojuelas de maíz, pasto aguja o cualquier otro material vegetal. En ambos casos, los azúcares fermentables se extraen de la materia prima y se fermentan por los microorganismos en alcohol, que se destila y se puede utilizar como combustible de transporte. La composición enzimática según la presente invención puede utilizarse en esta producción de biocombustible. El complejo de enzimas puede añadirse para mejorar la extracción de polisacáridos de la materia prima, ayudar a degradar los polisacáridos en azúcares fermentables y/o mejorar los parámetros de procesamiento, tales como la separación de líquidos de los sólidos, las características de flujo y la capacidad de bombeo.
El procedimiento de la invención puede aplicarse al macerado de cualquier granulado. De acuerdo con la invención, el grano puede comprender cualquier material vegetal que contenga almidón y/o azúcar que pueda derivarse de cualquier planta y partes de plantas, incluyendo tubérculos, raíces, tallos, hojas y semillas.
En algunas realizaciones, el grano comprende grano, tal como grano de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo, y más preferiblemente al menos 10%, o más preferiblemente al menos 15%, incluso más preferiblemente al menos el 25%, o lo más preferiblemente al menos el 35%, tal como al menos el 50%, al menos el 75%, al menos el 90% o incluso el 100% (p/p) del grano del mosto se deriva del grano.
En algunas realizaciones, el grano comprende grano maltado, tal como malta de cebada. Preferentemente, al menos 10%, o más preferiblemente al menos 15%, aún más preferiblemente al menos 25%, o lo más preferiblemente al menos 35%, tal como al menos 50%, al menos 75%, al menos 90% o incluso el 100% (p/p) del grano del mosto se deriva del grano maltado.
El término "pasta" se entiende como una suspensión acuosa de almidón, por ejemplo, que comprende la malta de cebada triturada, la cebada triturada y/u otro adyuvante o una combinación de los mismos, mezclados con agua posteriormente para separarse en mosto + gránulos gastados.
La expresión "separación de la pasta" se entiende como la separación del mosto de los granos gastados, tales como por aclarado o por filtración de la pasta.
La expresión "filtración de la cerveza" se entiende como un proceso de separación en el que las células de levadura y otros materiales causantes de la turbidez todavía presentes en la cerveza son eliminados, por ejemplo, por microfiltración o procesos de membrana.
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La preparación enzimática, tal como en la forma de un ingrediente alimentario, puede estar en forma de una solución
o como un sólido -dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración. La forma sólida puede ser como un polvo de enzima desecada o como una enzima granulada.
De acuerdo con esto, se describe una preparación de composición enzimática que comprende las enzimas descritas en esta invención o la composición enzimática según la invención, un vehículo enzimático y opcionalmente un estabilizante y/o un conservante.
El vehículo enzimático puede seleccionarse del grupo que consiste en glicerol o agua.
La preparación puede comprender un estabilizante. El estabilizante se puede seleccionar del grupo que consiste en sales inorgánicas, polioles, azúcares y combinaciones de los mismos. El estabilizante puede ser una sal inorgánica, tal como cloruro de potasio. El poliol puede ser glicerol, propilenglicol o sorbitol. El azúcar puede ser un carbohidrato de molécula pequeña, en particular cualquiera de varios de sabor dulce tales como la glucosa, la fructosa y la sacarosa.
La preparación puede comprender un conservante. El conservante es metilparabeno, propilparabeno, benzoato, sorbato u otros conservantes aprobados para alimentos o una mezcla de los mismos.
La enzima que presenta actividad de endo-1,4-β-xilanasa, opcionalmente en combinación con una o más βglucanasa de acuerdo con la presente invención proporciona una viscosidad significativamente reducida en aplicaciones de elaboración de cerveza que facilitan una separación mejorada de la pasta y la cerveza.
Las características de xilanasa deseadas para las aplicaciones de elaboración de cerveza pueden incluir uno o más de los siguientes aspectos:
a) Especificidad del sustrato enzimático
-La relación WE-AX/WU-AX tiene un impacto sobre la viscosidad. En algunas realizaciones esta relación es menor que aproximadamente 7,0, tal como menos de aproximadamente 6,5, tal como menos de aproximadamente 6,0, tal como menos de aproximadamente 5,5, tal como menos de aproximadamente 5,0, tal como menos de aproximadamente 4,5.
b) Selectividad del sustrato enzimático
-Se cree que tiene un impacto en la funcionalidad cómo de próximo la enzima o las enzimas cortan respecto a los puntos de ramificación.
c) Termoestabilidad enzimática
-La solubilización continua de AX durante el macerado – la termoestabilidad es una característica clave. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa de acuerdo con la presente invención es termoestable dentro de un intervalo de temperaturas de 65-78ºC.
d) pH óptimo de la enzima. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la enzima que exhibe endo-1,4-β-xilanasa tiene un pH óptimo en el intervalo de pH 5,4-5,6.
e) Inhibición enzimática (por ejemplo, el factor clave conocido para las xilanasas)
Dicha viscosidad significativamente reducida en las aplicaciones de elaboración de la cerveza se puede medir como una viscosidad reducida en la aplicación de producción de cerveza en comparación con un control con una enzima conocida o combinación de actividades enzimáticas, tal como Ultraflo® Max usado en las mismas condiciones y cantidades.
La enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa de acuerdo con la presente descripción, opcionalmente en combinación con una o más β-glucanasas de acuerdo con la presente descripción proporciona una separación mejorada de masa y cerveza en aplicaciones de elaboración de cerveza.
La enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa de acuerdo con la presente descripción, opcionalmente en combinación con una o más β-glucanasas de acuerdo con la presente descripción, proporciona un potencial bajo para la formación de aromas, tal como la formación de aromas relacionada con la ruptura del arabinoxilano.
La enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa de acuerdo con la presente descripción, opcionalmente en combinación con una o más β-glucanasas de acuerdo con la presente descripción proporciona un menor riesgo de colapso del lecho de filtro, tal como en la filtración.
La enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa de acuerdo con la presente descripción, opcionalmente en combinación con una o más β-glucanasas de acuerdo con la presente invención, proporciona una reducción en el potencial de aromas y/o la reducción del aroma en la formación del aroma. Se describe en este documento una
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Debe entenderse que cualquiera de la combinación anterior de una 1ª enzima que es una enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa puede combinarse con una enzima que exhibe actividad de endo-1,3(4)-βglucanasa con una relación entre las dos enzimas de 1:10, 2:10, 3:10, 4:10, 5:10, 6:10, 7:10, 8:10, 9:10, 10:10, 10:9, 5 10:8, 10:7, 10:6, 10:5, 10:4, 10:3, 10:2 o 10:1, tal como dentro de un intervalo de 1:10-10:1, tal como 2:10-10:2, tal como 3:10-10:3, tal como 4:10-10:4, tal como 5:10-10:5, tal como 6:10-10:6, tal como 7:10-10:7, tal como 8:10-10:8,
o dentro de 9:10-10:9. En algunas realizaciones la composición de acuerdo con la invención comprende una combinación de al menos dos enzimas, dichas dos enzimas o las dos enzimas con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de
10 identidad de secuencia con la SEQ ID respectiva, siendo seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID: NO 1 y SEQ ID NO: 7; También se describen en el presente documento las siguientes composiciones: SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7;
15 SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 7;
20 SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 8
25 SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 9;
30 SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9;
SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 9; 5 SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 10; 10 SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 11; 15 SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11; 20 SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 12; 25 SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 12; 30 SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 13; 35 SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 13;
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SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, la actividad de endo-1,3(4)-β-glucanasa y la actividad de endo-1,4-β-xilanasa se derivan
de al menos dos enzimas diferentes, tales como al menos dos enzimas diferentes de dos especies diferentes.
En algunas realizaciones la presión total acumulada se reduce a un valor de menos de 470 mm de WC, tal como
menos de 450 mm de WC, tal como menos de 430 mm de WC, tal como menos de 410 mm de WC, tal como menos
de 390 mm WC, tal como menos de 370 mm de WC, tal como menos de 350 mm de WC, tal como menos de 330
mm de WC, tal como menos de 310 mm de WC, tal como menos de 300 mm de WC, tal como menos de 290 mm de
WC, cuando la composición de acuerdo con la presente invención se usa antes del aclarado en una aplicación de producción de cerveza. En algunas realizaciones la presión total acumulada se reduce en al menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,
29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89,
91, 93 o 95% en comparación con el uso de un control negativo sin dicha composición; cuando se utiliza antes del
aclarado en una aplicación cervecera.
En algunas realizaciones, la capacidad de filtración del mosto medida por el volumen de mosto recogido después de 5 min de filtración con respecto a un control sin enzimas se incrementa por encima de 1,5, tal como por encima de 1,6, tal como por encima de 1,7, tal como por encima de 1,8, tal como por encima de 1,9, tal como por encima de 2,0, tal como por encima de 2,1, tal como por encima de 2,2, tal como por encima de 2,3, tal como por encima de 2,4, tal como por encima de 2,5, cuando la composición de acuerdo con la invención se utiliza en una preparación cervecera antes de la separación del mosto.
En algunas realizaciones, la capacidad de filtración del mosto, medida por el volumen de mosto recogido después de 5 min de filtración, aumenta al menos 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 , 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300% en comparación con el uso de un control negativo sin dicha composición.
En algunas realizaciones, la composición de acuerdo con la invención comprende una o más enzimas adicionales. En algunas realizaciones, la enzima o las enzimas adicionales se seleccionan de una lista que consiste en una xilanasa clasificada en EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136 o EC 3.2.1.156, una celulasa, una laminarinasa, una endo-1,5-a-Larabinanasa, una beta-D-glucosida glucohidrolasa, una β-xilosidasa, una celobiohidrolasa, una glucano 1,4-betaglucosidasa, una exo-beta-1,4-glucanasa específica de xiloglucano y una a-N-arabinofuranosidasa.
Las secuencias y enzimas identificadas por una secuencia como se menciona en este documento y usadas de acuerdo con la presente invención solas o en combinación con otras enzimas o compuestos pueden estar con o sin péptido señal.
Ensayos Método de actividad de la DNS celulasa (método DNS CMC) Nombre sistemático: 1,4-(1,3;1,4)-β-D-glucano 4-glucanohidrolasa IUB Número: EC 3.2.1.4 Principio El ensayo de la celulasa se basa en la endo-hidrólisis enzimática de los enlaces 1,4-β-D-glucosídicos en
carboximetilcelulosa (CMC), un β-1,4-glucano. Los productos de la reacción (oligosacáridos β-1,4 glucano) se determinaron colorimétricamente midiendo el aumento resultante en grupos reductores usando un reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico. La actividad enzimática se calculó a partir de la relación entre la concentración de grupos reductores, como equivalentes de glucosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 5,0, pero se puede realizar a diferentes valores de pH para la caracterización y especificación adicionales de las enzimas.
Definición de la unidad Una unidad de actividad de celulasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5,0 (o según se especifica) y 50ºC).
Materiales Carboximetilcelulosa. Proveedor: Megazyme Ltd. Nº. producto: CM-Celulosa 4M D-Glucosa 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10117. P.M.: 180,16 Acetato de sodio anhidro 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10236. P.M.: 82,03 Ácido acético ("glacial") "AnalaR". Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10001. P.M.: 60,05 Ácido 3,5-dinitrosalicílico GPR (ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico). Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto:
28235 Peletes de hidróxido sódico 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10252. P.M.: 40,00 (+)-Tartrato de potasio y sodio 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10219. P.M.: 282,22 Carboximetilcelulosa (CMC) 1,5% (Solución al p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (solución de
sustrato).
Solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 20 g/l de DNS en un tampón que contenía gránulos de hidróxido sódico 32 g/l y 600 g/l de (+)-tartrato de potasio y sodio. Solución patrón de glucosa (0,50 mg/ml) Procedimiento La composición enzimática se diluyó en muestras y una curva estándar de glucosa como se muestra en la fig. 2 con
concentraciones de glucosa de 0, 0,125, 0,25, 0,375 y 0,5 mg/ml.
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0,25 ml de solución de enzima se mezclaron con 1,75 ml de la solución de sustrato (1,5% p/v) a 50ºC y la reacción se detuvo después de 10 min por la adición de solución de DNS. Esto se siguió calentando a 95ºC durante 5 minutos.
La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540) de las diferentes muestras. Cálculos La actividad enzimática se determina a partir de la curva estándar como se muestra en la fig. 2. La actividad se calcula de la siguiente manera:
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donde: T = ΔOD540nm PRUEBA
= ΔOD540nm PRUEBA -OD540nm CONTROL
m = gradiente de la curva patrón (aproximadamente 1,0) c = intersección del eje y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0,02) 180,16≡ peso molecular de glucosa 103 ≡ para convertir a μmoles A ≡ volumen de ensayo en ml V ≡ volumen enzimático en ml t ≡ tiempo de ensayo en minutos D = factor de dilución enzimática real (por ejemplo, para 1,000 g diluido a 1 litro D = 1000) Laminarinasa (método de la laminarina de DNS) Principios La reacción, catalizada por la laminarinasa, implica la endohidrólisis de los enlaces 1,3-glucosídicos en 1,3-β-D
glucanos. Los sustratos incluyen laminarina, Paramylon y Pachyman. Los productos de la reacción (oligosacáridos de β-1,3-glucano) se determinan colorimetricamente midiendo el aumento resultante en grupos reductores usando un reactivo de ácido 3,5-dintrosalicílico. La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración de grupos reductores, como equivalentes de glucosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 5,0 y 50ºC, pero se puede realizar a diferentes valores de pH y temperatura para la caracterización y especificación adicionales de enzimas.
Definición de la unidad Una unidad de actividad de laminarinasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de equivalentes de glucosa por minuto en las condiciones del ensayo (pH 5,0 y 50ºC (o como se especifica)).
Materiales Véanse los materiales dados anteriormente para el ensayo de actividad de celulasa. Laminarina (de Laminaria digitata). Proveedor: Sigma-Aldrich Co. Ltd. Nº. producto: L 9634 Solución de laminarinina al 1,00% (solución p/v) (solución de sustrato, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0) 1,75 ml de solución de laminarina se mezclan con 0,25 ml de solución de enzima diluida a 50ºC durante 10 minutos
y la reacción se detiene mediante la adición de 2 ml de solución de DNS. La curva estándar se realizó usando solución de glucosa 0, 0,125, 0,25, 0,5 y 0,75 mg/ml. La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540nm).
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Cálculo La actividad se calcula de la siguiente manera:
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donde: T = ΔOD540nm PRUEBA
= ΔOD540nm PRUEBA -OD540nm CONTROL
m = gradiente de la curva patrón (aproximadamente 1,0) c = intersección del eje y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0,03) 180,16≡ peso molecular de glucosa 103 ≡ para convertir a μmoles A ≡ volumen de ensayo en ml V ≡ volumen enzimático en ml t ≡ tiempo de ensayo en minutos D = factor de dilución enzimática (por ejemplo, para 1 g diluido a 1 litro D = 1000) Ensayo de arabinasa Principio El ensayo de la actividad de la arabinasa se basa en la determinación colorimétrica midiendo el aumento resultante
en los grupos reductores usando un reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico. La actividad enzimática se calculó a partir de la relación entre la concentración de grupos reductores, como equivalentes de arabinosa, y la absorbancia a 540 nm.
El ensayo se llevó a cabo a pH 3,5, pero se puede realizar a diferentes valores de pH para la caracterización y especificación adicionales de enzimas.
Definición de la unidad Una unidad de actividad de la arabinasa (actividad de la arabinanasa (endo-1,5-alfa-arabinanasa)) se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de equivalentes de arabinosa por minuto en las condiciones del ensayo (pH 3,5 (o como se especifica) y 50ºC).
Materiales Mezcla de remolacha azucarera Arabinan Arabinosa Sigma A3131 P.M.: 150,1 Acetato de sodio anhidro 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10236. P.M.: 82,03 Ácido acético ("glacial") "AnalaR". Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10001. P.M.: 60,05 Ácido 3,5-dinitrosalicílico GPR (ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico). Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto:
28235 Peletes de hidróxido sódico 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10252. P.M.: 40,00 (+)-Tartrato de potasio y sodio 'AnalaR'. Proveedor: Merck Ltd (BDH). Nº. producto: 10219. P.M.: 282,22 Solución de Arabinan al 1,5% (solución p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 3,5 (solución de sustrato). Solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 20 g/l de DNS en un tampón que contenía gránulos de hidróxido sódico
32 g/l y 600 g/l de (+)-tartrato de potasio y sodio. Solución estándar de arabinasa (0,50 mg/ml)
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Procedimiento
Se diluyó la composición enzimática en muestras y se preparó una curva estándar de glucosa utilizando concentraciones de arabinasa de 0, 0,125, 0,25, 0,375 y 0,5 mg/ml. 0,25 ml de solución de enzima se mezclaron con 1,75 ml de la solución de sustrato (1,5% p/v) a 50ºC y la reacción
se detuvo después de 10 min por la adición de solución de DNS. Seguido por calentamiento a 95ºC durante 5 minutos. La densidad óptica se midió a 540 nm (OD540nm) de las diferentes muestras. Cálculo La actividad enzimática se determina a partir de la curva estándar. La actividad se calcula de la siguiente manera:
, donde: T = ΔOD540nm PRUEBA
= ΔOD540nm PRUEBA -OD540nm CONTROL
m = gradiente de la curva patrón (aproximadamente 1,0)
c = intersección del eje y de la curva estándar (siempre negativo y aproximadamente -0,02)
150,13 ≡ peso molecular de arabinasa
103 ≡ para convertir a μmoles
A ≡ volumen de ensayo en ml
V ≡ volumen enzimático en ml
t ≡ tiempo de ensayo en minutos
D = factor de dilución enzimática real (por ejemplo, para 1,000 g diluido a 1 litro D = 1000)
Ensayo de arabinofuranosidasa.
La reacción, catalizada por la a-N-arabinofuranosidasa, implica la hidrólisis del enlace terminal, en el resto a-Larabinofuranosido no reductor, de a-L-arabinósidos. La enzima actúa sobre a-L-arabinofuranosidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,3)-y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos.
El ensayo de α-N-arabinofuranosidasa se basa en la hidrólisis enzimática de p-nitrofenil α-L-arabinofuranosido. El ensayo es un método de "dos puntos", más que un método de "monitoreo continuo". El cálculo de la actividad enzimática se basa en mediciones realizadas sólo al inicio y al final del período de incubación. Un producto de la reacción, p-nitrofenol se determina colorimetricamente (después del ajuste del pH). La actividad enzimática se calcula a partir de la relación entre la concentración de p-nitrofenol y la absorbancia a 400 nm.
Preparación de la solución enzimática diluida:
Preparar todas las soluciones enzimáticas, a partir de preparaciones enzimáticas líquidas o en polvo, con agua destilada de vidrio. Minimizar los errores de dilución del ensayo evitando grandes pasos de dilución que involucren pequeños volúmenes o pesos. Al hacer las diluciones enzimáticas, es más preciso, incluso para una muestra líquida, pesar la muestra enzimática inicial. Si se hace esto, en el caso de las muestras de líquido es, por lo tanto, necesario medir la gravedad específica del líquido a 20ºC.
Como el ensayo es un método de "dos puntos", en lugar de un "monitoreo continuo", es importante asegurar la linealidad dentro del período de incubación con diferentes sistemas y condiciones enzimáticas. Bajo las condiciones de ensayo estándar de concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de ensayo, el ensayo ha demostrado ser lineal en el intervalo ΔOD540nm PRUEBA (T) = 0,20-1,50. Sin embargo, para unas buenas prácticas, el ensayo se opera dentro de un intervalo definido de ΔOD540nm PRUEBA (T) = 0,400-0,800.
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PRUEBA
CONTROL
Solución de p-nitrofenil--D-celobiopiranósido
1,00 ml 1,00 ml
Se añadieron 0,25 ml de disolución enzimática disuelta a la solución de ensayo a 50ºC, después de 30 minutos se añadieron a cada tubo 4 ml de una solución de glicina 0,4 M, pH 10,8 (reactivo de parada).
La absorbancia se midió a 20ºC a 400 nm en una cubeta de vidrio de 1 cm contra un control de agua.
•
determinar OD400nm PRUEBA para las PRUEBAS duplicadas medidas;
•
determinar OD400nm CONTROL. Cálculos
Unidades
donde: T = OD400nm PRUEBA -OD400nm CONTROL 18300 = Coeficiente de extinción molar para p-nitrofenol (longitud de trayectoria de 1 cm) V = 7,25 (volumen total de líquido en ensayo en ml) 1000 = para convertir en litros 106 = para convertir en μmoles t = 30 (minutos) 1 u = 1 μmοΙ.min-1 E = 0,25 (volumen de la muestra enzimática diluida en ml) D = Factor de dilución enzimática, p. ej. para 1 ml diluido a 1 litro D = 1000) La presente descripción también se refiere a los siguientes párrafos numerados:
1.
Una enzima que exhibe actividad de endo-1,4-β-xilanasa, enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con cualquiera seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18, o cualquier fragmento funcional de las mismas.
2.
La enzima según el párrafo 1, enzima que tiene una relación en la actividad sobre el sustrato de arabinoxilano soluble (WE-AX) frente al sustrato de arabinoxilano insoluble (WU-AX) de menos de aproximadamente 7,0, tal como menos de aproximadamente 6,5, tal como menos de aproximadamente 6,0, tal como menos de aproximadamente 5,5, tal como menos de aproximadamente 5,0, tal como menos de aproximadamente 4,5.
3.
Una enzima que exhibe actividad de endo-1,3(4)-β-glucanasa, enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con cualquiera seleccionada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o cualquier fragmento funcional de las mismas.
4.
La enzima de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 3, enzima que tiene una temperatura óptima en el intervalo de 40-70ºC, tal como en el intervalo de 45-65ºC, tal como en el intervalo de 50-65ºC, tal como en el intervalo de 55-65ºC.
5.
La enzima de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1-4, en la que dicha enzima tiene al menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad con cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-18, o cualquier fragmento funcional de las mismas.
6.
La enzima de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 5 que tiene un número total de aminoácidos inferior a 350, tal como menor que 340, tal como menos de 330, tal como menos de 320, tal como menos de 310, tal como
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38.
El método para la producción de una masa para cerveza, comprendiendo dicho método la etapa de tratar un material que comprende almidón con la enzima de acuerdo con los párrafos 1-10, o una preparación de acuerdo con el párrafo 14, o una composición de acuerdo con cualquiera de los párrafos 15-26.
39.
El método para la producción de un biocombustible de primera o segunda generación, tal como bioetanol, comprendiendo dicho método la etapa de tratar un material que comprende almidón con una enzima de acuerdo con los párrafos 1-10, o una preparación de acuerdo con el párrafo 14, o una composición de acuerdo con cualquiera de los párrafos 15-26.
40.
El producto obtenido por el método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 38-39.
41.
Una composición que comprende el producto de acuerdo con el párrafo 40, tal como aquella en la que el producto está en un intervalo de 0,1% a 99,9%.
Ejemplos
Ejemplo 1
Métodos y resultados en relación con la presentación de xilanasas/glucanasas para la aplicación de la producción de cerveza.
Los siguientes métodos se han utilizado para detectar xilanasas y glucanasas con aplicación en la elaboración de la cerveza:
Métodos:
Método de arabinoxilano (WE-AX) xilanasa extraíble con agua:
Se preparan en agua destilada muestras, para obtener aprox. OD540 = 0,25-0,30 en este ensayo y estándares de xilosa (0, 0,125, 0,250, 0,375 y 0,500 mg/ml de agua destilada). En el tiempo t = 0 minutos, se coloca en un tubo de ensayo a 50ºC 1,75 ml de arabinoxilano de trigo soluble (arabinoxilano de trigo al 0,5% (PWAXYH, Megazyme, Bray, Irlanda)) en acetato de sodio 0,1 M/ácido acético, pH 5). En el tiempo t = 5 minutos, se añade una solución enzimática de 250 μl al sustrato a 50ºC seguido de mezcla. El agua destilada se utiliza como control. En el tiempo t = 15 minutos, se añaden 2 ml de solución de DNS (1% de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), 1,6% de hidróxido de sodio, 30% de tartrato sódico de potasio en agua destilada) y 2,0 ml de solución patrón. Las muestras, los controles y los patrones añadidos a DNS se colocan en un baño de agua hirviendo (95ºC) durante 5 minutos. A continuación, las muestras, los controles y los patrones se enfrían colocándolos en un baño de agua a 25ºC durante 20 minutos. La densidad óptica de todas las muestras se lee a OD540 usando un espectrofotómetro. En base a la dilución de las muestras, la cantidad de muestra en relación a las muestras de trabajo y los patrones, se puede calcular la actividad de las xilanasas de la muestra.
Una unidad de actividad de endo-1,4-beta-xilanasa WE-AX se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de equivalentes de xilosa por minuto en las condiciones mencionadas anteriormente (método de arabinoxilano (WE-AX) xilanasa extraíble con agua).
Método de arabinoxilano xilanasa (WU-AX) no extraíble en agua:
Las muestras se preparan en agua destilada. En el tiempo t = 0 minutos, se coloca en un tubo de ensayo a 50ºC 1,75 ml de trigo insoluble (0,5% de arabinoxilano de trigo (PWAXYI, Megazyme, Bray, Irlanda)) en acetato sódico 0,1M/ácido acético, pH 5). En el tiempo t = 5 minutos, se añade una solución enzimática de 250 μl al sustrato a 50ºC seguido de mezcla. El agua destilada se utiliza como control. En el tiempo t = 15 minutos, las muestras y los controles se colocaron en un baño de agua hirviendo (95ºC) durante 5 minutos.
A continuación, las muestras y los controles se centrifugan para precipitar el sustrato insoluble residual. La cantidad de arabinoxilano en solución se determina utilizando el método descrito por Rouau, X. y Surget, A. (1994), Carbohydrate Polymers, 24, 123-132.
La actividad de endo-1,4-beta-xilanasa WU-AX se define como la cantidad de pentosas solubilizadas (μg de pentosa) en las condiciones descritas anteriormente dando una definición unitaria de μg de pentosa/gramo de muestra de xilanasa.
Ensayo de actividad de xilanasa
Se preparan en agua destilada muestras, para obtener aprox. OD540 = 0,25-0,30 en este ensayo y patrones de xilosa (0, 0,125, 0,250, 0,375 y 0,500 mg/ml de agua destilada). En el tiempo t = 0 minutos, se coloca en un tubo de ensayo a 50ºC 1,75 ml de arabinoxilano de trigo soluble (0,5% de arabinoxilano de trigo (PWAXYH, Megazyme, Bray, Irlanda)) en acetato de sodio 0,1 M/ácido acético, pH 5). En el tiempo t = 5 minutos, se añade una solución enzimática de 250 μl al sustrato a 50ºC seguido de mezcla. El agua destilada se utiliza como control. En el tiempo t = 15 minutos, se añaden 2 ml de solución de DNS (1% de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), 1,6% de hidróxido de
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presente. (Ludwig Narziss y Werner Back, Technische Universitaet Muenchen (Fakultaet fuer Brauwesen, Weihenstephan), Abriss der Bierbrauerei. WILEY-VCH Verlags GmbH Weinheim, Alemania, 2005).
La purga de masa se inició después de un reposo de 5 minutos a 78ºC. El puré se transfirió al Lauter Tun, que previamente estaba lleno de agua a una altura justo debajo del "fondo falso". La masa se dejó reposar durante 5 minutos para la sedimentación de la torta de filtración. A esto siguió una recirculación de 15 min (140 L/h) que asegura la sedimentación de la torta del filtro y la clarificación del mosto. Típicamente, en la preparación de cerveza a gran escala, la filtración se iniciará cuando se obtenga una turbidez del mosto dada, sin embargo en los ensayos actuales la recirculación se mantuvo constante a los 15 minutos permitiendo la comparación de los ensayos. Durante el aclarado se recogieron los datos siguientes, incluyendo el tiempo (min), el volumen de mosto recogido (L), la diferencia de presión de filtración a través de la torta del filtro (mmWC, mm de columna de agua), la capacidad de la bomba (%), la turbidez del mosto DO) y temperatura de la mezcla (ºC).
La acumulación de presión a través de la torta de filtración durante la filtración se cree que es un factor que contribuye a establecer el estándar del rendimiento del aclarado del mosto. Alcanzando diferencias de presión muy altas -p. ej. 250 mmWC durante la primera recolección del mosto y, p. ej., 450 mmWC para el resto del aclarado -se induce una decantación de la torta del filtro (también conocida como corte profundo). La decantación es un proceso en el que una torta de filtro se desintagra o se alivia la formación de un canal de filtración reduciendo la velocidad de corte de la torta de filtración con cuchillos especialmente diseñados. Después de la decantación de la torta de filtro, se introdujo una recirculación de mosto de 6 minutos (caudal: 120 l/h), cebando la torta de filtro para una filtración continua. La decantación de la torta del filtro alivia un funcionamiento de filtración diverso comprometido que de otra manera también resultaría en una mala calidad del mosto. Si no se ha introducido ninguna decantación inducida por presión al comienzo del tercer rociado, se realizan decantaciones automáticas al principio del 3º y 4º rociado para asegurar que no se produce un bloqueo completo de la filtración justo antes de terminar la separación del mosto.
El aclarado se realizó con los ajustes ilustrados en la tabla 1.
Tabla 1. Configuración del aclarado. Volúmenes recogidos (L), flujo de filtración (L/h) y volúmenes de dispersión (L).
Mosto
Volumen recuperado, L Flujo de filtración, L/h Volumen de dispersión, L
Primer mosto
0-60 130
1ª dispersión
60-78 140 18
2ª dispersión
78-96 160 18
3ª dispersión
96-114 180 18
4ª dispersión
114-140 180 26
Después del aclarado final, el mosto dulce se devolvió al Mash Tun, se calentó hasta ebullición y se añadieron lúpulos. La adición de lúpulo se continuó durante 80 minutos y al final de la adición del lúpulo el pH se ajustó a 5,10 ± 0,05. El lúpulo se despejó del mosto amargo mediante el uso de remolinos y el mosto siguiente se enfrió a ~ 8ºC. Para la producción de cerveza, se seleccionó una levadura seca fermentante inferior (Saccharomyces cerevisiae) W34/70 de Fermentis. La levadura se rehidrató durante 30 min y se introdujo a 100 g/HL. La fermentación principal se mantuvo durante 5-6 días a 10ºC, seguido por maduración a 15ºC hasta atenuarse y Diacetil por debajo de 80 ppb. La cerveza se almacenó durante otras 2-3 semanas a 1ºC y 0,7 bar antes de filtrar.
La cerveza se filtró horizontalmente mediante el uso de placas de velas PP de 1,2 μm y kieselguhr. Se pueden incluir hasta 8 placas en la unidad de filtración, dando como resultado un área de filtración total de ~ 0,5 m2. En los estudios actuales se incluyeron 3 placas y se realizó la filtración a un caudal de 130 l/h, dando como resultado una velocidad de filtración de 6,9 HL/(h-m2). En las cervecerías a gran escala, la velocidad de filtración se suele establecer entre 5-7 HL/(h-m2). Por lo tanto, es obvio que los ajustes actuales están en el extremo superior -una elección deliberada desafiando las condiciones de filtración de la cerveza para verificar los beneficios potenciales de la elección de utilizar una enzima en el proceso de elaboración de la cerveza. Durante la filtración de la cerveza, se controlaron los caudales (L/h) así como los valores de presión (P-entrada y P-salida) para verificar el rendimiento de la filtración de la cerveza. También se realizaron varios análisis de la cerveza, tales como gravedad original (OG), extracto aparente (AE), alcohol por volumen (ABV), grado aparente de fermentación (ADF), grado real de fermentación (RDF), pH, color y amargor para evaluar la calidad de la cerveza.
Resultados:
Xilanasas:
Las xilanasas se examinaron en cuanto a su actividad sobre sustrato soluble e insoluble, sus características de pH y temperatura.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Xilanasas examinadas, su actividad sobre sustrato de arabinoxilano soluble (WE-AX) e insoluble (WU-AX) y sus características bioquímicas en cuanto a temperatura y pH.
Nombre
Origen GH WE-AX WU-AX WU-AX/WE-AX Temp opt, °C temp T½, °C pH opt.
AfuXyn2
Aspergillus fumingatus 11 7798 68790526 8822 65 59 5,5
AfuXyn3
Aspergillus fumingatus 11 26283 99716865 3794 60 62 5
AfuXyn5
Aspergillus fumingatus 11 90005 714363158 7937 60 50 4
BsuXyn3
Bacillus subtilis, BS3 11 82 1095357 13388 50 n. d. 6
BsuXyn4
subtilis, BS4 nº. 160 11 54 1005400 18619 50 n. d. 6
TerXyn1
Geosmithia emersonii 10 1467 6208786 4232 78 >78 3
AtuXyn3
Aspergillus tubigensis 10 1220 7760982 6361 65 67 4,5
AtuXyn4
Aspergillus tubigensis 11 1600 12934971 8084 45 58 5
AacXyn2
Aspergillus aculeatus 10 777 3880491 4994 70 73 4
TreXyn2
Trichoderma reesei 11 2244 16015846 7137 55 n. d. 5
TreXyn3
Trichoderma reesei 10 21487 141108772 6567 60 64 5,5
TreXyn5
Trichoderma reesei 11 1410 8842816 6272 70 68 5
n.d. = No determinado
Las actividades de las enzimas WE-AX y WU-AX (U) se midieron como se describe en las secciones "método de arabinoxilano xilanasa extraíble con agua (WE-AX)" y "método de arabinoxilano xilanasa no extraíble con agua (WU5 AX)".
Basándose en los resultados del cribado bioquímico, se seleccionaron xilanasas que tenían una relación de actividad apropiada en arabinoxilano soluble frente a insoluble para ensayos adicionales en ensayos de aplicación. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Las xilanasas se seleccionaron y el rendimiento relativo del extracto se obtuvo usando las xilanasas frente a 10 un control (sin xilanasas). Finalmente, la especificidad del sustrato de xilanasas se ilustra como una relación de su actividad sobre el arabinoxilano insoluble frente a soluble (WU-AX/WE-AX).
Nombre
Origen Rendimiento de Filtración WU-AX/WE-AX
5 min
10 min 15 min 30 min
Control
1,00 1,00 1,00 1,00
BsuXyn3
Bacillus subtilis, BS3 0,93 0,95 0,96 0,95 13388
BsuXyn4
Bacillus subtilis, BS4 nº. 160 n.d. n.d. n.d. n.d. 18619
Nombre
Origen Rendimiento de Filtración WU-AX/WE-AX
5 min
10 min 15 min 30 min
TerXynl
Geosmithia emersonii (Taleromyces emersonii) 2,19 1,92 1,70 1,44 4232
AtuXyn3
Aspergilo tubigensis 2,06 1,75 1,59 1,37 6361
AtuXyn4
Aspergilo tubigensis 1,02 1,01 1,01 1,01 8084
AacXyn2
Aspergilo aculeatus 2,07 1,86 1,67 1,43 4994
TreXyn3
Trichoderma reesei 2,41 2,02 1,81 1,55 6567
TreXyn5
Trichoderma reesei 2,06 1,75 1,59 1,37 6272
El rendimiento de filtración se midió como se describió anteriormente ("filtración"), y se presenta como un volumen de filtrado en los diferentes puntos temporales con respecto al control negativo (control).
Las actividades de las enzimas WE-AX y WU-AX (U) se midieron como se describe en las secciones "método de arabinoxilano xilanasa extraíble con agua (WE-AX)" y "método de arabinoxilano xilanasa no extraíble con agua (WU-AX)".
Glucanasas:
Las glucanasas se seleccionaron en cuanto a sus características de actividad y temperatura, y los resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Glucanasas seleccionadas, su actividad y sus características bioquímicas con respecto a la temperatura
Nombre
Origen U/ml Temp opt, °C temp_tampón T½, °C temp_mosto T½, °C pH opt.
TerGlu1
Talaromyces emersonii/Geosmithia emersonii 7338 70 78 78 3
BsuGluS
Bacillus subtilis 208 55-65 60 68 5-6
BsuGlu103FULL
Bacillus subtilis 391 50-60 53 58 5-6
TreGlu2
Trichoderma reesei 13 40-50 70 74 4,5-6
TreGlu3
Trichoderma reesei 9215 40-51 58 62 4,5-6
TreGlu4
Trichoderma reesei n.d. 40-52 62 62 4,5-6
TreGlu6
Trichoderma reesei n.d. 40-53 62 64 4,5-6
TreGlu7
Trichoderma reesei n.d. 40-54 62 62 4,5-6
TreGlu8
Trichoderma reesei n.d. 40-55 61 63 4,5-6
BsuGluC CBD
Bacillus subtilis 10 50-60 60 67 5-6
n.d. = No determinado
10 La actividad/unidades de glucanasa se determinó como se describe en el ensayo de actividad de glucanasa como se ha descrito anteriormente.
Basándose en los resultados de la selección bioquímica, se eligieron las glucanasas que tienen las características adecuadas para ensayos adicionales en los ensayos de aplicación. Los resultados se muestran en la tabla 5.
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Resultados y observaciones: Análisis final de la cerveza. Las cervezas de ensayo se analizaron de acuerdo con los procedimientos de operación estándar (EBC) y se presentan en la tabla 18. Tabla 18: Análisis final de la cerveza.
Cerveza final
UF max X3/BglS (a) X3/BglS (b) X3/BglS (a)
Alcohol (%)
4,82 4,89 5,01 4,92
Extracto real (% P)
4,5 4,6 4,6 4,4
RDF (%)
63,2 63,4 63,8 64,3
Extracto original (% P)
11,85 11,99 12,19 11,89
Color (EBC)
4,8 4,9 5 5
pH
4,4 4,4 4,4 4,4
SO2 (ppm)
13 13 10 6
Amargor (BU, EBC)
22 22 20 18
Turbidez (EBC)
0,43 0,4 0,38 0,4
Turbidez total -5d-60 dg C (EBC)
8,6 12,9 7,3 6,2
CO2 (g/L)
4,9 5,3 5,1 5,2
Diacetilo (ppb)
12 11 8 10
Retención de cabeza (S)
107 111 119 108
Volumen de espuma (ml)
452 476 460 470
5 Resultados y observaciones: Aldehículos de Strecker y "marcadores de envejecimiento" en la cerveza final.
El análisis se realizó tanto en la cerveza recién preparada como en la vieja. Aldehídos de Strecker y “marcadores de envejecimiento y calor” (2-Me-Pr (2-metilpropanal), 2-Me-Bu (2-metilbutanal), 3-Me-Bu (3-metilbutanal), Furfural, Metional, PheAcal (fenil acetaldehído) y T2N (trans-2-nonenal)) se analizaron por GC-MS tanto en la cerveza recién preparada y en la envejecida. Los datos del análisis de la cerveza recién preparada se presentan en la tabla 19.
10 Tabla 19: Análisis del aldehído de Strecker de la cerveza recién preparada. Se utilizan marcadores para el calor y el envejecimiento (Furfural y trans-2-Nonenal) como control de la muestra.
Marcadores de envejecimiento (cerveza recién preparada)
UF max X3/BglS (a) X3/BglS (b) X3/BglS (a)
2-ME-Pr (ppb)
5 5 5 6
2-ME-Bu (ppb)
2 2 2 2
3-ME-Bu (ppb)
6 6 6 6
Furfural (ppb)
10 11 11 10
Metional (ppb)
4 4 4 4
PheAcal (ppb)
6 6 6 7
T2N (ppb)
0,0011 0,005 0,004 0,006
Las cervezas de ensayo se incubaron a 37ºC durante 2 semanas antes del análisis de aldehído de Strecker. Los datos para las muestras de cerveza envejecida se presentan en la tabla 20.

Tabla 20: Análisis de aldehído de Strecker de cerveza envejecida. Se utilizan marcadores para el calor y el envejecimiento (furfural y trans-2-Nonenal) como control de muestra.
Marcadores de envejecimiento (cerveza envejecida forzada)
UF max X3/BglS (a) X3/BglS (b) X3/BglS (a)
2-ME-Pr (ppb)
25 23 22 26
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